Peptiidide andmebaasid ja disain: kuidas toimivad sõelumine ja ennustamine?

Peptiidide kogu on erinevate peptiidijadade kogum, mis on koostatud või esitatud nii, et neid oleks võimalik süstemaatiliselt võrrelda. Selle asemel, et analüüsida üksikut järjestust ilma laiemata võrdluspunktita, saavad teadlased kasutada raamatukogu, et kontrollida, millised peptiidid seonduvad kindla molekulaarse sihtmärgiga, on ensüümide substraatideks, põhjustavad mõõdetavat reaktsiooni antud testis, sisaldavad teatud motiivi, mida teised molekulid ära tunnevad, või ilmutavad mõnda muud määratletud omadust.

Kõik peptiidiraamatukogud ei ole ühesugused. Need võivad esineda sünteesitud molekulide füüsiliste kogumitena, bioloogilistel kandjatel esitatud peptiididena, kuulikestele või pindadele seotud peptiididena, aga ka täiesti virtuaalsete arvutiga analüüsitavate järjestuste ja molekulaarstruktuuride kogumitena.

Igaüks neist formaatidest annab vastuse veidi erinevatele teaduslikele küsimustele.

Peptiid, mille puhul arvuti ennustas võimalust seonduda teatud valgu külge, ei ole sama, mis peptiid, mis tegelikult sõelumiskatses välja valiti. Samamoodi ei muutu sõelumise käigus esile tõusnud peptiid automaatselt kinnitatud bioloogiliseks kandidaadiks.

Uuringud, milles kasutatakse faagidispleid, sünteetilisi raamatukogusid mikrokuulidel, kattuvaid peptiidide komplekte ning arvutusmeetoditel põhinevaid eksperimente, näitavad üht peptiidide avastamise põhiprintsiipi:

Huvitava signaali leidmine on uurimisprotsessi algus, mitte lõpp.

Lõppjärelduste veenvus sõltub muu hulgas järgmistest teguritest:

• raamatukogu kujunduse ja kvaliteedi osas;
• tegelikku, mitte ainult teoreetilist mitmekesisust;
• testi ülesehitus;
• asjakohased kontrollid;
• molekulaarne identifitseerimine;
• korratavus;
• alternatiivsete selgituste välistamine;
• sõltumatu eksperimentaalne valideerimine. [1] [2] [3]

Seetõttu on peptiidiraamatukogude analüüsimisel mõistlik eristada mitut järjestikust etappi:

andmebaasi ülesehitus → sõelumine → tabamuste tuvastamine → kinnitamine → iseloomustus → ennustamine või optimeerimine → sõltumatu valideerimine.

Igaüks neist etappidest pakub erinevat tõendite taset.

Mis on peptiidide andmebaas?

Süsteemne kogum erinevaid molekulaarseid variante

Peptiidide andmebaas sisaldab omavahel seotud või erinevaid peptiidijärjestusi, mis on koondatud konkreetse uurimisküsimuse ümber.

Mõned andmebaasid on mõeldud teadaoleva peptiidi piires esinevate väikeste muutuste uurimiseks. Teised hõlmavad märksa suuremat võimalike järjestuste valikut.

Raamatukogu üksikud osad võivad erineda järgmiste aspektide poolest:

• peptiidi pikkus;
• aminohapete tüüpi;
• üksikute jääkide asukohad;
• aminohapete järjestus;
• lõpprühmad;
• tsükliseerimine;
• stereokeemia;
• keemilised muudatused;
• muud tahtlikult muudetud struktuurilised omadused.

Raamatukogu peab samuti säilitama võimaluse huvipakkuva elemendi tuvastamiseks.

Peptiidmaatriksi puhul võib peptiidi identiteet olla seotud selle füüsilise asukohaga.

Faagidisplei raamatukogus on esitatud peptiidijada seotud bakteriofaagis sisalduva geneetilise teabega.

Sünteetilises raamatukogus, mis on paigutatud kuulikestele, võib valitud kuulikesel olev peptiid nõuda keemilist identifitseerimist või täiendava kodeerimissüsteemi kasutamist.

Signaali ja molekuli identiteedi vaheline seos on ülioluline.

Tundmatust segust pärinev tugev eksperimentaalne signaal ei anna veel teada, milline molekul selle põhjustas.

Peptiidide kogu väärtus sõltub seega mitte ainult selles sisalduvate kandidaatide arvust, vaid ka seostamisvõimalustest:

kandidaat → identiteet → mõõdetud vastus.

Juhuslikud, suunatud ja süstemaatilised raamatukogud

Erinevad raamatukogude struktuurid on mõeldud erinevatele teaduslikele küsimustele vastamiseks.

Juhuslik või kombinatoorne raamatukogu hõlmab ehituselementide kombinatsioone valitud kohtades.

Mõiste „juhuslik” kirjeldab kavandatud ülesehitust või valimi moodustamist. See ei tähenda, et iga teoreetiliselt võimalik jada esineks tegelikult sama sagedusega.

Sihtotstarbeline raamatukogu piirab variatsiooni järgmiste näitajate ümber:

• tuntud motiivi;
• emapeptiidi;
• kindlaksmääratud struktuurilist raamistikku;
• siduv jada;
• aktiivse piirkonna;
• hüpotees, mis puudutab konkreetset molekulaarset sihtmärki.

Süstemaatiliste asenduste raamatukogu muudab valitud jääke korrastatud viisil.

Näiteks võib ühes positsioonis olevat aminohapet järjest asendada mitme teise aminohappega, et kontrollida, kas see positsioon mõjutab uuritavat omadust.

Kattuvate peptiidide raamatukogu kasutab pikema lähtejada järjestikuseid fragmente, kusjuures naabruses asuvatel fragmentidel on osa ühiseid jääke.

Selline lähenemisviis on eriti kasulik teatavas testis tuvastatavate valgu piirkondade kindlakstegemisel.

Igal strateegial on oma eelised ja piirangud.

Laiaulatuslik kombinatooriline raamatukogu võib paljastada ootamatu järjestusmotiivi.

Sihtotstarbeline raamatukogu võimaldab juba huvipakkuvat jada täpsemalt uurida.

Süstemaatiline asendamine võib näidata, millised punktid tunduvad eriti olulised.

Kattuvate fragmentide raamatukogu aitab leida suurema valgu aktiivse või tuvastatava piirkonna.

Seetõttu:

Järjendite suurem ruum ei tähenda automaatselt paremat eksperimentaalset teavet.

Sobiva raamatukogu tüüp sõltub eelkõige uurimisküsimusest.

Teoreetiline mitmekesisus ei tähenda tegelikku esindatust

Võimalike peptiidijadade hulk kasvab väga kiiresti.

Kui raamatukogu lubab kõiki 20 standardaminohapet igas kuues positsioonis, on võimalike järjestuste teoreetiline arv:

20⁶ = 64 000 000 võimalikku kombinatsiooni.

See on teoreetiline mitmekesisus.

See ei tähenda, et füüsilises raamatukogus oleks tegelikult 64 miljonit erinevat, korrektselt esitatud peptiidi.

Tegelikku mitmekesisust võivad vähendada või moonutada muu hulgas järgmised tegurid:

• sünteesi ebaõnnestumised;
• ebavõrdne sidumise efektiivsus;
• järjestusest sõltuvad sünteetilised raskused;
• bioloogiline valik raamatukogu koostamisel;
• muutuste piirangud;
• erinevused paljunemises;
• korduvad järjestused;
• järjestamisega seotud koormused;
• proovivõtu piirangud;
• üksikute elementide arvu ebavõrdsus.

Oluline on ka see, milline osa kogu andmebaasist konkreetses eksperimendis tegelikult kasutati.

Isegi kui andmekogum sisaldab teoreetiliselt tohutut arvu järjestusi, võib üksik sõelumine hõlmata vaid osa sellest mitmekesisusest.

Kaubandusliku faagiraamatukogu põhjalik sekveneerimine näitas selgeid kõrvalekaldeid ühtlasest esindatusest, sealhulgas erinevusi peptiidide arvus ja järjestuste koostisega seotud koormuses. Teadlased tuvastasid ka tegurid, mis vähendavad raamatukogu efektiivset mahtu. [4]

Need tulemused kehtivad konkreetselt uuritud raamatukogu kohta ning neid ei tohiks kvantitatiivselt automaatselt üle kanda igale faagidisplei-raamatukogule.

Need näitavad siiski üht olulist põhimõtet:

Teoreetilist mitmekesisust ei tohiks käsitleda kui mõõdetud eksperimentaalset mitmekesisust.

Mis on kattuvate peptiidide andmebaas?

Kattuvate peptiidide andmebaas esitab pikema algse järjestuse lühemate fragmentide seeriana.

Kõrvuti asetsevad peptiidid sisaldavad ühist järjestuse osa.

Vaatleme hüpoteetilisi 15 jääki pikkusi lõike:

• järelejäänud 1–15;
• ülejäänud 6–20;
• ülejäänud 11–25.

Iga järgmine peptiid algab viis positsiooni eelmise järel.

See tähendab, et kõrvutiasetsevatel fragmentidel on kümme ühist jääki.

Selline paigutus aitab kindlaks teha piirkondi, mis on seotud äratundmise või mõne muu mõõdetava reaktsiooniga.

Kui kaks kõrvuti asetsevat peptiidi annavad signaali, võib nende ühine järjestus aidata kitsendada edasist uurimist vajavat valdkonda.

See ei tõesta siiski, et:

• iga osa ühises piirkonnas on vajalik;
• juba see ühine jada on piisav tulemuse saavutamiseks;
• on kindlaks tehtud minimaalne aktiivne järjestus;
• see fragment käitub täpselt samamoodi kui vastav piirkond kogu valgus.

Nende küsimuste lahendamiseks võib olla vaja täiendavaid katseid.

Meningokokkide välismembraani valgu uuringus kasutati 45 kattuvat sünteetilist peptiidi, et analüüsida nende äratundmist T-lümfotsüütide poolt inimdoonoritelt pärit rakkudes. [5]

Uuring näitas nii empiirilise peptiidikaardistamise kasulikkust kui ka tol ajal kättesaadavate ennustusalgoritmide piiranguid.

Täheldatud reaktsioonid jäid spetsiifiliseks kasutatud peptiidide komplekti, katsetingimuste ja uuritavatelt doonoritelt pärit proovide suhtes.

Füüsilised ja virtuaalsed raamatukogud annavad vastuseid teistele küsimustele

Mõiste „peptiidide kogum” võib viidata väga erinevatele eksperimentaalsetele süsteemidele.

See eristus on väga oluline:

digitaalne kandidaat ei ole automaatselt sünteesitud molekul, ning sünteesitud molekul ei ole automaatselt eksperimentaalselt valideeritud kandidaat.

Faagidisplay ja sünteetilised raamatukogud

Kuidas seostab faagidisplay peptiidi selle järjestusega?

Faagidisplei-tehnoloogias esitatakse peptiid bakteriofaagi pinnal asuva valgu osana.

Fag sisaldab samal ajal ka esitatud järjestust kodeerivat geneetilist teavet.

Selle tulemusel tekib kasulik seos järgmiste vahel:

fenotüüp – esitatud peptiid

a

genotüüp — sellega vastav geneetiline järjestus.

Teadlased saavad suunata erialase raamatukogu tegutsema kindla eesmärgi või testsüsteemi suunas, eraldada valitud osakesed, neid paljundada või analüüsida ning kindlaks teha, millised järjestused on rikastunud.

Seos geneetilise teabega hõlbustab kandidaatide identifitseerimist märkimisväärselt võrreldes identifitseerimata molekulaarse segu analüüsiga.

Varased uuringud, milles kasutati niitfaagidel esitatud juhuslikke peptide, näitasid võimalust rikastada kõrge afiinsusega antikeha ligande ning võrdlesid faagidel esitatud peptiidide käitumist keemiliselt sünteesitud peptiidide sidumistulemustega. [1]

See võrdlus oli eriti oluline, kuna faagi osakesel asuv peptiid ja sellega vastavuses olev isoleeritud sünteetiline peptiid ei kujuta endast identseid eksperimentaalseid esitusviise.

Rikkuse tekkimine on valiku tulemus, mitte aga selle mehhanismi täielik selgitus

Jada, mille osakaal järgnevates valikuetappides suureneb, nimetatakse sageli rikastatud jadaks.

Rikastumine on oluline teave.

See ei selgita aga automaatselt, miks just see järjestus on muutunud arvukamaks.

Võimalikud põhjused on järgmised:

• seos kavandatud eesmärgiga;
• kinnitumine katses kasutatud pinnaga;
• koostoime eksperimendi mõne teise elemendiga;
• parem kohanemine valikutingimustega;
• suurem nakkavus;
• tõhusam paljunemine;
• eelis levimisel;
• muu omadus, mis sõltub järjestusest või konkreetsest kloonist.

Need on teaduslikult erinevad selgitused.

Ühes uuringus tuvastati faagi kloon, mille rikastamine oli seotud genoomi deleetsioonist tuleneva paljunemisülekaaluga. [6]

Teises uuringus analüüsiti kõnealust peptiidi, mis seondus polüstüreeniga, mitte aga kavandatud sihtmärgiga. [7]

Need uuringud näitavad kahte erinevat mehhanismi, mille kaudu võib tekkida uuringu tegeliku eesmärgiga mitteseotud andmete rikastamine.

See ei tähenda, et iga rikastatud faagi järjestus oleks artefakt.

See näitab aga, miks:

rikastamine viitab kandidaadile, mis vajab selgitamist; see iseenesest ei tõenda molekulaarse sihtmärgi spetsiifilist tuvastamist.

Esitamisviis võib mõjutada täheldatud seost

Faagidisplei süsteemis esitatud peptiid on füüsiliselt seotud kandjaga.

Seega võib selle käitumine erineda sama molekuli käitumisest, mis asub vabalt lahuses.

Siinkohal on oluline mõiste „avidus”.

Afiliatsioon viitab tavaliselt konkreetse mudeli raames toimuva üksiku interaktsiooni tugevusele.

Kadedus võib aga tuleneda paljudest samaaegselt toimuvatest vastastikmõjudest.

Kui mitu esitatud peptiidi koopiat mõjutavad samaaegselt mitut seondumiskohta, võib nende koostoime tunduda tugevam kui ühe vaba peptiidi mõju eraldi.

Andmekandjaga ühendamine võib samuti:

• piirata peptiidi konformatsiooni;
• muuta selle kättesaadavust;
• suurendada kohalikku kontsentratsiooni;
• mõjutada orientatsiooni;
• põhjustada steriilseid efekte;
• paigutada mitu peptiidi koopiat üksteise lähedale.

Seetõttu võib esitussüsteemis tõhusalt valitud peptiid käituda teisiti pärast iseseisvat sünteesi.

Just seetõttu on isoleeritud molekuli uurimine oluline kinnitav etapp.

Fagidel esitatud ligandite võrdlus nende keemiliselt sünteesitud vastetega faagidisplei varastes uuringutes näitab hästi, kui oluline on seostada selektsiooni tulemus molekuli sõltumatu käitumisega. [1]

Sünteetilised raamatukogud võivad hõlmata teistsugust keemilist ruumi

Sünteetilised peptiidiraamatukogud luuakse keemiliste meetoditega, mitte ainult bioloogilise ekspressiooni teel.

Sõltuvalt kasutatud sünteesimeetodist võivad need potentsiaalselt hõlmata:

• ebatüüpilised aminohapped;
• valitud D-aminohapped;
• otsade muudatused;
• tsükliseerimine;
• keemilised märgid;
• modifitseeritud külgahelad;
• muud sünteetilised ehitusmaterjalid.

See võimaldab laiendada uurimiseks kättesaadavat keemilist ruumi.

Ainuüksi järjestuse kavandamine arvutitabelis või arvutiprogrammis ei tõenda siiski, et vastavat molekuli on võimalik hõlpsalt ja õigesti saada.

Praktilised probleemid võivad hõlmata järgmist:

• ebatäielik sidumine;
• deleetsioonijadad;
• agregatsioon;
• puhastamisega seotud raskused;
• halb lahustuvus;
• kõrvaltoimed;
• modifikatsioonide ebastabiilsus;
• järjestusest sõltuvad sünteetilised probleemid.

Seetõttu:

projekteeritud keemiline mitmekesisus ≠ eksperimentaalselt tõestatud keemiline mitmekesisus.

Geneetiliselt kodeeritud esitussüsteemid ja keemiline süntees hõlmavad seega osaliselt kattuvaid, kuid mitte identsed molekulaarruume.

Modifitseeritud esitustehnoloogiad võivad veelgi laiendada bioloogilistes süsteemides kättesaadava keemia ulatust, mistõttu ei tohiks seda eristust lihtsustada väitega, et bioloogilised raamatukogud võivad sisaldada ainult modifitseerimata standardpeptiide.

„Üks helmes – üks ühend” raamatukogud

One-bead–one-compound (OBOC) raamatukogus peaks iga helmes põhimõtteliselt sisaldama mitmeid koopiaid ühest konkreetsest ühendist.

Üks sagedamini kasutatavaid strateegiaid on split-and-pool-tüüpi süntees.

Kuulid jagatakse rühmadesse, iga rühm viiakse läbi reaktsiooni teise ehituselemendiga, seejärel ühendatakse kõik kuulid uuesti ja jagatakse enne järgmist sünteesi etappi uuesti.

Selle protsessi kordamine võib viia suure kombinatoorse raamatukogu tekkimiseni, säilitades samal ajal kavandatud seose ühe kuuli ja konkreetse jada vahel.

Esimesed uuringud, mis käsitlesid „one-bead–one-peptide” süsteemi, tutvustasid meetodit suurte sünteetiliste peptiidide kogumite loomiseks ja sõelumiseks ligandide seondumise seisukohast. [2]

Mõiste „one bead–one compound” kirjeldab siiski raamatukogu korralduse põhimõtet.

See ei tõenda, et:

• iga kuul sisaldab keemiliselt täiuslikku peptiidi;
• iga kuulike on peptiidiga ühtmoodi koormatud;
• kõik sidumisreaktsioonid toimusid sama tõhususega;
• iga kuulikesel olev peptiid on võrdselt kättesaadav.

Hilisemal üksikute pallikeste uuringul kasutati peptiidi koguse hindamiseks Ramani spektroskoopiat.

Teadlased täheldasid raamatukogu pallide vahel märkimisväärset varieeruvust, eriti pikemate järjestuste puhul, hoolimata algmaterjali ühtlasemast koormusest. [8]

See on oluline, kuna signaali tugevus sõelumise ajal võib sõltuda nii:

vastastikmõju jõud,

ning alates:

kuulil esitatud kättesaadava peptiidi kogus.

Maatriksid, individuaalselt sünteesitud komplektid ja pulgaanalüüsid

Peptiidiraamatukogusid võib korraldada ka maatriksina või eraldi sünteesitud kogumitena.

Peptiidimatriisis asuvad määratletud peptiidid teadaolevates füüsilistes asukohtades.

See tagab otsese ühenduse:

asukoht → jada identiteet → testsignaal.

Siiski tuleb meeles pidada, et peptiidi pinnale kinnitumine võib mõjutada selle konformatsiooni ja kättesaadavust.

Teine võimalus on pulseeriv sõelumine.

Mitu peptiidi ühendatakse üheks prooviks ja analüüsitakse koos.

Kui kogum annab positiivse vastuse, võib seejärel teostada selle dekonvolutsiooni, testides väiksemaid rühmi või üksikuid elemente.

Andmete koondamine võib vähendada algfaasis vajalike mõõtmiste arvu.

Pula ei käitu aga alati täpselt samamoodi kui iga üksik komponent.

Mõju võivad avaldada:

• kontsentratsioonide erinevused;
• konkurents;
• lahustuvus;
• agregatsioon;
• häired;
• antagonistlikud toimed;
• katse küllastus.

Positiivne tulemus viitab seega rühmale, mis vajab täiendavaid uuringuid.

See ei tõenda, et igal selles sisalduval peptiidil oleks uuritud omadus.

Kandidaatide eelvalik ja valik

Määra kõigepealt kindlaks, mida see test tegelikult mõõdab

Sõeluuringu tulemuse tähtsus sõltub täielikult mõõdetavast lõpptulemusest.

Seondumise sõelumine annab vastuse küsimusele, kas peptiid seondub kindla sihtmärgiga antud tingimustes.

Enüümsete substraatide sõelumine uurib, kas ensüüm muundab kindlat peptiidi.

Inhibitsioonitestiga kontrollitakse, kas peptiid vähendab teatavat aktiivsust.

Rakutest mõõdab rakkudes kindlaksmääratud reaktsiooni.

Need tulemused ei ole võrdsed.

Peptiid võib sihtmärgiga seonduda, ilma et seda aktiveeriks või pärsiks.

See võib olla ensüümi substraat, kuid ei pruugi rakusüsteemis asjakohast käitumist ilmutada.

Rakkude reaktsioon võib aga tuleneda tahtmatust signaaliteest.

Seetõttu on mõiste „aktiivne peptiid” sageli liiga lai, kui ei ole täpsustatud, millist tüüpi aktiivsust tegelikult mõõdeti.

Masinõpet kasutavas iteratiivses uuringus optimeeriti peptiidsubstraate teatud ensüümiklassi jaoks, testides valitud kandidaate korduvalt eksperimentaalselt. [3]

Järeldused puudutasid selles konkreetses süsteemis mõõdetud biokeemilisi funktsioone.

Need ei tõenda, et samad järjestused sobiksid ka muudes, sellega mitteseotud bioloogilistes rakendustes.

Kontrollid aitavad eristada sihtmärgi tuvastamist testi enda käitumisest

Õigesti valitud kontrollid aitavad eristada kavandatud molekulaarset nähtust muudest võimalikest selgitustest.

Sõltuvalt testist võivad need olla:

• pinnad, millel puudub sihtmolekul;
• kontrollid, mis hõlmavad ainult andmekandjat;
• mitte seotud molekulaarsed eesmärgid;
• positiivsed tulemused;
• negatiivsed kontrollid;
• taustmõõtmised;
• konkurentsikatsed;
• muud konkreetsele süsteemile omased kontrollid.

Pind, millel puudub sihtmolekul, võib näidata mittespetsiifilist seost katsematerjaliga.

Kandja kontrollimine aitab avastada vastuseid, mis on tingitud esitlussüsteemist endast.

Seosetu sihtmärk võib anda teavet selektiivsuse kohta.

Positiivne kontroll näitab, kas test suudab tuvastada teadaolevat tulemust.

Negatiivne kontroll aitab määrata taustataseme.

Kontrollid tuleks siiski valida vastavalt asjaomase katse tegelikele võimalikele veaallikatele.

Ei ole olemas üht universaalset kontrollpeptiidi, mis oleks igas võimalikus süsteemis bioloogiliselt neutraalne.

Polüstüreeniga seonduvate faagide uuring näitab, miks pindade kontrollimine on oluline. Teadlased analüüsisid eraldi seondumist ja paljunemist ning seostasid rikastumise katsepinnaga toimuva vastasmõjuga, selle asemel et eeldada, et faagi taaskasutamine tõendab sihtmärgi äratundmist. [7]

Sarnasus, selektiivsus ja funktsioon on erinevad omadused

Kolm mõistet, mida sageli omavahel segi aetakse, on:

sugulus, selektiivsus ja funktsioon.

Afiliatsioon viitab vastastikmõju tugevusele teatud tingimustes ja asjakohase mõjumudeli raames.

Selektiivsus kirjeldab, mil määral kandidaat suhtleb eelistatult ühe eesmärgiga võrreldes asjakohaste alternatiividega.

See funktsioon käsitleb sellise mõju bioloogilisi või biokeemilisi tagajärgi.

Seega võib peptiidil olla järgmised omadused:

• kõrge afiinsus, kuid madal selektiivsus;
• kõrge selektiivsus, kuid nõrk seondumine;
• tugev side, millel puudub oodatud funktsionaalne mõju;
• funktsionaalset aktiivsust ootamatu mehhanismi kaudu.

Need eristused määravad, milliseid katseid tuleks järgmisena läbi viia.

Näiteks:

näidatud sidumine ≠ näidatud pidurdamine.

Seondumise sõelumisel leitud peptiidi ei tohiks automaatselt nimetada inhibiitoriks, kui selle pärssivat toimet ei ole otseselt mõõdetud.

Kandidaate tasub hinnata mitme liiki andmete põhjal

Kandidaatide valik on usaldusväärsem, kui see ei tugine ainult ühele hindamisparameetrile.

Võib arvesse võtta muu hulgas järgmist:

• signaali tugevus;
• korratavus;
• taust säilitamine;
• järjestuse identiteet;
• kasv võrreldes algväärtusega;
• selektiivsus;
• järjestuste perekond;
• võimalus iseseisvaks sünteesiks;
• lahustuvus;
• katse korratavus;
• võimalus edasiseks valideerimiseks.

Kasulikuks võib osutuda ka valitud tabamuste järjestuslik mitmekesisus.

Mitme erineva järjestuse perekonna esindajate uurimine vähendab sõltuvust ühest potentsiaalselt eksitavast motiivist või kloonist.

Erialaraamatukogude puhul on eriti kasulik võrrelda raamatukogu fondide suurust enne ja pärast valikut.

Jada, mis esines juba lähteproovis väga sageli, võib pärast sõelumist olla arvukalt esindatud ilma eriti tugeva eesmärgipõhise rikastamiseta.

Naivse faagiraamatukogu sügavsekveneerimise uuring näitas, et esialgne esindatus oli ebaühtlane. [4]

Paljunemise eeliseid käsitlev uuring näitab lisaks, miks arvukust ei tohiks automaatselt tõlgendada suguluse mõõdupuuna. [6]

Kokkuvõttes viitavad need tulemused järgmisele analüüsile:

kuidas antud jada on täiendatud,

ja mitte ainult:

milline järjestus saavutas valiku lõppedes esimese koha.

Sõelumisel leitud juhtum ei ole veel kinnitatud kandidaat

Tulemus ehk tabamus on kandidaat, kes vastab esialgse sõelumise kriteeriumidele.

See on väärtuslik tulemus.

See ei lõpeta siiski valideerimisprotsessi.

Kinnitus peaks muu hulgas andma vastuse küsimusele, kas kandidaadi käitumine:

• on korratav;
• püsib pärast asjakohaste kontrollimeetmete rakendamist;
• ilmneb individuaalse läbivaatuse käigus;
• jääb nähtavaks pärast uuesti sünteesimist;
• võib omistada kavandatud molekulile;
• on oluline asjakohases järelkontrollis.

Edasised iseloomustused võivad seejärel hõlmata konkreetse uurimiseesmärgi seisukohalt olulisi omadusi.

Uuesti sünteesimine on eriti kasulik, kui esialgses sõelumises kasutati kandjat, kuuli, esitussüsteemi või segu.

Sõltumatu kokkuvõte võimaldab eraldada kandidaati tema esialgsest esitusviisist.

Proovi identiteedi ja muude oluliste parameetrite kinnitamine tugevdab veelgi seost vaadeldud tulemuse ja uuritava molekuli vahel. Siinkohal on eriti oluline õige tõlgendamine peptiidide puhtus ja laboratoorsed uuringud, kuna HPLC tulemus, massi kinnitus ja peptiidi tegelik sisaldus annavad vastuseid erinevatele analüütilistele küsimustele.

Seega on õige järjekord järgmine:

positiivne tulemus sõelumisel → kinnitatud positiivne tulemus → iseloomustatud kandidaat,

mitte aga:

positiivne tulemus sõelumisel → tõestatud funktsionaalne peptiid.

Hea tulemus edetabelis, visuaalselt veenev dokkimudel või sarnase tulemuse korduv saavutamine samas veatundlikus testis ei asenda automaatselt sõltumatut valideerimist.

Järjekordade kavandamine ja ennustusvahendid

Projekteerimine algab molekulaarse eesmärgi määratlemisest

Peptiidi disainimine võib alguse saada järgmiselt:

• tuntud motiivi;
• emapeptiidi;
• valkude mõjupiirkond;
• eksperimentaalselt saadud tulemus;
• struktuurimudeli;
• evolutsioonijada;
• uuritud peptiidide andmekogu.

Seejärel saab analüüsida selliseid muutusi nagu:

• aminohapete asendused;
• järjestuse lühendamine;
• järjestuse pikendamine;
• tsükliseerimine;
• otsade muudatused;
• aminohapete järjestuse muutus;
• muud struktuurilised muudatused.

Eesmärk peab olema selgelt määratletud.

Näiteks:

sideme ennustamine

ei ole sama ülesanne kui:

ensüümi poolt äratundmise ennustamine,

ja see omakorda ei ole sama mis:

lahustuvuse prognoosimine.

Üht omadust parandav muudatus ei pruugi mõjutada teist omadust või võib isegi avaldada sellele kahjulikku mõju.

Peptiidide praktiline disain võib seega nõuda mitme omavahel konkureeriva eesmärgi tasakaalustamist.

Enüümsete substraatide eksperimentaalselt toetatud uuring näitas sihipärast lähenemisviisi, mille puhul algoritm pakkus välja kandidaate, biokeemilised katsed hindasid neid ning saadud tulemused mõjutasid järgmisi järjestuse valikuga seotud otsuseid. [3]

Arvutused toetasid konkreetset eksperimentaalset eesmärki, kuid ei asendanud mõõtmisi.

Järjendipõhine ennustus sõltub treeningandmetest

Järjendil põhinev arvutimudel õpib ära seoseid peptiidide omaduste ja treeningandmestikus leiduvate märgiste või mõõtmistulemuste vahel.

Sõltuvalt mudelist võib tulemuseks olla:

• klassifikatsioon;
• tõenäosusele sarnane tulemus;
• reitinguväärtus;
• eeldatav kvantitatiivne omadus;
• teist tüüpi arvutipõhine hindamine.

Tõlgendus sõltub sellest, mida treeningu ajal kasutatud märgistused tegelikult tähendasid.

Näiteks võib mõiste „aktiivne” tähendada:

• seos, mis ületab kindlaksmääratud künnise;
• ensüümi poolt toimuv muundamine;
• mikroobivastane toime;
• rakulise reaktsiooni;
• muu konkreetse testi puhul kehtiv kriteerium.

Need omadused ei ole samaväärsed.

Andmekogumid võivad sisaldada ka erinevates katsetingimustes saadud tulemusi.

Uurimata peptiidi ei tohiks automaatselt käsitada kinnitatud negatiivse tulemusena ainult seetõttu, et selle kohta puudub positiivne tulemus.

Samavõrd oluline on mudeli hindamine.

Kui peaaegu identsed järjestused esinevad nii treening- kui ka testandmestikus, võib ennustamisülesanne olla märksa lihtsam kui tõeliselt uute peptiidide omaduste ennustamine.

Seetõttu:

Mudeli kõrge üldine täpsus ei tõesta iseenesest võimet üldistada tulemusi uutele järjestustele.

Üldistamine nõuab teadlikku hindamist

Üldistamine kirjeldab mudeli võimet säilitada kasulikkus ka väljaspool treeningu käigus kasutatud näiteid.

See on eriti oluline juhul, kui pakutav peptiid erineb treeningandmetest märkimisväärselt järgmistes aspektides:

• järjestus;
• pikkus;
• struktuuriklassi;
• keemilised muudatused;
• molekulaarne sihtmärk;
• eksperimentaalne kontekst.

Uuringus, mis käsitles T-lümfotsüütide retseptori sidumise ennustamist, analüüsiti treening- ja testpeptiidide vaheliste erinevuste mõju mudelite hindamisele. [9]

Järjendite ja struktuuride sarnasusel põhinevad andmekogumite jaotused ei andnud identset tulemust.

See näitab, miks treening- ja testandmete lihtne jagamine või üksainus mudeli tõhusust kirjeldav väärtus ei pruugi täielikult kajastada mudeli käitumist uute peptiidide suhtes.

See ei tähenda, et peptiidide ennustusmudelid oleksid oma olemuselt ebausaldusväärsed.

See tähendab aga, et nende hindamise viis peaks sarnanema tegeliku kasutusega, milleks neid kavandatakse.

Mida hõlmab peptiidide dokkimine?

Peptiidide dokkimine on arvutipõhine meetod, mille abil pakutakse välja, kuidas peptiid võib mõjutada retseptorit või muud molekulaarset sihtmärki.

Arvutused võivad analüüsida erinevaid:

• peptiidi konformatsioonid;
• suunad;
• positsioonid;
• kontaktid retseptoriga;
• mõju geomeetria.

Seejärel hinnatakse pakutud skeeme asjakohase punktifunktsiooni või energiatõhususe funktsiooni abil.

Dokkimise tulemus võib seega pakkuda:

• potentsiaalne sidumiskoht;
• interaktsioonis osalevate pakutud jääkide;
• struktuurihüpoteesid;
• kandidaatide edetabel;
• algstruktuurid edasisteks arvutianalüüsideks.

Siiski tuleb meeles pidada:

dokkimisest väljaspool on see vaid hüpotees, mitte eksperimentaalselt täheldatud kompleks.

Samamoodi:

dokkimise punktiskoor ei ole automaatselt eksperimentaalselt mõõdetud dissotsiatsioonikonstant, rakulise aktiivsuse näitaja ega bioloogilise edu tõenäosus.

Tõlgendus sõltub järgmistest teguritest:

• punktfunktsioon;
• konformatsiooni proovivõtmise viis;
• retseptori struktuurid;
• retseptori paindlikkus;
• peptiidi elastsus;
• esialgsed eeldused;
• protonatsioon ja molekulaarne esitus;
• kalibreerimine konkreetse ülesande jaoks.

Peptiidide dokkimine võib olla eriti keeruline, kuna peptiidid on sageli väga paindlikud.

Seostumise käigus võivad oluliselt muutuda nii nende konformatsioon kui ka asend sihtmärgi suhtes.

Rosetta FlexPepDock: täpsustamine ja globaalne dokkimine on erinevad protseduurid

FlexPepDocki serverit käsitlev esialgne publikatsioon kirjeldab mudeli kõrglahutusega täiustamist, mis algab peptiidist, mis asub ligikaudselt retseptori sidumispiirkonnas. [10]

Seega ei tohiks seda vahendit kirjeldada lihtsalt universaalse meetodina, mis võimaldab avastada mis tahes tundmatut sidumiskohta ilma struktuurilise teabeta.

PIPER-FlexPepDock laiendab seda kontseptsiooni globaalse dokkimise suunas, ühendades peptiidifragmentide paigutamise mudeli hilisema paindliku täiustamisega. [11]

Kõnealuses väljaandes hinnati seda meetodit piiratud, kuid representatiivse eksperimentaalselt määratletud peptiid-valgu komplekside kogumi põhjal.

Edu võrdlustestis näitab tulemuslikkust testitud tingimustes.

See ei taga õiget ennustust iga uue retseptori-peptiidi paari puhul.

Rosetta ametlikus dokumentatsioonis eristatakse järgmisi:

• täpsustamine;
• ab initio modelleerimine ligikaudse sidumiskoha läheduses;
• PIPER-FlexPepDocki globaalne töövoog. [12]

Seetõttu muutub arvutiaruanne palju informatiivsemaks, kui selles on märgitud:

millist FlexPepDocki protokolli kasutati + milliseid algandmeid kasutati + kuidas saadud struktuure hinnati.

Juba see väide:

„Rosetta dokkimine viidi läbi”

jätab paljud olulised metoodilised üksikasjad määratlemata.

Modifitseeritud peptiidid vajavad asjakohast esitusviisi

Arvutimudel peab uuritavat molekulaarstruktuuri õigesti kujutama.

Ainult standardseid ühetähelisi aminohappe koode kasutades kirjutatud järjestus võib jätta välja olulist keemilist teavet.

Need võivad olla muu hulgas järgmised:

• C-otsa amideerimine;
• N-otsa atsetüülimine;
• ebatüüpilised aminohapped;
• D-aminohapped;
• tsükliseerimine;
• kovalentsed ristlülid;
• fosforüülimine;
• muud muudatused.

FlexPepDocki abil läbi viidud uuringus analüüsiti peptiid-MHC modelleerimist, hõlmates mittestandardseid jääke ja valitud peptiidimodifikatsioone. [13]

Autorid said kasulikke võrdlustulemusi ning täheldasid seost arvutatud tulemuste ja uuritud valimis eksperimentaalselt mõõdetud suhtelise seondumise vahel.

See toetab konkreetseid modelleerimise rakendusi, mida on testitud.

See ei tähenda aga, et iga võimalik modifikatsioon oleks automaatselt õigesti esindatud ega seda, et dokkimine asendaks eksperimentaalset sidemõõtmist.

CHARMM-GUI, peptiidimudelid ja C-otsa amidatsioon

CHARMM-GUI pakub tööriistu molekulaarsete struktuuride ettevalmistamiseks simulatsioonideks.

Ametlikes dokumentides rõhutatakse, et modifitseeritud jäägid nõuavad asjakohaseid struktuurimääratlusi ja jõuvälja parameetreid. [14]

Simulatsiooni sisendandmete edukas genereerimine tähendab seega, et süsteemi arvutimudel on valmis.

Seda ei ole eksperimentaalselt tõestatud:

• peptiidi identiteet;
• lahendused;
• bioloogiline funktsioon;
• stabiilsus;
• tegevused.

C-otsas amiditud peptiidi puhul on lõpprühm amid, mitte vaba karboksüülrühm.

See erinevus võib mõjutada:

• formaalne koormus;
• vesiniksidemed;
• elektrostaatilised mõjud;
• konformatsioon;
• koostoimed ümbritseva molekulaarse keskkonnaga.

Simulatsioonis kasutatav jõuvälja struktuur, topoloogia ja parameetrid peaksid seega kajastama sama lõplikku vormi, mida eksperimentaalselt uuritakse.

Maximin H5-i uurimisel kombineeriti eksperimentaalseid ja simulatsioonimeetodeid, et hinnata C-otsa vormi muutuse tagajärgi. [15]

Selle konkreetse peptiidi puhul täheldati erinevusi struktuuris ja mõjusid membraanidele.

See ei tähenda, et amidatsioon parandaks iga peptiidi omadusi.

See näitab aga, miks molekuli kirjeldamisel ei tohiks lõpprühmade keemiat tähelepanuta jätta.

Seetõttu peaks amidatsiooni võimaluste otsimine peptiidide sünteesiprogrammis algama järgmisest keemilisest küsimusest:

Millist molekulistruktuuri täpselt tuleb modelleerida?

Alles pärast selle küsimuse selgitamist omandab tarkvara seadistuste valik tähtsuse.

Eksperimentaalne valideerimine ja korratavus

Uurige asjaomast molekuli iseseisvalt

Valitud kandidaat tuleks lõpuks uurida määratletud molekulaarse materjalina.

Olulised omadused võivad hõlmata järgmist:

• täpne järjestus;
• lõppude vorm;
• teatavad muudatused;
• molekulaarne identiteet;
• muud eksperimendi seisukohalt olulised omadused.

Kui esialgses sõelumises kasutati faagidispleid või kuulikestele kinnitatud peptiide, võib järgmiste katsete käigus kontrollida, kas isoleeritud peptiid säilitab mõõdetud omaduse väljaspool esialgset esitussüsteemi.

Ühes varases faagidisplei uuringus võrreldi faagidel esitatud peptideid nende keemiliselt sünteesitud vastetega. [1]

See näitab, kuidas sõltumatu uuring võib ühendada raamatukogu valiku tulemuse peptiidimolekuli enda käitumisega.

Oluline on ka proovi kvaliteet ja omadused.

Erinevused seoses:

• määratud kontsentratsiooniga;
• lahustuvus;
• puhastus;
• agregatsioon;
• lõplik vorm;
• keemilised muudatused

võivad mõjutada eksperimentaalseid võrdlusi.

Kaks proovi, mida tähistatakse sama peptiidinimega, ei pruugi olla keemiliselt ekvivalentsed, kui nende vastavaid molekulivorme ei ole määratletud. Seetõttu on enne eksperimendi tulemuste tõlgendamist kasulik eristada mõisteid „identiteet”, „puhtus” ja „materjali tegelik kogus”, mida on põhjalikumalt käsitletud artiklis teemal peptiidide puhtus ja laboratoorsed uuringud.

Täiendav test on kõige väärtuslikum siis, kui see annab vastuse konkreetsele küsimusele

Ortogonaalne test uurib teatavat omadust, kasutades teistsugust mõõtmispõhimõtet või teistsugust eksperimentaalse esituse viisi.

Selle suurim väärtus on võimalus kontrollida konkreetset alternatiivset selgitust.

Teine test võib näiteks aidata kindlaks teha, kas esialgne tulemus tulenes:

• pinnaga seotud;
• märgi interferents;
• andmekandjast sõltuv käitumine;
• liikumisvõimetuse tagajärjed;
• muu esimesele katsele iseloomulik artefakt.

Kahe erineva seadmemudeli kasutamine ei tähenda veel seda, et mõõtmised oleksid ortogonaalsed.

Kui mõlemad testid kasutavad sama kinnitusmeetodit või sama tuvastuspõhimõtet, võivad need olla tundlikud sama veaallika suhtes.

Kõige olulisem küsimus on:

Millist alternatiivset selgitust kontrollib teine eksperiment?

Tõeliselt teineteist täiendavate meetodite vaheline kooskõla pakub tavaliselt tugevamat tuge kui sama veaprobleemidele altis lugemise korduv kordamine.

Replikatsioon ja bioloogiline kontekst

Erinevad replikatsiooni liigid võimaldavad hinnata erinevaid ebakindluse allikaid.

Tehnilised kordused aitavad hinnata tulemuste korratavust sama katseseadistuse raames.

Katset sõltumatult korrates võib arvesse võtta täiendavat variatsiooni valmististe või katseseeriate vahel.

Bioloogilisi proove kasutavates katsetes võib olla vaja arvesse võtta ka erinevusi järgmiste vahel:

• doonorid;
• rakkude ettevalmistamisega;
• organismidega;
• kudedega;
• muudest bioloogilise materjali allikatest.

Uuringus, milles kasutati kattuvaid peptide, analüüsiti T-lümfotsüütide poolt doonoritelt pärit proovides toimuvat tunnustamist ning kasutati raamatukogu tunnustatud piirkondade identifitseerimiseks. [5]

Vaadeldud reaktsioonid sõltusid bioloogilisest kontekstist.

Ühe doonori või ühe katsesüsteemi puhul saadud tulemust ei tohiks automaatselt üldistada iga inimese või iga bioloogilise süsteemi kohta.

Korduvus tähendab seega võimalust konkreetne väide asjakohaselt kirjeldatud tingimustes uuesti esile tuua.

See ei tähenda lihtsalt järjekordse sarnase välimusega graafiku saamist.

Dokumentatsioon peaks võimaldama analüüsi taasesitamist

Peptiidide andmebaasi põhjalik uurimine eeldab piisavat dokumentatsiooni, et teine teadlane saaks aru, kuidas tulemus saadi.

Kasulikud eksperimentaalsed andmed hõlmavad järgmist:

• peptiidi täpne järjestus;
• peptiidi pikkus;
• lõpprühmad;
• keemilised muudatused;
• raamatukogu arhitektuur;
• proovide identifikaatorid;
• sõelumise tingimused;
• mõõdetav lõpp-punkt;
• kontrollid;
• korduste struktuur;
• taustamääramise viis;
• tabamuse kvalifitseerimiskünnis;
• kandidaatide valikukriteeriumid;
• kasutatud analüüsimeetodid.

Arvutiuuringutes võivad olulised olla järgmised aspektid:

• tarkvara nimi;
• versioon;
• protokoll;
• sisendstruktuur;
• molekuli esitusviis;
• parameetrite kogum;
• andmete töötlemine;
• treening- ja testandmestike jaotamise viis;
• punktisüsteem;
• kandidaatide hindamismenetlus;
• valikukriteeriumid.

Kui säilitatakse ainult kõige kõrgemalt hinnatud mudel, parim dokkimispilt või lõplik jada, võib see takistada tulemuse saamise viisi hilisemat taasesitamist.

Ka raamatukogu enda eripära on üks korduvuse element.

Erialaraamatukogude koosseisu ja pallide koormuse uuringud näitavad, et variatsioon võib esineda juba enne sõelumise algust. [4] [8]

Ainult lõpliku tabamuse dokumenteerimine võib seega jätta tähelepanuta olulist teavet algmaterjali kohta.

Positiivsed prognoosid ja negatiivsed tulemused on võrdselt olulised

Arvutipõhiselt prognoositud kandidaat, kes ei ole eksperimentaalselt kinnitust leidnud, võib siiski pakkuda kasulikku teavet.

Võib paljastada:

• mudeli piirangud;
• vale mehhanistlik eeldus;
• keemilise omaduse ebapiisav kirjeldus;
• probleem testiga seotud hüpoteesiga;
• järjestusruumi piirkond, kus mudel üldistab halvasti.

Selliseid tulemusi ei tohiks hindamisest välja jätta ainult sellepärast, et need ei kinnitanud esialgset prognoosi.

Iteratiivne projekteerimine muutub väärtuslikumaks, kui eksperimentaalsed tähelepanekud – sealhulgas ootamatud ja negatiivsed tulemused – mõjutavad järgmisi otsuseid.

Enüümsete substraatide kavandamist käsitlevas uuringus kasutati järgmist üldist tsüklit:

prognoos → eksperimentaalne mõõtmine → mudeli täiustamine andmete põhjal. [3]

Selle teaduslik väärtus tulenes arvutuste ja vaatluste ühendamisest, mitte aga sellest, et esimest edetabelit peeti lõplikuks vastuseks.

Seega peaks kõige veenvam järeldus täpselt määratlema, mida on tõendatud:

• rikastamine;
• lahendus;
• käitumine ensüümi substraadina;
• inhibitsioon;
• rakuline reaktsioon;
• arvutipõhine prognoos;
• tulemuslikkus struktuurilises võrdlusuuringus.

Igaüks neist tulemustest võib olla teaduslikult väärtuslik.

Siiski ei tohiks üht teisega asendada.

Peptiidiraamatukogude tõlgendamisel esinevad kõige sagedasemad vead

Peptiidide andmebaaside uuringute tulemused võivad olla eksitavad, kui järeldused lähevad kaugemale sellest, mida tegelikult mõõdeti.

Üks levinumaid vigu on käsitleda raamatukogu teoreetilist suurust eksperimentaalselt kinnitatud mitmekesisusena. Füüsilised raamatukogud võivad sisaldada ebavõrdset esindatust, puuduvaid elemente, dubleeritud elemente või sünteesiprotsessist tulenevaid koormusi. [4]

Järgmine viga on käsitleda rikastumist suguluse tõendina. Rikastumine võib tuleneda ka paljunemise eelistest, pinnaga seostumisest või muudest valikuprotsessiga seotud omadustest. [6] [7]

Kolmas probleem on seose samastamine funktsiooniga. Peptiid võib sihtmärgiga interakteeruda, ilma et see põhjustaks kavandatud bioloogilist mõju.

Samuti ei tohiks dokkimise tulemust käsitleda kui afiinsuse eksperimentaalset mõõtmist. Punktilised tulemused pärinevad arvutimudelidest ja vajavad valideerimist, enne kui neid võib pidada seose kvantitatiivseks tõendiks. [10] [11] [13]

Virtuaalne peptiid ei ole ka automaatselt peptiid, mida oleks võimalik kergesti saada õiges keemilises vormis. Süntees, lahustuvus, molekulaarne identiteet ja proovi omadused jäävad eksperimentaalseteks küsimusteks.

Lõpuks ei pruugi faagil esitatud, pinnale kinnitatud või kuuliga seotud peptiidi puhul saadud tulemust suuta vastav vaba molekul korrata, kuna esitamisviis ise võib mõjutada konformatsiooni, kättesaadavust, kohalikku tihedust ja aviidsust.

Need piirangud ei vähenda peptiidiraamatukogude väärtust.

Need määravad aga kindlaks, kuidas tuleb nende esitatud tõendeid tõlgendada.

Korduma kippuvad küsimused

1. Mis on kattuvate peptiidide andmebaas?

Kattuvate peptiidide raamatukogu on kogum fragmente, mis hõlmavad pikemat algse järjestust, kusjuures naaberpeptiididel on osa ühisest aminohapete järjestusest. Selline lahendus aitab teadlastel identifitseerida piirkondi, mis on seotud tunnustamise või mõne muu mõõdetava reaktsiooniga. Uuring, milles kasutati meningokoki valgu kattuvaid fragmente, näitas selle meetodi rakendatavust T-lümfotsüütide reaktsiooni kaardistamisel doonoritelt pärit proovides. [5] Fragmendi suhtes saadud positiivne tulemus ei identifitseeri siiski automaatselt minimaalse epitoobi, ei tõenda, et iga ühine jääk on vajalik, ega tähenda, et fragment kajastab täpselt kogu valgu struktuuri ja töötlemist.

2. Kas arvutipõhised prognoosid võivad asendada eksperimente?

Ei. Arvutipõhised ennustused võivad aidata kandidaatide prioriteetide määramisel, mustrite tuvastamisel, struktuurihüpoteeside koostamisel ja nende järjestuste arvu piiramisel, mis nõuavad viivitamatut eksperimentaalset uurimist. Nende usaldusväärsus sõltub aga mudelist, treeningandmetest, molekulide esitusviisist, kasutatud eeldustest ja konkreetsest ülesandest. Enüümsete substraatide disainimise uuringus testiti korduvalt algoritmi poolt valitud peptide ja kasutati eksperimentaalseid tulemusi järgmiste valikuringide jaoks. [3] See näitab arvutusmeetodite ja eksperimendi koostööd, mitte aga eksperimendi asendamist mudeliga. Kandidaat jääb arvutipõhiseks ennustuseks seni, kuni tema asjakohast omadust pole eksperimentaalselt hinnatud.

3. Kas peptiidide raamatukogu on füüsiline kogum või andmebaas?

See võib olla nii üks kui ka teine. Füüsilised raamatukogud sisaldavad molekule, mida saab otseselt eksperimentaalselt uurida, samas kui virtuaalsed raamatukogud sisaldavad digitaalseid järjestusi, molekulaarstruktuure või muid arvutiesitusi. Esimesed „one-bead–one-peptide” uuringud käsitlesid füüsilisi sünteetilisi raamatukogusid, samas kui arvutipõhised disainimeetodid analüüsivad molekulaarseid esitusviise enne valitud kandidaatide sünteesi. [2] [3] Jada olemasolu virtuaalses raamatukogus ei kinnita veel, et vastav peptiid on õigesti sünteesitud, omab kavandatud keemilist struktuuri või ilmutab ennustatud omadust. Seetõttu tuleb raamatukogu suurust või sõelumistulemusi arutades alati täpsustada selle formaat.

4. Kas suurem kandidaatide andmebaas tagab alati parimate kandidaatide leidmise?

Ei. Raamatukogu suurus on oluline vaid siis, kui see sisaldab olulist, kättesaadavat, identifitseeritavat ja asjakohaselt esindatud mitmekesisust. Faagi raamatukogu sügavsekveneerimine näitas järjestuste ebavõrdset arvukust ning tegureid, mis vähendavad tegelikku mitmekesisust hoolimata projekti laiaulatuslikust kavandamisest. [4] Väga suured raamatukogud võivad suurendada ka proovivõtu ja tõlgendamisega seotud probleeme, kuna mitte iga teoreetiliselt võimalik element ei pruugi tegelikult olemas olla või piisavalt uuritud olla. Kandidaatide kvaliteet sõltub seega raamatukogu koostisest, sõelumisprojektist, testi kvaliteedist, kontrollist ja valideerimisest, mitte ainult reklaamitud võimalike järjestuste arvust.

5. Kas juhuslikud peptiidiraamatukogud on tõepoolest eelarvamustest vabad?

Mitte alati. Randomiseeritud disain võib ikkagi põhjustada nukleotiidide, aminohapete ja tervete järjestuste ebavõrdset esindatust. Bioloogiline tootmine, paljundamine, sünteeskeemia ja proovivõtt võivad tekitada täiendavaid häireallikaid. Kaubandusliku faagiraamatukogu süvasequentseerimine näitas ebaühtlast esindatust juba enne sihtmärgipõhise valiku algust. [4] See ei tähenda, et iga juhuslik raamatukogu oleks ebausaldusväärne. See näitab aga, et „juhuslik projekt” ja „eksperimentaalselt kinnitatud ühtlus” on kaks erinevat väidet. Algse raamatukogu omadused aitavad eristada suurt algset arvukust valikust sõltuvast tegelikust rikastamisest.

6. Kuidas võimaldab faagidisplay peptiidi järjestust identifitseerida?

Faagidisplay ühendab bakteriofaagi pinnal esitatud peptiidi sama osakese sees oleva geneetilise informatsiooniga. Seega on võimalik valitud faagid eraldada ja määrata neile vastavad peptiidijadad seotud geneetilise materjali põhjal. Varased uuringud, milles kasutati niitfaagidel esitatud juhuslikke peptide, kasutasid seda genotüübi ja fenotüübi vahelist seost seonduvate ligandide eraldamiseks ja iseloomustamiseks. [1] Fagi taastamine üksi ei tõesta siiski sihtmolekuli suhtes spetsiifilisust, kuna arvukusele võivad mõju avaldada pinnaga toimuvad interaktsioonid, paljunemise erinevused ja muud selektsioonisurved. Geneetiline seos võimaldab kindlaks teha kandidaadi identiteedi ning edasised katsed aitavad selgitada selle valiku põhjuse.

7. Miks võib faagi rikastada ilma, et see oleks seotud kavandatud eesmärgiga?

Eesmärgiga mitteseotud rikastumiseni võib viia mitu mehhanismi. Faag võib reageerida testpinnaga, taluda valikutingimusi erakordselt hästi või paljuneda tõhusamalt kui konkureerivad kloonid. Eraldi uuringutes on näidatud polüstüreeniga seotud taastumist ja paljunemise ülekaaluga seotud rikastumist. [6] [7] Need on erinevad mehhanismid ja nõuavad erinevaid kontrollimeetmeid. Rikkumist tuleks seega tõlgendada kui tõendit, et kloon on selektsiooniprotsessi käigus ellu jäänud ja suurendanud oma esindatust. Eesmärgi spetsiifilise äratundmise tõendamiseks on vaja täiendavaid tõendeid, mis võimaldavad eristada seda võimalust alternatiivsetest selgitustest.

8. Mida tähendab „one-bead–one-compound”?

„One-bead–one-compound” tähendab, et iga helmes peaks põhimõtteliselt sisaldama mitmeid koopiaid ühest konkreetsest ühendist, mille tulemusel saab valitud helme lõpuks seostada raamatukogu ühe konkreetse elemendiga. See kontseptsioon võimaldab luua suuri kombinatoorseid sünteetilisi raamatukogusid ja seda tutvustati varastes „one-bead–one-peptide“ uuringutes. [2] Termin kirjeldab siiski raamatukogu kavandatud ülesehitust, kuid ei taga iga helme identse koormuse, täiusliku sünteesi ega keemilist ühtsust. Hilisemad üksikute helmete mõõtmised näitasid märkimisväärseid erinevusi esitatud peptiidi koguses. [8] Seega on materjali kvaliteet ja koormus omadused, mida tuleb eksperimentaalselt hinnata.

9. Kas peptiidi kogus kuulikesel võib mõjutada sõelumise tulemust?

Jah. Kuul, millel on rohkem kättesaadavat peptiidi, võib tekitada tugevama testisignaali isegi siis, kui molekulaarne interaktsioon ise ei ole tugevam. Uuringus, kus kasutati Ramani spektroskoopiat ühe helme ja ühe ühendi raamatukogude analüüsimiseks, täheldati peptiidi koguse märkimisväärset varieeruvust, eriti pikemate järjestuste puhul. [8] Uuringus ei määratleta koormuse mõju igas võimalikus sõelumissüsteemis, kuid tuvastatakse variatsiooni allikas, mis võib mõjutada signaali intensiivsust. Seega tuleb kuulidel läbiviidud sõelumise tulemusi tõlgendada nii molekulaarse interaktsiooni kui ka esitatud materjali tiheduse kontekstis.

10. Kas seondumine on sama mis bioloogiline aktiivsus?

Ei. Sidumine tähendab molekulide vastastikmõju teatud tingimustes. Bioloogiline või biokeemiline aktiivsus eeldab eraldi määratletud lõpptulemust. Peptiid võib seonduda valguga, kuid seda ei aktiveeri ega pärsi, ning rakkude reaktsioon võib tekkida muul mehhanismil kui eeldatud mõju sihtmärgile. Faagidisplei uuringud keskendusid peamiselt seondumisele, samas kui masinõpet kasutav uuring käsitles peptiidide käitumist ensüümsete substraatidena. [1] [3] Tegemist on erinevate teaduslike küsimustega. Seega tuleks sõelumise tulemust kirjeldada vastavalt tegelikult mõõdetud omadusele, ilma sellele laiemat toimet omistamata.

11. Miks tasub tabamust uuesti sünteesida ja eraldi uurida?

Sõltumatu süntees aitab kindlaks teha, kas konkreetne määratletud peptiid tõepoolest jäljendab väljaspool algset raamatukogusüsteemi täheldatud käitumist. Fagi külge kinnitumine, materjali kogus kuulil, segunemise mõjud, interaktsioonid kandjaga või muud sõelumise tegurid võivad mõjutada esialgset tulemust. Fagidisplei varastes uuringutes võrreldi esitatud ligandeid keemilise sünteesi teel saadud peptiididega, mis illustreerib seda kinnitavat etappi. [1] Uus süntees on kõige informatiivsem siis, kui saadud materjal on asjakohaselt iseloomustatud ja uuritud algse väitega seotud testis. Süntees ise ei kinnita veel funktsiooni ega toimemehhanismi.

12. Mida ennustab Rosetta FlexPepDock?

Rosetta FlexPepDock modelleerib peptiid-valgu komplekside struktuure, kuid FlexPepDockiga seotud üksikud protseduurid eeldavad erinevat algandmete ulatust. Selle serveri kohta avaldatud esialgne artikkel kirjeldab peamiselt kõrge resolutsiooniga täiustamist peptiidimudelile, mis asub juba ligikaudselt retseptori sidumiskoha lähedal. [10] PIPER-FlexPepDock kasutab laiemat globaalse dokkimise strateegiat, millele järgneb mudeli paindlik täiustamine. [11] Võrdlustestide tulemused ei taga õigsust iga uue peptiid-valgu paari puhul. Seetõttu peaks kasulik aruanne sisaldama kasutatud protokolli, algandmeid ja ennustatud struktuuride hindamise meetodit.

13. Kas dokkimise soodne tulemus kinnitab tugevat seost?

Ei. Dokkimise tulemus on arvutifunktsiooni abil genereeritud väärtus ega ole automaatselt võrdväärne eksperimentaalselt mõõdetud afiinsusega, nagu näiteks dissotsiatsioonikonstant. Selle tähendus sõltub dokkimisprotokollist, molekuli esitusviisist, konformatsioonide valimise meetodist, uuritavast sihtmärgist ja kalibreerimisest. Uuringus „FlexPepDock”, mis käsitles peptiid-MHC-komplekse, võrreldi arvutuslikke tulemusi suhteliste seondumismõõtmistega kindlas andmekogus, näidates, et selliseid seoseid tuleb uurida, mitte eeldada. [13] Soodne dokkimistulemus võib aidata kandidaatide prioriteete kindlaks määrata või toetada struktuurihüpoteesi, kuid tugev seondumine nõuab asjakohaseid eksperimentaalseid tõendeid.

14. Miks on C-otsa amidatsioon peptiidi modelleerimisel oluline?

C-otsa amidatsioon muudab peptiidi otsas asuvat keemilist rühma ning võib mõjutada formaalset laengut, vesiniksidemeid, elektrostaatilisi vastasmõjusid ja molekuli konformatsiooni. Seega peaks arvutimudel kajastama sama lõpprühma keemilist koostist, mis on eksperimentaalselt uuritud peptiidil. Maximin H5 uuringutes täheldati struktuuri ja membraanidega toimuvate vastasmõjude erinevusi, mis olid seotud lõpprühma muutumisega. [15] See ei tõesta, et amidatsioon parandab alati peptiidide omadusi. See näitab aga, miks lõpprühmade keemiline koostis peaks olema õigesti määratletud ja mudelis kajastatud.

15. Kas mudeli genereerimine CHARMM-GUI-s kinnitab peptiidi omadusi?

Ei. CHARMM-GUI aitab valmistada molekulaarseid süsteeme simulatsiooniks ette. Struktuuri või sisendfailide edukas loomine tähendab, et on loodud uuritava süsteemi arvutiline mudel; see ei kinnita eksperimentaalselt sidemeid, bioloogilist aktiivsust, stabiilsust ega kliinilist tähtsust. Ametlik dokumentatsioon osutab ka sellele, et modifitseeritud jäägid vajavad asjakohaseid struktuurimääratlusi ja parameetreid. [14] Arvutimudeli ettevalmistamine on seega lähtepunktiks edasiseks modelleerimiseks. Kas tegelik molekul käitub ennustuste kohaselt, jääb eraldi eksperimentaalseks küsimuseks.

16. Miks võib ennustusmudel uue peptiidi puhul ebaõnnestuda?

Uus peptiid võib erineda treeningu käigus kasutatud näidetest viisil, mida mudel ei ole õppinud korrektselt esindama. Erinevused võivad puudutada järjestust, struktuuri, pikkust, modifikatsioone, molekulaarset sihtmärki või muid omadusi. T-lümfotsüütide retseptorite sidumist ennustavate mudelite uuring näitas, et tõhususe hinnang muutus sõltuvalt sellest, kuidas võeti arvesse järjestuslikku ja struktuurilist sarnasust treening- ja testpeptiidide vahel. [9] See ei tähenda, et iga uue järjestuse ennustus oleks vale. See näitab aga, et mudeli üldisi tõhususnäitajaid tuleks tõlgendada selle kontekstis, kui palju sarnanevad testitingimused mudeli kavandatud rakendusega.

17. Mis tagab peptiidiraamatukogude uuringutulemuste korratavuse?

Korduvus eeldab piisavat hulka teavet, mis võimaldab määratleda raamatukogu, kandidaatmolekuli, katsetingimused, kontrollid, analüüsimeetodi ning kriteeriumid, mille alusel tulemust loetakse tabamuseks. Fagiraamatukogude koostise ja kuulidel oleva peptiidi koguse uuringud näitavad, et variatsioon võib esineda juba enne sõelumise algust. [4] [8] Seega jätab ainult lõpliku järjestuse ja punktiskoori esitamine tähelepanuta potentsiaalselt olulised erinevuste allikad. Korduvate uuringute puhul on vaja selgelt esitada järjestused, modifikatsioonid, raamatukogu struktuur, proovide identifikaatorid, testi lõpppunktid, kontrollid, analüütilised kriteeriumid, arvutiparameetrid ning peamise tulemuse sõltumatu kinnitus.

18. Kas kõige rikkam peptiid peab olema parim ligand?

Ei. Suur rikastumine võib tuleneda seondumisest sihtmärgiga, kuid seda võivad mõjutada ka sekventside algne arv, paljunemise efektiivsus, mittespetsiifilised interaktsioonid pinnaga ja muud valikuga seotud omadused. Sügavsekveneerimine on näidanud faagiraamatukogude ebaühtlast esialgset esindatust ning teised uuringud on dokumenteerinud rikastumist, mis on seotud paljunemise ülekaaluga. [4] [6] Seetõttu ei tohiks kõige arvukamat lõppjärjestust automaatselt samastada kõrgeima afiinsusega ligandiga. Tugevamaid tõendeid annab algse ja lõpliku arvukuse võrdlus, asjakohased kontrollid ning sõltumatu seondumise mõõtmine.

19. Kas esitatud peptiidijada tõendab, et seda on võimalik edukalt sünteesida?

Ei. Arvutipõhine projekt loob järjestuse või molekulaarhüpoteesi, kuid ei kinnita sünteesi õnnestumist. Mõned järjestused võivad põhjustada probleeme seoses konjugeerimise efektiivsusega, agregatsiooniga, puhastamisega, lahustuvusega või keemiliste modifikatsioonidega. Seega võib virtuaalne raamatukogu sisaldada kandidaate, mille praktiline sünteesitavus on väga erinev. Alles materjali eksperimentaalne saamine ja selle analüütiline iseloomustus võimaldavad kindlaks teha, kas soovitud molekul on tõepoolest saadud. Arvutipõhine prioriteetide seadmine ja keemiline teostatavus on omavahel seotud, kuid eraldiseisvad uurimisetapid.

20. Kas faagi-display meetodil valitud peptiid võib vaba molekulina käituda teisiti?

Jah. Faagidispleis asub peptiid kandjaga seotud keskkonnas, mis võib mõjutada selle konformatsiooni, orientatsiooni, kättesaadavust, kohalikku tihedust ja aviidsust. Vabal peptiidil puuduvad osad neist omadustest ja seetõttu võib see seondumisel näidata teistsugust näivkäitumist. Fagidisplei varastes uuringutes võrreldi faagidel esitatud ligande nende keemiliselt sünteesitud vastetega, mis näitab selle eksperimentaalse eristuse tähtsust. [1] Edukas faagivalik on seega väärtuslik tõend esitatud järjestuse kohta, kuid selle vaba peptiidi vastava käitumise kindlaksmääramiseks on vaja eraldi uuringut.

Peptiidiraamatukogudest pärinevate tõendite ja prognooside piirangud

Peptiidide andmebaaside uuringute tõlgendamisel tuleb silmas pidada mõningaid piiranguid.

Esiteks ei ole teoreetiline mitmekesisus sama mis tegelik eksperimentaalne mitmekesisus. Ebavõrdne esindatus, sünteetilised probleemid, paljunemise erinevused ja proovivõtmise viis võivad muuta raamatukogu tegelikku koosseisu. [4]

Teiseks ei tõenda rikastumine sõelumise käigus automaatselt spetsiifilist seost sihtmärgiga. Pinnaga toimuvad interaktsioonid ja paljunemise eelis võivad viia rikastumiseni teistsuguste mehhanismide kaudu. [6] [7]

Kolmandaks on oluline esitamisviis. Faagidele, kuulkestele või pinnale kinnitatud peptiidid võivad käituda teisiti kui samad molekulid lahuses, sõltuvalt nende kättesaadavusest, orientatsioonist, kohalikust tihedusest või avidiinsusest. [1] [8]

Neljandaks: seondumine, selektiivsus ja funktsioon on erinevad omadused. Ühe neist tõendamine ei kinnita automaatselt ka teisi.

Viiendaks sõltub arvutipõhine prognoos mudelist. Treeningandmed, hindamismeetod, molekulaarne esitusviis ja kasutatud eeldused määravad, millist tähtsust tulemusele omistada. [3] [9]

Kuuendaks, dokkimise tulemused ei ole afiinsuse eksperimentaalsed mõõtmised. Struktuurimudelid ja punktfunktsioonid võivad aidata hüpoteeside valimisel, kuid sidumise tegeliku käitumise kindlakstegemiseks on vaja eksperimentaalseid mõõtmisi. [10] [11] [13]

Seitsmendaks on keemiline vorm oluline. Lõpprühmad, ebatüüpilised aminohapped, stereokeemia ja muud modifikatsioonid tuleks nii eksperimentaalsetes kirjeldustes kui ka arvutimudelites õigesti esitada. [13] [14] [15]

Lõppude lõpuks on sõelumisel saadud tulemus valideerimise algus, mitte lõpp. Materjali sõltumatu ettevalmistamine, molekulaarne iseloomustus, kontrollid, täiendavad testid ja replikatsioon tugevdavad järk-järgult olemasolevaid tõendeid.

Kokkuvõte

Peptiidide kogud võimaldavad süstemaatiliselt uurida tohutut hulka võimalikke molekulaarseid järjestusi.

Need võimaldavad võrrelda paljusid kandidaate ja analüüsida järgmisi teemasid:

• molekulaarne tuvastamine;
• ensüümide substraatidega;
• järjestusmotiividega;
• lahendus;
• struktuuri ja aktiivsuse seosed;
• rakuliste reaktsioonidega;
• arvutipõhiste prognoosidega.

Mõiste „peptiidide raamatukogu” hõlmab siiski mitmeid põhimõtteliselt erinevaid uurimisformaate.

Kattuvate peptiidide kogum aitab kaardistada pikema järjestuse piirkondi.

Sihtotstarbeline asenduste raamatukogu võimaldab analüüsida üksikute kirjetite tähendust.

Faagi-display-raamatukogu ühendab esitatud peptiidi geneetilise informatsiooniga ja võimaldab selektsiooni.

Raamatukogu „one-bead–one-compound” korraldab sünteetilisi kandidaate üksikutel helvestel.

Virtuaalne raamatukogu on digitaalses vormis ja seda saab kasutada järjestuse prioriteetide määramiseks enne eksperimentaalsete uuringute alustamist.

Neid formaate ei tohi pidada omavahel asendatavateks.

Ka raamatukogu suurus nõuab ettevaatlikku tõlgendamist.

Teoreetiline kogum, mis hõlmab miljoneid võimalikke järjestusi, ei tõenda, et iga selle element on füüsiliselt olemas, ühtlaselt esindatud, keemiliselt korrektne ja tegelikult sõelumise alla kuuluv. Sügavsekveneerimist kasutavad uuringud näitavad, miks raamatukogu tegelik koostis võib erineda kavandatud mitmekesisusest. [4]

Samamoodi ei ole rikastumine sünonüümiks teatud kalduvusele eesmärgi poole.

Faagikloonid võivad rikastuda mehhanismide tõttu, mis ei ole seotud nende algse eesmärgiga, näiteks pinnaga toimuva vastasmõju või paljunemise eelise tõttu. [6] [7]

Seetõttu on asjakohased kontrollid ja sõltumatud uuringud nii olulised.

Sama ettevaatus kehtib ka peptiidide arvutipõhise projekteerimise puhul.

Järjekorramudelid ja dokkimisvahendid võivad aidata tuvastada paljulubavaid kandidaate ja luua mehhanistlikke hüpoteese, kuid nende ennustused sõltuvad treeningandmetest, struktuurilistest esitusviisidest, punktifunktsioonidest ja algsetest eeldustest. [3] [9] [10] [11]

Dokkimise soodne tulemus ei kinnita iseenesest tugevat eksperimentaalset seost.

Arvutiga genereeritud jada ei tõenda, et seda on võimalik korrektselt sünteesida.

Eeldatav koostoime ei kinnita bioloogilist funktsiooni.

Seega käsitleb kõige informatiivsem peptiidide avastamise protsess erinevaid tõendiliike eraldiseisvate, kuid üksteist täiendavate etappidena:

projekteerimine → andmebaasi ülesehitus → sõelumine → tabamuste tuvastamine → sõltumatu kinnitamine → iseloomustus → arvutuslik täiustamine → eksperimentaalne valideerimine.

Lõppjärelduse veenvus sõltub sellest, kui hoolikalt on need etapid omavahel seotud.

Kõige olulisemat põhimõtet võib lihtsalt sõnastada järgmiselt:

raamatukogu näitab võimalusi, sõelumine tuvastab signaale, mudel genereerib prognoose ning valideerimine määrab kindlaks, millised järeldused on tegelikult eksperimentaalsete tõenditega toetatud.

Vastutusest loobumine

Artikkel on puhtalt hariduslik ja teaduslik-teavitav. Selles kirjeldatakse üldpõhimõtteid, mis puudutavad peptiidide kogusid, faagidisplei tehnoloogiat, sünteetiliste peptiidide sõelumist, järjestuste kavandamist, arvutipõhist ennustamist, peptiidide dokkimist, molekulaarset modelleerimist, eksperimentaalset valideerimist ja uuringute korratavust. See ei kujuta endast meditsiinilist nõuannet, ravi soovitust, peptiidide kasutamisjuhendit, annustamisalast teavet ega juhiseid nende manustamiseks inimestele. Arvutipõhiseid prognoose, sõelumise käigus saadud tulemusi, dokkimise tulemusi ega prekliinilisi eksperimentaalseid tulemusi ei tohi tõlgendada tõendina selle kohta, et antud peptiid on ohutu, tõhus, kliiniliselt valideeritud või sobiv kasutamiseks inimestel.

Viited

1. Barrett, R. W., Cwirla, S. E., Ackerman, M. S., Olson, A. M., Peters, E. A., & Dower, W. J. (1992). Kõrge afiinsusega ligandite selektiivne rikastamine ja iseloomustamine filamentaarsete faagide juhuslike peptiidide kogumitest. Analytical Biochemistry, 204(2), 357–364. https://doi.org/10.1016/0003-2697(92)90252-3
2. Lam, K. S., Salmon, S. E., Hersh, E. M., Hruby, V. J., Kazmierski, W. M. ja Knapp, R. J. (1991). Uut tüüpi sünteetiline peptiidide kogumik ligandiga seondumise aktiivsuse kindlakstegemiseks. Nature, 354(6348), 82–84. https://doi.org/10.1038/354082a0
3. Tallorin, L., Wang, J., Kim, W. E., Sahu, S., Kosa, N. M., Yang, P., Thompson, M., Gilson, M. K., Frazier, P. I., Burkart, M. D., & Gianneschi, N. C. (2018). Uute peptiidsubstraatide avastamine ensüümide jaoks masinõppe abil. Nature Communications, 9(1), artikkel 5253. https://doi.org/10.1038/s41467-018-07717-6
4. Sloth, A. B., Bakhshinejad, B., Jensen, M., Stavnsbjerg, C., Liisberg, M. B., Rossing, M., & Kjaer, A. (2022). Koostise eelarvamuste analüüs kaubanduslikus faagidisplei peptiidide kogus järgmise põlvkonna sekveneerimise abil. Viirused, 14(11), artikkel 2402. https://doi.org/10.3390/v14112402
5. Wiertz, E. J., van Gaans-van den Brink, J. A., Gausepohl, H., Prochnicka-Chalufour, A., Hoogerhout, P., & Poolman, J. T. (1992). Meningokoki 1. klassi välismembraanivalgus esinevate T-rakkude epitoopide identifitseerimine, kasutades üksteisega kattuvaid peptiide, mis on koostatud samaaegse mitmekordse peptiidisünteesi abil. „Journal of Experimental Medicine”, 176(1), 79–88. https://doi.org/10.1084/jem.176.1.79
6. Kamstrup Sell, D., Sloth, A. B., Bakhshinejad, B., & Kjaer, A. (2022). M13KE-põhisest peptiidiraamatukogust pärinev valge plaak, mis on seotud genoomse deleetsiooniga, rikastub faagidisplei biopanningu käigus sihtmärgiga mitteseotud viisil paljunemise eelise tõttu. International Journal of Molecular Sciences, 23(6), artikkel 3308. https://doi.org/10.3390/ijms23063308
7. Bakhshinejad, B., & Sadeghizadeh, M. (2016). Faagidisplei-raamatukogu sõelumisel eraldatud polüstüreeniga seonduv sihtmärgiga mitteseotud peptiid. Analytical Biochemistry, 512, 120–128. https://doi.org/10.1016/j.ab.2016.08.013
8. Tang, Y., Thillier, Y., Liu, R., Li, X., Lam, K. S. ja Gao, T. (2017). Peptiidide jaotuse kvantifitseerimine ühe helme põhjal ühe helme ja ühe ühendi raamatukogu sünteesil konfokaalse Ramani spektroskoopia abil. Analüütiline keemia, 89(13), 7000–7008. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b00516
9. Castorina, L. V., Grazioli, F., Machart, P., Mösch, A. ja Errica, F. (2025). TCR-i sidumist ennustavate mudelite üldistamisvõime hindamine peptiidide vahekauguse analüüsi abil. PLOS ONE, 20(5), artikkel e0324011. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0324011
10. London, N., Raveh, B., Cohen, E., Fathi, G. ja Schueler-Furman, O. (2011). Rosetta FlexPepDock veebiserver – peptiidide ja valkude vastastikmõjude kõrglahutusega modelleerimine. Nucleic Acids Research, 39(veebiserver), W249–W253. https://doi.org/10.1093/nar/gkr431
11. Alam, N., Goldstein, O., Xia, B., Porter, K. A., Kozakov, D. ja Schueler-Furman, O. (2017). Kõrge eraldusvõimega globaalne peptiidide ja valkude dokkimine fragmentidel põhineva PIPER-FlexPepDocki abil. PLOS Arvutusbioloogia, 13(12), artikkel e1005905. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1005905
12. RosettaCommons. (kuupäev puudub). FlexPepDock. Allikas: 20. september 2026, aadressilt Ametlikud dokumendid
13. Bloodworth, N., Barbaro, N. R., Moretti, R., Harrison, D. G. ja Meiler, J. (2022). Rosetta FlexPepDock peptiidi ja MHC-i seondumise ennustamiseks: lähenemisviis mittekanonilistele aminohapetele. PLOS ONE, 17(12), artikkel e0275759. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0275759
14. CHARMM-GUI. (kuupäev puudub). Korduma kippuvad küsimused. Allikas: 20. september 2026, aadressilt Ametlikud dokumendid
15. Dennison, S. R., Mura, M., Harris, F., Morton, L. H. G., Zvelindovsky, A., & Phoenix, D. A. (2015). C-terminaalse amideerimise roll anioonilise antimikroobse peptiidi, maksimini H5, membraaniga toimuva interaktsiooni puhul. Biochimica et Biophysica Acta, 1848(5), 1111–1118. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2015.01.014