Peptidreinheit und Labortests: Wie man ein Analysenzertifikat (COA) liest

Die Peptidreinheit beschreibt die Zusammensetzung einer Probe, die mit einer bestimmten analytischen Methode ermittelt wurde. Sie allein bestätigt weder die vollständige Identität des Peptids, noch die tatsächliche Peptidmenge in der Probe, die Sterilität, die biologische Aktivität, die Stabilität oder die Sicherheit. Ein Analysenzertifikat, meist mit der Abkürzung COA bezeichnet, ist dann am nützlichsten, wenn jedes darin aufgeführte Ergebnis als Antwort auf eine spezifische analytische Frage betrachtet wird.

Daher benötigt eine Angabe wie „Reinheitsgrad 99%” den entsprechenden Kontext.

Bedeutet 99%, dass der Hauptchromatographie-Peak für 99% der gesamten integrierten Detektorantwort in der HPLC-Analyse verantwortlich ist? Stellt dieser Wert den Massenanteil des Zielpeptids unter Berücksichtigung von Wasser, Gegenionen und anderen Bestandteilen dar? Wurde die stereochemische Reinheit bewertet? Welche Art von Verunreinigungen kann die jeweilige Methode nachweisen, und welche können außerhalb ihres Erfassungsbereichs liegen?

Diese Unterscheidungen sind wichtig, weil mehrere verschiedene Parameter umgangssprachlich mit demselben Wort „Reinheit” bezeichnet werden, obwohl sie in Wirklichkeit unterschiedliche Eigenschaften der Probe beschreiben.

Untersuchungen zur Peptidanalytik zeigen, warum dies von Bedeutung ist. Strukturell ähnliche Verunreinigungen können manchmal in einem scheinbar einfachen chromatographischen Peak verborgen bleiben, während Wasser, Gegenionen, Rückstände anderer Substanzen und verwandte Verbindungen die Gesamtmasse des isolierten Peptidmaterials beeinflussen können. [1] [2]

Dies sind unterschiedliche analytische Probleme und sie erfordern unterschiedliche Arten von Beweisen.

Deshalb ist bei der Bewertung des COA eines Peptids nützlicher als die bloße Frage:

„Wie hoch ist der Reinheitsgrad?”

Hier ist eine Frage:

„Was genau wurde gemessen, mit welcher Methode, in welcher Probe und welche Schlussfolgerung ergibt sich tatsächlich aus dieser Messung?”

Was bedeutet die Reinheit von Peptiden eigentlich?

Sauberkeit ist das Ergebnis, das auf einer bestimmten Methode beruht

Das Wort „Reinheit” mag eine einzige, leicht messbare Eigenschaft suggerieren. In der Praxis können Labore die Peptidreinheit jedoch auf verschiedene Weise ausdrücken.

Das kann unter anderem sein:

• Prozentsatz der chromatographischen Fläche;
• Massenanteil;
• chemische Reinheit;
• Stereochemische Reinheit;
• Sequenzbezogenes Verschmutzungsprofil;
• die nach einer bestimmten analytischen Methode bestimmte Reinheit.

Diese sollten nicht als austauschbar betrachtet werden.

Die chromatographische Reinheit beschreibt typischerweise den Anteil der integrierten Detektorantwort, der der Hauptkomponente der Probe zugeordnet wird.

Der Massenanteil gibt das Verhältnis der Masse eines bestimmten Stoffes zur Gesamtmasse des untersuchten Materials an.

Die stereochemische Reinheit bezieht sich hingegen auf den Anteil der verschiedenen räumlichen Konfigurationen eines Moleküls oder der es bildenden Aminosäurereste.

Deshalb sollte eine korrekt dargestellte Reinheitsinformation nach Möglichkeit vier Fragen beantworten:

Was wurde gemessen? + Wie wurde gemessen? + Wie wurde das Ergebnis berechnet? + Welche Probe wurde untersucht?.

Die bloße Feststellung:

„Reinheitsgrad 99%”

vermittelt deutlich weniger Informationen als:

„99% – Fläche des Hauptpeaks gemäß RP-HPLC-UV”.

Doch auch die zweite Fassung beantwortet nicht alle Fragen.

Es muss noch festgestellt werden, ob die angewandte chromatografische Methode in der Lage war, die relevanten Verunreinigungen zu trennen, und ob der verwendete Detektor diese nachweisen konnte.

Was bedeutet der Prozentsatz der Spitzenfläche beim HPLC?

Vereinfacht lässt sich die Berechnung auf der Grundlage der Normalisierung der Peakflächen wie folgt darstellen:

Fläche des Hauptpeaks ÷ Gesamtfläche der berücksichtigten Peaks × 100.

Wenn dem Hauptpeak 990 Flächeneinheiten zugewiesen wurden und die Summe des berücksichtigten chromatographischen Signals 1000 Einheiten beträgt, beträgt die Fläche des Hauptpeaks:

990 ÷ 1000 × 100 = 99%.

Es handelt sich um eine Angabe zum Detektorausgangssignal, das unter bestimmten chromatographischen Bedingungen gemessen wurde.

Das bedeutet nicht automatisch, dass:

99% der physikalischen Masse des Pulvers entspricht dem Zielpeptid.

Es gibt mehrere Gründe für diesen Unterschied.

Verschiedene chemische Verbindungen können pro Masseneinheit unterschiedliche Detektorreaktionen hervorrufen.

Einige Bestandteile der Probe können die Strahlung bei der verwendeten Wellenlänge nur schwach absorbieren.

Andere werden möglicherweise überhaupt nicht in die chromatographischen Berechnungen einbezogen.

Einige Verunreinigungen können ebenfalls zusammen mit dem Hauptbestandteil eluieren.

Wichtig ist auch das Wort „berücksichtigt”.

Chromatografische Berechnungen hängen von Entscheidungen ab bezüglich:

• Peakintegration;
• Meldeschwellen;
• der Auswahl der Baseline;
• lösungsmittelbezogener Signale;
• nicht getrennter Peaks;
• Detektoreinstellungen;
• Prinzip des Ausschlusses bestimmter Signale.

Deshalb sollte der Prozentsatz der HPLC-Fläche als das Ergebnis einer spezifischen chromatographischen Methode und nicht als universelle Beschreibung der gesamten physikalischen Zusammensetzung der Probe interpretiert werden.

Verwandte Verunreinigungen können schwer zu trennen sein

Verunreinigungen in Peptiden können dem Zielmolekül strukturell sehr ähnlich sein.

Sie können unter anderem umfassen:

• Deletionssequenzen;
• gekürzte Sequenzen;
• veränderte Seitenketten;
• oxidierte Formen;
• modifizierte Endgruppen;
• Strukturisomere;
• Stereoizomere;
• Produkte der unvollständigen Entsicherung;
• weitere Varianten, die entstehen während Peptidsynthesen oder des Abbaus.

Einige dieser Strukturen können sich im chromatographischen Verhalten deutlich vom Zielpeptid unterscheiden.

Andere können sich sehr ähnlich verhalten.

In einer Studie wurde die zweidimensionale Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie zur Bewertung der Reinheit des Hauptpeptidpeaks eingesetzt. Die Forscher wandten zusätzliche Trennungsbedingungen an, da Peptidisomeren mit demselben Masse-zu-Ladungs-Verhältnis allein durch routinemäßige Messung der Masse nicht unterschieden werden konnten. [1]

In einer anderen Studie mit vier synthetischen cyclischen Peptiden wurde die Umkehrphasen-Chromatographie mit der Hydrophilen Interaktions-Chromatographie verglichen.

Beide Methoden trennten die Verunreinigungen auf unterschiedliche Weise. [3]

Das bedeutet nicht, dass eine dieser Techniken immer besser ist.

Sie zeigt hingegen das Phänomen der komplementären Selektivität: Zwei analytische Methoden können dieselbe Mischung unterschiedlich auftrennen, da sie unterschiedliche physikochemische Eigenschaften der untersuchten Moleküle nutzen.

Deshalb:

Nicht jedes saubere Chromatogramm bedeutet zwangsläufig das Fehlen aller strukturell ähnlichen Verunreinigungen.

Wasser und Gegenionen beeinflussen ebenfalls die Materialzusammensetzung

Das isolierte Peptidmaterial kann Bestandteile enthalten, die keine zusätzlichen Peptidsequenzen sind.

Zu den wichtigen Beispielen gehören:

• Wasser;
• Gegenteil;
• Lösungsmittelrückstände;
• anorganische Stoffe;
• weitere mit dem Produktionsprozess zusammenhängende Komponenten.

Ein Gegenion ist ein Ion mit entgegengesetzter elektrischer Ladung, das an die geladenen Gruppen des Peptids gebunden ist.

In der Peptidchemie kann man zum Beispiel auf Acetat oder Trifluoracetat stoßen.

Ihr Vorhandensein muss keinen Synthesefehler oder eine Verunreinigung bedeuten. Das Peptid kann absichtlich in einer bestimmten Salzenform vorliegen.

Diese Inhaltsstoffe sind jedoch von Bedeutung, wenn wir die Frage beantworten wollen:

Wie viel des Zielpeptyds befindet sich tatsächlich in der abgewogenen Materialmenge?

Die Interpretation hängt also davon ab, ob sich der gemeldete Wert bezieht auf:

• des selben Peptids;
• Soll Peptidu;
• Trockenbaumaterials;
• wasserfreien Materials;
• im Anlieferungszustand.

In einer Studie zur Sublancin aus dem Jahr 2026 bestimmten Forscher Wasser, Trifluoracetat, organische Verbindungen und anorganische Verunreinigungen im Rahmen einer umfassenderen Massenbilanzanalyse. [2]

Der schließlich zugewiesene Peptidanteil lag deutlich unter 100%, obwohl strukturell verwandte organische Verunreinigungen nur einen relativ kleinen Teil des Materials ausmachten.

Dies ist ein praktisches Beispiel für einen wichtigen Unterschied:

Ein reines chromatografisches Peptidprofil und ein hoher Massenanteil des Zielpeptids sind nicht derselbe Parameter.

Der Reinheitsgrad ist keine Wahrscheinlichkeit für Sicherheit

Der Prozentwert, der die Reinheit angibt, sagt nicht aus, wie wahrscheinlich es ist, dass das betreffende Material sicher ist.

Beispielsweise bedeutet der Reinheitswert 99% nicht:

„99% Sicherheit”.

Es enthält auch keine Angaben zur biologischen Bedeutung der einzelnen Substanzen, die im restlichen 1% enthalten sind.

Eine geringe Menge einer Verbindung kann eine größere analytische oder biologische Bedeutung haben als eine größere Menge einer anderen Verbindung, abhängig von:

• seiner Identität;
• biologische Aktivität;
• Konzentrationen;
• Expositionswege;
• der geplanten Verwendung;
• anderer kontextueller Faktoren.

Ebenso kann ein korrekt identifiziertes Molekül mit sehr hoher chemischer Reinheit selbst bestimmte biologische Eigenschaften aufweisen.

Chemische Reinheit und biologische Sicherheit beantworten somit völlig unterschiedliche Fragen.

Die Reinheitsprüfung dient dazu, die Probe im Rahmen der Möglichkeiten der angewandten Analysemethode zu charakterisieren.

Sie wandelt das chemische Ergebnis nicht in eine allgemeine Bewertung der Sicherheit für den Menschen um.

HPLC und Massenspektrometrie

Was kann uns HPLC sagen?

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) trennt die Bestandteile einer Probe anhand der Unterschiede in ihrer Wechselwirkung mit der stationären Phase und der durchströmenden mobilen Phase.

Bei der Peptidanalyse wird häufig die HPLC-Chromatographie mit umgekehrter Phasenverteilung (RP-HPLC) eingesetzt, oft in Kombination mit einer UV-Detektion.

Das Chromatogramm zeigt die Detektorsignal als Funktion der Zeit.

Daraus lassen sich einige wichtige Informationen entnehmen.

Die Retentionszeit gibt den Zeitpunkt an, zu dem ein bestimmter Bestandteil unter bestimmten Bedingungen das Chromatographiesystem verlässt.

Die Fläche des Peaks stellt die integrierte Detektorantwort dar.

Die Form des Peaks liefert Informationen über das chromatographische Verhalten der Substanz.

Die Auflösung beschreibt, wie effektiv benachbarte Komponenten voneinander getrennt werden.

Die Retentionszeit ist jedoch kein einzigartiger molekularer „Fingerabdruck”.

Verschiedene Moleküle können manchmal in ähnlichen Zeiträumen eluieren.

Derselbe Peptid kann nach einer Änderung auch andere Retentionszeiten aufweisen:

• Spalten;
• Zusammensetzung der mobilen Phase;
• Gradienten;
• Durchflussgeschwindigkeit;
• Temperaturen;
• Gerätekonfiguration;
• anderer Methodenparameter.

Studien, in denen verschiedene Systeme zur Trennung von Peptiden verglichen werden, zeigen, wie stark die chromatographische Selektivität von der verwendeten Methode abhängt. [1]

Die Übereinstimmung der Verweildauer kann daher die Identifizierung im jeweiligen Kontext unterstützen, sollte jedoch nicht automatisch als vollständige Bestätigung der Struktur gewertet werden.

Warum muss ein Peak nicht unbedingt einer Substanz entsprechen?

Koelution tritt auf, wenn zwei oder mehr Komponenten das chromatographische System in so ähnlichem zeitlichen Abstand verlassen, dass sie nicht ausreichend voneinander getrennt werden.

Dadurch können sie wie ein einziger Peak wirken.

Selbst ein optisch symmetrischer Hauptpeak beweist also nicht automatisch, dass das gesamte Signal von einer einzigen Molekülart stammt.

Die Zusammensetzung des Peaks kann genauer untersucht werden durch:

• eine Änderung der chromatographischen Selektivität;
• Verwendung einer anderen stationären Phase;
• eine Analyse bei mehreren Wellenlängen;
• Kopplung von Chromatographie und Massenspektrometrie;
• zweidimensionale Chromatografie;
• Anwendung einer anderen ergänzenden Analysetechnik.

Keine dieser Methoden erkennt jedoch automatisch jede mögliche Verunreinigung.

Eng verwandte Verbindungen können haben:

• ähnliche Retentionszeit;
• ähnliche UV-Wellenlängen;
• gleiche nominelle Masse;
• Andere gemeinsame analytische Eigenschaften.

Eine Untersuchung zirkulärer Peptide, bei der die chromatographische Analyse in umgekehrter Phase-Konzentration mit der Hydrofilitätschromatographie verglichen wurde, zeigte deutlich unterschiedliche Ausleuchtungsprofile von Schadstoffen. [3]

Das bedeutet nicht, dass jeder Hauptpunkt zusätzliche Verunreinigung enthält.

Der Vorschlag ist genauer:

Die scheinbare Einfachheit des Chromatogramms ist das Ergebnis einer Verteilung in einem einzigen System; die Anwendung einer anderen Selektivität kann jedoch Komponenten aufzeigen, die die erste Methode nicht identifiziert hat.

Was misst die Massenspektrometrie?

Massenspektrometrie (MS) erkennt Ionen anhand des Verhältnisses ihrer Masse zu ihrem Ladungszustand, das als m/z angegeben wird.

Bei der Analyse kann ein Peptid mehr als einen elektrischen Ladung besitzen.

Daher kann eine Peptidmolekül eine Reihe von Signalen generieren, die auf verschiedene Ladungszustände reagieren, anstatt eines einzigen Peaks, der direkt der neutralen Molekularmasse entspricht.

Eine entsprechende Interpretation der Daten ermöglicht es, die grundlegende Molekülmasse wiederherzustellen oder zu bestätigen.

Massemessung kann wertvolle Informationen über Folgendes liefern:

• Molekulengewicht;
• einige chemische Modifikationen;
• bestimmter Schadstoffe;
• Isotopische Muster;
• Verhalten bei der Fragmentierung.

Hochauflösende Massenspektrometrie ermöglicht es, Teilchen mit sehr ähnlichen Massen genauer zu unterscheiden.

Die Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) besteht darin, ausgewählte Ionen zu fragmentieren und die entstehenden Produkte zu analysieren, wodurch zusätzliche strukturelle Informationen bereitgestellt werden.

Allerdings gilt eine wichtige Regel:

Die Beobachtung der erwarteten Teilchenmasse ≠ die Bestätigung der vollständigen molekularen Struktur.

Verschiedene Strukturen können dieselbe Masse haben.

Stereochemische Änderungen können die Elementzusammensetzung nicht beeinflussen.

Positionsexemplare können ebenfalls zusätzliche Beweismittel erfordern.

Studien zur Verunreinigung mit synthetischem Peptid als Renin-Substrat zeigten diese Einschränkung. Zusätzliche Informationen aus Fragmentierung und Derivatisierung waren erforderlich, um die in der isobaren Mischung vorkommenden Modifikationen zu unterscheiden. [4]

Sequenz, Endgruppen und Stereochemie

Die Identität eines Peptids umfasst weit mehr als seine Bezeichnung.

Zu den wesentlichen strukturellen Merkmalen können gehören:

• Aminosäuresequenz;
• Konfiguration der einzelnen Restbestandteile;
• Struktur des N-Endes;
• C-Endstruktur;
• Modifikationen der Seitenketten;
• Platzierung der disiarczischen Brücken;
• Cyklisierung;
• Konjugation;
• Andere kovalerische Eigenschaften.

Beispielsweise ist ein Peptid mit einem C-terminalen Carboxylsäurerest chemisch gesehen eine andere Substanz als ein Peptid mit einem entsprechenden C-terminalen Amidrest.

Die Forscher entwickelten die Massenspektrometrie-Methode mit Derivatisierung gerade um diese Endformen effektiver zu unterscheiden. [5]

Dies zeigt eine wichtige Regel:

Die analytische Methode sollte auf die spezifische strukturelle Frage abgestimmt werden.

Die Stereochemie stellt eine zusätzliche Herausforderung dar.

Ein Peptid, das D-Aminosäure enthält und ein entsprechendes Variantenmodell mit L-Aminosäure enthält, kann eine gleiche Molekularmasse aufweisen und gleichzeitig das räumliche Anordnen der Atome unterscheiden.

In einer Studie zur stereochemischen Reinheit von Peptiden wurde eine Methode eingesetzt, die so konzipiert wurde, dass sie die Reizung berücksichtigt, die während der Hydrolyse der Probe entsteht. [6]

Ohne diese Kontrolle könnte die eigentliche Probenvorbereitung die Eigenschaft verändern, die gemessen werden sollte.

Eine verlässliche Analyse von Peptiden hängt daher nicht nur von den Parametern der Geräte ab, sondern auch von der korrekten Probenvorbereitung und dem Design der Methode.

LC-MS vereint die Vorteile beider Methoden, entfernt jedoch nicht alle Einschränkungen.

Die Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie (LC-MS) vereint die chromatografische Trennung mit der Massenanalyse.

Vielleicht liefern sie dadurch wesentlich mehr Informationen als jede dieser Methoden einzeln angewendet.

LC-MS kann unter anderem helfen,

• Zu den Schadstoffpunkten zu bestimmten Massen zu zählen;
• chromatografisch ähnliche Bestandteile unterschiedlicher Massen zu unterscheiden;
• die Degradationsprodukte zu untersuchen;
• Die Verunreinigung durch die Sequenz zu charakterisieren;
• die Unterstützung struktureller Zuordnungen fördern.

In einer Untersuchung zur Synthese von Oxytocin wurde mithilfe einer intern validierten LC-Methode in Verbindung mit einer Hochdurchsatz-Massenspektrometrie eine Quantifizierung von 18 strukturell verwandten Verunreinigungen durchgeführt. [7]

Die Forscher erklärten auch, warum diese Verunreinigungen bei der Bestimmung der Reinheit des Referenzmaterials berücksichtigt werden mussten.

Diese Ergebnisse beziehen sich jedoch auf eine bestimmte Probe, eine bestimmte Methode und ein bestimmtes Schadstoffprofil.

Sie sollten nicht als universelle Liste von Schadstoffen betrachtet werden, die in jedem Material enthalten sind, das Oxytocin enthält.

LC-MS ist daher eine äußerst nützliche Kombination aus analytischen Techniken.

Ein guter LC-MS-Bericht sollte jedoch weiterhin die folgenden Punkte erklären:

• was gemessen wurde;
• wie die einzelnen Piki zugeordnet werden;
• wie die vorgeschlagenen Strukturen identifiziert wurden;
• ob die Zuordnungen bestätigt wurden;
• welche quantitativen Methode angewendet wurde;
• welche analytischen Einschränkungen bleiben.

Identität, Reinheit und Quantität sind verschiedene Parameter.

Die Identität beantwortet die Frage: Welche Teilchen sind vorhanden?

Die Identitätsuntersuchung soll die Frage beantworten, ob das analysierte Material der beabsichtigten Substanz entspricht.

Je nachdem, für welches Peptid und welches Problem es sich handelt, können die Beweise zur Identität Folgendes umfassen:

• die Masse der gesamten Teilchenmenge;
• fragmentarische Daten;
• Analysieren der Sequenz;
• Charakterisierung der Endgruppen;
• Aminosäurezusammensetzung;
• Platzierung der disiarczischen Brücken;
• Spektroskopische Daten;
• chromatographische Vergleiche mit dem Referenzmaterial;
• die Kombination mehrerer Methoden.

Eine Methode kann einen bestimmten Aspekt der Identität bestätigen, ohne alle anderen strukturellen Fragen zu klären.

Zum Beispiel:

„Die erwartete Masse der gesamten Teilchenmenge wurde beobachtet”

Es ist ein schmalerer Schluss als:

„Die vollständige molekulare Struktur wurde bestätigt.”.

Studien zur endlichen und isobarischen Peptideinwirkungen zeigen, warum diese Unterscheidung wichtig ist. [4] [5]

In beiden Fällen waren Informationen erforderlich, die über die bloße Beobachtung eines Massenphänomens in der Nähe des erwarteten Wertes hinausgingen.

Die Reinheit beantwortet die Frage: Was noch in der Probe enthalten ist?

Die Reinheitsuntersuchung untersucht die Zusammensetzung der Probe im definierten analytischen Bereich.

Je nachdem, wie die Methode verwendet wird, kann der Bericht Folgendes enthalten:

• der Hauptbestandteil;
• die einzelnen Verunreinigungen;
• die Gesamtzahl der gemessenen Verunreinigung;
• Prozent der Fläche des Hauptpikas;
• stereochemische Verunreinigung;
• Verwandte Substanzen;
• Gesamtwert des Massenanteils.

Verschiedene Schadstoffklassen erfordern möglicherweise unterschiedliche Methoden.

Eine chromatografische Methode, die für die Detektion von delezyonsträngen optimiert wurde, muss nicht auf Fragen zur Stereochemie eingehen.

Die Massenbasierte Methode kann Isomere nicht unterscheiden.

Die chirale Methode kann jedoch nur wenig Informationen über den Wassergehalt liefern.

Das Ziel der Anwendung von komplementären Methoden ist daher nicht allein die Erfassung einer größeren Anzahl von Ergebnissen.

Es geht darum, Antworten auf verschiedene analytische Fragen zu erhalten, die eine Methode allein nicht beantworten kann.

Die Menge entspricht der Frage: Wie viele Substanzen sind vorhanden?

Die Menge kann sich auf mehrere verschiedene Parameter beziehen.

Es könnte bedeuten:

• Konzentration des Peptids in der Lösung;
• die Gesamtzahl der Peptide im Behälter;
• Massenanteil des Ziel-Peptids;
• Molensiedern;
• Die Menge pro Einheit des Volumens;
• ein anderer klar definierter quantitativer Parameter.

Jeder dieser Methoden erfordert eine entsprechende Einheit und eine Berechnungsgrundlage.

Die quantitativen chromatographischen Angaben erfordern in der Regel eine entsprechende Kalibrierung und sollten nicht ausschließlich auf der Normierung der Pixeloberfläche basieren.

In entsprechend entwickelten Methoden können auch die folgenden Faktoren zur Bestimmung der Menge beitragen:

• Aminosäureanalyse;
• quantitativer Magnetresonanztomografie;
• Methode der Isotopverdünnung;
• Andere validierte quantitative Techniken.

Wichtig ist außerdem, dass verwandte peptische Verunreinigungen auf bestimmte quantitativen Messungen Einfluss nehmen können.

Forschung über die Reinheit von Oxytocin hat die Notwendigkeit hervorgehoben, Ergebnisse solcher Verunreinigung zu korrigieren, anstatt anzunehmen, dass jeder gemessene Aminosäure oder analytische Signal ausschließlich von der Zielmolekül stammt. [7]

Beispiel: Prozentsatz der HPLC-Fläche und tatsächliche Menge des Peptids

Stellen wir uns einen hypothetischen Peptidpulver vor, für das folgende Ergebnisse erzielt wurden:

RP-HPLC-UV, Oberfläche des Hauptspiels = 99,0%

und

Unabhängig davon beträgt der Massenanteil des Zielpeptids = 78,0% im Ausgangsmaterial.

Diese Ergebnisse müssen nicht gegensätzlich sein.

Sie haben unterschiedliche Attribute und beantworten verschiedene analytische Fragen.

Wenn man 10,0 mg dieses hypothetischen Pulvers verwendet und der validierte Anteil des Zielpeptids in der Masse beträgt 78,0%, beträgt die Menge des daraus resultierenden Peptids folgende:

10,0 mg × 0,780 = 7,80 mg.

Es sollte nicht automatisch akzeptiert werden:

10,0 mg × 0,990 = 9,90 mg

Nur deshalb, weil der Hauptpunkt für 99,0% der eingerechneten UV-Fläche verantwortlich war.

Dies ist lediglich eine analytische Illustration und beschreibt keine konkreten kommerziellen Produkte oder experimentelle Materialien.

Die Untersuchung der Sublancin stellt ein reales Beispiel für die Grundprinzipien dieser Unterscheidung dar, da bei der Bewertung der Zusammensetzung des Materials insbesondere Wasser und Antigone berücksichtigt wurden [2].

Die numerischen Werte aus dieser Studie sollten nicht auf andere Peptide übertragen werden.

Messunsicherheit und Messkonstanz

Das Analyseergebnis sollte nicht als Werte mit unbegrenzter Genauigkeit betrachtet werden.

Dies ist eine Schätzung, die mithilfe einer bestimmten Messmethode ermittelt wurde.

Die Unsicherheit der Messung beschreibt den Bereich oder die Streuung der Werte, die gemäß der angewendeten Bewertungsmethode auf eine veranlassbare Weise mit dem Messresultat verknüpft werden können.

Das bedeutet nicht, dass das Labor weiß, dass sein Ergebnis falsch ist.

Es informiert jedoch über die Grenzen der numerischen Sicherheit.

Messgenauigkeit bezieht sich auf die dokumentierte Beziehung zwischen dem Ergebnis und dem entsprechenden Referenzwert über den Kalibrierungsketten.

Sie hilft, die Vergleichbarkeit der Messungen zu gewährleisten, aber nur für den spezifischen Parameter, der tatsächlich gemessen wurde, und für einen festgelegten Bezugsrahmen.

In einer Studie zur Entwicklung eines Referenzmaterials, NT-proBNP, wurden Methoden zur isotopischen Verfälschung, korrigiert für Verunreinigungen, mit der Bewertung der Homogenität und Stabilität des Materials kombiniert. [8]

Dies zeigt, warum eine verlässliche Zunahme der quantitativen Werte wesentlich mehr erfordert als nur die Anzeige der von dem Gerät generierten Zahl.

Wie liest man den COA-Analyseschlüssel?

Beginnen Sie mit der Identifizierung der Probe und der Partie.

Bevor eine Interpretation eines Analysevergebnisses vorgenommen wird, muss festgelegt werden, welches Material tatsächlich untersucht wurde.

Ein nützlicher COA sollte die Ergebnisse mit Identifikationsinformationen wie z. B.

• Name oder Beschreibung des Materials;
• Probeidentifikator;
• Chargen- oder Seriennummer;
• die entsprechenden Daten;
• strukturelle Form;
• die Form der Salze, falls das wichtig ist;
• Änderungen der Enden oder andere wesentliche strukturelle Merkmale.

Das ist wichtig, da die Analyseergebnisse auf eine Probe beziehen, die tatsächlich untersucht wurde.

Das Zertifikat für eine einzelne Partie bestätigt nicht direkt die Zusammensetzung einer anderen Partie.

Ebenso bewirkt eine Analyse auf einer Stichprobe von Gesamtmaterial nicht automatisch die Menge oder den Zustand des Materials in jedem einzelnen Behälter, der später befüllt wird, es sei denn, das Probenahme-, Befüll-, Homogenitäts- und Prozesskontrollsystem rechtfertigt einen solchen Schluss.

Es handelt sich um Fragen in Bezug auf die Konsistenz und Identifizierung des Materials.

Sie bedeuten nicht automatisch eine falsche Handlung oder eine mangelhafte Qualität.

Der Leser des Berichts braucht einfach eine Verbindung, die sich verteidigen lässt:

Bericht → geprüfte Probe → Partie oder Material, auf das der Ergebnisbetrag zutrifft.

Die Methode, das Ergebnis, die Einheit und die Spezifikation lesen Sie zusammen.

COA stellt oft sowohl das Akzeptanzkriterium als auch den tatsächlich erzielten Ergebnis dar.

Zum Beispiel:

Spezifikation: Mindestens 98,0%

und

Ergebnis: 99,2%.

Es handelt sich um zwei verschiedene Informationen.

Die Spezifikation legt das Akzeptanzkriterium fest.

Der Wert zeigt den für die jeweilige Probe gemessenen Wert an.

Egalerweise sind die Einheit und die Grundlage der Messung ebenso wichtig.

Man kann unter anderem folgende Arten treffen:

• Gebiet%;
• Massen%;
• mg/Behälter;
• mg/mL;
• µg/mL;
• mol/L;
• Ausdruck in Trockenmasse;
• Ausbeute bezogen auf das wasserfreie Material;
• Der Wert für das erhaltene Materialzustand.

Diese Werte können nicht beliebig ersetzt werden.

Beispielsweise berücksichtigt der als „eingespeichertes Ergebnis” ausgewiesene Wert das Material in der Form, in der es untersucht wurde, während ein unverwasserter oder korrigierter Wert die Wassermenge aus dem Berechnungsgrundsatz mathematisch ausschließen kann.

Die Meldung „Pass” bedeutet, dass der eingegebene Wert das bestimmte Akzeptanzkriterium für den jeweiligen Test erfüllt.

Sie erweitert den Untersuchungsbereich nicht.

Deshalb:

Zulässiger Identitätsnachweis ≠ bestätigte Sterilität

und

Zulassener Reinheitstest HPLC ≠ die bestimmte Peptidkonzentration,

Es sei denn, diese Eigenschaften wurden unabhängig gemessen.

Beispielhafte Interpretation der Einträge in der COA

Die folgenden Beiträge sind hypothetisch und dienen ausschließlich dazu, die Interpretation analytischer Daten zu veranschaulichen. Sie beschreiben keine reale Partei und bieten auch keine Akzeptanzkriterien an.

Die dargestellten Unterscheidungen basieren auf Studien zur Reinheit des Hauptpeptidmoleküms, der Antigone und zur Bestimmung des Massenanteils. [1] [2] [9]

Die angegebenen Zahlen und die Formate der Tabellen dienen ausschließlich der Information.

Überprüfen Sie das Chromatogramm und das Spektrum

Zusätzliche analytische Daten helfen, die in der COA zusammengefassten Ergebnisse richtig zu interpretieren.

Bei einem Chromatogramm ist es wichtig, Folgendes zu beachten:

• Probeidentifikator;
• Methoden-ID;
• Chromatogramm-Achsen;
• Art des Detektors;
• Frequenz;
• Wesentliche Verweilzeiten;
• Markierungen der Piks;
• Tabellen der Schadstoffe;
• Ergebnisse der Integration;
• Meldeplattformen.

Ein Chromatogramm, das so zuschneidet, dass nur der große Hauptpunkt angezeigt wird, kann Informationen verstreichen lassen, die für eine korrekte Interpretation des Reinheitswertes erforderlich sind.

Im Falle der Massenspektrometrie kann ein Kontext, der nützlich ist, Folgendes umfassen:

• die erwartete molekulare Form;
• die erwartete Masse;
• erkannte Ionen;
• angewiesene Ladestände;
• De-Konvolutionsverfahren;
• Massenfehler;
• fragmentarische Daten, falls sie anwendbar sind;
• Die Grundlage für die Zuordnung der Struktur.

Das Bild einer gesamten Massenmoleküle, die zerfällt, und strukturelle Beweise auf der Grundlage der Fragmentierung sind miteinander verbunden, aber sie bedeuten nicht dasselbe.

Die COA muss nicht unbedingt alle Rohdaten der Geräte enthalten.

Die darin zusammengefassten analytischen Schlussfolgerungen sollten jedoch mit der Quellendokumentation verknüpft werden können, die überprüft werden kann, falls Fragen zur Zuordnung einer Struktur oder eines numerischen Ergebnisses auftreten.

„Nicht entdeckt” und „nicht untersucht” bedeuten etwas völlig anderes.

„Nicht nachgewiesen” bedeutet, dass die angewendete analytische Methode das untersuchte Substrat unter bestimmten Bedingungen und bei ihrer Sensitivität nicht nachgewiesen hat.

Das bedeutet nicht, dass die tatsächliche Konzentration genau null beträgt.

„Unterhalb der Messgrenze” bedeutet hingegen, dass der Stoff auf einem Niveau vorliegen kann, das eine bestimmte Methode nicht in der Lage ist, quantitativ zuverlässig zu bestimmen.

Das ist eine andere Situation.

„Nicht untersucht” bedeutet, dass für die betreffende Eigenschaft kein Messwert ermittelt wurde.

Das sollte nicht so interpretiert werden:

„korrekter Ergebnis”

auch:

„nicht vorhandene Substanz”.

Eine korrekte Interpretation der Informationen zur Detektion oder zur quantitativen Bestimmung erfordert auch die Kenntnis:

• Grenze der Erkennbarkeit oder Messbarkeit;
• Einheiten;
• Grundlagen der Berichterstattung;
• die angewandte Methode;
• des Verfahrens zur Herstellung der Probe.

Was liefert eine unabhängige Labortestung heraus?

Ein unabhängiges Labor kann eine zusätzliche analytische Untersuchung für die gesendete Probe liefern.

Dies kann die Anzahl der verfügbaren Beweise für ein bestimmtes Material erhöhen.

Nur der Begriff:

„durch ein unabhängiges Labor geprüft”

Er erklärt jedoch nicht:

• Was genau untersucht wurde;
• wie viele Proben untersucht wurden;
• Wer die Probe ausgewählt hat;
• Wer hat sie gebrochen;
• ob sie repräsentativ war;
• von welcher Partei sie stammte;
• welche Methoden verwendet wurden;
• ob der Bericht überprüft werden kann;
• ob die Probe dem später vertriebenen Material entspricht;
• Über welche Eigenschaften das Untersuchungsergebnis überhaupt nicht berichtete.

Die nützlichsten Fragen beziehen sich daher auf:

Identität der Probe + Identifizierung der Partie + Art der Probenahme + analytische Bandbreite + Authentizität des Labortrags.

Eine unabhängige Untersuchung beseitigt die Einschränkungen der angewandten Methoden nicht.

HPLC, das von einem externen Labor durchgeführt wird, bleibt weiterhin eine Untersuchung für HPLC.

Es wird nicht als Test für Sterilität, als Kennzeichnung der Peptidkonzentration, als stereochemische Analyse oder als Untersuchung der biologischen Aktivität durchgeführt, nur weil es von einer unabhängigen Stelle durchgeführt wurde.

Deshalb ist es wichtig, die COA vor allem anhand ihres analytischen Umfangs und der Möglichkeiten zur Nachverfolgung einer Probenahme zu bewerten, und nicht ausschließlich anhand der Laborekennzeichnung oder einer hohen Prozentzahl, die am Anfang des Dokuments angegeben ist.

Was bestätigen nicht die routinemäßigen analytischen Untersuchungen?

HPLC weist die Sterilität nicht zurück

Die routinemäßige HPLC-Analytik von Peptiden untersucht die chemischen Bestandteile anhand ihrer chromatographischen Eigenschaften.

Es ist keine Methode zur Erkennung lebender Mikroorganismen.

Ein reiner Chromatogramm kann daher nicht bestätigen, dass der Probenkörper steril ist.

Sterilität ist ein mikrobiologisches Problem, das entsprechende Methoden und eine Kontrolle des Produktionsprozesses erfordert.

Selbst eine separate Untersuchung der Sterilität weist Einschränkungen hinsichtlich der Probenahme auf, da nur ein Teil des Materials, das im Test verwendet wird, direkt untersucht wird.

Aus diesem Grund basiert die Gewährleistung der Sterilität in der pharmazeutischen Produktion auf einem umfassenderen Produktions- und Kontrollsystem und nicht ausschließlich auf der endgültigen Produktkontrolle.

Die FDA-Richtlinien für die aseptische Produktion behandeln mikrobiologische Kontrollen und die Untersuchung der Sterilität als separate Elemente des Prozesses. [10]

Deshalb:

Hohe Reinheit von HPLC ≠ Sterilität

und

Das Fehlen sichtbarer chromatographischer Verunreinigungen ≠ das Fehlen von Mikroorganismen.

Die Untersuchung von Endotoxinen beantwortet eine andere Frage

Endotoxine sind Bestandteile von Bakterien, insbesondere ein Material, das mit Lipopolysäuren von gramnegativen Bakterien verbunden ist.

Sie sind nicht dasselbe wie lebende Bakterien.

Die Untersuchung bakterieller Endotoxine beantwortet also eine andere Frage als der Sterilitätstest.

Theoretisch kann die Probe keine nachweisbaren lebenden Bakterien enthalten, doch kann sie bestimmte Komponenten bakteriellen Ursprungs enthalten.

Ebenso kann der Sterilitätstest nicht automatisch die Messung von Endotoxin ersetzen.

Die Probenmatrix kann auch die Untersuchung von Endotoxinen beeinflussen.

Es ist daher wichtig, die Methode entsprechend anzupassen und die Interferenzen zu kontrollieren.

Die FDA-Richtlinien zu Pyrogenen und Endotoxinen behandeln analytische Einschränkungen sowie die Unterscheidung zwischen bakteriellen Endotoxinen und anderen pyrogenen Substanzen. [11]

Eine routinemäßige Analyse der HPLC-Reinheit kann weder die Sterilität-Testung noch die Endotoxin-Testung ersetzen.

Die chemische Reinheit bestätigt keine biologische Aktivität

Die Probe kann Folgendes enthalten:

• die erwartete Molekularmasse;
• eine hohe Oberfläche des Hauptchromatografie-Abscheiders;
• eine relativ geringe Anzahl von nachgewiesenen chemischen Verunreinigungen,

und gleichzeitig keine bestätigte spezifische biologische Funktion zu haben.

Die funktionelle Beeinträchtigung kann auch von folgenden Faktoren abhängen:

• Verformung;
• Anordnung der Disulfidbrücken;
• Aggregation;
• strukturelle Konformität;
• Zustand der Modifikation;
• Testbedingungen;
• des angewendeten biologischen Systems.

Die Untersuchung zur Synthese von BPTI zeigt gut die Bedeutung der Aufteilung dieser Fragen.

Die Wissenschaftler kombinieren die analytische und die biofizikale Charakterisierung mit einem Trypsin-Hemmungstest. [12]

Insgesamt lieferten diese Ergebnisse stärkere Beweise über das untersuchte Material.

Kein einzelnes Messwert konnte die anderen ersetzen.

Deshalb:

Chemischer Reinheitsgrad ≠ biologische Aktivität

und

Die biologische Aktivität in einem Test ≠ die vollständige strukturelle oder produktive Charakteristik.

COA ist keine Bewertung der klinischen Sicherheit

COA stellt die Ergebnisse analytischer Untersuchungen dar, die an der beschriebenen Probe durchgeführt wurden.

Er legt nicht fest:

• klinische Toleranz;
• die Sicherheit der Exposition gegenüber Menschen;
• die entsprechende Dosis;
• Interaktion;
• Effektivität;
• langfristigen Auswirkungen;
• Nützlichkeit für eine bestimmte Person.

Diese Fragen erfordern andere Arten von Beweisen.

Diese Regelung bleibt auch dann gültig, wenn die Analyseergebnisse genau sind und die Identität des Peptids korrekt bestätigt wurde.

Eine Reinheitsuntersuchung kann bestimmte Aspekte des chemischen Stoffespektrums charakterisieren.

Er darf den analytischen Bericht nicht in eine klinische Studie umwandeln oder die Sicherheit bei der Anwendung bei Menschen bewerten.

Ein Zeitpunkt belegt nicht die Haltbarkeit.

COA beschreibt normalerweise das Material zu einem bestimmten Zeitpunkt der Untersuchung.

Die Peptide können dann Veränderungen unterliegen, die mit:

• Degradation;
• Oxydation;
• Hydrolyse;
• durch Deamidierung;
• Aggregat;
• Feuchtigkeitsspeicherung;
• strukturellen Umstrukturierungen;
• andere Prozesse, die von den Eigenschaften der Teilchen und den Umweltbedingungen abhängen.

Das Ergebnis, das in einem einzigen Moment erreicht wird, bestätigt daher keine unbegrenzte Stabilität.

Die Haltbarkeitsdauer erfordert Daten, die die definierten Lagerbedingungen mit einer analytischen Materialverfügbarkeitsanalyse verbinden.

In einer Studie zu Exenatid wurde eine chromatografische Methode entwickelt, die die Stabilität zeigte und die Abbauprodukte beschrieben, die unter mehreren stressigen Bedingungen entstehen. [13]

Diese Studie zeigt, wie man Abbauprodukte von dem ursprünglichen Peptid trennen kann.

Es gibt jedoch keine universelle Speicherdauer für alle Peptide und künstliche Stressbedingungen sollten nicht automatisch mit normalen Speicherbedingungen gleichgesetzt werden.

Der stärkste Antrag sollte der Stärke der Beweislage entsprechen.

Eine wissenschaftlich vorsichtige Interpretation sollte den Rahmen der durchgeführten Messungen nicht überschreiten.

Zum Beispiel kann die COA eine Aussage wie folgt begründen:

„In der untersuchten Probe wurde ein Gesamtmasseverhältnis der gesamten Teilchen erhalten, das mit dem zugehörigen Peptid übereinstimmt, der spezifische Anteil der Hauptoberfläche des Pikks in der angewendeten HPLC-Methode sowie die jeweils ermittelte Peptidkonzentration.”.

Es handelt sich um ein wertvolles Ensemble analytischer Beweise.

Das bedeutet jedoch nicht automatisch:

„Der Peptid wurde vollständig charakterisiert; er ist steril, biologisch aktiv, sicher, stabil über einen unbegrenzten Zeitraum und geeignet zur Anwendung bei Menschen.”.

Es geht nicht darum, die Bedeutung der Labortests in Frage zu stellen.

Es darf auch nicht erwartet werden, dass eine bestimmte Analysemethode alle möglichen Fragen beantworten kann.

Das Wichtigste ist die Verbindung:

jedes Argument → mit einem Maßstab, der tatsächlich eine Begründung dafür liefern kann,

mit deutlicher Angabe der Fragen, auf die keine Antworten erhalten wurden.

Häufig gestellte Fragen

1. Bedeutet die Reinheit von 99%, dass das Produkt sicher ist?

Nein. Der Reinheitsgehalt beschreibt die Zusammensetzung der Probe gemäß einer bestimmten analytischen Methode und nicht das Sicherheitsrisiko. Darüber hinaus kann dieser Wert den Anteil des chromatographischen Signals und nicht den physischen Massenanteil des Zielpeptids bedeuten. Studien über den Massenbilanzwert von Peptiden zeigen, warum Wasser, Antikörper und andere Bestandteile zu Unterschieden zwischen diesen Werten führen können. [2] Unabhängig von der analytischen Reinheit kann die Zielmolekül selbst auch eigene biologische Eigenschaften besitzen. Ein hoher Reinheitswert kann daher die chemische Charakteristik der untersuchten Probe unterstützen, ersetzt jedoch nicht toxikologische, pharmakologische, mikrobiologische oder klinische Sicherheitsnachweise.

2. Bestätigt HPLC die Sterilität?

Nein. Eine routinierte HPLC-Peptidanalyse unterscheidet und erkennt chemische Bestandteile anhand ihrer chromatographischen Eigenschaften. Sie bestimmt nicht, ob in der Probe lebende Mikroorganismen vorhanden sind. Sterilität ist eine separate Eigenschaft, die entsprechende mikrobiologische Untersuchungen und eine Kontrollprüfung des Produktionsprozesses erfordert. Die FDA-Richtlinien für aseptische Produktion behandeln die mikrobiologische Kontrolle unabhängig von der chemischen Analyse. [10] Daher können ein reiner Chromatogramm, ein hoher Hauptspeichermaterialienanteil oder die erwartete Retentionszeit des Peptids keine Beweise für Sterilität ersetzen.

3. Was genau bedeutet der Prozentsatz der HPLC-Fläche?

Der HCPL-Gehalt in Prozent bezieht sich in der Regel auf den Anteil des integrierten Signals, das dem Hauptpik zugewiesen wird, an dem gesamten aufgenommenen chromatografischen Signal. Der Wert hängt von der Qualität der Auflösung, der Empfindlichkeit des Detektors, der Wellenlänge, den Integrationsregeln, den Berichtsgrenzen und anderen Bedingungen der Methode ab. Daher bedeutet er nicht automatisch die physische Beteiligung des massenreichen Peptids an der gesamten Probe. Untersuchungen zur Reinheit des Hauptpik-Peptids zeigen, warum unaufgelöste Isomere die Interpretation verkomplizieren können. [1] Der HPLC-Gehalt in Prozent sollte daher als Ergebnis einer bestimmten analytischen Methode betrachtet werden, deren Messgrundlage klar definiert sein muss.

4. Kann ein Pik HPLC mehrere Substanzen enthalten?

Ja. Zwei oder mehr Komponenten können so nah voneinander eluieren, dass sie in einem bestimmten Chromatographieverfahren nicht ausreichend getrennt werden und als ein einzelnes Pik erscheinen. Daher ist selbst ein visuell symmetrischer Pik kein absoluter Beweis für molekulare Homogenität. Untersuchungen an cyclischen Peptiden zeigten, dass ein anderer Chromatographieverfahren ergab eine unterschiedliche Art der Abspaltung von Verunreinigungen als RP-HPLC. [3] Das bedeutet nicht, dass jeder Hauptpik versteckte Substanzen enthält. Es zeigt jedoch, dass die Abspaltungsfähigkeit von der Selektivität der Methode abhängt und bei stark verwandten Strukturen zusätzliche analytische Techniken erforderlich sein können.

5. Bestätigt die korrekte Molekularmasse die korrekte Peptidsequenz?

Nein. Die Masse der gesamten Teilchen entspricht dem erwarteten Wert und stellt einen wertvollen Beweis für die Identität dar, muss jedoch nicht die Reihenfolge der Aminosäuren, die Stereochemie, die Art der Endgruppen, die Position der Modifikationen oder alle anderen strukturellen Merkmale bestätigen. Untersuchungen an synthetischen Verunreinigungen von Peptiden zeigten Komponenten mit gleicher Masse, aber mit Modifikationen in verschiedenen Positionen, was zusätzliche analytische Informationen erfordert hat. [4] Eine vollständige Bestimmung der Identität erfordert daher Methoden, die auf die spezifischen strukturellen Unklarheiten des jeweiligen Peptids zugeschnitten sind.

6. Wie unterscheidet sich die Zusammensetzung eines Peptids von der Reinheit?

Die Peptidkonzentration gibt an, wie viel des definierten Zielpeptids in dem Material nach einer bestimmten quantitativen Grundlage vorhanden ist. Die Reinheit hingegen kann die Menge des chromatografischen Signals bedeuten, das einem Hauptkomponent oder einem anderen definierten Reinheitsparameter zugeordnet ist. Wasser, Antikörper, Prozess- und strukturell verwandte Verbindungen können dazu führen, dass diese Werte unterschiedlich ausfallen. Bei der Untersuchung von Sublankinen wurden mehrere dieser Bestandteile während der Massenbilanzanalyse separat bestimmt. [2] Das Ergebnis der Peptidkonzentration und des HPLC-Oberflächenanteils muss daher separat interpretiert werden, es sei denn, ein validiertes analytisches System bestimmt eindeutig die Beziehung zwischen diesen Parametern.

7. Können Wasser und Antidote die Menge des Peptids im Pulver beeinflussen?

Ja. Wasser und Antikörper erhöhen die gesamte physikalische Masse der Probe und können daher einen Teil der Masse reduzieren, der auf den endgültigen Peptid zugewiesen wird, wenn der Wert für das Material in der erhaltenen Form angegeben wird. Studien zur Sublanin und peptischen Antikörper zeigen, warum diese Komponenten möglicherweise eine separate Bestimmung erfordern. [2] [9] Ihre Anwesenheit muss weder eine Synthese-Fehlfunktion noch eine Verunreinigung bedeuten, da das Antikörperteil als Teil der gewünschten Salzform fungieren kann. Die entscheidenden Fragen beziehen sich daher auf die Art der molekularen Formanalyse, die Menge der einzelnen Bestandteile und die Grundlage der angewendeten Berechnung.

8. Ist das Antijon das gleiche wie Peptidverschmutzung?

Nicht immer. Das Gegenjon kann ein erwartetes Bestandteil der Peptideinheit sein, während die Sequenzbedingte Verunreinigung eine andere Peptideinheit darstellt. Es handelt sich also um verschiedene analytische Kategorien, obwohl beide Einfluss auf die Gesamtsammensetzung der Probe haben können. In Studien, die Peptideinheiten vergleichen, wurden in Versuchen zur Durchdringung durch Membranen Sequenzabhängige und Formbedingte Unterschiede beobachtet. [9] Wenn ein Gegenjon für die Materialcharakteristik relevant ist, sollten seine Art und Menge getrennt gemeldet werden und nicht anhand der chromatographischen Reinheit des Hauptpeptidpeaks abgeleitet werden.

9. Kann die einfache Massenspektrometrie Varianten von D- und L-Aminosäuren unterscheiden?

Die Messung der gesamten Massen der einzelnen Moleküle selbst ermöglicht in der Regel nicht die Unterscheidung zwischen Strukturen mit identischer Elementarzusammensetzung, die sich lediglich in ihrer Stereochemie unterscheiden. Die Varianten D und ihr entsprechender Varianten L können daher eine gleiche Molekularmasse aufweisen. Wenn die Frage jedoch die räumliche Konfiguration betrifft, ist eine entsprechende chiralen oder stereochemischen Analyse erforderlich. Bei der Untersuchung der chiralen Reinheit von Peptiden wurde ein speziell entwickeltes Verfahren eingesetzt, das die während der Probenvorbereitung entstehenden stereochemischen Veränderungen berücksichtigt. [6] Das Problem ist strukturell bedingt, weshalb eine alleinige Verbesserung der Genauigkeit der Massenbestimmung diese Unklarheit nicht beseitigt.

10. Warum ist die Parteiennummer auf der COA wichtig?

Die Partien- oder Seriennummer hilft, die analytischen Ergebnisse mit dem spezifischen Material zu verknüpfen, das untersucht wurde. Die Ergebnisse für eine bestimmte Partie können nicht automatisch auf eine andere Partie oder auf jeden Behälter übertragen werden, der zu einem anderen Zeitpunkt hergestellt wurde. Untersuchungen zu zertifizierten Referenzmaterialien bewerten Eigenschaften wie Homogenität und Stabilität, anstatt diese auf der Grundlage eines einzelnen Messes zu erwarten. [8] Eine entsprechende Partiennummer ist daher ein wichtiger Bestandteil der Identifizierung, obwohl sie selbst nicht beweisen kann, dass die Probenahme, Lagerung, Handhabung des Materials und alle anderen Elemente des Kontrollsystems korrekt durchgeführt wurden.

11. Bedeutet „nicht gefunden” Null?

Nein. „Nicht nachgewiesen” bedeutet, dass die angewandte Methode die untersuchte Substanz unter bestimmten Bedingungen und innerhalb ihrer Empfindlichkeit nicht nachgewiesen hat. Dies bedeutet nicht, dass die tatsächliche Menge genau null beträgt. Ein Wert unterhalb der Nachweisgrenze oder der Messgrenze sollte zusammen mit der entsprechenden Grenzwerte, der Einheitsgröße, der Probenbasis und den analytischen Bedingungen interpretiert werden. Richtlinien für Endotoxinanalysen behandeln ebenfalls die Bedeutung der Empfindlichkeit der Methoden und mögliche Interferenzen. [11] Ein wissenschaftlich begründeter Schluss sollte sich daher auf das, was die Methode tatsächlich nachweisen konnte, beziehen, und nicht auf die absolute Aussage über die vollständige Abwesenheit der Substanz.

12. Was bedeutet die Unsicherheit bei der Messung im Bericht?

Die Messunsicherheit beschreibt die Streuung von Werten, die nach angemessener Überlegung mit dem erstellten Ergebnis in Übereinstimmung gebracht werden können. Sie bedeutet nicht, dass das Labor seinen Wert für falsch hält. Sie zeigt jedoch die quantitativen Unsicherheitsgrenzen einer bestimmten Schätzung an. In Untersuchungen zu Referenzmaterialien kann die Zuordnung von Werten unter anderem durch die Unsicherheit des Messens selbst, die Homogenität und Stabilität berücksichtigt werden. [8] Die Unsicherheit muss daher zusammen mit ihrer Definition, den verwendeten Einheiten, dem angewendeten Deckungsniveau und der genau definierten Messgröße interpretiert werden.

13. Bestätigt die Untersuchung durch ein unabhängiges Labor, dass alle Behälter denselben Inhalt enthalten?

Nein. Eine unabhängige Untersuchung liefert Beweise bezüglich der Proben oder Stichproben, die tatsächlich zur Analyse übergeben wurden. Die Übertragbarkeit dieser Ergebnisse auf jeden Behälter hängt unter anderem von der Art der Probenahme, der Identifizierung der Chargen, der Einheitlichkeit des Materials, dem Befüllungsprozess, dem Lagerungsprozess und anderen Kontrollelementen ab. Bei der Entwicklung zertifizierter Referenzmaterialien wird die Einheitlichkeit bewertet und nicht einfach anhand eines einzelnen Messes angenommen. [8] Die Unabhängigkeit des Labors kann die Unabhängigkeit der Messung selbst erhöhen, aber sie beweist nicht automatisch die Identität der gesamten Charge.

14. Kann das Sterilitätswert und das Endotoxinwert alternativ verwendet werden?

Nein. Die Sterilitätstestung betrifft lebende Mikroorganismen, während die Untersuchung bakterieller Endotoxine bestimmte Bakterienbestandteile umfasst, die auch bei Abwesenheit lebender Bakterien in dem Material vorhanden sein können. Dies sind also zwei separate analytische Fragen. Die Messung von Endotoxinen kann zudem durch Interferenzen aus der Probenmatrix beeinflusst werden, weshalb eine entsprechende Anpassung der Methode wichtig ist. [11] Die Sterilität oder den Endotoxinspiegel kann weder aus der routinemäßigen Reinheit des HC noch aus der HPLC-Probe selbst abgeleitet werden. Falls diese Untersuchungen durchgeführt wurden, sollten sie separat gemeldet werden.

15. Bestätigt die chemische Reinheit die biologische Aktivität?

Nein. Die chemische Analyse und die funktionelle Untersuchung liefern andere Arten von Informationen. Ein Peptid kann eine erwartete Molekularmasse und eine hohe chromatografische Reinheit aufweisen, ohne dass ein bestimmtes biologisches Testresultat nachgewiesen wird. In einer Untersuchung zur BPTI wurden die strukturelle und biophysikalische Charakterisierung zusammen mit einem Trypsinhämmerungstest kombiniert, anstatt anzunehmen, dass ein einzelner analytischer Wert für alle Schlussfolgerungen ausreicht. [12] Funktionelle Hinweise sind zudem spezifisch für die untersuchte Substanz, das experimentelle System und den jeweiligen Test. Eine Probe mit hoher Reinheit darf daher nicht als funktional bestätigt bezeichnet werden, wenn die entsprechende Aktivität nicht tatsächlich untersucht wurde.

16. Bestätigt die COA, dass das Peptid unbegrenzt stabil bleibt?

Nein. Die COA beschreibt die Probe zum Zeitpunkt oder zu einem Zeitpunkt innerhalb des Untersuchungsablaufes, der in dem Bericht angegeben ist. Während der späteren Lagerung können Peptide durch Abbau, Oxidation, Hydrolyse, Aggregation, Feuchtigkeitseinlagerung und andere von ihren Eigenschaften und dem Umfeld abhängige Veränderungen verfallen. Untersuchungen zur Degradation von Exenatid zeigten die Bedeutung von Methoden zur Bestimmung der Stabilität, die die Abbauprodukte von der ursprünglichen Substanz trennen können. [13] Stressuntersuchungen bestimmen jedoch nicht automatisch die Lagerungsdauer unter normalen Bedingungen. Jede Aussage über die Haltbarkeit erfordert entsprechende Stabilitätsdaten, die unter bestimmten Bedingungen und zu einem bestimmten Zeitpunkt gewonnen wurden.

17. Was muss man zuerst überprüfen, wenn man zwei COA-Peptide vergleicht?

Zunächst lohnt es sich, die Identität der Proben, die Partiennummern, die angewendeten analytischen Methoden, die Einheiten und die Messbasis zu vergleichen, anstatt sofort die größten Prozentwerte zusammenzufassen, die auf den Dokumenten zu sehen sind. Zwei Berichte können den Wert darstellen, der als „Reinheit” bezeichnet wird, und gleichzeitig andere Eigenschaften messen oder eine unterschiedliche Fähigkeit zur Trennung einzelner Schadstoffklassen aufweisen. Studien, die orthogonale chromatographische Methoden und Massenbilanzbestimmungen verwenden, zeigen die Bedeutung dieser Unterschiede. [2] [3] Ohne Feststellung, ob beide Zahlen auf die gleiche Größe und ausreichend vergleichbare Methoden bezogen sind, kann ein direkter Vergleich der Prozentwerte verlockend sein.

18. Bedeutet die Reinheit von 99% HPLC eine Reinheit von 99% Peptidgehalten?

Nein. Der Wert 99% HPLC bedeutet in der Regel, dass dem Hauptpik ein Anteil von 99% der eingegebenen Chromatographie-Detektionsantworten zugeschrieben wurde. Der Wert 99% Peptidgehalt erfordert hingegen eine quantitative Messung, die zeigt, dass der endgültige Peptidanteil 99% der entsprechenden Probenmenge entspricht, die anhand einer eindeutig festgelegten Grundlage definiert ist. Wasser, Antikörper, Restlösemittel und andere Bestandteile können die physikalische Masse der Probe erhöhen, ohne dass dies proportional zu dem Flächenanteil der RP-HPLC-UV wirkt. [2] Daher können sich beide Werte erheblich unterscheiden, obwohl keiner der Messungen falsch sein muss.

19. Kann ein Peptid den HPLC-Reinheitstest bestehen und dennoch eine falsche Stereochemie aufweisen?

Potenziell ja. Eine konventionelle RP-HPLC muss nicht alle stereochemischen Varianten unterscheiden, insbesondere wenn die Moleküle sehr ähnliche physikochemische Eigenschaften aufweisen. Ebenso lässt der übliche Massenwert der gesamten Moleküle keine Unterscheidung zwischen Stereoisomeren mit identischer Elementarzusammensetzung erkennen. Studien zur stereochemischen Reinheit von Peptiden zeigen, warum spezielle Methoden und eine genaue Kontrolle der Probenvorbereitung erforderlich sein können. [6] Ob eine bestimmte HCPL-Methode einen bestimmten Stereoisomer trennt, hängt von der nachgewiesenen Selektivität dieser Methode ab und nicht nur von der Tatsache, dass eine HPLC-Analyse durchgeführt wurde.

20. Bestätigt das COA, dass die gesamte Partie mit der untersuchten Probe identisch ist?

Nicht selbstständig. COA stellt die Ergebnisse in Bezug auf die Probe und die in der analytischen Dokumentation genannte Partie vor. Eine Erweiterung dieser Ergebnisse auf die gesamte Partie erfordert ein entsprechendes Probenahmeverfahren, Konsistenz des Prozesses, Einheitlichkeit, Identifizierung und andere Produktionskontrollen. Die Entwicklung von Referenzmaterialien zeigt, warum Konsistenz als separate Eigenschaft bewertet wird und nicht einfach als vorausgesetzt. [8] COA kann daher wichtige analytische Beweise für die Partien liefern, aber die Aussagekraft der Schlussfolgerungen bezüglich des gesamten Materials hängt vom umfassenderen Qualitätssystem ab, das die untersuchte Probe mit der von dem Bericht repräsentierten Partie verbindet.

Begrenzungen der Interpretation der Reinheit von Peptiden und COA

Bei der Interpretation analytischer Peptide-Berichte ist man sich jedoch über einige Einschränkungen bewusst.

Zunächst einmal hängt die Reinheit von der Methode ab. Der RP-HPLC-UV-Wert beschreibt, was ein bestimmter Chromatographie- und Detektionssystem gemessen hat. Ein anderer Trennmechanismus kann Komponenten enthüllen, die die erste Methode nicht identifizieren konnte. [1] [3]

Zweitens haben die chromatografische Oberfläche und die physikalische Masse unterschiedliche Messgrundlagen. Wasser, Antikörper, Rückstände anderer Substanzen sowie Unterschiede in der Reaktion des Detektors können dazu führen, dass der Anteil der HPLC-Oberfläche nicht dem Massenanteil des Zielpeptids entspricht. [2]

Zweitens stellt die erwartete Molekularmasse einen starken, aber unvollständigen Beweis für die Identität dar. Isomere, Positionenvarianten und stereochemische Unterschiede können die Anwendung zusätzlicher struktureller Methoden erfordern. [4] [5] [6]

Viertens können selbst analytische Methoden Artefakte verursachen. Die Probenvorbereitung, die Hydrolyse, die Derivatisierung, die Lagerung und die Handhabung des Materials können den Analyten oder der untersuchten Eigenschaft Änderungen zufügen. [6]

Fünfte, eine geprüfte Probe ist nicht automatisch gleichwertig mit jedem Behälter oder demselben Material in einer späteren Zeit. Einheitlichkeit, Identifizierung der Partie und Stabilität sind separate Aspekte. [8]

Zweitens beantworten chemische Untersuchungen keine mikrobiologischen Fragen. HPLC und Massenspektrometrie bestätigen weder die Sterilität noch den Endotoxingehalt. [10] [11]

Zweitens, die chemische Charakterisierung bestätigt weder die biologische Aktivität noch die klinische Sicherheit. Dies sind separate Fragen, die andere Arten von Beweisen erfordern. [12]

Schließlich bestätigt der Wert, der zu einem bestimmten Zeitpunkt ermittelt wird, keine langfristige Stabilität. Eine Bewertung der Stabilität erfordert entsprechende Daten, die zu einem bestimmten Zeitpunkt und unter bestimmten Bedingungen erhoben werden. [13]

Diese Einschränkungen bedeuten nicht, dass COA wenig wertvoll ist.

Stattdessen erklären sie, wie man ihn richtig interpretieren sollte.

Zusammenfassung

Das Peptidanalysedokument ist am nützlichsten, wenn man es als Zusammenfassung einzelner analytischer Messungen betrachtet und nicht als eine einzelne Qualitätsbewertung.

Der angegebene Anfangswert der Reinheit ist nur der Anfang der Interpretation.

Ein Ergebnis wie 99% RP-HPLC-Gehalte beschreibt die Verteilung der Antwort des Detektors in einer bestimmten chromatografischen Methode. Es bedeutet nicht automatisch, dass 99% der physikalischen Pulvermasse den Zielpeptid darstellen. [1] [2]

Massenspektrometrie kann starke Hinweise auf die Molekularmasse und einige strukturelle Merkmale liefern, aber die Übereinstimmung der gesamten Molekülschicht mit der erwarteten Größe belegt nicht automatisch alle Aspekte der Sequenz, der Endenstruktur, der Stereochemie oder der molekularen Bindung. [4] [5] [6]

Die Menge des Peptids erfordert eine eigene quantitativen Grundlage.

Wasser, Antidote, Rückstände anderer Substanzen und verwandte peptidische Verunreinigungen können die Abhängigkeit zwischen der Masse des verfestigten Materials und der tatsächlichen Menge des Zielpeptids beeinflussen. [2] [7] [9]

Deshalb ist es beim Lesen der COA sinnvoll, einige separate Fragen zu stellen:

Welche Probe wurde untersucht?

Zu welcher Partei geht es?

Welche analytische Methode wurde verwendet?

Was genau bedeutet der gemeldete Prozentsatz?

Welche Einheiten und welche Berechnungsbasis wurden verwendet?

Ist die molekulare Identität unabhängig von der chromatografischen Reinheit untersucht worden?

Ist die tatsächliche Peptidkonzentration bestimmt worden?

Wurden in den entsprechenden Fällen Wasser oder Antidote gemessen?

Ist Stereochemie bewertet, wenn sie für die betreffende Substanz von Bedeutung ist?

Welche Eigenschaften wurden nicht untersucht?

Es ist besonders wichtig, den Unterschied zwischen „nicht nachgewiesen” und „nicht untersucht” zu erkennen.

Das Nichtergebnis sollte nicht als Beweis für einen positiven Testverlauf interpretiert werden.

Ebenso kann eine Untersuchung durch ein unabhängiges Labor eine wertvolle zusätzliche Informationsquelle sein, aber die Angabe „third-party tested” beschreibt nicht den Probenahmeprozess, seine Verbindung zur Partie, den analytischen Umfang, die Einheitlichkeit oder die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf jeden Behälter.

Routinechemische Verfahren haben ebenfalls klare Grenzen.

HPLC bestätigt die Sterilität nicht.

Die Reinheit von HPLC bestätigt nicht den Gehalt an Endotoxinen.

Die chemische Reinheit bestätigt keine biologische Aktivität.

Die COA stellt keine Bewertung der klinischen Sicherheit dar.

Ein analytischer Wert, der zu einem bestimmten Zeitpunkt ermittelt wird, beweist nicht unbegrenzte Stabilität. [10] [11] [12] [13]

Die wissenschaftlich am besten begründete Interpretation ist daher immer so breit gefasst wie die verfügbaren Beweise es erlauben – und nicht breiter.

Ein gut dokumentiertes analytisches Gutachten kann wertvolle Informationen über die Identität, Zusammensetzung und Menge des Materials liefern, das in der untersuchten Probe enthalten ist.

Sein Wert steigt, wenn die angewendeten Methoden, die Messgrundlage, die Identifizierung des Materials und die Einschränkungen einzelner Tests klar beschrieben werden.

Die wichtigste Regel ist einfach:

Identität, Reinheit, Menge, Stereochemie, mikrobiologischer Status, biologische Aktivität, Stabilität und Sicherheit sind verschiedene Fragen. Ein verlässlicher Analysezertifikat hilft, die Fragen zu beantworten, die tatsächlich untersucht wurden – er sollte nicht dazu verwendet werden, Antworten auf Fragen zu suggerieren, die nicht untersucht wurden.

Haftungsausschluss

Der Artikel hat ausschließlich pädagogischen und wissenschaftlichen Informationscharakter. Er erläutert die allgemeinen Grundsätze der analytischen Chemie von Peptiden, die Interpretation von Analysezertifikaten (COA), der HPLC-Chromatographie, der Massenspektrometrie, der Peptidkonzentrationmessung, der Kontaminationsbestimmung, der Materialidentifizierung sowie der damit verbundenen Untersuchungsmethoden. Er stellt keine medizinische Beratung, Produktempfehlungen, Sicherheitsbewertungen, Produktionsgenehmigungen oder eine Bestätigung dar, dass ein bestimmter Peptid oder ein Peptid enthaltender Stoff für den Einsatz bei Menschen geeignet ist. Analytische Ergebnisse sollten stets im Hinblick auf die spezifische Probe, die Partie, die angewandte Methode, die Messgrundlage, die Spezifikation, das analysierte analytische Problem und die Grenzen des durchgeführten Tests interpretiert werden.

Referenzen

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