Synthèse peptidique : méthode en phase solide, en solution et méthodes de production

La synthèse peptidique est un processus contrôlé de création de chaînes d'acides aminés ayant une séquence spécifique. Dans la synthèse chimique, les acides aminés choisis sont reliés entre eux par liaisons peptidiques, tout en contrôlant d'autres groupes réactifs présents dans ces molécules. Le but n'est donc pas seulement de lier des acides aminés, mais d'obtenir une structure moléculaire spécifique avec une séquence, une stéréochimie, une structure des extrémités de chaîne et – si nécessaire – des caractéristiques structurales supplémentaires déterminées.

Parmi les principales méthodes figurent la synthèse peptidique sur phase solide (SPPS), la synthèse classique en solution et les méthodes plus récentes de synthèse peptidique en phase liquide (LPPS), qui utilisent des supports solubles ou des marqueurs moléculaires. Les laboratoires de recherche et les unités de production peuvent également combiner différentes approches, préparer séparément des fragments plus courts pour les assembler ensuite, ou utiliser l'expression biologique si elle s'avère plus adaptée à une séquence donnée.

La comparaison de la synthèse chimique et de l'expression bactérienne de polypeptides constitués de 20 à 40 résidus d'acides aminés met en évidence un principe important : le choix pratique de la méthode de production dépend de la molécule spécifique, de sa séquence, de sa propension à l'agrégation, des modifications requises, de l'échelle de production et des exigences analytiques. [1]

L'obtention de la séquence d'acides aminés souhaitée n'est qu'une étape de la production du peptide.

Tout le processus peut inclure :

conception de la séquence → préparation des blocs de construction → protection des groupes fonctionnels → couplage → déprotection → assemblage de la chaîne → clivage ou ligature des fragments → repliement final de la structure → purification → confirmation de l'identité → analyse des impuretés → détermination de la teneur → caractérisation finale.

Pour certains peptides, des étapes supplémentaires sont également nécessaires, telles que la cyclisation, la formation de ponts disulfures, le repliement, la conjugaison ou d'autres modifications chimiques.

Pour cette raison, l'assemblage correct de la chaîne ne signifie pas automatiquement que le matériel final possède l'identité, la pureté, la stéréochimie, la conformation, la stabilité ou d'autres caractéristiques requises.

Qu'est-ce que la synthèse des peptides ?

Création d'une séquence d'acides aminés spécifique

Peptide il est composé de résidus d'acides aminés reliés par des liaisons peptidiques.

Le but de la synthèse peptidique est de créer ces liaisons dans un ordre prédéterminé, souvent tout en contrôlant :

• de type d'acides aminés ;
• ordre des acides aminés dans la séquence;
• stéréochimie;
• structures N-terminales;
• structures de l'extrémité C;
• modification des chaînes latérales;
• les positions des ponts disulfure;
• cyclisation;
• d'autres caractéristiques structurelles requises.

La séquence revêt une importance fondamentale, car une composition en acides aminés identique peut donner lieu à des molécules différentes si les acides aminés se trouvent dans un ordre différent.

Affirmer qu'une molécule donnée est „ un peptide composé de cinq acides aminés ” fournit donc très peu d'informations sur sa structure réelle. Pour décrire correctement la molécule, il faut connaître la nature des acides aminés, leur ordre, leur stéréochimie, les groupes terminaux ainsi que d'éventuelles modifications supplémentaires.

Deux peptides peuvent ainsi avoir exactement la même composition en acides aminés et pourtant être des structures moléculaires différentes.

Des différences supplémentaires peuvent résulter de modifications des extrémités de chaîne, de la présence de ponts disulfure, d'un squelette cyclique, de modifications des chaînes latérales ou d'une configuration stéréochimique différente.

La synthèse chimique des peptides utilise généralement des acides aminés dont les groupes réactifs ont été sélectivement protégés.

Les groupes protecteurs temporaires permettent de créer une liaison chimique spécifique voulue tout en limitant les réactions concurrentes sur d'autres sites de la molécule.

Au cours des étapes de synthèse suivantes, ces groupes sont éliminés ou modifiés.

Réaction contrôlée au lieu d'une connexion spontanée

Dans les descriptions chimiques de base, la formation d'une liaison peptidique est souvent présentée comme une réaction de condensation, dans laquelle deux acides aminés s'unissent avec l'élimination nette d'une molécule d'eau.

Une telle équation décrit le bilan global de la réaction.

Il ne faut cependant pas l'assimiler à la manière dont on réalise en pratique la synthèse peptidique contrôlée.

Le seul mélange d'acides aminés libres ne permettrait pas de déterminer de manière fiable :

• quel groupe aminé doit réagir;
• quel groupe carboxyle doit réagir ;
• quel aminokwas doit être le premier ;
• qui doit se trouver en second ;
• est-ce que les chaînes latérales vont commencer à réagir ;
• La stéréochimie sera-t-elle conservée ?;
• ne se formera-t-il pas de nombreux produits indésirables.

Dans la synthèse chimique pratique, on utilise donc des stratégies contrôlées d'activation et de protection des groupes fonctionnels.

Un groupe dérivé d'un groupe carboxyle est généralement activé de manière à pouvoir réagir efficacement avec un groupe aminé choisi. Les groupes protecteurs, l'ordre des réactions, la chimie du support, les réactifs de couplage, l'environnement du solvant et les méthodes d'isolement contribuent conjointement à orienter la réaction vers le produit souhaité.

La synthèse efficace d'un peptide exige donc le contrôle tant de la chimie qui doit avoir lieu que de celle qu'il faut éviter.

Un bon exemple est la formation d'aspartimide.

Les chercheurs ont développé une méthode alternative de protection du groupe carboxyle, dont le but était de limiter cette réaction secondaire problématique lors de l'assemblage du peptide. [2]

L'étude révèle un principe plus large de la chimie des peptides : la prévention des transformations moléculaires indésirables peut être tout aussi importante que la formation de la liaison peptidique appropriée.

Quand peut-on considérer qu'un peptide est prêt ?

La fin de la création du squelette peptidique linéaire ne signifie pas toujours la fin de toute la synthèse.

Selon la molécule cible, des étapes supplémentaires peuvent être nécessaires après l'assemblage de la chaîne.

Elles peuvent inclure :

• déprotection totale;
• clivage du peptide du support solide;
• suppression des balises temporaires;
• cyclisation;
• oxydation;
• formation de ponts disulfure ;
• plissement;
• conjugaison;
• modification des extrémités de chaîne;
• nettoyage;
• caractéristique analytique.

Certains peptides nécessitent relativement peu de modifications structurelles supplémentaires après l'assemblage de la chaîne.

Pour d'autres, les étapes ultérieures sont cruciales.

Un bon exemple est la synthèse de l'inhibiteur trypsique pancréatique bovin (BPTI). Les chercheurs ont assemblé une séquence linéaire, purifié le matériel, puis obtenu une structure repliée contenant des ponts disulfures. Selon les analyses et les comparaisons fonctionnelles présentées dans l'étude, le matériel final à séquence naturelle correspondait à la protéine naturelle pour les paramètres étudiés. [3]

Cet exemple montre la différence entre l'assemblage du squelette peptidique et l'obtention de la forme moléculaire finale entièrement caractérisée.

La méthode qui permet d'obtenir une séquence linéaire correcte ne confirme pas automatiquement :

• du repliement correct;
• du bon arrangement des ponts disulfures ;
• activité biologique;
• de la stabilité;
• profil de pollution ;
• d'adéquation à un usage particulier.

Chacune de ces questions nécessite des preuves distinctes.

Synthèse chimique, expression biologique et méthodes combinées

Dans la synthèse chimique des peptides, des blocs moléculaires préparés au préalable sont assemblés lors de réactions de laboratoire contrôlées.

L'expression biologique utilise quant à elle la machinerie cellulaire pour produire la séquence d'acides aminés codée. Ensuite, le matériel doit être récupéré, purifié et, si nécessaire, soumis à un traitement ultérieur.

Les deux méthodes peuvent conduire à l'obtention de peptides ou de polypeptides, mais elles impliquent des possibilités et des limites différentes.

La synthèse chimique peut s'avérer particulièrement utile lorsque l'on a besoin de :

• acides aminés non standard sélectionnés;
• modifications chimiques spécifiques à un site;
• structures spécifiques des extrémités de chaîne;
• traceurs isotopiques;
• modifications du squelette peptidique;
• d'autres caractéristiques difficiles à obtenir par l'expression biologique standard.

L'expression biologique peut être intéressante dans le cas de séquences plus longues appropriées ou de stratégies de marquage spécifiques, mais elle n'élimine pas les problèmes rencontrés lors des étapes ultérieures de production.

Il faut également tenir compte de la récupération des matériaux, du repliement, du traitement, des contaminants d'origine hôte, de la purification et de la caractérisation analytique.

Aucune méthode n'est donc universellement la meilleure.

Dans la comparaison de polypeptides composés de 20 à 40 résidus d'acides aminés, à la fois la longueur de la séquence et sa propension à l'agrégation ont influencé les résultats de la synthèse en phase solide et de l'expression bactérienne. [1]

Ces observations soutiennent l'approche selon laquelle la méthode de production est choisie en fonction de chaque molécule spécifique.

Les données historiques concernant le rendement, les coûts, les équipements et le temps de production ne doivent pas être considérées comme des valeurs contemporaines universelles, car les technologies, les réactifs, l'automatisation, les méthodes de purification et l'économie de production évoluent avec le développement technologique.

Synthèse peptidique en phase solide

La chaîne croissante est attachée à un support insoluble

Dans la synthèse peptidique sur phase solide (SPPS), la chaîne peptidique en croissance reste liée à un support insoluble au cours des cycles successifs de synthèse.

Le support est le plus souvent une résine polymère fonctionnalisée.

Le connecteur, ou linker, lie le peptide au support et influence, entre autres, le mode de libération ultérieure de la chaîne obtenue ainsi que le type de groupe terminal obtenu.

L'un des principaux avantages pratiques du SPPS est de faciliter la répartition du matériel.

À la fin d'une étape de réaction spécifique, les réactifs solubles et de nombreux sous-produits solubles peuvent être éliminés par lavage, tandis que le peptide en croissance reste lié à la phase solide.

Cela évite d'avoir à isoler et purifier le peptide en croissance en tant que composé libre distinct après l'ajout de chaque nouvel acide aminé.

Cette commodité peut cependant conduire à un malentendu important.

Le lavage de la résine ne signifie pas que tous les peptides incorrects ont été éliminés.

Si la chaîne liée à la résine ne réagit pas lors d'une étape de couplage, elle peut toujours rester sur le support.

Dans les cycles suivants, il peut réagir à nouveau et continuer à s'allonger.

Il en résulte qu'une séquence de délétion peut se former, c'est-à-dire une molécule qui diffère du peptide cible par l'absence d'un ou de plusieurs résidus d'acides aminés.

De même, les chaînes liées à la matière vivante modifiées chimiquement ou non complètement peuvent participer aux étapes ultérieures de la synthèse.

SPPS simplifie donc la séparation des substances solubles du matériau lié à la résine.

Cependant, il ne garantit pas une conformité parfaite de la séquence.

Un cycle récurrent de déblocage et de raccordement

La synthèse SPPS classique comprend la répétition de trois opérations fondamentales :

déverrouillage → assemblage → lavage.

Premièrement, la groupement aminique réactif situé à la fin de la chaîne en croissance est révélé.

Par la suite, un autre acide aminé sécurisé est ajouté au fil.

Les agents solubles, l'excès d'aminoacide et de nombreux produits de la réaction sont éliminés avant le début du prochain cycle.

La répétition de ce processus permet de construire un peptide à partir d'une seule ressource d'aminoacide.

Dans une SPPS classique, le reste de la C-extrémité est généralement connecté au support en premier, puis le câble s'allonge vers l'extrémité N.

Cela diffère de la synthèse protéique ribosomalienne standard, où les acides aminés successifs sont ajoutés au C-terminal du brin en croissance.

La séquence finale des acides aminés peut toutefois être identique, même si le sens et la chimie du processus de synthèse sont différents.

Les termes „ cycle ” ne doivent pas être interprétés comme un ensemble unique de conditions de réaction appropriées pour chaque reste et chaque séquence.

Le déroulement de la réaction peut dépendre de :

• stratégies de groupes de protection ;
• le type d'acide aminé ;
• les conditions spatiales entourant le lieu de réaction ;
• le type de la résine ;
• lien ;
• la longueur du fil ;
• l’agrégation ;
• un solvant ;
• chimie de l'adhésion ;
• la structure structurelle du peptide croissant.

La réaction qui est facile au début de la synthèse peut devenir beaucoup plus difficile à l'étape ultérieure.

C’est pourquoi le suivi du processus reste essentiel même dans les systèmes très automatisés.

Pourquoi les propriétés de la résine sont-elles importantes ?

Le support permanent n’est pas seulement un support passif.

Ses propriétés physiques et chimiques peuvent avoir un effet direct sur le déroulement de la réaction.

L'un des paramètres importants est le gonflement.

Si la résine se gonfle correctement dans l’environnement de dissolution choisi, les réactifs peuvent plus facilement atteindre les sites réactifs présents dans toute la structure du polymère.

Un gonflement insuffisant ou des modifications de la structure de la gomme peuvent limiter cet accès.

Ils peuvent également avoir une signification :

• densité d'occupation ;
• architecture en polymère ;
• la structure du lien ;
• compatibilité avec les solvants ;
• stabilité mécanique ;
• porosité ;
• propriétés diffusives ;
• les interactions entre les chaînes peptidiques en croissance.

Avec l’augmentation de la longueur du peptide, les chaînes individuelles peuvent également interagir entre elles.

L'agglomération sur la résine peut limiter l'accès aux sites réactifs et entraîner un non-adhésion ou un non-débrillantage complet.

Cela signifie que la séquence qui se comporte correctement au début de la synthèse peut devenir de plus en plus difficile à suivre au fur et à mesure que le chaînon s'allonge.

Les chercheurs ont développé un réacteur à flux variable composé, qui permettait de surveiller la dilatation de la matière plastique à partir de mesures liées à la pression. [4]

Cette étude portait sur l'agglomération sur la résine et la formation incomplète des liaisons comme des problèmes de processus qui, dans d'autres conditions, peuvent être difficiles à observer directement lors de la synthèse.

Cela montre que le suivi de la comportement physique du support peut fournir des informations allant au-delà de la simple enregistrement des modifications apportées.

À quoi sert la résine de Wanga ?

La chimie des ligands de type Wang est couramment utilisée dans les SPPS lorsque, après l'élimination du peptide, il est souhaitable de conserver la partie C en forme d'acide carboxylique.

Le peptide est lié par une liaison estéroïde qui peut ensuite être dégradée dans des conditions appropriées.

D'autres systèmes de ligases peuvent être choisis lorsque c'est une structure différente de la C-taille qui est nécessaire, par exemple un amid.

Il est utile de distinguer la chimie du ligateur de tout le support physique.

Les ligands liés tels que Wang peuvent être introduits dans différentes architectures polymériques.

Ces matériaux n’ont pas nécessairement les mêmes caractéristiques :

• propriétés de gonflement ;
• Capacité ;
• conformité avec les solvants ;
• caractéristiques mécaniques ;
• les comportements lors de la réaction.

Des recherches utilisant des supports peptidyl-Wang-TentaGel ont révélé une méthode alternative spécialisée pour la préparation d'hydrazides peptidiques, qui sont des produits semi-actifs dans la chimie peptidique. [5]

Cela ne signifie pas que le déshydrogénation standard à base de résine Wanga conduit généralement à la formation d'hydrazides peptidiques.

Il montre cependant une importante règle :

le support + le ligase + les conditions de réaction + la chimie de déshydrogénation déterminent ensemble le produit obtenu.

Synthèse de SPPS dans le système périodique et le système de flux

Le SPPS peut être réalisé dans des cuves classiques périodiques ou dans des systèmes où les réactifs circulent à travers un réacteur contenant un support fixe.

Les systèmes de flux peuvent permettre un échange rapide des agents de réaction et un contrôle plus précis de l’environnement chimique entourant la matière plastique.

Une synthèse rapide des peptides dans un système circulatoire a été présentée dans une étude de 2014, avec un suivi continu et appliquée à plusieurs peptides et à un petit peptide [6].

Dans une étude ultérieure automatisée, on a décrit un dépôt des chaînes beaucoup plus rapide, obtenant pour les exemples analysés une pureté du produit brut et une productivité après l’isolation comparable à la synthèse périodique classique. [7]

Ces études montrent les possibilités de certains systèmes dans des conditions spécifiques.

Ils ne prouvent cependant pas que tout peptide puisse être produit aussi rapidement et avec la même qualité.

Le temps nécessaire à la production d'un peptide comprend également bien plus que la simple formation d'un brin de chaîne.

Le processus complet peut comprendre :

• préparation des agents de réaction ;
• préparation de la résine ;
• l’intégration ;
• déverrouillage ;
• lavage ;
• déshabillage ;
• le traitement du produit ;
• nettoyage;
• élimination des solvants ;
• la formation finale de la structure ;
• analyses de laboratoire;
• la documentation.

La création rapide des liens est donc seulement l’un des éléments de l’efficacité totale de la production.

Synthèse en phase liquide

Qu'est-ce que signifie ce terme ?

Le terme „ synthèse de peptides en phase liquide ” peut être utilisé de plusieurs manières.

Dans une perspective plus large, cela peut simplement signifier la synthèse d'un peptide effectuée dans un milieu aqueux.

Dans la littérature plus spécialisée, on distingue cependant souvent :

1. la synthèse classique des peptides dans un milieu aqueux;
2. la synthèse des peptides en phase solide ;
3. les méthodes LPPS plus récentes, dans lesquelles la chaîne en croissance possède un marqueur ou un support solubles.

Cette distinction est importante car elle modifie la manière dont le produit est séparé et récupéré.

Le peptide semi-moulé, dissous librement, peut nécessiter une isolation en utilisant ses propres propriétés physiques et chimiques.

Dans le cas d’un produit semi-fini marqué, le marquage peut être conçu de manière à faciliter l’extraction, l’extraction, le maintien sur la membrane ou tout autre mode de séparation.

L’étude relative à l’LPPS distingue clairement la synthèse classique dans un milieu aqueux, la SPPS et les méthodes utilisant des marqueurs solubles. [8]

Cette publication est utile pour organiser la terminologie et la méthodologie.

Elle ne devrait cependant pas être interprétée comme un seul et unique essai démontrant que l'une des méthodes est la meilleure pour chaque peptide.

Synthèse classique des peptides dans un milieu aqueux

Dans la synthèse classique, dans un milieu protecteur, les acides aminés, les produits de la synthèse peptidique ou les fragments restent dissous dans le milieu réactionnel plutôt que de se lier covalentement à la résine insoluble.

Après la fin de la réaction, le produit intermédiaire approprié peut être isolé, purifié et, si nécessaire, caractérisé avant le début du prochain stade.

Cela peut apporter certains avantages.

Les chercheurs peuvent :

• caracteriser les différents produits semi-finis ;
• choisir la méthode de purification en fonction du produit intermédiaire ;
• optimiser les différentes transformations ;
• préparer les fragments indépendamment ;
• moduler la voie de synthèse lorsque le produit intermédiaire en question pose des problèmes.

La synthèse dans un milieu aqueux peut cependant également entraîner de nombreuses difficultés.

En allongant le peptide, ils peuvent :

• devenir faiblement solubles ;
• agglomérer ;
• être difficile à cristalliser ;
• créer des polluants étroitement liés ;
• être difficile à distinguer ;
• exiger une isolation répétée ;
• causer des pertes de matière lors des étapes suivantes de la transformation.

La synthèse dans un milieu non organique n'est donc pas automatiquement plus simple ni plus facile à scalable que SPPS.

Sa utilité dépend de la séquence spécifique, de la stabilité des produits semi-moules, de la solubilité, de la longueur de la route de synthèse, de la conservation lors du nettoyage et de l'efficacité des étapes ultérieures d'isolation.

Le développement des stratégies LPPS marquées résulte en partie des tentatives visant à résoudre précisément ces problèmes liés à la séparation et au traitement des matières. [8]

Les marqueurs solubles associent la conception de la réaction à la conception de la séparation

Dans le cas de l'LPPS marquée, le peptide en croissance possède une liaison moléculaire temporaire conçue de manière à influer sur ses propriétés physiques.

Le marqueur peut permettre de maintenir une solubilité suffisante du peptide pendant la réaction et de faciliter ensuite son élimination sélective.

Selon la technologie, le découpage peut utiliser :

• déplétion ;
• extraction ;
• retrait sur la membrane ;
• phase comportementale ;
• autres propriétés résultant de la présence d'un marqueur.

Dans une des stratégies expérimentales, une séquence longue à chaîne protectrice au C-terminus a été utilisée pour préparer des amidases peptidiques.

Les réactions répétées et les étapes de déshydrogénation ont permis aux chercheurs de préparer un peptide hydrophobe, qui, dans l’analyse comparée qu’ils ont effectuée, était difficile à obtenir de manière satisfaisante par la méthode SPPS [9].

Cela montre l’utilité de cette stratégie particulière pour la séquence analysée.

Cependant, elle ne démontre pas une avantage généralisé de la synthèse marquée.

Le signe devient un élément du processus de production et soulève ses propres questions :

• Comment est-il connecté efficacement ?
• Doit-il modifier le cours de la réaction ?
• Comment récupérer avec fiabilité un produit semi-fini marqué ?
• Doit-il entraîner la formation de nouvelles polluants ?
• Comment est-il éliminé ?
• Est-ce possible de confirmer l’élimination totale ?
• Quelles méthodes analytiques confirment son absence dans le produit final ?

Les marqueurs solubles doivent donc être considérés comme des éléments fonctionnels du projet du processus, et non pas seulement comme des étiquettes simples.

Comparaison des principales méthodes

Le tableau présente les principes généraux de fonctionnement des différentes méthodes.

Il ne précise pas laquelle d'entre elles offrira la meilleure performance, la pureté, le coût, l'équilibre environnemental ou la possibilité de l'échelle pour une séquence particulière.

Ces paramètres doivent être évalués en fonction de la véritable molécule et du processus de production spécifique. [4] [8] [9]

La fusion de fragments et la production hybride

Le peptide ne doit pas toujours être formé dans un seul et même processus continu consistant à ajouter des résidus d'aminoacides successifs.

Une stratégie alternative consiste à préparer séparément des fragments peptidiques plus courts puis à les combiner.

Le procédé hybride peut par exemple utiliser SPPS pour recevoir des fragments individuels et une chimie dans un milieu aqueux pour les assembler.

Les stratégies fragmentaires peuvent limiter certains problèmes liés à la synthèse étape par étape très longue.

Cependant, cela pose de nouveaux défis, tels que :

• choisir le lieu de connexion approprié ;
• la solubilité des fragments ;
• activation de la zone de connexion ;
• chemoselectivité ;
• la persistance de la stéréotypie ;
• effets secondaires;
• le nettoyage des fragments ;
• le nettoyage après leur combinaison.

Un exemple important de fusion contrôlée de fragments est la ligation chimique native.

Dans la version classique, le tiéster peptidique réagit avec un deuxième peptide contenant la cystéine N-terminale. Une réorganisation ultérieure conduit à la formation d’une liaison correcte dans le peptide schématique au niveau de la liaison ligase.

Des études initiales ont montré la possibilité d'obtenir une protéine contenant des ponts disacryliques après ligation et folding [10].

Cela confirme l’importance de cette stratégie de collage des fragments.

Cela ne signifie toutefois pas que deux fragments peptidiques non modifiés puissent se lier spontanément.

Equipement et groupes de protection

La coordination crée une connexion intentionnelle

La liaison est une étape de la réaction au cours de laquelle un nouvel lien peptidique se forme entre les unités sélectionnées.

Souvent, un groupe carboxyle est activé pour permettre à la molécule de réagir efficacement avec le groupe aminé correspondant.

La chimie de l’activation doit être conforme à :

• une séquence croissante ;
• des groupes de protection temporaires ;
• la protection des chaînes latérales ;
• stéréochimie ;
• un support ou un signe ;
• le milieu de dissolution ;
• par d'autres groupes fonctionnels présents dans la molécule.

Une liaison efficace est particulièrement importante lors de la synthèse de phase, car une réaction incomplète peut conduire à la formation de séquences délictives.

Si un seul passage d’ajout d’un acide aminé échoue pour certaines parties des chaînes de croissance, ces chaînes peuvent rester dans l’appareil et participer aux cycles suivants.

En conséquence, des molécules très similaires au peptide cible peuvent se former, mais dépourvues de la dernière ressource.

Ainsi, même de petites inefficacités peuvent s’accumuler au cours de nombreux stades de la synthèse.

Un exemple mathématique simple illustre bien ce problème.

Si chacun des 50 étapes indépendantes de dépôt avait 99% chances de succès, le pourcentage de molécules pour lesquelles toutes les étapes se termineraient avec succès serait de :

0,99^50 ≈ 0,605

soit environ 61%.

C’est uniquement une illustration mathématique.

Il ne constitue pas une estimation de la pureté réelle ni de la performance de la synthèse du peptide contenant 50 résidus.

La production réelle comprend :

• différentes performances d’accouplement dans les différentes positions ;
• Les étapes de déblocage ;
• effets secondaires;
• dépend de la séquence des difficultés ;
• stratégies de réintégration ;
• Les pertes lors du décapage ;
• les pertes lors du nettoyage ;
• autres variables processuelles.

Le calcul montre simplement pourquoi même une faible inefficacité apparente d'un seul stade peut avoir une grande importance dans une synthèse à plusieurs étapes.

Des groupes de protection contrôlent le lieu de l'intervention

Un acide aminé peut contenir plusieurs groupes chimiques réactifs.

Sans un contrôle sélectif, les réactions d'adhésion pourraient avoir lieu dans des endroits indésirables.

Les groupes de protection bloquent temporairement les zones de réaction sélectionnées.

La groupement aminique utilisé pour allonger le chaînon nécessite généralement une protection temporaire, tandis que les chaînes latérales réactives peuvent nécessiter un maintien en place pendant de nombreux cycles de synthèse.

La connexion avec le support doit également survivre à ces étapes jusqu'au moment de la déconnexion prévue.

Le choix des groupes protecteurs influence donc toute la stratégie de synthèse.

Il convient de prendre en considération :

• la manière dont ils sont introduits ;
• stabilité;
• le mode d’élimination ;
• compatibilité avec d'autres groupes de protection ;
• conformité avec le support ;
• effets secondaires;
• l’influence d’une séquence particulière ;
• Les conditions finales de débranchage.

Les recherches utilisant une protection à base de cyanosulfurylide concernaient la formation de l'aspartimide par une modification de la façon de protéger le groupe carboxyle. [2]

Les résultats montrent que la stratégie des groupes de protection n'a pas seulement une incidence sur la possibilité d'une réaction souhaitée, mais aussi sur les réactions indésirables qui peuvent se produire.

Fmoc, Boc et protection orthogonale

Les Fmoc et le Boc appartiennent aux groupes de protection des groupes aminés les plus utilisés.

Ils diffèrent vraiment dans la manière dont ils sont éliminés.

L'fmoc est généralement éliminé dans des conditions basiques, tandis que le Boc est sensible aux conditions acides.

Ces propriétés permettent de les utiliser comme éléments de stratégies de protection plus larges.

Dans la SPPS populaire basée sur Fmoc, la protection provisoire de la fin N-terminale est éliminée à plusieurs reprises, tandis que les groupes protecteurs choisis sur les chaînes latérales et la liaison avec la résine restent intacts jusqu’aux étapes ultérieures.

D'autres stratégies peuvent utiliser des combinaisons différentes.

Une notion particulièrement importante est la protection orthogonale.

Deux groupes protecteurs sont considérés comme orthogonaux si l'un peut être éliminé sélectivement dans des conditions où l'autre reste suffisamment stable pour permettre la poursuite de la synthèse.

L’orthogonalité est donc une relation pratique de conformité chimique.

Cela ne signifie pas que chaque groupe protégé restera totalement inchangé après une exposition indéfinie à toutes les conditions de réaction.

Des effets secondaires peuvent toujours se produire.

Dans les études de synthèse de Fmoc, l’apparition de l’aspartimide et les modifications stéréochimiques indésirables ont été décrites, malgré la sélectivité générale de la stratégie de protection prévue. [11]

La chimie stéréochimique fait partie de l’identité d’une molécule

De nombreuses protéines possèdent un centre chirale.

Cela signifie que leurs atomes peuvent prendre des arrangements spatiaux différents correspondant à différentes formes stéréochimiques.

Une modification de la configuration d'un centre stéréoisomérique peut conduire à la formation d'une autre structure peptidique sans nécessiter de modification de sa masse nominale.

C’est pourquoi la masse elle-même ne peut pas confirmer l’identité complète du peptide.

L'épimérisation signifie généralement une modification de la configuration d'un centre stéréoisomérique dans une molécule contenant plusieurs de ces centres.

La racemisation est également souvent étudiée en chimie peptidique dans le contexte de la perte de l'intégrité stéréochimique des résidus aminés.

Ces changements sont importants car la reconnaissance moléculaire peut dépendre fortement de la disposition spatiale des atomes.

Deux molécules ayant le même contenu élémentaire et la même masse nominale peuvent donc se comporter différemment si elles diffèrent par leur stereochemistry.

Dans une étude de synthèse de Fmoc assistée par des micro-ondes, il a été constaté que certaines résidus étaient sensibles à des modifications stéréochimiques indésirables dans les conditions appliquées. La modification de la méthode a limité l’apparition de ces réactions. [11]

Cela ne signifie pas que le chauffage, par définition, détruit tous les peptides.

La conclusion correcte est que l’accélération de la réaction doit être évaluée en parallèle avec la sélectivité chimique dépendante de la séquence.

Aspartame et autres polluants apparentés

La formation de l'aspartimide est une réaction secondaire connue concernant certaines séquences contenant l'asparagine.

Un produit intermédiaire cyclique indésirable peut alors se former, qui constitue ensuite les composés présentant une liaison structurelle ou stéréochimique modifiée.

La probabilité de cette réaction dépend de la séquence et des conditions du processus.

Autres polluants liés à la synthèse peuvent provenir de :

• inefficacité de l’intégration ;
• absence de déblocage complet ;
• la formation de séquences délictives ;
• réactions des chaînes latérales ;
• des changements stéréotypés ;
• réactions lors du débridage ;
• oxydation ;
• des réorganisations ;
• les conditions de traitement du produit ;
• absence d'élimination complète des groupes protecteurs.

Certaines polluants entraînent une modification facilement perceptible de la masse moléculaire.

D'autres sont beaucoup plus difficiles à distinguer.

Dans des études analytiques sur un peptide synthétique étant un substrat de la rénine, de nombreuses substances indésirables ont été identifiées, dont des composants présentant une même variation de masse mais contenant des modifications à différentes positions. [12]

Une analyse structurelle supplémentaire était nécessaire pour les distinguer.

Les chercheurs ont également considéré les mécanismes proposés pour l’apparition de ces polluants comme des hypothèses.

C’est une distinction importante :

Définir ce que constitue la pollution et prouver le mécanisme exact de sa formation sont deux questions scientifiques distinctes.

Il ne faut pas présenter un mécanisme probable comme confirmé uniquement parce qu’il correspond à une masse moléculaire observée.

Traitement, scalage et qualité de production

Produit brut, produit nettoyé et rendement

Le peptide brut est un produit obtenu avant la fin des étapes de purification correspondantes.

Il peut contenir :

• peptide cible ;
• séquences de délétion;
• le matériau n'est pas complètement débranché ;
• des séquences modifiées ;
• résidus d'agents de décoloration ;
• produits liés à la déshumidification ;
• sole;
• solvants;
• autres ingrédients issus du processus.

Le nettoyage vise à séparer le peptide approprié de cette mixture.

Il convient de distinguer clairement trois concepts :

pureté du produit brut — composition mesurée du matériau avant le traitement final ;

La performance du produit purifié ou isolé — la quantité de matière cible récupérée par rapport à une valeur initiale ou théorique déterminée ;

Pureté finale — composition du matériau isolé déterminée à l'aide d'une méthode analytique spécifique.

Ces concepts ne sont pas interchangeables.

Le procédé peut conduire à la production d'une grande quantité de matière brute, mais il permet de récupérer une quantité relativement faible de produit purifié.

Un autre procédé peut produire moins de matière première, mais se caractériser par une haute sélectivité dans la création du produit final.

Une pureté analytique aussi élevée ne doit pas nécessairement signifier une haute productivité.

Dans les études de synthèse accélérée par flux, la pureté du matériau brut et la performance après l'isolation ont été correctement rapportées séparément [7].

La chromatographie sépare les composants, mais elle ne répond pas à toutes les questions.

La chromatographie liquide à haute performance en mode inversé (RP-HPLC) est largement utilisée pour l'analyse et le purification des peptides.

Les différentes molécules interagissent de manière différente avec la phase stagne et mobile.

Dans des conditions appropriées, ces différences permettent de séparer les composants de la mixture.

La chromatographie analytique et la préparation sont liées mais ont des applications différentes.

L'analyseur HPLC est principalement utilisé pour étudier la composition de la prélèvement.

La HPLC préparatoire est utilisée pour la collecte physique des composants disséminés.

Le chromatogramme peut fournir de nombreuses informations utiles.

Cependant, un grand pic principal ou une forte proportion de sa surface ne doit pas être considéré comme une caractéristique moléculaire complète.

Les résultats de la chromatographie dépendent notamment de :

• le type de colonne ;
• phase mobile ;
• gradient;
• températures;
• Méthodes de détection ;
• longueur d'onde ;
• Prélèvement de la prélèvement de la prélèvement de la prélèvement de la;
• la manière d’intégrer les pixels ;
• résolution ;
• Les propriétés des polluants.

Deux composés peuvent potentiellement édulcorer simultanément.

Certains composants de l'échantillon peuvent également réagir différemment avec le détecteur utilisé.

C’est pourquoi une haute pureté superficielle dans le HPLC n’est pas équivalente à une confirmation complète de l’identité moléculaire.

Des études sur les polluants peptidiques iso-barriques ainsi que des analyses chirales montrent pourquoi des méthodes analytiques complémentaires peuvent être nécessaires. [12] [13]

La méthode analytique doit correspondre à une question structurelle spécifique.

L'identité, la pureté et la teneur signifient des choses différentes

Trois concepts sont particulièrement importants dans la description des peptides.

L'identité répond à la question :

Est-ce que la molécule désignée se trouve dans l'échantillon ?

La pureté répond à la question :

Quels autres composants se trouvent dans la prélèvement ou quelle partie du signal mesuré correspond au composant principal ?

Le contenu répond à la question suivante :

Combien de peptide réel se trouve dans la préforme ?

Ces questions ne peuvent pas toujours être répondues avec un seul seul test.

Le matériau contenant le peptide peut également contenir :

• l'eau ;
• hypoténuse;
• sole;
• résidus de solvants;
• autres ingrédients associés au processus ;
• Pollution.

La masse totale du matériau solide n’a donc pas besoin d’être égale à la masse du peptide lui-même.

De même, la conformité entre la masse mesurée des particules et la valeur théorique n’est pas confirmée :

• une séquence d'acides aminés complète ;
• une bonne communication entre les différentes parties;
• intégralité de la stéréochimie;
• les positions des ponts disulfure;
• déformation ;
• absence d'impuretés isobariques.

La spectrométrie de masse peut fournir de solides preuves quant à la masse moléculaire.

La spectrométrie de masse en tandem et d'autres techniques structurelles peuvent fournir des informations supplémentaires sur la séquence.

Les méthodes chirales permettent d’analyser les questions stéréochimiques qui ne peuvent pas être résolues par des mesures de masse classiques.

Dans une étude analytique, même la rafraîchissement lors de la préparation de la prélèvement a été prise en compte. Cela illustre une autre règle importante : la procédure analytique elle-même peut entraîner des artefacts si elle n’est pas correctement conçue. [13]

Le pliage et l’activité peuvent nécessiter une confirmation distincte

Dans le cas de peptides et de petites protéines structurellement restreints, la séquence correcte et la masse moléculaire peuvent toujours ne pas suffire à confirmer la structure finale souhaitée.

Des questions supplémentaires peuvent inclure :

• Les ponts disiarchimiques sont-ils correctement formés ?
• La molécule a-t-elle pris la conformation attendue ?
• Le cycle est-il complet ?
• Les isomères structurels sont-ils présents ?
• La molécule synthétique présente-t-elle l'activité attendue dans le test expérimental spécifié ?

Dans l’étude de synthèse de BPTI, plusieurs méthodes analytiques et biochimiques ont été utilisées, ainsi qu’une évaluation de l’inhibition de la trypsine. [3]

Les résultats globaux confirmaient la conformité du matériau synthétique ayant une séquence naturelle avec le protéine naturelle dans le cadre des critères étudiés.

Le test d’activité répond toutefois à une question fonctionnelle spécifique.

Il ne remplace pas l’analyse des polluants.

De même, une activité similaire dans un seul test ne confirme pas l’équivalence complète de toutes les propriétés biologiques, structurelles ou productives.

L'augmentation de la production change plus que la quantité de matière première

L’augmentation de la production ne consiste pas uniquement à augmenter proportionnellement la quantité de tous les additifs.

Les processus physiques peuvent se comporter différemment à une échelle plus grande.

Ils peuvent avoir une signification :

• mélange ;
• échange de chaleur ;
• La distribution d’agents de transformation ;
• diffusion ;
• déformation de la résine ;
• la pression ;
• filtration ;
• l'économie des solvants ;
• déplétion ;
• la solubilité des semi-produits ;
• transport de masse ;
• Les possibilités du système de traitement des eaux usées.

Ces facteurs peuvent influer à la fois sur le déroulement de la réaction et sur la formation des polluants.

Le nettoyage à des étapes ultérieures peut également devenir un véritable frein à toute la production.

L’augmentation de la vitesse de synthèse n’a que peu d’importance si le système de purification n’est pas capable de séparer efficacement les polluants générés ou de récupérer le produit de qualité requise.

Dans une analyse industrielle comprenant 40 processus de synthèse de peptides de 14 entreprises pharmaceutiques, la consommation de matières premières lors de la synthèse, du nettoyage et de l’isolation a été évaluée. [14]

L'étude montre pourquoi l'évaluation de la production doit être effectuée pour l'ensemble du processus.

Cela ne signifie toutefois pas que toutes les usines, toutes les séquences ou toutes les technologies de production donnent des résultats identiques.

La qualité de la production résulte de nombreux éléments de contrôle

La production fiable de peptides nécessite plus que l’obtention d’un seul résultat analytique satisfaisant.

Le processus contrôlé comprend généralement plusieurs éléments liés entre eux :

particule cible définie → matériaux de départ appropriés → synthèse contrôlée → purification contrôlée → échantillonnage approprié → analyse validée ou adaptée à l’objectif → documentation de la loterie.

La documentation du parti combine les résultats analytiques avec le matériel qui a effectivement été produit.

Le certificat d’analyse (COA) résume les résultats des analyses effectuées sur une partie déterminée.

Sa valeur informative dépend de :

• le type d’études réalisées ;
• les méthodes utilisées ;
• l’utilité de ces méthodes ;
• les spécifications ;
• identification de l’échantillon ;
• Les possibilités de traçabilité des parties ;
• une confirmation que les résultats rapportés concernent réellement le matériau en question.

La valeur individuelle définie comme „ pureté ” ne peut pas elle-même confirmer :

• une identité moléculaire complète ;
• la teneur en peptide ;
• intégralité de la stéréochimie;
• niveau de résidus de solvants ;
• la teneur en eau ;
• composant des anti-ions ;
• caractéristiques microbiologiques ;
• déformation ;
• activité biologique;
• utilité pour un but précis.

Le bon ensemble d’analyses dépend de l’utilisation prévue du matériau.

Le peptide utilisé comme référence analytique, l’agent de recherche utilisé dans l’expérimentation cellulaire et le produit en phase de développement pharmaceutique peuvent nécessiter des réponses à d’autres questions qualitatives.

Les preuves analytiques doivent donc être interprétées dans un contexte clairement défini, et non comme une confirmation universelle de la qualité.

L’évaluation de l’équilibre environnemental doit inclure l’ensemble du processus.

La synthèse des peptides peut nécessiter d'importantes quantités de solvants et d'agents de décomposition.

L’évaluation de l’impact environnemental doit donc prendre en compte bien plus que le seul aspect de l’intégration.

Les éléments importants peuvent inclure :

• la préparation des blocs de construction ;
• agents de liaison ;
• agents de débrillance ;
• lavage ;
• déshabillage ;
• traitement du produit ;
• chromatographie ;
• échange des solvants ;
• l'isolement ;
• séchage;
• gestion des déchets.

La réduction de la charge environnementale peut nécessiter une amélioration simultanée de plusieurs étapes.

Dans l’analyse publiée concernant la production de peptides, les problèmes liés à la synthèse ainsi qu’au nettoyage ont été abordés, et il a été indiqué qu’il fallait améliorer l’ensemble du projet du procédé. [15]

En tant que publication prospective, elle ne constitue pas un comparaison directe et contrôlée démontrant que telle ou telle technologie est toujours plus écologique.

De même :

Une synthèse plus rapide n'implique pas automatiquement une synthèse plus écologique,

Et une consommation moindre de solvants lors de la synthèse elle-même ne signifie pas automatiquement une moindre incidence de l’ensemble du processus de production.

Les comparaisons environnementales nécessitent l'utilisation de limites cohérentes pour l'analyse et devraient, de préférence, faire correspondre la consommation de ressources à une quantité déterminée de produit final isolé et caractérisé.

Questions fréquemment posées

1. Comment la synthèse des peptides à phase solide se distingue-t-elle de la synthèse à phase liquide ?

Dans la synthèse en phase solide, le peptide en croissance reste lié à un support insoluble, tandis que dans la synthèse classique, le produit intermédiaire peptide est dissous et doit généralement être récupéré en fonction de ses propriétés physiques et chimiques. Dans un sens plus restreint, le LPPS dissous présente en outre un marqueur soluble ou un support qui facilite la séparation ultérieure. Les études de synthèse marquée montrent une stratégie de liaison chimique entre la chimie du milieu réactionnel et la récupération par extraction, tandis que la littérature relative au LPPS distingue ces solutions tant de la synthèse classique dans le milieu réactionnel que de la SPPS. Aucune méthode n’est en soi optimale pour chaque peptide. La différence fondamentale concerne la manière physique de conduire et de séparer le peptide en croissance lors des étapes ultérieures de la synthèse. [8] [9]

2. Pourquoi des contaminants peuvent-ils se former lors de la synthèse des peptides ?

Les contaminations peuvent se produire parce que les réactions prévues ne se déroulent pas toujours quantitativement, et d'autres groupes fonctionnels peuvent participer aux réactions indésirables. L'association incomplète peut conduire à des séquences délecitiques, l'indétermination incomplète peut perturber la formation ultérieure de la chaîne, et certaines séquences sont sensibles à des changements stéréochimiques, à la formation d'aspartimide, à l'oxydation, aux regroupements ou aux produits secondaires liés à la déshydrogénation. Les études de synthèse de Fmoc et les analyses structurelles des contaminants peptidiques synthétiques documentent plusieurs exemples de ce type [11] [12]. La fréquence et l'importance des contaminants individuels dépendent de la séquence et du processus, c'est pourquoi l'automatisation de la synthèse ne doit pas être confondue avec une absence totale d'erreurs chimiques.

3. Quel rôle joue la résine dans la synthèse des peptides ?

La résine maintient un peptide en croissance, tandis que les agents solubles et de nombreux produits secondaires peuvent être éliminés entre les étapes de synthèse successives. Cela simplifie considérablement le dépôt répétitif de la chaîne, mais la résine n’est pas uniquement un support mécanique. Son gonflement, le taux d’adsorption, l’architecture du polymère, la compatibilité avec les solvants et la disponibilité des sites de réaction peuvent influer sur l’efficacité de la pénétration des agents dans le peptide lié. Dans les études utilisant un réacteur à charge variable, la stabilité de la résine a été surveillée lors de l’analyse de l’agrégation et de l’efficacité de l’adhésion. [4] Ce suivi n’élimine pas les erreurs de séquence, mais il montre pourquoi l’état physique de la résine peut être une variable importante de la réaction.

4. À quoi sert la résine de Wanga dans la synthèse des peptides ?

Les supports de type Wang sont généralement associés à la préparation de peptides libérés après leur déshydrogénation avec le C-terminus sous forme d'acide carboxylique. Cependant, le produit final précis dépend du ligase, de l'architecture du support et de la chimie de déshydrogénation utilisée, et non seulement de la nomenclature de la résine. Les chercheurs ont également présenté une méthode spécialisée pour transformer le matériau peptidyl-Wang-TentaGel en hydrazides peptidiques, qui peuvent servir de produits semi-synthétiques utiles. [5] Cette réaction alternative ne modifie pas l'importance du déshydrogénage standard de la résine Wang. Elle montre toutefois pourquoi, lors de la prévision du produit, il faut analyser l'ensemble du système support et les conditions de réaction.

5. SPPS construit-il le peptide à partir de la N-extrémité ou de la C-extrémité ?

L'étape classique de la SPPS débute généralement par l'attachement de la partie C à la molécule support, après quoi le brin est allongé vers l'extrémité N. C'est le sens opposé à l'allongement classique du brin sur la ribosome, où la protéine se développe en ajoutant des acides aminés supplémentaires à la C-terminale. La synthèse de BPTI est un exemple d'utilisation de blocs constructifs et de support sécurisés pour empêcher ultérieurement la libération, l'élimination et la dégradation du produit. [3] Cependant, il existe des stratégies chimiques spécialisées en peptide qui utilisent d'autres solutions, de sorte que l'allongement de la molécule depuis la C- à l'extrémité N doit être considéré comme une approche classique de la SPPS et non comme une règle absolue pour toutes les méthodes de synthèse.

6. Pourquoi les groupes de protection sont-ils nécessaires ?

Les acides aminés contiennent souvent plusieurs groupes fonctionnels réactifs. Les groupes protecteurs empêchent temporairement la réaction dans certains sites, laissant un espace disponible à un stade particulier de la synthèse. Cela permet de contrôler l’ordre et la manière dont les résidus sont combinés. Sans une bonne protection, les réactions concurrentes pourraient conduire à la formation de mélanges complexes ou de produits à structure modifiée. Les études sur l’apparition de l’aspartimide ont montré que le changement de la chimie des groupes carboxyle protecteurs peut limiter une réaction secondaire importante dans les séquences analysées. [2] Les groupes protecteurs ne garantissent pas un déroulement optimal de la synthèse, mais ils assurent une contrôle chimique sélectif qui doit rester compatible avec tous les étapes importantes du processus.

7. Comment se distinguent les Fmoc et les Boc ?

Les Fmoc et le Boc sont des groupes temporaires largement utilisés pour protéger la groupement aminique, mais ils réagissent également à d’autres conditions chimiques. Le Fmoc est généralement éliminé dans un milieu basique, tandis que le Boc est sensible aux acides. Cette différence affecte la manière dont ils sont liés à la protection des chaînes latérales, aux ligands et aux autres étapes de la synthèse. La synthèse basée sur le Fmoc est largement utilisée dans la SPPS moderne, mais des études ont également montré la possibilité d’effets secondaires dépendants de la séquence des réactions dans de tels conditions. [11] Dans la pratique, il est donc plus utile de comparer les stratégies de protection complètes et leur conformité avec la séquence donnée que de considérer uniquement les noms des deux groupes protecteurs.

8. Qu’est-ce que la protection orthogonale ?

La protection orthogonale signifie que l’une des groupes protecteurs peut être supprimée dans des conditions où une autre groupe protecteur nécessaire reste suffisamment stable pour permettre la poursuite de la synthèse. Cela permet de révéler différents sites réactifs à des étapes déterminées. Cette conception revêt une importance fondamentale lors de la synthèse contrôlée de peptides complexes. Cependant, la protection orthogonale dépend des conditions et non pas de l’absolu : une exposition répétée, le caractère de la séquence et les paramètres de la réaction peuvent toujours entraîner des réactions secondaires. Les recherches sur des méthodes alternatives de protection des groupes carboxyle montrent comment la stratégie de protection peut être modifiée afin de contrôler la chimie difficile des peptides [2].

9. Qu’est-ce que la séquence de delection ?

La séquence délecytaire est un peptide dépourvu d’une ou plusieurs réserves présentes dans la séquence cible prévue. Elle peut se produire lorsque l’étape de liaison d’un acide aminé n’a pas lieu complètement, mais que le brin non réagi reste attaché au support et participe aux cycles suivants. Étant donné que le brin défectueux reste encore lié à la matrice, le lavage classique n’est pas nécessaire pour le supprimer. Les études de surveillance SPPS en temps réel indiquent que la formation incomplète des liaisons amidiques constitue un problème de processus important. [4] La séquence délecytaire est donc un problème lié à la structure et à l’identité du produit, et non seulement à la résiduelle de l’agent de liaison.

10. Les deux polimères peptidiques peuvent-ils avoir la même masse moléculaire ?

Oui. Des structures moléculaires différentes peuvent avoir une masse nominale identique ou indiscernable. Pour cette raison, la seule conformité de masse ne confirme pas l’identité complète de la molécule. Lors de l’étude d’un peptide synthétique sous forme de substrat de la rénine, des composants isobariques de la contamination ont été identifiés, les modifications se trouvant dans différentes positions. La dérivation et la spectrométrie de masse tandem ont fourni des informations structurelles supplémentaires. [12] Cet exemple montre pourquoi la conformité de masse observée avec l’attente ne peut pas elle-même confirmer la séquence correcte, la liaison, la stereochimie ou l’absence d’isomères structuralement similaires.

11. Qu’est-ce que l’épimérisation et la racémisation dans la synthèse des peptides ?

L’épimérisation et la racemisation concernent des modifications indésirables de la configuration stéréochimique. Elles peuvent se produire sans modification de la séquence nominale des acides aminés ou de la masse moléculaire, de sorte que la simple mesure de la masse ne peut pas révéler une différence structurelle. Dans les études de synthèse Fmoc assistée par des micro-ondes, on a identifié des résidus sensibles à des modifications stéréochimiques et on a montré que la modification des conditions de réaction peut limiter de tels processus. [11] Le risque dépend du bloc constructif, de la séquence et des conditions du procédé. La qualité stéréochimique exige donc des méthodes analytiques capables d’évaluer la configuration, et elle ne peut pas être déduite uniquement à partir de la masse moléculaire.

12. Qu’est-ce que la formation de l’aspartimide?

La formation de l’aspartimide est une réaction indésirable liée à certaines séquences contenant de l’asparaginate. La formation de ce produit intermédiaire cyclique peut conduire à des produits avec une liaison structurelle ou stéréochimique modifiée, réduisant ainsi la productivité et rendant plus difficile le nettoyage. Les chercheurs ont analysé des stratégies de protection alternatives conçues pour limiter cette réaction dans certains peptides et protéines. [2] Les résultats ne montrent pas une solution unique universelle pour toutes les séquences contenant de l’asparaginate. Ils montrent cependant pourquoi la conception de la synthèse et des stratégies de contrôle des polluants doit tenir compte de la structure chimique spécifique de chaque séquence.

13. La haute pureté du HPLC confirme-t-elle l’identité correcte du peptide ?

Non. La pureté de l’HPLC décrit la composition d’une échantillon dans le cadre d’un chapitre chromatographique spécifique, du détecteur utilisé et de la manière dont les données sont analysées. La forte proportion de surface du pic principal peut être une preuve précieuse que l’échantillon est dominé par un seul composant chromatographiquement séparé, mais elle ne confirme pas en soi l’identité moléculaire complète. Les impuretés concomitantes, les isomères et les autres variantes peuvent nécessiter des techniques supplémentaires. Dans les études d’analyse chirale des peptides, un procédé spécialement conçu a été utilisé, qui a également pris en compte les changements stéréochimiques induits lors de la préparation de l’échantillon. [13] L’identité et la pureté doivent donc être considérées comme des questions analytiques liées mais distinctes.

14. La performance d’un produit nettoyé signifie-t-elle la même chose que la pureté ?

Non. La performance d’un produit purifié ou isolé détermine la quantité de matière cible récupérée par rapport à la quantité initiale ou théorique définie. La pureté quant à elle décrit la composition de la matière récupérée selon une méthode analytique déterminée. La synthèse peut conduire à obtenir une quantité relativement faible de produit très haute pureté ou une grande quantité de matière brute contenant une importante quantité de contaminants. Dans les études de synthèse automatique à flux continu, la pureté du produit brut et la performance après l’isolation sont rapportées séparément. [7] Le regroupement de ces paramètres empêche de faire erreur en considérant à tort la valeur élevée d’un de ces deux paramètres comme preuve de la haute valeur de l’autre.

15. Est-ce que les peptides longs peuvent être produits en combinant des fragments plus courts ?

Oui. Dans une stratégie fragmentaire, les segments peptidiques plus courts peuvent être préparés séparément puis combinés à l’aide de la chimie appropriée. La ligacion chimique non protégée était un exemple important où des segments peptidiques non protégés étaient combinés de manière à créer un lien naturel entre les segments peptidiques, puis on a obtenu une protéine ondulée. [10] Cela ne signifie pas que tous les segments peptidiques peuvent se lier spontanément. Il faut prendre en compte la structure des segments, la chimie de la liaison, le choix du site de liaison, la solubilité, la chimie stéréochimique et les exigences de purification. La constitution des segments est donc une stratégie de conception de synthèse alternative et non une solution automatique aux problèmes liés aux peptides longs.

16. L’automatisation plus rapide de la synthèse élimine-t-elle la nécessité de traitement de l’eau ?

Non. Le dépôt automatisé ou le dépôt par flux plus rapide raccourcissent le temps des étapes de synthèse déterminées, mais cela ne prouve pas que chaque molécule formée ait une structure souhaitée. Dans les études de synthèse rapide par flux, le matériau brut est toujours caractérisé et un nettoyage ultérieur est utilisé, et dans les travaux ultérieurs concernant l’automatisation, la pureté du matériau brut et la performance après l’isolation sont comparées séparément. [6] [7] Les bons résultats du système pour les séquences étudiées ne garantissent pas non plus des résultats identiques pour chaque nouvelle étape. La synthèse accélérée doit toujours être associée à un nettoyage approprié, à une confirmation de l’identité, à une analyse des contaminants et à une caractérisation finale.

17. Pourquoi l'augmentation de la production est-elle plus complexe que la préparation d'une plus grande quantité de produits ?

L’augmentation de l’échelle modifie les conditions physiques et chimiques, et non seulement la quantité de matière. La réaction, l’échange de chaleur, la condensation de la résine, la distribution des agents de transformation, la pression, la filtration, l’utilisation des solvants, la solubilité des produits semi-finis et les capacités du système de purification peuvent se comporter différemment à une plus grande volume de production. Dans l’analyse industrielle, 40 processus peptidiques ont été évalués séparément : la synthèse, l’épuration et l’isolation lors de l’analyse de l’utilisation des matières premières. [14] Les résultats montrent pourquoi la production doit être considérée comme un processus complet. La méthode à l’échelle doit conduire systématiquement à l’obtention d’un matériau caractérisé à tous les stades, et non seulement d’une quantité plus importante de peptide brut.

18. Le peptide est-il prêt dès que la séquence correcte est formée ?

Pas nécessairement. Le collage d’une chaîne crée un squelette de la séquence uniquement dans la mesure où le processus et les données analytiques le confirment. Selon la molécule, des détoxifications, des dépolymérisations, des cyclisations, des oxydations, la formation de ponts disarsiques, des plis, des conjugations, des purifications et des caractéristiques peuvent encore être nécessaires. La synthèse de BPTI constitue un bon exemple d’un processus dans lequel, après le collage d’une séquence linéaire, un nettoyage et la formation d’une structure pliée contenant des ponts disarsiques ont suivi. [3] La mention „ peptide prêt ” devrait donc désigner la forme moléculaire requise dans le contexte scientifique donné, et non seulement la fin de l’addition graduelle d’aminoacides.

19. La masse moléculaire correcte confirme-t-elle la séquence correcte du peptide ?

Non. La masse moléculaire est une preuve précieuse, mais elle ne peut pas elle-même confirmer la séquence complète ni la structure moléculaire. Les structures isobares peuvent avoir la même masse, et les différences stéréochimiques peuvent en aucun cas entraîner une variation de la masse moléculaire. Les études sur les polluants synthétiques de peptides ont montré que la distinction entre des composants structuralement différents peut nécessiter une spectrométrie de masse tandem et des analyses supplémentaires. [12] Dans le cas de questions concernant l’intégrité stéréochimique, des méthodes chirales peuvent également être nécessaires. [13] La masse moléculaire doit donc être considérée comme l’un des éléments d’une évaluation de l’identité, et non comme sa confirmation complète.

20. Pourquoi le nettoyage doit-il être considéré comme une partie de la production du peptide, et non seulement comme un ajout final ?

Le nettoyage est déterminant pour déterminer si le peptide cible peut être efficacement séparé de la séquence délictive, des produits secondaires, des résidus d’agents de synthèse et d’autres composants issus de la synthèse. Une méthode permettant de produire très rapidement de grandes quantités de matière brute peut rester peu pratique si l’obtention du produit final de qualité requise ne peut pas être réalisée efficacement. C’est pourquoi les analyses industrielles des processus peptidiques prennent en compte simultanément la synthèse, le nettoyage et l’isolation. [14] L’efficacité de la production doit finalement être évaluée en fonction de la quantité et des propriétés du matériau final isolé, et non seulement de la vitesse de synthèse.

Les limitations lors de la comparaison des méthodes de synthèse des peptides

Lors de l’interprétation des études comparant les technologies de production de peptides, il convient de tenir compte de plusieurs limitations importantes.

Premièrement, la séquence a un impact significatif sur la difficulté de la synthèse. Une méthode qui fonctionne pour un peptide ne doit pas nécessairement fonctionner de la même manière pour un autre. L’agregation, l’hydrophobie, la composition aminésique, la longueur, la tendance à former des structures secondaires et la sensibilité aux réactions secondaires peuvent modifier le comportement du processus [1] [4].

Deuxièmement, la pureté du matériau brut, la performance après l’isolation, la pureté finale et la teneur en peptide sont des paramètres différents. Comparer les méthodes uniquement en fonction d’un d’entre eux peut donner une image incomplète de l’efficacité de la production. [7]

Troisièmement, le collage rapide du fil ne signifie pas une production rapide de tout le matériau. Le découplage, le nettoyage, l’isolation, la finition structurelle, les analyses et la documentation ont également un impact sur le temps total de production. [6] [7]

Quatrièmement, la pureté analytique dépend de la méthode utilisée. L’HPLC, la spectrométrie de masse, la spectrométrie de masse tandem et l’analyse chirale répondent à des questions différentes. Un seul résultat analytique ne doit pas confirmer l’identité structurelle complète. [12] [13]

Cinquièmement, la dimension de l’échelle influence le comportement du processus. Les résultats de la synthèse en laboratoire ne peuvent pas automatiquement être transposés à la production industrielle sans tenir compte de la mise en mélange, du transport de la masse, des possibilités de purification, de l’utilisation des matières premières et d’autres facteurs dépendants de la dimension. [14]

En sixième lieu, les comparaisons économiques historiques peuvent perdre leur actualité avec le temps. Les coûts des agents de nettoyage, le niveau d’automatisation, les technologies d’extraction, l’équipement de purification, le recyclage des solvants et l’infrastructure de production évoluent constamment. Les analyses de coûts plus anciennes peuvent encore avoir une importance scientifique, mais elles ne doivent pas refléter l’économie du marché actuelle. [1]

Septièmement, les comparaisons environnementales nécessitent des limites cohérentes pour l’analyse. L’évaluation de la consommation de solvants lors de la fabrication même du fil, tout en négligeant le traitement et l’isolation, peut conduire à des conclusions erronées concernant l’équilibre du processus. [14] [15]

Enfin, le nom de la méthode lui-même ne définit pas la qualité du produit. L'SPPS, la synthèse en solution, l'LPPS, la ligation des fragments et l'expression biologique peuvent mener à l'obtention d'un matériau de haute qualité si le processus est correctement conçu et contrôlé. Toutefois, aucune de ces méthodes ne garantit automatiquement une bonne identité, la pureté, la stéréochimie, la folding ou l'utilité pour une application particulière.

Résumé

La synthèse des peptides doit être comprise comme un processus contrôlé de fabrication de molécules, et non simplement comme la formation d’interconnexions peptidiques.

L'objectif est de construire une séquence d'acides aminés déterminée tout en contrôlant la façon dont les résidus s'assemblent, la chimie des groupes protecteurs, la stéréochimie, les réactions secondaires et toutes les exigences structurelles supplémentaires.

La synthèse des peptides à phase solide maintient la chaîne croissante sur un support insoluble, ce qui rend les étapes répétées de liaison et de lavage bien adaptées à l’automatisation. Cependant, les avantages liés à une mise en oeuvre répétée n’éliminent pas les problèmes tels que les réactions incomplètes, l’agglomération, les séquences délecyennes ou les réactions secondaires dépendantes de la séquence. [4] [6] [7]

La synthèse classique en solution maintient les produits peptidiques en phase liquide et peut permettre une plus grande flexibilité lors de l’isolation et de la caractérisation des différents produits intermédiaires. Cependant, la séparation multiple et la diminution de la solubilité peuvent devenir de graves limitations.

Les méthodes de synthèse en phase liquide avec des marqueurs solubles tentent de combiner la chimie aqueuse avec des stratégies de récupération du matériau conçues. Elles peuvent donc constituer une option supplémentaire en cas de séquences et de problèmes de production pour lesquels la SPPS classique n’est pas optimale. [8] [9]

Des molécules plus longues ou particulièrement complexes peuvent également être préparées en procédant à des liaisons fragmentaires, notamment par l’intermédiaire d’une ligacion chimique native, au lieu de s’appuyer uniquement sur une addition continue de résidus aminés successifs. [10]

Quelles que soient les méthodes de synthèse choisies, l'efficacité de l'association et la chimie des groupes protecteurs restent essentielles, car de faibles inefficiences et des réactions secondaires peuvent s'accumuler lors des étapes ultérieures de la synthèse. La formation de l'aspartimide, les séquences délecyliques et les modifications stéréochimiques montrent pourquoi la séquence intentionnelle elle-même ne décrit pas tout ce qui peut se produire lors du processus [2] [11] [12].

Le travail ne prend pas fin non plus avec le dépôt du fil.

Le nettoyage détermine si le produit final peut être séparé des autres ingrédients.

Les méthodes analytiques convenablement sélectionnées répondent ensuite à des questions spécifiques concernant l’identité, la pureté, la teneur, la stéréochimie, la conformité et – si cela est pertinent – l’activité fonctionnelle [3] [12] [13].

L’augmentation de la taille de la production introduit de nouvelles questions concernant le transport de la masse, la conservation de la résine, l’utilisation des solvants, la filtration, la possibilité de purification, la reproductibilité du procédé et son impact environnemental. Pour cette raison, l’évaluation industrielle du procédé doit inclure la synthèse, le nettoyage et l’isolation, et ne se concentrer pas uniquement sur la vitesse de liaison. [14] [15]

La règle la plus importante est la suivante :

La production efficace d’un peptide nécessite le contrôle de l’ensemble du processus – depuis le projet moléculaire jusqu’au traitement et la caractérisation structurelle. L’obtention d’une chaîne d’une masse nominale attendue ou d’un pic chromatographique principal élevé constitue une preuve valable, mais aucun de ces paramètres ne confirme en soi l’identité moléculaire complète ni la qualité du processus de production.

Avis de non-responsabilité

Cet article a uniquement un caractère éducatif et scientifique-informatif. Il décrit les principes généraux de la chimie des peptides, de la synthèse à phase solide, de la synthèse dans un milieu aqueux et liquide, des stratégies de groupements protecteurs, de la liaison, de la purification, de la caractérisation analytique, des procédés de fabrication et des exemples issus d’études publiées. Il ne constitue pas un protocole de laboratoire, une instruction de fabrication, un conseil médical, un guide de posologie ou d’administration ni un certificat de qualité pour un produit peptidique spécifique. Les résultats expérimentaux doivent être interprétés dans le contexte de la séquence, des méthodes utilisées, de l’échelle du processus, des techniques analytiques et des limitations des différents essais.

Références

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K., & Perczel, A. (2016). Expression bactérienne et/ou synthèse en phase solide de peptides issus de polypeptides et de miniproteins de 20 à 40 acides aminés, étude de cas concernant les ligands des GPCR de classe B. Current Protein & Peptide Science, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Prévention de la formation d’aspartimide lors de la synthèse de peptides en utilisant des cyanosulfurylides en tant que groupes protecteurs de l’acide carboxylique. Nature Communications, 11(1), Article 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). Synthèse en phase solide de l'inhibiteur de la trypsine pancréatique bovine (BPTI) et de deux analogues. Une approche chimique pour évaluer le rôle des ponts disulfure dans le pliage et la stabilité des protéines. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. Récépteur PubMed
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). Suivi en temps réel de la synthèse de peptides en phase solide à l’aide d’un réacteur à flux variable. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F., & Becker, C. F. W. (2015). Génération efficace de hydrazides peptidiques grâce à la hydrazinolyse directe des résines Peptidyl-Wang-TentaGel. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Synthèse peptidique rapide à base de flux. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2017). Une approche entièrement automatisée basée sur un flux pour une synthèse accélérée de peptides. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G., & Albericio, F. (2022). Synthèse peptidique à phase liquide (LPPS) : une troisième vague pour la préparation de peptides. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T. et Fukui, T. (2012). Nouvelle groupement protecteur amide dérivé du diphenylméthyl pour une synthèse peptidique en phase liquide efficace : AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., & Kent, S. B. (1994). Synthèse de protéines par l’interférence chimique native. Science, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Limitation de la racemisation et de la formation d’aspartimide lors de la synthèse par phase solide de peptides à base de Fmoc améliorée par le micro-ondes. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Caractérisation des impuretés dans un peptide synthétique à base de rénin par spectrométrie de masse à impact rapide et spectrométrie de masse hybride tandem. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G. & Crowther, J. B. (1995). Détermination de la pureté péptidique : hydrolyse dans un acide deutérosé, dérivation avec le réactif de Marfey et analyse par chromatographie liquide à haute performance-ionisation par électrospray-spectrométrie de masse. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Intensité de la production de processus (PMI) : une analyse holistique des processus actuels de fabrication de peptides informe la durabilité dans la synthèse des peptides. Journal of Organic Chemistry, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Défis de durabilité dans la synthèse et la purification des peptides : de la R&D à la production. Journal of Organic Chemistry, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001