Peptiders renhet och laboratorietester: Så läser du ett analyscertifikat (COA)

Peptidens renhet beskriver sammansättningen av ett prov bestämt med en specifik analytisk metod. Den bekräftar inte i sig peptidens fullständiga identitet, den faktiska mängden peptid i provet, steriliteten, den biologiska aktiviteten, stabiliteten eller säkerheten. Ett analyscertifikat, oftast förkortat COA, är som mest användbart när varje resultat som anges i det behandlas som ett svar på en specifik analytisk fråga.

Därför kräver en uppgift som „99% renhet” ett lämpligt sammanhang.

Betyder 99% att den största kromatografiska ugnstoppen står för 99% av det totala integrerade detektorsvaret vid HPLC-analysen? Representerar detta värde massandelen av målpeptiden efter korrigering för vatten, motjoner och andra beståndsdelar? Har den stereokemiska renheten utvärderats? Vilken typ av föroreningar kan metoden upptäcka, och vilka kan ligga utanför dess räckvidd?

Dessa distinktioner är viktiga eftersom flera olika parametrar i talspråk brukar kallas med samma ord „renhet”, trots att de i själva verket beskriver olika egenskaper hos provet.

Studier om peptidanalys visar varför detta är viktigt. Strukturellt liknande orenheter kan ibland förbli dolda i en skenbar enkel kromatografisk topp, medan vatten, motjoner, restprodukter från andra substanser och besläktade föreningar kan påverka den totala massan av det isolerade peptidmaterialet. [1] [2]

Detta är skilda analytiska problem och de kräver olika typer av bevis.

Därför är det vid bedömningen av ett COA för en peptid mer användbart än bara frågan:

„Vad är renhetsprocenten?”

Det finns en fråga:

„Vad mättes exakt, med vilken metod, i vilken provmängd och vilken slutsats följer faktiskt av denna mätning?”

Vad betyder egentligen peptidrenhet?

Renlighet är ett resultat baserat på en specifik metod

Ordet „renhet” kan tyda på en enda, lätt mätbar egenskap. I praktiken kan dock laboratorier uttrycka peptidens renhet på flera olika sätt.

Det kan bland annat vara:

• procent av den kromatografiska ytan;
• masshalt;
• kemisk renhet;
• stereoisomer renhet;
• sekvensassocierad föroreningsprofil;
• renhet bestämd enligt en specifik analytisk metod.

Dessa värden ska inte betraktas som utbytbara.

Kromatografisk renhet beskriver vanligtvis den del av det integrerade detektorsvaret som kan hänföras till provets huvudkomponent.

Massehalten anger massan av en specifik substans i förhållande till den totala massan av det undersökta materialet.

Stereokemisk renhet avser i stället andelen av olika rumsliga konfigurationer av molekylen eller de aminosyrarester som utgör den.

Därför bör korrekt presenterad information om renlighet, om möjligt, besvara fyra frågor:

vad som mättes + hur det mättes + hur resultatet beräknades + vilken provstorlek som undersöktes.

Enbart konstaterandet:

„99% renhet”

förmedlar betydligt mindre information än:

„99 % av huvudtoppens area enligt RP-HPLC-UV”.

Inte ens den andra versionen besvarar dock alla frågor.

Det är också nödvändigt att veta om den använda kromatografiska metoden var kapabel att separera relevanta föroreningar och om den använda detektorn kunde upptäcka dem.

Vad betyder procenten av peak-arean i HPLC?

Förenklat kan beräkningen baserad på toppytebalansering uttryckas som:

area för huvudtoppen ÷ den totala arean för de inkluderade topparna × 100.

Om huvudtoppen har tilldelats 990 areaenheter och summan av den integrerade kromatografiska signalen är 1000 enheter, blir huvudtoppens area:

990 ÷ 1000 × 100 = 99%.

Detta är information om detektorsvaret som erhålls under givna kromatografiska förhållanden.

Det betyder inte automatiskt att:

99% av pulverets fysiska massa utgörs av målpeptiden.

Det finns flera anledningar till denna skillnad.

Olika kemiska föreningar kan generera olika detektorsvar per massenhet.

Vissa komponenter i provet kan ha svag absorption av strålning vid den använda våglängden.

De kan komma att uteslutas helt från kromatografiska beräkningar.

Vissa föroreningar kan också elueras tillsammans med huvudkomponenten.

Det är också viktigt med ordet „inkuderade”.

Kromatografiska beräkningar beror på beslut om:

• toppintegrering;
• rapporteringsgränserna;
• val av baslinje;
• lösningsmedelsrelaterade signaler;
• oidentifierade toppar;
• detektorinställningar;
• principen om att undkomma specifika signaler.

Därför bör procentandelen av ytan HPLC tolkas som resultatet av en specifik kromatografisk metod och inte som en universell beskrivning av hela provets fysiska sammansättning.

Besläktade orenheter kan vara svåra att separera

Föroreningar som förekommer i peptider kan vara strukturellt mycket lika den avsedda molekylen.

De kan bland annat omfatta:

• deletionssekvenser;
• förkortade sekvenser;
• modifierade sidokedjor;
• oxiderade former;
• modifierade ändgrupper;
• ställningsisomerer;
• stereoisomeri;
• produkter för ofullständig avsäkring;
• andra varianter som uppstår under peptidsyntes nedbrytningshastighet.

Några av dessa strukturer kan skilja sig avsevärt från målpeptiden i sitt kromatografiska beteende.

Andra kan bete sig väldigt lika.

I en studie användes tvådimensionell vätskekromatografi kopplad till masspektrometri för att utvärdera renheten hos den huvudsakliga peptidtoppen. Forskarna tillämpade ytterligare separationsförhållanden eftersom peptidisomerer med samma mass-laddningsförhållande inte kunde särskiljas enbart med hjälp av rutinmässig massmätning. [1]

I en annan studie som omfattade fyra syntetiska cykliska peptider jämfördes omvänd fas-kromatografi med hydrofil interaktionskromatografi.

Båda metoderna separerade föroreningarna på olika sätt. [3]

Det betyder inte att en av dessa teknikerna alltid är bättre.

Det visar däremot ett fenomen av komplementär selektivitet: två analytiska metoder kan separera samma blandning olika eftersom de utnyttjar de undersökta molekylernas olika fysikalisk-kemiska egenskaper.

Därför:

ett rent kromatogram betyder inte nödvändigtvis frånvaron av alla strukturellt liknande föroreningar.

Vatten och motjoner påverkar också materialets sammansättning

Det isolerade peptidmaterialet kan innehålla beståndsdelar som inte är ytterligare peptidsekvenser.

Viktiga exempel inkluderar:

• vatten;
• motjonar;
• lösningsmedelsrester;
• oorganiska ämnen;
• inklusive komponenter som är relaterade till produktionsprocessen.

Motjon är en jon med motsatt elektrisk laddning, bunden till peptidens laddade grupper.

Inom peptidkemins värld kan man till exempel stöta på acetat eller trifluoracetat.

Deras närvaro behöver inte innebära ett syntesfel eller en kontaminering. Peptiden kan avsiktligt förekomma i en viss saltform.

Dessa ingredienser är dock av betydelse när vi vill besvara frågan:

Hur mycket av målpeptiden finns det faktiskt i den uppvägda mängden material?

Tolkningen beror således på om det rapporterade värdet avser:

• samma peptid;
• peptidsalt;
• torrt material;
• vattenfritt material;
• leveranstillstånd.

I en studie av sublantycin från 2026 kvantifierade forskare vatten, trifluoracetat, organiska föreningar och oorganiska föroreningar som en del av en bredare massbalansanalys. [2]

Den slutgiltigt tilldelade peptidandelen var betydligt lägre än 100%, trots att strukturellt besläktade organiska föroreningar utgjorde en förhållandevis liten del av materialet.

Detta är ett praktiskt exempel på en viktig skillnad:

En ren kromatografisk peptidprofil och en hög massandel av målpeptiden är inte samma parameter.

Renhetsgraden är inte en säkerhetssannolikhet

Procentandelen som anger renheten säger inget om sannolikheten för att det givna materialet är säkert.

Exempelvis betyder inte en renhet på 99%:

„99% säkerhet”.

Den informerar inte heller om den biologiska betydelsen av varje ämne som finns i det återstående %.

En liten mängd av en viss förening kan ha större analytisk eller biologisk betydelse än en större mängd av en annan förening, beroende på:

• sin identitet;
• biologisk aktivitet;
• koncentrationer;
• exponeringsvägar;
• planerad användning;
• andra kontextuella faktorer.

På samma sätt kan en korrekt identifierad molekyl med mycket hög kemisk renhet själv ha specifika biologiska egenskaper.

Kemisk renhet och biologisk säkerhet besvarar därmed helt olika frågor.

Renhetsanalysen används för att karakterisera ett prov med avseende på tillämpligheten av den använda analytiska metoden.

Den omvandlar inte det kemiska resultatet till en generell bedömning av mänsklig säkerhet.

HPLC i masspektrometri

Vad kan HPLC berätta för oss?

Högeffektiv vätskekromatografi (HPLC) separerar provkomponenter baserat på skillnader i deras interaktioner med en stationär fas och en rörlig fas under flöde.

Vid analys av peptider används ofta HPLC-kromatografi med omvänd fas (RP-HPLC), ofta i kombination med UV-detektion.

Kromatogramet visar detektorns respons som funktion av tiden.

Man kan få fram viss viktig information från den.

Retentionstiden indikerar den tidpunkt då ett visst ämne lämnar kromatografisystemet under givna förhållanden.

Toppytan representerar det integrerade detektorsvaret.

Toppens form ger information om substansens kromatografiska beteende.

Upplösning beskriver hur effektivt närliggande komponenter separeras från varandra.

Retentionstiden är dock inte ett unikt molekylärt „fingeravtryck”.

Olika molekyler kan ibland eluera vid liknande tidpunkter.

Samma peptid kan också uppvisa andra retentionstider efter ändring:

• kolumner;
• sammansättning av den rörliga fasen;
• gradient;
• flödeshastigheter;
• temperaturer;
• konfigurering av utrustning;
• andra metodparametrar.

Studier som jämför olika system för peptidseparation visar hur starkt kromatografisk selektivitet beror på den använda metoden. [1]

Retentionstidens överensstämmelse kan därför stödja identifiering i lämpligt sammanhang, men den bör inte automatiskt betraktas som en fullständig bekräftelse av strukturen.

Varför behöver en topp inte betyda ett ämne?

Samtidig elution (koelution) förekommer när två eller flera komponenter lämnar kromatografisystemet vid så nära tidpunkter att de inte separeras ordentligt.

Som ett resultat kan de se ut som en enda topp.

Även en visuellt symmetrisk huvudtopp bevisar därför inte automatiskt att hela signalen kommer från en enda typ av molekyl.

Sammansättningen av en topp kan undersökas mer noggrant genom att:

• förändring av kromatografisk selektivitet;
• användning av en annan stationär fas;
• analys vid flera våglängder;
• gaskromatografi-masspektrometri;
• tvådimensionell kromatografi;
• användning av en annan kompletterande analytisk teknik.

Ingen av dessa metoder upptäcker dock automatiskt varje möjlig förorening.

Nära besläktade föreningar kan ha:

• liknande retentionstid;
• liknande UV-spektra;
• identisk nominell massa;
• delade gemensamma analytiska egenskaper.

En studie av cykliska peptider, som jämförde omvänd fas-kromatografi med kromatografi med hydrofila interaktioner, visade tydligt olika elueringsprofiler för orenheter. [3]

Detta betyder inte att varje huvudtopp döljer ytterligare föroreningar.

Slutsatsen är mer exakt:

Kromatogrammets skenbara enkelhet är ett resultat som erhållits i ett enda separationssystem, och tillämpningen av en annan selektivitet kan avslöja komponenter som den första metoden inte separerade.

Vad mäter masspektrometri?

Masspektrometri (MS) detekterar joner baserat på deras mass-laddningsförhållande, skrivet som m/z.

Under analysen kan en peptid ha mer än en elektrisk laddning.

Därför kan en enda peptidmolekyl generera flera signaler som motsvarar olika laddningstillstånd, istället för en enda topp som direkt motsvarar den neutrala molekylmassan.

En lämplig datatolkning gör det möjligt att återställa eller bekräfta den grundläggande molekylvikten.

Masspektrometri kan ge värdefull information om:

• molekylmassans;
• av vissa kemiska modifieringar;
• specifika föroreningar;
• isotopmönstren;
• beteenden vid fragmentering.

Masspektrometri med hög upplösning gör det möjligt att noggrannare skilja mellan molekyler med mycket likartade massor.

Tandemmasspektrometri (MS/MS) går ut på att fragmentera utvalda joner och analysera de resulterande produkterna, vilket ger ytterligare strukturell information.

Men en viktig regel gäller fortfarande:

observerandet av den förväntade molekylvikten ≠ bevis på en komplett molekylstruktur.

Olika strukturer kan ha samma massa.

Stereokemiska förändringar kanske inte påverkar grundämnessammansättningen.

Positionsisomerer kan också kräva ytterligare bevis.

Studier av föroreningar hos en syntetisk peptid som fungerar som reninsubstrat visade denna begränsning. För att skilja mellan modifieringar som förekommer i olika positioner i den isobara blandningen behövdes ytterligare information från fragmentering och derivatisering. [4]

Sekvens, ändgrupper och stereokemi

En peptidskonstitution omfattar mycket mer än bara dess namn.

Viktiga strukturella egenskaper kan vara:

• aminosyrensekvens;
• konfiguration av enskilda aminosyror;
• N-terminal struktur;
• C-terminal struktur;
• sidokedjemodifikationer;
• disulfidbryggors placering;
• cyklisering;
• böjning;
• inre kovalenta egenskaper.

Ett exempel är att en peptid med en C-terminal karboxylsyra är en kemiskt annan molekyl än motsvarande peptid med en C-terminal amid.

Forskare har utvecklat en derivatiseringsassisterad masspektrometrimetod just för att effektivare kunna skilja mellan dessa slutformer. [5]

Detta visar en viktig princip:

Den analytiska metoden bör väljas för den specifika strukturfrågan.

Stereokemin utgör en extra utmaning.

En peptid innehållande en D-aminosyra och dess motsvarande variant med en L-aminosyra kan ha identisk molekylvikt och samtidigt skilja sig åt i atomernas rumsliga arrangemang.

I en studie om peptiders stereokemiska renhet användes en metod som utformats på ett sådant sätt att den tog hänsyn till den racemisering som uppstår under provets hydrolys. [6]

Utan en sådan kontroll skulle själva provberedningen kunna förändra den egenskap som man försökte mäta.

En tillförlitlig peptidanalys beror därför inte bara på apparatens parametrar, utan också på korrekt provberedning och metoddesign.

LC-MS kombinerar fördelarna med två metoder, men tar inte bort alla begränsningar

Vätskekromatografi kopplad till masspektrometri (LC-MS) kombinerar kromatografisk separation med massanalys.

Det kan därmed ge betydligt mer information än någon av dessa metoder som används separat.

LC-MS kan bland annat hjälpa till med:

• att tillskriva vissa massor till föroreningspunkterna;
• distinguera kromatografiskt likartade beståndsdelar med olika massor;
• studera nedbrytningsprodukterna;
• karakterisera föroreningarna relaterade till sekvensen;
• stödja strukturella tilldelningar.

I en studie av syntetisk oxytocin identifierades och mättes kvantitativt 18 strukturellt relaterade föroreningar med hjälp av en intern validerad LC-metod kombinerad med högpresterande masspektrometri (HPLC-MS). [7]

Forskarna förklarade också varför dessa föroreningar borde beaktas vid bestämningen av referensmaterialets renhet.

Disse resultaten gäller dock en specifik provtagningsmetod och en specifik föroreningsprofil.

De bör inte betraktas som en universell lista över föroreningar som förekommer i varje material som innehåller oxytocin.

LC-MS är alltså en oerhört användbar kombination av analytiska tekniker.

En bra LC-MS-rapport bör dock fortfarande kunna förklara:

• det som har mätts;
• hur de olika punkterna har fördelats;
• hur de föreslagna strukturerna identifierats;
• om tilldelningarna har bekräftats;
• vilken kvantitativ metod som använts;
• vilka analytiska begränsningar kvarstår.

Identitet, renhet och kvantitet är olika parametrar

Identitet svarar på frågan: vilken molekyl är närvarande?

Denna identitetsundersökning syftar till att besvara frågan om materialet som analyseras motsvarar den avsedda substansen.

Beroende på peptidet och det undersökta problemet kan bevisen om identitet omfatta:

• massan av hela partikeln;
• fragmenterade data;
• analys av sekvenserna;
• karakterisering av slutgrupper;
• aminosyrekompositionen;
• disulfidbryggors placering;
• spektroskopiska data;
• kromatografisk jämförelse med referensmaterialet;
• En kombination av flera metoder.

En metod kan bekräfta en viss aspekt av identiteten utan att avgöra alla andra strukturella frågor.

Till exempel:

„den förväntade massan för hela partikeln observerades”

det är en mer begränsad slutsats än:

„en fullständig molekylär struktur har bekräftats”.

Studier av slutlig amidering och isobariska peptidsföroreningar visar varför denna skillnad är viktig. [4] [5]

I båda fallen behövdes information som gick utöver själva observationen av en massiv ökning nära den förväntade nivån.

Renhet besvarar frågan: Vad finns det mer i provet?

Renhetsanalys studerar provens sammansättning inom ett visst analysområde.

Enligt metoden kan rapporten presentera:

• huvudkomponenten;
• enskilda föroreningar;
• den totala mängden av observerade föroreningar;
• procentandelen av huvudområdets yta;
• stereokemiska föroreningar;
• relaterade substanser;
• Den totala massiva andelen.

Olika klasser av föroreningar kan kräva olika metoder.

En kromatografimetod som är optimerad för att upptäcka deleterande sekvenser behöver inte vara lämpad för frågor om stereokemi.

Metoden baserad på massa kan inte skilja mellan isomerer.

Den kiraliska metoden kan dock ge endast lite information om vattenhalten.

Syftet med att använda kompletterande metoder är alltså inte bara att samla in fler resultat.

Det handlar om att få svar på olika analytiska frågor som en enda metod inte kan besvara självständigt.

Antalet motsvarar frågan: hur många substanser finns det?

Antalet kan avse flera olika parametrar.

Det kan betyda:

• peptidsammansättningen i lösningen;
• den totala mängden peptid i behållaren;
• massaandel av det målade peptidet;
• molsvikt;
• antal per volymenhet;
• ett annat tydligt definierat kvantitativt parameter.

Var och en av dessa metoder kräver en lämplig enhet och en grundläggande beräkningsmetod.

Volymmässig kromatografisk märkning kräver vanligtvis lämplig kalibrering och bör inte baseras enbart på standardisering av pikytäckningen.

I lämpligt utformade metoder kan även följande bidra till att fastställa mängden:

• aminosyreanalys;
• kvantitativ magnetisk resonans av kärnan;
• metoder för att beräkna isotopförskjutningen;
• andra godkända kvantitativa metoder.

Det är viktigt att notera att närbesläktade peptidskador kan påverka vissa kvantitativa mätningar.

Studier av oxytocins renhet betonade behovet av att korrigera resultaten för sådana föroreningar i stället för att anta att varje mättatamin eller analytisk signal härrör enbart från den målmolekyl som används [7].

Exempel: procentandel av HPLC-ytan och den faktiska mängden av peptidet

Tänk dig en hypotetisk peptidsuspension där man har erhållit:

RP-HPLC-UV, huvudskärmens yta = 99,0%

och

Oberoende av bestämd massandel av det målade peptidet = 78,0% i det erhållna materialet.

Dessa resultat behöver inte vara motstridiga.

De har olika namn och svarar på olika analytiska frågor.

Om man utvärderade 10,0 mg av detta hypotetiska pulver och den validerade massandelvärdet för det målade peptidet är 78,0%, skulle mängden av peptidet som härrör från denna mätning vara:

10,0 mg × 0,780 = 7,80 mg.

Det borde inte automatiskt accepteras:

10,0 mg × 0,990 = 9,90 mg

Enbart därför att huvudpunkten stod för 99,0% av den inkluderade UV-ytan.

Detta är endast en analytisk illustration och beskriver inte någon särskild kommersiell produkt eller experimentell material.

Studien av sublansin utgör ett verkligt exempel på principen som ligger till grund för denna skillnad, eftersom vid bedömningen av materialets sammansättning beaktades bland annat vatten och antijoner [2].

De numeriska värdena från denna studie får inte överföras till andra peptider.

Mätosäkerhet och mätkonstans

Analytiska resultat bör inte betraktas som värden med oändlig noggrannhet.

Detta är en uppskattning som erhålls genom en specifik mätmetod.

Mätosäkerhet beskriver det intervall eller den spridning av värden som på ett välgrundat sätt kan kopplas till mätresultatet enligt den tillämpliga bedömningsmetoden.

Det betyder inte att laboratoriet vet att resultatet är felaktigt.

Det informerar däremot om gränserna för numerisk säkerhet.

Mätkonstans avser den dokumenterade kopplingen mellan resultatet och det tillämpliga referensvärdet genom en kalibreringskedja.

Det hjälper till att säkerställa jämförbarheten hos mätningarna, men endast för den specifika parameter som faktiskt mätts samt för en fast referenskedja.

I studien om utveckling av referensmaterialet NT-proBNP kombinerades isotopförtydningsmetoder med korrigering för föroreningar och en bedömning av materialets homogenitet och stabilitet [8].

Det visar varför en trovärdig värdering av kvantitet kräver mycket mer än bara att läsa av det antal som genereras av enheten.

Hur läser man COA-analyscertifikatet?

Börja med att identifiera provet och partiet

Innan någon analysresultat ska tolkas måste man fastslå vilken del av materialet som faktiskt har undersökts.

En användbar COA bör kombinera resultaten med identifierande information, såsom:

• namn eller beskrivning av materialet;
• provets identifierare;
• parti- eller serielängden;
• lämpliga datum;
• strukturell form;
• saltform, om det spelar någon roll;
• ändringar av ändpunkter eller andra väsentliga strukturella egenskaper.

Detta är viktigt eftersom analysresultaten avser den prov som faktiskt testades.

En certifiering av en parti inte direkt bekräftar sammansättningen av en annan part.

På samma sätt visar analysen av ett prov av den sammanställda materialen inte automatiskt mängden eller tillståndet hos materialet i varje enskilt behållare som sedan fylls, såvida inte provtagnings-, fyllnings-, homogenitetsbedömnings- och processkontrollsystemet motiverar en sådan slutsats.

Det handlar om frågor som rör materialets sammanhang och identifierbarhet.

De innebär inte automatiskt felaktig hantering eller låg kvalitet.

Den som läser rapporten behöver helt enkelt en förklarbar koppling:

rapport → prov som testats → parti eller material som resultatet av testet ska gälla.

Läs metoden, resultatet, enheten och specifikationen tillsammans.

COA presenterar ofta både kriteriet för godkännande och det faktiska resultat som uppnåtts.

Till exempel:

Specifikation: minst 98,0%

och

Resultat: 99,2%.

Det är två olika uppgifter.

Specifikationen anger kriteriet för godkännande.

Resultatet visar den mätvärde som har erhållits för en specifik provtagningsprovning.

Enheten och grunden för mätningen är lika viktiga.

Man kan bland annat träffa:

• område%;
• massa%;
• mg/behållare;
• mg/ml;
• µg/ml;
• mol/L;
• resultatet i procent av torr massa;
• resultatet i form av vattenfritt material;
• resultatet för materialet i den erhållna tillståndet.

Det är inte tillåtet att byta ut dessa värden.

Till exempel tar resultatet som anges som „i mottagen form” hänsyn till materialet i dess befintliga form, medan den vattenfria eller korrigerade värdena matematiskt kan utesluta vatten från beräkningsgrunden.

Informationen „pass” betyder att det angivna resultatet uppfyller ett visst godkännandekriterium för den specifika testet.

Den utvidgar inte omfattningen av denna undersökning.

Därför:

En genomförd identitetskontroll ≠ bekräftad sterilitet

och

genomförd test av renhet HPLC ≠ den angivna halten av peptidet,

om inte dessa egenskaper har mätts separat.

Ett exempel på tolkning av uppgifterna i COA

Nedanstående inlägg är hypotetiska och är endast avsedda att visa hur analytiska data ska tolkas. De beskriver inte den verkliga partiet eller föreslår kriterier för godkännande.

De presenterade skillnaderna bygger på studier av renheten hos huvudpeptidpeptidet, antikropparna och bestämningen av massandel. [1] [2] [9]

De angivna siffrorna och tabellens format är endast av pedagogisk karaktär.

Kontrollera kromatogram och spektrum

Ytterligare analytiska data hjälper till att korrekt tolka resultaten som sammanställts i COA.

Vid en chromatogram ska man vara uppmärksam på följande:

• provets identifierare;
• metodens identifierare;
• kromatografiska axlar;
• typ av detektor;
• våglängd;
• Viktiga tidsintervall för retention;
• märkning av punkter;
• tabell över föroreningar;
• resultaten av integrationen;
• rapporteringsgränser.

En kromatogram som är skärpt så att endast den stora huvudpunkten visas kan missa information som behövs för en korrekt tolkning av renhetsresultatet.

För massspectrometri kan en relevant kontext innefatta:

• den förväntade molekylformen;
• den förväntade massan;
• det observerade antalet joner;
• tilldelade laddningsnivåer;
• dekonvolution;
• massfel;
• fragmenterade data, om de är tillämpliga;
• grunden för att tilldela strukturen.

Skymningen av massan av hela partikeln, den dekonvolverade molekylmassan och strukturella bevis baserade på fragmentering är sammanlänkade, men de betyder inte samma sak.

COA behöver inte nödvändigtvis innehålla alla hårda filer från utrustningen.

Dock bör de analytiska slutsatserna i sammanfattningen kunna kopplas till den källmaterial som kan verifieras om frågor uppstår om att koppla samman en struktur eller ett numeriskt resultat.

„Upptäckts” och „studerades inte” betyder något helt annat

„Not detected” betyder att den analysmetod som användes inte upptäckte det undersökta ämnet under de angivna förhållandena och med den angivna känsligheten.

Detta betyder inte att det verkliga koncentrationen är exakt noll.

„Under den mätbarhetsgränsen” betyder däremot att beståndsdelen kan vara närvarande på en nivå som den givna metoden inte kan mätas kvantitativt på ett tillförlitligt sätt.

Det är en annan situation.

„Not studied” betyder att ingen mätning gjordes för den aktuella egenskapen.

Det får inte tolkas som:

„korrekt resultat”

inte:

„icke-föremål”.

En korrekt tolkning av information om detektering eller kvantitativ märkning kräver också kunskap om:

• gränsen för detektion eller mätbarhet;
• enheter;
• grunderna för rapportering;
• den använda metoden;
• metoden för provens beredning.

Vad ger ett oberoende laboratorieanalys av provet?

En oberoende laboratorium kan tillhandahålla ytterligare analytiska mätningar för den skickade provet.

Detta kan öka mängden tillgängliga bevisen om en viss sak.

Endast beteckningen:

„testades av ett oberoende laboratorium”

men förklarar inte:

• vad som exakt undersöktes;
• hur många prover som undersöktes;
• vem som valde provet;
• vem som tog henne;
• om den var representativ;
• från vilken parti hon tillhörde;
• vilka metoder som användes;
• om rapporten kan verifieras;
• om provet motsvarar det material som senare distribueras;
• om vilka egenskaper undersökningen inte alls omfattade.

De mest användbara frågorna handlar alltså om:

provens identitet + partiets identifiering + provtagningsmetod + analysområde + laboratorieresultatens autenticitet.

En oberoende undersökning eliminerar inte de begränsningar som tillämpas på metoderna.

HPLC som utförs av ett externt laboratorium förblir fortfarande en undersökning av HPLC.

Det blir inte testat för sterilitet, mättat med peptidhalt, analyserat stereokemiskt eller undersökt för biologisk aktivitet bara för att det har utförts av en oberoende part.

Det är därför viktigt att bedöma COA framför allt utifrån analysområdet och möjligheten att spåra provet, och inte bara utifrån laboratoriemärket eller den höga procentandel som finns i början av dokumentet.

Vad bekräftar inte rutinmässiga analytiska undersökningar?

HPLC bekräftar inte steriliteten

En rutinanalys av HPLC-peptidet undersöker kemiska beståndsdelar utifrån deras kromatografiska beteende.

Det är inte en metod för att upptäcka levande mikroorganismer.

En ren chromatogram kan därför inte bekräfta att provet är sterilt.

Sterilitet är ett mikrobiologiskt problem som kräver lämpliga metoder och kontroll av produktionsprocessen.

Även en separat undersökning av steriliteten har sina begränsningar när det gäller provtagning, eftersom endast en del av det material som används i testet undersöks direkt.

Av denna anledning grundar tillhandahållandet av sterilitet inom läkemedelsindustrin sig på ett bredare system av produktion och kontroll, och inte enbart på slutlig produktanalys.

FDA:s riktlinjer för aseptisk produktion behandlar mikrobiologisk kontroll och undersökning av sterilitet som separata delar av processen. [10]

Därför:

hög renhet av HPLC ≠ sterilitet

och

Absen av synliga kromatografiska föroreningar ≠ avsaknad av mikroorganismer.

Studien om endotoxiner svarar på en annan fråga

Endotoxiner är bakteriekomponenter, särskilt material som är kopplat till lipopolysackarider från gramnegativa bakterier.

De är inte samma som levande bakterier.

Studien av bakterieendotoksiner svarar alltså på en annan fråga än testet för sterilitet.

Teoretiskt sett kan provet inte innehålla upptäckbara levande bakterier, men det kan innehålla vissa komponenter av bakteriellt ursprung.

På samma sätt kan en sterilitetstest inte automatiskt ersätta mätning av endotoxiner.

Provetillverkaren kan också påverka studien av endotoxiner.

Det är därför viktigt att metoden anpassas och interferenskontrollen kontrolleras korrekt.

FDA:s riktlinjer om pyrogener och endotoxiner behandlar analytiska begränsningar samt skillnaden mellan bakteriella endotoxiner och andra pyrogener. [11]

En rutinanalys av HPLC-renhet kan varken ersätta en testning av steriliteten eller en endotoxinanalys.

Kemisk renhet bekräftar inte biologisk aktivitet

Provet kan innehålla:

• den förväntade molekylmängden;
• en hög yta på huvudkolonnen för kromatografi;
• en relativt liten mängd av de kemiska föroreningarna som upptäckts,

och samtidigt inte ha någon bekräftad specifik biologisk funktion.

Den funktionella funktionen kan också bero på:

• fållning;
• disulfidbryggors placering;
• aggregering;
• strukturell konformitet;
• Status för ändringar;
• testförhållanden;
• den använda biologiska metoden.

Studien om syntesen av BPTI visar väl hur värdefullt det är att dela upp frågorna.

Forskare kombinerade analytisk och biofysisk karaktärisering med ett trypsinhemmestest [12].

Sammanlagt gav dessa resultat starkare bevis för den undersökta substansen.

Ingen enskild mätning ersatte de andra.

Därför:

kemisk renhet ≠ biologisk aktivitet

och

Den biologiska aktiviteten i ett test ≠ den fullständiga strukturella eller produktiva karaktäristiken.

COA är inte en bedömning av klinisk säkerhet

COA presenterar resultaten av analytiska tester som utförts på den beskrivna provtanken.

Det fastslår inte:

• klinisk tolerans;
• säkerheten vid exponering för människor;
• den lämpliga dosen;
• interaktioner;
• effektivitet;
• langvariga effekter;
• användbarhet för en specifik person.

De här frågorna kräver andra typer av bevis.

Denna regel gäller även när analysresultaten är korrekta och peptidsammansättningen har bekräftats korrekt.

En renhetsanalys kan karakterisera vissa aspekter av den kemiska sammansättningen.

Det får inte ändra den analytiska rapporten till en klinisk studie eller en säkerhetsbedömning för användning på människor.

En tidsangivelse bekräftar inte hållbarhetsperioden

COA beskriver vanligtvis materialet vid en viss tidpunkt under undersökningen.

Peptider kan sedan förändras på grund av:

• nedgradering;
• med oxidering;
• hydrolys;
• med avdämning;
• aggregat;
• ångränning av fukt;
• strukturella omstruktureringar;
• andra processer som beror på molekylens egenskaper och omgivande förhållanden.

Resultatet erhålls vid en enda tidpunkt, vilket inte bekräftar obegränsad stabilitet.

Förvaringstiden kräver data som kopplar samman definierade förvaringsvillkor med analytisk materialbevarande över tid.

I studien av eksenatid utvecklades en kromatografisk metod som visade på stabiliteten och karakteriserade nedbrytningsprodukterna som bildas under flera stressförhållanden. [13]

Denna studie visar hur nedbrytningsprodukterna kan separeras från det ursprungliga peptidet.

Det definierar dock inte den universella lagringstiden för alla peptider, och artificiella stressförhållanden bör inte automatiskt jämföras med normala lagringsvillkor.

Det starkaste argumentet bör motsvara styrkan i bevisen.

En vetenskapligt noggrann tolkning bör inte gå utöver det som kan mätas.

Till exempel kan COA motivera ett uttalande som:

„I den undersökta provsmältningen erhölls ett resultat för massan av hela partikeln som var förenligt med det tilldelade peptidet, den angivna andelen av huvudytan av partikeln i den använda HPLC-metoden samt den separat märkta innehållsmängden av peptidet.

Detta är en värdefull samling av analytiska bevis.

Innebär dock inte automatiskt:

„Peptidet har fullständigt karakteriserats; det är sterilt, biologiskt aktivt, säkert, stabilt i obegränsad tid och lämpligt för användning på människor.”.

Det handlar inte om att ifrågasätta värdet av laboratorieundersökningar.

Man bör inte heller förvänta sig att en analytisk metod ska kunna besvara alla möjliga frågor.

Det viktigaste är sammansättningen:

varje påstående → med en mätning som faktiskt kan styrka det,

med samtidig tydlig uppräkning av frågor som inte fått svar.

Vanliga frågor och svar

1. Betecknar 99% renhet att produkten är säker?

Nej. Procent renhet beskriver provens sammansättning enligt en specifik analytisk metod, inte säkerhetsrisken. Dessutom kan denna värdering innebära andelen av den kromatografiska signalen och inte den fysiska massedelen av det eftersträvade peptidet. Studier av peptidsammansättningsbalans visar varför vatten, anti-joner och andra komponenter kan orsaka skillnader mellan dessa värden [2]. Oavsett analytisk renhet kan den eftersträvade molekylen själv också ha egna biologiska egenskaper. En hög renhetsnivå kan därför stödja den kemiska profilen hos den undersökta provet, men den ersätter inte toxikologiska, farmakologiska, mikrobiologiska eller kliniska bevis för säkerhet.

2. Bekräftar HPLC steriliteten?

Nej. En rutinanalys av HPLC-peptidet delar upp och identifierar kemiska komponenter baserat på deras kromatografiska beteende. Den anger inte om det finns levande mikroorganismer i provet. Steriliteten är en separat egenskap som kräver lämpliga mikrobiologiska undersökningar och kontroll av produktionsprocessen. FDA:s riktlinjer för aseptisk produktion behandlar mikrobiologisk kontroll oberoende av den kemiska analysen. [10] Därför kan en ren kromatogram, en hög andel av huvudpartikeln eller den förväntade retentionstiden för peptidet inte ersätta bevisen om steriliteten.

3. Vad innebär egentligen procentandelen av HPLC-ytan?

Procenten av HCPL-ytan innebär vanligtvis andelen av det integrerade signalet som tilldelas huvudpiket i det totala integrerade chromatografiska signalet. Resultatet beror på kvaliteten på uppdelningen, detektorns respons, våglängden, integreringsreglerna, rapporteringsgränserna och andra metodvillkor. Det betyder alltså inte automatiskt att masspektrometrin fysiskt deltar i hela provet. Undersökningar av renheten hos huvudpiket av peptid visar varför oidentifierade isomerer kan komplicera tolkningen. [1] Procenten av HPLC-ytan bör därför betraktas som resultatet av en specifik analytisk metod, vars mätgrund ska vara tydligt definierad.

4. Kan en enskild pik HPLC innehålla flera substanser?

Ja. Två eller fler komponenter kan elueras så nära varandra att de inte blir adekvat separerade i ett visst kromatografiskt system och ser ut som en enda prick. Därför är även en visuellt symmetrisk prick inte ett absolut bevis på molekylär homogenitet. Studien av cykliska peptider visade att en annan kromatografisk metod gav en annan metod för att separera föroreningar än RP-HPLC. [3] Det betyder inte att varje huvudpunkt innehåller dolda substanser. Det visar dock att separeringsförmågan beror på metodens selektivitet och att kompletterande analytiska tekniker kan behövas för nära besläktade strukturer.

5. Stämmer den korrekta molekylmassen med den korrekta peptidskedjan?

Nej. Massan av hela partikeln som överensstämmer med den förväntade värdena utgör ett värdefullt bevis för identiteten, men den behöver inte bekräfta ordningsföljden av aminosyrorna, stereokemien, typen av slutgrupper, positionen för modifieringarna eller alla andra strukturella egenskaper. Forskningar om föroreningar av syntetiska peptider har visat på komponenter med samma massa, men med modifieringar som finns i olika positioner, vilket kräver ytterligare analytiska uppgifter. [4] En fullständig bedömning av identiteten kräver därför metoder som är anpassade till de specifika strukturella otydligheterna hos det givna peptidet.

6. Vad skiljer peptidsammansättningen från renheten?

Innehållet av peptidet anger hur mycket av den definierade målpulpet som finns i materialet baserat på en viss kvantitativ grund. Renheten kan däremot betyda andelen av den chromatografiska signalen som tillskrivs den huvudsakliga ingrediensen eller en annan definierad renhetsparameter. Vatten, anti-joner, processrelaterade rester och strukturellt närbesläktade föreningar kan göra att dessa värden kan variera. I undersökningen av sublankiner har flera sådana komponenter mätts separat under massbalansbedömningen. [2] Resultatet av peptidhalten och procenten av HPLC-ytan bör därför tolkas separat, såvida inte ett validerat analyssystem tydligt visar samband mellan dem.

7. Kan vatten och syror påverka mängden peptid i pulvret?

Ja. Vatten och antipartiklar ökar provens totala fysiska massa och kan därför minska den del av massan som hänförs till den slutliga peptiden om resultatet anges för materialet i det erhållna tillståndet. Studien av sublankiner och peptidhårande antipartiklar visar varför dessa komponenter kan kräva särskild bestämning. [2] [9] Deras närvaro behöver inte betyda syntesfel eller förorening eftersom antipartikeln kan vara en del av den avsedda saltformen. Viktiga frågor gäller därför typen av den molekylära formen som analyseras, mängden av de enskilda komponenterna samt grunden för den använda beräkningen.

8. Är antikropparna samma som peptidsmutagena ämnen?

Inte alltid. En antijon kan vara en förväntad komponent i peptidsaltet, medan föroreningen som är relaterad till sekvensen är en annan peptidsammansättning. Dessa är alltså olika analytiska kategorier, även om båda kan påverka provets totala sammansättning. I studier som jämförde peptidsalter sågs skillnader i experimenten om permeation genom cellmembran beroende på sekvens och saltform [9]. Om antijonen har betydelse för materialets egenskaper, bör dess typ och mängd rapporteras separat och inte dras slutsatser baserat på den kromatografiska renheten hos huvudprovet av peptidet.

9. Kan vanlig masspektrometri skilja mellan D- och L-aminosättningar?

Enbart mätningen av massan för hela partikeln gör det normalt inte möjligt att skilja strukturerna med identisk atomfördelning, som endast skiljer sig genom stereokemiska egenskaper. Varianterna D och motsvarande variant L kan alltså ha samma molekylmassa. Om frågan handlar om den rumsliga konfigurationen krävs en lämplig chiral eller stereokemisk analys. I studier av chiralitet hos peptider användes en särskilt utformad process som tog hänsyn till de stereokemiska förändringar som uppstår vid provtillverkningen. [6] Problemet är strukturellt av natur, därför löser själva förbättringen av mätningen av massan inte detta oklarhetsmoment.

10. Varför är partiets nummer på COA viktigt?

Parti- eller serienumret hjälper till att koppla samman analysresultaten med det specifika materialet som har undersökts. Resultaten för en viss part får inte automatiskt överföras till en annan part eller till varje behållare som har framställts vid en annan tidpunkt. Studien av certifierade referensmaterial bedömer sådana egenskaper som homogenitet och stabilitet i stället för att förutsätta dem utifrån en enstaka mätning. [8] Därför utgör numret på partiet en viktig del av identifieringen, även om det i sig inte utgör bevis för att provtagningen, lagringen, hanteringen av materialet eller alla andra delar av kontrollsystemet är korrekt.

11. Beträffande „inte påvisat” betyder det noll?

Nej. „Upptäcktes inte” betyder att den använda metoden inte upptäckte den undersökta substansen under de angivna förhållandena och inom dess känslighetsgräns. Det betyder inte att den faktiska mängden är exakt noll. Resultatet som ligger under detektionsgränsen eller mätbarhetsgränsen bör tolkas tillsammans med den relevanta gränsvärden, enhetsenheten, provbasen och analytiska förhållandena. I riktlinjerna för endotoximätning diskuteras också betydelsen av metodernas känslighet och möjliga interferenser. [11] En vetenskapligt motiverad slutsats bör därför hänvisa till vad metoden kunde upptäcka, inte till ett absolut påstående om fullständig avsaknad av substansen.

12. Vad innebär osäkerheten vid mätningen i rapporten?

Mätosäkerheten beskriver spridningen av värden som på ett välgrundat sätt kan kopplas till det erhållna resultatet enligt den tillämpliga bedömningen. Det betyder inte att laboratoriet anser sitt resultat vara felaktigt. Det visar däremot gränserna för den numeriska säkerheten för den beräknade värden. I studier av referensmaterial kan osäkerheten vid värderingen beaktas, bland annat osäkerheten i själva mätningen, homogeniteten och stabiliteten. [8] Osäkerheten bör därför tolkas tillsammans med dess definition, enheterna, den tillämpliga täckningsnivån och den exakt fastställda mätobjektet.

13. Stämmer det att en undersökning utförd av ett oberoende laboratorium bekräftar att alla behållare innehåller identiskt material?

Nej. En oberoende undersökning ger bevis för provet eller provsmålen som faktiskt överlämnats för analys. Möjligheten att överföra dessa resultat till varje behållare beror bland annat på hur provsmålen tas, partiernas identifierbarhet, materialets enhetlighet, fyllningsprocessen, lagringen och andra kontrollparametrar. I utvecklingen av certifierade referensmaterial bedöms enhetlighet, och inte bara antas den enbart på grundval av en enskild mätning. [8] Laboratoriets oberoende kan öka oberoendet i själva mätningen, men det bevisar inte automatiskt att hela partiet är identiskt.

14. Kan resultaten av sterilitet och endotoxiner användas som substitut för varandra?

Nej. Studien av steriliteten gäller levande mikroorganismer, medan studien av bakteriella endotoxiner gäller vissa bakteriekomponenter som kan finnas kvar i materialet även när det inte finns några levande bakterier. Dessa är alltså två separata analytiska frågor. Identifieringen av endotoxiner kan dessutom påverkas av interferenser från provmatrisen, därför är det viktigt att metoden anpassas korrekt. [11] Varken steriliteten eller nivåerna av endotoxiner kan utvärderas med hjälp av rutinmässig HPLC-renhet. Om dessa studier har utförts bör de rapporteras separat.

15. Stämmer den kemiska renheten med den biologiska aktiviteten?

Nej. Kemisk analys och funktionell undersökning ger andra typer av information. En peptid kan ha den förväntade molekylmassen och hög kromatografisk renhet utan bekräftat resultat i en specifik biologisk test. I studien av BPTI kombinerades strukturell och biofysisk karakterisering med en trypsininhiberingstest i stället för att anta att ett analysresultat är tillräckligt för alla slutsatser. [12] Funktionell information är dessutom specifik för den undersökta partikeln, det experimentella systemet och det specifika testet. En provs höga renhet bör därför inte betraktas som funktionellt bekräftad om den relevanta aktiviteten inte faktiskt har undersökts.

16. Stämmer det att peptidet kommer att vara stabilt i obegränsad tid?

Nej. COA beskriver provet vid den tidpunkt eller vid den fasen av undersökningen som anges i rapporten. Under senare lagring kan peptidet nedbrytas, oxideras, hydrolyseras, aggregera, absorbera fukt och andra förändringar som beror på dess egenskaper och miljö. Undersökningar av eksantatids nedbrytning har visat vikten av metoder som indikerar stabilitet, vilket kan skilja nedbrytningsprodukterna från den ursprungliga substansen. [13] Stressundersökningar anger dock inte automatiskt lagringstid under normala förhållanden. Varje påstående om hållbarhetstid kräver relevanta stabilitetsdata som erhållits under specificerade förhållanden och vid en specifik tidpunkt.

17. Vad bör man kontrollera först när man jämför två COA-peptider?

Det är först värt att jämföra provens identitet, partiantal, de använda analysmetoderna, enheterna och mätgrunden, i stället för att direkt sammanställa de största procentvärdena som syns i dokumenten. Två rapporter kan presentera ett värde som definieras som „renhet”, samtidigt som de mäter andra egenskaper eller har olika kapacitet att separera olika klasser av föroreningar. Studien som använder ortogonala kromatografimetoder och mätning av massbalans visar vikten av dessa skillnader. [2] [3] Om man inte fastställer om de båda siffrorna avser samma storlek och tillräckligt jämförbara metoder, kan en direkt jämförelse av procentandelarna vara missvisande.

18. Betecknar 99% purity HPLC 99% peptidinnehåll?

Nej. Resultatet 99% HPLC betyder oftast att huvudpekaren har fått 99% svar från det kromatografiska detektorn. Resultatet 99% peptidinnehåll skulle däremot kräva en kvantitativ mätning som visar att den avsedda peptiden utgör 99% av den tillåtna provvolymen enligt en tydligt definierad grund. Vatten, anti-joner, restsubstanser och andra komponenter kan öka provens fysiska massa utan att proportionellt påverka procentandelen av RP-HPLC-UV-ytan. [2] Därför kan de båda värdena variera avsevärt, trots att ingen av mätningarna behöver vara felaktig.

19. Kan en peptid genomgå HPLC-renhetsanalys och ändå ha en felaktig stereokemi?

Potentiellt sett kan det vara så. Den konventionella RP-HPLC behöver inte skilja mellan alla stereokemiska varianter, särskilt när partiklarna har mycket liknande fysikokemiska egenskaper. På samma sätt tillåter en vanlig mätning av massan för en hel partikel inte att stereoisomerer med identisk grundämnesammansättning kan särskiljas. Forskning om den stereokemiska renheten hos peptider visar varför specialiserade metoder och noggrann kontroll av provberedningen kan behövas. [6] Huruvida en viss HPLC-metod kan skilja mellan en given stereoisomer beror på metodens påvisade selektivitet och inte bara på att en HPLC-analys utförts.

20. Stämmer det att COA bekräftar att hela partiet är identiskt med den undersökta provbeställningen?

Inte själva. COA presenterar resultaten för provet och den parti som anges i den analytiska dokumentationen. Att utvidga dessa resultat till hela partiet kräver ett lämpligt provtagningssystem, enhetlighet i processen, enhetlighet, identifierbarhet och andra produktionskontroller. Utarbetandet av referensmaterial visar varför enhetlighet betraktas som en separat egenskap och inte bara som en förutsättning. [8] COA kan därför tillhandahålla viktiga analytiska bevis för partiet, men kraften i slutsatserna som omfattar hela materialet beror på ett bredare kvalitetssystem som kopplar den undersökta provet till den parti som representeras av rapporten.

Begränsningar av tolkningen av renheten hos peptider och COA

När man tolkar peptidsanalyser bör man vara medveten om några begränsningar.

Först och främst beror renheten på metoden. Resultatet från RP-HPLC-UV beskriver vad den specifika kromatografiska systemet och detektorn har mätt. En annan separationsmekanism kan avslöja beståndsdelar som den första metoden inte har kunnat separera. [1] [3]

För det andra har den kromatografiska ytan och den fysiska massan olika mätgrundsatser. Vatten, antikoagulantia, restsubstanser från andra substanser samt skillnader i detektorns respons kan göra att procentandelen av HPLC-ytan inte motsvarar den massiva andelen av det målade peptidet.[2]

För det tredje utgör den förväntade molekylmassen ett starkt, men ofullständigt bevis på identitet. Isomerer, positionella varianter och stereokemiska skillnader kan kräva användning av ytterligare strukturella metoder. [4] [5] [6]

Fjärde, själva analysmetoderna kan orsaka artefakter. Provberedning, hydrolys, derivatisering, lagring och hantering av materialet kan ändra analysen eller den undersökta egenskapen. [6]

Femte, en undersökt provbit är inte automatiskt jämförbar med varje behållare eller samma material vid senare tidpunkt. Enhetlighet, partiidentifikation och stabilitet är separata frågor. [8]

Sjätte, kemiska analyser svarar inte på mikrobiologiska frågor. HPLC och masspektrometri bekräftar varken steriliteten eller endotoxinstatusen. [10] [11]

Sju: Den kemiska profilen bekräftar varken biologisk aktivitet eller klinisk säkerhet. Dessa är separata frågor som kräver andra typer av bevis. [12]

Slutligen bekräftar resultatet erhållet vid en given tidpunkt inte långsiktig stabilitet. En bedömning av stabiliteten kräver relevanta data som erhållits över tid och under specificerade förhållanden. [13]

Dessa begränsningar betyder inte att COA inte är av värde.

De förklarar dock hur det ska tolkas korrekt.

Sammanfattning

Peptidanalyscertifikat är mest användbart när man behandlar det som en samling av separata analytiska mätningar, och inte som en enskild kvalitetsbedömning.

Den renhetsgrad som anges i början är bara början på en tolkning.

En resultat som liknar 99% RP-HPLC-ytor beskriver analysen av detektorns respons i en specifik kromatografimetod. Det betyder inte automatiskt att 99% fysisk massa av pulvret utgör den slutliga peptiden. [1] [2]

Massspektrometri kan ge starka bevis om molekylmassa och vissa strukturella egenskaper, men överensstämmelsen mellan hela molekylets massa och den förväntade värdena bekräftar inte automatiskt alla aspekter av sekvensen, ändstyperna, stereokemien eller molekylär bindning. [4] [5] [6]

Innehållet av peptidet kräver sin egen kvantitativa bas.

Vatten, kontaminanter, restsubstanser från andra ämnen och peptidsubstanser som liknar dem kan påverka sambandet mellan den massan av material som utgör en belastning och den faktiska mängden av det målpeptidet. [2] [7] [9]

Det är därför viktigt att ställa flera separata frågor under läsningen av COA:

Vilken provtagningsprovning har testats?

Vilken partier gäller det?

Vilken analytisk metod användes?

Vad innebär den rapporterade procentvärdet exakt?

Vilka enheter och vilken beräkningsgrund användes?

Behandlades molekylär identitet oberoende av den kromatografiska renheten?

Har den verkliga halten av peptidet mätts?

Har man i lämpliga fall mätt vatten eller antimon?

Behöver stereokemien utvärderas om den är relevant för den aktuella substansen?

Vilka egenskaper har inte undersökts?

Det är särskilt viktigt att göra en skillnad mellan „inte påvisat” och „inte undersökt”.

Resultatfel bör inte tolkas som bevis på att man har klarat testet positivt.

På samma sätt kan en undersökning som utförs av ett oberoende laboratorium utgöra en värdefull extra informationskälla, men själva beteckningen „third-party tested” beskriver inte hur provet tas, dess samband med partiet, analysområdet, homogeniteten eller om resultatet kan överföras till varje behållare.

Vanliga kemiska metoder har också tydligt definierade gränser.

HPLC bekräftar inte steriliteten.

HPLC:s renhet bekräftar inte endotoxinstatusen.

Den kemiska renheten bekräftar inte den biologiska aktiviteten.

COA utgör inte en bedömning av klinisk säkerhet.

En analytisk analys som erhålls vid en viss tidpunkt bekräftar inte obegränsad stabilitet. [10] [11] [12] [13]

Den mest vetenskapligt motiverade tolkningen är alltså alltid så bred som de tillgängliga bevisen tillåter – och inte bredare.

En väl dokumenterad analytisk rapport kan ge kraftfull information om identiteten, sammansättningen och mängden av materialet i den undersökta provmassan.

Dess värde ökar när de tillämpliga metoderna, mätgrunden, materialets identifierbarhet och begränsningarna för de enskilda testen tydligt beskrivs.

Den viktigaste principen är enkel:

Identitet, renhet, mängd, stereokemi, mikrobiologisk status, biologisk aktivitet, stabilitet och säkerhet är olika frågor. En trovärdig analyscertifiering hjälper till att svara på frågor som faktiskt har undersökts – den bör inte användas för att föreslå svar på frågor som inte har undersökts.

Varning

Artikelns syfte är endast utbildningsrelaterat och vetenskapligt informativt. Den förklarar de allmänna principerna för analytisk peptidkemi, tolkningen av analysintyg (COA), HPLC-kromatografi, massspectrometri, bestämning av peptidinnehåll, bedömning av föroreningar, materialidentifiering samt relaterade undersökningsmetoder. Den utgör inte medicinsk rådgivning, produktrekommendationer, säkerhetsbedömning, tillverkningstillstånd eller bekräftelse på att någon peptid eller material som innehåller peptider är lämpligt för användning på människor. Analysresultaten bör alltid tolkas med hänsyn till den specifika provet, partiet, den använda metoden, mätgrunden, specifikationerna, det analyserade analytiska problemet samt begränsningarna för den utförda testet.

Referenser

1. Petersson, P., Buckenmaier, S., Euerby, M. R., & Stoll, D. R. (2023). En strategi för att bedöma den maximala renheten hos farmaceutiska peptider i metoder för omvänd faskromatografi med användning av tvådimensionell flytande kromatografi kopplad till masspektrometri. Del I: Val av kolonnar och mobilfaser. Journal of Chromatography A, 1693, Artikel 463874. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2023.463874
2. Chen, W., Yan, J., Yang, M., Wang, M., Zhou, J., Li, F., & Li, L. (2026). SI-spårbar renhetsbestämning för peptidet sublancin med hjälp av en massaövervakningsmetod och isotoputspädning med masspektrometri baserat på aminosyraförsökning. Journal of Chromatography B, 1277, Artikel 125038. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2026.125038
3. Yoshida, K., Kato, S., Nagai, K., Shimamoto, S., Onishi, T., & Ohnishi, A. (2025). Analys av föroreningar i syntetiska cykliska peptider baserat på orthogonalitet mellan vattenlöslig interaktion och omvänd fas-vätskekromatografi. Journal of Chromatography A, 1745, Artikel 465748. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2025.465748
4. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Karakterisering av föroreningar i ett syntetiskt renin-substratpeptid genom masspektrometri med snabbatombombardering och hybrid tandemmasspektrometri. Rapid kommunikation inom massspectrometri, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
5. Kuyama, H., Nakajima, C., Nakazawa, T., Nishimura, O., & Tsunasawa, S. (2009). En ny metod för att upptäcka C-terminal amidering av proteiner och peptider med hjälp av masspektrometri i kombination med kemisk derivatisering. Proteomik, 9(16), 4063–4070. https://doi.org/10.1002/pmic.200900267
6. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G. & Crowther, J. B. (1995). Peptidkiralisk renhetsbestämning: Hydrolyse i deutererad syra, derivatisering med Marfey’s reagens och analys med högpresterande vätskekromatografi-elektrosprayspray-ionisationsmassspektrometri. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
7. Li, M., Josephs, R. D., Daireaux, A., Choteau, T., Westwood, S., Martos, G., Wielgosz, R. I., & Li, H. (2021). Strukturell relaterad identifiering av peptidföroreningar och exakt kvantifiering av syntetisk oxytocin genom flytande kromatografi-masspektrometri med hög upplösning. Analytisk och bioanalytisk kemi, 413(7), 1861–1870. https://doi.org/10.1007/s00216-021-03154-5
8. Xiao, P., Chen, J., Wu, P., Zhang, W., Sun, Z., Ma, J., & Li, H. (2024). Utveckling av ett SI-spårbart N-terminalt pro-B-typ natriuretfenpeptid-certifierat referensmaterial med hjälp av strukturbaserade, obalanskorrigerade isotopfördelningsmassspektrometrismetoder. Analytisk och bioanalytisk kemi, 416(14), 3447–3458. https://doi.org/10.1007/s00216-024-05295-9
9. Erckes, V., Streuli, A., Chamera Rendueles, L., Krämer, S. D., & Steuer, C. (2025). Mot en konsensus för analys och utbyte av TFA som en motjon i syntetiska peptider och dess påverkan på membranpermeation. Läkemedel, 18(8), Artikel 1163. https://doi.org/10.3390/ph18081163
10. Amerikanska livsmedels- och läkemedelsmyndigheten. (2004). Sterila läkemedelsprodukter framställda genom aseptisk bearbetning – Gällande god tillverkningspraxis: Vägledning för industrin. Officiell vägledning
11. U.S. Food and Drug Administration. (2026). Testning av pyrogener och endotoxiner: Frågor och svar – Riktlinjer för industrin. Officiell vägledning
12. Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). Solid-phase syntes av bovin pankreatisk trypsininhibitor (BPTI) och två analoger. En kemisk metod för att utvärdera rollen av disulfidbroar i proteinspackning och stabilitet. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. PubMed-post
13. Badgujar, D., Maskar, T., Paritala, S. T., & Sharma, N. (2024). Utveckling och validering av en stabilitetsindikatorisk analysmetod och identifiering av kraftnedbrytningsprodukter av den syntetiska analogen av glukagonliknande peptid-1, Exenatide, genom vätskekromatografi kopplad till en Orbitrap-masspektrometer. European Journal of Mass Spectrometry, 30(3–4), 171–186. https://doi.org/10.1177/14690667241262935