Synteza peptyd\u00f3w na fazie sta\u0142ej, okre\u015blana najcz\u0119\u015bciej skr\u00f3tem SPPS (solid-phase peptide synthesis), jest chemiczn\u0105 metod\u0105 budowania peptyd\u00f3w aminokwas po aminokwasie, podczas gdy jeden koniec powstaj\u0105cego \u0142a\u0144cucha pozostaje chemicznie zwi\u0105zany z nierozpuszczalnym no\u015bnikiem.<\/p>\n
Zamiast izolowa\u0107 powstaj\u0105cy peptyd po ka\u017cdej reakcji, chemicy pozostawiaj\u0105 go przy\u0142\u0105czonego do fazy sta\u0142ej, wprowadzaj\u0105c i usuwaj\u0105c kolejne ciek\u0142e odczynniki oraz roztwory przemywaj\u0105ce. Powtarzaj\u0105ce si\u0119 cykle umo\u017cliwiaj\u0105 ods\u0142oni\u0119cie reaktywnej grupy aminowej, przy\u0142\u0105czenie kolejnego aminokwasu i usuni\u0119cie rozpuszczalnych sk\u0142adnik\u00f3w, kt\u00f3re nie s\u0105 ju\u017c potrzebne. Po zbudowaniu zaplanowanej sekwencji aminokwasowej peptyd mo\u017cna od\u0142\u0105czy\u0107 od no\u015bnika, a nast\u0119pnie podda\u0107 dalszej obr\u00f3bce i analizie.<\/p>\n
Taka organizacja procesu jest jednym z g\u0142\u00f3wnych powod\u00f3w, dla kt\u00f3rych SPPS sta\u0142a si\u0119 tak wa\u017cn\u0105 metod\u0105 w chemii peptyd\u00f3w. Faza sta\u0142a upraszcza wykonywanie wielu powtarzalnych operacji chemicznych i umo\u017cliwi\u0142a automatyzacj\u0119 syntezy.<\/p>\n
Wygoda syntezy na fazie sta\u0142ej nie oznacza jednak gwarancji chemicznej doskona\u0142o\u015bci.<\/p>\n
Przy\u0142\u0105czenie powstaj\u0105cego peptydu do no\u015bnika nie gwarantuje, \u017ce ka\u017cdy \u0142a\u0144cuch otrzyma wszystkie zaplanowane aminokwasy. Nie oznacza r\u00f3wnie\u017c, \u017ce materia\u0142 uwolniony na ko\u0144cu procesu b\u0119dzie chemicznie czysty lub b\u0119dzie mia\u0142 prawid\u0142ow\u0105 struktur\u0119.<\/p>\n
Sk\u0142adanie \u0142a\u0144cucha, odszczepianie i odzyskiwanie produktu, oczyszczanie, potwierdzanie to\u017csamo\u015bci oraz ko\u0144cowa charakterystyka strukturalna s\u0105 odr\u0119bnymi cz\u0119\u015bciami ca\u0142ego procesu.<\/p>\n
Wsp\u00f3\u0142czesne publikacje metodologiczne pokazuj\u0105 zar\u00f3wno u\u017cyteczno\u015b\u0107 SPPS, jak i konieczno\u015b\u0107 modyfikowania standardowych metod w przypadku trudnych sekwencji. W jednej z opublikowanych metod wykorzystuj\u0105cych strategi\u0119 Fmoc opisano na przyk\u0142ad rutynow\u0105 syntez\u0119, ale tak\u017ce zmodyfikowane podej\u015bcie do sekwencji peptydowych podatnych na agregacj\u0119. [1]<\/p>\n
Zrozumienie SPPS wymaga wi\u0119c czego\u015b wi\u0119cej ni\u017c zapami\u0119tania kolejnych etap\u00f3w chemicznych. Trzeba r\u00f3wnie\u017c wiedzie\u0107, jaki jest cel ka\u017cdego etapu, co mo\u017ce podczas niego p\u00f3j\u015b\u0107 nieprawid\u0142owo i na jakie pytania analityczne nadal trzeba odpowiedzie\u0107 po jego zako\u0144czeniu.<\/p>\n
W konwencjonalnej SPPS peptyd jest chemicznie przy\u0142\u0105czony do niewielkich nierozpuszczalnych cz\u0105stek, nazywanych zwykle ziarnami \u017cywicy, za pomoc\u0105 odpowiedniego \u0142\u0105cznika chemicznego.<\/p>\n
Ziarna pozostaj\u0105 w uk\u0142adzie reakcyjnym, podczas gdy kolejne ciek\u0142e odczynniki i roztwory przemywaj\u0105ce s\u0105 wprowadzane i usuwane.<\/p>\n
Znacznie upraszcza to powtarzaln\u0105 syntez\u0119.<\/p>\n
W klasycznej, etapowej syntezie w roztworze izolowanie i oczyszczanie rosn\u0105cego peptydu po ka\u017cdym przy\u0142\u0105czeniu aminokwasu mo\u017ce by\u0107 uci\u0105\u017cliwe. W SPPS powstaj\u0105cy \u0142a\u0144cuch pozostaje zwi\u0105zany z nierozpuszczaln\u0105 faz\u0105. Dzi\u0119ki temu rozpuszczalne nadmiary odczynnik\u00f3w i wiele produkt\u00f3w ubocznych mo\u017cna usuwa\u0107 poprzez przemywanie, podczas gdy peptyd zwi\u0105zany z \u017cywic\u0105 pozostaje na miejscu.<\/p>\n
Okre\u015blenie \u201efaza sta\u0142a\u201d mo\u017ce jednak prowadzi\u0107 do nieporozumie\u0144.<\/p>\n
Nie oznacza ono, \u017ce tworzenie wi\u0105za\u0144 peptydowych zachodzi bez udzia\u0142u cieczy czy rozpuszczalnika.<\/p>\n
\u017bywica jest zwykle otoczona ciek\u0142ym \u015brodowiskiem reakcyjnym, a jej oddzia\u0142ywanie z rozpuszczalnikiem mo\u017ce istotnie wp\u0142ywa\u0107 na przebieg syntezy. Odczynniki nadal musz\u0105 przemieszcza\u0107 si\u0119 w \u015brodowisku polimerowym lub wok\u00f3\u0142 niego i dociera\u0107 do reaktywnych miejsc rosn\u0105cego peptydu.<\/p>\n
Przy\u0142\u0105czenie peptydu do no\u015bnika ma zazwyczaj charakter kowalencyjny. Oznacza to, \u017ce powstaj\u0105ca cz\u0105steczka jest po\u0142\u0105czona z no\u015bnikiem poprzez \u0142\u0105cznik za pomoc\u0105 wi\u0105zania chemicznego.<\/p>\n
Peptyd nie jest wi\u0119c po prostu uwi\u0119ziony pomi\u0119dzy cz\u0105stkami, zatrzymany przez filtr czy lu\u017ano osadzony na powierzchni.<\/p>\n
Takie po\u0142\u0105czenie chemiczne jest celowo projektowane w taki spos\u00f3b, aby powstaj\u0105cy \u0142a\u0144cuch pozostawa\u0142 zwi\u0105zany podczas kolejnych reakcji i etap\u00f3w przemywania, a p\u00f3\u017aniej m\u00f3g\u0142 zosta\u0107 uwolniony w odpowiednich warunkach.<\/p>\n
Klasyczna liniowa strategia SPPS zazwyczaj rozpoczyna si\u0119 od aminokwasu, kt\u00f3ry w gotowym peptydzie b\u0119dzie stanowi\u0142 jego C-koniec.<\/p>\n
Reszta ta zostaje przy\u0142\u0105czona do no\u015bnika.<\/p>\n
Po ods\u0142oni\u0119ciu odpowiedniej reaktywnej grupy aminowej wprowadza si\u0119 kolejny zabezpieczony aminokwas i chemicznie przy\u0142\u0105cza do powstaj\u0105cego \u0142a\u0144cucha. Powtarzanie tego procesu stopniowo wyd\u0142u\u017ca peptyd w kierunku N-ko\u0144ca.<\/p>\n
Warto podkre\u015bli\u0107 ten kierunek, poniewa\u017c r\u00f3\u017cni si\u0119 on od biologicznej syntezy bia\u0142ek przez rybosomy.<\/p>\n
Synteza rybosomalna wyd\u0142u\u017ca polipeptyd od N-ko\u0144ca w kierunku C-ko\u0144ca. Konwencjonalna etapowa SPPS zazwyczaj buduje sekwencj\u0119 w przeciwnym kierunku.<\/p>\n
Ko\u0144cowa sekwencja aminokwas\u00f3w mo\u017ce by\u0107 jednak identyczna. R\u00f3\u017cni si\u0119 spos\u00f3b jej zbudowania.<\/p>\n
Istotne jest tutaj okre\u015blenie \u201ekonwencjonalna\u201d, poniewa\u017c chemia peptyd\u00f3w obejmuje r\u00f3wnie\u017c wyspecjalizowane strategie wykorzystuj\u0105ce alternatywne miejsca przy\u0142\u0105czenia, sk\u0142adanie fragment\u00f3w, reakcje ligacji i inne niestandardowe rozwi\u0105zania.<\/p>\n
Opis kierunku od C- do N-ko\u0144ca odnosi si\u0119 wi\u0119c do typowego etapowego procesu SPPS, a nie do wszystkich mo\u017cliwych metod chemii peptyd\u00f3w wykorzystuj\u0105cych faz\u0119 sta\u0142\u0105.<\/p>\n
Synteza na fazie sta\u0142ej nie jest jedynym sposobem otrzymywania peptyd\u00f3w.<\/p>\n
Peptydy mog\u0105 by\u0107 r\u00f3wnie\u017c otrzymywane poprzez syntez\u0119 chemiczn\u0105 w roztworze, biologiczne systemy ekspresyjne, przemiany enzymatyczne, ligacj\u0119 fragment\u00f3w lub kombinacje r\u00f3\u017cnych metod.<\/p>\n
SPPS jest szczeg\u00f3lnie u\u017cyteczna, gdy potrzebne jest kontrolowane sk\u0142adanie sekwencji oraz wykorzystanie zabezpieczonych, zmodyfikowanych lub w inny spos\u00f3b specjalistycznych aminokwasowych blok\u00f3w budulcowych.<\/p>\n
Nawet w ramach jednego projektu dotycz\u0105cego konkretnego peptydu nie zawsze trzeba stosowa\u0107 t\u0119 sam\u0105 metod\u0119 od pocz\u0105tku do ko\u0144ca.<\/p>\n
Poszczeg\u00f3lne fragmenty peptydu mog\u0105 na przyk\u0142ad zosta\u0107 zsyntetyzowane na \u017cywicy, osobno oczyszczone, a nast\u0119pnie po\u0142\u0105czone inn\u0105 metod\u0105 chemiczn\u0105. Inne cz\u0105steczki mog\u0105 wymaga\u0107 fa\u0142dowania, utleniania, cyklizacji lub dodatkowych przemian strukturalnych ju\u017c po uzyskaniu pocz\u0105tkowej liniowej sekwencji.<\/p>\n
Wyb\u00f3r odpowiedniej drogi zale\u017cy wi\u0119c od docelowej cz\u0105steczki, jej z\u0142o\u017cono\u015bci strukturalnej oraz wymaga\u0144 analitycznych i jako\u015bciowych projektu.<\/p>\n
Proces warto rozpatrywa\u0107 jako seri\u0119 kolejnych pyta\u0144.<\/p>\n
Przy\u0142\u0105czenie do no\u015bnika wyznacza punkt pocz\u0105tkowy i wp\u0142ywa na p\u00f3\u017aniejsz\u0105 chemi\u0119 uwalniania produktu. Nadal trzeba jednak ustali\u0107, czy przy\u0142\u0105czenie nast\u0105pi\u0142o prawid\u0142owo i czy zachowana zosta\u0142a integralno\u015b\u0107 stereochemiczna.<\/p>\n
Sk\u0142adanie \u0142a\u0144cucha ma doprowadzi\u0107 do przy\u0142\u0105czania aminokwas\u00f3w w zaplanowanej kolejno\u015bci. Nast\u0119pnie trzeba jednak sprawdzi\u0107, czy wszystkie \u0142a\u0144cuchy zareagowa\u0142y prawid\u0142owo i czy nie powsta\u0142y sekwencje z brakuj\u0105cymi aminokwasami, produkty skr\u00f3cone lub zmodyfikowane.<\/p>\n
Odszczepianie i usuwanie grup ochronnych maj\u0105 uwolni\u0107 peptyd oraz usun\u0105\u0107 okre\u015blone zabezpieczenia chemiczne. Samo skuteczne uwolnienie produktu nie m\u00f3wi jednak, jakie inne substancje znajduj\u0105 si\u0119 w surowym materiale.<\/p>\n
Oczyszczanie s\u0142u\u017cy oddzieleniu po\u017c\u0105danego materia\u0142u od niepo\u017c\u0105danych sk\u0142adnik\u00f3w, ale nawet oczyszczona frakcja nadal wymaga potwierdzenia to\u017csamo\u015bci i oceny jako\u015bci.<\/p>\n
Ko\u0144cowa charakterystyka strukturalna i analityczna ma natomiast odpowiedzie\u0107 na pytanie, czy wyizolowany materia\u0142 ma w\u0142a\u015bciwo\u015bci chemiczne oczekiwane dla docelowego peptydu i czy zastosowane metody analityczne s\u0105 odpowiednie dla zamierzonego zastosowania.<\/p>\n
S\u0105 to etapy koncepcyjne, a nie instrukcja laboratoryjna. Konkretne odczynniki, aparatura i warunki reakcji zale\u017c\u0105 od docelowego peptydu i wymagaj\u0105 odpowiednio opracowanej oraz zwalidowanej metody.<\/p>\n
W dyskusjach dotycz\u0105cych SPPS cz\u0119sto pojawiaj\u0105 si\u0119 trzy terminy: \u017cywica, \u0142\u0105cznik i stopie\u0144 podstawienia, czyli loading.<\/p>\n
Opisuj\u0105 one powi\u0105zane, ale r\u00f3\u017cne w\u0142a\u015bciwo\u015bci.<\/p>\n
\u017bywica jest nierozpuszczalnym materia\u0142em stanowi\u0105cym no\u015bnik.<\/p>\n
\u0141\u0105cznik zapewnia chemiczne po\u0142\u0105czenie pomi\u0119dzy tym no\u015bnikiem a peptydem lub pierwsz\u0105 reszt\u0105 aminokwasow\u0105. Jego chemia mo\u017ce wp\u0142ywa\u0107 zar\u00f3wno na spos\u00f3b przy\u0142\u0105czenia peptydu, jak i na p\u00f3\u017aniejsze jego uwalnianie.<\/p>\n
Loading opisuje natomiast liczb\u0119 reaktywnych miejsc przy\u0142\u0105czenia w odniesieniu do ilo\u015bci no\u015bnika.<\/p>\n
Poj\u0119cia te nie s\u0105 synonimami.<\/p>\n
Dwie \u017cywice mog\u0105 wygl\u0105da\u0107 fizycznie bardzo podobnie, a jednocze\u015bnie mie\u0107 odmienne grupy funkcyjne, \u0142\u0105czniki lub stopie\u0144 podstawienia. R\u00f3\u017cnice te mog\u0105 wp\u0142ywa\u0107 na dost\u0119pno\u015b\u0107 reaktywnych miejsc podczas sk\u0142adania \u0142a\u0144cucha, p\u0119cznienie \u017cywicy oraz chemiczn\u0105 posta\u0107 ko\u0144cowego peptydu po odszczepieniu.<\/p>\n
Kolejnym wa\u017cnym elementem jest planowana grupa na C-ko\u0144cu.<\/p>\n
R\u00f3\u017cne uk\u0142ady no\u015bnik\u2013\u0142\u0105cznik mog\u0105 by\u0107 dobierane na przyk\u0142ad w taki spos\u00f3b, aby otrzyma\u0107 peptyd zako\u0144czony grup\u0105 karboksylow\u0105 albo amidow\u0105.<\/p>\n
Jest to istotna r\u00f3\u017cnica chemiczna.<\/p>\n
Zmiana grupy terminalnej oznacza zmian\u0119 samej cz\u0105steczki, a nie tylko sposobu jej zapakowania czy opisania.<\/p>\n
Wiele \u017cywic stosowanych w SPPS poch\u0142ania rozpuszczalnik i p\u0119cznieje po kontakcie z odpowiednim ciek\u0142ym \u015brodowiskiem.<\/p>\n
Zmienia to \u015brodowisko polimerowe i mo\u017ce zwi\u0119ksza\u0107 lub zmniejsza\u0107 przestrze\u0144, przez kt\u00f3r\u0105 rozpuszczone odczynniki musz\u0105 si\u0119 przemieszcza\u0107, aby dotrze\u0107 do zwi\u0105zanych z \u017cywic\u0105 \u0142a\u0144cuch\u00f3w peptydowych.<\/p>\n
P\u0119cznienie nie jest wi\u0119c wy\u0142\u0105cznie ciekawostk\u0105 fizyczn\u0105.<\/p>\n
Mo\u017ce wp\u0142ywa\u0107 na dost\u0119pno\u015b\u0107 reaktywnych grup podczas syntezy.<\/p>\n
Systematyczne badanie no\u015bnik\u00f3w opartych na polistyrenie i PEG wykaza\u0142o, \u017ce takie w\u0142a\u015bciwo\u015bci jak rodzaj \u0142\u0105cznika i stopie\u0144 podstawienia \u017cywicy istotnie wp\u0142ywa\u0142y na p\u0119cznienie w badanych bardziej ekologicznych rozpuszczalnikach. Stwierdzono r\u00f3wnie\u017c, \u017ce p\u0119cznienie mo\u017ce zmienia\u0107 si\u0119 podczas usuwania grup ochronnych oraz w miar\u0119 wyd\u0142u\u017cania \u0142a\u0144cucha peptydowego. [2]<\/p>\n
Pokazuje to, \u017ce zachowania \u017cywicy nie zawsze mo\u017cna traktowa\u0107 jako jej sta\u0142ej w\u0142a\u015bciwo\u015bci.<\/p>\n
W praktyce zale\u017cy ono od wsp\u00f3\u0142dzia\u0142ania \u017cywicy, rozpuszczalnika, \u0142\u0105cznika, przy\u0142\u0105czonego peptydu oraz aktualnego etapu syntezy.<\/p>\n
Dobre p\u0119cznienie lub korzystny przebieg reakcji dla jednej kombinacji \u017cywicy, rozpuszczalnika i peptydu nie oznaczaj\u0105 wi\u0119c, \u017ce inna kombinacja b\u0119dzie zachowywa\u0142a si\u0119 identycznie.<\/p>\n
Pierwszy etap przy\u0142\u0105czenia mo\u017ce wydawa\u0107 si\u0119 prosty, poniewa\u017c \u0142a\u0144cuch peptydowy dopiero zaczyna powstawa\u0107.<\/p>\n
B\u0142\u0105d wprowadzony na tym etapie mo\u017ce jednak pozosta\u0107 obecny podczas ca\u0142ej p\u00f3\u017aniejszej syntezy.<\/p>\n
Je\u017celi pierwsza reszta zostanie przy\u0142\u0105czona nieprawid\u0142owo albo podczas tego procesu zmieni si\u0119 jej konfiguracja stereochemiczna, prawid\u0142owe dodanie wszystkich kolejnych reszt nie musi naprawi\u0107 pocz\u0105tkowego problemu.<\/p>\n
W badaniu z 1992 r. opracowano metod\u0119 analityczn\u0105 przeznaczon\u0105 specjalnie do pomiaru racemizacji zachodz\u0105cej podczas przy\u0142\u0105czania zabezpieczonych aminokwas\u00f3w do no\u015bnik\u00f3w sta\u0142ych. [3]<\/p>\n
Znaczenie tej pracy wykracza poza sam\u0105 zastosowan\u0105 metod\u0119 analityczn\u0105.<\/p>\n
Pokazuje ona, \u017ce jako\u015b\u0107 stereochemiczna mo\u017ce wymaga\u0107 kontroli jeszcze przed rozpocz\u0119ciem powtarzaj\u0105cych si\u0119 cykli wyd\u0142u\u017cania \u0142a\u0144cucha.<\/p>\n
R\u00f3wnie\u017c ilo\u015b\u0107 materia\u0142u pocz\u0105tkowo przy\u0142\u0105czonego do no\u015bnika wymaga w\u0142a\u015bciwej interpretacji.<\/p>\n
Nominalny stopie\u0144 podstawienia \u017cywicy, loading zmierzony eksperymentalnie, ilo\u015b\u0107 surowego materia\u0142u odzyskanego po odszczepieniu oraz ko\u0144cowa wydajno\u015b\u0107 wyizolowanego i oczyszczonego peptydu s\u0105 r\u00f3\u017cnymi wielko\u015bciami.<\/p>\n
Nie nale\u017cy traktowa\u0107 ich jako zamiennych wska\u017anik\u00f3w powodzenia syntezy.<\/p>\n
W miar\u0119 wyd\u0142u\u017cania \u0142a\u0144cucha peptydowego sama przy\u0142\u0105czona cz\u0105steczka zaczyna wp\u0142ywa\u0107 na swoje \u015brodowisko chemiczne.<\/p>\n
S\u0105siednie \u0142a\u0144cuchy mog\u0105 oddzia\u0142ywa\u0107 ze sob\u0105 poprzez wi\u0105zania wodorowe, oddzia\u0142ywania hydrofobowe i inne si\u0142y mi\u0119dzycz\u0105steczkowe. Niekt\u00f3re sekwencje mog\u0105 wykazywa\u0107 szczeg\u00f3lnie siln\u0105 tendencj\u0119 do takich oddzia\u0142ywa\u0144.<\/p>\n
Mo\u017ce to ogranicza\u0107 dost\u0119p do reaktywnych grup.<\/p>\n
W takiej sytuacji przy\u0142\u0105czenie kolejnego aminokwasu mo\u017ce sta\u0107 si\u0119 trudniejsze, nawet je\u017celi do uk\u0142adu wprowadzono pozornie wystarczaj\u0105c\u0105 ilo\u015b\u0107 odczynnika sprz\u0119gaj\u0105cego.<\/p>\n
W badaniu dotycz\u0105cym trudnych, podatnych na agregacj\u0119 sekwencji por\u00f3wnano r\u00f3\u017cne metody sprz\u0119gania i przeanalizowano otrzymane produkty surowe. Wyniki wspieraj\u0105 zasad\u0119, \u017ce proces powinien by\u0107 dostosowywany do konkretnej sekwencji, zamiast zak\u0142ada\u0107 istnienie jednej strategii sprz\u0119gania, kt\u00f3ra zawsze jest najlepsza. [4]<\/p>\n
Wyja\u015bnia to r\u00f3wnie\u017c, dlaczego samo zwi\u0119kszenie stopnia podstawienia \u017cywicy lub ilo\u015bci odczynnika nie rozwi\u0105zuje automatycznie wszystkich problem\u00f3w.<\/p>\n
Je\u017celi podstawowym problemem jest ograniczony dost\u0119p do reaktywnych miejsc, wa\u017cniejsze od pytania o ilo\u015b\u0107 dodanego odczynnika staje si\u0119 pytanie, czy rzeczywi\u015bcie dotar\u0142 on do odpowiednich miejsc i czy reakcja zasz\u0142a wydajnie bez powstawania niedopuszczalnej ilo\u015bci produkt\u00f3w ubocznych.<\/p>\n
Aminokwasy zawieraj\u0105 grupy chemiczne zdolne do uczestniczenia w r\u00f3\u017cnych reakcjach.<\/p>\n
Podczas kontrolowanego sk\u0142adania peptydu chemicy chc\u0105 zazwyczaj, aby okre\u015blona grupa aminowa reagowa\u0142a z konkretnym blokiem zawieraj\u0105cym grup\u0119 karboksylow\u0105, podczas gdy inne potencjalnie reaktywne miejsca pozostaj\u0105 czasowo nieaktywne.<\/p>\n
W\u0142a\u015bnie temu s\u0142u\u017c\u0105 grupy ochronne.<\/p>\n
Tymczasowo blokuj\u0105 wybrane miejsca reaktywne, pozwalaj\u0105c innemu miejscu uczestniczy\u0107 w zaplanowanej reakcji.<\/p>\n
W powszechnie stosowanej strategii SPPS opartej na Fmoc ko\u0144cowa grupa aminowa rosn\u0105cego \u0142a\u0144cucha pozostaje zabezpieczona pomi\u0119dzy kolejnymi etapami przy\u0142\u0105czania. Gdy ma zosta\u0107 do\u0142\u0105czony nast\u0119pny aminokwas, tymczasow\u0105 ochron\u0119 usuwa si\u0119, ods\u0142aniaj\u0105c grup\u0119 aminow\u0105.<\/p>\n
Reaktywne \u0142a\u0144cuchy boczne mog\u0105 posiada\u0107 osobne grupy ochronne, zaprojektowane tak, aby pozosta\u0142y nienaruszone podczas powtarzaj\u0105cych si\u0119 cykli budowania g\u0142\u00f3wnego \u0142a\u0144cucha.<\/p>\n
Celem jest kontrolowana selektywno\u015b\u0107.<\/p>\n
Odpowiedni blok zawieraj\u0105cy grup\u0119 karboksylow\u0105 powinien po\u0142\u0105czy\u0107 si\u0119 z odpowiedni\u0105 grup\u0105 aminow\u0105, zamiast prowadzi\u0107 do niekontrolowanego rozga\u0142\u0119ziania lub innych konkurencyjnych reakcji.<\/p>\n
Ortogonalna strategia grup ochronnych pozwala usun\u0105\u0107 jedn\u0105 grup\u0119 ochronn\u0105 w warunkach, w kt\u00f3rych inne potrzebne zabezpieczenia pozostaj\u0105 w wystarczaj\u0105cym stopniu nienaruszone.<\/p>\n
Daje to chemikowi mo\u017cliwo\u015b\u0107 kontrolowanego ods\u0142aniania r\u00f3\u017cnych miejsc reaktywnych na poszczeg\u00f3lnych etapach syntezy.<\/p>\n
Fmoc i Boc s\u0105 dobrze znanymi okre\u015bleniami w chemii peptyd\u00f3w, ale nie oznaczaj\u0105 r\u00f3\u017cnych rodzaj\u00f3w wi\u0105za\u0144 peptydowych ani r\u00f3\u017cnych ko\u0144cowych struktur peptydu.<\/p>\n
S\u0105 to grupy ochronne zwi\u0105zane z r\u00f3\u017cnymi strategiami syntezy i r\u00f3\u017cnymi metodami ich usuwania.<\/p>\n
Tymczasow\u0105 drog\u0119 chemiczn\u0105 stosowan\u0105 podczas budowania peptydu nale\u017cy wi\u0119c odr\u00f3\u017cni\u0107 od jego ostatecznej struktury.<\/p>\n
Zabezpieczenia nie stanowi\u0105 r\u00f3wnie\u017c pe\u0142nej ochrony przed wszystkimi mo\u017cliwymi reakcjami ubocznymi.<\/p>\n
Badania nad powstawaniem aspartimidu pokazuj\u0105 na przyk\u0142ad, \u017ce strategia zabezpieczania, s\u0105siednie reszty aminokwasowe oraz warunki usuwania grup ochronnych mog\u0105 wp\u0142ywa\u0107 na powstawanie zanieczyszcze\u0144 nawet w dobrze poznanych metodach SPPS. [5] [6]<\/p>\n
Strategia grup ochronnych ogranicza wi\u0119c okre\u015blone niepo\u017c\u0105dane reakcje, ale nie eliminuje potrzeby kontroli procesu ani ko\u0144cowej charakterystyki analitycznej.<\/p>\n
Reakcja sprz\u0119gania prowadzi do utworzenia kolejnego wi\u0105zania amidowego w szkielecie peptydu.<\/p>\n
Blok aminokwasowy zawieraj\u0105cy grup\u0119 karboksylow\u0105 jest zazwyczaj aktywowany chemicznie, aby m\u00f3g\u0142 skutecznie reagowa\u0107 z ods\u0142oni\u0119t\u0105 grup\u0105 aminow\u0105 rosn\u0105cego peptydu zwi\u0105zanego z \u017cywic\u0105.<\/p>\n
Po zako\u0144czeniu sprz\u0119gania rozpuszczalny nadmiar materia\u0142u mo\u017cna usun\u0105\u0107 przez przemywanie.<\/p>\n
Nowo przy\u0142\u0105czony aminokwas staje si\u0119 wtedy ko\u0144cow\u0105 reszt\u0105 rosn\u0105cego \u0142a\u0144cucha. Nast\u0119pnie mo\u017cna ods\u0142oni\u0107 jego grup\u0119 aminow\u0105 i rozpocz\u0105\u0107 kolejny cykl sprz\u0119gania.<\/p>\n
Teoretycznie powtarzanie tej sekwencji pozwala kontrolowa\u0107 kolejno\u015b\u0107 aminokwas\u00f3w poprzez kontrolowanie kolejno\u015bci wprowadzania blok\u00f3w budulcowych.<\/p>\n
W praktyce istnieje jednak bardzo wa\u017cne zastrze\u017cenie:<\/p>\n
zaplanowana reakcja chemiczna musi rzeczywi\u015bcie przebiec prawid\u0142owo w ka\u017cdym cyklu.<\/p>\n
Je\u017celi jedno sprz\u0119ganie jest niepe\u0142ne, cz\u0119\u015b\u0107 \u0142a\u0144cuch\u00f3w mo\u017ce nie otrzyma\u0107 zaplanowanej reszty.<\/p>\n
Je\u017celi pozostan\u0105 one przy\u0142\u0105czone do \u017cywicy i prawid\u0142owo zareaguj\u0105 w kolejnym cyklu, mog\u0105 powsta\u0107 sekwencje delecyjne, czyli cz\u0105steczki peptydu pozbawione jednego lub kilku zaplanowanych aminokwas\u00f3w.<\/p>\n
Inne \u0142a\u0144cuchy mog\u0105 pozosta\u0107 skr\u00f3cone.<\/p>\n
Przemywanie usuwa rozpuszczalne odczynniki i produkty uboczne, ale nie eliminuje selektywnie wszystkich nieprawid\u0142owo zbudowanych \u0142a\u0144cuch\u00f3w, kt\u00f3re nadal s\u0105 kowalencyjnie zwi\u0105zane z no\u015bnikiem.<\/p>\n
Powtarzalny charakter SPPS prowadzi do istotnego problemu matematycznego.<\/p>\n
Niewielka niedoskona\u0142o\u015b\u0107 pojedynczego etapu mo\u017ce wydawa\u0107 si\u0119 nieistotna, ale po wielu powt\u00f3rzeniach jej skutki mog\u0105 si\u0119 kumulowa\u0107.<\/p>\n
Rozwa\u017cmy prosty przyk\u0142ad matematyczny.<\/p>\n
Je\u017celi synteza peptydu wymaga\u0142aby 50 etap\u00f3w sprz\u0119gania, a ka\u017cdy z nich mia\u0142by niezale\u017cnie 99% prawdopodobie\u0144stwa prawid\u0142owego zako\u0144czenia, teoretyczny odsetek cz\u0105steczek, kt\u00f3re pomy\u015blnie przesz\u0142yby wszystkie 50 etap\u00f3w, wynosi\u0142by oko\u0142o 60,5%.<\/p>\n
Jest to jedynie ilustracja.<\/p>\n
Zak\u0142ada ona, \u017ce wszystkie etapy zachowuj\u0105 si\u0119 identycznie i niezale\u017cnie. Nie uwzgl\u0119dnia problem\u00f3w z usuwaniem grup ochronnych, reakcji ubocznych, strat podczas odszczepiania i oczyszczania, agregacji ani wielu innych rzeczywistych czynnik\u00f3w.<\/p>\n
Nie nale\u017cy wi\u0119c interpretowa\u0107 tego wyniku jako przewidywania rzeczywistej wydajno\u015bci produkcji.<\/p>\n
Przyk\u0142ad pokazuje jedynie, dlaczego nawet bardzo wysoka wydajno\u015b\u0107 pojedynczych etap\u00f3w nie gwarantuje chemicznie prostego produktu surowego po kilkudziesi\u0119ciu powt\u00f3rzeniach.<\/p>\n
Dlatego monitorowanie syntezy i kontrola zanieczyszcze\u0144 s\u0105 istotne podczas ca\u0142ego procesu sk\u0142adania peptydu, a nie dopiero po dodaniu ostatniego aminokwasu.<\/p>\n
Automatyzacja, ogrzewanie i inne rozwi\u0105zania technologiczne mog\u0105 przyspieszy\u0107 syntez\u0119, ale szybko\u015b\u0107 procesu powinna by\u0107 zawsze oceniana razem z jako\u015bci\u0105 produktu.<\/p>\n
Badanie nad SPPS wspomagan\u0105 mikrofalami analizowa\u0142o zale\u017cn\u0105 od rodzaju reszty racemizacj\u0119 oraz powstawanie aspartimidu, pokazuj\u0105c, dlaczego warunki reakcji nadal musz\u0105 by\u0107 dostosowywane do w\u0142a\u015bciwo\u015bci konkretnej sekwencji. [7]<\/p>\n
Po zbudowaniu zaplanowanej sekwencji peptyd nale\u017cy zazwyczaj chemicznie oddzieli\u0107 od no\u015bnika.<\/p>\n
Etap ten okre\u015bla si\u0119 jako cleavage, czyli odszczepianie.<\/p>\n
Odszczepianie przerywa celowo zaprojektowane chemiczne po\u0142\u0105czenie pomi\u0119dzy peptydem a no\u015bnikiem.<\/p>\n
W zale\u017cno\u015bci od zastosowanej strategii odszczepianie mo\u017ce nast\u0119powa\u0107 jednocze\u015bnie z usuni\u0119ciem cz\u0119\u015bci lub wszystkich grup ochronnych \u0142a\u0144cuch\u00f3w bocznych. W innych procesach peptyd lub jego fragment mo\u017ce zosta\u0107 uwolniony przy zachowaniu niekt\u00f3rych zabezpiecze\u0144, je\u017celi planowane s\u0105 dalsze przemiany chemiczne.<\/p>\n
Odpowiednia chemia uwalniania zale\u017cy od \u0142\u0105cznika i docelowej cz\u0105steczki.<\/p>\n
Warunki, kt\u00f3re skutecznie uwalniaj\u0105 jeden peptyd, mog\u0105 uszkodzi\u0107 chemicznie wra\u017cliw\u0105 grup\u0119 w innym.<\/p>\n
Dlatego odszczepianie opisuje cel chemiczny, a nie jeden uniwersalny zestaw odczynnik\u00f3w lub warunk\u00f3w odpowiedni dla wszystkich peptyd\u00f3w.<\/p>\n
Podobnie prawid\u0142owe zbudowanie szkieletu peptydu nie dowodzi, \u017ce wszystkie grupy ochronne zosta\u0142y nast\u0119pnie skutecznie usuni\u0119te.<\/p>\n
Sk\u0142adanie \u0142a\u0144cucha i ko\u0144cowe usuwanie zabezpiecze\u0144 odpowiadaj\u0105 na r\u00f3\u017cne pytania chemiczne i wymagaj\u0105 osobnej oceny.<\/p>\n
Odszczepianie nie musi by\u0107 chemicznie oboj\u0119tnym etapem.<\/p>\n
Usuwanie grup ochronnych oraz zrywanie po\u0142\u0105czenia peptydu z no\u015bnikiem mo\u017ce prowadzi\u0107 do powstawania reaktywnych form chemicznych zdolnych do modyfikowania peptydu lub innych sk\u0142adnik\u00f3w mieszaniny.<\/p>\n
Dlatego w opracowanych metodach mog\u0105 by\u0107 stosowane tzw. scavengery, czyli zwi\u0105zki wychwytuj\u0105ce okre\u015blone niepo\u017c\u0105dane reaktywne produkty i wp\u0142ywaj\u0105ce na powstawanie produkt\u00f3w ubocznych.<\/p>\n
W badaniu z 2019 r. przeanalizowano r\u00f3\u017cne scavengery podczas odszczepiania exenatydu z \u017cywicy peptydowej i wykazano, \u017ce ich wyb\u00f3r wp\u0142ywa\u0142 na jako\u015b\u0107 surowego produktu oraz obserwowany profil zanieczyszcze\u0144. [8]<\/p>\n
Nie nale\u017cy na tej podstawie tworzy\u0107 uniwersalnej receptury odszczepiania.<\/p>\n
Badanie pokazuje natomiast, \u017ce warunki tego etapu mog\u0105 wp\u0142ywa\u0107 na jako\u015b\u0107 produktu i dlatego powinny by\u0107 oceniane dla konkretnego peptydu oraz zastosowanego systemu grup ochronnych.<\/p>\n
Prawid\u0142owy proces odszczepiania ma wi\u0119c kilka wymiar\u00f3w.<\/p>\n
Peptyd musi zosta\u0107 odpowiednio od\u0142\u0105czony, wymagane grupy ochronne powinny zosta\u0107 usuni\u0119te, materia\u0142 docelowy musi zosta\u0107 odzyskany, a niepo\u017c\u0105dane przemiany chemiczne powinny by\u0107 kontrolowane.<\/p>\n
Po odszczepieniu przeprowadza si\u0119 proces umo\u017cliwiaj\u0105cy oddzielenie materia\u0142u zawieraj\u0105cego peptyd od sta\u0142ej \u017cywicy oraz cz\u0119\u015bci pozosta\u0142ych sk\u0142adnik\u00f3w mieszaniny reakcyjnej.<\/p>\n
Mo\u017cna przy tym wykorzystywa\u0107 r\u00f3\u017cnice w rozpuszczalno\u015bci, lotno\u015bci lub innych w\u0142a\u015bciwo\u015bciach chemicznych.<\/p>\n
Odzyskanie widocznego osadu czy frakcji zawieraj\u0105cej peptyd nie dowodzi jednak, \u017ce materia\u0142 sk\u0142ada si\u0119 wy\u0142\u0105cznie z zamierzonego produktu.<\/p>\n
Na tym etapie m\u00f3wi si\u0119 zwykle o surowym peptydzie.<\/p>\n
Mo\u017ce on zawiera\u0107 docelow\u0105 cz\u0105steczk\u0119 razem z sekwencjami delecyjnymi, skr\u00f3conymi \u0142a\u0144cuchami, chemicznie zmodyfikowanymi peptydami, nieca\u0142kowicie odbezpieczonymi strukturami, materia\u0142ami pochodz\u0105cymi z odczynnik\u00f3w i innymi zanieczyszczeniami.<\/p>\n
Znaczenie poszczeg\u00f3lnych zanieczyszcze\u0144 zale\u017cy od sekwencji, warunk\u00f3w syntezy i zamierzonego zastosowania.<\/p>\n
W jednym z bada\u0144 po\u0142\u0105czono rozdzia\u0142 chromatograficzny ze spektrometri\u0105 mas w celu scharakteryzowania surowych produkt\u00f3w SPPS i przypisania poszczeg\u00f3lnych pik\u00f3w chromatograficznych okre\u015blonym peptydom. [9]<\/p>\n
Pokazuje to, dlaczego informacje uzyskane dzi\u0119ki metodom separacyjnym i strukturalnym wzajemnie si\u0119 uzupe\u0142niaj\u0105.<\/p>\n
Chromatografia mo\u017ce wykaza\u0107 obecno\u015b\u0107 wielu sk\u0142adnik\u00f3w, natomiast spektrometria mas mo\u017ce dostarczy\u0107 dodatkowych informacji pomagaj\u0105cych ustali\u0107, czym mog\u0105 by\u0107 niekt\u00f3re z nich.<\/p>\n
Oczyszczanie ma na celu wzbogacenie lub wyizolowanie docelowej cz\u0105steczki spo\u015br\u00f3d innych sk\u0142adnik\u00f3w.<\/p>\n
Identyfikacja odpowiada natomiast na pytanie, czy wyizolowany materia\u0142 rzeczywi\u015bcie ma oczekiwane w\u0142a\u015bciwo\u015bci chemiczne.<\/p>\n
Pytania te cz\u0119\u015bciowo si\u0119 pokrywaj\u0105, ale nie s\u0105 tym samym.<\/p>\n
Dobrze rozdzielony pik chromatograficzny nie stanowi automatycznie pe\u0142nego dowodu struktury cz\u0105steczki.<\/p>\n
Podobnie uzyskanie oczekiwanej masy cz\u0105steczkowej samo w sobie nie jest pe\u0142n\u0105 ocen\u0105 czysto\u015bci ani poprawno\u015bci strukturalnej.<\/p>\n
Blisko spokrewnione warianty sekwencji, stereoizomery lub chemicznie zmodyfikowane formy mog\u0105 by\u0107 trudne do rozr\u00f3\u017cnienia lub rozdzielenia.<\/p>\n
Metoda oczyszczania powinna wi\u0119c by\u0107 oceniana w odniesieniu do rzeczywistej mieszaniny powsta\u0142ej podczas danej syntezy, a nie uznawana za wystarczaj\u0105c\u0105 tylko dlatego, \u017ce sprawdzi\u0142a si\u0119 w przypadku innego peptydu.<\/p>\n
Je\u017celi ko\u0144cowa cz\u0105steczka wymaga r\u00f3wnie\u017c utworzenia mostk\u00f3w disiarczkowych, cyklizacji lub innej transformacji po zako\u0144czeniu sk\u0142adania \u0142a\u0144cucha, pojawiaj\u0105 si\u0119 kolejne pytania analityczne dotycz\u0105ce prawid\u0142owo\u015bci po\u0142\u0105cze\u0144, jednorodno\u015bci strukturalnej oraz tego, czy rzeczywi\u015bcie otrzymano zamierzon\u0105 dojrza\u0142\u0105 posta\u0107 cz\u0105steczki.<\/p>\n
Jedn\u0105 z najwa\u017cniejszych zalet SPPS jest mo\u017cliwo\u015b\u0107 utrzymywania powstaj\u0105cego peptydu na no\u015bniku podczas wielokrotnej wymiany ciek\u0142ych odczynnik\u00f3w.<\/p>\n
Upraszcza to powtarzalne operacje chemiczne i umo\u017cliwia automatyzacj\u0119.<\/p>\n
Chemicy mog\u0105 wprowadza\u0107 zaplanowan\u0105 sekwencj\u0119 aminokwasowych blok\u00f3w budulcowych, a je\u017celi pozwala na to chemia procesu, r\u00f3wnie\u017c niekt\u00f3re niestandardowe aminokwasy i inne modyfikacje.<\/p>\n
Wsp\u00f3\u0142czesne systemy automatyczne pokazuj\u0105, jak daleko mo\u017cna rozwin\u0105\u0107 t\u0119 koncepcj\u0119.<\/p>\n
W badaniu dotycz\u0105cym zautomatyzowanej syntezy przep\u0142ywowej z 2020 r. opisano otrzymywanie \u0142a\u0144cuch\u00f3w bia\u0142kowych zawieraj\u0105cych nawet 164 reszty aminokwasowe. Po p\u00f3\u017aniejszym oczyszczaniu i fa\u0142dowaniu uzyskano funkcjonalne materia\u0142y. [10]<\/p>\n
Jest to imponuj\u0105cy przyk\u0142ad mo\u017cliwo\u015bci technicznych.<\/p>\n
Nie oznacza jednak, \u017ce ka\u017cd\u0105 sekwencj\u0119 o d\u0142ugo\u015bci 164 reszt \u2014 ani ka\u017cdy d\u0142ugi peptyd czy bia\u0142ko \u2014 mo\u017cna otrzyma\u0107 z tak\u0105 sam\u0105 \u0142atwo\u015bci\u0105.<\/p>\n
Nie oznacza r\u00f3wnie\u017c, \u017ce oczyszczanie i charakterystyka strukturalna staj\u0105 si\u0119 zb\u0119dne.<\/p>\n
Badanie pokazuje raczej, jakie rezultaty mo\u017cna osi\u0105gn\u0105\u0107 dzi\u0119ki starannie opracowanemu systemowi dla odpowiednio dobranych cz\u0105steczek.<\/p>\n
Automatyzacja kontroluje wykonanie procesu.<\/p>\n
Nie jest jednak w stanie zamieni\u0107 nieodpowiedniej chemii w odpowiedni\u0105.<\/p>\n
Dlatego wydajno\u015b\u0107 aparatury, sekwencj\u0119 peptydu i zachowanie samej cz\u0105steczki nale\u017cy analizowa\u0107 \u0142\u0105cznie.<\/p>\n
Podczas SPPS mo\u017ce wyst\u0119powa\u0107 kilka r\u00f3\u017cnych dr\u00f3g prowadz\u0105cych do powstawania zanieczyszcze\u0144. Ich zrozumienie pomaga wyja\u015bni\u0107, dlaczego ko\u0144cowe badania analityczne s\u0105 nadal konieczne.<\/p>\n
Sekwencja delecyjna lub produkt skr\u00f3cony mo\u017ce powsta\u0107, gdy nie powiedzie si\u0119 planowane przy\u0142\u0105czenie aminokwasu albo gdy wzrost \u0142a\u0144cucha zostanie przerwany. Poniewa\u017c nieprawid\u0142owy \u0142a\u0144cuch mo\u017ce nadal pozostawa\u0107 przy\u0142\u0105czony do \u017cywicy, p\u00f3\u017aniejsze przemywanie nie musi go usuwa\u0107.<\/p>\n
Epimeryzacja oznacza zmian\u0119 konfiguracji stereochemicznej odpowiedniego centrum. Ma to szczeg\u00f3lne znaczenie analityczne, poniewa\u017c epimer mo\u017ce mie\u0107 tak\u0105 sam\u0105 nominaln\u0105 mas\u0119 cz\u0105steczkow\u0105 jak w\u0142a\u015bciwy peptyd, a jednocze\u015bnie r\u00f3\u017cni\u0107 si\u0119 konfiguracj\u0105 przestrzenn\u0105.<\/p>\n
Produkty zwi\u0105zane z aspartimidem mog\u0105 powstawa\u0107 w wyniku zale\u017cnych od sekwencji reakcji ubocznych obejmuj\u0105cych reszty asparaginianu. W zale\u017cno\u015bci od przebiegu chemicznego mo\u017ce powstawa\u0107 wi\u0119cej ni\u017c jeden rodzaj takiego produktu.<\/p>\n
Niepe\u0142ne usuni\u0119cie grup ochronnych wyst\u0119puje wtedy, gdy grupa, kt\u00f3ra powinna zosta\u0107 usuni\u0119ta, pozostaje zwi\u0105zana z cz\u0105steczk\u0105. Peptyd mo\u017ce wi\u0119c mie\u0107 nominalnie oczekiwan\u0105 d\u0142ugo\u015b\u0107 \u0142a\u0144cucha, ale nadal posiada\u0107 nieprawid\u0142ow\u0105 struktur\u0119 chemiczn\u0105.<\/p>\n
Modyfikacje zwi\u0105zane z odszczepianiem mog\u0105 pojawia\u0107 si\u0119 podczas ko\u0144cowego uwalniania peptydu lub usuwania grup ochronnych. Prawid\u0142owe zbudowanie \u0142a\u0144cucha nie gwarantuje wi\u0119c, \u017ce peptyd przejdzie etap odszczepiania bez zmian.<\/p>\n
Niepe\u0142ne reakcje zwi\u0105zane z agregacj\u0105 mog\u0105 natomiast wyst\u0119powa\u0107 wtedy, gdy powstaj\u0105ce \u0142a\u0144cuchy oddzia\u0142uj\u0105 ze sob\u0105 w spos\u00f3b ograniczaj\u0105cy dost\u0119p do miejsc reaktywnych. Wprowadzenie wystarczaj\u0105cej ilo\u015bci odczynnika do naczynia reakcyjnego nie gwarantuje, \u017ce ka\u017cde miejsce reaktywne jest fizycznie dost\u0119pne i ulega odpowiedniej reakcji.<\/p>\n
S\u0105 to mo\u017cliwe drogi powstawania zanieczyszcze\u0144.<\/p>\n
Nie oznacza to, \u017ce ka\u017cda partia otrzymywana metod\u0105 SPPS musi zawiera\u0107 wszystkie wymienione rodzaje nieprawid\u0142owo\u015bci.<\/p>\n
Ich znaczenie w konkretnej syntezie ustala si\u0119 na podstawie wiedzy o procesie, bada\u0144 analitycznych i odpowiedniej kontroli jako\u015bci.<\/p>\n
Niekt\u00f3re peptydy s\u0105 strukturalnie znacznie bardziej z\u0142o\u017cone, ni\u017c wynika\u0142oby to z samej liniowej sekwencji aminokwas\u00f3w.<\/p>\n
Dobrym przyk\u0142adem jest epidermina.<\/p>\n
Charakterystyka strukturalna epiderminy wykaza\u0142a obecno\u015b\u0107 wielu pier\u015bcieni zawieraj\u0105cych siark\u0119 oraz nietypowych reszt. [11]<\/p>\n
Samo odtworzenie liniowej kolejno\u015bci aminokwas\u00f3w nie by\u0142oby wi\u0119c wystarczaj\u0105cym dowodem, \u017ce otrzymano autentyczn\u0105 dojrza\u0142\u0105 epidermin\u0119.<\/p>\n
Rozr\u00f3\u017cnienie to jest wa\u017cne podczas interpretowania publikacji czy wyszukiwa\u0144 dotycz\u0105cych syntezy epiderminy na fazie sta\u0142ej.<\/p>\n
Publikacja mo\u017ce opisywa\u0107 liniowy prekursor, fragment, analog lub inn\u0105 pokrewn\u0105 struktur\u0119, a nie zweryfikowan\u0105 ca\u0142kowit\u0105 syntez\u0119 kompletnej dojrza\u0142ej cz\u0105steczki.<\/p>\n
Publikacja strukturalna cytowana tutaj jako [11] opisuje charakterystyk\u0119 samej epiderminy; nie jest raportem dotycz\u0105cym jej ca\u0142kowitej syntezy metod\u0105 SPPS.<\/p>\n
Twierdzenia o ca\u0142kowitej syntezie nale\u017cy wi\u0119c ocenia\u0107 w odniesieniu do rzeczywistej struktury docelowej cz\u0105steczki, a nie wy\u0142\u0105cznie jej liniowej sekwencji aminokwasowej.<\/p>\n
Trzy poj\u0119cia cz\u0119sto mylone w dyskusjach o syntezie peptyd\u00f3w to wydajno\u015b\u0107, czysto\u015b\u0107 i to\u017csamo\u015b\u0107.<\/p>\n
Du\u017ca masa odzyskanego produktu nie musi oznacza\u0107, \u017ce wi\u0119kszo\u015b\u0107 tego materia\u0142u stanowi zamierzony peptyd. Surowy materia\u0142 mo\u017ce zawiera\u0107 znaczne ilo\u015bci zanieczyszcze\u0144.<\/p>\n
Podobnie wysoka czysto\u015b\u0107 chromatograficzna nie potwierdza automatycznie wszystkich aspekt\u00f3w to\u017csamo\u015bci strukturalnej.<\/p>\n
Nawet peptyd, kt\u00f3rego struktur\u0119 chemiczn\u0105 dok\u0142adnie scharakteryzowano, nie uzyskuje przez to automatycznie potwierdzonego zastosowania biologicznego, terapeutycznego czy klinicznego.<\/p>\n
S\u0105 to odr\u0119bne zagadnienia.<\/p>\n
Rzetelny opis syntezy powinien wi\u0119c wskazywa\u0107, jaka by\u0142a docelowa cz\u0105steczka, na jakim etapie zmierzono wydajno\u015b\u0107, czy analizowany materia\u0142 by\u0142 surowy czy oczyszczony oraz jakie dane analityczne wykorzystano do potwierdzenia twierdze\u0144 dotycz\u0105cych struktury.<\/p>\n
Dzi\u0119ki temu wyniki syntezy mo\u017cna interpretowa\u0107 i por\u00f3wnywa\u0107 w bardziej wiarygodny spos\u00f3b.<\/p>\n
Pojedynczej warto\u015bci procentowej lub warto\u015bci masy nie nale\u017cy przekszta\u0142ca\u0107 w og\u00f3lne stwierdzenie, \u017ce peptyd jest \u201ewysokiej jako\u015bci\u201d, bez wiedzy o tym, co rzeczywi\u015bcie zmierzono.<\/p>\n
Faza sta\u0142a utrzymuje powstaj\u0105cy peptyd na no\u015bniku, podczas gdy rozpuszczalne odczynniki, produkty uboczne reakcji i roztwory przemywaj\u0105ce mog\u0105 by\u0107 wielokrotnie wprowadzane i usuwane. Znacznie upraszcza to powtarzalne sk\u0142adanie \u0142a\u0144cucha i umo\u017cliwia automatyzacj\u0119 syntezy peptyd\u00f3w, czego przyk\u0142adem s\u0105 wsp\u00f3\u0142czesne metody zautomatyzowanej syntezy przep\u0142ywowej. [10] No\u015bnik nie gwarantuje jednak, \u017ce ka\u017cda reakcja przebiegnie idealnie, ani nie oddziela nieprawid\u0142owo zbudowanego \u0142a\u0144cucha zwi\u0105zanego z \u017cywic\u0105 od prawid\u0142owego. Jego podstawow\u0105 zalet\u0105 jest usprawnienie prowadzenia procesu. Selektywno\u015b\u0107 chemiczna, kompletno\u015b\u0107 reakcji, czysto\u015b\u0107 i to\u017csamo\u015b\u0107 strukturalna nadal wymagaj\u0105 osobnej oceny.<\/p>\n
Nie. Nieprawid\u0142owe \u0142a\u0144cuchy peptydowe mog\u0105 pozostawa\u0107 przy\u0142\u0105czone do \u017cywicy podczas syntezy, a nast\u0119pnie zosta\u0107 uwolnione razem z zamierzonym produktem. Badania analizuj\u0105ce surowe produkty SPPS za pomoc\u0105 chromatografii i spektrometrii mas pokazuj\u0105, \u017ce przemywanie podczas syntezy i ko\u0144cowe oczyszczanie pe\u0142ni\u0105 odmienne funkcje. [9] Przemywanie usuwa przede wszystkim rozpuszczalne sk\u0142adniki otaczaj\u0105ce \u017cywic\u0119, natomiast oczyszczanie po odszczepieniu ma oddzieli\u0107 po\u017c\u0105dany peptyd od niepo\u017c\u0105danych sk\u0142adnik\u00f3w peptydowych i niepeptydowych. SPPS upraszcza operacje po\u015brednie, ale nie gwarantuje ko\u0144cowej czysto\u015bci.<\/p>\n
Nie. W konwencjonalnej SPPS nierozpuszczalny no\u015bnik jest zazwyczaj otoczony ciek\u0142ymi odczynnikami i rozpuszczalnikami. Rozpuszczalniki wp\u0142ywaj\u0105 na fizyczne \u015brodowisko \u017cywicy, mi\u0119dzy innymi na stopie\u0144 jej p\u0119cznienia i \u0142atwo\u015b\u0107, z jak\u0105 odczynniki mog\u0105 dociera\u0107 do przy\u0142\u0105czonych \u0142a\u0144cuch\u00f3w. Badania eksperymentalne wykaza\u0142y zale\u017cne od rozpuszczalnika p\u0119cznienie \u017cywic oraz zmiany zwi\u0105zane z chemi\u0105 \u0142\u0105cznika, stopniem podstawienia i wyd\u0142u\u017caniem \u0142a\u0144cucha. [2] \u017bywica i rozpuszczalnik wsp\u00f3lnie tworz\u0105 wi\u0119c \u015brodowisko reakcji.<\/p>\n
Konwencjonalna etapowa SPPS zazwyczaj buduje peptyd od jego reszty C-ko\u0144cowej w kierunku N-ko\u0144ca. Pierwszy aminokwas, kt\u00f3ry ma stanowi\u0107 C-koniec gotowej cz\u0105steczki, jest przy\u0142\u0105czany do no\u015bnika, a kolejne reszty wyd\u0142u\u017caj\u0105 ods\u0142oni\u0119ty koniec aminowy \u0142a\u0144cucha. Opublikowane metody oparte na Fmoc pokazuj\u0105 ten typowy schemat. [1] Istniej\u0105 jednak wyspecjalizowane strategie wykorzystuj\u0105ce faz\u0119 sta\u0142\u0105, kt\u00f3re mog\u0105 przebiega\u0107 inaczej.<\/p>\n
Nie. \u017bywica jest nierozpuszczalnym no\u015bnikiem, natomiast \u0142\u0105cznik stanowi chemiczne po\u0142\u0105czenie pomi\u0119dzy no\u015bnikiem a rosn\u0105cym peptydem. Funkcjonalno\u015b\u0107 \u0142\u0105cznika mo\u017ce niezale\u017cnie od samego polimeru wp\u0142ywa\u0107 na przy\u0142\u0105czenie, zachowanie \u017cywicy oraz p\u00f3\u017aniejsze uwalnianie peptydu. Badania no\u015bnik\u00f3w stosowanych w syntezie peptyd\u00f3w pokazuj\u0105, dlaczego samo okre\u015blenie rodzaju \u017cywicy mo\u017ce nie wystarczy\u0107 do opisania zachowania ca\u0142ego systemu. [2]<\/p>\n
Nie. Wy\u017cszy loading oznacza wi\u0119ksz\u0105 liczb\u0119 potencjalnych miejsc przy\u0142\u0105czenia na okre\u015blon\u0105 ilo\u015b\u0107 no\u015bnika, ale nie musi prowadzi\u0107 do uzyskania wi\u0119kszej ilo\u015bci prawid\u0142owo zbudowanego i mo\u017cliwego do odzyskania peptydu. Stopie\u0144 podstawienia mo\u017ce zmienia\u0107 lokalne \u015brodowisko cz\u0105steczkowe i zosta\u0142 eksperymentalnie wskazany jako jeden z czynnik\u00f3w wp\u0142ywaj\u0105cych na p\u0119cznienie \u017cywicy. [2] Je\u017celi przy\u0142\u0105czone \u0142a\u0144cuchy s\u0105 nadmiernie zag\u0119szczone lub silnie ze sob\u0105 oddzia\u0142uj\u0105, dost\u0119pno\u015b\u0107 reaktywnych miejsc mo\u017ce si\u0119 pogorszy\u0107. Loading nale\u017cy wi\u0119c analizowa\u0107 razem z w\u0142a\u015bciwo\u015bciami \u017cywicy, zachowaniem sekwencji, wydajno\u015bci\u0105 reakcji i jako\u015bci\u0105 produktu ko\u0144cowego.<\/p>\n
Grupy ochronne tymczasowo uniemo\u017cliwiaj\u0105 wybranym grupom reaktywnym uczestniczenie w reakcjach, podczas gdy tworzone jest konkretne wi\u0105zanie. Umo\u017cliwia to kontrolowane, etapowe sk\u0142adanie \u0142a\u0144cucha. Zabezpieczenie nie eliminuje jednak wszystkich reakcji ubocznych. Badania na modelowych uk\u0142adach wykaza\u0142y na przyk\u0142ad, \u017ce strategia grup ochronnych oraz otaczaj\u0105ca sekwencja mog\u0105 wp\u0142ywa\u0107 na powstawanie aspartimidu. [5] Grupy ochronne zapewniaj\u0105 wi\u0119c selektywno\u015b\u0107 chemiczn\u0105, ale ca\u0142a strategia zabezpieczania i odbezpieczania nadal wymaga starannego zaplanowania i oceny.<\/p>\n
Ortogonalno\u015b\u0107 oznacza mo\u017cliwo\u015b\u0107 usuni\u0119cia jednej grupy ochronnej w warunkach, kt\u00f3re pozostawiaj\u0105 inne potrzebne zabezpieczenia w wystarczaj\u0105cym stopniu nienaruszone. Pozwala to ods\u0142ania\u0107 okre\u015blone miejsca reaktywne na zaplanowanych etapach syntezy. Ugruntowane metody SPPS opieraj\u0105 si\u0119 na kontrolowanym zabezpieczaniu i odbezpieczaniu, zamiast jednoczesnego ods\u0142aniania wszystkich reaktywnych grup. [1] Rzeczywista zgodno\u015b\u0107 zastosowanych zabezpiecze\u0144 nadal zale\u017cy jednak od docelowej cz\u0105steczki i warunk\u00f3w reakcji.<\/p>\n
Nie. Fmoc i Boc to grupy ochronne oraz zwi\u0105zane z nimi strategie syntetyczne, a nie r\u00f3\u017cne rodzaje szkieletu peptydowego. R\u00f3\u017cnice w chemii ich usuwania wp\u0142ywaj\u0105 na spos\u00f3b prowadzenia syntezy, ale tymczasowej chemii ochronnej nie nale\u017cy myli\u0107 z ko\u0144cow\u0105 struktur\u0105 docelowego peptydu. Opublikowane metody oparte na Fmoc pokazuj\u0105 jeden z powszechnie stosowanych wariant\u00f3w SPPS, ale nie oznacza to, \u017ce ka\u017cdy peptyd musi by\u0107 otrzymywany t\u0105 metod\u0105. [1]<\/p>\n
Tak. Etap przy\u0142\u0105czania mo\u017ce wp\u0142ywa\u0107 na jako\u015b\u0107 stereochemiczn\u0105 jeszcze przed rozpocz\u0119ciem wielokrotnego wyd\u0142u\u017cania \u0142a\u0144cucha. Opracowano metody analityczne przeznaczone specjalnie do oznaczania racemizacji podczas przy\u0142\u0105czania zabezpieczonych aminokwas\u00f3w do \u017cywic. [3] Nie oznacza to, \u017ce ka\u017cde przy\u0142\u0105czenie powoduje istotn\u0105 racemizacj\u0119. Pokazuje natomiast, \u017ce samo przy\u0142\u0105czenie jest chemicznie istotnym etapem, podczas kt\u00f3rego mog\u0105 pojawi\u0107 si\u0119 mierzalne zmiany wymagaj\u0105ce uwzgl\u0119dnienia w og\u00f3lnej ocenie jako\u015bci.<\/p>\n
Niekt\u00f3re rosn\u0105ce \u0142a\u0144cuchy peptydowe oddzia\u0142uj\u0105 ze sob\u0105 lub z s\u0105siednimi \u0142a\u0144cuchami w spos\u00f3b ograniczaj\u0105cy dost\u0119p do miejsc reaktywnych. Wi\u0105zania wodorowe, oddzia\u0142ywania hydrofobowe i zachowania przypominaj\u0105ce agregacj\u0119 mog\u0105 utrudnia\u0107 p\u00f3\u017aniejsze sprz\u0119ganie. Badania sekwencji podatnych na agregacj\u0119 pokazuj\u0105, \u017ce zmiana sposobu sprz\u0119gania mo\u017ce wp\u0142ywa\u0107 na sk\u0142ad surowego produktu. [4] Trudno\u015b\u0107 syntezy zale\u017cy wi\u0119c od w\u0142a\u015bciwo\u015bci cz\u0105steczki i warunk\u00f3w reakcji, a nie wy\u0142\u0105cznie od d\u0142ugo\u015bci peptydu.<\/p>\n
Nie. Szybko\u015b\u0107 syntezy i jako\u015b\u0107 produktu s\u0105 odr\u0119bnymi parametrami. Ogrzewanie, wspomaganie mikrofalami i automatyzacja mog\u0105 skr\u00f3ci\u0107 czas procesu, ale przyspieszanie reakcji mo\u017ce r\u00f3wnie\u017c zmieni\u0107 r\u00f3wnowag\u0119 pomi\u0119dzy reakcjami po\u017c\u0105danymi i ubocznymi. Badania syntezy wspomaganej mikrofalami wykaza\u0142y zale\u017cn\u0105 od rodzaju reszty racemizacj\u0119 i powstawanie aspartimidu, co wskazuje na konieczno\u015b\u0107 odpowiedniej kontroli warunk\u00f3w. [7] Kr\u00f3tszy czas syntezy jest korzystny tylko wtedy, gdy uzyskany materia\u0142 spe\u0142nia r\u00f3wnie\u017c wymagane kryteria chemiczne i analityczne.<\/p>\n
Nie. Odszczepianie jest procesem chemicznym prowadz\u0105cym do zerwania zaprojektowanego po\u0142\u0105czenia pomi\u0119dzy peptydem a no\u015bnikiem. Usuni\u0119cie ziaren \u017cywicy poprzez filtracj\u0119 jest natomiast operacj\u0105 fizycznego rozdzielenia i samo w sobie nie potwierdza prawid\u0142owego przebiegu chemii odszczepiania. Uwalnianie peptydu mo\u017ce zachodzi\u0107 jednocze\u015bnie z usuwaniem grup ochronnych i innymi reakcjami. Badania scavenger\u00f3w stosowanych podczas odszczepiania pokazuj\u0105, \u017ce etap ten mo\u017ce wp\u0142ywa\u0107 na profil zanieczyszcze\u0144. [8]<\/p>\n
Nie. Wydajno\u015b\u0107 surowa opisuje ilo\u015b\u0107 odzyskanego materia\u0142u przed usuni\u0119ciem wszystkich niepo\u017c\u0105danych sk\u0142adnik\u00f3w. Materia\u0142 ten mo\u017ce zawiera\u0107 docelowy peptyd wraz z sekwencjami delecyjnymi, zmodyfikowanymi strukturami, pozosta\u0142ymi grupami ochronnymi i innymi zanieczyszczeniami. Badania surowych mieszanin SPPS z wykorzystaniem chromatografii i spektrometrii mas pokazuj\u0105, dlaczego odzyskana masa, czysto\u015b\u0107 i to\u017csamo\u015b\u0107 cz\u0105steczkowa wymagaj\u0105 osobnej interpretacji. [9] Rzetelnie przedstawiona wydajno\u015b\u0107 powinna wi\u0119c wskazywa\u0107 etap, na kt\u00f3rym zosta\u0142a zmierzona, oraz to, czy materia\u0142 by\u0142 ju\u017c oczyszczony.<\/p>\n
Tak. Starannie opracowane metody SPPS mog\u0105 umo\u017cliwia\u0107 otrzymywanie bardzo d\u0142ugich \u0142a\u0144cuch\u00f3w. W badaniach nad zautomatyzowan\u0105 syntez\u0105 przep\u0142ywow\u0105 otrzymywano \u0142a\u0144cuchy zawieraj\u0105ce nawet 164 reszty, kt\u00f3re nast\u0119pnie poddawano oczyszczaniu i fa\u0142dowaniu przed ocen\u0105 funkcjonaln\u0105. [10] Pokazuje to mo\u017cliwo\u015bci wsp\u00f3\u0142czesnej syntezy peptyd\u00f3w, ale nie oznacza, \u017ce ka\u017cd\u0105 sekwencj\u0119 o podobnej d\u0142ugo\u015bci mo\u017cna otrzyma\u0107 z jednakow\u0105 wydajno\u015bci\u0105. D\u0142ugo\u015b\u0107 jest tylko jednym z czynnik\u00f3w; znaczenie maj\u0105 r\u00f3wnie\u017c agregacja zale\u017cna od sekwencji, reakcje uboczne, wymagania dotycz\u0105ce fa\u0142dowania i trudno\u015b\u0107 oczyszczania.<\/p>\n
Nie. Dojrza\u0142a epidermina zawiera nietypowe elementy strukturalne, w tym pier\u015bcienie zawieraj\u0105ce siark\u0119, kt\u00f3re wykraczaj\u0105 poza sam\u0105 liniow\u0105 kolejno\u015b\u0107 aminokwas\u00f3w. Zosta\u0142o to wykazane w badaniach strukturalnych. [11] Otrzymanie liniowej sekwencji, prekursora lub fragmentu nie oznacza wi\u0119c automatycznie syntezy kompletnej dojrza\u0142ej cz\u0105steczki. Twierdzenie o syntezie ca\u0142kowitej wymaga danych analitycznych potwierdzaj\u0105cych odtworzenie zamierzonych po\u0142\u0105cze\u0144 i innych istotnych element\u00f3w strukturalnych.<\/p>\n
Nie. Uzyskanie oczekiwanej masy cz\u0105steczkowej stanowi warto\u015bciow\u0105 informacj\u0119, ale sama masa nie potwierdza wszystkich aspekt\u00f3w struktury peptydu i nie wyklucza wszystkich istotnych zanieczyszcze\u0144. Dwie cz\u0105steczki mog\u0105 mie\u0107 t\u0119 sam\u0105 nominaln\u0105 mas\u0119, a jednocze\u015bnie r\u00f3\u017cni\u0107 si\u0119 stereochemi\u0105 lub okre\u015blonym uk\u0142adem strukturalnym. Badania obejmuj\u0105ce rozdzielanie epimerycznych peptyd\u00f3w pokazuj\u0105, dlaczego r\u00f3\u017cnice stereochemiczne mog\u0105 wymaga\u0107 metod analitycznych zdolnych rozr\u00f3\u017cnia\u0107 struktury, kt\u00f3rych nie mo\u017cna odr\u00f3\u017cni\u0107 wy\u0142\u0105cznie na podstawie pomiaru masy. [12] Ko\u0144cow\u0105 charakterystyk\u0119 nale\u017cy wi\u0119c projektowa\u0107 z uwzgl\u0119dnieniem realistycznych zanieczyszcze\u0144 i alternatywnych struktur, kt\u00f3re mog\u0105 powsta\u0107 podczas konkretnej syntezy.<\/p>\n
Synteza peptyd\u00f3w na fazie sta\u0142ej zmieni\u0142a chemi\u0119 peptyd\u00f3w, umo\u017cliwiaj\u0105c utrzymywanie rosn\u0105cego \u0142a\u0144cucha na nierozpuszczalnym no\u015bniku podczas wielokrotnego wprowadzania, przeprowadzania reakcji i usuwania rozpuszczalnych odczynnik\u00f3w. U\u0142atwia to etapowe budowanie sekwencji i stanowi praktyczn\u0105 podstaw\u0119 automatycznej syntezy.<\/p>\n
Pozorna prostota tej metody nie powinna jednak przes\u0142ania\u0107 chemii zachodz\u0105cej na ka\u017cdym etapie.<\/p>\n
\u017bywica, \u0142\u0105cznik i stopie\u0144 podstawienia wp\u0142ywaj\u0105 na istotne w\u0142a\u015bciwo\u015bci \u015brodowiska syntezy. Zale\u017cne od rozpuszczalnika p\u0119cznienie wp\u0142ywa na dost\u0119p do \u0142a\u0144cuch\u00f3w zwi\u0105zanych z \u017cywic\u0105. Grupy ochronne kontroluj\u0105, kt\u00f3re grupy funkcyjne mog\u0105 reagowa\u0107, natomiast reakcje sprz\u0119gania buduj\u0105 szkielet peptydu reszta po reszcie. [1] [2]<\/p>\n
Ka\u017cdy z tych etap\u00f3w ma r\u00f3wnie\u017c swoje ograniczenia.<\/p>\n
Pocz\u0105tkowe przy\u0142\u0105czenie mo\u017ce wp\u0142ywa\u0107 na jako\u015b\u0107 stereochemiczn\u0105. [3] Trudne sekwencje mog\u0105 agregowa\u0107 i ogranicza\u0107 dost\u0119p odczynnik\u00f3w. [4] Chemia zabezpieczania i usuwania grup ochronnych mo\u017ce sprzyja\u0107 reakcjom ubocznym, takim jak powstawanie aspartimidu. [5] [6] Przyspieszone warunki syntezy mog\u0105 zmienia\u0107 stopie\u0144 racemizacji lub profil zanieczyszcze\u0144. [7] Warunki odszczepiania mog\u0105 dodatkowo wp\u0142ywa\u0107 na sk\u0142ad surowego produktu. [8]<\/p>\n
Dlatego prawid\u0142owe zbudowanie \u0142a\u0144cucha nie jest r\u00f3wnoznaczne z uzyskaniem czystego i prawid\u0142owo zidentyfikowanego peptydu.<\/p>\n
Odzyskiwanie surowego produktu, oczyszczanie oraz charakterystyka strukturalna pozostaj\u0105 odr\u0119bnymi etapami. Chromatografia mo\u017ce dostarcza\u0107 informacji o sk\u0142adzie mieszaniny i czysto\u015bci, natomiast spektrometria mas i inne metody analityczne dostarczaj\u0105 informacji o to\u017csamo\u015bci. \u017baden pojedynczy wynik analityczny nie musi potwierdza\u0107 wszystkich aspekt\u00f3w struktury peptydu. [9] [12]<\/p>\n
Wsp\u00f3\u0142czesna zautomatyzowana synteza przep\u0142ywowa pokazuje, \u017ce przy odpowiednio opracowanych warunkach SPPS mo\u017cna stosowa\u0107 nawet do bardzo d\u0142ugich \u0142a\u0144cuch\u00f3w. [10] Jednocze\u015bnie strukturalnie z\u0142o\u017cone peptydy, takie jak epidermina, pokazuj\u0105, dlaczego samo odtworzenie liniowej sekwencji aminokwasowej mo\u017ce by\u0107 niewystarczaj\u0105ce, je\u017celi dojrza\u0142a cz\u0105steczka zawiera dodatkowe pier\u015bcienie, nietypowe reszty lub okre\u015blony uk\u0142ad po\u0142\u0105cze\u0144. [11]<\/p>\n
Najlepiej rozumie\u0107 SPPS nie jako pojedyncz\u0105 reakcj\u0119, lecz jako sekwencj\u0119 odr\u0119bnych etap\u00f3w chemicznych i analitycznych.<\/p>\n
Przy\u0142\u0105czenie wyznacza punkt pocz\u0105tkowy. Powtarzaj\u0105ce si\u0119 cykle zabezpieczania, odbezpieczania i sprz\u0119gania buduj\u0105 zaplanowany \u0142a\u0144cuch. Odszczepianie uwalnia produkt. Oczyszczanie oddziela cz\u0105steczk\u0119 docelow\u0105 od niepo\u017c\u0105danych sk\u0142adnik\u00f3w. Ko\u0144cowa charakterystyka pozwala nast\u0119pnie ustali\u0107, czy wyizolowany materia\u0142 rzeczywi\u015bcie ma przypisywan\u0105 mu struktur\u0119 i jako\u015b\u0107.<\/p>\n
Rozdzielenie tych etap\u00f3w pozwala unikn\u0105\u0107 kilku cz\u0119stych nieporozumie\u0144: udana synteza nie potwierdza automatycznie czysto\u015bci, wysoka wydajno\u015b\u0107 nie potwierdza automatycznie to\u017csamo\u015bci, a oczekiwana masa cz\u0105steczkowa sama w sobie nie dowodzi pe\u0142nej poprawno\u015bci strukturalnej.<\/p>\n
La sintesi dei peptidi in fase solida, pi\u00f9 comunemente definita SPPS (solid-phase peptide synthesis), \u00e8 un metodo chimico per costruire peptidi aminoacidi uno ad uno, mentre l\u2019estremit\u00e0 del catenaccio formato \u00e8 ricoperta da un altro\u2026<\/p>","protected":false},"author":7910,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_monsterinsights_skip_tracking":false,"footnotes":""},"categories":[305],"tags":[],"class_list":["post-56550","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-materialy-edukacyjne","beh-no-thumb"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/bioevidencehub.com\/it\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/56550","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/bioevidencehub.com\/it\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/bioevidencehub.com\/it\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/bioevidencehub.com\/it\/wp-json\/wp\/v2\/users\/7910"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/bioevidencehub.com\/it\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=56550"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/bioevidencehub.com\/it\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/56550\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":56553,"href":"https:\/\/bioevidencehub.com\/it\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/56550\/revisions\/56553"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/bioevidencehub.com\/it\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=56550"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/bioevidencehub.com\/it\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=56550"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/bioevidencehub.com\/it\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=56550"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}