La pureté du peptide décrit la composition d'un échantillon déterminée par une méthode analytique spécifique. Elle ne confirme pas à elle seule l'identité complète du peptide, la quantité réelle de peptide dans l'échantillon, la stérilité, l'activité biologique, la stabilité ni la sécurité. Un certificat d'analyse, le plus souvent désigné par l'abréviation CoA, est le plus utile lorsque chaque résultat qui y figure est traité comme une réponse à une question analytique précise.
C'est pourquoi une information telle que „99% de pureté” nécessite un contexte approprié.
Est-ce que 99% signifie que le pic chromatographique principal représente 99% de la réponse totale intégrée du détecteur dans l'analyse HPLC ? Cette valeur représente-t-elle la fraction massique du peptide cible après correction pour l'eau, les contre-ions et les autres composants ? La pureté stéréochimique a-t-elle été évaluée ? Quel type d'impuretés cette méthode est-elle capable de détecter, et lesquelles peuvent échapper à son champ d'application ?
Ces distinctions sont importantes car plusieurs paramètres différents sont communément désignés par le même terme de „ pureté ”, alors qu'ils décrivent en réalité des propriétés différentes de l'échantillon.
Des recherches sur l'analyse des peptides montrent pourquoi cela est important. Des impuretés structurellement similaires peuvent parfois rester cachées dans un pic chromatographique apparemment simple, tandis que l'eau, les contre-ions, les résidus d'autres substances et les composés apparentés peuvent influencer la masse totale du matériel peptidique isolé. [1] [2]
Ce sont des problèmes analytiques distincts qui nécessitent différents types de preuves.
C'est pourquoi, lors de l'évaluation du CoA d'un peptide, il est plus utile que la simple question :
„Quel est le pourcentage de pureté ?”
Il y a une question :
„Qu'a-t-on mesuré exactement, par quelle méthode, dans quel échantillon et quelle conclusion découle réellement de cette mesure ?”
Que signifie réellement la pureté d'un peptide ?
La propreté est le résultat basé sur une méthode spécifique
Le mot „ pureté ” peut suggérer une propriété unique et facilement mesurable. En pratique, cependant, les laboratoires peuvent exprimer la pureté d'un peptide de plusieurs manières différentes.
Cela peut être, entre autres :
- pourcentage de surface chromatographique;
- fraction massique;
- pureté chimique;
- pureté stéréochimique;
- profil des contaminants liés à la séquence;
- pureté déterminée selon une méthode analytique spécifique.
Il ne faut pas considérer ces valeurs comme interchangeables.
La pureté chromatographique décrit généralement la fraction de la réponse intégrée du détecteur attribuée au composant principal de l'échantillon.
La fraction massique détermine la masse d'une substance spécifique par rapport à la masse totale du matériau analysé.
La pureté stéréochimique concerne quant à elle la proportion des différentes configurations spatiales de la molécule ou des résidus d'acides aminés qui la composent.
C'est pourquoi une information correctement présentée sur la propreté devrait, dans la mesure du possible, répondre à quatre questions :
ce qui a été mesuré + comment cela a été mesuré + comment le résultat a été calculé + quel échantillon a été étudié.
La seule affirmation :
„ 99% de pureté ”
transmet beaucoup moins d'informations que :
„ 99% de la surface du pic principal selon RP-HPLC-UV ”.
Cependant, même la deuxième version ne répond pas à toutes les questions.
Il faut en outre savoir si la méthode chromatographique utilisée était capable de séparer les impuretés pertinentes et si le détecteur utilisé était en mesure de les détecter.
Que signifie le pourcentage de la surface du pic dans HPLC ?
En termes simplifiés, le calcul basé sur la normalisation de la surface des pics peut être présenté comme suit :
aire du pic principal ÷ aire totale des pics pris en compte × 100.
Si 990 unités de surface sont attribuées au pic principal et que la somme du signal chromatographique pris en compte est de 1000 unités, la surface du pic principal sera de :
990 ÷ 1000 × 100 = 99%.
Il s'agit d'une information concernant la réponse du détecteur obtenue dans des conditions chromatographiques spécifiques.
Elle ne signifie pas automatiquement que :
99% de la masse physique de la poudre correspond au peptide cible.
Il y a plusieurs raisons à cette différence.
Différents composés chimiques peuvent générer une réponse de détecteur différente par unité de masse.
Certains composants de l'échantillon peuvent faiblement absorber le rayonnement à la longueur d'onde utilisée.
D'autres peuvent ne pas être prises en compte du tout dans les calculs chromatographiques.
Certaines impuretés peuvent également éluer avec le composant principal.
Le mot „pris en compte” est également important.
Les calculs chromatographiques dépendent des décisions concernant :
- intégration des pics;
- seuils de reporting;
- de la sélection de la ligne de base;
- de signaux liés au solvant;
- des pics non résolus;
- des paramètres du détecteur;
- politique d'exclusion de signaux spécifiques.
Par conséquent, le pourcentage de surface HPLC doit être interprété comme le résultat d'une méthode chromatographique spécifique et non comme une description universelle de l'ensemble de la composition physique de l'échantillon.
Les impuretés apparentées peuvent être difficiles à séparer
Les impuretés présentes dans les peptides peuvent être structurellement très similaires à la molécule souhaitée.
Ils peuvent inclure, entre autres :
- séquences de délétion;
- séquences abrégées;
- chaînes latérales modifiées;
- formes oxydées;
- groupes de fins modifiés;
- isomérie de position;
- stéréoisomérie;
- produits de déclenchement non total;
- autres variantes générées lors de synthèses de peptides taux de dégradation.
Certaines de ces structures peuvent différer significativement du peptide cible dans leur comportement chromatographique.
D'autres peuvent se comporter de manière très similaire.
Dans une étude, une chromatographie liquide bidimensionnelle couplée à la spectrométrie de masse a été utilisée pour évaluer la pureté du pic peptidique principal. Les chercheurs ont appliqué des conditions de séparation supplémentaires, car les isomères peptidiques ayant le même rapport masse/charge ne pouvaient pas être distingués uniquement sur la base d'une mesure de masse de routine. [1]
Dans une autre étude portant sur quatre peptides cycliques synthétiques, la chromatographie en phase inversée a été comparée à la chromatographie d'interaction hydrophile.
Les deux méthodes séparaient les polluants différemment. [3]
Cela ne signifie pas qu'une de ces techniques est toujours meilleure.
Elle met en revanche en évidence un phénomène de sélectivité complémentaire : deux méthodes analytiques peuvent séparer différemment le même mélange, car elles exploitent des propriétés physico-chimiques différentes des molécules étudiées.
Par conséquent :
Un seul chromatogramme propre ne signifie pas nécessairement l'absence de toutes les impuretés structurellement similaires.
L'eau et les contre-ions influencent également la composition du matériau
Le matériau peptidique isolé peut contenir des composants qui ne sont pas des séquences peptidiques supplémentaires.
Parmi les exemples importants figurent :
- eau;
- hypoténuse;
- résidus de solvants;
- substances inorganiques;
- autres composants liés au processus de production.
Un contre-ion est un ion de charge électrique opposée, lié aux groupes chargés du peptide.
En chimie des peptides, on peut rencontrer par exemple l'acétate ou le trifluoroacétate.
Leur présence ne doit pas nécessairement signifier une erreur de synthèse ou une contamination. Le peptide peut être intentionnellement présent sous une forme de sel spécifique.
Ces ingrédients ont cependant leur importance lorsque nous voulons répondre à la question :
Le peptide cible se trouve-t-il effectivement dans la quantité de matériel pesée ?
L'interprétation dépend donc de savoir si la valeur rapportée fait référence à :
- même peptide;
- sols peptidiques;
- matériau sec;
- matériau anhydre;
- du matériau à l'état brut de réception.
Dans une étude sur la sublacine de 2026, des chercheurs ont quantifié l'eau, le trifluoroacétate, des composés organiques et des contaminants inorganiques dans le cadre d'une analyse plus large du bilan massique. [2]
La proportion de peptide finalement attribuée était nettement inférieure à 100%, bien que les impuretés organiques structurellement apparentées ne représentent qu'une part relativement faible du matériel.
C'est un exemple pratique d'une différence importante :
Un profil chromatographique de peptide pur et une teneur massique élevée en peptide cible ne sont pas le même paramètre.
Le pourcentage de pureté n'est pas une probabilité de sécurité
Le pourcentage de pureté n'indique pas la probabilité qu'un matériau donné soit sûr.
Par exemple, un résultat de pureté de 99 % ne signifie pas :
„ 99% de sécurité ”.
Il n'informe pas non plus sur la signification biologique de chaque substance présente dans les 1% restants.
Une petite quantité d'un composé peut avoir une plus grande importance analytique ou biologique qu'une quantité plus importante d'un autre composé, selon :
- de son identité ;
- activité biologique;
- concentrations;
- voies d'exposition;
- de l'utilisation prévue ;
- d'autres facteurs contextuels.
De même, une molécule correctement identifiée et présentant une très haute pureté chimique peut elle-même posséder des propriétés biologiques spécifiques.
La pureté chimique et la sécurité biologique répondent donc à des questions totalement différentes.
Le test de pureté sert à caractériser un échantillon au regard des capacités de la méthode analytique utilisée.
Il ne transforme pas le résultat chimique en une évaluation générale de la sécurité d'utilisation chez l'humain.
HPLC et spectrométrie de masse
Que peut nous dire HPLC ?
La chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) sépare les composants d'un échantillon en fonction des différences dans leurs interactions avec une phase stationnaire et une phase mobile en circulation.
Dans l'analyse des peptides, la chromatographie en phase inverse HPLC (RP-HPLC) est largement utilisée, souvent en combinaison avec la détection UV.
Le chromatogramme montre la réponse du détecteur en fonction du temps.
Il est possible d'en tirer plusieurs informations importantes.
Le temps de rétention indique le moment où un composé donné quitte le système chromatographique dans des conditions déterminées.
L'aire du pic représente la réponse intégrée du détecteur.
La forme du pic fournit des informations sur le comportement chromatographique de la substance.
La résolution décrit l'efficacité avec laquelle les composants adjacents sont séparés les uns des autres.
Cependant, le temps de rétention n'est pas une „ empreinte digitale ” moléculaire unique.
Différentes molécules peuvent parfois éluer à des moments similaires.
Le même peptide peut également présenter des temps de rétention différents lors d'un changement :
- colonnes;
- de la composition de la phase mobile ;
- gradient;
- débits;
- températures;
- de la configuration de l'appareil;
- des autres paramètres de la méthode.
Des études comparant différents systèmes de séparation des peptides montrent à quel point la sélectivité chromatographique dépend de la méthode utilisée. [1]
La conformité du temps de rétention peut donc étayer l'identification dans le contexte approprié, mais ne doit pas être automatiquement considérée comme une confirmation complète de la structure.
Pourquoi un seul pic ne signifie pas nécessairement une seule substance ?
La coélution se produit lorsque deux ou plusieurs composés sortent du système chromatographique à des moments si proches qu'ils ne sont pas convenablement séparés.
En conséquence, ils peuvent ressembler à un seul pic.
Même un pic principal visuellement symétrique ne prouve donc pas automatiquement que l'ensemble du signal provient d'un seul type de particule.
La composition du pic peut être étudiée plus précisément par :
- modification de la sélectivité chromatographique;
- utilisation d'une autre phase stationnaire;
- analyse à plusieurs longueurs d'onde;
- couplage de la chromatographie et de la spectrométrie de masse;
- chromatographie bidimensionnelle;
- l'utilisation d'une autre technique analytique complémentaire.
Cependant, aucune de ces méthodes ne détecte automatiquement toutes les contaminations possibles.
Les composés étroitement apparentés peuvent présenter :
- temps de rétention similaire ;
- spectres UV similaires;
- masse nominale identique;
- autres propriétés analytiques communes.
Une étude sur les peptides cycliques, comparant la chromatographie en phase inverse et la chromatographie d'interaction hydrophile, a mis en évidence des profils d'élution des impuretés nettement différents. [3]
Cela ne signifie pas que chaque pic principal cache des impuretés supplémentaires.
La conclusion est plus précise :
La simplicité apparente du chromatogramme est un résultat obtenu dans un seul système de séparation, et l'application d'une autre sélectivité peut révéler des composants que la première méthode n'a pas séparés.
Que mesure la spectrométrie de masse ?
La spectrométrie de masse (SM) détecte les ions en fonction de leur rapport masse/charge, noté m/z.
Lors de l'analyse, un peptide peut posséder plus d'une charge électrique.
Par conséquent, une seule molécule de peptide peut générer plusieurs signaux correspondant à différents états de charge, au lieu d'un seul pic correspondant directement à la masse moléculaire neutre.
Une interprétation adéquate des données permet de reconstituer ou de confirmer la masse moléculaire de base.
La spectrométrie de masse peut fournir des informations précieuses concernant :
- masses moléculaires;
- de certaines modifications chimiques ;
- de polluants spécifiques ;
- de motifs isotopiques;
- comportements lors de la fragmentation.
La spectrométrie de masse à haute résolution permet de mieux différencier les molécules ayant des masses très proches.
La spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) consiste à fragmenter des ions sélectionnés et à analyser les produits obtenus, fournissant ainsi des informations structurelles supplémentaires.
Une règle importante reste cependant en vigueur :
l'observation de la masse moléculaire attendue ≠ la preuve de la structure moléculaire complète.
Différentes structures peuvent avoir la même masse.
Les modifications stéréochimiques peuvent ne pas affecter la composition élémentaire.
Les isomères de position peuvent également nécessiter des preuves supplémentaires.
Des études sur les impuretés d'un peptide synthétique servant de substrat à la rénine ont mis en évidence cette limitation. Pour distinguer les modifications survenant à différentes positions du mélange isobarique, des informations supplémentaires provenant de la fragmentation et de la dérivatisation ont été nécessaires. [4]
Séquence, groupes terminaux et stéréochimie
L'identité d'un peptide va bien au-delà de son nom.
Les caractéristiques structurelles importantes peuvent inclure :
- séquence d'acides aminés;
- configuration des résidus individuels ;
- structure de l'extrémité N-terminale;
- structure du C-terminal;
- modifications des chaînes latérales;
- la disposition des ponts disulfures;
- cyclisation;
- conjugaison;
- autres caractéristiques covalentes.
Par exemple, un peptide possédant un acide carboxylique C-terminal est une molécule chimiquement différente du peptide correspondant avec un amide C-terminal.
Les chercheurs ont mis au point une méthode de spectrométrie de masse assistée par dérivatisation précisément pour mieux différencier ces formes finales. [5]
Cela démontre une règle importante :
La méthode analytique doit être choisie en fonction de la question structurelle spécifique.
La stéréochimie constitue un défi supplémentaire.
Un peptide contenant un D-aminoacide et sa variante correspondante avec un L-aminoacide peuvent avoir une masse moléculaire identique tout en différant par la disposition spatiale des atomes.
Dans une étude portant sur la pureté stéréochimique des peptides, une méthode conçue de manière à tenir compte de la racémisation survenant lors de l'hydrolyse de l'échantillon a été utilisée. [6]
Sans un tel contrôle, la préparation de l'échantillon elle-même pourrait modifier la propriété que l'on tentait de mesurer.
L'analyse fiable des peptides dépend donc non seulement des paramètres de l'appareil, mais aussi de la préparation adéquate de l'échantillon et de la conception de la méthode.
La CL-SM combine les avantages de deux méthodes, mais n'élimine pas toutes les limitations
La chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) associe la séparation chromatographique à l'analyse de masse.
Cela pourrait permettre de fournir beaucoup plus d'informations que toutes ces méthodes appliquées séparément.
Le LC-MS peut aider notamment à :
- attribuer des masses spécifiques aux piques de pollution ;
- distinguer chromatographiquement des composants similaires ayant des masses différentes ;
- étudier les produits de dégradation ;
- caracteriser les polluants liés à cette séquence ;
- Appuyer les affectations structurelles.
Dans une étude sur l'oxytocine synthétique, 18 contaminants structuralement liés ont été identifiés et quantifiés grâce à une méthode LC interne validée associée à une spectrométrie de masse haute résolution [7].
Les chercheurs ont également expliqué pourquoi ces polluants devaient être pris en compte lors de l'évaluation de la pureté du matériau de référence.
Ces résultats concernent toutefois une échantillon spécifique, une méthode et un profil de polluants analysés.
Ils ne doivent pas être considérés comme une liste universelle des contaminants présents dans tous les matériaux contenant l'ocytocine.
Le LC-MS est donc un ensemble extrêmement utile de techniques analytiques.
Un bon rapport LC-MS devrait néanmoins encore expliquer :
- ce qui a été mesuré ;
- comment les différents piques ont été attribués ;
- comment les structures proposées ont été identifiées ;
- les affectations ont-elles été confirmées ;
- quelle méthode quantitative a été utilisée ;
- quels sont les limitations analytiques qui subsistent.
L'identité, la pureté et la quantité sont des paramètres différents
L'identité répond à la question : quelle molécule est présente ?
Cette étude de l'identité vise à répondre à la question de savoir si le matériau analysé correspond à la substance prévue.
Selon le peptide et le problème examiné, les preuves concernant l'identité peuvent inclure :
- la masse de toute la molécule ;
- données fragmentaires ;
- analyse de la séquence ;
- la caractérisation des groupes finaux ;
- composé d'acides aminés ;
- la disposition des ponts disulfures;
- données spectroscopiques ;
- comparaison chromatographique avec le matériau de référence ;
- un mélange de plusieurs méthodes.
Une méthode peut confirmer un élément particulier de l’identité sans trancher toutes les autres questions structurelles.
Par exemple :
„ la masse attendue de toute la molécule a été observée ”
Il est une conclusion plus étroite que :
„ une structure moléculaire complète a été confirmée ”.
Des études concernant les amides de terminaison et les polluants peptidiques isobaryques montrent pourquoi cette distinction est importante. [4] [5]
Dans les deux cas, des informations supplémentaires étaient nécessaires, allant au-delà de la simple observation d'un pic de masse proche de la valeur attendue.
La pureté répond à la question : qu'est-ce qui se trouve encore dans la prélèvement ?
L'analyse de pureté analyse la composition de la prélèvement dans un certain cadre analytique.
Selon la méthode utilisée, le rapport peut présenter :
- composante principale ;
- les différentes polluants ;
- la quantité totale de polluants détectés ;
- pourcentage de la surface du pic principal ;
- pollution stéréochimique ;
- substances apparentées ;
- partage total massique.
Les différentes classes de polluants peuvent nécessiter des méthodes différentes.
La méthode chromatographique optimisée pour détecter des séquences délétères n’a pas besoin de répondre aux questions relatives à la stéréochimie.
La méthode basée sur la masse ne peut pas distinguer les isomères.
La méthode chirale peut toutefois fournir peu d'informations sur la teneur en eau.
L’objectif de l’utilisation des méthodes complémentaires n’est donc pas uniquement d’obtenir un plus grand nombre de résultats.
Il s’agit de trouver des réponses à diverses questions analytiques que l’une des méthodes ne peut pas résoudre elle-même.
La quantité correspond à la question : combien de substances sont présentes ?
La quantité peut concerner plusieurs paramètres différents.
Cela peut signifier :
- la concentration du peptide dans le milieu réactionnel ;
- la quantité totale de peptide dans le contenant ;
- partage massique du peptide cible ;
- concentration en moles ;
- la quantité par unité de volume ;
- un autre paramètre quantitatif clairement défini.
Chacun de ces modes nécessite une unité appropriée et une base de calcul.
La caractérisation chromatographique quantititative nécessite généralement une calibration appropriée et ne devrait pas se fonder uniquement sur la normalisation de la surface des pixels.
Dans les méthodes correctement élaborées pour déterminer les quantités, il peut également être utile de prendre en considération :
- analyse aminéscologique ;
- résonance magnétique nucléaire quantitative ;
- Méthodes de dilution isotopique ;
- Autres techniques quantitatives validées.
Il est important de noter que les polluants peptidiques apparentés peuvent influer sur certaines mesures quantitatives.
Des études sur la pureté de l’oxytocine soulignaient la nécessité de corriger les résultats en fonction de ces contaminants plutôt que de supposer que chaque acide aminé mesuré ou signal analytique provienne exclusivement de la molécule cible [7].
Exemple : pourcentage de surface de HPLC et quantité réelle de peptide
Imaginez une poudre peptidique hypothétique pour laquelle on obtient :
RP-HPLC-UV, surface du pic principal = 99,0%
et
La proportion massique déterminée du peptide cible = 78,0% dans le matériau obtenu.
Ces résultats ne doivent pas être contradictoires.
Ils ont des paramètres différents et répondent à différentes questions analytiques.
Si on a pesé 10,0 mg de cette poudre hypothétique, et que la valeur validée de la proportion en masse du peptide cible est de 78,0%, la quantité de peptide résultant de cette mesure serait de:
10,0 mg × 0,780 = 7,80 mg.
Il ne faudrait pas automatiquement accepter :
10,0 mg × 0,990 = 9,90 mg
Tout simplement parce que le point central était responsable de 99,0% de la surface UV prise en compte.
C’est uniquement une illustration analytique et ne décrit aucun produit commercial ni aucun matériau expérimental en particulier.
L’étude de la sublancine constitue un véritable exemple de la loi qui sous-tend cette distinction, car lors de l’évaluation de la composition du matériau, on a notamment pris en compte l’eau et le contrejonctif [2].
Les valeurs numériques de cette étude ne doivent pas être appliquées à d'autres peptides.
Incertitude de mesure et cohérence de mesure
Le résultat d’une analyse ne doit pas être considéré comme une valeur d’une précision infinie.
C’est une estimation obtenue grâce à une procédure de mesure spécifique.
L’incertitude de mesure décrit la portée ou la dispersion des valeurs qui peuvent être raisonnablement associées au résultat de la mesure selon la méthode d’évaluation utilisée.
Cela ne signifie pas que le laboratoire sait que son résultat est erroné.
Il informe plutôt des limites de la certitude quantitative.
La cohérence de mesure concerne l’association documentée entre le résultat et un référent approprié au travers d’un processus de calibration.
Elle permet d’assurer la comparabilité des mesures, mais uniquement pour un paramètre précis qui a effectivement été mesuré et dans le cadre d’un lien de référence établi.
Dans une étude visant à développer un biomarqueur, le NT-proBNP a été associé à des méthodes de dilution isotopique corrigées des contaminations, ainsi qu’à une évaluation de l’homogénéité et de la stabilité du biomarqueur. [8]
Cela montre pourquoi une attribution fiable de valeur quantitative nécessite bien plus que la simple lecture du nombre généré par l'appareil.
| Question | Des preuves suffisantes | Ce que ces preuves ne confirment pas automatiquement |
|---|---|---|
| Est-ce un peptide intentionnel ? | Des études structurelles et des tests d’identité appropriés | Quantités, stérilisation et sécurité |
| Quelle partie du signal chromatographique détecté appartient au pic principal ? | Méthode HPLC définie et mode d'intégration | La participation du peptide cible massique |
| Combien de peptide cible se trouve dans la préforme ? | Une étiquette quantitative calibrée ou une méthode appropriée d’attribution de valeurs | Une identité structurelle complète |
| Existe-t-il des variantes stéréochimiques? | Une analyse chirale ou stéréochimique appropriée | Tous les autres types de pollution |
| L’eau ou les anti-ions affectent-ils la masse de l’échantillon ? | Des études conçues spécifiquement pour ces composants | Activités biologiques |
| Le matériau est-il stable pendant un certain temps ? | Données de stabilité appropriées | Stabilité dans toutes les conditions possibles |
| N'ont-ils pas détecté d'organismes micro-organiques vivants selon un test spécifique ? | Des analyses microbiologiques appropriées | Identités chimiques ni pureté |
| Les endotoxines ont-elles été évaluées ? | Un test approprié pour les endotoxines | Stérilisation ou absence de tous les pirogènes |
Comment lire le certificat d’analyse COA ?
Commencez par l’identification de la pièce échantillonnée et de la loterie.
Avant d’interpréter tout résultat d’analyse, il convient de déterminer quel matériau a effectivement été examiné.
Un COA utile devrait combiner les résultats avec des informations d’identification, telles que :
- nom ou description du matériau ;
- identifiant de l'échantillon ;
- le numéro de lot ou de série ;
- les dates correspondantes ;
- forme structurelle ;
- la forme de la saleté, si cela importe ;
- modifications des extrémités ou autres caractéristiques structurelles importantes.
Cela importe car les résultats analytiques concernent une échantillon qui a effectivement été analysée.
Un certificat concernant une partie n’atteste pas directement la composition d’une autre partie.
De même, une analyse effectuée sur une échantillon de matière collective ne prouve pas automatiquement la quantité ni l’état de la matière dans chaque récipient individuel rempli ultérieurement, à moins que le système de prélèvement d’échantillons, de remplissage, d’évaluation de la uniformité et de contrôle du processus ne justifie une telle conclusion.
Il s’agit de questions liées à la cohérence et à l’identification du matériau.
Ils ne signifient pas automatiquement une mauvaise conduite ni une faible qualité.
Le lecteur du rapport a simplement besoin d’un lien qui puisse être défendu :
rapport → échantillon examiné → lot ou matière dont le résultat doit être déterminé.
Lisez la méthode, le résultat, l'unité et la spécification ensemble.
Le COA présente souvent à la fois le critère d’acceptation et le résultat effectif obtenu.
Par exemple :
Spécification : au moins 98,0%
et
Résultat : 99,2%.
Il s'agit de deux informations différentes.
La spécification définit le critère d’acceptation.
Le résultat indique la valeur mesurée pour une échantillon spécifique.
L’unité et la base de mesure sont tout aussi importants.
On peut y rencontrer notamment :
- zone %;
- masse %;
- mg/flacon ;
- mg/mL ;
- µg/mL ;
- mol/L ;
- résultat exprimé en masse sèche ;
- résultat exprimé en matière inerte ;
- résultat pour le matériau dans l’état obtenu.
Ces valeurs ne peuvent pas être remplacées à l’arbitrage.
Par exemple, le résultat défini comme „ en état reçu ” prend en compte le matériau tel qu’il a été examiné, tandis que la valeur anhydre ou corrigée peut mathématiquement exclure l’eau de la base de calcul.
La mention „ pass ” signifie que le résultat indiqué satisfait à un critère d’acceptation spécifique pour le test en question.
Elle ne renforce pas le champ d’application de cette étude.
Par conséquent :
Un test d’identité validé ≠ une stérilité confirmée
et
test de pureté HPLC = teneur déterminée de peptide,
à moins que ces propriétés n’aient été mesurées indépendamment.
Exemple d'interprétation des entrées dans le COA
Les articles suivants sont hypothétiques et servent uniquement à illustrer la manière de interpréter les données analytiques. Ils ne décrivent pas le déroulement d’un tournoi réel ni ne proposent de critères d’acceptation.
| Un post hypothétique | Une interprétation raisonnable | Informations supplémentaires |
|---|---|---|
| Identité : la masse attendue de l'ensemble de la molécule a été observée | Le résultat massique soutient la forme moléculaire attribuée | Mass attendue et mesurée, méthode et preuves structurelles supplémentaires |
| Pureté RP-HPLC-UV : 99,2 % en surface% | Le pic principal est responsable de cette part de réponse de la réponse détectée par le détecteur dans cette méthode. | Chromatogramme, identificateur de la méthode, longueur d’onde, mode d’intégration |
| Contenu du peptide : 78,0% en état obtenu | Le résultat quantitatif correspond à la masse totale du matériau obtenu. | Méthode d'étiquetage, calibration, incertitude, façon d'inclure les polluants |
| Eau : rapporté séparément | La teneur en eau a été mesurée indépendamment | Unités, méthode et base de calcul |
| Przeciwjon : identifié et quantifié | La composante liée à la forme de la saleté a été évaluée | Type de contre-ion, sa quantité et la manière de le signaler |
| Endotoxines : pas étudié | D’après COA, aucun résultat n’est conclu quant aux endotoxines. | Un test spécifique serait nécessaire |
| Sterilisation : pas étudié | Le rapport ne permet pas de conclure à une stérilité | Ni le HPLC ni le MS ne peuvent remplacer cette étude. |
Les distinctions présentées reposent sur des études concernant la pureté du peptide principal, des ions anti-joniques et la détermination de la masse molaire. [1] [2] [9]
Les chiffres et le format de la table sont uniquement destinés à des fins éducatives.
Consultez le chromatogramme et le spectre
Les données analytiques supplémentaires permettent d’interpréter correctement les résultats résumés dans le COA.
Dans le cas d’un chromatogramme, il convient de noter :
- identifiant de l'échantillon ;
- identificateur de la méthode ;
- axe du chromatogramme ;
- le type de détecteur ;
- la longueur de la fréquence ;
- durées de rétention importantes ;
- les marques de points ;
- une table des polluants ;
- les résultats de l’intégration ;
- Barres de reporting.
Le chromatogramme, coupé de manière à montrer uniquement le grand pic principal, peut omettre des informations nécessaires à une interprétation correcte du résultat de la pureté.
Dans le cas de la spectrométrie de masse, un contexte utile peut inclure :
- la forme moléculaire attendue ;
- la masse attendue ;
- ions observés ;
- les états de charge attribués ;
- déconvolucion ;
- erreur de masse ;
- des données fragmentaires, si elles sont applicables ;
- La base de l'attribution de la structure.
Le spectre de masse de toute la molécule, la masse moléculaire décomptée et les preuves structurelles basées sur la fragmentation sont liées entre elles, mais elles ne signifient pas la même chose.
Le COA n'est pas forcément composé de tous les fichiers bruts de l'appareil.
Cependant, les conclusions analytiques résumées dans ce document devraient pouvoir être liées à la documentation source, laquelle pourrait être vérifiée si des questions surviennent concernant l'attribution d'une structure ou d'un résultat numérique.
„ Non détecté ” et „ pas étudié ” signifient quelque chose complètement différent.
„ Non détecté ” signifie que la méthode analytique utilisée n’a pas détecté le composant examiné dans les conditions et avec la sensibilité spécifiées.
Cela ne signifie pas que le taux réel soit exactement égal à zéro.
„ En dessous de la limite de quantification ” signifie que le composant peut être présent à un niveau que la méthode n’est pas en mesure de quantifier de manière fiable.
C'est une autre situation.
„ Pas étudié ” signifie que le test n’a pas été effectué pour cette propriété.
Cela ne doit pas être interprété comme :
„ résultat correct ”
ni:
„ substance absente ”.
Une interprétation correcte des informations relatives à la détection ou à la quantification nécessite également la connaissance de :
- la limite de détectabilité ou de caractérisation ;
- unités ;
- Les bases de la déclaration ;
- de la méthode utilisée ;
- du mode d'obtention de l'échantillon.
Qu’en dit une étude de laboratoire indépendante ?
Un laboratoire indépendant peut fournir une analyse complémentaire pour la prélèvement envoyé.
Cela pourrait augmenter le nombre de preuves disponibles concernant un matériau particulier.
Seu seul nom :
„ analysées par un laboratoire indépendant ”
Il ne précise cependant pas :
- ce qui a été examiné précisément ;
- le nombre d’échantillons analysés ;
- qui a choisi la sélection ;
- qui l'a prise ;
- si elle était représentative ;
- du parti dont elle faisait partie ;
- les méthodes utilisées ;
- le rapport peut-il être vérifié ;
- la spécification correspond-elle au matériel qui sera ultérieurement distribué ;
- des propriétés que l’étude n’avait pas du tout couvertes.
Les questions les plus utiles sont donc les suivantes :
l’identité de l’échantillon + l’identifiabilité de la partie + la méthode de prélèvement de l’échantillon + la portée de l’analyse + l’authenticité du rapport de laboratoire.
Une étude indépendante ne supprime pas les restrictions appliquées aux méthodes utilisées.
Les HPLC réalisés par un laboratoire externe restent une étude sur les HPLC.
Il ne devient pas un test de stérilité, un indicateur de la teneur en peptide, une analyse stéréochimique ou une étude de l’activité biologique uniquement parce qu’il a été réalisé par un organisme indépendant.
C’est pourquoi il est important de mesurer la COA principalement en fonction de la portée de l’analyse et des possibilités de dépistage de la souche, et non seulement en fonction du logo du laboratoire ou d’une forte valeur % indiquée au début du document.
Qu’ignorent les analyses routinières ?
HPLC ne confirme la stérilité
L'analyse routinière des peptides HPLC examine les composants chimiques en fonction de leur comportement chromatographique.
Ce n'est pas une méthode de détection de micro-organismes vivants.
Un chromatogramme pur ne peut donc pas confirmer que l’échantillon est stérile.
La stérilité est un aspect microbiologique qui nécessite des méthodes appropriées ainsi que des contrôles du processus de production.
Même l’analyse séparée de la stérilité présente des limitations liées à la collecte des échantillons, car seule une partie du matériel utilisé dans le test est directement analysée.
C’est pourquoi la garantie de la stérilité dans la production pharmaceutique repose sur un système de production et de contrôle plus large, et non seulement sur une inspection finale du produit.
Les directives de la FDA concernant la production aseptique considèrent la maîtrise microbiologique et l’essai de la stérilité comme des éléments distincts du processus [10].
Par conséquent :
Haute pureté HPLC ≠ stérilité
et
L'absence de contaminants chromatographiques visibles ≠ l'absence d'organismes micro-organismes.
L’étude des endotoxines répond à une autre question
Les endotoxines sont des composants bactériens, en particulier une matière liée aux lipopolysaccharides des bactéries Gram- négatives.
Ils ne sont pas les mêmes que les bactéries vivantes.
L’étude des endotoxines bactériennes répond donc à une autre question que le test de stérilité.
Théoriquement, un échantillon ne peut pas contenir des bactéries vivantes détectables, mais il peut néanmoins contenir certains composants d'origine bactérienne.
De même, un test de stérilité ne peut pas automatiquement remplacer l’analyse des endotoxines.
La matrice de prélèvement peut également influer sur l'étude des endotoxines.
Il est donc important d’adapter correctement la méthode et de contrôler les interférences.
Les directives de la FDA concernant les pirogènes et les endotoxines abordent les limitations analytiques et la différence entre les endotoxines bactériennes et d'autres substances pirogènes. [11]
L’analyse routinière de la pureté du HPLC ne peut pas remplacer ni l’analyse de la stérilité ni l’analyse des endotoxines.
La pureté chimique ne confirme pas l’activité biologique
La prélèvement peut comporter :
- la masse moléculaire attendue ;
- une surface haute du pic principal chromatographique ;
- une quantité relativement faible de polluants chimiques détectés,
et en même temps ne présenter aucune fonction biologique déterminée confirmée.
La fonctionnelle peut également dépendre de :
- déformation ;
- les positions des ponts disulfure;
- l’agrégation ;
- conformité structurelle ;
- État des modifications ;
- les conditions du test ;
- du système biologique utilisé.
L'étude sur la synthèse de BPTI montre bien l'intérêt de diviser ces questions en plusieurs parties.
Les scientifiques ont combiné la caractérisation analytique et la biochimie avec un test de blocage de la trypsine [12].
Globalement, ces résultats fournissaient des preuves plus solides concernant le matériau examiné.
Aucun seul mesure n'a remplacé les autres.
Par conséquent :
La pureté chimique ≠ l'activité biologique
et
L’activité biologique dans un seul test ≠ la caractéristique structurelle ou productrice complète.
COA n’est pas une évaluation de la sécurité clinique
COA présente les résultats des analyses effectuées sur l’échantillon décrit.
Il n'est pas établi :
- la tolérance clinique ;
- la sécurité des expositions chez l'homme ;
- d'une dose appropriée ;
- interactions ;
- efficacité ;
- des effets à long terme ;
- utilité pour une personne particulière.
Ces questions nécessitent d'autres types de preuves.
Cette règle reste vraie même lorsque les résultats analytiques sont précis et que l'identité du peptide a été correctement confirmée.
L'analyse de la pureté peut caractériser certains aspects du composant chimique.
Il ne peut pas transformer un rapport analytique en étude clinique ni en évaluation de la sécurité d'utilisation chez l'homme.
Un point horaire ne confirme pas la durée de conservation
COA décrit généralement le matériau à un moment donné de l’étude.
Les peptides peuvent ensuite subir des modifications liées à :
- dégradation ;
- par oxydation ;
- hydrolisation ;
- par déméthylation ;
- agglomération ;
- absorption de l’humidité ;
- par des réorganisations structurelles ;
- par d'autres processus dépendants des propriétés de la molécule et des conditions de l'environnement.
Le résultat obtenu à un moment donné ne confirme donc pas une stabilité illimitée.
Le délai de conservation nécessite des données associant les conditions de stockage définies avec un suivi analytique du matériel au fil du temps.
Dans une étude sur l’exenatide, une méthode chromatographique a été développée permettant d’identifier la stabilité et de caractériser les produits de dégradation issus de plusieurs conditions de stress. [13]
Cette étude montre comment les produits de dégradation peuvent être séparés du peptide d'origine.
Cependant, il ne définit pas un temps de conservation universel pour tous les peptides, et les conditions de stress artificielles ne doivent pas automatiquement être assimilées à des conditions de conservation normales.
La preuve la plus forte doit correspondre à la force des preuves.
Une interprétation scientifiquement prudente ne devrait pas aller au-delà de la portée des mesures effectuées.
Par exemple, la COA peut justifier la déclaration suivante :
„Dans l’échantillon étudié, on a obtenu un résultat de masse de la totalité de la molécule compatible avec le peptide assigné, la part de surface principale du pic déterminée selon la méthode HPLC utilisée, ainsi que la teneur de peptide spécifiée séparément.
Il s’agit d’un ensemble de preuves analytiques très précieux.
Cependant, cela ne signifie pas automatiquement :
„ Le peptide a été complètement caractérisé ; il est stérile, biologiquement actif, sûr, stable à long terme et adapté à l'utilisation chez l'homme ”.
Il ne s'agit pas de remettre en question la valeur des études de laboratoire.
Il ne faut pas non plus s’attendre à ce que toute méthode analytique puisse répondre à toutes les questions possibles.
Le plus important est la connexion :
toute assertion → avec un argument qui peut réellement la justifier,
avec une mention claire des questions auxquelles aucune réponse n'a été fournie.
Questions fréquemment posées
1. L’indication « 99% de pureté » signifie-t-elle que le produit est sûr ?
Non. Le pourcentage de pureté décrit la composition de l’échantillon selon une méthode analytique spécifique, et non la probabilité de sécurité. De plus, cette valeur peut indiquer la présence d’un signal chromatographique, et non la présence physique en masse du peptide cible. Les études du bilan massique des peptides montrent pourquoi l’eau, les anti-ions et d’autres composants peuvent entraîner des différences entre ces valeurs [2]. Malgré la pureté analytique, la molécule cible elle-même peut également posséder des propriétés biologiques propres. Un taux de pureté élevé peut donc soutenir la caractérisation chimique de l’échantillon examiné, mais ne remplace pas les preuves toxicolographiques, pharmacologiques, microbiologiques ou cliniques relatives à la sécurité.
2. Le HPLC confirme-t-il la stérilité ?
Non. L’analyse routinière du HPLC du peptide décompose et détecte les composants chimiques en fonction de leur comportement chromatographique. Elle ne détermine pas si la prétendue présence de micro-organismes dans l’échantillon est réelle. La stérilité est une propriété distincte nécessitant des analyses microbiologiques appropriées et un contrôle du processus de production. Les directives de l’FDA concernant la production aseptique abordent la surveillance microbiologique indépendamment de l’analyse chimique. [10] Par conséquent, un chromatogramme propre, un taux élevé de surface de la zone principale ou un délai de rétention prévus ne peuvent remplacer les preuves de stérilité.
3. Qu’est-ce que le pourcentage de surface de l’HPLC exactement ?
Le pourcentage de surface HPLC signifie généralement la proportion du signal intégré attribué au signal chromatographique principal dans le signal total pris en compte. Ce résultat dépend de la qualité de la séparation, de la réponse du détecteur, de la longueur d’onde, des règles d’intégration, des limites de rapport et d’autres conditions de la méthode. Il ne signifie donc pas automatiquement une participation physique du peptide massif à l’ensemble de la solution. Les études de pureté du peptide de pointe montrent pourquoi les isomères non séparés peuvent compliquer l’interprétation. [1] Le pourcentage de surface HPLC doit donc être considéré comme le résultat d’une méthode analytique spécifique, dont la base de mesure doit être clairement définie.
4. Peut-on trouver plusieurs substances dans un seul pic HPLC ?
Oui. Deux ou plusieurs composants peuvent s’élever suffisamment près les uns des autres pour ne pas être correctement séparés dans un système chromatographique donné et ressembler à un seul pic. C’est pourquoi même un pic symétrique visuellement ne constitue pas une preuve absolue d’homogénéité moléculaire. L’étude des peptides cycliques a montré que d’autres modes de chromatographie donnaient un mode de séparation différent des RP-HPLC pour les contaminants [3]. Cela ne signifie pas que chaque pic principal contienne des substances cachées. Cela montre cependant que la capacité de séparation dépend de la sélectivité de la méthode et que des techniques analytiques supplémentaires peuvent être nécessaires dans le cas de structures proches entre elles.
5. La masse moléculaire correcte confirme-t-elle la séquence correcte du peptide ?
Non. La masse de toute la molécule conforme à la valeur attendue constitue une preuve précieuse quant à l’identité, mais elle n’est pas nécessaire pour confirmer l’ordre des acides aminés, la stéréochimie, le type des groupes terminales, la position des modifications ni toutes les autres caractéristiques structurelles. Les études sur les polluants synthétiques de peptides ont révélé des constituants de masse identique mais avec des modifications situées dans des positions différentes, ce qui nécessitait des informations analytiques supplémentaires. [4] Une évaluation complète de l’identité nécessite donc des méthodes adaptées aux incertitudes structurelles spécifiques du peptide en question.
6. Comment la teneur en peptide se différencie-t-elle de la pureté ?
La teneur en peptide indique le nombre de peptide cible défini dans le matériau selon une base quantitative déterminée. La pureté peut cependant signifier la proportion de signal chromatographique attribué au principal constituant ou un autre paramètre de pureté défini. L’eau, les anti-ions, les résidus de traitement et les composés structuralement apparentés peuvent rendre ces valeurs différentes. Lors de l’étude des sublannines, plusieurs de ces composants ont été mesurés séparément lors de l’évaluation du bilan de masse. [2] Le résultat de la teneur en peptide et du pourcentage de surface HPLC doit donc être interprété séparément, à moins que le système analytique validé ne détermine clairement la relation entre ces deux paramètres.
7. L’eau et les antioxydants peuvent-ils influer sur la quantité de peptide dans le produit en poudre ?
Oui. L’eau et les antioxydants augmentent la masse physique totale de la solution et peuvent donc réduire la partie de la masse qui revient au peptide cible lui-même, si le résultat est indiqué pour un matériau obtenu à partir de la matière. Les études sur les sublancines et les antioxydants peptidiques montrent pourquoi ces composants peuvent nécessiter une analyse distincte. [2] [9] Leur présence ne doit pas signifier une erreur de synthèse ou une contamination, car l’antioxydant peut être une partie de la forme de sel prévue. Les questions clés concernent donc le type de forme moléculaire analysée, la quantité des différents composants et la base de calcul utilisée.
8. Est-ce que le contrejon est la même chose que la contamination peptidique ?
Pas toujours. L’antijon peut être un constituant attendu de la protéine peptidique, tandis que la contamination liée à la séquence est une autre molécule peptidique. Il s’agit donc de différentes catégories analytiques, même si les deux peuvent influer sur la composition totale de l’échantillon. Dans les études comparant les antijons peptidiques, des différences liées à la séquence et à la forme des sels ont été observées lors des expériences de pénétration par les membranes. [9] Si l’antijon est important pour la caractérisation du matériau, son type et sa quantité doivent être rapportés séparément et non tirés de la pureté chromatographique du pic principal du peptide.
9. La spectrométrie de masse classique est-elle capable de distinguer les variantes D- et L-aminosuriques ?
Le seul calcul de la masse totale de la molécule ne permet généralement pas de distinguer les structures ayant la même composition élémentaire, qui diffèrent uniquement par leur stereochemistry. Les variantes D et L correspondantes peuvent donc avoir une masse moléculaire identique. Si la question concerne la configuration spatiale, une analyse chirale ou stéréochemique appropriée est nécessaire. Dans le cadre de l’étude de la pureté chirale des peptides, un procédé spécialement conçu a été utilisé, qui prend en compte les changements stéréochimiques qui surviennent lors de la préparation de l’échantillon. [6] Le problème est structurel, donc le simple accroissement de la précision du calcul de la masse ne résout pas cette ambiguïté.
10. Pourquoi le numéro de parti sur la COA est-il important ?
Le numéro de lot ou de série permet de relier les résultats analytiques à un matériau spécifique qui a été examiné. Les résultats obtenus pour un même lot ne peuvent pas automatiquement être transférés à un autre lot ou à chaque contenant préparé à un autre moment. Les études concernant les matériaux de référence certifiés évaluent des propriétés telles que la uniformité et la stabilité, plutôt que de les imputer sur la base d’une seule mesure. [8] Le numéro de lot conforme constitue donc un élément important d’identification, même s’il ne prouve pas en soi la validité de la collecte des échantillons, du stockage, de la manipulation du matériau ou de tous les autres éléments du système de contrôle.
11. Le „ non détecté ” signifie zéro ?
Non. „ Non détecté ” signifie que la méthode utilisée n’a pas détecté la substance analysée dans les conditions et dans les limites de sa sensibilité. Cela ne signifie pas que la quantité réelle soit exactement nulle. Le résultat situé en dessous de la limite de détection ou de spécificabilité doit être interprété en conjonction avec la valeur limite correspondante, la unitité, la base d’échantillonnage et les conditions analytiques. Les directives relatives aux tests endotoxiques évoquent également l’importance de la sensibilité des méthodes et des éventuelles interférences. [11] Un résultat scientifiquement justifié doit donc se référer à ce que la méthode a pu détecter, et non à une affirmation absolue de l’absence totale de la substance.
12. Qu'implique l'incertitude de la mesure dans le rapport ?
L’incertitude de mesure décrit la dispersion des valeurs qui peuvent être raisonnablement associées au résultat obtenu selon l’évaluation appliquée. Cela ne signifie pas que le laboratoire considère son résultat comme erroné. Cela indique plutôt les limites de la certitude statistique de l’estimation en question. Dans les études concernant les matériaux de référence, l’attribution de valeurs peut être prise en compte, notamment, par l’incertitude de l’estimation elle-même, la homogénéité et la stabilité. [8] L’incertitude doit donc être interprétée en liaison avec sa définition, les unités utilisées, le niveau de recouvrement appliqué et la grandeur mesurée précisément.
13. Le test réalisé par un laboratoire indépendant confirme-t-il que tous les contenants contiennent le même matériau ?
Non. Une étude indépendante fournit des preuves concernant les échantillons ou les prélèvements de matières effectivement soumis à l’analyse. La possibilité de transférer ces résultats vers chaque contenant dépend notamment de la méthode de prélèvement des échantillons, de l’identifiabilité de la partie, de la uniformité du matériau, du processus de remplissage, du stockage et d’autres éléments de contrôle. Lors de l’élaboration des matériaux de référence certifiés, l’uniformité est évaluée et non simplement supposée à partir d’une seule mesure. [8] L’indépendance du laboratoire peut renforcer l’indépendance de la mesure elle-même, mais elle ne prouve pas automatiquement l’identité de toute la partie.
14. Les résultats de stérilité et d’endotoxines peuvent-ils être utilisés de manière interchangeable ?
Non. L’étude de la stérilité concerne les micro-organismes vivants, tandis que l’étude des endotoxines bactériennes concerne certains composants bactériens qui peuvent rester dans le matériau même en l’absence de bactéries vivantes. Il s’agit donc de deux questions analytiques distinctes. L’identification des endotoxines peut également être affectée par les interférences résultant de la matrice de l’échantillon, de sorte que l’adaptation adéquate de la méthode est importante. [11] Ni la stérilité ni le niveau des endotoxines ne peuvent être déterminés par la pureté habituelle de l’HPLC. Si ces études ont été réalisées, elles doivent être signalées séparément.
15. La pureté chimique confirme-t-elle l’activité biologique ?
Non. L’analyse chimique et l’analyse fonctionnelle fournissent d’autres types d’informations. Un peptide peut avoir une masse moléculaire attendue et une pureté chromatographique élevée sans avoir été confirmé comme ayant un effet dans un test biologique spécifique. Dans l’étude concernant le BPTI, la caractérisation structurelle et biochimique a été combinée avec un test de blocage de la trypsine, au lieu d’hypothéser que un seul résultat analytique suffise pour toutes les conclusions. [12] Les preuves fonctionnelles sont également spécifiques à la molécule, au système expérimental et au test spécifique considéré. La pureté de l’échantillon ne doit donc pas être qualifiée de fonctionnellement confirmée si l’activité correspondante n’a pas été réellement étudiée.
16. Le COA confirme-t-il que le peptide restera stable à l’infini ?
Non. Le COA décrit l’échantillon au moment ou au stade de l’étude indiqué dans le rapport. Lors de son stockage ultérieur, le peptide peut subir une dégradation, une oxydation, une hydrolyse, une agglomération, une absorption d’humidité et d’autres modifications dépendantes de ses propriétés et de son environnement. Les études de dégradation de l’exenatide ont montré l’importance des méthodes indiquant la stabilité, capables de séparer les produits de la dégradation de la molécule mère. [13] Cependant, les études stressantes ne déterminent pas automatiquement le délai de conservation dans des conditions normales. Chaque affirmation concernant la durée de conservation nécessite des données de stabilité appropriées obtenues dans des conditions et un délai spécifiques.
17. Qu’est-ce qu’il faut vérifier en premier lors de la comparaison de deux peptides COA ?
Il est d’abord utile de comparer l’identité des échantillons, les numéros de lot, les méthodes analytiques utilisées, les unités et la base de mesure, plutôt que de comparer immédiatement les plus grandes valeurs en pourcentage visibles dans les documents. Deux rapports peuvent présenter une valeur déterminée comme „ pureté ” tout en mesurant d’autres propriétés ou ayant une capacité de séparation différente des différentes classes de contaminants. Les études utilisant des méthodes chromatographiques orthogonales et une mesure du bilan massique montrent l’importance de ces différences. [2] [3] Sans déterminer si ces deux chiffres concernent la même grandeur et des méthodes suffisamment comparables, une comparaison directe des pourcentages peut être trompeuse.
18. La pureté de 99% HPLC signifie-t-elle une teneur de 99% peptides ?
Non. Le résultat 99% HPLC signifie généralement que le signal principal a été attribué à 99% réponses détectées par le spectromètre chromatographique. Le résultat 99% de la concentration du peptide nécessiterait cependant une quantification indiquant que le peptide cible représente 99% de la quantité d’échantillon correspondante selon une base clairement définie. L’eau, les anti-ions, les résidus de solvants et d’autres composants peuvent augmenter la masse physique de l’échantillon sans affecter proportionnellement le pourcentage de surface RP-HPLC-UV. [2] Par conséquent, les deux valeurs peuvent différer considérablement, bien que l’un ou l’autre des deux résultats ne puisse pas être erroné.
19. Peut-on tester la pureté d'un peptide en utilisant le test HPLC et obtenir une stéréochimie incorrecte malgré tout ?
Dans une certaine mesure, oui. La RP-HPLC classique n’est pas obligée de distinguer tous les isomères stéréochimiques, surtout lorsque les molécules présentent des propriétés physicochimiques très similaires. De même, une simple mesure de la masse de la molécule entière ne permet pas de distinguer les isomères stéréochimiques ayant la même composition élémentaire. Les études sur la pureté stéréochimique des peptides montrent pourquoi des méthodes spécialisées et un contrôle précis de la préparation de l’échantillon peuvent être nécessaires. [6] La capacité d’une méthode de PLRP-HC à distinguer un isomère stéréochimique dépend de la sélectivité démontrée de cette méthode, et non seulement du fait que l’analyse de RP-HPLC a été effectuée.
20. Le COA confirme-t-il que toute la partie est identique à l'échantillon examiné ?
Pas individuellement. Le COA présente les résultats liés à l’échantillon et à la partie spécifiée dans la documentation analytique. L’extension de ces résultats à toute la partie nécessite un système de prélèvement d’échantillons approprié, une cohérence du processus, une uniformité, une identifiabilité et d’autres contrôles de production. L’élaboration de matériaux de référence montre pourquoi la uniformité est évaluée comme une propriété distincte et non simplement comme une hypothèse. [8] Le COA peut donc fournir des preuves analytiques valables concernant la partie, mais la force des conclusions concernant toute la matière dépend d’un système de qualité plus large reliant l’échantillon examiné à la partie représentée par le rapport.
Restrictions sur l'interprétation de la pureté des peptides et de la COA
Lors de l’interprétation des rapports analytiques sur les peptides, il convient de tenir compte de plusieurs limitations.
Premièrement, la pureté dépend de la méthode. Le résultat de RP-HPLC-UV décrit ce que mesure un système chromatographique et un détecteur spécifiques. Un autre mécanisme de séparation peut révéler des composants que la première méthode n’a pas pu séparer. [1] [3]
Deuxièmement, la surface chromatographique et la masse physique ont des bases de mesure différentes. L’eau, les antioxydants, les résidus d’autres substances et les différences dans la réponse du détecteur peuvent entraîner que le pourcentage de surface de l’HPLC ne corresponde pas à la masse totale du peptide cible [2].
Troisièmement, la masse moléculaire attendue constitue une preuve forte, mais incomplète de l’identité. Les isomères, les variantes positionnelles et les différences stéréochématiques peuvent nécessiter l’utilisation de méthodes structurelles supplémentaires. [4] [5] [6]
Quatrièmement, les méthodes analytiques elles-mêmes peuvent entraîner des artefacts. La préparation de la prélèvement, l’hydrolyse, la dérivation, le stockage et la manipulation du matériel peuvent modifier l’analyt ou la caractéristique analysée. [6]
Cinquièmement, un échantillon analysé n’est pas automatiquement équivalent à tout récipient ni au même matériau à un moment ultérieur. L’uniformité, l’identifiabilité de la partie et la stabilité sont des questions distinctes. [8]
En sixième lieu, les études chimiques ne répondent pas aux questions microbiologiques. L’HPLC et la spectrométrie de masse ne confirment ni la stérilité ni le niveau d’endotoxines. [10] [11]
Septièmement, la caractérisation chimique ne confirme ni l’activité biologique ni la sécurité clinique. Ces questions sont distinctes et nécessitent d’autres types de preuves. [12]
Enfin, le résultat obtenu à un moment donné ne confirme pas la stabilité à long terme. L’évaluation de la stabilité nécessite des données appropriées obtenues au fil du temps et dans des conditions spécifiques. [13]
Ces restrictions ne signifient pas que COA n'est pas très utile.
Ils expliquent toutefois comment il doit être interprété correctement.
Résumé
Le certificat d’analyse peptidique est le plus utile lorsque nous le considérons comme un ensemble de mesures analytiques distinctes, et non comme une seule et unique évaluation de la qualité.
La valeur de pureté indiquée au début n’est qu’un début d’interprétation.
Un résultat tel que 99% surfaces RP-HPLC décrit le déclin de la réponse du détecteur dans une méthode chromatographique spécifique. Cela ne signifie pas automatiquement que 99% masses physiques de poudre constituent le peptide cible. [1] [2]
La spectrométrie de masse peut fournir des preuves solides concernant la masse moléculaire et certaines caractéristiques structurelles, mais la conformité de la masse de toute la molécule avec la valeur attendue ne confirme pas par elle-même tous les aspects de la séquence, de la structure des extrémités, de la stereochimie ni de la liaison moléculaire [4] [5] [6].
La teneur en peptide nécessite une base quantitative propre.
L'eau, les ions, les résidus d'autres substances et les polluants peptidiques apparentés peuvent influer sur la relation entre la masse du matériau solide et la quantité réelle de peptide cible [2] [7] [9].
C’est pourquoi, lors de la lecture du COA, il est utile de poser plusieurs questions séparément :
Quelle échantillon a été analysée ?
À quelle partie cela concerne-t-il ?
Quelle méthode analytique a été utilisée ?
Qu'est-ce que la valeur en pourcentage rapportée signifie exactement ?
Quelles unités et quelle base de calcul ont été utilisées ?
L'identité moléculaire a-t-elle été étudiée indépendamment de la pureté chromatographique?
La teneur réelle du peptide a-t-elle été déterminée ?
Ont-ils été mesurés des échantillons d’eau ou de contre-jets dans les cas appropriés ?
Est-ce que la stéréochimie est évaluée si elle est importante pour la molécule en question ?
Quelles propriétés n'ont-elles pas été étudiées ?
Il est particulièrement important de faire la distinction entre „ non détecté ” et „ non étudié ”.
Le fait d’être sans résultat ne doit pas être interprété comme une preuve d’un passage positif au test.
De même, une étude réalisée par un laboratoire indépendant peut constituer une source d’informations précieuse, mais la mention „ testée par un tiers ” ne décrit pas le mode d’obtention de l’échantillon, sa relation avec le lot, le niveau d’analyse, l’homogénéité ni le fait que le résultat puisse être transféré sur tout récipient.
Les méthodes chimiques courantes ont également des limites bien définies.
HPLC ne confirme pas la stérilité.
La pureté de l'HPLC n'est pas confirmée par le niveau d'endotoxines.
La pureté chimique ne confirme pas l’activité biologique.
Le COA n'est pas une évaluation de la sécurité clinique.
Un seul résultat analytique obtenu à un moment donné ne confirme pas une stabilité illimitée. [10] [11] [12] [13]
La interprétation la plus scientifiquement justifiée est donc toujours aussi large que les preuves disponibles le permettent – et pas plus large.
Un rapport analytique bien documenté peut fournir des informations solides sur l'identité, la composition et la quantité du matériau contenu dans l'échantillon examiné.
Sa valeur augmente lorsque les méthodes appliquées, la base de mesure, l’identifiabilité du matériau et les limites des différents tests sont clairement décrites.
La règle la plus importante est simple :
l’identité, la pureté, la quantité, la stéréochimie, l’état microbiologique, l’activité biologique, la stabilité et la sécurité sont des questions différentes. Un certificat d’analyse fiable aide à répondre aux questions qui ont effectivement été étudiées – il ne doit pas être utilisé pour suggérer des réponses à des questions qui n’ont pas été étudiées.
Avis de non-responsabilité
Cet article a uniquement un caractère éducatif et scientifique. Il explique les principes généraux de la chimie analytique des peptides, l’interprétation des certificats d’analyse (COA), la chromatographie HPLC, la spectrométrie de masse, la quantification du contenu de peptide, l’évaluation des contaminants, l’identification du matériau et les méthodes de recherche connexes. Il ne constitue pas de conseil médical, de recommandations de produit, d’évaluation de la sécurité, d’autorisation de fabrication ni de confirmation que tout peptide ou tout matériau contenant un peptide est approprié à l’utilisation chez l’homme. Les résultats analytiques doivent toujours être interprétés en fonction de l’échantillon spécifique, de la partie, de la méthode utilisée, de la base de mesure, des spécifications, du problème analytique examiné et des limites du test effectué.
Références
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