Síntese de péptidos: método em fase sólida, em solução e métodos de produção

A síntese de péptidos é um processo controlado de formação de cadeias de aminoácidos com uma sequência específica. Na síntese química, os aminoácidos selecionados são ligados por meio de ligações peptídicas, controlando simultaneamente outras grupos reativos presentes nessas moléculas. O objetivo não é, portanto, a simples ligação de aminoácidos, mas sim a obtenção de uma estrutura molecular específica com uma sequência, estereoquímica e configuração dos terminais da cadeia definidas e — se necessário — características estruturais adicionais.

Entre os principais métodos contam-se a síntese de péptidos em fase sólida (SPPS), a síntese clássica em solução e os métodos mais recentes de síntese de péptidos em fase líquida (LPPS), que utilizam suportes solúveis ou marcadores moleculares. Os laboratórios de investigação e as unidades de produção podem também combinar diferentes abordagens, preparar separadamente fragmentos mais curtos e, posteriormente, uni-los, ou recorrer à expressão biológica, caso esta seja mais adequada para a sequência em questão.

A comparação entre a síntese química e a expressão bacteriana de polipéptidos compostos por 20 a 40 resíduos de aminoácidos revela um princípio importante: a escolha prática do método de produção depende da molécula específica, da sua sequência, da sua tendência para a agregação, das modificações necessárias, da escala de produção e dos requisitos analíticos. [1]

A obtenção da sequência de aminoácidos pretendida é apenas uma das etapas da produção do péptido.

Todo o processo pode incluir:

concepção da sequência → preparação dos blocos de construção → proteção dos grupos funcionais → acoplamento → remoção dos grupos protetores → montagem da cadeia → clivagem ou junção de fragmentos → modelagem final da estrutura → purificação → confirmação da identidade → análise deimpurezas → determinação do teor → caracterização final.

No caso de alguns péptidos, são também necessárias etapas adicionais, tais como ciclização, formação de pontes dissulfuretas, dobramento, conjugação ou outras modificações químicas.

Por esse motivo, a correta disposição da cadeia não significa automaticamente que o material final possua a identidade, pureza, estereoquímica, conformação, estabilidade ou outras características exigidas.

O que é a síntese de péptidos?

Criação de uma sequência específica de aminoácidos

Péptido é constituída por resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas.

O objetivo da síntese de péptidos é formar essas ligações numa sequência pré-determinada, muitas vezes controlando simultaneamente:

• tipos de aminoácidos;
• ordem dos aminoácidos na sequência;
• estereoquímica;
• estruturas do final N;
• estruturas do final de C;
• modificações nas cadeias laterais;
• distribuição das pontes dissulfureto;
• ciclização;
• outras características estruturais exigidas.

A sequência é de importância fundamental, uma vez que uma composição de aminoácidos idêntica pode dar origem a moléculas diferentes, se os aminoácidos se apresentarem numa ordem diferente.

Afirmar que uma determinada molécula é um „peptídeo composto por cinco aminoácidos” fornece, portanto, muito pouca informação sobre a sua estrutura real. Para descrever corretamente uma molécula, é necessário conhecer o tipo de aminoácidos, a sua sequência, a estereoquímica, os grupos terminais e eventuais modificações adicionais.

Dois péptidos podem, portanto, ter exatamente a mesma composição de aminoácidos e, mesmo assim, apresentar estruturas moleculares diferentes.

Podem existir outras diferenças decorrentes de modificações nas extremidades da cadeia, da presença de pontes dissulfuretas, de uma estrutura cíclica, de alterações nas cadeias laterais ou de uma configuração estereoquímica diferente.

A síntese química de péptidos recorre normalmente a aminoácidos cujos grupos reativos foram seletivamente protegidos.

Os grupos protetores temporários permitem a formação de uma ligação química específica pretendida, ao mesmo tempo que limitam as reações concorrentes noutros locais da molécula.

Nas etapas seguintes da síntese, estas grupos são removidos ou alterados.

Uma reação controlada em vez de uma ligação espontânea

Nas descrições químicas básicas, a formação da ligação peptídica é frequentemente apresentada como uma reação de condensação, na qual dois aminoácidos se unem com a libertação, no total, de uma molécula de água.

Essa equação descreve o balanço geral da reação.

No entanto, não se deve equiparar este método à forma como, na prática, se realiza a síntese controlada de péptidos.

A simples mistura de aminoácidos livres não permitiria determinar com fiabilidade:

• qual o grupo amino que deve reagir;
• qual o grupo carboxílico que deve reagir;
• qual o aminoácido deve aparecer em primeiro lugar;
• que deve vir em segundo lugar;
• será que as cadeias laterais vão começar a reagir;
• se a estereoquímica será mantida;
• se não se formarão numerosos produtos indesejáveis.

Na síntese química prática, são, portanto, utilizadas estratégias controladas de ativação e proteção de grupos funcionais.

O grupo derivado do grupo carboxílico é normalmente ativado de forma a poder reagir eficazmente com o grupo amínico selecionado. Os grupos protetores, a sequência da reação, a química do suporte, os reagentes de acoplamento, o ambiente do solvente e os métodos de isolamento contribuem, em conjunto, para orientar a reação na direção do produto pretendido.

A síntese eficaz de um péptido requer, portanto, o controlo tanto das reações químicas que devem ocorrer como daquelas que devem ser evitadas.

Um bom exemplo é a formação do aspartimido.

Os investigadores desenvolveram um método alternativo de proteção do grupo carboxilo, com o objetivo de limitar essa reação secundária problemática durante a síntese do péptido. [2]

O estudo revela um princípio mais geral da química dos péptidos: a prevenção de alterações moleculares indesejadas pode ser tão importante quanto a formação da ligação peptídica adequada.

Quando é que se pode considerar que um péptido está pronto?

A conclusão da formação da estrutura linear do péptido nem sempre significa o fim de toda a síntese.

Dependendo da molécula final, podem ser necessárias etapas adicionais após a montagem da cadeia.

Podem incluir:

• remoção total dos grupos de proteção;
• desligamento do péptido do suporte sólido;
• remoção dos marcadores temporários;
• ciclagem;
• oxidação;
• formação de pontes dissulfuretas;
• prega;
• conjugação;
• modificação das extremidades da corrente;
• purificação;
• características analíticas.

Alguns péptidos requerem relativamente poucas alterações estruturais adicionais após a montagem da cadeia.

No caso de outros, as fases posteriores assumem uma importância fundamental.

Um bom exemplo é a síntese do inibidor bovino da tripsina pancreática (BPTI). Os investigadores montaram uma sequência linear, purificaram o material e, em seguida, obtiveram uma estrutura ondulada contendo pontes dissulfuretas. De acordo com as análises e comparações funcionais apresentadas no estudo, o material final com sequência natural correspondia à proteína natural no que diz respeito aos parâmetros analisados. [3]

Este exemplo ilustra a diferença entre a montagem do esqueleto peptídico e a obtenção da forma molecular final totalmente caracterizada.

O método que permite obter uma sequência linear correta não confirma automaticamente:

• dobragem correta;
• a disposição adequada das pontes dissulfuretas;
• atividade biológica;
• estabilidade;
• perfil de poluentes;
• adequação a uma determinada aplicação.

Cada uma destas questões requer provas específicas.

Síntese química, expressão biológica e métodos combinados

Na síntese química de péptidos, os blocos moleculares previamente preparados são unidos em reações laboratoriais controladas.

A expressão biológica, por sua vez, recorre à maquinaria celular para produzir a sequência de aminoácidos codificada. Em seguida, o material tem de ser recuperado, purificado e, se necessário, submetido a um processamento adicional.

Ambos os métodos podem conduzir à obtenção de péptidos ou polipéptidos, mas apresentam diferentes possibilidades e limitações.

A síntese química pode revelar-se particularmente útil quando são necessários:

• aminoácidos não convencionais selecionados;
• alterações químicas em locais específicos;
• estruturas específicas das extremidades da cadeia;
• marcadores isotópicos;
• modificações na estrutura peptídica;
• outras características difíceis de obter através da expressão biológica padrão.

A expressão biológica pode ser interessante no caso de sequências mais longas adequadas ou de determinadas estratégias de marcação, mas não elimina os problemas que surgem nas fases posteriores da produção.

É ainda necessário ter em conta a recuperação do material, a dobragem, o processamento, os contaminantes provenientes do organismo hospedeiro, a purificação e as características analíticas.

Nenhuma das métodos é, portanto, universalmente a melhor.

Na comparação de polipéptidos compostos por 20 a 40 resíduos de aminoácidos, tanto o comprimento da sequência como a sua tendência para a agregação influenciaram os resultados da síntese em fase sólida e da expressão bacteriana. [1]

Estas observações apoiam uma abordagem em que o método de produção é escolhido em função de uma molécula específica.

Os dados históricos relativos ao rendimento, aos custos, ao equipamento e ao tempo de produção não devem ser considerados como valores universais atuais, uma vez que as tecnologias, os reagentes, a automatização, os métodos de purificação e a economia da produção evoluem à medida que a tecnologia avança.

Síntese de péptidos em fase sólida

A cadeia em crescimento está ligada a um suporte insolúvel

Na síntese de péptidos em fase sólida (SPPS), a cadeia peptídica em formação permanece ligada a um suporte insolúvel durante os ciclos sucessivos de síntese.

O suporte é, na maioria das vezes, uma resina polimérica funcionalizada.

O ligante, ou «linker», liga o péptido ao suporte e influencia, entre outras coisas, a forma como a cadeia final é posteriormente libertada, bem como o tipo de grupo terminal obtido.

Uma das principais vantagens práticas do SPPS é a maior facilidade na separação do material.

Após a conclusão de uma determinada etapa da reação, os reagentes solúveis e muitos produtos secundários solúveis podem ser removidos por lavagem, enquanto o péptido em formação permanece ligado à fase sólida.

Desta forma, não é necessário, após a adição de cada aminoácido sucessivo, isolar e purificar o péptido em formação como um composto livre e separado.

No entanto, essa comodidade pode dar origem a um mal-entendido importante.

A lavagem da resina não significa que todos os peptídeos anormais tenham sido removidos.

Se a corrente ligada à resina não reagir durante uma das etapas de acoplamento, pode permanecer no suporte.

Nos ciclos seguintes, pode voltar a reagir e continuar a alongar-se.

Como resultado, pode formar-se uma sequência de deleção, ou seja, uma molécula que difere do péptido alvo pela ausência de um ou mais resíduos de aminoácidos.

Da mesma forma, as cadeias ligadas à resina que tenham sido quimicamente modificadas ou que não tenham sido totalmente desprotegidas podem participar nas etapas seguintes da síntese.

O SPPS simplifica, assim, a separação das substâncias solúveis do material ligado à resina.

No entanto, não garante uma correspondência perfeita das sequências.

Ciclo repetitivo de desbloqueio e engate

A síntese por etapas típica do SPPS envolve a repetição de três operações básicas:

desbloqueio → acoplamento → lavagem.

Primeiro, é exposta a grupo amina reativo que se encontra na extremidade da cadeia em crescimento.

Em seguida, é ligado à cadeia mais um aminoácido protegido.

Os reagentes solúveis, o excesso de aminoácidos e muitos dos produtos da reação são removidos antes do início do ciclo seguinte.

A repetição deste processo permite a construção do péptido, um resíduo de aminoácido de cada vez.

Na SPPS clássica, a parte terminal C é normalmente ligada ao suporte em primeiro lugar e, em seguida, a cadeia alonga-se na direção da extremidade N.

Isto difere da síntese ribossómica padrão de proteínas, durante a qual os aminoácidos são adicionados sucessivamente ao extremo C-terminal da cadeia em formação.

No entanto, a sequência final de aminoácidos pode ser idêntica, apesar de o sentido e a química do processo de montagem serem diferentes.

O termo „ciclo” não deve ser entendido como um conjunto único e universal de condições de reação adequadas para cada resíduo e cada sequência.

O decurso da reação pode depender de:

• estratégias dos grupos de proteção;
• tipo de aminoácido;
• condições espaciais em torno do local da reação;
• tipo de resina;
• linker;
• comprimento da corrente;
• agregação;
• solvente;
• química de acoplamento;
• manutenção da estrutura do péptido em crescimento.

Uma reação que decorre facilmente no início da síntese pode tornar-se significativamente mais difícil numa fase posterior.

Por isso, a monitorização do processo continua a ser importante, mesmo em sistemas altamente automatizados.

Por que razão as propriedades da resina são importantes?

Um suporte fixo não é apenas um suporte passivo.

As suas propriedades físicas e químicas podem influenciar diretamente o decurso da reação.

Um dos parâmetros importantes é o inchaço.

Se a resina inchar corretamente no meio solvente escolhido, os reagentes poderão chegar mais facilmente aos pontos reativos presentes em toda a estrutura do polímero.

Um inchaço insuficiente ou alterações na estrutura da resina podem limitar esse acesso.

Também podem ser relevantes:

• densidade de plantação;
• estrutura do polímero;
• estrutura do ligador;
• compatibilidade com solventes;
• estabilidade mecânica;
• porosidade;
• propriedades de difusão;
• interações entre as cadeias peptídicas em crescimento.

À medida que o comprimento do péptido aumenta, as diferentes cadeias também podem interagir entre si.

A agregação na resina pode limitar o acesso aos sítios reativos e conduzir a uma ligação incompleta ou a uma desproteção incompleta.

Isto significa que uma sequência que se comporta corretamente no início da síntese pode tornar-se cada vez mais difícil à medida que a cadeia se alonga.

Os investigadores desenvolveram um reator de fluxo contínuo com leito variável, que permitia monitorizar o inchaço da resina com base em medições relacionadas com a pressão. [4]

O estudo incidiu sobre a agregação na resina e a formação incompleta de ligações como problemas de processo que, noutras condições, podem ser difíceis de observar diretamente durante a síntese.

Isto demonstra que a monitorização do comportamento físico do suporte pode fornecer informações que vão além do simples registo dos reagentes adicionados.

Para que serve a resina Wanga?

A química dos ligantes do tipo Wang é amplamente utilizada na SPPS quando, após a desligação do péptido, se pretende que o extremo C-terminal assuma a forma de um ácido carboxílico.

O péptido está ligado por meio de uma ligação de tipo éster, que pode ser posteriormente clivada em condições adequadas.

Podem ser selecionados outros sistemas de ligantes quando for necessária uma estrutura diferente na extremidade C, por exemplo, uma amida.

É importante distinguir a composição química do ligante do suporte físico na sua totalidade.

Os ligantes do tipo Wang podem ser incorporados em diversas arquiteturas poliméricas.

Esses materiais não têm de ser idênticos:

• propriedades de expansão;
• capacidades;
• compatibilidade com solventes;
• propriedades mecânicas;
• comportamentos durante a reação.

Estudos que utilizaram os suportes peptidil-Wang-TentaGel revelaram um método alternativo específico para a obtenção de hidrazidas peptídicas, que são intermediários úteis na química dos peptídeos. [5]

Isso não significa que a separação padrão a partir da resina de Wang conduza normalmente à formação de hidrazidas peptídicas.

No entanto, ilustra um princípio importante:

O suporte + o ligante + as condições da reação + a química da desligação determinam, em conjunto, o produto obtido.

Síntese de SPPS em sistema periódico e em fluxo contínuo

A SPPS pode ser realizada em recipientes periódicos clássicos ou em sistemas em que os reagentes circulam através de um reator que contém um suporte sólido.

Os sistemas de fluxo contínuo podem permitir a substituição rápida de reagentes e um controlo mais preciso do ambiente químico em torno da resina.

Num estudo de 2014, foi apresentada uma síntese rápida de péptidos num sistema de fluxo contínuo com monitorização contínua, tendo sido aplicada a vários péptidos e a uma pequena proteína. [6]

Num estudo posterior automatizado, foi descrita uma montagem de cadeias significativamente mais rápida, tendo-se obtido, para os exemplos analisados, uma pureza do produto bruto e um rendimento após a isolamento comparáveis aos da síntese periódica clássica. [7]

Estes estudos demonstram as capacidades de sistemas específicos em determinadas condições.

No entanto, isso não prova que todos os péptidos possam ser produzidos com a mesma rapidez e com a mesma qualidade.

O tempo necessário para produzir um péptido envolve muito mais do que a simples montagem da cadeia.

O processo completo pode incluir:

• preparação dos reagentes;
• preparação da resina;
• acoplamento;
• desarmamento;
• lavagem;
• separação;
• o processamento do produto;
• purificação;
• remoção de solventes;
• definição final da estrutura;
• análises laboratoriais;
• documentação.

A rápida formação de ligações é, portanto, apenas um dos elementos da eficiência global da produção.

Síntese em fase líquida

O que significa este termo?

A expressão „síntese de péptidos em fase líquida” pode ser utilizada com vários significados.

Numa perspetiva mais ampla, pode simplesmente significar a síntese de um péptido realizada em solução.

Na literatura mais especializada, no entanto, distingue-se frequentemente:

1. síntese clássica de péptidos em solução;
2. síntese de péptidos em fase sólida;
3. métodos mais recentes de LPPS, nos quais a cadeia em crescimento possui um marcador ou suporte solúvel.

Esta distinção é importante, pois altera a forma como o produto é separado e valorizado.

Um intermediário peptídico em solução livre e protegido pode necessitar de ser isolado recorrendo às suas próprias propriedades físicas e químicas.

No caso de um produto semiacabado marcado, o marcador pode ser concebido de forma a facilitar a precipitação, a extração, a retenção na membrana ou qualquer outro método de separação.

A revisão sobre a LPPS distingue claramente entre a síntese clássica em solução, a SPPS e os métodos que utilizam marcadores solúveis. [8]

Esta publicação é útil para clarificar a terminologia e a metodologia.

No entanto, não deve ser interpretada como uma experiência isolada que comprove que um dos métodos é o melhor para todos os péptidos.

Síntese clássica de péptidos em solução

Na síntese clássica em solução, os aminoácidos protegidos, os intermediários peptídicos ou os fragmentos permanecem dissolvidos no meio de reação, em vez de ficarem ligados covalentemente a uma resina insolúvel.

Após a conclusão da reação, o intermediário em questão pode ser isolado, purificado e, se necessário, caracterizado antes do início da etapa seguinte.

Isso pode trazer algumas vantagens.

Os investigadores podem:

• caracterizar cada um dos produtos semiacabados;
• escolher o método de purificação adequado a cada produto intermédio;
• otimizar cada uma das transformações;
• preparar os excertos de forma independente;
• modificar a via de síntese quando um determinado intermediário causar problemas.

No entanto, a síntese em solução pode também implicar dificuldades consideráveis.

À medida que a cadeia se alonga, os peptídeos podem:

• tornar-se pouco solúvel;
• agregar;
• ser difícil de cristalizar;
• gerar poluentes muito semelhantes;
• ser difícil de separar;
• exigir isolamento múltiplo;
• provocar perdas de material nas etapas seguintes do processamento.

A síntese em solução não é, portanto, automaticamente mais simples nem mais fácil de escalar do que a SPPS.

A sua utilidade depende da sequência específica, da estabilidade dos intermediários, da solubilidade, da extensão do percurso de síntese, do comportamento durante a purificação e da eficácia das etapas sucessivas de isolamento.

O desenvolvimento de estratégias LPPS marcadas resulta, em parte, das tentativas de resolver precisamente estes problemas relacionados com a separação e o manuseamento do material. [8]

Os marcadores solúveis combinam a conceção de reações com a conceção de separações

Na LPPS marcada, o péptido em crescimento possui uma ligação molecular temporária concebida de forma a influenciar as suas propriedades físicas.

O marcador pode permitir manter uma solubilidade suficiente do péptido durante a reação e, posteriormente, facilitar a sua recuperação seletiva.

Dependendo da tecnologia, a separação pode recorrer a:

• precipitação;
• extração;
• retenção na membrana;
• comportamento de fase;
• outras propriedades decorrentes da presença do marcador.

Numa das estratégias experimentais, utilizou-se um grupo protetor de cadeia longa no extremo C-terminal para a preparação de amidas peptídicas.

As reações repetidas e as etapas de precipitação permitiram aos investigadores preparar um péptido hidrofóbico que, na comparação que realizaram, era difícil de obter de forma satisfatória através do método SPPS. [9]

Isto demonstra a utilidade desta estratégia específica para a sequência em análise.

No entanto, isso não comprova a superioridade universal da síntese marcada.

O marcador torna-se parte integrante do processo de produção e suscita as suas próprias questões:

• Qual é a eficácia da sua ligação?
• Altera o decurso da reação?
• Como é possível recuperar de forma fiável um produto semiacabado marcado?
• Isso leva à formação de novos poluentes?
• Como é que se elimina?
• É possível confirmar a eliminação total?
• Que métodos analíticos confirmam a sua ausência no produto final?

Os marcadores solúveis devem, portanto, ser considerados elementos funcionais do projeto do processo e não apenas simples etiquetas.

Comparação das principais métodos

A comparação apresenta os princípios gerais de funcionamento de cada um dos métodos.

Não especifica qual delas garantirá o melhor desempenho, limpeza, custo, sustentabilidade ambiental ou capacidade de escalabilidade para uma sequência específica.

Estes parâmetros devem ser avaliados com base na molécula real e no processo de produção específico. [4] [8] [9]

Combinação de fragmentos e produção híbrida

Um péptido nem sempre tem de ser formado num único processo contínuo que consiste na adição sucessiva de resíduos de aminoácidos.

Uma estratégia alternativa consiste em preparar separadamente fragmentos peptídicos mais curtos e, em seguida, uni-los.

O processo híbrido pode, por exemplo, utilizar a SPPS para obter fragmentos individuais e a química em solução para os ligar.

As estratégias fragmentadas podem mitigar alguns dos problemas associados à síntese por etapas muito longa.

No entanto, trazem novos desafios, tais como:

• escolha do local adequado para a ligação;
• solubilidade dos fragmentos;
• ativação do ponto de junção;
• quimioseletividade;
• manutenção da estereoquímica;
• efeitos secundários;
• limpeza de fragmentos;
• limpeza após a sua união.

Um exemplo importante de junção controlada de fragmentos é a ligação química nativa.

Na versão clássica, o tioéster peptídico reage com um segundo péptido que contém uma cisteína no extremo N-terminal. A reordenação que se segue conduz à formação de uma ligação correta na estrutura do péptido, no local da ligação.

Estudos iniciais demonstraram a possibilidade de se obter, após a ligação e a dobragem, uma proteína que contém pontes dissulfuretas. [10]

Isto confirma a importância desta estratégia de unir fragmentos.

Isso não significa, contudo, que quaisquer dois fragmentos peptídicos não modificados possam ligar-se espontaneamente.

Acoplamento e grupos de proteção

O acoplamento cria uma ligação intencional

A acoplagem é a etapa da reação durante a qual se forma uma nova ligação peptídica entre as unidades selecionadas.

Normalmente, o grupo derivado do grupo carboxilo é ativado de forma a poder reagir eficazmente com o grupo amínico correspondente.

A composição química de ativação deve estar em conformidade com:

• secuência crescente;
• grupos de proteção temporários;
• proteção das cadeias laterais;
• estereoquímica;
• um suporte ou marcador;
• meio de solvente;
• outros grupos funcionais presentes na molécula.

Uma ligação eficaz é particularmente importante na síntese por etapas, uma vez que uma reação incompleta pode conduzir à formação de sequências com deleções.

Se uma etapa da adição de aminoácidos falhar para algumas das cadeias em crescimento, essas cadeias podem permanecer no sistema e participar nos ciclos seguintes.

Como resultado, podem formar-se moléculas muito semelhantes ao péptido-alvo, mas sem uma resíduo.

Mesmo pequenas ineficiências podem, portanto, acumular-se ao longo das várias etapas da síntese.

Um exemplo matemático simples ilustra bem este problema.

Se cada uma das 50 etapas independentes do processo de montagem tivesse uma probabilidade de sucesso de 99%, a percentagem de moléculas para as quais todas as etapas seriam bem-sucedidas seria:

0,99^50 ≈ 0,605

ou seja, cerca de 61%.

Trata-se apenas de uma ilustração matemática.

Não constitui uma previsão da pureza real nem do rendimento da síntese de um péptido com 50 resíduos.

A produção efetiva inclui:

• diferentes capacidades de acoplamento em cada posição;
• etapas de desbloqueio;
• efeitos secundários;
• dependentes da sequência de dificuldades;
• estratégias de reconexão;
• perdas durante a separação;
• perdas durante a purificação;
• outras variáveis do processo.

O cálculo mostra apenas por que razão mesmo uma ineficiência aparentemente pequena numa única etapa pode assumir grande importância numa síntese em várias etapas.

As equipas de proteção controlam o local da reação

Um aminoácido pode possuir várias grupos quimicamente reativos.

Sem um controlo seletivo, as reações de acoplamento poderiam ocorrer em locais indesejáveis.

Os grupos de proteção bloqueiam temporariamente os locais reativos selecionados.

O grupo amino utilizado para prolongar a cadeia requer, normalmente, uma proteção temporária, enquanto as cadeias laterais reativas podem necessitar de uma proteção que permaneça no local durante vários ciclos de síntese.

A ligação ao suporte também tem de resistir a estas etapas até ao momento da separação prevista.

A escolha dos grupos protetores influencia, portanto, toda a estratégia de síntese.

É necessário ter em conta:

• a forma como são introduzidos;
• estabilidade;
• método de remoção;
• compatibilidade com outros grupos de proteção;
• compatibilidade com o suporte;
• efeitos secundários;
• o impacto de uma sequência específica;
• condições finais de desativação da proteção.

Os estudos que utilizaram a proteção baseada no cianossulfurilido incidiram sobre a formação do aspartimida através da alteração do modo de proteção do grupo carboxilo. [2]

Os resultados mostram que a estratégia dos grupos de proteção influencia não só a possibilidade de a reação pretendida ocorrer, mas também o tipo de reações indesejáveis que se tornam possíveis.

Fmoc, Boc e proteção ortogonal

O Fmoc e o Boc pertencem a grupos amplamente utilizados para proteger grupos amínicos.

Na verdade, diferem na forma como são removidos.

O Fmoc é normalmente removido em condições alcalinas, enquanto o Boc é sensível a condições ácidas.

Estas características permitem que sejam utilizadas como elementos de estratégias de proteção mais abrangentes.

Na popular SPPS baseada em Fmoc, a proteção temporária N-terminal Fmoc é removida repetidamente, enquanto os grupos protetores selecionados das cadeias laterais e a ligação à resina permanecem intactos até etapas posteriores.

Outras estratégias podem utilizar combinações diferentes.

Um conceito particularmente importante é a proteção ortogonal.

Dois grupos protetores são considerados ortogonais se for possível remover seletivamente um deles em condições em que o outro permaneça suficientemente estável para permitir a continuação da síntese.

A ortogonalidade é, portanto, uma relação prática de compatibilidade química.

Isso não significa que cada grupo protegido permaneça totalmente inalterado após um número ilimitado de exposições a todas as condições de reação.

Ainda podem ocorrer efeitos secundários.

Nos estudos sobre a síntese de Fmoc, foram descritas tanto a formação de aspartimida como alterações estereoquímicas indesejáveis, apesar da seletividade prevista da estratégia de proteção geral. [11]

A estereoquímica faz parte da identidade de uma molécula

Muitos aminoácidos possuem um centro quiral.

Isto significa que os seus átomos podem assumir diferentes arranjos espaciais, correspondentes a diferentes formas estereoquímicas.

A alteração da configuração de um centro estereogênico pode levar à formação de outra estrutura do péptido, sem que seja necessário alterar a sua massa nominal.

Por isso, a massa por si só não permite confirmar a identidade completa do péptido.

A epimerização significa, normalmente, a alteração da configuração de um centro estereogénico numa molécula que contenha vários desses centros.

A racemização é também frequentemente abordada na química dos péptidos no contexto da perda da integridade estereoquímica dos resíduos de aminoácidos.

Estas alterações são importantes, uma vez que o reconhecimento molecular pode depender fortemente da disposição espacial dos átomos.

Duas moléculas com a mesma composição elementar e a mesma massa nominal podem, portanto, comportar-se de forma diferente se apresentarem uma estereoquímica diferente.

Num estudo sobre a síntese Fmoc assistida por micro-ondas, verificou-se que alguns resíduos eram suscetíveis a alterações estereoquímicas indesejadas nas condições utilizadas. A modificação do método reduziu a ocorrência dessas reações. [11]

Isso não significa que o aquecimento, por definição, danifique todos os péptidos.

A conclusão correta é que a aceleração da reação deve ser avaliada em conjunto com a seletividade química dependente da sequência.

Aspartimida e outras impurezas relacionadas

A formação de aspartimida é uma reação secundária conhecida que envolve determinadas sequências que contêm asparaginato.

Pode formar-se um intermediário cíclico indesejado, a partir do qual se formam, posteriormente, compostos com ligações da estrutura ou estereoquímica alteradas.

A probabilidade desta reação depende da sequência e das condições do processo.

Outras impurezas associadas à síntese podem resultar de:

• acoplamento incompleto;
• desbloqueio incompleto;
• formação de sequências de deleção;
• reações das cadeias laterais;
• alterações estereoquímicas;
• reação durante a separação;
• oxidação;
• reorganizações;
• condições de processamento do produto;
• remoção incompleta dos grupos de proteção.

Algumas impurezas provocam uma alteração facilmente percetível na massa molecular.

Outros são muito mais difíceis de distinguir.

Em análises realizadas a um péptido sintético que serve de substrato da renina, foram identificadas várias impurezas, incluindo componentes que apresentavam a mesma variação de massa, mas que continham modificações em posições diferentes. [12]

Para os distinguir, foi necessária uma análise estrutural adicional.

Os investigadores também consideraram os mecanismos propostos para a formação destes poluentes como hipóteses.

Esta é uma distinção importante:

Determinar o que é a poluição e comprovar o mecanismo exato da sua formação são duas questões científicas distintas.

Não se deve apresentar um mecanismo provável como confirmado apenas pelo facto de corresponder à massa molecular observada.

Purificação, descalcificação e qualidade da produção

Produto bruto, produto purificado e rendimento

Um péptido bruto é um material obtido antes da conclusão das etapas de purificação adequadas.

Pode conter:

• peptídeo-alvo;
• sequências de deleção;
• material não totalmente desarmado;
• sequências modificadas;
• resíduos de reagentes;
• produtos relacionados com a separação;
• sais;
• solventes;
• outros componentes formados durante o processo.

A purificação tem como objetivo separar o péptido pretendido dessa mistura.

É necessário distinguir claramente três conceitos:

pureza da matéria-prima — composição medida do material antes da purificação final;

rendimento do produto purificado ou isolado — quantidade de material-alvo recuperado em relação a um valor inicial ou teórico definido;

pureza final — composição do material isolado, determinada através de um método analítico específico.

Estes conceitos não são intercambiáveis.

O processo pode resultar na produção de uma grande quantidade de matéria-prima, mas permitir a recuperação de uma quantidade relativamente pequena de produto purificado.

Outro processo pode produzir menos matéria-prima, mas caracterizar-se por uma elevada seletividade na obtenção do produto final.

Da mesma forma, uma elevada pureza analítica não implica necessariamente um elevado rendimento de produção.

Nos estudos sobre a síntese acelerada em fluxo contínuo, a pureza da matéria-prima e o rendimento após a isolação foram devidamente relatados separadamente. [7]

A cromatografia separa os componentes, mas não responde a todas as perguntas

A cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) é amplamente utilizada na análise e purificação de peptídeos.

As diferentes moléculas interagem de forma distinta com a fase estacionária e com a fase móvel.

Em condições adequadas, essas diferenças permitem a separação dos componentes da mistura.

A cromatografia analítica e a cromatografia preparativa têm aplicações relacionadas, mas distintas.

O Analityczna HPLC destina-se principalmente à análise da composição da amostra.

A unidade preparativa HPLC é utilizada para a recolha física dos componentes separados.

Um cromatograma pode fornecer muitas informações úteis.

No entanto, um pico principal de grande intensidade ou uma elevada percentagem da sua área não devem ser considerados como uma caracterização molecular completa.

Os resultados da cromatografia dependem, entre outros fatores, de:

• tipo de coluna;
• fase móvel;
• gradiente;
• temperaturas;
• métodos de deteção;
• comprimento de onda;
• preparação da amostra;
• forma de integração dos picos;
• resolução;
• propriedades dos poluentes.

Dois compostos podem, potencialmente, ser eluídos ao mesmo tempo.

Alguns componentes da amostra podem também reagir de forma diferente ao detetor utilizado.

Por isso, a elevada pureza superficial do HPLC não equivale a uma confirmação total da identidade molecular.

Estudos sobre impurezas peptídicas isobáricas e análises quirais demonstram por que razão podem ser necessários métodos analíticos complementares. [12] [13]

O método analítico deve responder a uma questão estrutural específica.

Identidade, pureza e conteúdo têm significados diferentes

Na caracterização dos péptidos, há três conceitos que se revelam particularmente importantes.

A identidade responde à pergunta:

A amostra contém a molécula pretendida?

A pureza responde à pergunta:

Que outros componentes estão presentes na amostra ou que parte do sinal medido corresponde ao componente principal?

O conteúdo responde à seguinte pergunta:

Quanto peptídeo real existe na amostra?

Nem sempre é possível responder a estas perguntas com base numa única medição.

O material que contém o peptídeo pode também conter:

• água;
• contrário;
• sais;
• resíduos de solventes;
• outros componentes relacionados com o processo;
• poluição.

A massa total do material pesado não tem, portanto, de corresponder à massa do próprio péptido.

Da mesma forma, a concordância entre a massa molecular medida e o valor teórico não confirma:

• sequência completa de aminoácidos;
• a ligação correta entre os diferentes fragmentos;
• integridade estereoquímica;
• distribuição das pontes dissulfureto;
• prega;
• ausência de poluentes isobáricos.

A espectrometria de massa pode fornecer provas sólidas relativas à massa molecular.

A espectrometria de massa em tandem e outras técnicas estruturais podem fornecer informações adicionais sobre a sequência.

Os métodos quirais permitem analisar questões estereoquímicas que não podem ser resolvidas através da simples medição da massa.

Num dos estudos analíticos, foi até tida em conta a racemização que ocorre durante a preparação da amostra. Isto ilustra outro princípio importante: o próprio procedimento analítico pode causar artefactos, se não for devidamente concebido. [13]

A dobragem e a atividade podem exigir uma confirmação separada

No caso de péptidos com estrutura limitada e de pequenas proteínas, a sequência correta e a massa molecular podem continuar a ser insuficientes para confirmar a estrutura final pretendida.

Outras perguntas podem incluir:

• Será que se formaram as pontes dissulfuretas corretas?
• A molécula assumiu a conformação esperada?
• A ciclagem está completa?
• Existem isómeros estruturais?
• A molécula sintética apresenta a atividade esperada num determinado teste experimental?

No estudo sobre a síntese do BPTI, foram utilizadas várias métodos analíticos e biofísicos, juntamente com a avaliação da inibição da tripsina. [3]

Os resultados globais confirmaram a compatibilidade do material sintético com sequência natural com a proteína natural no que diz respeito aos critérios analisados.

No entanto, o teste de atividade responde a uma questão funcional específica.

Não substitui a análise de poluentes.

Da mesma forma, uma atividade semelhante num único teste não confirma a equivalência total de todas as propriedades biológicas, estruturais ou de produção.

A expansão da produção altera mais do que apenas a quantidade de material

O aumento da escala de produção não consiste apenas num aumento proporcional da quantidade de todos os reagentes.

Os processos físicos podem comportar-se de forma diferente em escalas maiores.

Podem ser relevantes:

• mistura;
• troca de calor;
• distribuição de reagentes;
• difusão;
• inchaço da resina;
• pressão;
• filtração;
• gestão de solventes;
• precipitação;
• solubilidade dos produtos intermédios;
• transporte de massa;
• capacidades do sistema de tratamento.

Estes fatores podem influenciar tanto o decurso da reação como a formação de impurezas.

O tratamento em fases posteriores também pode tornar-se um ponto de estrangulamento de toda a produção.

O aumento da velocidade de síntese tem uma importância limitada se o sistema de purificação não for capaz de separar eficazmente os contaminantes gerados ou de recuperar o produto com a qualidade exigida.

Numa análise industrial que abrangeu 40 processos de síntese de péptidos de 14 empresas farmacêuticas, foi avaliado o consumo de materiais durante a síntese, a purificação e a isolamento. [14]

O estudo mostra por que razão a avaliação da produção deve ser realizada ao longo de todo o processo.

Isso não significa, contudo, que todas as fábricas, sequências ou tecnologias de produção alcancem resultados idênticos.

A qualidade da produção resulta de vários elementos de controlo

A produção fiável de péptidos requer mais do que a obtenção de um único resultado analítico satisfatório.

Um processo controlado envolve, normalmente, vários elementos interligados:

molécula-alvo definida → matérias-primas adequadas → síntese controlada → purificação controlada → amostragem adequada → análise validada ou adequada ao objetivo → documentação do lote.

A documentação do lote associa os resultados analíticos ao material que foi efetivamente produzido.

O certificado de análise (COA) resume os resultados selecionados dos ensaios realizados num determinado lote.

O seu valor informativo depende de:

• tipo de análises realizadas;
• métodos utilizados;
• a utilidade destes métodos;
• especificações;
• identificação da amostra;
• capacidade de rastreabilidade dos lotes;
• a confirmação de que os resultados comunicados se referem efetivamente ao material em questão.

Um valor isolado, designado por „pureza”, não pode, por si só, confirmar:

• identidade molecular completa;
• teor do péptido;
• integridade estereoquímica;
• nível de resíduos de solventes;
• teor de água;
• composição de contra-iões;
• propriedades microbiológicas;
• prega;
• atividade biológica;
• adequação a um determinado fim.

O conjunto adequado de análises depende da utilização pretendida do material.

Um péptido utilizado como material de referência analítico, um reagente de ensaio utilizado numa experiência celular e um material em fase de desenvolvimento farmacêutico podem exigir respostas a outras questões relacionadas com a qualidade.

As evidências analíticas devem, portanto, ser interpretadas num contexto claramente definido e não como uma confirmação universal da qualidade.

A avaliação da sustentabilidade ambiental deve abranger todo o processo

A síntese de péptidos pode exigir quantidades significativas de solventes e reagentes.

A avaliação do impacto ambiental deve, portanto, ter em conta muito mais do que apenas a fase de acoplamento.

Entre os elementos importantes podem incluir-se:

• preparação de blocos de construção;
• reagentes de acoplamento;
• reagentes para a remoção da proteção;
• lavagem;
• separação;
• acabamento do produto;
• cromatografia;
• substituição de solventes;
• isolamento;
• secagem;
• gestão de resíduos.

A redução do impacto ambiental pode exigir a melhoria simultânea de várias etapas.

Numa análise publicada sobre a produção de péptidos, foram abordados os problemas relacionados tanto com a síntese como com a purificação, tendo-se salientado a necessidade de melhorar todo o projeto do processo. [15]

Por se tratar de uma publicação prospectiva, não constitui uma comparação direta e controlada que comprove que uma determinada tecnologia seja sempre mais ecológica.

Da mesma forma:

uma síntese mais rápida não significa automaticamente uma síntese mais ecológica,

e o menor consumo de solventes durante a própria síntese não significa automaticamente um menor impacto de todo o processo de produção.

As comparações ambientais exigem a utilização de limites de análise coerentes e, idealmente, devem relacionar o consumo de recursos com uma determinada quantidade de produto final isolado e caracterizado.

Perguntas mais frequentes

1. Em que difere a síntese de péptidos em fase sólida da síntese em fase líquida?

Na síntese em fase sólida, o péptido em formação permanece ligado a um suporte insolúvel, enquanto que na síntese clássica em solução o intermediário peptídico permanece dissolvido e, normalmente, tem de ser recuperado com base nas suas propriedades físicas e químicas. Num sentido mais restrito, na LPPS, a cadeia em formação dissolvida possui, adicionalmente, um marcador ou suporte solúvel que facilita a separação posterior. Estudos sobre a síntese marcada mostram uma das estratégias para combinar a química em solução com a recuperação por precipitação, enquanto a literatura relativa ao LPPS distingue essas abordagens tanto da síntese clássica em solução como do SPPS. Nenhum método é, por definição, ideal para todos os peptídeos. A diferença fundamental diz respeito à forma física como a cadeia em crescimento é conduzida e separada durante as sucessivas etapas da síntese. [8] [9]

2. Por que razão podem surgir impurezas durante a síntese de peptídeos?

Podem surgir impurezas porque as reações pretendidas nem sempre ocorrem quantitativamente, e outros grupos funcionais podem participar em reações indesejadas. A ligação incompleta pode conduzir a sequências com deleções, a desproteção incompleta pode interferir com a continuação da montagem da cadeia, e algumas sequências são suscetíveis a alterações estereoquímicas, à formação de aspartimida, à oxidação, rearranjos ou produtos secundários associados à desprotecção. Estudos sobre a síntese de Fmoc e análises estruturais de impurezas peptídicas sintéticas documentam vários exemplos deste tipo. [11] [12] A frequência e a importância de cada impureza dependem da sequência e do processo, pelo que a automatização da síntese não deve ser equiparada à ausência total de erros químicos.

3. Que papel desempenha a resina na síntese de péptidos?

A resina retém o péptido em formação, enquanto os reagentes solúveis e muitos subprodutos podem ser removidos entre as sucessivas etapas da síntese. Isto simplifica consideravelmente a montagem repetitiva da cadeia, mas a resina não é apenas um suporte mecânico. O seu inchaço, o grau de ocupação, a arquitetura do polímero, a compatibilidade com solventes e a disponibilidade de sítios de reação podem influenciar a eficácia com que os reagentes chegam ao péptido ligado. Em estudos que utilizaram um reator de leito variável, monitorizou-se o comportamento da resina durante a análise da agregação e da eficácia da ligação. [4] Esse monitorização não elimina erros de sequência, mas mostra por que razão o estado físico da resina pode ser uma variável processual importante.

4. Para que serve a resina de Wanga na síntese de péptidos?

Os suportes do tipo Wang são geralmente associados à preparação de péptidos que são libertados após a clivagem adequada a partir do extremo C-terminal, na forma de ácido carboxílico. No entanto, o produto final exato depende do ligante, da arquitetura do suporte e da química de desligamento utilizada, e não apenas do nome da resina. Os investigadores também apresentaram um método especializado para converter o material peptídeo-Wang-TentaGel em hidrazidas peptídicas, que podem servir como intermediários sintéticos úteis. [5] A reação alternativa não altera a importância da desprotecção padrão da resina de Wang. Demonstra, no entanto, por que razão, ao prever o produto, é necessário analisar todo o sistema do suporte e as condições da reação.

5. O SPPS sintetiza o péptido a partir do extremo N-terminal ou do extremo C-terminal?

A SPPS clássica por etapas começa normalmente com a ligação do resíduo do extremo C ao suporte, após o que a cadeia é alongada na direção do extremo N. Esta é a direção oposta ao alongamento normal da cadeia no ribossoma, onde a proteína cresce através da adição de aminoácidos sucessivos à extremidade C-terminal. A síntese de BPTI é um exemplo da utilização de blocos de construção protegidos e de um suporte, com vista à posterior libertação, purificação e dobragem do produto. [3] No entanto, existem estratégias especializadas de química de péptidos que utilizam outras soluções; por isso, a construção do C- ao N-terminal deve ser definida como a abordagem clássica da SPPS e não como uma regra absoluta para todos os métodos de síntese.

6. Por que razão são necessários os grupos de proteção?

Os aminoácidos contêm frequentemente várias grupos funcionais reativos. Os grupos protetores impedem temporariamente a reação de determinados locais, deixando o local adequado disponível numa etapa específica da síntese. Isto ajuda a controlar a sequência e a forma como as unidades são ligadas. Sem a proteção adequada, reações concorrentes poderiam conduzir à formação de misturas complexas ou de produtos com estrutura alterada. Estudos sobre a formação do aspartimido demonstraram que a alteração da química de proteção do grupo carboxilo pode limitar uma importante reação secundária nas sequências analisadas. [2] Os grupos protetores não garantem um decurso ideal da síntese, mas asseguram um controlo químico seletivo, que deve permanecer compatível com todas as etapas relevantes do processo.

7. Em que é que o Fmoc e o Boc diferem?

O Fmoc e o Boc são grupos protetores temporários da amina amplamente utilizados, mas reagem a condições químicas diferentes. O Fmoc é normalmente removido em ambiente alcalino, enquanto o Boc é sensível aos ácidos. Esta diferença influencia a forma como são ligados à proteção das cadeias laterais, aos ligantes e às restantes etapas da síntese. A síntese baseada em Fmoc é amplamente utilizada na SPPS contemporânea, mas estudos demonstraram também a possibilidade de ocorrência de reações secundárias dependentes da sequência nessas condições. [11] Na prática, é, portanto, mais útil comparar estratégias de proteção na sua totalidade e a sua compatibilidade com uma determinada sequência do que considerar apenas os nomes de dois grupos protetores.

8. O que significa «proteção ortogonal»?

A proteção ortogonal significa que um grupo protetor pode ser removido em condições em que outro grupo protetor necessário permanece suficientemente estável para que a síntese possa prosseguir. Isto permite expor diferentes sítios reativos em etapas específicas. Este conceito reveste-se de importância fundamental na síntese controlada de peptídeos complexos. No entanto, a ortogonalidade depende das condições e não é absoluta: a exposição repetida, a natureza da sequência e os parâmetros da reação podem ainda conduzir a reações secundárias. Estudos sobre métodos alternativos de proteção de grupos carboxílicos demonstram como a estratégia de proteção pode ser modificada para controlar a química peptídica complexa. [2]

9. O que é uma sequência de deleção?

Uma sequência de deleção é um péptido do qual faltam um ou vários resíduos presentes na sequência-alvo pretendida. Pode formar-se quando a etapa de ligação do aminoácido não ocorre na totalidade, mas a cadeia não reagida permanece ligada ao suporte e participa nos ciclos seguintes. Uma vez que a cadeia anómala continua ligada à resina, a lavagem normal pode não ser suficiente para a remover. Estudos de monitorização do SPPS em tempo real apontam a formação incompleta de ligações amídicas como um problema processual importante. [4] A sequência com deleção é, portanto, um problema relacionado com a estrutura e a identidade do produto, e não apenas um resíduo do reagente.

10. É possível que duas impurezas peptídicas tenham a mesma massa molecular?

Sim. Diferentes estruturas moleculares podem ter uma massa nominal idêntica ou indistinguível. Por esse motivo, a mera concordância de massa não confirma a identidade total da molécula. Num estudo sobre um péptido sintético que serve de substrato da renina, foram identificados componentes isobáricos de impurezas, nos quais as modificações ocorriam em posições diferentes. A derivatização e a espectrometria de massas em tandem forneceram informações estruturais adicionais. [12] Este exemplo ilustra por que razão a concordância entre a massa observada e a esperada não pode, por si só, confirmar a sequência correta, as ligações, a estereoquímica nem a ausência de isómeros estruturalmente semelhantes.

11. O que são a epimerização e a racemização na síntese de péptidos?

A epimerização e a racemização referem-se a alterações indesejáveis na configuração estereoquímica. Estas podem ocorrer sem alteração da sequência nominal de aminoácidos ou do peso molecular, pelo que a simples medição do peso pode não revelar qualquer diferença estrutural. Em estudos sobre a síntese de Fmoc assistida por micro-ondas, foram identificados resíduos suscetíveis a alterações estereoquímicas e demonstrou-se que a modificação das condições de reação pode limitar esses processos. [11] O risco depende do bloco de construção, da sequência e das condições do processo. A qualidade estereoquímica requer, portanto, métodos analíticos capazes de avaliar a configuração, não podendo ser inferida exclusivamente com base na massa molecular.

12. O que é a formação do aspartimido?

A formação de aspartimida é uma reação indesejada associada a determinadas sequências que contêm asparaginato. A formação de um intermediário cíclico pode conduzir a produtos subsequentes com ligações na estrutura ou estereoquímica alteradas, reduzindo o rendimento e dificultando a purificação. Os investigadores analisaram estratégias alternativas de proteção concebidas para limitar esta reação em peptídeos e proteínas selecionados. [2] Os resultados não apontam para uma solução única e universal para todas as sequências que contêm asparaginato. Mostram, em vez disso, por que razão o planeamento da síntese e as estratégias de controlo de impurezas devem ter em conta o comportamento químico específico de cada sequência.

13. A elevada pureza do HPLC confirma a identidade correta do péptido?

Não. A pureza HPLC descreve a amostra no âmbito de uma determinada separação cromatográfica, do detetor utilizado e do método de análise dos dados. Uma elevada área do pico principal pode constituir uma prova valiosa de que a amostra é dominada por um único componente cromatograficamente separado, mas não confirma, por si só, a identidade molecular completa. Impurezas coelutantes, estereoisómeros e outras variantes podem exigir técnicas adicionais. Nos estudos de análise quiral de péptidos, foi utilizado um processo especialmente concebido, que também teve em conta as alterações estereoquímicas que ocorrem durante a preparação da amostra. [13] A identidade e a pureza devem, portanto, ser consideradas questões analíticas interligadas, mas distintas.

14. O rendimento do produto purificado é sinónimo de pureza?

Não. O rendimento do produto purificado ou isolado define a quantidade de material-alvo recuperado em relação a uma quantidade inicial ou teórica definida. A pureza, por sua vez, descreve a composição do material recuperado de acordo com um método analítico específico. A síntese pode conduzir à obtenção de uma quantidade relativamente pequena de produto com pureza muito elevada ou de uma grande quantidade de matéria-prima contendo uma quantidade significativa de impurezas. Nos estudos sobre síntese automática em fluxo contínuo, a pureza do produto bruto e o rendimento após a isolação foram relatados separadamente. [7] A separação destes parâmetros evita que o valor elevado de um deles seja erroneamente interpretado como prova do valor elevado do outro.

15. É possível produzir peptídeos longos através da ligação de fragmentos mais curtos?

Sim. Na estratégia fragmentária, os segmentos peptídicos mais curtos podem ser preparados separadamente e, posteriormente, ligados através de uma química adequada. A ligação química in vitro foi um exemplo importante em que fragmentos peptídicos não protegidos foram ligados de forma a dar origem a uma ligação natural da estrutura peptídica, tendo-se obtido, posteriormente, uma proteína dobrada. [10] Isto não significa que quaisquer fragmentos peptídicos se possam ligar espontaneamente. É necessário ter em conta a estrutura dos fragmentos, a química da ligação, a escolha do local de ligação, a solubilidade, a estereoquímica e os requisitos de purificação. A montagem de fragmentos é, portanto, uma estratégia alternativa de conceção da síntese, e não uma solução automática para os problemas relacionados com peptídeos longos.

16. Será que uma síntese automatizada mais rápida elimina a necessidade de purificação?

Não. A síntese automatizada ou em fluxo contínuo, mais rápida, reduz o tempo de determinadas etapas da síntese, mas não prova que cada molécula resultante tenha a estrutura pretendida. Nos estudos sobre síntese em fluxo contínuo rápida, continuou-se a caracterizar a matéria-prima e a aplicar uma purificação posterior, e em trabalhos subsequentes sobre automatização comparou-se separadamente a pureza da matéria-prima e o rendimento após a isolamento. [6] [7] Os bons resultados do sistema para as sequências estudadas também não garantem resultados idênticos para cada novo alvo. A síntese acelerada continua a ter de ser acompanhada de uma purificação adequada, confirmação da identidade, análise de impurezas e caracterização final.

17. Por que razão aumentar a escala de produção é mais complicado do que preparar um lote maior?

O aumento da escala altera as condições físicas e químicas, e não apenas a quantidade de material. A mistura, a troca de calor, o inchaço da resina, a distribuição dos reagentes, a pressão, a filtração, o manuseamento de solventes, a solubilidade dos produtos intermédios e as capacidades do sistema de purificação podem comportar-se de forma diferente com um maior volume de produção. Numa análise industrial de 40 processos peptídicos, a síntese, a purificação e a isolamento foram avaliadas separadamente durante a análise do consumo de materiais. [14] Os resultados mostram por que razão a produção deve ser considerada como um processo completo. Um método escalável deve conduzir, de forma repetível, à obtenção de um material caracterizado em todas as etapas, e não apenas a uma maior quantidade de peptídeo bruto.

18. O peptídeo fica pronto logo após a montagem da sequência correta?

Não necessariamente. A estrutura da cadeia constitui o esqueleto da sequência apenas na medida em que tal seja confirmado pelo processo e pelos dados analíticos. Dependendo da molécula, podem ainda ser necessários processos de desproteção, clivagem, ciclização, oxidação, formação de pontes dissulfureto, dobragem, conjugação, purificação e caracterização. A síntese do BPTI constitui um bom exemplo de um processo em que, após a montagem da sequência linear, se seguiu a purificação e a formação de uma estrutura dobrada contendo pontes dissulfuretas. [3] O termo „peptídeo acabado” deve, portanto, referir-se à forma molecular exigida num determinado contexto científico, e não apenas à conclusão da adição gradual de aminoácidos.

19. A massa molecular correta confirma que a sequência do péptido está correta?

Não. A concordância da massa molecular é uma prova valiosa, mas não pode, por si só, confirmar a sequência completa nem a estrutura molecular. As estruturas isobáricas podem ter a mesma massa, e as diferenças estereoquímicas podem nem sequer provocar alterações na massa molecular. Estudos sobre impurezas em péptidos sintéticos demonstraram que a distinção entre componentes estruturalmente diferentes pode exigir espectrometria de massas em tandem e análises adicionais. [12] No caso de questões relativas à integridade estereoquímica, podem também ser necessários métodos quirais. [13] A massa molecular deve, portanto, ser considerada como um dos elementos da avaliação da identidade, e não como a sua confirmação completa.

20. Por que razão a purificação deve ser considerada parte integrante do processo de produção do peptídeo e não apenas uma etapa final?

A purificação determina se o péptido alvo pode ser separado eficazmente das sequências de deleção, subprodutos, resíduos de reagentes, impurezas estruturalmente semelhantes e outros componentes formados durante a síntese. Um método que permita produzir rapidamente grandes quantidades de matéria-prima pode continuar a ser impraticável se não for possível recuperar eficazmente o produto alvo com a qualidade exigida. Por este motivo, as análises industriais dos processos peptídicos têm em conta, em conjunto, a síntese, a purificação e a isolamento. [14] A eficiência da produção deve, em última análise, ser avaliada com base na quantidade e nas propriedades do material final isolado, e não exclusivamente na velocidade de síntese.

Limitações na comparação de métodos de síntese de péptidos

Ao interpretar estudos que comparam tecnologias de produção de péptidos, é importante ter em conta algumas limitações significativas.

Em primeiro lugar, a sequência influencia significativamente a dificuldade da síntese. Um método que funciona para um péptido não tem necessariamente de funcionar da mesma forma para outro. A agregação, a hidrofobicidade, a composição aminoacídica, o comprimento, a tendência para formar estruturas secundárias e a suscetibilidade a reações secundárias podem alterar o comportamento do processo. [1] [4]

Em segundo lugar, a pureza da matéria-prima, o rendimento após a isolamento, a pureza final e o teor de peptídeo são parâmetros distintos. Comparar os métodos com base apenas num deles pode dar uma imagem incompleta da eficácia da produção. [7]

Em terceiro lugar, a rápida síntese da cadeia não significa uma produção rápida de todo o material. A purificação, a limpeza, a isolamento, o modelamento final da estrutura, os ensaios analíticos e a documentação também influenciam o tempo total de produção. [6] [7]

Em quarto lugar, a pureza analítica depende do método utilizado. O HPLC, a espectrometria de massa, a espectrometria de massa em tandem e a análise quiral respondem a questões diferentes. Um único resultado analítico não tem necessariamente de confirmar a identidade estrutural completa. [12] [13]

Em quinto lugar, a escala influencia o comportamento do processo. Os resultados da síntese laboratorial não podem ser automaticamente transpostos para a produção industrial sem uma avaliação da mistura, do transporte da massa, das capacidades de purificação, do consumo de materiais e de outros fatores dependentes da escala. [14]

Em sexto lugar, as comparações económicas históricas podem, com o tempo, perder a sua atualidade. Os custos dos reagentes, o nível de automatização, as tecnologias de expressão, o equipamento de purificação, a recuperação de solventes e a infraestrutura de produção estão em constante evolução. As análises de custos mais antigas podem continuar a ter relevância científica, mas não têm necessariamente de refletir a situação económica atual do mercado. [1]

Em sétimo lugar, as comparações ambientais exigem limites de análise coerentes. Avaliar o consumo de solventes apenas durante a montagem da cadeia, ignorando simultaneamente a purificação e o isolamento, pode levar a conclusões enganosas sobre a sustentabilidade do processo. [14] [15]

Por fim, o próprio nome do método não determina a qualidade do produto. A SPPS, a síntese em solução, a LPPS, a ligação de fragmentos e a expressão biológica podem conduzir à obtenção de material de alta qualidade, desde que o processo tenha sido devidamente concebido e controlado. No entanto, nenhuma destas métodos garante automaticamente a identidade correta, a pureza, a estereoquímica, o dobramento ou a adequação a uma aplicação específica.

Resumo

A síntese de péptidos deve ser entendida, antes de mais, como um processo controlado de produção de moléculas, e não simplesmente como a formação de ligações peptídicas.

O objetivo é construir uma sequência específica de aminoácidos, controlando simultaneamente a forma como os resíduos se ligam, a química dos grupos protetores, a estereoquímica, as reações secundárias e quaisquer requisitos estruturais adicionais.

A síntese de péptidos em fase sólida mantém a cadeia em crescimento num suporte insolúvel, pelo que as etapas repetidas de acoplamento e lavagem se prestam bem à automatização. No entanto, as vantagens associadas à síntese repetitiva não eliminam problemas como reações incompletas, agregação, sequências com deleções ou reações secundárias dependentes da sequência. [4] [6] [7]

A síntese clássica em solução mantém os intermediários peptídicos na fase líquida e pode proporcionar maior flexibilidade na isolação e caracterização de cada um dos produtos intermédios. No entanto, a separação repetida e a diminuição da solubilidade podem constituir sérias limitações.

Os métodos de síntese em fase líquida com marcadores solúveis procuram combinar a química em solução com estratégias de recuperação de material concebidas especificamente para o efeito. Podem, assim, constituir uma alternativa adicional no caso de sequências e problemas de produção para os quais a SPPS clássica não é a solução ideal. [8] [9]

As moléculas mais longas ou particularmente complexas também podem ser preparadas através da montagem de fragmentos, incluindo a ligação química nativa, em vez de se basear exclusivamente na adição contínua de resíduos de aminoácidos sucessivos. [10]

Independentemente do método de montagem escolhido, a eficiência da acoplagem e a química dos grupos protetores continuam a ser fundamentais, uma vez que pequenas ineficiências e reações secundárias podem acumular-se ao longo das etapas subsequentes da síntese. A formação do aspartimido, as sequências de deleção e as alterações estereoquímicas demonstram por que razão a sequência pretendida, por si só, não descreve tudo o que pode surgir durante o processo. [2] [11] [12]

O trabalho também não termina com a montagem da corrente.

A purificação determina se o produto final pode ser separado dos outros componentes.

Em seguida, os métodos analíticos adequadamente selecionados respondem a questões específicas relativas à identidade, pureza, composição, estereoquímica, conformação e — se for o caso — atividade funcional. [3] [12] [13]

O aumento da escala de produção levanta novas questões relacionadas com o transporte da massa, a estabilidade da resina, o consumo de solventes, a filtração, as capacidades de purificação, a repetibilidade do processo e o seu impacto ambiental. Por este motivo, a avaliação industrial do processo deve abranger, em conjunto, a síntese, a purificação e a isolamento, em vez de se concentrar exclusivamente na velocidade de copulação. [14] [15]

A regra mais importante é a seguinte:

A produção eficaz de um péptido requer o controlo de todo o processo – desde a conceção molecular e a formação de ligações até à purificação e à caracterização estrutural. A obtenção de uma cadeia com a massa nominal esperada ou de um pico cromatográfico principal elevado constitui uma prova valiosa, mas nenhum destes parâmetros, por si só, confirma a identidade molecular completa nem a qualidade do processo de produção.

Aviso legal

Este artigo tem caráter exclusivamente educativo e científico-informativo. Descreve os princípios gerais da química dos péptidos, da síntese em fase sólida, da síntese em solução e em fase líquida, das estratégias de grupos protetores, da ligação, da purificação, da caracterização analítica, dos processos de produção, bem como exemplos retirados de estudos publicados. Não se trata de um protocolo laboratorial, de instruções de produção, de aconselhamento médico, de um guia sobre dosagem ou administração, nem de um certificado de qualidade de qualquer produto peptídico específico. Os resultados experimentais devem ser interpretados no contexto das sequências, dos métodos utilizados, da escala do processo, das técnicas analíticas e das limitações de cada estudo.

Referências

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2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Prevenção da formação de aspartimida durante a síntese de péptidos utilizando cianosulfurilidos como grupos protetores de ácidos carboxílicos. Nature Communications, 11(1), artigo 982.º. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
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