Pureza dos peptídeos e análises laboratoriais: como interpretar o certificado de análise (COA)

A pureza do péptido descreve a composição da amostra determinada através de um método analítico específico. Por si só, não confirma a identidade completa do péptido, a quantidade real do péptido na amostra, a esterilidade, a atividade biológica, a estabilidade nem a segurança. O certificado de análise, mais frequentemente designado pela sigla COA, é mais útil quando cada resultado nele indicado é considerado como uma resposta a uma questão analítica específica.

Por isso, uma informação como „99% de pureza” requer um contexto adequado.

Será que 99% significa que o pico cromatográfico principal é responsável por 99% da resposta total integrada do detetor na análise HPLC? Este valor representa a fração em massa do péptido alvo, tendo em conta a água, os contra-iões e outros componentes? A pureza estereoquímica foi avaliada? Que tipo de impurezas pode este método detetar e quais podem ficar fora do seu âmbito?

Estas distinções são importantes, uma vez que vários parâmetros diferentes são frequentemente designados coloquialmente com a mesma palavra „pureza”, embora, na realidade, descrevam propriedades diferentes da amostra.

Os estudos sobre a análise de péptidos mostram por que razão isto é importante. Impurezas estruturalmente semelhantes podem, por vezes, permanecer ocultas num pico cromatográfico aparentemente simples, enquanto a água, os contra-iões, os resíduos de outras substâncias e os compostos relacionados podem influenciar a massa total do material peptídico isolado. [1] [2]

Trata-se de problemas analíticos distintos, que exigem diferentes tipos de provas.

Por isso, ao avaliar o COA de um péptido, é mais útil do que a própria pergunta:

„Qual é a percentagem de pureza?”

A questão é a seguinte:

„O que foi medido exatamente, com que método, em que amostra e que conclusão se pode realmente tirar dessa medição?”

O que significa, afinal, a pureza de um péptido?

A pureza é um resultado baseado num método específico

A palavra „pureza” pode sugerir uma única característica facilmente mensurável. Na prática, porém, os laboratórios podem expressar a pureza de um péptido de várias formas diferentes.

Pode tratar-se, entre outros, de:

• percentagem da área cromatográfica;
• participação em massa;
• pureza química;
• pureza estereoquímica;
• perfil de poluentes associados à sequência;
• pureza determinada de acordo com um método analítico específico.

Estes valores não devem ser considerados intercambiáveis.

A pureza cromatográfica descreve, normalmente, a parte da resposta integrada do detetor atribuída ao componente principal da amostra.

A proporção em massa define a massa de uma determinada substância em relação à massa total do material analisado.

A pureza estereoquímica, por sua vez, diz respeito à proporção das diferentes configurações espaciais da molécula ou dos resíduos de aminoácidos que a compõem.

Por isso, uma informação sobre a limpeza apresentada de forma correta deve, na medida do possível, responder a quatro perguntas:

o que foi medido + como foi medido + como foi calculado o resultado + que amostra foi analisada.

A própria afirmação:

„99% de pureza”

transmite muito menos informação do que:

„99% da área do pico principal, de acordo com o RP-HPLC-UV”.

No entanto, nem mesmo a segunda versão responde a todas as perguntas.

É ainda necessário saber se o método cromatográfico utilizado era capaz de separar os contaminantes relevantes e se o detetor utilizado era capaz de os detetar.

O que significa a percentagem da área de pico no HPLC?

De forma simplificada, o cálculo baseado na normalização da área dos picos pode ser apresentado da seguinte forma:

área do pico principal ÷ área total dos picos considerados × 100.

Se ao pico principal tiverem sido atribuídas 990 unidades de área e a soma do sinal cromatográfico considerado for de 1000 unidades, a área do pico principal será de:

990 ÷ 1000 × 100 = 99%.

Trata-se de informação relativa à resposta do detetor obtida em determinadas condições cromatográficas.

Isso não significa automaticamente que:

99% da massa física do pó corresponde ao péptido alvo.

Existem várias razões para esta diferença.

Diferentes compostos químicos podem gerar respostas diferentes do detetor por unidade de massa.

Alguns componentes da amostra podem absorver pouco a radiação na comprimento de onda utilizada.

Outros podem nem sequer ser tidos em conta nos cálculos cromatográficos.

Algumas impurezas também podem ser eluídas juntamente com o componente principal.

A palavra „considerados” também é importante.

Os cálculos cromatográficos dependem das decisões relativas a:

• integração de picos;
• limiares de comunicação;
• escolha da linha de referência;
• sinais relacionados com o solvente;
• picas não distribuídas;
• configurações do detetor;
• regras para excluir determinados sinais.

Por isso, a percentagem da área do HPLC deve ser interpretada como o resultado de um método cromatográfico específico e não como uma descrição universal de toda a composição física da amostra.

Os contaminantes semelhantes podem ser difíceis de separar

As impurezas presentes nos péptidos podem ser estruturalmente muito semelhantes à molécula pretendida.

Podem incluir, entre outros:

• sequências de deleção;
• sequências abreviadas;
• cadeias laterais alteradas;
• formas oxidadas;
• grupos terminais modificados;
• isómeros posicionais;
• estereoisómeros;
• produtos de cobertura não integral;
• outras variantes que surgem durante síntese de péptidos ou degradação.

Algumas destas estruturas podem apresentar um comportamento cromatográfico significativamente diferente do do péptido-alvo.

Outros podem comportar-se de forma muito semelhante.

Num dos estudos, utilizou-se cromatografia líquida bidimensional combinada com espectrometria de massas para avaliar a pureza do pico peptídico principal. Os investigadores aplicaram condições de separação adicionais, uma vez que os isómeros peptídicos com a mesma relação massa/carga não podiam ser distinguidos apenas com base na medição de massa de rotina. [1]

Num outro estudo que envolveu quatro péptidos cíclicos sintéticos, comparou-se a cromatografia de fases invertidas com a cromatografia de interações hidrofílicas.

Ambas as métodos separavam os contaminantes de forma diferente. [3]

Isso não significa que uma dessas técnicas seja sempre melhor.

Mostram, pelo contrário, o fenómeno da seletividade complementar: duas métodos analíticos podem separar de forma diferente a mesma mistura, uma vez que utilizam propriedades físico-químicas distintas das moléculas em análise.

Por isso:

Um cromatograma limpo não significa necessariamente que não existam impurezas estruturalmente semelhantes.

A água e os contra-iões também influenciam a composição do material

O material peptídico isolado pode conter componentes que não são sequências peptídicas adicionais.

Entre os exemplos mais importantes contam-se:

• água;
• contrário;
• resíduos de solventes;
• substâncias inorgânicas;
• outros componentes relacionados com o processo de produção.

Um contra-ião é um ião com carga elétrica oposta, ligado a grupos carregados do péptido.

Na química dos péptidos, podem encontrar-se, por exemplo, o acetato ou o trifluoroacetato.

A sua presença não tem de significar um erro de síntese nem uma contaminação. O péptido pode estar deliberadamente presente numa determinada forma de sal.

No entanto, estes elementos são importantes quando queremos responder à seguinte pergunta:

Qual é a quantidade real do péptido alvo presente na amostra pesada?

A interpretação depende, portanto, do facto de o valor reportado se referir a:

• do próprio péptido;
• sal do peptídeo;
• de material seco;
• matéria anidra;
• do material tal como foi recebido.

Num estudo realizado em Sublancyne em 2026, os investigadores determinaram os teores de água, trifluoroacetato, compostos orgânicos e contaminantes inorgânicos no âmbito de uma análise mais abrangente do balanço de massa. [2]

Em última análise, a proporção atribuída ao péptido foi claramente inferior à do 100%, apesar de as impurezas orgânicas estruturalmente semelhantes representarem uma parte relativamente pequena do material.

Este é um exemplo prático de uma diferença importante:

Um perfil cromatográfico puro do péptido e uma elevada fração em massa do péptido alvo não são o mesmo parâmetro.

A percentagem de pureza não corresponde à probabilidade de segurança

O valor percentual que indica a pureza não indica qual é a probabilidade de um determinado material ser seguro.

Por exemplo, o resultado 99% relativo à pureza não significa:

„99% de segurança”.

Também não fornece informações sobre a importância biológica de cada substância presente no restante 1%.

Uma pequena quantidade de um composto pode ter maior importância analítica ou biológica do que uma quantidade maior de outro composto, dependendo de:

• a sua identidade;
• atividade biológica;
• concentrações;
• vias de exposição;
• da utilização prevista;
• outros fatores contextuais.

Da mesma forma, uma molécula devidamente identificada e com elevada pureza química pode, por si só, possuir determinadas propriedades biológicas.

A pureza química e a segurança biológica respondem, portanto, a questões completamente diferentes.

O ensaio de pureza serve para caracterizar a amostra dentro dos limites do método analítico utilizado.

Não transforma o resultado químico numa avaliação geral da segurança da utilização em seres humanos.

HPLC e espectrometria de massa

O que é que o HPLC nos pode dizer?

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) separa os componentes da amostra com base nas diferenças nas suas interações com a fase estacionária e com a fase móvel.

Na análise de péptidos, a cromatografia HPLC em fase reversa (RP-HPLC) é amplamente utilizada, frequentemente em combinação com a deteção por UV.

O cromatograma apresenta a resposta do detetor em função do tempo.

É possível obter algumas informações importantes a partir dele.

O tempo de retenção indica o momento em que um determinado componente sai do sistema cromatográfico em determinadas condições.

A área do pico representa a resposta integrada do detetor.

A forma do pico fornece informações sobre o comportamento cromatográfico da substância.

A resolução descreve a eficácia com que os componentes adjacentes são separados uns dos outros.

O tempo de retenção não é, contudo, uma „impressão digital” molecular única.

Por vezes, moléculas diferentes podem ser eluídas em tempos semelhantes.

O mesmo péptido pode também apresentar outros tempos de retenção após a alteração:

• colunas;
• composição da fase móvel;
• gradiente;
• velocidade do fluxo;
• temperaturas;
• configuração do equipamento;
• outros parâmetros do método.

Estudos que comparam diferentes sistemas de separação de péptidos demonstram até que ponto a seletividade cromatográfica depende do método utilizado. [1]

A coerência do tempo de retenção pode, portanto, contribuir para a identificação no contexto adequado, mas não deve ser automaticamente considerada como uma confirmação total da estrutura.

Porque é que um pico não tem de corresponder a uma única substância?

A coelucção ocorre quando dois ou mais componentes saem do sistema cromatográfico num intervalo de tempo tão próximo que não são devidamente separados.

Como resultado, podem parecer uma única carta de espadas.

Mesmo um pico principal visualmente simétrico não prova, portanto, automaticamente que todo o sinal provenha de um único tipo de partícula.

A composição do pico pode ser analisada com maior precisão através de:

• alteração da seletividade cromatográfica;
• utilização de outra fase estacionária;
• análise em vários comprimentos de onda;
• combinação de cromatografia com espectrometria de massas;
• cromatografia bidimensional;
• a utilização de outra técnica analítica complementar.

No entanto, nenhuma destas métodos deteta automaticamente todos os possíveis contaminantes.

As ligações geneticamente próximas podem ter:

• tempo de retenção semelhante;
• espectros de UV semelhantes;
• uma massa nominal idêntica;
• outras características analíticas comuns.

Um estudo sobre péptidos cíclicos, no qual se comparou a cromatografia de fases invertidas com a cromatografia de interações hidrofílicas, revelou perfis de eluição de impurezas claramente diferentes. [3]

Isso não significa que cada pico principal esconda poluentes adicionais.

A conclusão é mais precisa:

A aparente simplicidade do cromatograma é o resultado obtido num único sistema de separação, e a utilização de outra seletividade pode revelar componentes que o primeiro método não separou.

O que mede a espectrometria de massa?

A espectrometria de massas (MS) deteta iões com base na relação entre a sua massa e a sua carga, expressa como m/z.

Durante a análise, um péptido pode possuir mais do que uma carga elétrica.

Por isso, uma única molécula de péptido pode gerar vários sinais correspondentes a diferentes estados de carga, em vez de um único pico que corresponda diretamente à massa molecular neutra.

A interpretação adequada dos dados permite determinar ou confirmar a massa molecular básica.

A espectrometria de massa pode fornecer informações valiosas sobre:

• massa molecular;
• algumas modificações químicas;
• determinados poluentes;
• padrões isotópicos;
• comportamentos durante a fragmentação.

A espectrometria de massa de alta resolução permite distinguir com maior precisão moléculas com massas muito semelhantes.

A espectrometria de massas em tandem (MS/MS) consiste na fragmentação de iões selecionados e na análise dos produtos resultantes, fornecendo assim informações estruturais adicionais.

No entanto, continua a vigorar um princípio importante:

A observação da massa molecular esperada ≠ a comprovação da estrutura molecular completa.

Estruturas diferentes podem ter a mesma massa.

As alterações estereoquímicas podem não afetar a composição elementar.

Os isómeros posicionais também podem exigir provas adicionais.

Estudos relativos às impurezas de um péptido sintético que serve de substrato à renina revelaram esta limitação. Para distinguir as modificações que ocorrem em diferentes posições da mistura isobárica, foram necessárias informações adicionais provenientes da fragmentação e da derivatização. [4]

Sequência, grupos terminais e estereoquímica

A identidade de um péptido vai muito além do seu nome.

Entre as características estruturais relevantes podem incluir-se:

• sequência de aminoácidos;
• configuração de cada resíduo;
• estrutura do extremo N-terminal;
• estrutura do extremo C;
• modificações nas cadeias laterais;
• distribuição das pontes dissulfuretas;
• ciclo;
• conjugação;
• outras características covalentes.

Por exemplo, um péptido com um ácido carboxílico no extremo C-terminal é uma molécula quimicamente diferente do péptido correspondente com um amido no extremo C-terminal.

Os investigadores desenvolveram um método de espectrometria de massas assistida por derivatização precisamente para distinguir estas formas finais de forma mais eficaz. [5]

Isto ilustra um princípio importante:

O método analítico deve ser escolhido de acordo com a questão estrutural específica.

A estereoquímica constitui um desafio adicional.

Um péptido que contenha um aminoácido D e a sua variante correspondente com um aminoácido L podem ter uma massa molecular idêntica, mas, ao mesmo tempo, diferir na disposição espacial dos átomos.

No estudo sobre a pureza estereoquímica dos péptidos, foi utilizado um método concebido de forma a ter em conta a racemização que ocorre durante a hidrólise da amostra. [6]

Sem esse controlo, a própria preparação da amostra poderia alterar a propriedade que se pretendia medir.

Uma análise fiável de péptidos depende, portanto, não só dos parâmetros do equipamento, mas também da preparação adequada da amostra e da conceção do método.

A LC-MS combina as vantagens de dois métodos, mas não elimina todas as limitações

A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS) combina a separação cromatográfica com a análise de massa.

Talvez, graças a isso, consiga fornecer muito mais informações do que qualquer uma dessas métodos, quando utilizados separadamente.

A LC-MS pode ajudar, entre outras coisas:

• atribuir massas específicas aos picos de poluição;
• distinguir cromatograficamente componentes semelhantes com massas diferentes;
• analisar os produtos de degradação;
• caracterizar a contaminação associada à sequência;
• apoiar as atribuições estruturais.

Num estudo sobre a oxitocina sintética, realizado através de um método de LC validado internamente e combinado com espectrometria de massa de alta resolução, foram identificadas e quantificadas 18 impurezas estruturalmente relacionadas. [7]

Os investigadores explicaram também por que razão essas impurezas tiveram de ser tidas em conta na determinação da pureza do material de referência.

No entanto, estes resultados referem-se a uma amostra específica, a um método específico e ao perfil de poluentes em análise.

Não se deve considerar esta lista como uma lista universal de impurezas presentes em todos os materiais que contenham oxitocina.

A LC-MS é, portanto, uma combinação extremamente útil de técnicas analíticas.

No entanto, um bom relatório de LC-MS deve ainda esclarecer:

• o que foi medido;
• como foram atribuídos os picos específicos;
• de que forma foram identificadas as estruturas propostas;
• se as atribuições foram confirmadas;
• que método quantitativo foi utilizado;
• que restam quais as limitações analíticas.

Identidade, pureza e quantidade são parâmetros diferentes

A identidade responde à pergunta: que molécula está presente?

A análise de identificação tem como objetivo determinar se o material analisado corresponde à substância pretendida.

Dependendo do péptido e do problema em estudo, as provas relativas à identidade podem incluir:

• a massa total da molécula;
• dados de fragmentação;
• análise de sequências;
• características dos grupos finais;
• composição em aminoácidos;
• distribuição das pontes dissulfuretas;
• dados espectroscópicos;
• comparação cromatográfica com o material de referência;
• a combinação de várias métodos.

Um método pode confirmar um determinado elemento da identidade sem resolver todas as restantes questões estruturais.

Por exemplo:

„foi observada a massa esperada de toda a molécula”

é uma conclusão mais restrita do que:

„foi confirmada a estrutura molecular completa”.

Estudos sobre a amidação terminal e as impurezas peptídicas isobáricas demonstram por que razão esta distinção é importante. [4] [5]

Em ambos os casos, foram necessárias informações que fossem além da simples observação de um pico de massa próximo do valor esperado.

A pureza responde à pergunta: o que mais está presente na amostra?

O ensaio de pureza analisa a composição da amostra num determinado intervalo analítico.

Dependendo do método, o relatório pode apresentar:

• ingrediente principal;
• os diferentes poluentes;
• a quantidade total de poluentes detetados;
• percentagem da área do pico principal;
• impurezas estereoquímicas;
• substâncias afins;
• percentagem em massa total.

Diferentes classes de poluentes podem exigir métodos diferentes.

Um método cromatográfico otimizado para a deteção de sequências com deleções não tem necessariamente de responder a questões relacionadas com a estereoquímica.

O método baseado na massa pode não distinguir os isómeros.

Por outro lado, o método quiral pode fornecer pouca informação sobre o teor de água.

O objetivo da utilização de métodos complementares não é, portanto, apenas a obtenção de um maior número de resultados.

O objetivo é obter respostas a várias questões analíticas que um único método não consegue resolver por si só.

A quantidade responde à pergunta: quanta substância está presente?

A quantidade pode referir-se a vários parâmetros diferentes.

Pode significar:

• concentração do péptido na solução;
• a quantidade total de péptido no recipiente;
• concentração do péptido-alvo;
• concentração molar;
• quantidade por unidade de volume;
• outro parâmetro quantitativo claramente definido.

Cada uma destas formas requer uma unidade adequada e uma base de cálculo.

A determinação quantitativa por cromatografia requer, normalmente, uma calibração adequada e não deve basear-se exclusivamente na normalização da área dos picos.

Em métodos devidamente elaborados para a determinação de quantidades, também podem contribuir:

• análise de aminoácidos;
• ressonância magnética nuclear quantitativa;
• métodos de diluição isotópica;
• outras técnicas quantitativas validadas.

É importante referir que as impurezas peptídicas relacionadas podem afetar algumas medições quantitativas.

Os estudos sobre a pureza da oxitocina salientaram a necessidade de corrigir os resultados tendo em conta essas impurezas, em vez de partir do princípio de que cada aminoácido ou sinal analítico medido provém exclusivamente da molécula alvo. [7]

Exemplo: percentagem da área de HPLC e quantidade real do péptido

Imaginemos um pó peptídico hipotético, para o qual se obteve:

RP-HPLC-UV, área do pico principal = 99,0%

e

percentagem em massa do péptido alvo, determinada de forma independente = 78,0% no material no estado em que foi obtido.

Estes resultados não têm necessariamente de ser contraditórios entre si.

Têm denominadores diferentes e respondem a diferentes questões analíticas.

Se fossem pesados 10,0 mg desse pó hipotético e o valor validado da fração em massa do péptido alvo fosse 78,0%, a quantidade de péptido resultante dessa determinação seria:

10,0 mg × 0,780 = 7,80 mg.

Não se deve partir automaticamente do princípio de que:

10,0 mg × 0,990 = 9,90 mg

apenas porque o pico principal correspondia a 99,01 TP30T da área UV considerada.

Trata-se apenas de uma ilustração analítica e não descreve nenhum produto comercial específico nem nenhum material experimental.

O estudo sobre a sublancina constitui um exemplo concreto do princípio subjacente a esta distinção, uma vez que, durante a avaliação da composição do material, foram considerados separadamente, entre outros, a água e o contra-ião. [2]

Os valores numéricos deste estudo não devem ser extrapolados para outros péptidos.

Incerteza de medição e coerência de medição

O resultado analítico não deve ser considerado como um valor com precisão infinita.

Trata-se de uma estimativa obtida através de um procedimento de medição específico.

A incerteza da medição descreve o intervalo ou a dispersão dos valores que podem ser razoavelmente associados ao resultado da medição, de acordo com o método de avaliação utilizado.

Isso não significa que o laboratório saiba que o seu resultado está errado.

Por outro lado, informa sobre os limites da precisão numérica.

A coerência de medição refere-se à relação documentada entre o resultado e a referência adequada, através da cadeia de calibração.

Contribui para garantir a comparabilidade das medições, mas apenas no que diz respeito a um parâmetro específico que tenha sido efetivamente medido e a uma cadeia de referência estabelecida.

Num estudo relativo ao desenvolvimento do material de referência do NT-proBNP, foram combinados métodos de diluição isotópica, corrigidos em função das impurezas, com a avaliação da homogeneidade e da estabilidade do material. [8]

Isto demonstra por que razão uma atribuição fiável de um valor quantitativo exige muito mais do que a simples leitura do número gerado pelo dispositivo.

Como interpretar o certificado de análise (COA)?

Comece por identificar a amostra e o lote

Antes de interpretar qualquer resultado analítico, é necessário determinar qual foi, de facto, o material analisado.

Um COA útil deve associar os resultados a informações de identificação, tais como:

• nome ou descrição do material;
• identificador da amostra;
• número de lote ou de série;
• as datas correspondentes;
• forma estrutural;
• forma do sal, se for relevante;
• alterações nas extremidades ou outras características estruturais significativas.

Isto é importante porque os resultados analíticos referem-se à amostra que foi efetivamente analisada.

Um certificado relativo a um lote não confirma diretamente a composição de outro lote.

Da mesma forma, a análise efetuada numa amostra composta não comprova automaticamente a quantidade nem o estado do material em cada recipiente individual enchido posteriormente, a menos que o sistema de amostragem, enchimento, avaliação da homogeneidade e controlo do processo justifique tal conclusão.

Trata-se de questões relacionadas com a coerência e a rastreabilidade do material.

Não significam, automaticamente, uma conduta inadequada nem baixa qualidade.

O leitor do relatório precisa simplesmente de uma ligação que se justifique:

relatório → amostra analisada → lote ou material a que o resultado se refere.

Leia em conjunto o método, o resultado, a unidade e a especificação

O COA apresenta frequentemente tanto o critério de aceitação como o resultado efetivamente obtido.

Por exemplo:

Especificação: não inferior a 98,0%

e

Resultado: 99,2%.

Trata-se de duas informações diferentes.

A especificação define o critério de aceitação.

O resultado apresenta o valor medido para uma amostra específica.

A unidade e a base de medida são igualmente importantes.

É possível encontrar, entre outros:

• area%;
• mass%;
• mg/recipiente;
• mg/mL;
• µg/mL;
• mol/L;
• resultado calculado com base na massa seca;
• resultado calculado com base na matéria seca;
• resultado para o material no estado em que foi recebido.

Estes valores não podem ser substituídos arbitrariamente.

Por exemplo, um resultado definido como „no estado em que foi recebido” tem em conta o material tal como foi analisado, enquanto que o valor anidro ou corrigido pode excluir matematicamente a água da base de cálculo.

A indicação „pass” significa que o resultado apresentado cumpriu um determinado critério de aceitação para um teste específico.

Não alarga o âmbito deste estudo.

Por isso:

teste de identidade aprovado ≠ esterilidade confirmada

e

teste de pureza HPLC aprovado ≠ teor especificado do péptido,

a menos que essas propriedades tenham sido medidas de forma independente.

Exemplo de interpretação das entradas no COA

As entradas que se seguem são hipotéticas e destinam-se exclusivamente a ilustrar a forma de interpretar os dados analíticos. Não descrevem um lote real nem propõem critérios de aceitação.

As distinções apresentadas baseiam-se em estudos relativos à pureza do pico peptídico principal, aos contra-iões e à determinação da fração de massa. [1] [2] [9]

Os números apresentados e o formato da tabela têm caráter exclusivamente educativo.

Verifique o cromatograma e o espectro

Os dados analíticos adicionais ajudam a interpretar corretamente os resultados resumidos no COA.

No caso de um cromatograma, convém prestar atenção ao seguinte:

• identificador da amostra;
• identificador do método;
• eixos do cromatograma;
• tipo de detetor;
• comprimento de onda;
• tempos de retenção significativos;
• símbolos do naipe de espadas;
• tabela de poluentes;
• resultados da integração;
• limiares de comunicação.

Um cromatograma recortado de forma a mostrar apenas o pico principal de grande dimensão pode omitir informações necessárias para a interpretação correta do resultado de pureza.

No caso da espectrometria de massa, o contexto útil pode incluir:

• forma molecular esperada;
• peso previsto;
• iões observados;
• estados de carga atribuídos;
• desconvolução;
• erro de massa;
• dados de fragmentação, se aplicável;
• base para a atribuição da estrutura.

O espectro de massa da molécula completa, a massa molecular desconvoluída e as evidências estruturais baseadas na fragmentação estão interligadas, mas não significam a mesma coisa.

O COA não tem necessariamente de incluir todos os ficheiros brutos provenientes do equipamento.

No entanto, as conclusões analíticas nele resumidas devem poder ser associadas à documentação de referência, que pode ser verificada caso surjam dúvidas relativamente à atribuição da estrutura ou ao resultado numérico.

„Não foi detetado” e „não foi analisado” significam coisas completamente diferentes

„Não detetado” significa que o método analítico utilizado não detetou o componente em análise nas condições especificadas e com a sua sensibilidade.

Isso não significa que a concentração real seja exatamente zero.

„Por outro lado, ”abaixo do limite de detecção» significa que o componente pode estar presente num nível que o método em questão não consegue quantificar de forma fiável.

Esta é uma situação ainda diferente.

„Não foi analisado” significa que não foi realizada qualquer medição para essa característica.

Isto não deve ser interpretado como:

„resultado correto”

nem:

„substância ausente”.

A interpretação correta das informações relativas à deteção ou à quantificação requer também o conhecimento de:

• limite de deteção ou de quantificação;
• unidades;
• princípios básicos de elaboração de relatórios;
• método utilizado;
• método de preparação da amostra.

O que traz uma análise laboratorial independente?

Um laboratório independente pode fornecer uma análise adicional da amostra enviada.

Isto pode aumentar a quantidade de provas disponíveis relativas a um determinado material.

A própria expressão:

„testado por um laboratório independente”

no entanto, não explica:

• o que foi analisado exatamente;
• quantas amostras foram analisadas;
• quem recolheu a amostra;
• quem a descarregou;
• se foi representativa;
• de que partido ela era;
• que métodos foram utilizados;
• é possível verificar o relatório;
• se a amostra corresponde ao material posteriormente distribuído;
• cujas propriedades o estudo nem sequer abrangeu.

As perguntas mais úteis dizem, portanto, respeito a:

identidade da amostra + rastreabilidade do lote + método de amostragem + âmbito analítico + autenticidade do relatório laboratorial.

Um estudo independente não elimina as limitações dos métodos utilizados.

O HPLC realizado por um laboratório externo continua a ser um exame HPLC.

Não se torna um teste de esterilidade, uma determinação do teor de péptidos, uma análise estereoquímica nem um ensaio de atividade biológica apenas pelo facto de ter sido realizado por uma entidade independente.

Por isso, o COA deve ser avaliado, acima de tudo, em termos do âmbito analítico e da rastreabilidade da amostra, e não apenas com base no logótipo do laboratório ou num valor percentual elevado indicado no início do documento.

O que é que os exames analíticos de rotina não confirmam?

O HPLC não confirma a esterilidade

A análise de rotina do péptido HPLC analisa os componentes químicos com base no seu comportamento cromatográfico.

Não é um método de deteção de microrganismos vivos.

Um cromatograma limpo não pode, portanto, confirmar que a amostra é estéril.

A esterilidade é uma questão microbiológica que exige métodos adequados e o controlo do processo de produção.

Mesmo um teste de esterilidade independente apresenta limitações relacionadas com a recolha de amostras, uma vez que apenas é analisada diretamente a parte do material utilizada no teste.

Por esse motivo, a garantia da esterilidade na produção farmacêutica assenta num sistema mais abrangente de produção e controlo, e não apenas na análise final do produto.

As diretrizes da FDA relativas à produção asséptica consideram o controlo microbiológico e o ensaio de esterilidade como elementos distintos do processo. [10]

Por isso:

alta pureza HPLC ≠ esterilidade

e

ausência de impurezas cromatográficas visíveis ≠ ausência de microrganismos.

O teste de endotoxinas responde a outra questão

As endotoxinas são componentes bacterianos, nomeadamente a substância associada aos lipopolissacarídeos das bactérias Gram-negativas.

Não são o mesmo que bactérias vivas.

O teste de endotoxinas bacterianas responde, portanto, a uma questão diferente da do teste de esterilidade.

Teoricamente, uma amostra pode não conter bactérias vivas detetáveis e, mesmo assim, conter determinados componentes de origem bacteriana.

Da mesma forma, o teste de esterilidade não pode substituir automaticamente a determinação de endotoxinas.

A matriz da amostra também pode influenciar o ensaio de endotoxinas.

É, portanto, importante ajustar adequadamente o método e controlar as interferências.

As orientações da FDA relativas aos pirogénios e às endotoxinas abordam os limites analíticos e a diferença entre as endotoxinas bacterianas e outras substâncias pirogénicas. [11]

A análise de rotina da pureza do HPLC não pode substituir nem o ensaio de esterilidade nem o ensaio de endotoxinas.

A pureza química não confirma a atividade biológica

A amostra pode ter:

• massa molecular esperada;
• área elevada do pico cromatográfico principal;
• uma quantidade relativamente reduzida de poluentes químicos detetados,

e, ao mesmo tempo, não ter uma função biológica específica comprovada.

O comportamento funcional pode também depender de:

• prega;
• distribuição das pontes dissulfureto;
• agregação;
• conformação estrutural;
• estado de modificação;
• condições do teste;
• do sistema biológico utilizado.

O estudo sobre a síntese do BPTI ilustra bem a importância de separar estas questões.

Os investigadores combinaram as características analíticas e biofísicas com o teste de inibição da tripsina. [12]

No seu conjunto, estes resultados forneceram provas mais sólidas sobre o material em estudo.

Nenhuma medição isolada substituía as restantes.

Por isso:

pureza química ≠ atividade biológica

e

A atividade biológica num único teste ≠ caracterização estrutural ou produtiva completa.

O COA não é uma avaliação da segurança clínica

O COA apresenta os resultados das análises realizadas na amostra descrita.

Não determina:

• tolerância clínica;
• segurança da exposição em seres humanos;
• da dose adequada;
• interações;
• eficácia;
• efeitos a longo prazo;
• utilidade para uma pessoa específica.

Estas questões exigem outros tipos de provas.

Este princípio mantém-se válido mesmo quando os resultados analíticos são precisos e a identidade do péptido foi devidamente confirmada.

A análise de pureza pode caracterizar determinados aspetos da composição química.

Não pode transformar um relatório analítico num ensaio clínico nem numa avaliação da segurança da utilização em seres humanos.

Um único momento no tempo não confirma o prazo de validade

O COA descreve normalmente o material num determinado momento do estudo.

Os péptidos podem, posteriormente, sofrer alterações relacionadas com:

• degradação;
• oxidação;
• hidrólise;
• desamidação;
• agregação;
• absorção de humidade;
• reorganizações estruturais;
• outros processos que dependem das propriedades da molécula e das condições do ambiente.

O resultado obtido num determinado momento não confirma, portanto, uma estabilidade ilimitada.

O prazo de validade requer dados que relacionem as condições de armazenamento definidas com a estabilidade analítica do produto ao longo do tempo.

Num estudo sobre o exenatido, foi desenvolvido um método cromatográfico que demonstra a estabilidade da substância e foram caracterizados os produtos de degradação formados em várias condições de stress. [13]

Este estudo mostra como é possível separar os produtos de degradação do péptido original.

No entanto, não define um prazo de conservação universal para todos os péptidos, e as condições artificiais de stress não devem ser automaticamente equiparadas às condições normais de conservação.

A conclusão mais forte deve corresponder à força das provas

Uma interpretação cientificamente cautelosa não deve ir além do âmbito das medições efetuadas.

Por exemplo, o COA pode justificar a seguinte afirmação:

„Na amostra analisada, obteve-se um resultado relativo à massa total da molécula compatível com o péptido atribuído, determinou-se a proporção da área do pico principal na método HPLC utilizado e determinou-se separadamente o teor do péptido”.

Trata-se de um conjunto valioso de provas analíticas.

No entanto, isso não significa automaticamente que:

„O péptido foi totalmente caracterizado, é estéril, biologicamente ativo, seguro, estável por tempo indeterminado e adequado para utilização em seres humanos.”.

Não se trata de pôr em causa o valor dos exames laboratoriais.

Também não se deve esperar que um único método analítico responda a todas as questões possíveis.

O mais importante é a ligação:

cada afirmação → acompanhada de uma medição que possa realmente justificá-la,

destacando, ao mesmo tempo, as questões que ficaram sem resposta.

Perguntas mais frequentes

1. O grau de pureza 99% significa que o produto é seguro?

Não. A percentagem de pureza descreve a composição da amostra de acordo com um método analítico específico, e não a probabilidade de segurança. Além disso, este valor pode corresponder à proporção do sinal cromatográfico, e não à proporção em massa do peptídeo alvo. Estudos de balanço de massa de peptídeos demonstram por que razão a água, os contra-iões e outros componentes podem causar diferenças entre estes valores. [2] Independentemente da pureza analítica, a própria molécula-alvo pode também possuir propriedades biológicas próprias. Um elevado índice de pureza pode, portanto, corroborar as características químicas da amostra analisada, mas não substitui as evidências toxicológicas, farmacológicas, microbiológicas ou clínicas relativas à segurança.

2. O HPLC confirma a esterilidade?

Não. A análise de rotina do péptido HPLC separa e deteta os componentes químicos com base no seu comportamento cromatográfico. Não determina se a amostra está isenta de microrganismos vivos. A esterilidade é uma característica distinta que requer análises microbiológicas adequadas e controlo do processo de produção. As diretrizes da FDA relativas à produção asséptica abordam o controlo microbiológico independentemente da análise química. [10] Por conseguinte, um cromatograma limpo, uma elevada percentagem da área do pico principal ou o tempo de retenção esperado do péptido não podem substituir as provas relativas à esterilidade.

3. O que significa, afinal, a percentagem da área HPLC?

A percentagem da área do HPLC refere-se, normalmente, à proporção do sinal integrado atribuído ao pico principal no sinal cromatográfico total considerado. O resultado depende da qualidade da separação, da resposta do detetor, do comprimento de onda, das regras de integração, dos limiares de relatório e de outras condições do método. Por isso, não indica automaticamente a proporção em massa do péptido na amostra total. Os estudos de pureza do pico principal do péptido mostram por que razão os isómeros não separados podem complicar a interpretação. [1] A percentagem da área do pico HPLC deve, portanto, ser considerada como o resultado de um método analítico específico, cuja base de medição deve ser claramente definida.

4. Um pico HPLC pode conter várias substâncias?

Sim. Dois ou mais componentes podem eluir tão próximos uns dos outros que, num determinado sistema cromatográfico, não serão devidamente separados e parecerão um único pico. Por isso, mesmo um pico visualmente simétrico não constitui prova absoluta de homogeneidade molecular. Um estudo sobre péptidos cíclicos revelou que um modo de cromatografia diferente proporcionava uma forma distinta de separação de impurezas em comparação com o RP-HPLC. [3] Isto não significa que cada pico principal contenha substâncias ocultas. Mostram, sim, que a capacidade de separação depende da seletividade do método e que, no caso de estruturas muito semelhantes, podem ser necessárias técnicas analíticas complementares.

5. A massa molecular correta confirma a sequência correta do péptido?

Não. A massa da molécula completa, conforme o valor esperado, constitui uma prova válida da identidade, mas não tem de confirmar a sequência de aminoácidos, a estereoquímica, o tipo de grupos terminais, a localização das modificações nem todas as outras características estruturais. Estudos sobre impurezas em péptidos sintéticos revelaram componentes com a mesma massa, mas com modificações localizadas em posições diferentes, o que exigiu informações analíticas adicionais. [4] A avaliação completa da identidade requer, portanto, métodos adaptados às ambiguidades estruturais específicas do peptídeo em questão.

6. Em que difere o teor do péptido da pureza?

O teor do péptido determina a quantidade do péptido-alvo definido presente no material, de acordo com uma base quantitativa específica. A pureza, por sua vez, pode referir-se à proporção do sinal cromatográfico atribuído ao componente principal ou a outro parâmetro de pureza definido. A água, os contra-iões, os resíduos do processo e os compostos estruturalmente relacionados podem fazer com que estes valores variem. No estudo da sublancyna, vários desses componentes foram determinados separadamente durante a avaliação do balanço de massa. [2] O resultado do teor do péptido e a percentagem da área de HPLC devem, portanto, ser interpretados separadamente, a menos que um sistema analítico validado determine inequivocamente a relação entre ambos.

7. A água e os contra-iões podem influenciar a quantidade de péptido no pó?

Sim. A água e os contra-iões aumentam a massa física total da amostra e, por isso, podem reduzir a parte da massa correspondente ao próprio péptido-alvo, se o resultado for apresentado para o material no estado em que foi obtido. Estudos sobre a sublancina e os contra-iões peptídicos demonstram por que razão estes componentes podem exigir uma determinação separada. [2] [9] A sua presença não tem necessariamente de indicar um erro de síntese ou contaminação, uma vez que o contra-ião pode fazer parte da forma salina pretendida. As questões fundamentais dizem, portanto, respeito ao tipo de forma molecular analisada, à quantidade de cada componente e à base do cálculo utilizado.

8. O contra-ião é o mesmo que uma impureza peptídica?

Nem sempre. O contra-ião pode ser um componente esperado do sal do péptido, enquanto a impureza associada à sequência é uma molécula peptídica diferente. Trata-se, portanto, de categorias analíticas distintas, embora ambas possam influenciar a composição total da amostra. Em estudos que compararam os contra-íons dos péptidos, observaram-se diferenças, dependentes da sequência e da forma da sal, em experiências relativas à permeabilidade das membranas. [9] Se o contra-ião for relevante para as características do material, o seu tipo e quantidade devem ser relatados separadamente, e não deduzidos com base na pureza cromatográfica do pico principal do péptido.

9. A espectrometria de massa convencional consegue distinguir as variantes D e L dos aminoácidos?

A simples medição da massa total da molécula não permite, normalmente, distinguir estruturas com composição elementar idêntica, que diferem apenas na estereoquímica. A variante D e a variante L correspondente podem, portanto, ter uma massa molecular idêntica. Se a questão se referir à configuração espacial, é necessária uma análise quiral ou estereoquímica adequada. No estudo da pureza quiral dos péptidos, foi utilizado um processo especialmente concebido que tem em conta as alterações estereoquímicas que ocorrem durante a preparação da amostra. [6] O problema é de natureza estrutural, pelo que o simples aumento da precisão da medição da massa não resolve esta ambiguidade.

10. Por que é que o número do lote no COA é importante?

O número de lote ou de série ajuda a associar os resultados analíticos a um material específico que foi analisado. Os resultados obtidos para um lote não podem ser automaticamente transferidos para outro lote nem para cada recipiente preparado noutro momento. Os ensaios relacionados com materiais de referência certificados avaliam propriedades como a homogeneidade e a estabilidade, em vez de as pressupor com base numa única medição. [8] O número de lote correspondente constitui, portanto, um elemento importante da rastreabilidade, embora, por si só, não comprove a correção da amostragem, do armazenamento, do manuseamento do material nem de todos os restantes elementos do sistema de controlo.

11. „Não detetado” significa zero?

Não. „Não detetado” significa que o método utilizado não detetou a substância analisada nas condições especificadas e dentro dos limites da sua sensibilidade. Isso não prova que a quantidade real seja exatamente zero. Um resultado inferior ao limite de deteção ou de quantificação deve ser interpretado em conjunto com o valor-limite adequado, a unidade, a base da amostra e as condições analíticas. As orientações relativas aos ensaios de endotoxinas também abordam a importância da sensibilidade dos métodos e das possíveis interferências. [11] Uma conclusão cientificamente fundamentada deve, portanto, referir-se ao que o método conseguiu detetar, e não a uma afirmação absoluta sobre a ausência total da substância.

12. O que significa a incerteza da medição no relatório?

A incerteza da medição descreve a dispersão dos valores que podem ser razoavelmente associados ao resultado obtido, de acordo com a avaliação aplicada. Não significa que o laboratório considere o seu resultado errado. Mostrará, sim, os limites da certeza numérica de uma determinada estimativa. Nos ensaios de materiais de referência, para a atribuição de valores, podem ser tidas em conta, entre outras coisas, a incerteza da própria medição, a homogeneidade e a estabilidade. [8] A incerteza deve, portanto, ser interpretada em conjunto com a sua definição, as unidades, o nível de cobertura aplicado e a grandeza medida especificamente definida.

13. A análise realizada por um laboratório independente confirma que todos os recipientes contêm o mesmo material?

Não. Um ensaio independente fornece provas relativas à amostra ou amostras efetivamente entregues para análise. A possibilidade de extrapolar esses resultados para cada recipiente depende, entre outros fatores, do método de amostragem, da rastreabilidade do lote, da homogeneidade do material, do processo de enchimento, do armazenamento e de outros elementos de controlo. Na elaboração de materiais de referência certificados, a homogeneidade é avaliada e não simplesmente assumida com base numa única medição. [8] A independência do laboratório pode aumentar a independência da própria medição, mas não prova automaticamente a identidade de todo o lote.

14. Os resultados dos testes de esterilidade e de endotoxinas podem ser utilizados de forma intercambiável?

Não. O ensaio de esterilidade diz respeito a microrganismos vivos, enquanto o ensaio de endotoxinas bacterianas diz respeito a determinados componentes bacterianos que podem permanecer no material, mesmo na ausência de bactérias vivas. Trata-se, portanto, de duas questões analíticas distintas. A determinação das endotoxinas pode, além disso, ser afetada por interferências decorrentes da matriz da amostra, pelo que é importante ajustar adequadamente o método. [11] Nem a esterilidade nem o nível de endotoxinas podem ser inferidos a partir da pureza de rotina do HPLC. Se estes ensaios tiverem sido realizados, devem ser relatados separadamente.

15. A pureza química confirma a atividade biológica?

Não. A análise química e os ensaios funcionais fornecem outros tipos de informação. Um péptido pode ter o peso molecular esperado e elevada pureza cromatográfica sem que a sua ação tenha sido confirmada num determinado ensaio biológico. Num estudo sobre o BPTI, as características estruturais e biofísicas foram combinadas com um teste de inibição da tripsina, em vez de se partir do princípio de que um único resultado analítico é suficiente para todas as conclusões. [12] Além disso, as evidências funcionais são específicas da molécula em estudo, do sistema experimental e do teste concreto. Por conseguinte, uma amostra de elevada pureza não deve ser considerada funcionalmente confirmada se a atividade relevante não tiver sido efetivamente testada.

16. O COA confirma que o péptido permanecerá estável por tempo indeterminado?

Não. O COA descreve a amostra no momento ou na fase do ensaio indicada no relatório. Durante o armazenamento posterior, os péptidos podem sofrer degradação, oxidação, hidrólise, agregação, absorção de humidade e outras alterações dependentes das suas propriedades e do ambiente. Os estudos de degradação do exenatido demonstraram a importância de métodos que indiquem a estabilidade e que sejam capazes de distinguir os produtos de degradação da molécula original. [13] No entanto, os ensaios de stress não determinam automaticamente o tempo de armazenamento em condições normais. Qualquer afirmação relativa ao prazo de validade requer dados de estabilidade adequados, obtidos em condições e durante um período de tempo específicos.

17. O que se deve verificar em primeiro lugar ao comparar dois COA de péptidos?

Em primeiro lugar, convém comparar a identidade das amostras, os números de lote, os métodos analíticos utilizados, as unidades e a base de medição, em vez de comparar imediatamente os valores percentuais mais elevados que constam nos documentos. Dois relatórios podem apresentar um valor designado como „pureza”, mas, ao mesmo tempo, medir outras propriedades ou ter uma capacidade diferente de separar as várias classes de impurezas. Os estudos que utilizam métodos cromatográficos ortogonais e a determinação do balanço de massa demonstram a importância destas diferenças. [2] [3] Sem determinar se ambos os valores se referem à mesma grandeza e a métodos suficientemente comparáveis, a comparação direta de percentagens pode ser enganadora.

18. O código de pureza 99% HPLC significa que o 99% contém peptídeos?

Não. O resultado 99% HPLC significa, na maioria das vezes, que ao pico principal foi atribuído o valor 99% da resposta registada pelo detetor cromatográfico. Por outro lado, um resultado de 99% relativo ao teor do péptido exigiria uma medição quantitativa que demonstrasse que o péptido alvo representa 99% da quantidade correspondente da amostra, de acordo com uma base claramente definida. A água, os contra-iões, os resíduos de solventes e outros componentes podem aumentar a massa física da amostra, sem afetar proporcionalmente a percentagem da área de retenção RP-HPLC-UV. [2] Por conseguinte, ambos os valores podem diferir significativamente, embora nenhuma das medições tenha necessariamente de estar errada.

19. É possível que um péptido passe no teste de pureza HPLC e, mesmo assim, apresente uma estereoquímica incorreta?

Potencialmente, sim. O RP-HPLC convencional não tem necessariamente de separar todas as variantes estereoquímicas, especialmente quando as moléculas apresentam propriedades físico-químicas muito semelhantes. Da mesma forma, a simples medição da massa da molécula completa não permite distinguir estereoisómeros com composição elementar idêntica. Estudos sobre a pureza estereoquímica de péptidos demonstram por que razão podem ser necessários métodos especializados e um controlo rigoroso da preparação da amostra. [6] O facto de um determinado método HPLC separar um determinado estereoisómero depende da seletividade demonstrada desse método e não apenas do facto de ter sido realizada uma análise HPLC.

20. O COA confirma que todo o lote é idêntico à amostra analisada?

Não de forma isolada. O COA apresenta os resultados relativos à amostra e ao lote indicados na documentação analítica. A extrapolação desses resultados para todo o lote requer um sistema adequado de amostragem, consistência do processo, homogeneidade, rastreabilidade e outros controlos de produção. O desenvolvimento de materiais de referência demonstra por que razão a homogeneidade é avaliada como uma característica distinta e não simplesmente assumida. [8] O COA pode, portanto, fornecer provas analíticas importantes relativas ao lote, mas a validade das conclusões que abrangem todo o material depende de um sistema de qualidade mais abrangente que relacione a amostra analisada com o lote representado pelo relatório.

Limitações na interpretação da pureza dos péptidos e do COA

Ao interpretar os relatórios analíticos sobre péptidos, é importante ter em conta algumas limitações.

Em primeiro lugar, a pureza depende do método. O resultado RP-HPLC-UV descreve o que foi medido por um determinado sistema cromatográfico e detetor. Outro mecanismo de separação pode revelar componentes que o primeiro método não separou. [1] [3]

Em segundo lugar, a área cromatográfica e a massa física têm bases de medição diferentes. A água, os contra-iões, os resíduos de outras substâncias e as diferenças na resposta do detetor podem fazer com que a percentagem da área do HPLC não corresponda à fração em massa do péptido alvo. [2]

Em terceiro lugar, a massa molecular esperada constitui uma prova forte, mas incompleta, da identidade. Os isómeros, as variantes posicionais e as diferenças estereoquímicas podem exigir a utilização de métodos estruturais adicionais. [4] [5] [6]

Em quarto lugar, os próprios métodos analíticos podem causar artefactos. A preparação da amostra, a hidrólise, a derivatização, o armazenamento e o manuseamento do material podem alterar o analito ou a característica analisada. [6]

Em quinto lugar, a amostra analisada não é automaticamente equivalente a qualquer recipiente nem ao mesmo material numa fase posterior. A homogeneidade, a rastreabilidade do lote e a estabilidade são questões distintas. [8]

Em sexto lugar, os análises químicas não respondem a questões microbiológicas. O HPLC e a espectrometria de massa não confirmam a esterilidade nem o nível de endotoxinas. [10] [11]

Em sétimo lugar, as características químicas não comprovam a atividade biológica nem a segurança clínica. Trata-se de questões distintas que exigem outros tipos de provas. [12]

Por fim, um resultado obtido num determinado momento não confirma a estabilidade a longo prazo. A avaliação da estabilidade requer dados adequados, obtidos ao longo do tempo e em condições específicas. [13]

Estas limitações não significam que o COA tenha pouco valor.

Em vez disso, explicam como o deve interpretar corretamente.

Resumo

O certificado de análise de um péptido é mais útil quando o encaramos como um conjunto de medições analíticas distintas, e não como uma única avaliação de qualidade.

O valor de pureza indicado no início é apenas o ponto de partida para a interpretação.

Um resultado como 99% na superfície RP-HPLC descreve a distribuição da resposta do detetor num método cromatográfico específico. Não significa automaticamente que o 99% da massa física do pó corresponda ao péptido-alvo. [1] [2]

A espectrometria de massa pode fornecer provas sólidas relativamente à massa molecular e a algumas características estruturais, mas a concordância da massa da molécula completa com o valor esperado não confirma, por si só, todos os aspetos da sequência, da estrutura das extremidades, da estereoquímica nem das ligações moleculares. [4] [5] [6]

A concentração do péptido requer uma base quantitativa própria.

A água, os contra-iões, os resíduos de outras substâncias e os contaminantes peptídicos associados podem influenciar a relação entre a massa do material pesado e a quantidade real do péptido alvo. [2] [7] [9]

Por isso, ao ler o COA, convém fazer algumas perguntas específicas:

Que amostra foi analisada?

A que partido diz respeito?

Que método analítico foi utilizado?

O que significa exatamente o valor percentual indicado?

Que unidades e que base de cálculo foram utilizadas?

A identidade molecular foi analisada independentemente da pureza cromatográfica?

O teor real do péptido foi indicado?

Nos casos em que se justificava, foram medidos os níveis de água ou de contra-iões?

A estereoquímica foi avaliada, caso seja relevante para a molécula em questão?

Quais são as propriedades que não foram estudadas?

É particularmente importante distinguir entre „não detetado” e „não analisado”.

A ausência de resultado não deve ser interpretada como prova de que o teste foi aprovado.

Da mesma forma, um teste realizado por um laboratório independente pode constituir uma fonte adicional valiosa de informação, mas a simples menção de „testado por terceiros” não descreve o método de recolha da amostra, a sua relação com o lote, o âmbito analítico, a homogeneidade nem se o resultado é extrapolável para cada embalagem.

Os métodos químicos de rotina têm também limites claramente definidos.

O HPLC não garante a esterilidade.

A pureza do HPLC não confirma o nível de endotoxinas.

A pureza química não confirma a atividade biológica.

O COA não constitui uma avaliação da segurança clínica.

Um único resultado analítico obtido num determinado momento não confirma uma estabilidade ilimitada. [10] [11] [12] [13]

A interpretação com maior fundamento científico é, portanto, sempre tão ampla quanto as provas disponíveis permitirem – e não mais ampla do que isso.

Um relatório analítico bem documentado pode fornecer informações sólidas sobre a identidade, a composição e a quantidade do material presente na amostra analisada.

O seu valor aumenta quando são claramente descritos os métodos utilizados, a base de medição, a rastreabilidade do material e as limitações de cada ensaio.

A regra mais importante é simples:

A identidade, a pureza, a quantidade, a estereoquímica, o estado microbiológico, a atividade biológica, a estabilidade e a segurança são questões diferentes. Um certificado de análise fiável ajuda a responder às questões que foram efetivamente analisadas – não deve ser utilizado para sugerir respostas a questões que não foram medidas.

Aviso legal

Este artigo tem caráter exclusivamente educativo e científico-informativo. Explica os princípios gerais da química analítica de peptídeos, da interpretação de certificados de análise (COA), cromatografia HPLC, espectrometria de massas, determinação do teor de péptidos, avaliação de impurezas, identificabilidade do material e métodos de análise relacionados. Não constitui aconselhamento médico, recomendação de produto, avaliação de segurança, autorização de produção nem confirmação de que qualquer péptido ou material que contenha péptidos seja adequado para utilização em seres humanos. Os resultados analíticos devem ser sempre interpretados tendo em conta a amostra específica, o lote, o método utilizado, a base de medição, as especificações, o problema analítico em estudo e as limitações do ensaio realizado.

Referências

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