펩타이드의 순도 및 실험실 분석: 분석 증명서(COA)를 읽는 방법

펩타이드의 순도는 특정 분석 방법을 통해 규명된 시료의 구성을 나타냅니다. 이는 그 자체만으로는 펩타이드의 완전한 동일성, 시료 내 펩타이드의 실제 함량, 무균성, 생물학적 활성, 안정성 또는 안전성을 입증하지는 않습니다. 일반적으로 COA라는 약어로 표기되는 분석 증명서는, 그 안에 기재된 각 결과를 구체적인 분석적 질문에 대한 답변으로 간주할 때 가장 유용합니다.

따라서 „순도 99%”와 같은 정보는 적절한 맥락이 필요합니다.

99%는 HPLC 분석에서 주요 크로마토그래피 피크가 검출기의 총 적분 신호 중 99%를 차지함을 의미합니까? 이 값은 물, 대이온 및 기타 성분을 고려한 후 대상 펩타이드의 질량 비율을 나타내는 것입니까? 입체화학적 순도는 평가되었습니까? 해당 방법으로 어떤 종류의 불순물을 검출할 수 있으며, 어떤 불순물은 검출 범위를 벗어날 수 있습니까?

이러한 구별은 매우 중요합니다. 왜냐하면 실제로는 시료의 서로 다른 특성을 나타내지만, 일상적으로는 여러 가지 다른 매개변수가 모두 „순도’라는 같은 단어로 지칭되는 경우가 있기 때문입니다.

펩타이드 분석에 관한 연구는 이것이 왜 중요한지 보여줍니다. 구조적으로 유사한 불순물은 때때로 겉보기에는 단순한 크로마토그래피 피크 속에 숨어 있을 수 있으며, 물, 반이온, 기타 물질의 잔류물 및 관련 화합물은 분리된 펩타이드 물질의 총 질량에 영향을 미칠 수 있습니다. [1] [2]

이는 서로 별개의 분석적 문제이며, 각기 다른 유형의 증거가 필요합니다.

따라서 펩타이드의 COA를 평가할 때, 단순히 다음과 같은 질문만 하는 것보다 더 유용한 것은:

„순도는 몇 퍼센트인가요?”

질문이 하나 있습니다:

„정확히 무엇을, 어떤 방법으로, 어떤 시료를 대상으로 측정했으며, 그 측정 결과로부터 실제로 어떤 결론을 도출할 수 있는가?”

펩타이드의 순도란 정확히 무엇을 의미할까요?

순도는 특정 방법에 기반한 결과입니다

„순도”라는 단어는 단일하고 측정하기 쉬운 특성을 암시할 수 있습니다. 그러나 실제로는 연구소에서 펩타이드의 순도를 여러 가지 방식으로 표현할 수 있습니다.

예를 들어 다음과 같은 것들이 있을 수 있습니다:

• 크로마토그래피 면적의 백분율;
• 대량 참여;
• 화학적 순도;
• 입체화학적 순도;
• 서열과 관련된 오염 물질 프로파일;
• 특정 분석 방법에 따라 측정된 순도.

이 값들을 서로 대체 가능한 것으로 간주해서는 안 됩니다.

크로마토그래피적 순도는 일반적으로 시료의 주요 성분에 기인하는 검출기의 통합 응답 중 일부를 나타냅니다.

질량 분율은 시험 대상 물질의 총 질량에 대한 특정 물질의 질량을 나타냅니다.

반면, 입체화학적 순도는 분자 또는 분자를 구성하는 아미노산 잔기의 다양한 공간적 배열이 차지하는 비율을 의미합니다.

따라서 정확하게 제시된 청결도에 관한 정보는 가능한 한 다음 네 가지 질문에 답해야 합니다:

무엇을 측정했는지 + 어떻게 측정했는지 + 결과를 어떻게 산출했는지 + 어떤 표본을 조사했는지.

단순히 다음과 같이 언급하는 것만으로도:

„순도 99%”

다음보다 훨씬 적은 정보를 전달합니다:

„RP-HPLC-UV에 따른 주 피크 면적 99%”.

하지만 두 번째 버전조차도 모든 의문을 해소해주지는 못한다.

또한, 사용된 크로마토그래피 방법이 주요 불순물을 분리할 수 있었는지, 그리고 사용된 검출기가 이를 감지할 수 있었는지도 확인해야 한다.

HPLC에서 피크 면적 비율은 무엇을 의미하나요?

간단히 말해, 피크 면적 정규화를 기반으로 한 계산은 다음과 같이 표현할 수 있다:

주 피크의 면적 ÷ 고려된 피크들의 총 면적 × 100.

주 피크에 990 단위의 면적이 할당되었고, 고려된 크로마토그래피 신호의 합이 1000 단위라면, 주 피크의 면적은 다음과 같을 것이다:

990 ÷ 1000 × 100 = 99%.

이는 특정 크로마토그래피 조건에서 얻은 검출기 응답에 관한 정보입니다.

그렇다고 해서 반드시 다음을 의미하는 것은 아닙니다:

99%의 분말 총 질량 중 목표 펩타이드가 차지하는 비율입니다.

이러한 차이가 발생하는 데에는 몇 가지 이유가 있습니다.

각기 다른 화합물은 질량 단위당 검출기의 반응이 다르게 나타날 수 있다.

시료의 일부 성분은 사용된 파장에서 방사선을 약하게 흡수할 수 있다.

다른 것들은 크로마토그래피 분석에서 아예 고려되지 않을 수도 있습니다.

일부 오염 물질은 주성분과 함께 용출될 수도 있습니다.

„반영된”이라는 단어 또한 중요합니다.

크로마토그래피 분석은 다음 사항에 대한 결정에 따라 달라집니다:

• 피크 통합;
• 보고 기준;
• 기준선 선택;
• 용매와 관련된 신호;
• 분리되지 않은 스페이드;
• 감지기 설정;
• 특정 신호를 배제하는 원칙.

따라서 HPLC의 면적 백분율은 특정 크로마토그래피 분석법의 결과로 해석되어야 하며, 시료의 전체 물리적 구성을 포괄적으로 설명하는 것으로 간주해서는 안 됩니다.

유사한 오염 물질은 분리하기 어려울 수 있다

펩타이드에 포함된 불순물은 의도된 분자와 구조적으로 매우 유사할 수 있다.

여기에는 다음이 포함될 수 있습니다:

• 결실 서열;
• 축약된 시퀀스;
• 변형된 측쇄;
• 산화된 형태;
• 수정된 말단기;
• 위치 이성질체;
• 스테레오이성체;
• 부분적 보험 해지 상품;
• ~하는 과정에서 발생하는 다른 변형들 펩타이드 합성 또는 퇴화.

이러한 구조 중 일부는 표적 펩타이드와 크로마토그래피적 특성이 상당히 다를 수 있다.

다른 것들도 매우 비슷한 행동을 보일 수 있습니다.

한 연구에서는 2차원 액체 크로마토그래피와 질량 분석법을 결합하여 주요 펩타이드 피크의 순도를 평가했다. 연구진은 동일한 질량 대 전하 비율을 가진 펩타이드 이성질체를 일상적인 질량 측정만으로는 구별할 수 없었기 때문에 추가적인 분리 조건을 적용했다. [1]

4가지 합성 고리형 펩타이드를 대상으로 한 또 다른 연구에서는 역상 크로마토그래피와 친수성 상호작용 크로마토그래피를 비교하였다.

두 방법은 오염 물질을 서로 다른 방식으로 분리했다. [3]

그렇다고 해서 이 기술들 중 하나가 항상 더 낫다는 뜻은 아닙니다.

반면, 이는 상호 보완적 선택성 현상을 보여준다. 두 분석 방법은 분석 대상 분자의 서로 다른 물리화학적 특성을 활용하기 때문에, 동일한 혼합물을 서로 다른 방식으로 분리할 수 있다.

따라서:

하나의 깨끗한 크로마토그램이 구조적으로 유사한 모든 불순물이 없다는 것을 의미하지는 않는다.

물과 대이온 또한 재료의 조성에 영향을 미칩니다

분리된 펩타이드 물질에는 추가적인 펩타이드 서열이 아닌 성분이 포함될 수 있다.

주요 예시로는 다음과 같은 것들이 있습니다:

• 물;
• 반대되는;
• 용매 잔류물;
• 무기 물질;
• 생산 공정과 관련된 기타 성분.

반이온은 전하를 띤 펩타이드 단위와 결합된, 반대 전하를 띤 이온을 말한다.

펩타이드 화학에서는 예를 들어 아세테이트나 트리플루오로아세테이트를 볼 수 있다.

이러한 성분이 존재한다고 해서 반드시 합성 오류나 불순물을 의미하는 것은 아닙니다. 펩타이드가 의도적으로 특정 형태의 염으로 존재할 수도 있습니다.

그러나 이러한 요소들은 다음과 같은 질문에 답하고자 할 때 중요해집니다:

계량된 시료량에 실제로 목표 펩타이드가 얼마나 포함되어 있는가?

따라서 해석은 보고된 값이 다음 중 어느 것에 해당하는지에 따라 달라집니다:

• 펩타이드 자체;
• 펩타이드 염;
• 건조 물질;
• 무수 물질의;
• 수령한 상태 그대로의 재료.

2026년에 실시된 서블란시나 연구에서 과학자들은 보다 광범위한 질량 균형 분석의 일환으로 물, 트리플루오로옥탄, 유기 화합물 및 무기 오염 물질을 측정했다. [2]

결국, 이 펩타이드의 귀속 비율은 100%보다 현저히 낮았는데, 구조적으로 유사한 유기 불순물이 시료에서 차지하는 비중은 비교적 적었음에도 불구하고 그러했다.

다음은 중요한 차이점을 보여주는 실제 사례입니다:

펩타이드의 깨끗한 크로마토그래피 프로파일과 표적 펩타이드의 높은 질량 비율은 동일한 매개변수가 아닙니다.

순도 백분율은 안전 확률이 아닙니다

순도를 나타내는 백분율은 해당 물질이 안전할 확률이 어느 정도인지를 나타내지 않습니다.

예를 들어, 99%라는 순도 수치는 다음을 의미하지 않습니다:

„99% 안전”.

또한 나머지 1%에 포함된 각 물질의 생물학적 중요성에 대해서도 설명하지 않습니다.

한 화합물의 소량이 다른 화합물의 다량보다 분석적 또는 생물학적 측면에서 더 큰 의미를 가질 수 있으며, 이는 다음 요인에 따라 달라집니다:

• 그의 정체성;
• 생물학적 활성;
• 농도;
• 노출 경로;
• 예정된 용도;
• 기타 맥락적 요인들.

마찬가지로, 화학적으로 매우 높은 순도를 지닌 분자는 그 자체로 특정 생물학적 특성을 가질 수도 있다.

따라서 화학적 순도와 생물학적 안전성은 완전히 다른 질문에 대한 답을 제시합니다.

순도 분석은 적용된 분석 방법의 범위 내에서 시료의 특성을 파악하기 위한 것입니다.

화학 실험 결과를 인간에 대한 전반적인 안전성 평가로 전환하지 않습니다.

HPLC 및 질량 분석법

HPLC는 우리에게 무엇을 알려줄 수 있을까요?

고효율 액체 크로마토그래피(HPLC)는 시료 성분들이 고정상과 유동하는 이동상과의 상호작용 차이를 바탕으로 이를 분리합니다.

펩타이드 분석에서는 역상 크로마토그래피(RP-HPLC)가 널리 사용되며, 종종 UV 검출법과 함께 활용된다.

크로마토그램은 시간에 따른 검출기의 응답을 나타냅니다.

이것을 통해 몇 가지 중요한 정보를 얻을 수 있습니다.

유지 시간은 특정 조건에서 특정 성분이 크로마토그래피 시스템을 떠나는 시점을 나타냅니다.

피크 면적은 검출기의 통합 응답을 나타냅니다.

피크의 모양은 물질의 크로마토그래피적 거동에 대한 정보를 제공합니다.

분해능은 인접한 성분들이 서로 얼마나 효과적으로 분리되는지를 나타냅니다.

그러나 체류 시간은 분자 수준의 고유한 „지문’은 아니다.

때로는 서로 다른 분자들이 비슷한 시간에 용출되기도 합니다.

동일한 펩타이드도 변형 후 다른 머무름 시간을 보일 수 있습니다:

• 컬럼;
• 이동상의 조성;
• 그라디언트;
• 유속;
• 온도;
• 장비 구성;
• 기타 방법의 매개변수.

다양한 펩타이드 분리 시스템을 비교한 연구들은 크로마토그래피의 선택성이 사용된 방법에 얼마나 크게 좌우되는지를 보여준다. [1]

따라서 체류 시간의 일관성은 적절한 맥락에서 식별을 뒷받침할 수는 있지만, 이를 구조에 대한 완전한 확인으로 자동적으로 간주해서는 안 된다.

왜 하나의 피크가 반드시 하나의 물질을 의미하는 것은 아닐까요?

공류는 두 개 이상의 성분이 크로마토그래피 시스템에서 거의 동시에 배출되어 제대로 분리되지 않는 경우에 발생합니다.

결과적으로 하나의 스페이드처럼 보일 수도 있습니다.

따라서 시각적으로 대칭을 이루는 주요 피크라고 해도, 전체 신호가 단일 종류의 입자에서 비롯되었다는 것을 자동으로 증명하는 것은 아니다.

피크의 구성을 다음과 같은 방법을 통해 더 자세히 분석할 수 있습니다:

• 크로마토그래피 선택성의 변화;
• 다른 고정상을 사용하는 것;
• 여러 파장에서의 분석;
• 크로마토그래피와 질량 분석법의 결합;
• 2차원 크로마토그래피;
• 다른 보완적인 분석 기법을 적용하는 것.

그러나 이러한 방법 중 어느 것도 가능한 모든 오염 물질을 자동으로 탐지하지는 못합니다.

가까운 친족 관계에는 다음과 같은 특징이 있을 수 있습니다:

• 유사한 체류 시간;
• 유사한 자외선 스펙트럼;
• 동일한 공칭 질량;
• 그 밖의 공통적인 분석적 특성.

역상 크로마토그래피와 친수성 상호작용 크로마토그래피를 비교한 순환 펩타이드 연구에서, 불순물의 용출 양상이 뚜렷하게 다른 것으로 나타났다. [3]

그렇다고 해서 모든 주요 피크가 추가적인 오염 물질을 포함하고 있다는 뜻은 아닙니다.

이 주장은 더 정확합니다:

크로마토그램이 겉보기에는 단순해 보이지만, 이는 단일 분리 시스템에서 얻은 결과일 뿐이며, 다른 선택성을 적용하면 첫 번째 방법으로는 분리되지 않았던 성분들이 드러날 수 있다.

질량 분석법은 무엇을 측정하나요?

질량 분석법(MS)은 이온의 질량 대 전하 비율(m/z로 표기됨)을 바탕으로 이온을 검출합니다.

분석 과정에서 펩타이드가 하나 이상의 전하를 띨 수 있다.

따라서 하나의 펩타이드 분자는 중성 분자량에 직접적으로 대응하는 단일 피크 대신, 서로 다른 전하 상태에 해당하는 여러 신호를 생성할 수 있다.

데이터를 적절히 해석하면 기본 분자량을 재현하거나 확인할 수 있다.

질량 분석법은 다음 사항에 관한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다:

• 분자량;
• 일부 화학적 변형;
• 특정 오염물질;
• 동위원소 패턴;
• 파편화 시의 동작.

고분해능 질량 분석법은 질량이 매우 유사한 입자들을 더 정확하게 구별할 수 있게 해준다.

탠덤 질량 분석법(MS/MS)은 선택된 이온을 단편화하고 생성된 생성물을 분석하는 방식으로, 이를 통해 추가적인 구조 정보를 제공합니다.

그러나 여전히 중요한 원칙이 하나 있습니다:

예상 분자량을 관측하는 것 ≠ 완전한 분자 구조를 입증하는 것.

서로 다른 구조라도 질량이 같을 수 있습니다.

입체화학적 변화는 원소 조성에 영향을 미치지 않을 수도 있다.

위치 이성질체 역시 추가적인 증거가 필요할 수 있다.

레닌의 기질인 합성 펩타이드의 불순물에 대한 연구에서 이러한 한계가 드러났다. 등압 혼합물 내 다양한 위치에서 발생하는 변형을 구별하기 위해서는 단편화 및 유도체화 과정을 통해 얻은 추가 정보가 필요했다. [4]

서열, 말단 그룹 및 입체화학

펩타이드의 정체성은 그 이름보다 훨씬 더 많은 요소를 포함합니다.

주요 구조적 특징으로는 다음이 포함될 수 있다:

• 아미노산 서열;
• 각 잔여물의 구성;
• N-말단 구조;
• C-말단 구조;
• 사이드 체인의 변형;
• 이황화물 브리지의 배치;
• 순환화;
• 활용;
• 기타 공유 결합적 특성.

예를 들어, C-말단에 카르복실산을 가진 펩타이드와 C-말단에 아미드를 가진 대응하는 펩타이드는 화학적으로 서로 다른 분자이다.

연구자들은 바로 이러한 최종 형태들을 더 효과적으로 구별하기 위해 유도체화 기반 질량 분석법을 개발했다. [5]

이는 다음과 같은 중요한 원칙을 보여줍니다:

분석 방법은 구체적인 구조적 질문에 맞게 선정되어야 한다.

입체화학은 또 다른 난제입니다.

D-아미노산을 포함하는 펩타이드와 이에 대응하는 L-아미노산 변이체는 동일한 분자량을 가질 수 있지만, 동시에 원자의 공간적 배열은 다를 수 있다.

펩타이드의 입체화학적 순도를 조사하는 연구에서는 시료의 가수분해 과정에서 발생하는 라세미화를 고려하도록 설계된 방법을 적용하였다. [6]

이러한 검증이 없다면, 시료 준비 과정 자체만으로도 측정하려는 특성이 변할 수 있다.

따라서 신뢰할 수 있는 펩타이드 분석은 장비의 성능뿐만 아니라 시료의 적절한 전처리 및 분석법 설계에도 달려 있습니다.

LC-MS는 두 방법의 장점을 결합하지만, 모든 한계를 해소하지는 못한다

액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)은 크로마토그래피 분리와 질량 분석을 결합한 기술입니다.

이를 통해 각 방법을 개별적으로 사용하는 것보다 훨씬 더 많은 정보를 제공할 수 있을 것입니다.

LC-MS는 특히 다음과 같은 데 도움이 될 수 있습니다:

• 오염 농도의 최고치에 특정 질량을 할당하고;
• 질량이 다른 유사한 성분들을 크로마토그래피를 통해 구별하고;
• 분해 생성물을 조사한다;
• 서열과 관련된 오염을 특성화한다;
• 구조적 할당을 지원합니다.

내부적으로 검증된 LC-고분해능 질량분석법(HRMS)을 이용한 합성 옥시토신 연구에서, 구조적으로 관련된 18종의 불순물이 확인되고 정량되었다. [7]

연구진은 또한 기준 물질의 순도를 결정할 때 이러한 오염 물질을 고려해야 했던 이유를 설명했다.

그러나 이러한 결과는 특정 시료, 분석 방법 및 조사 대상 오염 물질 프로필에 한정된 것입니다.

이 목록을 옥시토신이 함유된 모든 물질에서 발견되는 오염 물질의 포괄적인 목록으로 간주해서는 안 됩니다.

따라서 LC-MS는 매우 유용한 분석 기법의 결합입니다.

그러나 양질의 LC-MS 보고서는 여전히 다음 사항을 명확히 설명해야 합니다:

• 측정된 내용은 다음과 같습니다;
• 각 피크가 어떻게 할당되었는지;
• 제안된 구조를 어떻게 규명했는지;
• 할당이 확인되었는지;
• 어떤 정량적 방법을 적용했는지;
• 어떤 분석적 제약이 남아 있는가.

정체성, 순도, 양은 서로 다른 매개변수입니다

정체성은 ‘어떤 분자가 존재하는가?’라는 질문에 답을 제공합니다.

정체성 검사는 분석 대상 물질이 의도된 물질과 일치하는지 여부를 확인하기 위한 것입니다.

펩타이드와 연구 대상 문제에 따라, 동일성을 입증하는 증거에는 다음이 포함될 수 있습니다:

• 전체 분자의 질량;
• 분할 데이터;
• 서열 분석;
• 종단군의 특성;
• 아미노산 조성;
• 이황화물 브리지의 배치;
• 분광 데이터;
• 기준 물질과의 크로마토그래피 비교;
• 여러 방법의 결합.

한 가지 방법은 다른 모든 구조적 문제를 해결하지 않으면서도 특정 정체성 요소를 확인할 수 있다.

예를 들어:

„전체 분자의 예상 질량이 관측되었다”

다음보다 더 좁은 결론입니다:

„분자 구조가 완전히 확인되었다”.

말단 아미드화 및 등압성 펩타이드 오염 물질에 관한 연구는 이러한 구분이 왜 중요한지를 보여준다. [4] [5]

두 경우 모두, 예상값 근처에서 질량 피크가 관측된 사실 그 자체를 넘어서는 정보가 필요했습니다.

순도는 “시료에는 또 무엇이 들어 있는가?”라는 질문에 답해 줍니다.

순도 분석은 특정 분석 범위 내에서 시료의 성분을 분석합니다.

방법에 따라 보고서는 다음을 포함할 수 있습니다:

• 주성분;
• 각종 오염 물질;
• 검출된 오염물질의 총량;
• 주 피크 면적의 백분율;
• 입체화학적 오염;
• 유사 물질;
• 총 질량 비율.

오염 물질의 종류에 따라 서로 다른 처리 방법이 필요할 수 있습니다.

결실 서열 검출에 최적화된 크로마토그래피 방법은 입체화학에 관한 의문을 반드시 해결해야 할 필요는 없다.

질량에 기반한 방법은 이성질체를 구별하지 못할 수도 있다.

반면, 키랄 분석법은 수분 함량에 대한 정보를 거의 제공하지 못할 수 있다.

따라서 보완적 방법을 적용하는 목적은 단순히 더 많은 결과를 수집하는 데 있는 것이 아니다.

이는 단일 방법만으로는 해결할 수 없는 다양한 분석적 질문에 대한 답을 얻기 위한 것입니다.

‘양’은 ‘물질이 얼마나 존재하는가?’라는 질문에 대한 답을 제공합니다.

수량은 몇 가지 다른 매개변수를 가리킬 수 있습니다.

다음 중 하나를 의미할 수 있습니다:

• 용액 내 펩타이드 농도;
• 용기 내 펩타이드의 총량;
• 표적 펩타이드의 질량 비율;
• 몰 농도;
• 부피 단위당 양;
• 명확하게 정의된 또 다른 정량적 매개변수.

이러한 각 방법에는 적절한 단위와 계산 기준이 필요합니다.

크로마토그래피를 이용한 정량 분석은 일반적으로 적절한 보정이 필요하며, 피크 면적의 정규화만을 근거로 해서는 안 된다.

적절하게 마련된 정량 분석 방법에는 다음 요소들도 기여할 수 있다:

• 아미노산 분석;
• 양적 핵자기공명;
• 동위원소 희석법;
• 그 밖의 검증된 정량적 기법.

중요한 점은, 관련 펩타이드 오염 물질이 일부 정량 측정 결과에 영향을 미칠 수 있다는 것입니다.

옥시토신의 순도에 관한 연구들은, 측정된 모든 아미노산이나 분석 신호가 오로지 표적 분자에서 유래한다고 가정하기보다는, 이러한 불순물을 고려하여 결과를 보정할 필요가 있음을 강조하였다. [7]

예시: HPLC의 면적 비율과 실제 펩타이드 양

다음과 같은 결과가 도출된 가상의 펩타이드 분말을 가정해 보자:

RP-HPLC-UV, 주요 피크 면적 = 99,0%

및

독립적으로 측정된 최종 펩타이드의 질량 분율 = 78.0% (수득된 상태의 시료 기준).

이러한 결과들이 서로 모순될 필요는 없다.

이것들은 각기 다른 분모를 가지며, 서로 다른 분석적 질문에 답합니다.

이러한 가상의 분말 10.0 mg을 계량했을 때, 검증된 목표 펩타이드의 질량 비율이 78.0%라면, 이 측정 결과로 산출되는 펩타이드의 양은 다음과 같을 것입니다:

10.0 mg × 0.780 = 7.80 mg.

다음과 같은 가정을 무조건 받아들여서는 안 됩니다:

10.0 mg × 0.990 = 9.90 mg

오로지 주 피크가 고려된 UV 면적의 99.0%를 차지했기 때문이었다.

이는 단지 분석적 예시일 뿐이며, 어떠한 구체적인 상용 제품이나 실험용 재료도 설명하는 것이 아닙니다.

서블란시니 연구는 이 구분의 기초가 되는 원칙을 보여주는 실제 사례인데, 이는 물질의 조성을 평가할 때 물과 대이온 등을 별도로 고려했기 때문이다. [2]

이 연구에서 도출된 수치 값을 다른 펩타이드에 그대로 적용해서는 안 됩니다.

측정 불확실성과 측정 일관성

분석 결과를 무한한 정확도를 지닌 값으로 간주해서는 안 됩니다.

이는 특정 측정 절차를 통해 도출된 추정치입니다.

측정 불확실성은 적용된 평가 방법에 따라 측정 결과와 합리적으로 연관 지을 수 있는 값의 범위 또는 분산을 나타낸다.

그렇다고 해서 연구소가 그 결과가 잘못되었다는 것을 알고 있다는 뜻은 아니다.

반면, 수치적 신뢰도의 한계를 알려준다.

측정 일관성이란 교정 체인을 통해 측정 결과가 적절한 기준과 문서화된 방식으로 연계되어 있음을 의미합니다.

이는 측정 결과의 비교 가능성을 보장하는 데 도움이 되지만, 실제로 측정된 특정 매개변수와 정해진 참조 사슬에 한해서만 해당됩니다.

NT-proBNP 기준 물질 개발에 관한 연구에서는, 불순물을 보정한 동위원소 희석법을 물질의 균일성 및 안정성 평가와 결합하여 수행하였다. [8]

이는 신뢰할 수 있는 정량적 값을 산출하기 위해서는 단순히 기기에서 생성된 수치를 읽는 것만으로는 턱없이 부족하다는 점을 보여줍니다.

COA 분석 증명서는 어떻게 읽어야 할까요?

먼저 시료와 로트를 확인하십시오

어떤 분석 결과를 해석하기 전에, 실제로 어떤 시료가 분석되었는지 확인해야 한다.

유용한 COA는 결과를 다음과 같은 식별 정보와 결합해야 합니다:

• 재료의 이름 또는 설명;
• 시료 식별자;
• 로트 번호 또는 일련 번호;
• 해당 날짜;
• 구조적 형태;
• 염의 형태(중요하다면);
• 단부의 수정 또는 기타 중요한 구조적 특징.

이는 분석 결과가 실제로 검사된 시료에 대한 것이기 때문에 중요합니다.

한 로트에 대한 인증서는 다른 로트의 구성을 직접적으로 입증하지는 않습니다.

마찬가지로, 혼합 시료에 대한 분석 결과만으로는 이후에 채워진 개별 용기 각각에 들어 있는 물질의 양이나 상태를 자동으로 입증할 수 없으며, 시료 채취, 충전, 균일성 평가 및 공정 관리 시스템이 그러한 결론을 뒷받침하는 경우를 제외한다.

이는 재료의 일관성과 추적 가능성과 관련된 문제들입니다.

그것이 반드시 부적절한 행위나 낮은 품질을 의미하는 것은 아닙니다.

이 보고서를 읽는 사람은 단순히 논리적으로 타당한 연관성만 있으면 됩니다:

보고서 → 검사 대상 시료 → 해당 결과가 적용될 로트 또는 자재.

방법, 결과, 단위 및 사양은 함께 읽어보세요

COA는 종종 승인 기준과 실제로 얻은 결과를 모두 제시합니다.

예를 들어:

사양: 98.0% 이상

및

결과: 99.2%.

이 두 가지는 서로 다른 정보입니다.

이 사양서는 승인 기준을 규정하고 있습니다.

이 결과는 특정 시료에 대해 측정된 값을 나타냅니다.

단위와 측정 기준 역시 마찬가지로 중요합니다.

그중에서는 다음과 같은 것들을 볼 수 있습니다:

• area%;
• mass%;
• mg/용기;
• mg/mL;
• µg/mL;
• mol/L;
• 건중량 기준으로 환산한 결과;
• 무수 물질 기준으로 환산한 결과;
• 수령 상태의 재료에 대한 결과.

이 값들은 임의로 대체할 수 없습니다.

예를 들어, „수령 상태”로 명시된 분석 결과는 시험을 받은 그대로의 상태의 시료를 반영하는 반면, 무수함량 또는 보정된 값은 계산의 기초에서 수분을 수학적으로 제외할 수 있다.

„pass”라는 결과는, 제시된 결과가 해당 테스트에 대한 특정 합격 기준을 충족했음을 의미합니다.

이는 해당 연구의 범위를 확대하지 않습니다.

따라서:

동일성 검사 통과 ≠ 무균성 확인

및

HPLC 순도 테스트 통과 ≠ 특정 펩타이드 함량,

단, 이러한 특성이 독립적으로 측정된 경우는 예외이다.

COA 항목에 대한 해석 예시

다음 내용은 가상의 사례이며, 분석 데이터를 해석하는 방법을 보여주기 위한 목적으로만 제공됩니다. 실제 생산 로트를 설명하거나 승인 기준을 제안하는 것은 아닙니다.

위에서 제시한 구분은 주요 펩타이드 피크의 순도, 반이온 및 질량 비율 측정에 관한 연구를 근거로 합니다. [1] [2] [9]

제시된 수치와 표의 형식은 오로지 교육적 목적으로만 사용됩니다.

크로마토그램과 스펙트럼을 확인해 보세요

추가 분석 데이터는 COA에 요약된 결과를 올바르게 해석하는 데 도움이 됩니다.

크로마토그램의 경우 다음 사항에 주목할 필요가 있습니다:

• 시료 식별자;
• 메서드 식별자;
• 크로마토그램의 축;
• 검출기 유형;
• 파장;
• 중요한 체류 시간;
• 스페이드 기호;
• 오염 물질 표;
• 통합 결과;
• 보고 기준.

큰 주 피크만 보이도록 잘라낸 크로마토그램은 순도 결과를 올바르게 해석하는 데 필요한 정보를 누락할 수 있다.

질량 분석의 경우, 유용한 배경 정보로는 다음이 포함될 수 있습니다:

• 예상되는 분자 형태;
• 예상 질량;
• 관측된 이온;
• 할당된 충전 상태;
• 역컨볼루션;
• 질량 오차;
• 해당되는 경우, 파편화 데이터;
• 구조 할당의 기준.

전체 분자의 질량 스펙트럼, 디콘볼루션된 분자량, 그리고 단편화를 기반으로 한 구조적 증거는 서로 관련이 있지만, 동일한 것을 의미하지는 않는다.

COA에는 반드시 장비에서 생성된 모든 원본 파일이 포함되어야 하는 것은 아닙니다.

그러나 그 보고서에 요약된 분석적 결론은, 구조나 수치적 결과의 도출 과정에 대해 의문이 제기될 경우 검증할 수 있는 원본 자료와 연계될 수 있어야 한다.

„검출되지 않음”과 „검사되지 않음”은 완전히 다른 의미를 지닙니다

„검출되지 않음”이란, 사용된 분석 방법이 특정 조건 하에서 해당 감도 범위 내에서 검사 대상 성분을 검출하지 못했음을 의미합니다.

그렇다고 해서 실제 농도가 정확히 0이라는 뜻은 아닙니다.

„반면, ”검출 한계 미만”이란 해당 성분이 특정 분석법으로 신뢰성 있게 정량할 수 없는 수준으로 존재할 수 있음을 의미한다.

이건 또 다른 상황입니다.

„검토되지 않음”은 해당 특성에 대해 측정이 수행되지 않았음을 의미합니다.

이를 다음과 같이 해석해서는 안 됩니다:

„정상 결과”

ani:

„존재하지 않는 물질”.

검출 또는 정량 분석에 관한 정보를 올바르게 해석하려면 다음 사항에 대한 이해도 필요합니다:

• 검출 한계 또는 정량 한계;
• 개체;
• 보고의 기초;
• 적용된 방법;
• 시료 준비 방법.

독립적인 실험실 검사는 어떤 이점을 제공하나요?

독립적인 실험실은 제출된 시료에 대해 추가적인 분석 결과를 제공할 수 있습니다.

이를 통해 특정 자료와 관련된 이용 가능한 증거의 양이 늘어날 수 있습니다.

그 자체만으로도:

„독립적인 실험실에서 검사를 마쳤다”

그러나 다음과 같은 점은 설명하지 않는다:

• 정확히 무엇을 조사했는지;
• 몇 개의 시료를 분석했는지;
• 누가 시료를 선택했는지;
• 누가 그것을 다운로드했는지;
• 대표성이 있었는지;
• 어느 정당 출신이었는지;
• 어떤 방법을 사용했는지;
• 해당 보고서를 검증할 수 있습니까;
• 시료가 이후 유통되는 재료와 일치하는지;
• 해당 연구에서 전혀 다루지 않은 특성들.

따라서 가장 유용한 질문들은 다음과 같습니다:

시료의 신원 확인 + 로트 추적성 + 시료 채취 방법 + 분석 범위 + 실험실 보고서의 진위성.

독립적인 연구라고 해서 해당 연구 방법의 한계가 사라지는 것은 아니다.

외부 연구소에서 수행한 HPLC는 여전히 HPLC 검사입니다.

단순히 독립 기관에서 수행되었다는 이유만으로, 그것이 무균성 검사, 펩타이드 함량 측정, 입체화학 분석 또는 생물학적 활성 검사가 되는 것은 아닙니다.

따라서 COA는 실험실 로고나 문서 초반부에 기재된 높은 백분율 수치만을 기준으로 평가하기보다는, 무엇보다도 분석 범위와 시료 추적 가능성을 중심으로 평가하는 것이 좋습니다.

정기적인 분석 검사로는 무엇을 확인할 수 없나요?

HPLC는 무균성을 입증하지 못함

HPLC 펩타이드에 대한 일상적인 분석은 크로마토그래피적 거동을 바탕으로 화학 성분을 조사합니다.

이는 살아있는 미생물을 검출하는 방법이 아닙니다.

따라서 깨끗한 크로마토그램만으로는 시료가 무균 상태임을 확인할 수 없다.

무균성은 적절한 방법과 생산 공정 관리가 필요한 미생물학적 문제입니다.

별도의 무균 검사조차도 시료 채취와 관련된 한계가 있는데, 이는 시험에 사용된 재료의 일부만이 직접 검사되기 때문이다.

이러한 이유로, 제약 생산 과정에서 무균 상태를 보장하는 것은 단순히 제품의 최종 검사에만 의존하는 것이 아니라, 보다 광범위한 생산 및 관리 시스템에 기반을 두고 있습니다.

FDA의 무균 제조 지침은 미생물학적 관리와 무균성 검사를 공정의 별개의 요소로 취급하고 있다. [10]

따라서:

HPLC의 높은 순도 ≠ 무균성

및

크로마토그래피상 눈에 띄는 오염 물질이 없다는 것 ≠ 미생물이 없다는 것을 의미하지는 않는다.

엔도톡신 검사는 또 다른 질문에 대한 답을 제공합니다

내독소는 세균의 구성 성분으로, 특히 그람 음성균의 리포폴리사카라이드와 관련된 물질입니다.

살아있는 박테리아와는 다릅니다.

따라서 세균 내독소 검사는 무균성 검사와는 다른 질문에 대한 답을 제공합니다.

이론적으로 시료에는 검출 가능한 살아있는 박테리아가 포함되어 있지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고 박테리아 유래의 특정 성분이 포함되어 있을 수 있다.

마찬가지로 무균 시험이 엔도톡신 측정을 자동으로 대체할 수는 없습니다.

엔도톡신 분석 결과는 시료의 매트릭스에 의해서도 영향을 받을 수 있습니다.

따라서 방법을 적절히 조정하고 간섭을 제어하는 것이 중요합니다.

FDA의 발열원 및 내독소에 관한 지침에서는 분석적 한계와 세균성 내독소와 기타 발열성 물질 간의 차이점을 다루고 있다. [11]

HPLC에 대한 일상적인 순도 분석은 무균 검사나 내독소 검사를 대체할 수 없습니다.

화학적 순도가 생물학적 활성을 입증하지는 않는다

시료는 다음과 같은 특성을 가질 수 있습니다:

• 예상 분자량;
• 크로마토그래피에서 주요 피크의 면적이 넓은;
• 발견된 화학 오염 물질의 양이 비교적 적다는 점,

동시에 특정 생물학적 기능이 확인되지 않은 경우.

기능적 행동은 다음 요인들에 의해서도 달라질 수 있습니다:

• 주름;
• 이황화물 브리지의 배치;
• 집계;
• 구조적 적합성;
• 수정 상태;
• 시험 조건;
• 사용된 생물학적 시스템.

BPTI 합성에 관한 연구는 이러한 질문들을 구분하는 것의 중요성을 잘 보여준다.

연구진은 분석적 및 생물물리학적 특성을 트립신 억제 시험과 결합했다. [12]

종합해 볼 때, 이러한 결과들은 연구 대상 물질에 대해 더 강력한 증거를 제시했다.

어떤 단일 측정값도 다른 측정값들을 대체할 수는 없었다.

따라서:

화학적 순도 ≠ 생물학적 활성

및

단일 시험에서의 생물학적 활성 ≠ 완전한 구조적 또는 생산적 특성.

COA는 임상 안전성 평가가 아닙니다.

COA는 해당 시료에 대해 수행된 분석 결과를 제시합니다.

다음 사항을 정하지 않는다:

• 임상적 내약성;
• 인체에 대한 노출 안전성;
• 적절한 용량;
• 상호작용;
• 효과성;
• 장기적인 효과;
• 특정 개인에게 유용성.

이러한 질문에는 다른 종류의 증거가 필요합니다.

이 원칙은 분석 결과가 정확하고 펩타이드의 정체성이 올바르게 확인된 경우에도 여전히 유효합니다.

순도 분석은 화학 조성의 특정 측면을 규명할 수 있다.

분석 보고서를 임상시험이나 인체에 대한 안전성 평가로 변경할 수 없다.

단일 시점만으로는 유통기한을 확인할 수 없다

COA는 일반적으로 특정 검사 시점의 원료 상태를 기술합니다.

펩타이드들은 이후 다음과 같은 변화들을 겪을 수 있습니다:

• 강등;
• 산화;
• 가수분해;
• 탈아미드화;
• 집계;
• 수분 흡수;
• 구조적 재편;
• 분자의 특성과 주변 환경에 따라 달라지는 다른 과정들.

따라서 한 순간에 얻은 결과가 무한한 안정성을 입증하는 것은 아니다.

유통기한을 산정하려면, 정의된 보관 조건과 시간이 지남에 따른 물질의 분석적 안정성 사이의 관계를 보여주는 데이터가 필요합니다.

엑세나티드에 대한 연구에서는 약물의 안정성을 확인하는 크로마토그래피 분석법을 개발하고, 여러 스트레스 조건에서 생성되는 분해 생성물을 규명하였다. [13]

이 연구는 분해 생성물을 모 펩타이드로부터 어떻게 분리할 수 있는지를 보여준다.

그러나 이는 모든 펩타이드에 적용되는 보편적인 보관 기간을 명시하는 것은 아니며, 인위적인 스트레스 조건을 일반적인 보관 조건과 무조건 동일시해서는 안 된다.

가장 강력한 결론은 증거의 설득력에 부합해야 한다

과학적으로 신중한 해석은 수행된 측정 범위를 벗어나서는 안 된다.

예를 들어, COA는 다음과 같은 주장을 뒷받침할 수 있다:

„분석된 시료에서, 지정된 펩타이드와 일치하는 전체 분자 질량 값과, 사용된 HPLC 방법에서 주 피크가 차지하는 비율, 그리고 별도로 측정된 펩타이드 함량이 확인되었다.”.

이는 가치 있는 분석적 증거 자료들입니다.

하지만 이것이 반드시 다음을 의미하는 것은 아닙니다:

„이 펩타이드의 특성은 완전히 규명되었으며, 무균 상태이고, 생물학적 활성을 지니며, 안전하고, 무기한 안정적이며, 인체 사용에 적합합니다.”.

이는 실험실 검사의 가치를 폄하하려는 것이 아닙니다.

또한 하나의 분석 방법이 가능한 모든 질문에 답해 줄 것이라고 기대해서는 안 된다.

가장 중요한 것은 다음을 결합하는 것입니다:

모든 명제 → 이를 실제로 입증할 수 있는 측정 방법과 함께,

동시에 답변을 얻지 못한 질문들을 명확히 지적하면서.

자주 묻는 질문

1. 순도 99%라는 것은 해당 제품이 안전하다는 뜻인가요?

아닙니다. 순도 백분율은 특정 분석 방법에 따른 시료의 구성을 나타낼 뿐, 안전성을 보장하는 확률을 의미하지는 않습니다. 게다가 이 수치는 대상 펩타이드의 물리적 질량 비율이 아니라 크로마토그래피 신호의 비율을 나타낼 수도 있습니다. 펩타이드 질량 균형 연구에 따르면, 물, 반이온 및 기타 성분들이 이러한 수치 간의 차이를 유발할 수 있는 이유가 밝혀졌습니다. [2] 분석적 순도와는 별개로, 표적 분자 자체도 고유한 생물학적 특성을 가질 수 있습니다. 따라서 높은 순도 결과는 분석된 시료의 화학적 특성을 뒷받침할 수는 있지만, 안전성과 관련된 독성학적, 약리학적, 미생물학적 또는 임상적 증거를 대체할 수는 없습니다.

2. HPLC는 무균 상태를 확인해 줍니까?

아니요. HPLC 펩타이드에 대한 일상적인 분석은 크로마토그래피적 거동에 기초하여 화학 성분을 분리하고 검출합니다. 이 분석은 시료에 살아있는 미생물이 없는지 여부를 확인하지는 않습니다. 무균성은 별도의 특성으로, 적절한 미생물학적 검사 및 생산 공정 관리가 필요합니다. FDA의 무균 제조 지침은 화학 분석과는 별개로 미생물학적 관리를 다루고 있습니다. [10] 따라서 깨끗한 크로마토그램, 주 피크의 높은 면적 비율 또는 펩타이드의 예상 유지 시간은 무균성에 대한 증거를 대체할 수 없습니다.

3. HPLC의 면적 비율은 정확히 무엇을 의미하나요?

HPLC의 면적 백분율은 일반적으로 전체 고려된 크로마토그래피 신호 중 주 피크에 할당된 통합 신호의 비율을 나타냅니다. 이 결과는 분리 품질, 검출기 응답, 파장, 적분 규칙, 보고 기준치 및 기타 분석법 조건에 따라 달라집니다. 따라서 이는 펩티드의 질량 비율이 전체 시료에서 차지하는 물리적 비율을 자동으로 나타내는 것은 아닙니다. 주요 펩티드 피크의 순도 분석은 분리되지 않은 이성질체가 해석을 복잡하게 만들 수 있는 이유를 보여줍니다. [1] 따라서 HPLC의 면적 백분율은 특정 분석 방법의 결과로 간주되어야 하며, 그 측정 기준은 명확하게 정의되어야 한다.

4. HPLC라는 단일 피크에 여러 가지 물질이 포함될 수 있습니까?

네. 두 개 이상의 성분이 서로 매우 가까운 위치에서 용출되어, 특정 크로마토그래피 시스템에서는 제대로 분리되지 않고 하나의 피크처럼 보일 수 있습니다. 따라서 시각적으로 대칭을 이루는 피크라 하더라도 분자적 균일성을 입증하는 절대적인 증거는 아닙니다. 환형 펩타이드 연구에 따르면, RP-HPLC와는 다른 크로마토그래피 모드를 사용할 경우 불순물 분리 방식이 달라지는 것으로 나타났습니다. [3] 이는 모든 주요 피크에 숨겨진 물질이 포함되어 있다는 것을 의미하지는 않습니다. 대신, 분별 능력이 방법의 선택성에 달려 있으며, 구조적으로 매우 유사한 물질의 경우 보완적인 분석 기법이 필요할 수 있음을 보여줍니다.

5. 올바른 분자량이 펩타이드의 올바른 서열을 입증하는가?

아니요. 예상값과 일치하는 전체 분자 질량은 동일성에 대한 중요한 증거가 되지만, 아미노산 서열, 입체화학, 말단기의 종류, 치환 위치 또는 그 밖의 모든 구조적 특징을 반드시 확인해 주는 것은 아닙니다. 합성 펩타이드의 불순물 분석 결과, 질량은 동일하지만 수식기가 서로 다른 위치에 있는 성분들이 확인되어 추가적인 분석 정보가 필요했다. [4] 따라서 신원을 완전히 평가하려면 해당 펩타이드의 구체적인 구조적 모호성에 맞춰 선별된 방법이 필요합니다.

6. 펩타이드 함량과 순도는 어떻게 다른가?

펩타이드 함량은 특정 정량 기준에 따라 시료 내에 정의된 표적 펩타이드가 얼마나 포함되어 있는지를 나타냅니다. 반면 순도는 주성분에 할당된 크로마토그래피 신호의 비율이나 기타 정의된 순도 매개변수를 의미할 수 있습니다. 물, 대이온, 공정 잔류물 및 구조적으로 유사한 화합물은 이러한 수치의 차이를 초래할 수 있습니다. 서블란신 연구에서는 질량 균형 평가 과정에서 이러한 성분 중 몇 가지를 별도로 측정했습니다. [2] 따라서 펩타이드 함량 결과와 HPLC 표면적 비율은, 검증된 분석 시스템이 이 둘 간의 관계를 명확하게 규정하지 않는 한, 별도로 해석해야 한다.

7. 물과 반대 이온이 분말 내 펩타이드의 양에 영향을 미칠 수 있습니까?

네. 물과 반이온은 시료의 총 물리적 질량을 증가시키므로, 결과가 ‘수령 상태’의 시료에 대해 제시되는 경우, 대상 펩타이드 자체에 해당하는 질량 비율을 낮출 수 있습니다. 서블란신 및 펩타이드 반이온에 대한 연구는 이러한 성분들이 왜 별도로 측정되어야 하는지 보여줍니다. [2] [9] 이러한 성분의 존재가 반드시 합성 오류나 오염을 의미하는 것은 아닙니다. 왜냐하면 반이온이 의도된 염 형태의 일부일 수 있기 때문입니다. 따라서 핵심적인 질문은 분석된 분자 형태의 종류, 각 성분의 양, 그리고 사용된 계산의 근거에 관한 것입니다.

8. 반이온은 펩타이드 오염 물질과 같은 것입니까?

항상 그런 것은 아닙니다. 반이온은 펩타이드 염의 예상되는 구성 성분일 수 있지만, 서열과 관련된 불순물은 다른 펩타이드 분자입니다. 따라서 두 가지 모두 시료의 전체 조성에 영향을 미칠 수 있음에도 불구하고, 이는 서로 다른 분석 범주에 속합니다. 펩타이드의 반이온을 비교한 연구에서, 막 투과 실험 시 서열과 염 형태에 따른 차이가 관찰되었다. [9] 반이온이 물질의 특성에 중요한 역할을 하는 경우, 그 종류와 양은 별도로 보고되어야 하며, 펩타이드 주 피크의 크로마토그래피 순도를 바탕으로 추론해서는 안 된다.

9. 일반적인 질량 분석법으로는 D-아미노산과 L-아미노산의 이성질체를 구별할 수 있습니까?

단순히 전체 분자의 질량을 측정하는 것만으로는, 원소 조성은 동일하지만 입체화학만 다른 구조를 구별하기 어려운 경우가 많습니다. 따라서 D-이성질체와 이에 대응하는 L-이성질체는 동일한 분자량을 가질 수 있습니다. 공간적 배열에 관한 질문이라면, 적절한 키랄 분석이나 입체화학 분석이 필요합니다. 펩타이드의 키랄 순도 분석에서는 시료 준비 과정에서 발생하는 입체화학적 변화를 고려한 특수 설계된 공정이 적용되었습니다. [6] 이 문제는 구조적 성격을 띠고 있으므로, 단순히 질량 측정 정확도를 높이는 것만으로는 이러한 모호성을 해결할 수 없다.

10. COA에 기재된 로트 번호가 왜 중요한가요?

로트 번호 또는 일련 번호는 분석 결과를 검사 대상인 특정 시료와 연결하는 데 도움이 됩니다. 한 로트에 대해 얻은 결과를 다른 로트나 다른 시기에 준비된 각 용기에 자동으로 적용할 수는 없습니다. 인증된 기준 물질과 관련된 시험은 단일 측정 결과를 바탕으로 균일성 및 안정성을 가정하기보다는 이러한 특성을 직접 평가합니다. [8] 따라서 일치하는 로트 번호는 추적성의 중요한 요소이지만, 그 자체만으로는 시료 채취, 보관, 시료 취급 또는 기타 모든 관리 시스템 요소의 적절성을 입증하지는 못합니다.

11. „검출되지 않음”은 0을 의미합니까?

아니요. „검출되지 않음”이란, 사용된 분석법이 특정 조건 하에서 그 감도 범위 내에서 분석 대상 물질을 검출하지 못했음을 의미합니다. 이는 실제 양이 정확히 0이라는 것을 증명하지는 않습니다. 검출 한계 또는 정량 한계 미만의 결과는 해당 한계값, 단위, 시료 기준 및 분석 조건과 함께 해석되어야 합니다. 내독소 분석에 관한 지침에서도 분석법의 민감도와 가능한 간섭 요인의 중요성에 대해 다루고 있습니다. [11] 따라서 과학적으로 타당한 결론은 해당 방법이 검출할 수 있었던 것에 초점을 맞춰야 하며, 물질의 완전한 부재에 대한 절대적인 주장을 해서는 안 된다.

12. 보고서에서 ‘측정 불확도’란 무엇을 의미합니까?

측정 불확실성은 적용된 평가 기준에 따라 얻어진 결과와 합리적으로 연관 지을 수 있는 값들의 분포를 나타냅니다. 이는 실험실이 자신의 결과를 오류로 간주한다는 것을 의미하지 않는다. 오히려 이는 해당 추정치의 수치적 신뢰도를 나타내는 범위를 보여준다. 기준 물질 연구에서 값을 할당할 때, 측정 자체의 불확실성, 균일성 및 안정성 등을 고려할 수 있다. [8] 따라서 불확실성은 그 정의, 단위, 적용된 커버리지 수준 및 정확히 정의된 측정량과 함께 해석되어야 한다.

13. 독립적인 실험실의 검사 결과, 모든 용기에 동일한 물질이 들어 있다는 것이 확인되었습니까?

아니요. 독립적인 검사는 실제로 분석에 제출된 시료에 대한 증거를 제공합니다. 이러한 결과를 모든 용기에 일반화할 수 있는지는, 무엇보다도 시료 채취 방법, 로트 추적성, 재료의 균일성, 충전 공정, 보관 및 기타 관리 요소에 따라 달라집니다. 인증된 기준 물질을 개발할 때, 균일성은 단순히 단일 측정 결과를 바탕으로 가정하는 것이 아니라 실제로 평가됩니다. [8] 실험실의 독립성은 측정 자체의 독립성을 높일 수는 있지만, 전체 로트의 동일성을 자동으로 입증하는 것은 아닙니다.

14. 무균 검사 결과와 내독소 검사 결과를 서로 대체하여 사용할 수 있습니까?

아닙니다. 무균 검사는 살아있는 미생물을 대상으로 하는 반면, 세균 내독소 검사는 살아있는 세균이 없더라도 시료에 남아 있을 수 있는 특정 세균 성분을 대상으로 합니다. 따라서 이는 두 가지 별개의 분석적 문제입니다. 엔도톡신 정량에는 시료 매트릭스로 인한 간섭이 추가로 영향을 미칠 수 있으므로, 분석법을 적절히 조정하는 것이 중요합니다. [11] HPLC의 일상적인 순도만으로는 무균성이나 내독소 수준을 추론할 수 없습니다. 이러한 검사가 수행된 경우, 별도로 보고되어야 합니다.

15. 화학적 순도가 생물학적 활성을 입증하는가?

아닙니다. 화학 분석과 기능성 시험은 서로 다른 종류의 정보를 제공합니다. 펩타이드가 예상된 분자량과 높은 크로마토그래피 순도를 가지고 있더라도, 특정 생물학적 시험에서 효과가 입증되지 않을 수 있습니다. BPTI에 관한 연구에서는 하나의 분석 결과만으로도 모든 결론을 내릴 수 있다고 가정하는 대신, 구조적 및 생물물리학적 특성과 트립신 억제 시험을 결합하여 분석했다. [12] 또한 기능적 증거는 연구 대상 분자, 실험 설정 및 특정 시험에 특유한 것입니다. 따라서 해당 활성이 실제로 검증되지 않은 경우, 고순도 시료를 기능적으로 입증된 것으로 간주해서는 안 됩니다.

16. COA는 해당 펩타이드가 무기한으로 안정성을 유지할 것임을 확인해 주는가?

아닙니다. COA는 보고서에 명시된 검사 시점 또는 단계에서의 시료를 기술합니다. 이후 보관 과정에서 펩타이드가 분해, 산화, 가수분해, 응집, 수분 흡수를 비롯해 그 특성 및 환경에 따라 다양한 변화를 겪을 수 있습니다. 엑세나티드의 분해 연구 결과, 모 분자와 분해 생성물을 구분할 수 있는 안정성 평가 방법의 중요성이 입증되었다. [13] 그러나 스트레스 시험만으로는 일반적인 조건에서의 보관 기간을 자동으로 결정할 수 없습니다. 유효 기간에 관한 모든 주장은 특정 조건과 시간에서 얻어진 적절한 안정성 데이터를 바탕으로 해야 합니다.

17. 두 펩타이드의 COA를 비교할 때 가장 먼저 무엇을 확인해야 합니까?

먼저 문서에 표시된 가장 높은 백분율 수치를 바로 비교하기보다는, 시료의 동일성, 로트 번호, 사용된 분석 방법, 단위 및 측정 기준을 비교해 보는 것이 좋습니다. 두 보고서가 모두 „순도”로 표기된 수치를 제시하고 있더라도, 실제로는 서로 다른 특성을 측정하거나 개별 오염 물질 등급을 구분하는 능력이 다를 수 있습니다. 직교 크로마토그래피 방법과 질량 균형 분석을 활용한 연구는 이러한 차이점의 중요성을 보여줍니다. [2] [3] 두 수치가 동일한 물리량을 나타내는지, 그리고 측정 방법이 충분히 비교 가능한지 확인하지 않고 백분율을 직접 비교하면 오해를 불러일으킬 수 있다.

18. 순도 HPLC인 99%는 펩타이드 함량이 99%인 것을 의미합니까?

아니요. 99% HPLC라는 결과는 대개 주 피크에 99%에 해당하는 크로마토그래피 검출기 응답이 할당되었음을 의미합니다. 반면, 펩타이드 함량에 대한 99%라는 결과는 명확하게 정의된 기준에 따라 대상 펩타이드가 시료의 99%를 차지함을 보여주는 정량 측정이 필요함을 의미합니다. 물, 반이온, 용매 잔류물 및 기타 성분은 시료의 물리적 질량을 증가시킬 수 있지만, RP-HPLC-UV의 표면적 비율에는 비례적으로 영향을 미치지 않습니다. [2] 따라서 두 값은 서로 크게 다를 수 있지만, 어느 측정값도 반드시 잘못된 것은 아닙니다.

19. 펩타이드가 HPLC 순도 테스트를 통과했음에도 불구하고 입체화학이 비정상일 수 있습니까?

이론적으로는 그렇습니다. 기존의 RP-HPLC는 특히 분자들의 물리화학적 특성이 매우 유사할 경우, 모든 입체이성질체를 반드시 분리할 필요는 없습니다. 마찬가지로, 전체 분자의 질량을 단순히 측정하는 것만으로는 원소 구성이 동일한 스테리오이소머를 구별할 수 없습니다. 펩타이드의 스테레오화학적 순도에 관한 연구는 왜 전문적인 분석법과 시료 전처리에 대한 철저한 관리가 필요한지를 보여줍니다. [6] 특정 HPLC 방법이 주어진 스테리오이소머를 분리할 수 있는지 여부는 해당 방법의 입증된 선택성에 달려 있으며, 단순히 HPLC 분석을 수행했다는 사실에만 의존하는 것은 아닙니다.

20. COA는 해당 배치 전체가 검사된 시료와 동일함을 확인해 주는가?

단독으로는 아닙니다. COA는 분석 문서에 명시된 시료 및 로트와 관련된 결과를 제시합니다. 이러한 결과를 전체 로트로 일반화하기 위해서는 적절한 시료 채취 시스템, 공정 일관성, 균일성, 추적성 및 기타 생산 관리 조치가 필요합니다. 기준 물질의 개발 과정은 왜 균일성이 단순히 가정되는 것이 아니라 별도의 특성으로 평가되는지를 보여줍니다. [8] 따라서 COA는 배치에 관한 중요한 분석적 증거를 제공할 수 있지만, 전체 자재에 대한 결론의 타당성은 검사된 시료와 보고서가 나타내는 배치를 연결하는 보다 광범위한 품질 시스템에 달려 있습니다.

펩타이드 순도 해석 및 COA의 한계

펩타이드 분석 보고서를 해석할 때는 몇 가지 제한 사항을 염두에 두어야 합니다.

첫째, 순도는 분석 방법에 따라 달라집니다. RP-HPLC-UV 분석 결과는 특정 크로마토그래피 시스템과 검출기가 측정한 내용을 나타냅니다. 다른 분리 기법을 사용하면 첫 번째 방법으로는 분리되지 않았던 성분들이 드러날 수 있습니다. [1] [3]

둘째, 크로마토그래피 표면적과 물리적 질량은 서로 다른 측정 기준을 따릅니다. 물, 반이온, 기타 물질의 잔류물 및 검출기 반응의 차이로 인해 HPLC의 표면적 비율이 표적 펩타이드의 질량 비율과 일치하지 않을 수 있습니다. [2]

셋째, 예상 분자량은 강력하지만 완전하지는 않은 동질성 증거가 된다. 이성질체, 위치 변이체 및 입체화학적 차이로 인해 추가적인 구조 규명 방법이 필요할 수 있다. [4] [5] [6]

넷째, 분석 방법 자체로 인해 인공적 오류가 발생할 수 있다. 시료 전처리, 가수분해, 유도체화, 보관 및 시료 취급 방식은 분석 대상 물질이나 측정 대상 특성을 변화시킬 수 있다. [6]

다섯째, 검사된 시료가 이후의 모든 용기나 동일한 물질과 자동으로 동일시될 수는 없다. 균일성, 로트 추적성 및 안정성은 별개의 문제이다. [8]

여섯째, 화학 분석만으로는 미생물학적 의문을 해소할 수 없다. HPLC 및 질량 분석법은 무균성이나 내독소 수준을 입증하지 못한다. [10] [11]

일곱째, 화학적 특성은 생물학적 활성이나 임상적 안전성을 입증하지 못한다. 이는 별개의 문제로서 다른 종류의 증거가 필요하다. [12]

결국, 특정 시점에 얻은 결과가 장기적인 안정성을 입증하는 것은 아니다. 안정성을 평가하려면 일정 기간 동안 특정 조건 하에서 수집된 적절한 데이터가 필요하다. [13]

이러한 제한 사항들이 COA의 가치가 낮다는 것을 의미하는 것은 아닙니다.

대신 이를 올바르게 해석하는 방법을 설명하고 있다.

요약

펩타이드 분석 증명서는 이를 단일한 품질 평가가 아닌, 개별적인 분석 측정값들의 집합으로 간주할 때 가장 유용합니다.

처음에 제시된 순도 값은 해석의 시작에 불과합니다.

RP-HPLC 면적의 99%와 같은 결과는 특정 크로마토그래피 방법에서 검출기의 응답 분포를 나타냅니다. 이는 분말의 물리적 질량인 99%가 반드시 목표 펩타이드임을 의미하지는 않습니다. [1] [2]

질량 분석법은 분자량 및 일부 구조적 특성에 대한 강력한 증거를 제공할 수 있지만, 전체 분자의 질량이 예상값과 일치한다고 해서 그 자체만으로는 서열, 말단 구조, 입체화학 또는 분자 결합에 관한 모든 측면을 단독으로 입증하지는 못합니다. [4] [5] [6]

펩타이드의 함량은 별도의 정량 기준이 필요합니다.

물, 반이온, 기타 물질의 잔류물 및 이와 관련된 펩타이드 오염 물질은 계량된 시료의 질량과 목표 펩타이드의 실제 양 사이의 상관관계에 영향을 미칠 수 있다. [2] [7] [9]

따라서 COA를 읽을 때는 몇 가지 별도의 질문을 던져보는 것이 좋습니다:

어떤 시료가 분석되었나요?

어떤 정당과 관련된 건가요?

어떤 분석 방법을 사용했나요?

보고된 백분율 수치는 정확히 무엇을 의미합니까?

어떤 단위를, 어떤 산정 기준을 적용했나요?

분자적 동일성은 크로마토그래피적 순도와 별개로 조사되었습니까?

펩타이드의 실제 함량이 표시되어 있습니까?

해당 사례에서 물이나 대이온의 농도를 측정했습니까?

해당 분자에 있어 입체화학이 중요한 경우, 이를 평가했는가?

어떤 특성에 대해서는 연구되지 않았나요?

특히 „검출되지 않음”과 „검사하지 않음”을 구분하는 것이 중요합니다.

결과가 나오지 않았다고 해서 검사에 합격한 것으로 해석해서는 안 됩니다.

마찬가지로, 독립적인 실험실에서 수행한 검사는 유용한 추가 정보원이 될 수 있지만, „제3자 검사(third-party tested)”라는 표현만으로는 시료 채취 방법, 해당 시료와 해당 배치 간의 연관성, 분석 범위, 균일성, 그리고 그 결과가 모든 용기에 적용 가능한지 여부를 설명하지는 못합니다.

일반적인 화학 분석법에도 명확한 한계가 있다.

HPLC는 무균성을 보장하지 않습니다.

HPLC의 순도에는 내독소 함량이 확인되지 않습니다.

화학적 순도가 생물학적 활성을 입증하는 것은 아닙니다.

COA는 임상 안전성 평가를 의미하지 않습니다.

특정 시점에 얻은 하나의 분석 결과만으로는 무제한적인 안정성을 입증할 수 없다. [10] [11] [12] [13]

따라서 과학적으로 가장 타당한 해석은 항상 이용 가능한 증거가 허용하는 범위 내에서만 이루어져야 하며, 그 이상으로 확대되어서는 안 된다.

철저하게 문서화된 분석 보고서는 검사 대상 시료에 포함된 물질의 정체, 구성 및 양에 대한 확실한 정보를 제공할 수 있다.

사용된 방법, 측정 기준, 재료의 추적 가능성 및 개별 시험의 한계를 명확하게 설명할 때 그 가치가 높아집니다.

가장 중요한 원칙은 간단합니다:

정체성, 순도, 함량, 입체화학, 미생물학적 상태, 생물학적 활성, 안정성 및 안전성은 서로 다른 문제들입니다. 신뢰할 수 있는 분석 증명서는 실제로 조사된 사항에 대한 질문에 답하는 데 도움이 되며, 측정되지 않은 사항에 대한 답을 암시하는 데 사용되어서는 안 됩니다.

면책 조항

이 기사는 오로지 교육적, 과학적·정보 제공을 목적으로 합니다. 이 기사는 펩타이드 분석 화학의 일반적인 원리, 분석 증명서(COA) 해석, HPLC 크로마토그래피, 질량 분석법, 펩타이드 함량 측정, 불순물 평가, 물질 식별성 및 관련 분석 방법에 대한 일반적인 원리를 설명합니다. 본 문서는 의학적 조언, 제품 추천, 안전성 평가, 생산 허가 또는 특정 펩타이드나 펩타이드를 함유한 물질이 인체 사용에 적합하다는 확인을 구성하지 않습니다. 분석 결과는 항상 특정 시료, 배치, 적용된 방법, 측정 기준, 사양, 분석 대상 문제 및 수행된 시험의 한계를 고려하여 해석해야 합니다.

참조

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2. Chen, W., Yan, J., Yang, M., Wang, M., Zhou, J., Li, F., & Li, L. (2026). 아미노산 분석을 기반으로 한 질량 균형 접근법 및 동위원소 희석 질량 분석법을 이용한 펩타이드 서블란신의 SI 추적 가능 순도 산정. Journal of Chromatography B, 1277, 제125038조. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2026.125038
3. Yoshida, K., Kato, S., Nagai, K., Shimamoto, S., Onishi, T., & 오니시, A. (2025). 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피와 역상 액체 크로마토그래피 간의 직교성을 기반으로 한 합성 고리형 펩타이드의 불순물 프로파일링. Journal of Chromatography A, 1745, 제465748조. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2025.465748
4. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). 고속 원자 충돌 질량 분석법 및 하이브리드 탠덤 질량 분석법을 이용한 합성 레닌 기질 펩타이드 내 불순물의 특성 분석. 질량 분석 분야의 신속 통신, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
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6. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G., & Crowther, J. B. (1995). 펩타이드 키랄 순도 측정: 중수소 표지 산을 이용한 가수분해, Marfey 시약을 이용한 유도체화 및 고성능 액체 크로마토그래피-전기분무 이온화-질량 분석법을 이용한 분석. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
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10. 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration). (2004). 무균 공정을 통해 제조된 무균 의약품 — 현행 우수 제조 기준(cGMP): 산업계 지침. 공식 지침
11. 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration). (2026). 발열원 및 내독소 시험: 질문과 답변 — 산업계 지침. 공식 지침
12. Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). 소 췌장 트립신 억제제(BPTI) 및 두 가지 유사체의 고상 합성. 단백질 접힘 및 안정성에서 이황화 결합의 역할을 평가하기 위한 화학적 접근법. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. PubMed 기록
13. Badgujar, D., Maskar, T., 파리탈라, S. T., & 샤르마, N. (2024). 액체 크로마토그래피와 오비트랩 질량 분석기를 결합한 방법을 이용한 글루카곤 유사 펩타이드-1 합성 유사체 엑세나티드의 안정성 지표 분석법 개발 및 검증, 그리고 힘에 의한 분해 생성물의 동정. European Journal of Mass Spectrometry, 30(3–4), 171–186. https://doi.org/10.1177/14690667241262935