Peptidrenlighed og laboratorietestning: Sådan læser du et analysecertifikat (COA)

Peptidets renhed beskriver sammensætningen af en prøve bestemt ved hjælp af en specifik analytisk metode. I sig selv bekræfter den ikke peptidets fulde identitet, den faktiske mængde af peptid i prøven, sterilitet, biologisk aktivitet, stabilitet eller sikkerhed. Et analysecertifikat, som oftest forkortes COA, er mest nyttigt, når hvert resultat, der er angivet deri, behandles som et svar på et specifikt analytisk spørgsmål.

Derfor kræver information som „99% renhed” den rette sammenhæng.

Betyder 99%, at den primære kromatografiske top tegner sig for 99% af det samlede integrerede detektorsignal i HPLC-analysen? Repræsenterer denne værdi masseandelen af måletpeptidet efter korrektion for vand, modioner og andre komponenter? Er den stereokemiske renheid blevet vurderet? Hvilken slags urenheder kan den givne metode detektere, og hvilke kan ligge uden for dens rækkevidde?

Disse skelnen er vigtige, fordi flere forskellige parametre i daglig tale betegnes med det samme ord „renhed”, selvom de i virkeligheden beskriver forskellige egenskaber ved prøven.

Forskning i peptidanalyse viser, hvorfor dette er vigtigt. Strukturelt lignende urenheder kan nogle gange forblive skjult i en tilsyneladende simpel kromatografisk top, mens vand, modioner, rester af andre stoffer og beslægtede forbindelser kan påvirke den samlede masse af det isolerede peptidmateriale. [1] [2]

Dette er separate analytiske problemer og kræver forskellige typer bevismateriale.

Derfor er det ved vurdering af et peptids COA mere nyttigt end selve spørgsmålet:

„Hvad er renlighedsprocenten?”

der er et spørgsmål:

„Hvad blev der helt præcist målt, med hvilken metode, i hvilken prøve, og hvilken konklusion kan man rent faktisk drage af denne måling?”

Hvad betyder peptidrenlighed egentlig?

Renlighed er et resultat baseret på en bestemt metode

Ordet „renhed” kan antyde én enkelt, let målbar egenskab. I praksis kan laboratorier dog udtrykke et peptids renhed på flere forskellige måder.

Det kan blandt andet være:

• kromatografisk arealprocent;
• masseandel;
• kemisk renlighed;
• stereokemisk renhed;
• sekvensrelateret forureningsprofil;
• renhed bestemt i henhold til en specifik analytisk metode.

Disse bør ikke betragtes som ombyttelige.

Kromatografisk renhed beskriver normalt den del af det integrerede detektorsvar, der kan henføres til prøvens hovedkomponent.

Masseandelen angiver massen af et bestemt stof i forhold til den samlede masse af det undersøgte materiale.

Stereokemisk renhed vedrører derimod andelen af molekylets forskellige rumlige konfigurationer eller de aminosyrerester, der danner det.

Derfor bør korrekt fremlagt information om renlighed efter muligheden svare på fire spørgsmål:

hvad der blev målt + hvordan det blev målt + hvordan resultatet blev beregnet + hvilken prøve der blev undersøgt.

Selve udsagnet:

„99% renhed”

videregiver væsentligt mindre information end:

„99% af arealet for hovedtoppen i henhold til RP-HPLC-UV”.

Selv den anden version besvarer dog ikke alle spørgsmål.

Det skal også vides, om den anvendte kromatografiske metode var i stand til at adskille de relevante urenheder, og om den anvendte detektor var i stand til at registrere dem.

Hvad betyder procentdelen af toparealet i HPLC?

Forenklet kan beregningen baseret på normalisering af toparealer udtrykkes som:

arealet af hovedtoppen ÷ det samlede areal af de inkluderede toppe × 100.

Hvis hovedtoppen er blevet tildelt 990 fladeenheder, og summen af det medregnede kromatografiske signal er 1000 enheder, vil hovedtoppens areal være:

990 ÷ 1000 × 100 = 99%.

Dette er en information vedrørende detektorsvaret opnået under specifikke kromatografiske betingelser.

Det betyder ikke automatisk, at:

99% af pulverets fysiske masse udgør det endelige peptid.

Der er flere årsager til denne forskel.

Forskellige kemiske forbindelser kan generere et forskelligt detektorsvar pr. masseenhed.

Nogle prøvekomponenter kan absorbere stråling svagt ved den anvendte bølgelængde.

Andre bliver muligvis ikke taget i betragtning ved de kromatografiske beregninger overhovedet.

Nogle urenheder kan også eluere sammen med hovedkomponenten.

Ordet „inkluderet” er også vigtigt.

Chromatograficzne beregninger afhænger af beslutninger vedrørende:

• integrering af peaks;
• rapporteringstærskler;
• valg af baselinjen;
• opløsningsmiddelrelaterede signaler;
• uadskilte toppe;
• detektorindstillinger;
• princippet om udelukkelse af bestemte signaler.

Derfor bør procentsatsen af HPLC-overfladen fortolkes som resultatet af en specifik kromatografisk metode og ikke som en universel beskrivelse af hele prøvens fysiske sammensætning.

Beslægtede urenheder kan være svære at adskille

Forureninger i peptider kan være strukturelt meget svære at skelne fra det tilsigtede molekyle.

De kan blandt andet omfatte:

• sletningssekvenser;
• forkortede sekvenser;
• ændrede sidekæder;
• oxiderede former;
• modificerede endegrupper;
• positionsisomerer;
• stereoisomeri;
• produkter med ikke-fuldstændig deaktivering;
• andre varianter, der opstår under peptidsyntese nedbrydningsgitter.

Nogle af disse strukturer kan afvige betydeligt i kromatografisk adfærd fra målpeptidet.

Andre kan opføre sig meget ens.

I et af studierne blev der anvendt todimensional væskekromatografi koblet med massespektrometri til at vurdere renheden af det primære peptiptop. Forskerne anvendte yderligere separationsobetingelser, da peptidisotomerer med det samme masse-ladnings-forhold ikke kunne adskilles udelukkende på grundlag af rutinemæssig massemåling. [1]

I et andet studie med fire syntetiske cykliske peptider blev omvendt fase-kromatografi sammenlignet med hydrofil interaktionskromatografi.

Begge metoder adskilte forureningen på forskellige måder. [3]

Det betyder ikke, at en af disse teknikker altid er bedre.

Det viser til gengæld fænomenet komplementær selektivitet: to analytiske metoder kan adskille den samme blangkurs blanding forskelligt, fordi de udnytter de undersøgte molekylers forskellige fysikalsk-kemiske egenskaber.

Derfor:

Et enkelt rent chromatogram behøver ikke at betyde fraværet af alle strukturelt beslægtede urenheder.

Vand og modioner påvirker også materialets sammensætning

Isoleret peptidmateriale kan indeholde komponenter, der ikke er yderligere peptidsekvenser.

Vigtige eksempler omfatter:

• vand;
• modsat;
• opløsningsmiddelrester;
• uorganiske stoffer;
• andre ingredienser relateret til produktionsprocessen.

Modion er en ion med en modsatte elektrisk ladning, bundet til peptidets ladede grupper.

I peptidkemi kan man for eksempel støde på acetat eller trifluoracetat.

Deres tilstedeværelse behøver ikke at betyde en syntese- eller forureningsfejl. Peptidet kan med vilje forekomme i en bestemt saltform.

Disse ingredienser har dog betydning, når vi vil besvare spørgsmålet:

Hvor meget af det målsatte peptid er der reelt i den afvejede mængde materiale?

Fortolkningen afhænger derfor af, om den rapporterede værdi refererer til:

• sammensætning af peptid;
• solide peptider;
• tørt materiale;
• vandfrit materiale;
• leveringstilstand.

I undersøgelsen af sublancin fra 2026 identificerede forskere vand, trifluoracetat, organiske forbindelser og uorganiske urenheder som en del af en bredere massebalanceanalyse. [2]

Det endelig tildelte peptid-andel var markant lavere end 100%, selvom strukturelt beslægtede organiske urenheder udgjorde en forholdsvis lille del af materialet.

Dette er et praktisk eksempel på en vigtig forskel:

Et rent kromatografisk peptidprofil og en høj masseandel af det måletidssvarende peptid er ikke den samme parameter.

Renhedsprocenten er ikke en sikkerhedssandsynlighed

Procentandelen, der angiver renheden, siger intet om sandsynligheden for, at det pågældende materiale er sikkert.

For eksempel betyder et renhedsniveau på 99% ikke:

„99% sikkerhed”.

Det oplyser heller ikke om den biologiske betydning af hvert stof i de resterende 1%.

En lille mængde af én forbindelse kan have større analytisk eller biologisk betydning end en større mængde af en anden forbindelse, afhængigt af:

• hans identitet;
• biologisk aktivitet;
• koncentrationer;
• eksponeringsveje;
• tilsigtede anvendelse;
• andre kontekstuelle faktorer.

Ligeledes kan et korrekt identificeret molekyle med en meget høj kemisk renhed selv besidde specifikke biologiske egenskaber.

Kemisk renhed og biologisk sikkerhed besvarer således helt forskellige spørgsmål.

Renhedstesten tjærer til at karakterisere prøven med hensyn til den anvendte analytiske metodes egnethed.

Den omsætter ikke det kemiske resultat til en generel vurdering af menneskelig sikkerhed.

HPLC i massespektrometri

Hvad kan HPLC fortælle os?

Højeffektiv væskekromatografi (HPLC) adskiller prøvekomponenter på grundlag af forskelle i deres interaktioner med den stationære fase og den mobile fase under gennemstrømning.

Ved analyse af peptider anvendes HPLC-kromatografi med omvendt fase (RP-HPLC) i vid udstrækning, ofte i kombination med UV-detektion.

Kromatogramet viser detektorsvaret som en funktion af tiden.

Man kan udlede flere vigtige oplysninger fra det.

Retentionstiden angiver det tidspunkt, hvor en given komponent forlader det kromatografiske system under bestemte betingelser.

Toparealet repræsenterer detektorens integrerede respons.

Topologiens form giver oplysninger om stoffets kromatografiske adfærd.

Opløsning beskriver, hvor effektivt tilstødende komponenter adskilles fra hinanden.

Retentionstiden er imidlertid ikke et unikt molekylært „fingeraftryk”.

Forskellige molekyler kan nogle gange eluere på et lignende tidspunkt.

Det samme peptid kan også udvise andre retentionstider efter ændring:

• kolonner;
• sammensætningen af den mobile fase;
• gradient;
• gennemstrømningshastigheder;
• temperaturer;
• konfiguration af udstyr;
• andre metodeparametre.

Undersøgelser, der sammenligner forskellige peptidadskillelsessystemer, viser, hvor stærkt kromatografisk selektivitet afhænger af den anvendte metode. [1]

Overensstemmelse af retentionstiden kan derfor understøtte identifikation i den rette sammenhæng, men bør ikke automatisk betragtes som en fuldstændig bekræftelse af strukturen.

Hvorfor behøver én top ikke at betyde én substans?

Koeluering forekommer, når to eller flere komponenter forlader det kromatografiske system på et så tæt tidspunkt, at de ikke adskilles tilstrækkeligt.

Som resultat kan de ligne en enkelt pik.

Selv en visuelt symmetrisk hovedtop beviser derfor ikke automatisk, at hele signalet stammer fra én enkelt type molekyle.

Topologiens sammensætning kan undersøges nærmere ved:

• ændring af kromatografisk selektivitet;
• anvendelse af en anden stationær fase;
• analyse ved flere bølgelængder;
• kombination af kromatografi og massespektrometri;
• tovedimensionel kromatografi;
• anvendelse af en anden supplerende analytisk teknik.

Ingen af disse metoder detekterer dog automatisk enhver mulig forurening.

Nært beslægtede stoffer kan have:

• lignende retentionstid;
• lignende UV-spektre;
• identisk nominel masse;
• har visse fælles analytiske egenskaber.

Undersøgelsen af cykliske peptider, som sammenlignede omvendt-fase-kromatografi med hydrofil interaktionskromatografi, viste tydeligt forskellige elueringsprofiler for urenhederne. [3]

Dette betyder ikke, at hver hovedtop skjuler yderligere urenheder.

Konklusionen er mere præcis:

Den tilsyneladende enkelhed af chromatogrammet er et resultat opnået i ét separationessystem, og anvendelsen af en anden selektivitet kan afsløre komponenter, som den første metode ikke separerede.

Hvad måler massespektrometri?

Massespektrometri (MS) påviser ioner baseret på deres masse-til-ladnings-forhold, skrevet som m/z.

Under analysen kan et peptid have mere end én elektrisk ladning.

Derfor kan ét peptidmolekyle generere flere signaler svarende til forskellige ladningstilstande i stedet for én enkelt top, der direkte svarer til den neutrale molekylvægt.

Korrekt fortolkning af dataene gør det muligt at genskabe eller bekræfte den basale molekylvægt.

Massespektrometri kan levere værdifuld information om:

• molekylærmasse;
• visse kemiske modifikationer;
• visse forurenende stoffer;
• isotopmønstre;
• adfærd under fragmentering.

Massespektrometri med høj opløsning gør det muligt mere nøjagtigt at skelne mellem molekyler med meget ens masser.

Tandem massespektrometri (MS/MS) går ud på at fragmentere udvalgte ioner og analysere de dannede produkter, hvorved der tilvejebringes yderligere strukturelle oplysninger.

Men der gælder stadig en vigtig regel:

observation af den forventede molekylvægt ≠ bevis for den fuldstændige molekylstruktur.

Forskellige strukturer kan have den samme masse.

Stereokemiske ændringer påvirker muligvis ikke grundstofsammensætningen.

Positionsisomerer kan også kræve yderligere bevismateriale.

Undersøgelser af urenheder i det syntetiske reninsubstratpeptid viste denne begrænsning. Yderligere information fra the fragmentering og derivatisering var nødvendig for at skelne mellem modifikationer, der forekommer i forskellige positioner i den isobare blanding. [4]

Sekvens, endegrupper og stereokemi

En peptids identitet indebærer meget mere end blot dens navn.

Væsentlige strukturelle kendetegn kan omfatte:

• aminosyresekvens;
• konfiguration af de enkelte restbeløbskonti;
• N-terminal struktur;
• C-terminal struktur;
• modifikationer af sidekæder;
• placering af disulfidbindinger;
• cyklisering;
• Bøjning;
• indre kovalente egenskaber.

For eksempel er et peptid med en C-terminal carboxylsyre et kemisk andet molekyle end det tilsvarende peptid med et C-terminalt amid.

Forskere har udviklet en derivatiserings-assisteret massespektrometri-metode netop for mere effektivt at kunne skelne mellem disse slutformer. [5]

Dette viser en vigtig regel:

Den analytiske metode bør vælges til det specifikke strukturspørgsmål.

Stereokemi udgør en ekstra udfordring.

Et peptid indeholdende en D-aminosyre og den tilsvarende variant med en L-aminosyre kan have en identisk molekylvægt og samtidig adskille sig i atomernes rummelige opstilling.

I undersøgelsen af peptiders stereokemiske renthed anvendte man en metode, der var designet til at tage højde for den racemisering, der opstår under prøvens hydrolyse. [6]

Uden en sådan kontrol kunne selve prøveforberedelsen have ændret den egenskab, man forsøgte at måle.

Derfor afhængig af en pålidelig peptidanalyse ikke kun af udstyrets parametre, men også af korrekt prøveforberedelse og metodedesign.

LC-MS kombinerer fordelene ved to metoder, men fjerner ikke alle begrænsninger

Væskekromatografi koblet med massespektrometri (LC-MS) kombinerer kromatografisk separation med masseanalyse.

Det kan derved levere meget mere information end hver af disse metoder anvendt hver for sig.

LC-MS kan blandt andet hjælpe med:

• tilde specifikke masser til forureningstoppe;
• kromatografisk skelne mellem lignende komponenter med forskellige masser;
• undersøge nedbrydningsprodukter;
• karakterisere sekvensrelaterede urenheder;
• understøtte strukturelle tildelinger.

I undersøgelsen af syntetisk oxytocin ved hjælp af en internt valideret LC-metode kombineret med massespektrometri med høj opløsning blev 18 strukturelt beslægtede urenheder identificeret og kvantificeret. [7]

Forskere forklarede også, hvorfor disse urenheder skulle tages i betragtning ved bestemmelsen af renheden af referencematerialet.

Disse resultater vedrører dog en specifik prøve, metode og undersøgt forureningsprofil.

De bør ikke betragtes som en universel liste over urenheder, der findes i ethvert materiale, der indeholder oxytocin.

LC-MS er derfor en yderst nyttig kombination af analytiske teknikker.

En god LC-MS-rapport bør dog stadig forklare:

• hvad blev der målt;
• hvordan de enkelte peaks blev tildelt;
• hvordan de foreslåede strukturer blev identificeret;
• Er tildelingerne blevet bekræftet;
• hvilken kvantitativ metode blev anvendt;
• hvilke analytiske begrænsninger der er tilbage.

Identitet, renhed og mængde er forskellige parametre

Identitet besvarer spørgsmålet: hvilket molekyle er til stede?

Identifikationsundersøgelsen skal besvare spørgsmålet om, hvorvidt det analyserede materiale svarer til den tilsigtede substans.

Afhængigt af peptidet og det undersøgte problem kan beviser for identitet omfatte:

• hele molekylets masse;
• fragmentationsgranater;
• sekvensanalyse;
• karakteristikken af endegrupper;
• aminosyresammensætning;
• placering af disulfidbindinger;
• spektroskopiske data;
• kromatografisk sammenligning med referencemateriale;
• kombination af flere metoder.

Én metode kan bekræfte et bestemt element af identiteten uden at afgøre alle andre strukturelle spørgsmål.

For eksempel:

„den forventede masse af hele molekylet blev observeret”

er en smaltere konklusion end:

„den komplette molekylære struktur er blevet bekræftet.

Forskning i terminal amidering og isobariske peptidforureninger viser, hvorfor denne sondring er væsentlig. [4] [5]

I begge tilfælde var der brug for informationer, der gik ud over blot at observere massepikken nær den forventede værdi.

Renhed besvarer spørgsmålet: hvad er der ellers i prøven?

Renhedsanalyse analyserer prøvens sammensætning inden for et bestemt analytisk område.

Afhængigt af metoden kan rapporten vise:

• hovedingrediens;
• de enkelte forureninger;
• den samlede mængde af opdagede forurenende stoffer;
• procent af hovedtoppens areal;
• stereokemiske urenheder;
• beslægtede stoffer;
• samlet masseandel.

Forskellige forureningsklasser kan kræve forskellige metoder.

Kromatografimetoden, der er optimeret til detektion af deletionssekvenser, behøver ikke at besvare spørgsmål vedrørende stereokemi.

Den massebaserede metode kan muligvis ikke skelne mellem isomerer.

Den kirale metode kan derimod give lidt information om vandindholdet.

Formålet med at anvende komplementære metoder er altså ikke blot at samle flere resultater.

Det handler om at få svar på forskellige analytiske spørgsmål, som en enkelt metode ikke er i stand til at løse selvstændigt.

Mængden svarer til spørgsmålet: Hvor mange stoffer er der til stede?

Mængden kan vedrøre flere forskellige parametre.

Det kan betyde:

• peptidsammensætning i opløsning;
• Den samlede mængde af peptidet i beholderen;
• mængden af det målte peptid;
• molmængde;
• antal pr. enhed af volumen;
• en anden klart defineret kvantitativ parameter.

Hver af disse metoder kræver en passende enhed og en grundlæggende beregningsmetode.

Kromatografisk mærkning af mængder kræver normalt en passende kalibrering og bør ikke udelukkende baseres på standardisering af pikoverflader.

I passende udviklede metoder kan også følgende bidrage til at fastslå mængden:

• aminosyreanalyse;
• kvantitativ magnetisk resonans af kernen;
• metoder til fortynding af isotop;
• Andre validerede kvantitative teknikker.

Det er vigtigt at bemærke, at beslægtede peptidskader kan påvirke visse kvantitative målinger.

Forskning om oksytocins renhed understregede behovet for at korrigere resultaterne for sådanne forureninger i stedet for at antage, at hver målt aminosyre eller analytisk signal kun stammer fra det målte molekyle.[7]

Eksempel: Procentdelen af HPLC-overfladen og den faktiske mængde af peptidet

Forestil dig et hypotetisk peptidpulver, hvorved man opnår:

RP-HPLC-UV, overflade af hovedstykket = 99,0%

og

Uanset den bestemte masseandel af det målte peptid = 78,0% i det modtagne materiale.

Disse resultater behøver ikke at være i modstrid med hinanden.

De har forskellige kriterier og besvarer forskellige analytiske spørgsmål.

Hvis man tager 10,0 mg af dette hypotetiske pulver, og den validerede værdi for det målte masseindhold af det ønskede peptid er 78,0%, ville mængden af peptidet som følge af denne måling være:

10,0 mg × 0,780 = 7,80 mg.

Det ville ikke automatisk være acceptabelt at:

10,0 mg × 0,990 = 9,90 mg

Udelukkende fordi hovedpunktet svarede til 99,0% af den inkluderede UV-overflade.

Dette er kun en analytisk illustration og beskriver ingen specifikke kommercielle produkter eller eksperimentelle materialer.

Studiet af sublancin er et reelt eksempel på den grundlæggende regel bag denne sondring, da der under vurderingen af materialets sammensætning blev taget hensyn til blandt andet vand og antijon [2].

De numeriske værdier fra denne undersøgelse må ikke overføres til andre peptider.

Målingens usikkerhed og målegennemsigtighed

Analytiske resultater bør ikke betragtes som værdier med uendelig nøjagtighed.

Det er et estimat opnået ved hjælp af en bestemt måleprocedure.

Udvælgelsesusikkerhed beskriver det område eller den spredning af værdier, som på en begrundet måde kan forbindes med måledataet i overensstemmelse med den anvendte vurderingsmetode.

Det betyder ikke, at laboratoriet ved, at resultatet er forkert.

Det informerer imidlertid om grænserne for den numeriske sikkerhed.

Målekonstans henviser til den dokumenterede sammenhæng mellem resultatet og det relevante referencepunkt gennem en kalibreringskæde.

Det hjælper med at sikre sammenlignelighed af målingerne, men kun for det specifikke parameter, der faktisk er målt, og for en fast referencekæde.

I undersøgelsen om udvikling af referencematerialet NT-proBNP blev metoder til isotopfortynding kombineret med vurdering af materialets homogenitet og stabilitet. [8]

Dette viser, hvorfor en pålidelig tilføjelse af en kvantitativ værdi kræver meget mere end blot at læse tallet, der genereres af enheden.

Hvordan læser man COA-analysecertifikatet?

Start med at identificere prøven og partiet

Før en analyse af resultatet foretages, er det nødvendigt at fastslå, hvilket materiale der faktisk er blevet undersøgt.

En nyttig COA bør kombinere resultaterne med identificerende oplysninger, såsom:

• navnet eller beskrivelsen af materialet;
• prøveidentifikator;
• parti- eller serienummer;
• de relevante datoer;
• strukturelle form;
• formen af saltet, hvis det er relevant;
• ændringer i enderne eller andre væsentlige strukturelle egenskaber.

Det er vigtigt, fordi analyseresultaterne vedrører en prøve, der faktisk er blevet undersøgt.

Et certifikat for én parti bekræfter ikke direkte sammensætningen af et andet parti.

På samme måde bekræfter analysen af en prøve af det samlede materiale ikke automatisk mængden eller tilstanden af materialet i hver enkelt beholder, der senere bliver fyldt, medmindre et system til prøveudtagning, påfyldning, homogenitetsvurdering og proceskontrol begrunder en sådan konklusion.

Det drejer sig om spørgsmål vedrørende materialets sammenhæng og identifikation.

De betyder ikke automatisk, at det er forkert at handle eller at det er af lav kvalitet.

Læseren af rapporten har blot brug for en forbindelse, der kan forsvares:

rapport → testet prøve → parti eller materiale, som resultatet skal gælde for.

Se metoden, resultatet, enheden og specifikationerne sammen

COA præsenterer ofte både kriteriet om accept og det faktiske resultat.

For eksempel:

Specifikation: mindst 98,0%

og

Resultat: 99,2%.

Det er to forskellige oplysninger.

Specifikationen fastlægger kriteriet for accept.

Resultatet repræsenterer værdien målt for den specifikke prøve.

Netop også vigtige er enheden og målegrundlaget.

Man kan blandt andet møde:

• område%;
• mængde%;
• mg/beholder;
• mg/ml;
• µg/ml;
• mol/L;
• resultatet i forhold til tørvægt;
• resultatet beregnet som vandfri materiale;
• resultatet for det materiale i den modtagne tilstand.

Disse værdier kan ikke frit udskiftes.

For eksempel tager resultatet, der er angivet som „i den tilstand, der blev modtaget”, højde for materialet i den form, det blev undersøgt i, mens en vandfri eller korrigeret værdi matematiske set kan udelukke vandet fra grundlaget for beregningen.

Informationen „pass” betyder, at det angivne resultat opfylder et bestemt acceptkriterium for den pågældende test.

Den udvider ikke omfanget af denne undersøgelse.

Derfor:

En bestået identitetsprøve ≠ bekræftet sterilitet

og

Den udførte test for renhed HPLC ≠ den bestemte indhold af peptidet,

medmindre disse egenskaber er målt uafhængigt.

Eksempel på fortolkning af opførelser i COA

De følgende indlæg er hypotetiske og tjener udelukkende til at vise, hvordan analytiske data kan fortolkes. De beskriver ikke den faktiske part og foreslår ikke kriterier for accept.

De præsenterede forskelle bygger på undersøgelser af renheden af det primære peptidhoved, antijoner og bestemmelse af masseandelen. [1] [2] [9]

De angivne tal og tabellens format har udelukkende en uddannelsesmæssig karakter.

Tjek kromatogrammet og spektrumet

Yderligere analytiske data hjælper med at forstå resultaterne på en mere korrekt måde, som er opsummeret i COA.

Når det kommer til et chromatogram, er det værd at bemærke følgende:

• prøveidentifikator;
• metodens identifikator;
• chromatogrammets akse;
• type af detektor;
• bølgelængde;
• Vigtige retentionstider;
• pikernes mærkning;
• tabellen over forurening;
• resultaterne af integrationen;
• rapporteringsgrænser.

Et chromatogram, der er skåret således, at det kun viser det store hovedpik, kan udelade de oplysninger, der er nødvendige for en korrekt fortolkning af renhedsmålerens resultat.

For massespektrometri, kan en relevant kontekst omfatte:

• den forventede molekylform;
• den forventede masse;
• observerede ioner;
• tilknyttede ladetilstande;
• dekonvolucję;
• massefejl;
• fragmenterede data, hvis de er relevante;
• grundlaget for at tilordne strukturen.

Det synlige billede af en masse af en hel molekyle, den dekonvolverede molekylære masse og strukturelle beviser baseret på fragmentering er forbundet med hinanden, men betyder ikke det samme.

COA behøver ikke nødvendigvis at indeholde alle de rå filer fra apparaturen.

Men de analytiske konklusioner, der er opsummeret deri, bør kunne sammenkædes med den kildedokumentation, som kan verificeres, hvis der opstår spørgsmål om tilordning af en struktur eller et numerisk resultat.

„Ikke fundet” og „ikke undersøgt” betyder noget helt andet

„Ikke detekteret” betyder, at den anvendte analytiske metode ikke opdagede det undersøgte stof under de specifikke betingelser og ved sin sensitivitet.

Det betyder ikke, at det faktiske niveau er præcis nul.

„At ”under the limit of detectability" betyder imidlertid, at bestanddelen kan være til stede på et niveau, som en given metode ikke er i stand til at måle kvantitativt pålideligt.

Det er en anden situation.

„Ikke undersøgt” betyder, at der ikke er foretaget målinger for den pågældende egenskab.

Det må ikke tolkes som:

„korrekte resultat”

ingen:

„stoffet er ikke til stede”.

En korrekt fortolkning af oplysninger om påvisning eller kvantitativ mærkning kræver også kendskab til:

• grænser for detektion eller målingsevne;
• enheder;
• grundlaget for rapportering;
• den anvendte metode;
• metoden til at fremstille prøven.

Hvad indeholder det uafhængige laboratorieundersøgelse?

Et uafhængigt laboratorium kan levere yderligere analytiske målinger for den afsendte prøve.

Dette kan øge antallet af tilgængelige beviser vedrørende et bestemt materiale.

Selv definisjonen:

„testet af et uafhængigt laboratorium”

men det forklarer ikke:

• hvad der blev undersøgt nøjagtigt;
• hvor mange prøver der er undersøgt;
• hvem der valgte prøve;
• hvem der tog hende;
• om den var repræsentativ;
• hvilken parti hun kom fra;
• hvilke metoder der blev anvendt;
• om rapporten kan verificeres;
• om prøven svarer til det materiale, der senere distribueres;
• som undersøgelsen slet ikke omfattede.

De mest nyttige spørgsmål vedrører derfor:

prøveidentitet + partielæggelighed + prøveudtagningsmetode + analytisk område + autenticitet af laboratorieresultatet.

En uafhængig undersøgelse fjerner ikke begrænsningerne i de anvendte metoder.

HPLC, der er fremstillet af et eksternt laboratorium, forbliver fortsat en undersøgelse af HPLC.

Det bliver ikke brugt som en test for sterilitet, et mål for peptidholdet, en stereokemisk analyse eller en undersøgelse af biologisk aktivitet kun fordi det er udført af et uafhængigt organ.

Derfor er COA værd at vurdere frem for alt ud fra analyseomfanget og muligheden for at spore prøven, og ikke kun på grundlag af laboratorieets logo eller en høj procentdel placeret i begyndelsen af dokumentet.

Hvad bekræfter ikke de rutinemæssige analytiske undersøgelser?

HPLC ikke bekræfter steriliteten

En rutinemæssig HPLC-peptidanalyse undersøger kemiske bestanddele på grundlag af deres kromatografiske opførsel.

Det er ikke en metode til påvisning af levende mikroorganismer.

En ren chromatogram kan derfor ikke bekræfte, at prøven er steril.

Sterilitet er et mikrobiologisk problem, der kræver passende metoder og kontrol af produktionsprocessen.

Selv en individuel undersøgelse af steriliteten har begrænsninger i forbindelse med prøvetagningen, da kun en del af det materiale, der bruges i testen, bliver undersøgt direkte.

Af denne grund er sikring af steriliteten i farmaceutisk produktion baseret på et bredere produktions- og kontrolsystem, og ikke kun på den endelige produktkontrol.

FDA's retningslinjer for aseptisk produktion behandler mikrobiologisk kontrol og sterilitetsprøvning som separate elementer i processen.[10]

Derfor:

Høj renhed af HPLC ≠ sterilitet

og

Fravær af synlige kromatografiske forureninger ≠ fravær af mikroorganismer.

Studiet af endotoksiner besvarer et andet spørgsmål

Endotoksiner er bakteriebestanddele, især materiale forbundet med lipopolysaccharider fra gramnegative bakterier.

De er ikke det samme som levende bakterier.

Studiet af bakterielle endotoksiner svarer således på et andet spørgsmål end testet for sterilitet.

Teoretisk set kan prøven ikke indeholde påviselige levende bakterier, men kan alligevel indeholde bestemte bestanddele af bakterieoprindelse.

På samme måde kan en sterilitetsprøve ikke automatisk erstatte måling af endotoksiner.

Prøveemnet kan også påvirke undersøgelsen af endotoksiner.

Det er derfor vigtigt at tilpasse metoden og kontrollere interferensen korrekt.

FDA's retningslinjer om pyrogener og endotoksiner beskriver analytiske begrænsninger og forskellen mellem bakterielle endotoksiner og andre pyrogener. [11]

En rutinemæssig analyse af HPLC-renhed kan hverken erstatte en undersøgelse af steriliteten eller en undersøgelse af endotoksiner.

Kemisk renhed bekræfter ikke biologisk aktivitet

Prøven kan have:

• den forventede molekylmasse;
• en høj overflade på hovedet af den kromatografiske kolonne;
• en relativt lille mængde af detekterede kemiske forureninger,

og samtidig ikke have en bekræftet bestemt biologisk funktion.

Funktionsmæssig funktion kan også afhænge af:

• foldning;
• placering af disulfidbindinger;
• aggregering;
• strukturelle konformitet;
• tilstand af modifikationer;
• testbetingelserne;
• den anvendte biologiske metode.

En undersøgelse om syntesen af BPTI viser godt, hvor værdifuldt det er at opdele disse spørgsmål.

Forskere kombinerede analytisk og biofysisk karakterisering med en trypsinhemmetest. [12]

Samlet set gav disse resultater mere solide beviser om det undersøgte materiale.

Ingen enkelt måling erstattede de andre.

Derfor:

Kemisk renhed ≠ biologisk aktivitet

og

Den biologiske aktivitet i et enkelt test er ikke ensbetydende med en komplet strukturel eller produktionsmæssig karakteristika.

COA er ikke en vurdering af klinisk sikkerhed

COA fremsætter resultaterne af analytiske undersøgelser, der er udført på den beskrevne prøve.

Den fastslår ikke:

• klinisk tolerance;
• sikkerheden ved eksponering for mennesker;
• den rette dosis;
• interaktioner;
• Effektivitet;
• langsigtede virkninger;
• nytte for den enkelte person.

Disse spørgsmål kræver andre former for beviser.

Denne regel gælder stadig, selv når analyseresultaterne er nøjagtige og peptidsammensætningen er blevet bekræftet korrekt.

En renhedstest kan karakterisere bestemte aspekter af det kemiske sammensætning.

Det kan ikke ændre den analytiske rapport til et klinisk forsøg eller en vurdering af sikkerheden ved brug hos mennesker.

Et tidspunkt bekræfter ikke holdbarhedstiden

COA beskriver normalt materialet på et bestemt tidspunkt i undersøgelsen.

Peptider kan derefter blive ændret som følge af:

• nedgradering;
• med oxygenation;
• hydrolyse;
• med deamidering;
• aggregering;
• absorption af fugt;
• strukturelle omstruktureringer;
• Andre processer afhængige af molekylets egenskaber og omgivelseskonditionerne.

Et resultat opnået på et givent tidspunkt kan således ikke bekræfte en ubegrænset stabilitet.

Holdbarhedstiden kræver data, der forbinder definerede opbevaringsbetingelser med analytisk materiale over tid.

I undersøgelsen af eksenatid blev en kromatografimetode udviklet, der viste stabilitet og karakteriserede nedbrydningsprodukterne, der dannes under flere stressforhold. [13]

Denne undersøgelse viser, hvordan nedbrydningsprodukterne kan adskilles fra det oprindelige peptid.

Det angiver dog ikke det universelle opbevaringstidspunkt for alle peptider, og kunstige stressforhold bør ikke automatisk sammenlignes med normale opbevaringsforhold.

Det stærkeste argument bør svare til styrken af beviserne

En videnskabeligt forsigtig fortolkning bør ikke gå ud over det omfang, hvorpå målingerne er foretaget.

For eksempel kan COA begrunde en erklæring om:

„I den undersøgte prøve blev der opnået et resultat for massen af hele partiklen, der var i overensstemmelse med det tilsvarende peptid, den specifikke andel af hovedområdet af partiklen i den anvendte HPLC-metode og den individuelt bestemmende indhold af peptidet.

Det er et værdifuldt sæt analytiske beviser.

Det betyder dog ikke automatisk:

„Peptidet er fuldstændig karakteriseret, er sterilt, biologisk aktivt, sikkert, stabil over tid og egnet til brug hos mennesker.”.

Det handler ikke om at sætte spørgsmålstegn ved værdien af laboratorieundersøgelser.

Man bør heller ikke forvente, at en bestemt analysemetode kan besvare ethvert muligt spørgsmål.

Det vigtigste er sammenkoblingen:

hver påstand → med en måling, der faktisk kan begrunde den,

med samtidig tydelig angivelse af spørgsmål, som ikke blev besvaret.

Ofte stillede spørgsmål

1. Betegner 99% renhed, at produktet er sikkert?

Nej. Koncentrationsprocenten beskriver prøvens sammensætning efter en bestemt analytisk metode, ikke sikkerhedspotentialet. Desuden kan denne værdi betyde en andel af det chromatografiske signal og ikke den fysiske masseandel af det målte peptid. Undersøgelser af peptidsammensætning viser, hvorfor vand, antikoagulantia og andre bestanddele kan give forskelle mellem disse værdier. [2] Uanset analytisk koncentrationsprocent kan det målte peptid også have sine egne biologiske egenskaber. Et højt konsentrationsniveau kan derfor understøtte den kemiske karakteristika for prøven, men erstatter ikke toksikologiske, farmakologiske, mikrobiologiske eller kliniske sikkerhedsdata.

2. Bekræfter HPLC steriliteten?

Nej. En rutinemæssig analyse af HPLC-peptidet opdeler og identificerer kemiske bestanddele baseret på deres kromatografiske opførsel. Den fastslår ikke, om der er levende mikroorganismer i prøven. Sterilitet er en separat egenskab, der kræver passende mikrobiologiske undersøgelser og kontrol af produktionsprocessen. FDA's retningslinjer for aseptisk produktion behandler mikrobiologisk kontrol uafhængigt af den kemiske analyse. [10] Derfor kan et rent kromatogram, en høj andel af hovedstykkeoverfladen eller den forventede retentionstid for peptidet ikke erstatte beviser for sterilitet.

3. Hvad repræsenterer egentlig procentdelen af HPLC-arealet?

Procenten af HCPL-overflade betyder normalt andelen af det integrerede signal, der er knyttet til hovedpiket i det samlede optagede kromatografiske signal. Resultatet afhænger af kvaliteten af opsamlingssystemet, detektorsvaret, bølgelængden, integrationsprincipperne, rapporteringsgrænserne og andre metoderelaterede forhold. Det betyder således ikke automatisk, at massepeptidet fysisk deltager i hele prøven. Undersøgelser af renheden af hovedpiket peptidet viser, hvorfor uløselige isomerer kan komplicere fortolkningen. [1] Procenten af HPLC-overflade bør derfor betragtes som resultatet af en specifik analytisk metode, hvis målegrundlag skal være klart defineret.

4. Kan en enkelt pik HPLC indeholde flere stoffer?

Ja. To, at to eller flere bestanddele kan eluere så tæt sammen, at de ikke bliver adskilt ordentligt i et bestemt kromatografisystem, betyder ikke, at de er identiske. Derfor er selv et visuelt symmetrisk pik ikke absolut bevis for molekylær homogenitet. Undersøgelse af cykliske peptider viste, at en anden kromatografimetode gav en anderledes måde at adskille forureninger på end RP-HPLC. [3] Det betyder ikke, at hver eneste hovedpik indeholder skjulte stoffer. Det viser blot, at adskillelseskapaciteten afhænger af metodernes selektivitet, og i tilfælde af nært beslægtede strukturer kan supplerende analytiske teknikker være nødvendige.

5. Bekræfter den korrekte molekylmasse den korrekte peptidssekvens?

Nej. Massen af hele molekylet, der svarer til den forventede værdi, udgør et værdifuldt bevis for identiteten, men den behøver ikke at bekræfte aminosyresekvensen, stereokemien, typen af slutgrupper, positionen for modifikationer eller alle andre strukturelle egenskaber. Undersøgelser af forurening med syntetiske peptider viste bestanddele med samme masse, men med modifikationer placeret på forskellige positioner, hvilket krævede yderligere analytiske oplysninger. [4] En fuldstændig vurdering af identiteten kræver derfor metoder, der er udviklet til at håndtere de specifikke strukturelle uenighedsformer i det pågældende peptid.

6. Hvordan adskiller peptidsammensætningen sig fra renheden?

Indholdet af peptidet angiver, hvor mange definerede målpeptider der findes i materialet baseret på en bestemt kvantitativ basis. Renheden kan imidlertid betyde andelen af det chromatografiske signal, der tilskrives den primære bestanddel eller en anden defineret renhedsparameter. Vand, anti-ejendomme, procesrester og strukturelt beslægtede forbindelser kan medføre, at disse værdier kan variere. Ved undersøgelse af sublanciner blev flere sådanne bestanddele målt separat under vurderingen af massebalance. [2] Resultatet for peptidindholdet og HPLC-overfladeprocenten bør derfor tolkes separat, medmindre et valideret analysesystem entydigt fastslår sammenhængen mellem dem.

7. Kan vand og antioksidanter påvirke mængden af peptidet i pulveret?

Ja. Vand og antistoffer øger den samlede fysiske masse af prøven og kan derfor reducere den del af massen, der falder på det endelige peptid, hvis resultatet angives for det materiale i den tilstand, det er fremstillet i. Undersøgelser af sublankin og peptidhormonantistoffer viser, hvorfor disse bestanddele kan kræve separat bestemmelse. [2] [9] Deres tilstedeværelse behøver ikke at betyde syntesefejl eller forurening, da antistoffet kan være en del af den tilsigtede saltsform. Vigtige spørgsmål vedrører derfor typen af den molekylære form, der analyseres, mængden af de enkelte bestanddele samt grundlaget for den anvendte beregning.

8. Er anti-jon det samme som peptidskadelige stoffer?

Ikke altid. Antijon kan være en forventet bestanddel af peptidsaltet, mens forureningen relateret til sekvensen er en anden peptidsammensætning. Disse er således forskellige analytiske kategorier, selvom begge kan påvirke prøvens samlede sammensætning. I sammenlignende undersøgelser af peptidsalter blev der observeret sekvensafhængige og saltform-relaterede forskelle i permeabilitetstestene. [9] Hvis antijon har betydning for materialets egenskaber, bør dens type og mængde rapporteres separat og ikke udledes af den chromatografiske renhed af hovedstykket af peptidet.

9. Kan almindelig massespektrometri skelne mellem D- og L-aminosyrevarianter?

Selv målingen af massen af hele partiklen giver normalt ikke mulighed for at skelne strukturer med identisk atommængde, der kun adskiller sig ved stereokemien. Varianten D og den tilsvarende variant L kan derfor have identisk molekylmasse. Hvis spørgsmålet vedrører den rumlige konfiguration, kræves en passende chiral eller stereokemisk analyse. I undersøgelser af chiraliteten i peptider blev en specielt udviklet proces anvendt, der tager højde for de stereokemiske ændringer, der opstår under prøvepræpareringen. [6] Problemet er strukturelt af natur, hvorfor en forøgelse af målingens nøjagtighed alene ikke løser denne uklare situation.

10. Hvorfor er partiets nummer på COA vigtigt?

Partienummeret eller serienummeret hjælper med at forbinde de analytiske resultater med det specifikke materiale, der er blevet undersøgt. Resultaterne for én partie kan ikke automatisk overføres til en anden partie eller til enhver beholder, der er fremstillet på et andet tidspunkt. Undersøgelser vedrørende certificerede referencematerialer vurderer sådanne egenskaber som ensartethed og stabilitet i stedet for at basere sig på en enkelt måling. [8] Det korrekte partienummer udgør derfor et vigtigt element for identifikation, selvom det ikke i sig selv beviser rigtigheden af prøveudtagningen, opbevaringen, håndteringen af materialet eller alle andre elementer i kontrolsystemet.

11. Betegner „ikke fundet” nul?

Nej. „Ikke fundet” betyder, at den anvendte metode ikke opdagede den undersøgte substans under de specifikke betingelser og inden for dens sensitivitetsgrænser. Det bekræfter ikke, at den faktiske mængde er præcis nul. Et resultat under grænseværdien for påvisning eller måling bør fortolkes sammen med den relevante grænseværdi, enhed, prøvegrundlag og analysebetingelser. Retningslinjerne for endotoksinanalyser behandler også betydningen af metodens følsomhed og eventuelle interferenser. [11] En videnskabeligt begrundet konklusion bør derfor vedrøre, hvad metoden kunne opdage, og ikke en absolut påstand om fuldstændig mangel på stoffet.

12. Hvad betyder usikkerheden ved målingen i rapporten?

Udvælgelsesusikkerhed beskriver spredningen af værdier, som på en begrundet måde kan forbindes med det opnåede resultat i overensstemmelse med den anvendte vurdering. Det betyder ikke, at laboratoriet anser sit resultat for at være forkert. Det viser blot grænserne for den numeriske sikkerhed for den pågældende vurdering. I undersøgelser af referencematerialer kan usikkerheden ved angivelsen af værdier blandt andet være forbundet med selve målingen, homogeniteten og stabiliteten. [8] Udvælgelsesusikkerheden bør derfor fortolkes sammen med dens definition, enhedene, det anvendte dækningstrin og den nøjagtigt definerede måledimension.

13. Bekræfter undersøgelsen foretaget af et uafhængigt laboratorium, at alle beholdere indeholder identisk materiale?

Nej. En uafhængig undersøgelse leverer beviser om prøver eller stikprøver, der faktisk er blevet overført til analyse. Muligheden for at overføre disse resultater til enhver beholder afhænger blandt andet af måden hvorpå prøverne er indsamlet, partiernes identifikation, ensartetheden i materialet, påfyldningsprocessen, opbevaringen og andre kontrolelementer. I udviklingen af certificerede referencematerialer vurderes ensartetheden, og ikke blot antages den ud fra en enkelt måling. [8] Laboratoriets uafhængighed kan forbedre selve målingen, men beviser det ikke automatisk, at hele partiet er identisk.

14. Kan resultaterne for sterilitet og endotoksin anvendes som alternativer?

Nej. Kontaminationsundersøgelsen vedrører levende mikroorganismer, mens undersøgelsen af bakterieendotoksiner vedrører bestemte bakteriebestanddele, som kan være til stede i materialet selv ved fravær af levende bakterier. Dette er altså to separate analytiske spørgsmål. Inden for måling af bakterieendotoksiner kan der desuden påvirkes interferens fra prøveopløsningens matrix, hvorfor det er vigtigt at tilpasse metoden korrekt. [11] Ingen af disse to aspekter kan udledes af den almindelige renhedskarakterisering af HPLC. Hvis disse undersøgelser er udført, skal de rapporteres separat.

15. Bekræfter kemisk renhed den biologiske aktivitet?

Nej. Kemisk analyse og funktionel undersøgelse giver andre typer af informationer. En peptid kan have den forventede molekylmasse og høj kromatografisk renhed uden bekræftet virkning i en bestemt biologisk test. I undersøgelsen af BPTI blev strukturel og biofysisk karakterisering kombineret med en trypsinhemmingstest i stedet for at antage, at et enkelt analyseresultat er tilstrækkeligt til alle konklusioner. [12] Funktionelle beviser er desuden specifikke for den undersøgte molekyle, det eksperimentelle system og den konkrete test. En prøve af høj renhed bør derfor ikke betragtes som funktionelt bekræftet, hvis den relevante aktivitet ikke faktisk er undersøgt.

16. Bekræfter COA, at peptidet forbliver stabilt i uendelighed?

Nej. COA beskriver prøven på det tidspunkt eller på det niveau i undersøgelsen, der er angivet i rapporten. Under senere opbevaring kan peptidet nedbrydes, blive oxideret, hydrolyseres, aggregere sig, optage fugt og gennemgå andre ændringer afhængigt af dets egenskaber og miljø. Undersøgelser af eksenatids nedbrydning har vist betydningen af metoder, der angiver stabilitet, som kan adskille nedbrydningsprodukterne fra den oprindelige molekyle. [13] Stressforsøg definerer dog ikke automatisk opbevaringstiden under normale forhold. Enhver påstand om holdbarhedstid kræver relevante stabilitetsdata opnået under bestemte betingelser og tidspunkt.

17. Hvad skal man først kontrollere, når man sammenligner to COA-peptider?

Først er det værd at sammenligne prøveidentiteten, partiantallet, de anvendte analytiske metoder, enheder og målegrundlaget, i stedet for straks at sammenligne de største procentvise værdier, der er synlige på dokumenterne. To rapporter kan give en værdi, der defineres som „renhed”, og samtidig måle andre egenskaber eller have forskellige evner til at skelne mellem forskellige klasser af forurening. Undersøgelser, der anvender ortogonale kromatografimetoder og måling af massebalance, viser betydningen af disse forskelle. [2] [3] Uden at fastslå, om begge tal vedrører den samme størrelse og er tilstrækkeligt sammenlignelige metoder, kan en direkte sammenligning af procenttallet være misvisende.

18. Betegner 99% purity HPLC 99% peptidindhold?

Nej. Resultatet 99% HPLC betyder normalt, at 99% af de indberettede svar fra det kromatografiske detektor er tilskrevet hovedpikken. Et resultat på 99% peptidindhold kræver imidlertid en kvantitativ måling, der viser, at det målte peptid udgør 99% af den relevante prøvevolumen i overensstemmelse med en klart defineret grundlag. Vand, antistoffer, reststoffer og andre bestanddele kan øge prøvens fysiske masse uden at påvirke den relative andel af RP-HPLC-UV-overfladeområdet proportionalt. [2] Derfor kan begge værdier variere betydeligt, selvom ingen af målingerne behøver at være fejlagtige.

19. Kan et peptid gennemgå HPLC-renhedstest og alligevel have en ukorrekt stereokemi?

Potentielt setningsvis. Den konventionelle RP-HPLC behøver ikke at opdele alle stereokemiske varianter, især når molekylerne har meget lignende fysisk-kemiske egenskaber. På samme måde tillader almindelig måling af massen af en hel molekyle ikke at skelne mellem stereoisomerer med identisk grundstofindhold. Forskning om stereokemisk renhed af peptider viser, hvorfor specialiserede metoder og nøjagtig kontrol af prøvepræpareringen kan være nødvendige. [6] Om en bestemt HCPL-metode kan opdele en given stereoisomer afhænger af metodernes påviste selektivitet, og ikke kun af faktum at man har foretaget en HPLC-analyse.

20. Bekræfter COA, at hele partiet er identisk med den undersøgte prøve?

Ikke selvstændigt. COA præsenterer resultaterne for den prøve og den partikonsistens, der er angivet i den analytiske dokumentation. At udvide disse resultater til hele partiet kræver et passende prøveudtagningssystem, konsistens i processen, ensartethed, identifikation og andre produktionskontroller. Udarbejdelsen af referencematerialer viser, hvorfor konsistens vurderes som en separat egenskab og ikke bare som en forudsætning. [8] COA kan derfor levere vigtige analytiske beviser vedrørende partiet, men kraften i konklusionerne, der omfatter hele materialet, afhænger af et bredere kvalitetssystem, der forbinder den undersøgte prøve med partiet repræsenteret i rapporten.

Begrænsninger i fortolkningen af peptids renhed og COA

Når peptidernes analytiske rapporter fortolkes, er der flere begrænsninger at huske på.

For det første afhænger renheden af metoden. Resultatet fra RP-HPLC-UV beskriver det, som det specifikke kromatografiske system og detektoren har målt. En anden separationsmekanisme kan afsløre bestanddele, som den første metode ikke har kunne opdele. [1] [3]

For det andet har den kromatografiske overflade og den fysiske masse forskellige målestrukturer. Vand, antistoffer, reststoffer fra andre stoffer samt forskelle i detektorens respons kan medføre, at procentdelen af HPLC-overfladen ikke svarer til den maksimale masse af det målte peptid. [2]

For det tredje udgør den forventede molekylmasse et stærkt, men ikke fuldstændigt bevis på identitet. Isomerer, positionelle varianter og stereokemiske forskelle kan kræve anvendelse af yderligere strukturelle metoder. [4] [5] [6]

For det fjerde kan selv analytiske metoder give artefakter. Fremstillingen af prøven, hydrolysen, derivatiseringen, opbevaringen og håndteringen af materialet kan ændre analysen eller den undersøgte egenskab. [6]

Femte, en undersøgt prøve er ikke automatisk sammenlignelig med enhver beholder eller det samme materiale på et senere tidspunkt. Enhed, partiel identifikation og stabilitet er separate aspekter. [8]

Seksielt, kemiske undersøgelser besvarer ikke mikrobiologiske spørgsmål. HPLC og massespektrometri bekræfter hverken steriliteten eller niveauet af endotoksiner. [10] [11]

Siddende syv, bekræfter den kemiske karakteristika ikke biologisk aktivitet eller klinisk sikkerhed. Dette er separate emner, der kræver andre former for beviser. [12]

Endelig bekræfter resultatet opnået på et enkelt tidspunkt ikke langsigtet stabilitet. Evaluering af stabiliteten kræver relevante data, der er indsamlet over tid og under bestemte betingelser. [13]

Disse begrænsninger betyder ikke, at COA er ubetydeligt værdifuldt.

De forklarer imidlertid, hvordan det skal tolkes korrekt.

Sammenfatning

Peptidanalysens certifikat er mest nyttigt, når det betragtes som en samling af separate analysemålinger og ikke som en enkelt kvalitetsvurdering.

Den oprindelige værdi for renhed er kun begyndelsen på en fortolkning.

Et resultat som 99% RP-HPLC-overflader beskriver fordelingen af detektorens respons i en bestemt kromatografimetode. Det betyder ikke automatisk, at 99% fysisk masse af pulveret udgør det ønskede peptid.[1][2]

Massespektrometri kan give stærke beviser vedrørende molekylmasse og visse strukturelle egenskaber, men en overensstemmelse mellem hele molekylets masse og den forventede værdi bekræfter ikke automatisk alle aspekter af sekvensen, ende-strukturen, stereokemi eller molekylær binding.[4][5][6]

Indholdet af peptidet kræver sin egen kvantitative basis.

Vand, anti-ions, reststoffer af andre stoffer og beslægtede peptidskefter kan påvirke forholdet mellem den mængde af det modige materiale og den faktiske mængde af det målte peptid. [2] [7] [9]

Derfor er det værd at stille flere separate spørgsmål under læsning af COA:

Hvilken prøve blev undersøgt?

Hvilken parti gælder det for?

Hvilken analytisk metode blev brugt?

Hvad betyder den rapporterede procentvise værdi præcis?

Hvilke enheder og hvilken beregningsgrundlag blev brugt?

Er molekylær identitet undersøgt uafhængigt af kromatografisk renhed?

Er det blevet målt den faktiske indhold af peptidet?

Er der i de relevante tilfælde målt vand eller anti-oxider?

Er stereotyper vurderet, hvis de har betydning for det pågældende stof?

Hvilke egenskaber er ikke blevet undersøgt?

Det er særligt vigtigt at skelne mellem „ikke fundet” og „ikke undersøgt”.

Fravær af resultat bør ikke tolkes som bevis for en positiv test.

På samme måde kan en undersøgelse udført af et uafhængigt laboratorium udgøre en værdifuld ekstra informationskilde, men selv betegnelsen „third-party tested” beskriver ikke metoden til prøveudtagning, dens sammenhæng med partiet, analyseomfanget, ensartetheden eller om resultatet kan overføres til enhver beholder.

Rutinemæssige kemiske metoder har også tydelige grænser.

HPLC bekræfter ikke steriliteten.

HPLC-renheden bekræfter ikke niveauet af endotoksiner.

Den kemiske renhed bekræfter ikke biologisk aktivitet.

COA er ikke en vurdering af den kliniske sikkerhed.

Et enkelt analyseresultat opnået på et bestemt tidspunkt bekræfter ikke uendelig stabilitet. [10] [11] [12] [13]

Den videnskabeligt mest begrundede fortolkning er således altid så bred som de tilgængelige beviser tillader – og ikke bredere.

En veldokumenteret analytisk rapport kan give kraftige oplysninger om identiteten, sammensætningen og mængden af materialet i den undersøgte prøve.

Dens værdi stiger, når de anvendte metoder, målegrundlaget, materialets identifikation og begrænsningerne ved de enkelte test tydeligt beskrives.

Den vigtigste regel er simpel:

Identitet, renhed, mængde, stereokemi, mikrobiologisk status, biologisk aktivitet, stabilitet og sikkerhed er forskellige spørgsmål. Et troværdigt analysecertifikat hjælper med at besvare spørgsmål, som faktisk er blevet undersøgt – det bør ikke bruges til at antyde svar på spørgsmål, som ikke er blevet undersøgt.

Ansvarsfraskrivelse

Artikelet har udelukkende en uddannelsesmæssig og videnskabelig-informativ karakter. Det forklarer de generelle principper for analytisk kemi vedrørende peptider, fortolkningen af analysecertifikater (COA), HPLC-kromatografi, massespektrometri, bestemmelse af peptidinholdet, påvisning af forureninger, identifikationsmuligheder for materialet samt relaterede undersøgelsesmetoder. Det er ikke en medicinsk rådgivning, produktanbefalinger, sikkerhedsvurderinger, produktgodkendelser eller bekræftelse af, at enhver peptid eller materiale, der indeholder en peptid, er egnet til brug hos mennesker. Analytiske resultater bør altid fortolkes i forhold til den specifikke prøve, partiet, den anvendte metode, målegrundlaget, specifikationerne, det analyserede analytiske problem og begrænsningerne ved den udførte test.

Referencer

1. Petersson, P., Buckenmaier, S., Euerby, M. R., & Stoll, D. R. (2023). En strategi til at måle den maksimale renhed af farmaceutiske peptider i metoder med omvendt fase-kromatografi ved brug af todimensionel flydende kromatografi kombineret med massespektrometri. Del I: Udvælgelse af kolonner og mobile faser. Journal of Chromatography A, 1693, Artikel 463874. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2023.463874
2. Chen, W., Yan, J., Yang, M., Wang, M., Zhou, J., Li, F., & Li, L. (2026). SI-sporbar renhedsberegning for peptidet sublancin ved hjælp af en massebalancemetode og isotopfortyndingsmassespektrometri baseret på aminosyreanalyse. Journal of Chromatography B, 1277, Artikel 125038. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2026.125038
3. Yoshida, K., Kato, S., Nagai, K., Shimamoto, S., Onishi, T., & Ohnishi, A. (2025). Profilering af urenheder i syntetiske cykliske peptider baseret på orthogonality mellem hydrofil-interaktion og reversfasevæskekromatografi. Journal of Chromatography A, 1745, Artikel 465748. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2025.465748
4. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Karakterisering af urenheder i et syntetisk renin-substratpeptid ved hurtigatom-bombardement-massespektrometri og hybrid tandem-massespektrometri. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
5. Kuyama, H., Nakajima, C., Nakazawa, T., Nishimura, O., & Tsunasawa, S. (2009). En ny metode til påvisning af C-terminal amidering af proteiner og peptider ved massespektrometri i forbindelse med kemisk derivatisering. Proteomik, 9(16), 4063–4070. https://doi.org/10.1002/pmic.200900267
6. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G. & Crowther, J. B. (1995). Peptid-kiralitetsbestemmelse: Hydrolyse i deuterat syre, derivatisering med Marfey’s reagens og analyse ved brug af højtydende flydende kromatografi-elektrospray-ionisations-massespektrometri. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
7. Li, M., Josephs, R. D., Daireaux, A., Choteau, T., Westwood, S., Martos, G., Wielgosz, R. I., & Li, H. (2021). Strukturelt relateret identifikation af peptideleusker og nøjagtig kvantificering af syntetisk oxytocin ved flydende kromatografi-massespektrometri med høj opløsning. Analytisk og bioanalytisk kemi, 413(7), 1861–1870. https://doi.org/10.1007/s00216-021-03154-5
8. Xiao, P., Chen, J., Wu, P., Zhang, W., Sun, Z., Ma, J., & Li, H. (2024). Udvikling af et SI-sporbart N-terminalt pro-B-type natriuretisk peptid-certificeret referencemateriale ved hjælp af strukturbaserede, urenhedskorrigerede isotopfortyndelsesmålingsmetoder med massespektrometri. Analytisk og bioanalytisk kemi, 416(14), 3447–3458. https://doi.org/10.1007/s00216-024-05295-9
9. Erckes, V., Streuli, A., Chamera Rendueles, L., Krämer, S. D., & Steuer, C. (2025). Modtænkelige fremgangsmåder til analyse og udveksling af TFA som en modion i syntetiske peptider og dens indflydelse på membranpermeabilitet. Lægemidler, 18(8), Artikel 1163. https://doi.org/10.3390/ph18081163
10. U.S. Food and Drug Administration. (2004). Sterile lægemiddelprodukter fremstillet ved aseptisk behandling — Gældende god fremstillingspraksis: Vejledning for industrien. Officiel vejledning
11. U.S. Food and Drug Administration. (2026). Testning af pyrogener og endotoksiner: Spørgsmål og svar – Vejledning til industrien. Officiel vejledning
12. Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). Fusionssyntese i fast fase af bovin pankreatisk trypsininhibitor (BPTI) og to analoger. En kemisk tilgang til at evaluere disulfidbroernes rolle i proteinfoldning og stabilitet. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. PubMed-optegnelse
13. Badgujar, D., Maskar, T., Paritala, S. T., & Sharma, N. (2024). Udvikling og validering af en stabilitetsindikerende analysemetode og identifikation af kraftnedbrydningsprodukter fra det syntetiske glukagonlignende peptid-1-analog Exenatide ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med en Orbitrap-massemåler. European Journal of Mass Spectrometry, 30(3–4), 171–186. https://doi.org/10.1177/14690667241262935