Bibliotecas de péptidos e conceção: como funcionam a triagem e a previsão?

Uma biblioteca de peptídeos é um conjunto de várias sequências peptídicas preparadas ou apresentadas de forma a poderem ser comparadas sistematicamente. Em vez de analisarem uma sequência isolada sem um ponto de referência mais amplo, os investigadores podem utilizar a biblioteca para verificar quais os péptidos que se ligam a um alvo molecular específico, que são substratos enzimáticos, que provocam uma resposta mensurável num determinado teste, contêm um motivo específico reconhecido por outras moléculas ou apresentam outra propriedade definida.

Nem todas as bibliotecas de péptidos são iguais. Podem apresentar-se como coleções físicas de moléculas sintetizadas, péptidos apresentados em suportes biológicos, péptidos ligados a esferas ou superfícies, bem como coleções totalmente virtuais de sequências e estruturas moleculares analisadas por computador.

Cada um destes formatos responde a questões científicas ligeiramente diferentes.

Um péptido para o qual o computador previu a possibilidade de ligação a uma determinada proteína não é o mesmo que o péptido efetivamente selecionado no ensaio de triagem. Da mesma forma, um péptido enriquecido durante a triagem não se torna automaticamente um candidato biológico confirmado.

Estudos que utilizam a técnica de phage display, bibliotecas sintéticas em esferas, conjuntos de peptídeos sobrepostos e experiências apoiadas por métodos computacionais revelam um dos princípios fundamentais da descoberta de peptídeos:

Encontrar um sinal interessante dá início ao processo de investigação, não o conclui.

A solidez das conclusões finais depende, entre outros fatores, de:

• da forma como a biblioteca foi concebida e da sua qualidade;
• diversidade real, e não apenas teórica;
• estrutura do teste;
• controlos adequados;
• identificação molecular;
• repetibilidade;
• exclusão de explicações alternativas;
• validação experimental independente. [1] [2] [3]

Por isso, ao analisar bibliotecas de peptídeos, convém distinguir várias etapas sucessivas:

estrutura da biblioteca → triagem → identificação de resultados → confirmação → caracterização → previsão ou otimização → validação independente.

Cada uma destas fases fornece um nível diferente de provas.

O que é uma biblioteca de péptidos?

Conjunto organizado de diferentes variantes moleculares

A biblioteca de péptidos contém sequências peptídicas relacionadas entre si ou diversas, organizadas em torno de uma determinada questão de investigação.

Algumas bibliotecas servem para estudar pequenas variações no âmbito de um péptido conhecido. Outras abrangem um espaço muito maior de sequências possíveis.

Os diferentes elementos da biblioteca podem diferir em termos de:

• comprimento do péptido;
• tipos de aminoácidos;
• posição de cada resíduo;
• sequência de aminoácidos;
• grupos finais;
• ciclização;
• estereoquímica;
• modificações químicas;
• outras características estruturais alteradas intencionalmente.

A biblioteca deve também permitir identificar o elemento em questão.

No caso de uma matriz peptídica, a identidade do péptido pode estar associada à sua localização física.

Na biblioteca de phage display, a sequência peptídica apresentada está associada à informação genética contida no bacteriófago.

Numa biblioteca sintética disposta em esferas, o péptido presente numa esfera selecionada pode exigir identificação química ou a utilização de um sistema de codificação adicional.

A relação entre o sinal e a identidade da molécula é de importância fundamental.

Um sinal experimental forte proveniente de uma mistura desconhecida ainda não permite determinar qual a partícula que o provocou.

O valor de uma biblioteca de péptidos depende, portanto, não só do número de candidatos que contém, mas também das possibilidades de combinação:

candidato → identidade → resposta medida.

Bibliotecas aleatórias, direcionadas e sistemáticas

As diferentes estruturas das bibliotecas servem para responder a diferentes questões científicas.

Uma biblioteca aleatória ou combinatória inclui combinações de elementos constitutivos em posições selecionadas.

O termo „aleatório” descreve o método previsto de construção ou amostragem. Não significa que cada sequência teoricamente possível ocorra efetivamente com a mesma frequência.

A biblioteca orientada reduz a variabilidade em torno de:

• de um tema conhecido;
• do péptido precursor;
• de uma estrutura específica;
• sequência de ligação;
• de uma região ativa;
• hipótese relativa a um alvo molecular específico.

A biblioteca de substituições sistemáticas altera, de forma ordenada, os restos selecionados.

Por exemplo, um aminoácido numa determinada posição pode ser substituído sucessivamente por vários outros aminoácidos, para verificar se essa posição influencia a propriedade em análise.

A biblioteca de peptídeos sobrepostos utiliza fragmentos sucessivos de uma sequência-mãe mais longa, sendo que os fragmentos adjacentes partilham alguns resíduos.

Esta abordagem é particularmente útil na identificação das regiões da proteína reconhecidas num determinado teste.

Cada estratégia tem as suas vantagens e limitações.

Uma vasta biblioteca combinatória pode revelar um padrão sequencial inesperado.

Uma biblioteca orientada permite analisar com maior precisão uma sequência que já seja de interesse.

As substituições sistemáticas podem indicar quais os elementos que parecem ser particularmente importantes.

A biblioteca de fragmentos sobrepostos ajuda a localizar a região ativa ou reconhecida de uma proteína de maior dimensão.

Por isso:

Um maior espaço de sequências não significa automaticamente uma melhor informação experimental.

O tipo adequado de biblioteca depende, acima de tudo, da questão de investigação.

A diversidade teórica não significa uma representação real

O conjunto de sequências peptídicas possíveis está a crescer muito rapidamente.

Se a biblioteca permitir todos os 20 aminoácidos padrão em cada uma das seis posições, o número teórico de sequências possíveis é:

20⁶ = 64 000 000 de combinações possíveis.

Trata-se de uma diversidade teórica.

Isso não significa que na biblioteca física existam efetivamente 64 milhões de peptídeos diferentes, devidamente representados.

A diversidade efetiva pode ser reduzida ou distorcida, entre outros fatores, por:

• falhas na síntese;
• rendimento desigual do acoplamento;
• dificuldades sintéticas dependentes da sequência;
• seleção biológica durante a criação da biblioteca;
• limitações da transformação;
• diferenças na reprodução;
• sequências repetidas;
• cargas relacionadas com a sequenciação;
• limitações da amostragem;
• o número desigual dos elementos individuais.

Também é importante a parte da biblioteca total que foi efetivamente utilizada num determinado experimento.

Mesmo que, teoricamente, o conjunto contenha um número enorme de sequências, uma única análise pode abranger apenas uma parte dessa diversidade.

O sequenciamento profundo de uma biblioteca comercial de fagos revelou desvios evidentes em relação a uma representação uniforme, incluindo diferenças na abundância de peptídeos e na composição das sequências. Os investigadores identificaram também fatores que reduzem a dimensão efetiva da biblioteca. [4]

Estes resultados dizem respeito à biblioteca específica analisada e não devem ser automaticamente extrapolados, em termos quantitativos, para todas as bibliotecas de phage display.

No entanto, ilustram um princípio importante:

A diversidade teórica não deve ser considerada como diversidade experimental medida.

O que é uma biblioteca de peptídeos sobrepostos?

A biblioteca de peptídeos sobrepostos apresenta uma sequência-mãe mais longa como uma série de fragmentos mais curtos.

Os peptídeos adjacentes contêm uma parte da sequência comum.

Consideremos fragmentos hipotéticos com 15 reszt de comprimento:

• restantes 1–15;
• restos 6–20;
• restantes 11–25.

Cada péptido seguinte começa cinco posições mais à frente do que o anterior.

Isso significa que os fragmentos adjacentes têm dez resíduos em comum.

Esta disposição ajuda a identificar as regiões associadas ao reconhecimento ou a outra resposta medida.

Se dois peptídeos adjacentes emitirem um sinal, a sua sequência comum pode ajudar a delimitar a área que requer investigação adicional.

No entanto, isso não prova que:

• cada resto na região comum é necessário;
• basta a sequência comum para se obter o efeito;
• foi identificada a sequência mínima ativa;
• esse fragmento comporta-se exatamente da mesma forma que a região correspondente na proteína completa.

Para esclarecer estas questões, poderão ser necessárias novas experiências.

Num estudo sobre a proteína da membrana externa do meningococo, foram utilizados 45 péptidos sintéticos sobrepostos para analisar o reconhecimento por parte dos linfócitos T em células provenientes de dadores humanos. [5]

O estudo demonstrou tanto a utilidade do mapeamento empírico de péptidos como as limitações dos algoritmos de previsão disponíveis na altura.

As respostas observadas mantiveram-se específicas do conjunto de péptidos utilizado, das condições do teste e das amostras provenientes dos dadores estudados.

As bibliotecas físicas e virtuais respondem a questões diferentes

A expressão „biblioteca de péptidos” pode referir-se a sistemas experimentais muito diversos.

Esta distinção é muito importante:

Um candidato digital não é, automaticamente, uma molécula sintetizada, e uma molécula sintetizada não é, automaticamente, um candidato validado experimentalmente.

Phage display e bibliotecas sintéticas

Como é que o phage display associa um péptido à sua sequência?

Na tecnologia de phage display, o péptido é apresentado como parte de uma proteína situada na superfície de um bacteriófago.

O fago contém, simultaneamente, a informação genética que codifica a sequência apresentada.

Desta forma, cria-se uma ligação útil entre:

fenótipo — peptídeo apresentado

a

genótipo — a sequência genética que lhe corresponde.

Os investigadores podem submeter uma biblioteca de sequências a um objetivo específico ou a um sistema de teste, recuperar as sequências selecionadas, multiplicá-las ou analisá-las e determinar quais as sequências que foram enriquecidas.

A associação com a informação genética facilita significativamente a identificação de candidatos, em comparação com a análise de uma mistura molecular não identificada.

Estudos iniciais que utilizaram péptidos aleatórios apresentados em fagos filamentosos demonstraram a possibilidade de enriquecer ligantes de anticorpos de alta afinidade e compararam o comportamento dos péptidos apresentados nos fagos com os resultados de ligação obtidos para péptidos sintetizados quimicamente. [1]

Esta comparação foi particularmente importante, uma vez que o péptido presente na partícula de fago e o péptido sintético isolado que lhe corresponde não constituem uma apresentação experimental idêntica.

O enriquecimento é o resultado da seleção, mas não constitui uma explicação completa do mecanismo

A sequência cuja proporção aumenta nas fases sucessivas da seleção é frequentemente designada como «enriquecida».

O enriquecimento é uma informação importante.

No entanto, isso não explica automaticamente por que razão uma determinada sequência se tornou mais frequente.

As possíveis causas incluem:

• ligação com o objetivo pretendido;
• aderência à superfície utilizada no ensaio;
• interação com outro elemento da experiência;
• maior capacidade de sobrevivência face às condições de seleção;
• maior capacidade de contágio;
• uma multiplicação mais eficaz;
• vantagem durante a propagação;
• outra característica que depende da sequência ou de um clon específico.

Trata-se de explicações cientificamente diferentes.

Num dos estudos, foi identificado um clone de fago cujo enriquecimento estava associado a uma vantagem na multiplicação resultante de uma deleção genómica. [6]

Noutro estudo, foi analisado o péptido em questão, que se ligou ao poliestireno em vez de se ligar ao alvo pretendido. [7]

Estes estudos revelam dois mecanismos diferentes através dos quais pode ocorrer um enriquecimento não relacionado com o objetivo propriamente dito do estudo.

Isso não significa que todas as sequências fágicas enriquecidas sejam artefactos.

Mostrando, no entanto, por que razão:

O enriquecimento identifica um candidato que requer esclarecimento; por si só, não prova o reconhecimento específico de um alvo molecular.

A forma de apresentação pode influenciar a ligação observada

O péptido apresentado no sistema de phage display está fisicamente ligado ao suporte.

O seu comportamento pode, portanto, diferir do comportamento da mesma partícula quando se encontra em estado livre numa solução.

Um conceito importante neste contexto é a avidez.

A afinidade refere-se normalmente à intensidade de uma interação individual no âmbito de um determinado modelo.

A avidez, por sua vez, pode resultar de várias interações que ocorrem simultaneamente.

Se várias cópias do péptido em questão interagirem simultaneamente com vários sítios de ligação, a interação total pode parecer mais forte do que a interação isolada de um péptido livre.

A ligação ao suporte também pode:

• limitar a conformação do péptido;
• alterar a sua disponibilidade;
• aumentar a concentração local;
• influenciar a orientação;
• provocar efeitos estéricos;
• colocar várias cópias do péptido próximas umas das outras.

Por isso, um péptido selecionado com sucesso no sistema de apresentação pode comportar-se de forma diferente após uma síntese independente.

É precisamente por isso que a análise de uma molécula isolada constitui uma etapa importante de confirmação.

A comparação entre os ligantes apresentados em fagos e os seus equivalentes sintetizados quimicamente, nos primeiros estudos sobre o phage display, ilustra bem a importância de associar o resultado da seleção ao comportamento independente da molécula. [1]

As bibliotecas sintéticas podem abranger um espaço químico diferente

As bibliotecas de péptidos sintéticos são criadas através de métodos químicos e não exclusivamente por meio da expressão biológica.

Dependendo do método de síntese utilizado, podem potencialmente incluir:

• aminoácidos não convencionais;
• determinados D-aminoácidos;
• modificações nas extremidades;
• ciclagem;
• marcadores químicos;
• cadeias laterais modificadas;
• outros materiais de construção sintéticos.

Isto permite alargar o espaço químico disponível para investigação.

No entanto, o simples facto de se conceber uma sequência numa folha de cálculo ou num programa informático não prova que a molécula correspondente possa ser obtida de forma fácil e correta.

Os problemas práticos podem incluir:

• acoplamento incompleto;
• sequências de deleção;
• agregação;
• dificuldades na limpeza;
• baixa solubilidade;
• efeitos secundários;
• instabilidade das modificações;
• problemas sintéticos dependentes da sequência.

Por isso:

diversidade química projetada ≠ diversidade química comprovada experimentalmente.

Os sistemas de apresentação codificados geneticamente e a síntese química abrangem, portanto, espaços moleculares que se sobrepõem parcialmente, mas que não são idênticos.

As tecnologias de apresentação modificadas podem alargar ainda mais o âmbito da química disponível nos sistemas biológicos; por isso, não se deve simplificar esta distinção ao afirmar que as bibliotecas biológicas só podem conter péptidos padrão não modificados.

Bibliotecas «uma conta – um composto»

Na biblioteca «one-bead–one-compound» (OBOC), cada esfera deve, em princípio, conter várias cópias de um determinado composto.

Uma das estratégias frequentemente utilizadas é a síntese do tipo «split-and-pool».

As esferas são divididas em grupos; cada grupo é submetido a uma reação com um elemento constitutivo diferente; em seguida, todas as esferas são novamente reunidas e voltam a ser divididas antes da fase seguinte da síntese.

A repetição deste processo pode levar à criação de uma grande biblioteca combinatória, mantendo, ao mesmo tempo, a associação prevista entre uma bola individual e uma sequência específica.

Os primeiros estudos sobre o sistema «one-bead–one-peptide» apresentaram um método para a criação e triagem de grandes bibliotecas sintéticas de péptidos com vista à ligação de ligantes. [2]

A expressão «one bead–one compound» descreve, no entanto, o princípio de organização da biblioteca.

Não demonstra que:

• cada esferinha contém um péptido quimicamente perfeito;
• cada esferinha tem a mesma carga de peptídeo;
• todas as reações de acoplamento ocorreram com a mesma eficiência;
• O peptídeo em cada esferinha está igualmente disponível.

Num estudo posterior sobre esferas individuais, recorreu-se à espectroscopia Raman para avaliar a quantidade de péptido.

Os investigadores observaram uma variabilidade significativa entre as esferas da biblioteca, especialmente no caso de sequências mais longas, apesar de a distribuição do material inicial ser mais uniforme. [8]

Isto é importante porque a intensidade do sinal durante o rastreio pode depender tanto de:

forças de interação,

bem como de:

quantidade de péptido disponível apresentado na esfera.

Matrizes, conjuntos sintetizados individualmente e estudos agrupados

As bibliotecas de péptidos também podem ser organizadas sob a forma de matrizes ou de conjuntos sintetizados individualmente.

Na matriz peptídica, os peptídeos definidos encontram-se em posições físicas conhecidas.

Isto garante uma ligação direta:

localização → identidade da sequência → sinal de teste.

No entanto, é importante ter em conta que a imobilização na superfície pode afetar a conformação e a acessibilidade do péptido.

Outra solução é o rastreio por amostragem aleatória.

Vários peptídeos são combinados numa única amostra e analisados em conjunto.

Se o conjunto der uma resposta positiva, é possível, em seguida, proceder à sua deconvolução, testando grupos mais pequenos ou elementos individuais.

O agrupamento pode reduzir o número de medições necessárias na fase inicial.

No entanto, o conjunto nem sempre se comporta exatamente da mesma forma que cada um dos seus componentes individuais.

Podem ter influência:

• diferenças de concentração;
• concorrência;
• solubilidade;
• agregação;
• interferências;
• efeitos antagónicos;
• saturação do teste.

O conjunto de resultados positivos indica, portanto, um grupo que requer mais investigações.

Não demonstra que todos os péptidos nela contidos possuam a propriedade em análise.

Seleção e escolha dos candidatos

Primeiro, define o que é que o teste mede, afinal

O significado do resultado do rastreio depende inteiramente do desfecho medido.

O rastreio de ligação permite determinar se um péptido interage com um alvo específico nas condições em questão.

A análise de substratos enzimáticos verifica se a enzima transforma um determinado péptido.

O teste de inibição verifica se o péptido reduz uma determinada atividade.

O teste celular mede uma resposta definida nas células.

Estes resultados não são equivalentes.

O péptido pode ligar-se ao alvo sem o ativar nem o inibir.

Pode ser um substrato enzimático, mas não apresentar o comportamento adequado no sistema celular.

A resposta celular pode, por outro lado, resultar de uma via não intencional.

Por isso, a expressão „peptídeo ativo” é frequentemente demasiado abrangente, caso não seja especificado que tipo de atividade foi efetivamente medida.

Num estudo iterativo que recorreu à aprendizagem automática, foram otimizados substratos peptídicos para uma determinada classe de enzimas através de testes experimentais repetidos com candidatos selecionados. [3]

As conclusões diziam respeito às funções bioquímicas medidas nesse sistema específico.

Não demonstram que essas mesmas sequências seriam eficazes noutras aplicações biológicas não relacionadas.

As verificações ajudam a distinguir o reconhecimento do alvo do próprio comportamento do teste

Os controlos adequadamente selecionados ajudam a distinguir o fenómeno molecular pretendido de outras possíveis explicações.

Dependendo do teste, podem ser:

• superfícies sem a molécula-alvo;
• controlos que incluem apenas o suporte;
• alvos moleculares não relacionados;
• resultados positivos;
• controlos negativos;
• medições de fundo;
• experiências competitivas;
• outros controlos específicos do sistema em questão.

Uma superfície sem a molécula-alvo pode revelar uma ligação não específica com o material de teste.

A verificação do suporte ajuda a detetar respostas provocadas pelo próprio sistema de apresentação.

Um alvo não relacionado pode fornecer informações sobre a seletividade.

O controlo positivo mostra se o teste é capaz de detetar um resultado conhecido.

O controlo negativo ajuda a determinar o nível de fundo.

No entanto, os controlos devem ser selecionados de acordo com as fontes reais de erro possíveis no experimento em questão.

Não existe um único péptido de controlo universal que seja biologicamente inerte em todos os sistemas possíveis.

Um estudo sobre fagos que se ligam ao poliestireno demonstra por que razão o controlo da superfície é importante. Os investigadores analisaram separadamente a ligação e a multiplicação e atribuíram o enriquecimento à interação com a superfície de teste, em vez de partirem do princípio de que a recuperação do fago comprovava o reconhecimento do alvo pretendido. [7]

A afinidade, a seletividade e a função são propriedades diferentes

Três conceitos que são frequentemente confundidos entre si são:

afinidade, seletividade e função.

A afinidade diz respeito à força da interação em determinadas condições e no âmbito do modelo de interação adequado.

A seletividade descreve em que medida um candidato interage de forma preferencial com um determinado objetivo, em comparação com as alternativas relevantes.

Esta função diz respeito às consequências biológicas ou bioquímicas desse impacto.

Um péptido pode, portanto, apresentar:

• elevada afinidade, mas fraca seletividade;
• elevada seletividade, mas fraca ligação;
• ligação forte sem o efeito funcional esperado;
• atividade funcional através de um mecanismo inesperado.

Essas distinções determinam quais as experiências que devem ser realizadas a seguir.

Por exemplo:

ligação comprovada ≠ travagem comprovada.

Um péptido identificado num rastreio de ligação não deve ser automaticamente considerado um inibidor, caso a sua ação inibidora não tenha sido medida diretamente.

Vale a pena avaliar os candidatos com base em vários tipos de dados

A seleção de candidatos é mais fiável se não se basear exclusivamente num único parâmetro de classificação.

Entre outros aspetos, podem ser tidos em conta:

• amplitude do sinal;
• repetibilidade;
• manutenção do fundo;
• identidade da sequência;
• aumento em relação ao valor inicial;
• seletividade;
• família de sequências;
• capacidade de síntese autónoma;
• solubilidade;
• repetibilidade do teste;
• possibilidade de validação posterior.

A diversidade sequencial entre os resultados selecionados também pode ser útil.

A análise de representantes de várias famílias de sequências diferentes reduz a dependência de um único motivo ou clone potencialmente enganador.

No caso das bibliotecas especializadas, é particularmente útil comparar o número de exemplares antes e depois da seleção.

Uma sequência que já aparecia com grande frequência na biblioteca de partida pode ficar amplamente representada após o rastreio, sem que seja necessário um enriquecimento específico para o objetivo em questão.

A análise por sequenciação profunda de uma biblioteca de fagos não processada revelou uma representação inicial desigual. [4]

Um estudo sobre a vantagem reprodutiva demonstra, além disso, por que razão o simples número não deve ser automaticamente interpretado como um indicador de afinidade. [6]

No seu conjunto, estes resultados apontam para uma análise:

de que forma essa sequência foi enriquecida,

e não apenas:

qual sequência ficou em primeiro lugar no final da seleção.

Um resultado positivo na triagem ainda não é um candidato validado

Um «hit», ou seja, um resultado positivo, é um candidato que cumpre os critérios da triagem inicial.

Este é um resultado significativo.

No entanto, isso não encerra o processo de validação.

A confirmação deve responder, entre outras coisas, às seguintes questões: se o comportamento do candidato:

• é repetível;
• mantém-se após a aplicação das medidas de controlo adequadas;
• ocorre durante o exame individual;
• permanece visível após uma nova síntese;
• pode ser atribuída a uma partícula pretendida;
• continua a ser relevante num teste secundário adequado.

A caracterização posterior pode, em seguida, incluir propriedades relevantes para um objetivo específico da investigação.

A ressíntese é particularmente útil se a triagem inicial tiver utilizado um suporte, uma esfera, um sistema de apresentação ou uma mistura.

Uma síntese independente permite separar o candidato da forma inicial como este foi apresentado.

A confirmação da identidade e de outros parâmetros relevantes da amostra reforça ainda mais a relação entre o resultado observado e a molécula pretendida. Nesta fase, torna-se particularmente importante uma interpretação correta pureza dos péptidos e análises laboratoriais, uma vez que o resultado do HPLC, a confirmação da massa e o teor real do péptido respondem a diferentes questões analíticas.

A ordem correta é, portanto, a seguinte:

resultado positivo na triagem → resultado positivo confirmado → candidato caracterizado,

e não:

resultado positivo no rastreio → péptido funcional comprovado.

Uma classificação favorável, um modelo de acoplamento visualmente convincente ou a obtenção repetida de um resultado semelhante no mesmo teste, que é propenso a erros, não substituem automaticamente uma validação independente.

Conceção de sequências e ferramentas de previsão

A conceção começa pela definição do objetivo molecular

A conceção de um péptido pode começar por:

• de um tema conhecido;
• do péptido precursor;
• área de interação das proteínas;
• resultado obtido experimentalmente;
• modelo estrutural;
• sequência evolutiva;
• conjunto de dados relativos aos peptídeos analisados.

Em seguida, é possível analisar alterações como:

• substituições de aminoácidos;
• encurtamento de sequências;
• alongamento da sequência;
• ciclo;
• modificações nas extremidades;
• alteração da sequência de aminoácidos;
• outras modificações estruturais.

O objetivo tem de ser claramente definido.

Por exemplo:

previsão de ligação

não é a mesma tarefa que:

previsão do reconhecimento por parte da enzima,

e isso, por sua vez, não é o mesmo que:

previsão da solubilidade.

Uma modificação que melhora uma característica pode não afetar outra ou até mesmo ter um efeito negativo sobre ela.

A conceção prática de péptidos pode, portanto, exigir um equilíbrio entre vários objetivos concorrentes.

Um estudo experimental sobre substratos enzimáticos, apoiado por métodos experimentais, revelou uma abordagem orientada, na qual um algoritmo propunha candidatos, os experimentos bioquímicos avaliavam esses candidatos e os resultados obtidos influenciavam as decisões subsequentes relativas à seleção de sequências. [3]

Os cálculos apoiavam um objetivo experimental específico, não substituíam as medições.

A previsão baseada na sequência depende dos dados de treino

Um modelo computacional baseado em sequências aprende as relações entre as características dos péptidos e as etiquetas ou os resultados das medições presentes no conjunto de treino.

Dependendo do modelo, o resultado pode ser:

• classificação;
• um resultado semelhante à probabilidade;
• valor de classificação;
• propriedade quantitativa prevista;
• outro tipo de estimativa informática.

A interpretação depende do que as etiquetas utilizadas durante o treino realmente significavam.

Por exemplo, o termo „ativo” pode significar:

• ligação acima de um determinado limiar;
• transformação por uma enzima;
• atividade antimicrobiana;
• resposta celular;
• outro critério específico de um determinado teste.

Estas propriedades não são equivalentes.

Os conjuntos de dados podem também incluir resultados obtidos em diferentes condições experimentais.

Um péptido não testado não deve ser automaticamente considerado um resultado negativo confirmado apenas pelo facto de não existir um resultado positivo para o mesmo.

A avaliação do modelo é igualmente importante.

Se existirem sequências quase idênticas tanto no conjunto de treino como no de teste, o problema de previsão pode ser significativamente mais fácil do que prever as propriedades de péptidos verdadeiramente novos.

Por isso:

A elevada precisão geral do modelo não prova, por si só, a sua capacidade de generalização para novas sequências.

A generalização requer uma avaliação consciente

A generalização descreve a capacidade do modelo de manter a sua utilidade para além dos exemplos utilizados durante o treino.

Isto reveste-se de particular importância quando o peptídeo proposto difere significativamente dos dados de treino no que diz respeito a:

• sequência;
• comprimentos;
• classe estrutural;
• modificações químicas;
• alvo molecular;
• no contexto experimental.

Num estudo sobre a previsão da ligação ao recetor dos linfócitos T, analisou-se o impacto das diferenças entre os péptidos de treino e os péptidos de teste na avaliação dos modelos. [9]

A divisão dos conjuntos com base na semelhança das sequências e das estruturas não produziu resultados idênticos.

Isto demonstra por que razão uma única divisão dos dados de treino e de teste, ou um único valor que descreva a eficácia do modelo, pode não refletir plenamente o seu comportamento face a novos péptidos.

Isso não significa que os modelos preditivos de péptidos sejam, por natureza, pouco fiáveis.

Significa, pelo contrário, que o método de avaliação deve assemelhar-se à utilização real a que se destinam.

O que implica a ligação de peptídeos?

A simulação de ligação de péptidos é um método computacional utilizado para sugerir a forma como um péptido pode interagir com um recetor ou outro alvo molecular.

Os cálculos podem analisar diversos:

• conformações do péptido;
• orientações;
• itens;
• interações com o recetor;
• geometrias de interação.

Em seguida, os esquemas propostos são avaliados através de uma função de pontuação ou energética adequada.

O resultado da acoplagem pode, portanto, fornecer:

• potencial de ligação;
• resíduos propostos que participam na interação;
• hipóteses estruturais;
• classificação dos candidatos;
• estruturas iniciais para análises informáticas posteriores.

No entanto, é importante ter em conta o seguinte:

Fora da acoplagem, trata-se de uma hipótese e não de um complexo observado experimentalmente.

Da mesma forma:

A pontuação obtida no teste de ligação não corresponde automaticamente a uma constante de dissociação medida experimentalmente, à atividade celular nem à probabilidade de sucesso biológico.

A interpretação depende de:

• função pontual;
• método de amostragem da conformação;
• estruturas do recetor;
• flexibilidade do recetor;
• flexibilidade do péptido;
• pressupostos iniciais;
• protonação e representação molecular;
• calibração para uma tarefa específica.

A ligação de péptidos pode ser particularmente complexa, uma vez que os péptidos são frequentemente muito flexíveis.

Durante a ligação, tanto a sua conformação como a sua posição em relação ao alvo podem sofrer alterações significativas.

Rosetta FlexPepDock: o refinamento e o docking global são procedimentos diferentes

A publicação original relativa ao servidor FlexPepDock descreve um aperfeiçoamento do modelo de alta resolução, que tem início com um péptido posicionado aproximadamente na região de ligação ao recetor. [10]

Por isso, não se deve descrever esta ferramenta simplesmente como um método universal que permite descobrir qualquer local de ligação desconhecido sem informação estrutural.

O PIPER-FlexPepDock alarga este conceito no sentido de uma ligação global, combinando a inserção de fragmentos peptídicos com o posterior aperfeiçoamento flexível do modelo. [11]

Na publicação, este método foi avaliado num conjunto limitado, mas representativo, de complexos peptídeo-proteína determinados experimentalmente.

O sucesso no benchmark demonstra a eficácia nas condições testadas.

Não garante uma previsão correta para cada novo par recetor-peptídeo.

A documentação oficial do Rosetta distingue:

• aperfeiçoamento;
• modelização ab initio na vizinhança do local aproximado de ligação;
• fluxo de trabalho global do PIPER-FlexPepDock. [12]

Por isso, um relatório informático torna-se muito mais informativo se indicar:

qual protocolo FlexPepDock foi utilizado + que dados iniciais foram utilizados + como foram avaliadas as estruturas obtidas.

A própria afirmação:

„A Rosetta efetuou a acoplagem”

deixa muitas informações metodológicas importantes por esclarecer.

Os péptidos modificados requerem uma representação adequada

O modelo computacional tem de representar corretamente a estrutura molecular em estudo.

Uma sequência escrita exclusivamente com os códigos padrão de uma letra para os aminoácidos pode omitir informações químicas importantes.

Podem ser, entre outros:

• amidização do extremo C;
• acetilação do extremo N-terminal;
• aminoácidos não convencionais;
• D-aminoácidos;
• ciclo;
• ligações covalentes transversais;
• fosforilação;
• outras alterações.

Num estudo que utilizou o FlexPepDock, foi analisada a modelação peptídeo-MHC, incluindo resíduos não padrão e modificações selecionadas dos peptídeos. [13]

Os autores obtiveram resultados de referência úteis e observaram uma relação entre os resultados calculados e a ligação relativa medida experimentalmente no conjunto em análise.

Isto apoia uma aplicação concreta da modelação que já foi testada.

No entanto, isso não significa que todas as modificações possíveis sejam automaticamente representadas de forma correta, nem que a simulação de acoplamento substitua a medição experimental da ligação.

CHARMM-GUI, modelos de péptidos e amidização do extremo C-terminal

O CHARMM-GUI disponibiliza ferramentas para a preparação de arranjos moleculares para simulação.

A documentação oficial salienta que os resíduos modificados requerem definições estruturais e parâmetros do campo de forças adequados. [14]

A geração bem-sucedida dos dados de entrada para a simulação significa, portanto, que foi preparada uma representação computacional do sistema.

Não confirma experimentalmente:

• identidade do péptido;
• soluções;
• função biológica;
• estabilidade;
• atividades.

No caso de um péptido amidado na extremidade C-terminal, o grupo químico terminal é um amido e não um grupo carboxilo livre.

Esta diferença pode afetar:

• carga formal;
• ligações de hidrogénio;
• interações eletrostáticas;
• conformação;
• interações com o ambiente molecular circundante.

A estrutura, a topologia e os parâmetros do campo de força utilizados na simulação devem, portanto, representar a mesma forma final que está a ser estudada experimentalmente.

Num estudo sobre o maximin H5, foram combinados métodos experimentais e de simulação para avaliar as consequências da alteração da forma do extremo C-terminal. [15]

Foram observadas diferenças na estrutura e nas interações com as membranas neste péptido específico.

Isso não significa que a amidização melhore as propriedades de todos os péptidos.

Mostram, pelo contrário, por que razão a química dos grupos terminais não deve ser ignorada na descrição molecular.

Por isso, a procura de opções de amidação num programa de construção de péptidos deve começar com uma questão química:

Que forma molecular específica é que deve ser modelada?

Só depois de esclarecida esta questão é que a escolha das configurações do software ganha significado.

Validação experimental e repetibilidade

Analisa de forma independente a molécula em questão

O candidato selecionado deverá, por fim, ser analisado como material molecular definido.

As características relevantes podem incluir:

• a sequência exata;
• forma das terminações;
• determinadas modificações;
• identidade molecular;
• outras características relevantes para a experiência.

Se a triagem inicial tiver utilizado a técnica de phage display ou péptidos ligados a esferas, as experiências subsequentes poderão verificar se o péptido isolado mantém a propriedade medida fora do sistema de apresentação inicial.

Num estudo inicial sobre o phage display, compararam-se os péptidos apresentados em fagos com os seus equivalentes sintetizados quimicamente. [1]

Isto demonstra como um estudo independente pode associar o resultado da seleção da biblioteca ao comportamento da própria molécula peptídica.

A qualidade e as características da amostra também são importantes.

Diferenças relativas a:

• de uma determinada concentração;
• solubilidade;
• limpeza;
• agregação;
• forma final;
• modificações químicas

podem influenciar as comparações experimentais.

Duas amostras designadas com o mesmo nome de péptido não têm necessariamente de ser quimicamente equivalentes, caso as respetivas formas moleculares não tenham sido definidas. Por isso, antes de interpretar a experiência, é útil distinguir os conceitos de identidade, pureza e quantidade real do material, discutidos mais detalhadamente no artigo sobre pureza dos péptidos e análises laboratoriais.

Um teste adicional tem maior utilidade quando responde a uma dúvida específica

O teste ortogonal analisa uma determinada propriedade utilizando um princípio de medição diferente ou um método experimental distinto.

O seu maior valor reside na possibilidade de verificar uma explicação alternativa concreta.

Um segundo teste pode, por exemplo, ajudar a determinar se o resultado inicial se deveu a:

• fixação à superfície;
• interferência do marcador;
• comportamento dependente do suporte;
• efeitos da imobilização;
• outro artefacto característico do primeiro teste.

O simples facto de se utilizarem dois modelos diferentes de dispositivos não significa, por si só, que as medições sejam ortogonais.

Se ambos os testes utilizarem o mesmo método de imobilização ou o mesmo princípio de deteção, podem estar sujeitos a uma fonte de erro idêntica.

A questão mais importante é a seguinte:

Que explicação alternativa é testada pela segunda experiência?

A coerência entre métodos verdadeiramente complementares constitui, normalmente, um apoio mais sólido do que a repetição múltipla da mesma leitura, que está sujeita a erros.

Replicação e contexto biológico

Os diferentes tipos de replicação permitem avaliar as diversas fontes de incerteza.

As repetições técnicas ajudam a avaliar a repetibilidade no âmbito do mesmo esquema experimental.

As repetições independentes da experiência podem ter em conta a variabilidade adicional entre as preparações ou as séries de ensaios.

As experiências que utilizam amostras biológicas podem também exigir que se tenham em conta as diferenças entre:

• dadores;
• preparações celulares;
• organismos;
• tecidos;
• outras fontes de material biológico.

Num estudo que utilizou peptídeos sobrepostos, foi analisada a reconhecimento por parte dos linfócitos T em amostras provenientes de dadores e foi utilizada uma biblioteca para identificar as regiões reconhecidas. [5]

As respostas observadas dependiam do contexto biológico.

O resultado obtido para um único dador ou um único sistema experimental não deve ser automaticamente generalizado a todas as pessoas ou a todos os sistemas biológicos.

A repetibilidade significa, portanto, a possibilidade de reproduzir uma determinada afirmação em condições devidamente descritas.

Não significa apenas obter mais um gráfico com um aspeto semelhante.

A documentação deve permitir reconstituir a análise

Uma boa investigação sobre uma biblioteca de péptidos requer documentação suficiente para que outro investigador possa compreender como se chegou ao resultado.

Os dados experimentais úteis incluem:

• a sequência exata do péptido;
• comprimento do péptido;
• grupos finais;
• modificações químicas;
• a arquitetura da biblioteca;
• identificadores das amostras;
• condições do rastreio;
• ponto final medido;
• inspeções;
• estrutura das repetições;
• método de definição do fundo;
• limiar de qualificação de um acerto;
• critérios de seleção dos candidatos;
• métodos analíticos utilizados.

Nos estudos informáticos, podem ser importantes:

• nome do software;
• versão;
• ata;
• estrutura de entrada;
• forma de representar uma molécula;
• conjunto de parâmetros;
• tratamento de dados;
• forma de divisão dos conjuntos de treino e de teste;
• método de pontuação;
• procedimento de classificação dos candidatos;
• critérios de seleção.

Manter apenas o modelo com a classificação mais elevada, a melhor imagem de acoplamento ou a sequência final pode impedir que se recrie posteriormente a forma como se chegou ao resultado.

As características da própria biblioteca também constituem um elemento de repetibilidade.

Estudos sobre a composição das bibliotecas específicas e a carga das esferas mostram que pode existir variabilidade mesmo antes do início do rastreio. [4] [8]

Registar apenas o resultado final pode, portanto, omitir informações importantes relativas ao material inicial.

As previsões positivas e os resultados negativos são igualmente importantes

Um candidato previsto por simulação computacional, que não tenha sido confirmado experimentalmente, pode ainda assim fornecer informações úteis.

Pode revelar:

• limitações do modelo;
• pressuposto mecanicista errado;
• representação insuficiente da característica química;
• problema com a hipótese relativa ao teste;
• região do espaço sequencial em que o modelo apresenta fraca generalização.

Esses resultados não devem ser excluídos da avaliação apenas pelo facto de não terem confirmado a previsão inicial.

A conceção iterativa ganha mais valor quando as observações experimentais — incluindo os resultados inesperados e negativos — influenciam as decisões subsequentes.

O estudo sobre a conceção de substratos enzimáticos seguiu o ciclo geral:

previsão → medição experimental → aperfeiçoamento do modelo com base nos dados. [3]

O seu valor científico decorria da combinação de cálculos com a observação, e não do facto de se considerar a primeira classificação como a resposta definitiva.

A conclusão mais forte deve, portanto, definir com precisão o que foi demonstrado:

• enriquecimento;
• solução;
• comportamento como substrato enzimático;
• inibição;
• resposta celular;
• previsão computacional;
• eficácia no benchmark estrutural.

Cada um destes resultados pode ter valor científico.

No entanto, não se deve substituir um pelo outro.

Os erros mais comuns na interpretação das bibliotecas de péptidos

Os resultados dos estudos com bibliotecas de péptidos podem ser enganadores se as conclusões forem além do que foi efetivamente medido.

Um dos erros mais comuns é considerar a dimensão teórica da biblioteca como uma diversidade comprovada experimentalmente. As bibliotecas físicas podem caracterizar-se por uma representação desigual, elementos em falta, duplicados ou cargas resultantes do processo de síntese. [4]

Outro erro consiste em considerar o enriquecimento como prova de afinidade. O enriquecimento pode também resultar de uma vantagem na proliferação, na ligação à superfície ou noutras propriedades relacionadas com o processo de seleção. [6] [7]

O terceiro problema é a equiparação entre a ligação e a função. Um péptido pode interagir com o alvo sem provocar o efeito biológico pretendido.

Da mesma forma, o resultado da ligação não deve ser considerado como uma medição experimental da afinidade. Os resultados pontuais provêm de modelos informáticos e requerem validação antes de serem considerados como prova quantitativa da ligação. [10] [11] [13]

Um péptido virtual também não é, automaticamente, um péptido que possa ser facilmente obtido na sua forma química correta. A síntese, a solubilidade, a identidade molecular e as características da amostra continuam a ser questões experimentais.

Por fim, o resultado obtido para o péptido apresentado num fago, imobilizado na superfície ou ligado a uma esferinha pode não ser reproduzido pela respetiva molécula livre, uma vez que o próprio modo de apresentação pode influenciar a conformação, a acessibilidade, densidade local e avididade.

Estas limitações não diminuem o valor das bibliotecas de péptidos.

Determinam, contudo, a forma como se devem interpretar os elementos de prova por elas apresentados.

Perguntas mais frequentes

1. O que é uma biblioteca de peptídeos sobrepostos?

A biblioteca de peptídeos sobrepostos é um conjunto de fragmentos que abrangem uma sequência-mãe mais longa, sendo que os peptídeos adjacentes partilham uma parte da sequência de aminoácidos. Esta abordagem ajuda os investigadores a identificar regiões associadas ao reconhecimento ou a outra resposta medida. Um estudo que utilizou fragmentos sobrepostos da proteína meningocócica demonstrou a aplicação desta método no mapeamento da resposta dos linfócitos T em amostras provenientes de dadores. [5] No entanto, um resultado positivo para um fragmento não identifica automaticamente o epítopo mínimo, não prova que cada resíduo comum seja necessário e não significa que o fragmento reproduza exatamente a estrutura e o processamento da proteína completa.

2. Será que as previsões computacionais podem substituir as experiências?

Não. As previsões computacionais podem ajudar a estabelecer prioridades entre os candidatos, a identificar padrões, a formular hipóteses estruturais e a reduzir o número de sequências que requerem análise experimental imediata. No entanto, a sua fiabilidade depende do modelo, dos dados de treino, da forma de representação das moléculas, dos pressupostos adotados e da tarefa específica. Num estudo sobre a conceção de substratos enzimáticos, os peptídeos selecionados pelo algoritmo foram testados repetidamente e os resultados experimentais foram utilizados para rondas sucessivas de seleção. [3] Isto demonstra a colaboração entre métodos computacionais e a experiência, e não a substituição da experiência pelo modelo. O candidato continua a ser uma previsão computacional enquanto a sua propriedade relevante não for avaliada experimentalmente.

3. A biblioteca de péptidos é um conjunto físico ou uma base de dados?

Pode ser uma coisa ou outra. As bibliotecas físicas contêm moléculas que podem ser diretamente estudadas experimentalmente, enquanto as bibliotecas virtuais contêm sequências digitais, estruturas moleculares ou outras representações computacionais. Os primeiros estudos «one-bead–one-peptide» incidiram em bibliotecas físicas sintéticas, enquanto os métodos de conceção computacional analisam representações moleculares antes da síntese dos candidatos selecionados. [2] [3] A mera presença de uma sequência numa biblioteca virtual não confirma que o peptídeo correspondente tenha sido sintetizado corretamente, possua a forma química pretendida ou apresente a propriedade prevista. Por isso, ao referir-se à dimensão de uma biblioteca ou aos resultados de um rastreio, deve-se sempre especificar o seu formato.

4. Será que uma biblioteca maior leva sempre a encontrar melhores candidatos?

Não. A dimensão da biblioteca só é relevante se esta contiver uma diversidade significativa, acessível, identificável e devidamente representada. O sequenciamento profundo da biblioteca de fagos revelou desequilíbrios na abundância das sequências, bem como fatores que reduzem a diversidade efetiva, apesar do amplo âmbito do projeto planeado. [4] As bibliotecas de muito grande dimensão também podem agravar os problemas relacionados com a amostragem e a interpretação, uma vez que nem todos os elementos teoricamente possíveis têm de estar efetivamente presentes ou a ser devidamente analisados. A qualidade dos candidatos depende, portanto, da composição da biblioteca, do projeto de triagem, da qualidade do teste, do controlo e da validação, e não apenas do número anunciado de sequências possíveis.

5. Será que as bibliotecas de péptidos aleatórias estão realmente isentas de preconceitos?

Nem sempre. Uma conceção aleatória pode ainda conduzir a uma representação desigual de nucleótidos, aminoácidos e sequências completas. A produção biológica, a multiplicação, a química de síntese e a amostragem podem introduzir novas fontes de viés. O sequenciamento profundo de uma biblioteca fágica comercial revelou uma representação desigual mesmo antes do início da seleção em função do alvo. [4] Isto não significa que todas as bibliotecas aleatórias sejam pouco fiáveis. Mostram, sim, que „projeto aleatório” e „uniformidade confirmada experimentalmente” são duas afirmações diferentes. As características da biblioteca inicial ajudam a distinguir uma grande abundância inicial do enriquecimento real dependente da seleção.

6. De que forma a técnica de phage display permite identificar a sequência de um péptido?

A técnica de «phage display» associa o péptido apresentado na superfície de um bacteriófago à informação genética contida no interior da mesma partícula. Os fagos selecionados podem, assim, ser recuperados, e as sequências peptídicas correspondentes determinadas com base no material genético associado. Os primeiros estudos com péptidos aleatórios apresentados em fagos filamentosos utilizaram esta relação entre o genótipo e o fenótipo para recuperar e caracterizar ligantes de ligação. [1] No entanto, a simples recuperação do fago não prova a especificidade em relação ao alvo, uma vez que a abundância pode ser influenciada por interações com a superfície, diferenças na multiplicação e outras pressões seletivas. A ligação genética permite determinar a identidade do candidato, e experiências posteriores ajudam a esclarecer a razão da sua seleção.

7. Por que é que um fago pode ser enriquecido sem se ligar ao alvo pretendido?

Vários mecanismos podem conduzir a um enriquecimento não relacionado com o objetivo pretendido. O fago pode interagir com a superfície de teste, tolerar excepcionalmente bem as condições de seleção ou multiplicar-se de forma mais eficaz do que os clones concorrentes. Em estudos separados, foi demonstrada a recuperação associada ao poliestireno e o enriquecimento relacionado com a vantagem na propagação. [6] [7] Trata-se de mecanismos diferentes que exigem controlos distintos. O enriquecimento deve, portanto, ser interpretado como prova de que o clone sobreviveu e aumentou a sua representação durante o processo de seleção. A demonstração de um reconhecimento específico do alvo requer provas adicionais que permitam distinguir essa possibilidade de explicações alternativas.

8. O que significa «one-bead–one-compound»?

O conceito «one-bead–one-compound» significa que cada esferinha deve, em princípio, apresentar várias cópias de um composto específico, o que permite que a esferinha selecionada possa, em última análise, ser associada a um único elemento da biblioteca. Este conceito permite a criação de grandes bibliotecas combinatórias sintéticas e foi apresentado nos primeiros estudos sobre «one-bead–one-peptide». [2] No entanto, o termo descreve a organização pretendida da biblioteca, não garantindo uma carga idêntica, uma síntese perfeita nem a homogeneidade química de cada esfera. Medições posteriores de esferas individuais revelaram diferenças significativas na quantidade de péptido apresentado. [8] A qualidade do material e a carga permanecem, portanto, características que exigem uma avaliação experimental.

9. A quantidade de péptido presente na esfera pode influenciar o resultado do rastreio?

Sim. Uma esfera que apresente uma maior quantidade de péptido disponível pode gerar um sinal de teste mais forte, mesmo quando a própria interação molecular não é mais forte. Num estudo que utilizou a espectroscopia Raman para analisar bibliotecas do tipo «one-bead–one-compound», constatou-se uma variabilidade significativa na quantidade de peptídeo, especialmente no caso de sequências mais longas. [8] O estudo não determina o impacto da carga em todos os sistemas de rastreio possíveis, mas identifica a fonte de variabilidade que pode influenciar a intensidade do sinal. Os resultados da triagem em esferas devem, portanto, ser interpretados tanto no contexto da própria interação molecular como da densidade do material apresentado.

10. A ligação é o mesmo que a atividade biológica?

Não. A ligação refere-se à interação entre moléculas em determinadas condições. A atividade biológica ou bioquímica requer um ponto final definido separadamente. Um péptido pode ligar-se a uma proteína, mas não a ativar nem inibir, e a resposta celular pode surgir através de um mecanismo diferente da interação prevista com o alvo. Os estudos de phage display centraram-se principalmente na ligação, enquanto o estudo que utilizou a aprendizagem automática incidiu sobre o comportamento dos peptídeos enquanto substratos enzimáticos. [1] [3] Trata-se de questões científicas distintas. A descoberta resultante da triagem deve, portanto, ser descrita de acordo com a propriedade que foi efetivamente medida, sem lhe atribuir uma ação mais ampla.

11. Por que razão vale a pena voltar a sintetizar e analisar individualmente um resultado?

A síntese independente ajuda a determinar se um determinado péptido definido reproduz efetivamente o comportamento observado fora do sistema de biblioteca original. A ligação ao fago, a quantidade de material por esfera, os efeitos de mistura, as interações com o suporte ou outros elementos do rastreio podem influenciar o resultado inicial. Nos primeiros estudos de phage display, os ligantes apresentados foram comparados com peptídeos obtidos por síntese química, o que ilustra esta fase de confirmação. [1] A ressíntese é mais informativa quando o material obtido é devidamente caracterizado e testado num ensaio relacionado com a hipótese inicial. A síntese, por si só, ainda não confirma a função nem o mecanismo.

12. O que prevê o Rosetta FlexPepDock?

O Rosetta FlexPepDock modela as estruturas de complexos peptídeo-proteína, mas os diferentes procedimentos associados ao FlexPepDock pressupõem diferentes níveis de informação inicial. A publicação original sobre o servidor descreve, acima de tudo, o aperfeiçoamento de alta resolução do modelo de um péptido que já se encontra, aproximadamente, próximo do local de ligação ao recetor. [10] O PIPER-FlexPepDock utiliza uma estratégia mais abrangente de acoplamento global, seguida de um aperfeiçoamento flexível do modelo. [11] Os resultados dos testes comparativos não garantem a exatidão para cada novo par peptídeo-proteína. Por isso, um relatório útil deve indicar o protocolo utilizado, as informações iniciais e o método de avaliação das estruturas previstas.

13. Um resultado favorável no teste de acoplamento confirma uma ligação forte?

Não. O resultado da ligação é um valor gerado por uma função pontual computacional e não é automaticamente equivalente a uma afinidade medida experimentalmente, como a constante de dissociação. O seu significado depende do protocolo de acoplamento, da representação molecular, do método de amostragem de conformações, do alvo em estudo e da calibração. No estudo FlexPepDock sobre complexos peptídeo-MHC, os resultados computacionais foram comparados com medições relativas de ligação num conjunto de dados específico, demonstrando que tais relações devem ser investigadas e não assumidas. [13] Um resultado favorável na ligação pode ajudar a estabelecer prioridades entre os candidatos ou a apoiar uma hipótese estrutural, mas uma ligação forte requer provas experimentais adequadas.

14. Por que razão a amidização do extremo C é importante na modelação de péptidos?

A amidização do extremo C altera o grupo químico presente no terminal do péptido e pode influenciar a carga formal, as ligações de hidrogénio, as interações eletrostáticas e a conformação da molécula. O modelo computacional deve, portanto, apresentar a mesma química terminal que o péptido estudado experimentalmente. Nos estudos com o maximin H5, observaram-se diferenças na estrutura e nas interações com as membranas relacionadas com a alteração da forma terminal. [15] Isto não prova que a amidização melhore sempre as propriedades dos peptídeos. No entanto, demonstra por que razão a química dos grupos terminais deve ser corretamente definida e representada no modelo.

15. A geração do modelo no CHARMM-GUI confirma as propriedades do péptido?

Não. O CHARMM-GUI ajuda a preparar sistemas moleculares para simulação. A criação bem-sucedida de uma estrutura ou de ficheiros de entrada significa que foi criada uma representação computacional do sistema em estudo; não confirma experimentalmente a ligação, a atividade biológica, a estabilidade nem a relevância clínica. A documentação oficial indica também que os resíduos modificados requerem definições estruturais e parâmetros adequados. [14] A preparação do modelo computacional é, portanto, o ponto de partida para a modelização posterior. Se a molécula real se comporta de acordo com as previsões, essa é uma questão experimental à parte.

16. Por que é que o modelo preditivo pode falhar no caso de um novo péptido?

Um novo péptido pode diferir dos exemplos utilizados durante o treino de uma forma que o modelo não tenha aprendido a representar corretamente. As diferenças podem dizer respeito à sequência, à estrutura, ao comprimento, às modificações, ao alvo molecular ou a outras características. Um estudo sobre modelos de previsão da ligação aos recetores dos linfócitos T revelou que a avaliação da eficácia variava consoante a forma como se levava em conta a semelhança sequencial e estrutural entre os péptidos de treino e os de teste. [9] Isto não significa que todas as previsões de novas sequências sejam erradas. Mostrará, no entanto, que as estatísticas gerais de eficácia do modelo devem ser interpretadas no contexto do grau de semelhança entre as condições de teste e a sua aplicação prevista.

17. O que faz com que os resultados das análises das bibliotecas de péptidos sejam repetíveis?

A repetibilidade requer informação suficiente que permita definir a biblioteca, a molécula candidata, as condições experimentais, os controlos, o método de análise e os critérios para considerar um resultado como um acerto. Estudos sobre a composição das bibliotecas de fagos e a quantidade de peptídeos nas esferas demonstram que a variabilidade pode existir mesmo antes do início da triagem. [4] [8] A apresentação apenas da sequência final e da pontuação ignora, portanto, fontes potencialmente importantes de variação. Estudos repetíveis exigem um relato claro das sequências, modificações, arquitetura da biblioteca, identificadores das amostras, parâmetros de avaliação do teste, controlos, critérios analíticos, parâmetros informáticos e a confirmação independente do resultado principal.

18. Será que o peptídeo mais enriquecido tem de ser o melhor ligando?

Não. Um elevado enriquecimento pode resultar da ligação ao alvo, mas também pode ser influenciado pela abundância inicial das sequências, pela eficiência de replicação, por interações não específicas com a superfície e por outras propriedades relacionadas com a seleção. O sequenciamento profundo revelou uma representação inicial desigual das bibliotecas de fagos, e outros estudos documentaram um enriquecimento associado à vantagem na multiplicação. [4] [6] Por conseguinte, a sequência final mais abundante não deve ser automaticamente identificada como o ligante com maior afinidade. Provas mais sólidas são obtidas através da comparação das abundâncias inicial e final, de controlos adequados e de uma medição independente da ligação.

19. A sequência peptídica prevista comprova que é possível sintetizá-la com sucesso?

Não. Um projeto informático cria uma sequência ou uma hipótese molecular, mas não garante o sucesso da síntese. Algumas sequências podem causar problemas relacionados com a eficiência da ligação, a agregação, a purificação, a solubilidade ou as modificações químicas. A biblioteca virtual pode, portanto, conter candidatos com uma viabilidade sintética muito variável. Só a obtenção experimental do material e a sua caracterização analítica permitem determinar se a molécula pretendida foi efetivamente obtida. A priorização computacional e a viabilidade química são etapas de investigação interligadas, mas distintas.

20. Será que o péptido selecionado no phage display pode comportar-se de forma diferente quando se trata de uma molécula livre?

Sim. No phage display, o péptido encontra-se num ambiente ligado ao suporte, o que pode influenciar a sua conformação, orientação, acessibilidade, densidade local e avididade. O péptido livre não possui algumas dessas características e, por isso, pode apresentar um comportamento aparente diferente durante a ligação. Nos primeiros estudos sobre o phage display, compararam-se os ligantes apresentados nos fagos com os seus equivalentes sintetizados quimicamente, o que demonstra a importância desta distinção experimental. [1] Uma seleção fágica bem-sucedida constitui, portanto, uma prova valiosa relativamente à sequência apresentada, sendo, no entanto, necessário um estudo independente para determinar o comportamento do péptido livre correspondente.

Limitações das evidências provenientes de bibliotecas de peptídeos e de previsões

Ao interpretar os resultados dos ensaios com bibliotecas de péptidos, é importante ter em conta algumas limitações.

Em primeiro lugar, a diversidade teórica não é o mesmo que a diversidade experimental real. A representação desigual, os problemas sintéticos, as diferenças na amplificação e o método de amostragem podem alterar a composição real da biblioteca. [4]

Em segundo lugar, o enriquecimento observado durante o rastreio não confirma automaticamente uma ligação específica ao alvo. As interações com a superfície e a vantagem na proliferação podem conduzir ao enriquecimento através de mecanismos diferentes. [6] [7]

Em terceiro lugar, a forma de apresentação é importante. Os péptidos ligados a fagos, esferas ou superfícies podem comportar-se de forma diferente das mesmas moléculas em solução, devido à sua disponibilidade, orientação, densidade local ou avididade. [1] [8]

Em quarto lugar, a ligação, a seletividade e a função são propriedades diferentes. A demonstração de uma delas não confirma automaticamente as restantes.

Em quinto lugar, a previsão computacional depende do modelo. Os dados de treino, o método de avaliação, a representação molecular e os pressupostos adotados determinam o significado que se pode atribuir ao resultado. [3] [9]

Em sexto lugar, os resultados da ligação não são medições experimentais da afinidade. Os modelos estruturais e as funções pontuais podem ajudar na seleção de hipóteses, mas o comportamento real durante a ligação requer medições experimentais. [10] [11] [13]

Em sétimo lugar, a forma química é importante. Os grupos terminais, os aminoácidos não convencionais, a estereoquímica e outras modificações devem ser apresentados corretamente, tanto nas descrições experimentais como nos modelos computacionais. [13] [14] [15]

Por fim, um resultado positivo no rastreio é o início da validação, e não o seu fim. A preparação independente do material, a caracterização molecular, os controlos, os testes complementares e a replicação reforçam gradualmente as evidências disponíveis.

Resumo

As bibliotecas de péptidos permitem a investigação sistemática do vasto espaço de sequências moleculares possíveis.

Permitem comparar vários candidatos e analisar questões relacionadas com:

• reconhecimento molecular;
• substratos enzimáticos;
• motivos sequenciais;
• solução;
• relações estrutura-atividade;
• respostas celulares;
• previsões computacionais.

No entanto, o termo „biblioteca de péptidos” abrange vários formatos de investigação essencialmente diferentes.

A biblioteca de peptídeos sobrepostos ajuda a mapear regiões de uma sequência mais extensa.

A biblioteca de substituições direcionada permite analisar o significado de cada elemento.

A biblioteca de phage display associa o péptido apresentado à informação genética e permite a seleção.

A biblioteca «one-bead–one-compound» organiza candidatos sintéticos em esferas individuais.

A biblioteca virtual existe em formato digital e pode ser utilizada para definir as prioridades da sequência antes do início dos ensaios experimentais.

Estes formatos não devem ser considerados intercambiáveis.

A dimensão da biblioteca também requer uma interpretação cautelosa.

Uma coleção teórica que abrange milhões de sequências possíveis não prova que cada um dos seus elementos esteja fisicamente presente, seja representada de forma uniforme, seja quimicamente correta e tenha sido efetivamente incluída no rastreio. Estudos que utilizam sequenciação profunda mostram por que razão a composição real da biblioteca pode diferir da diversidade planeada. [4]

Da mesma forma, o enriquecimento não é sinónimo de uma afinidade específica com o objetivo.

Os clones fágicos podem ser enriquecidos em resultado de mecanismos não relacionados com o alvo específico, tais como a interação com a superfície ou a vantagem na multiplicação. [6] [7]

É por isso que as inspeções adequadas e os estudos independentes são tão importantes.

A mesma cautela aplica-se à conceção de péptidos por computador.

Os modelos sequenciais e as ferramentas de acoplamento podem ajudar a identificar candidatos promissores e a formular hipóteses mecanistas, mas as suas previsões dependem dos dados de treino, das representações estruturais, das funções pontuais e dos pressupostos iniciais. [3] [9] [10] [11]

Um resultado favorável na ligação não confirma, por si só, uma forte ligação experimental.

Uma sequência gerada por computador não prova que seja possível sintetizá-la corretamente.

A interação prevista não confirma a função biológica.

O processo de descoberta de péptidos mais informativo considera, portanto, os diferentes tipos de evidências como etapas distintas, mas que se complementam mutuamente:

conceção → construção da biblioteca → triagem → identificação de resultados → confirmação independente → caracterização → aperfeiçoamento computacional → validação experimental.

A força da conclusão final depende da forma como estas etapas foram cuidadosamente interligadas.

A regra mais importante pode ser resumida de forma simples:

A biblioteca apresenta possibilidades, a análise preliminar identifica sinais, o modelo gera previsões e a validação determina quais as conclusões que são efetivamente corroboradas por provas experimentais.

Aviso legal

Este artigo tem caráter exclusivamente educativo e científico-informativo. Descreve os princípios gerais relativos às bibliotecas de péptidos, à tecnologia de phage display, ao rastreio de péptidos sintéticos, à conceção de sequências, à previsão computacional, ao acoplamento de péptidos, à modelação molecular, à validação experimental e à repetibilidade dos estudos. Não constitui aconselhamento médico, recomendação terapêutica, instruções de utilização de peptídeos, informações relativas à dosagem nem orientações sobre a sua administração a seres humanos. As previsões computacionais, os resultados positivos obtidos durante o rastreio, os resultados do acoplamento e os resultados experimentais pré-clínicos não devem ser interpretados como prova de que um determinado péptido é seguro, eficaz, clinicamente validado ou adequado para utilização em seres humanos.

Referências

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