Peptidesynthese: vastefase-methode, in oplossing en productiemethoden

Peptidesynthese is een gecontroleerd proces waarbij aminozuurketens met een specifieke sequentie worden gevormd. Bij chemische synthese worden geselecteerde aminozuren met elkaar verbonden door middel van peptidebindingen, waarbij tegelijkertijd andere reactieve groepen in deze moleculen worden gecontroleerd. Het doel is dus niet alleen om aminozuren te koppelen, maar om een specifieke moleculaire structuur te verkrijgen met een bepaalde sequentie, stereochemie, structuur van de ketenuiteinden en – indien nodig – extra structurele kenmerken.

Tot de belangrijkste methoden behoren de vastefase-peptidesynthese (SPPS), de klassieke synthese in oplossing en nieuwere methoden voor vloeistoffase-peptidesynthese (LPPS) die gebruikmaken van oplosbare dragers of moleculaire tags. Onderzoekslaboratoria en productiefaciliteiten kunnen ook verschillende benaderingen combineren, kortere fragmenten afzonderlijk bereiden en deze vervolgens aan elkaar koppelen, of biologische expressie gebruiken als dat geschikter is voor een bepaalde sequentie.

Vergelijking van chemische synthese met bacteriële expressie van polypeptiden bestaande uit 20-40 aminozuurresiduen toont een belangrijk principe aan: de praktische keuze van de productiemethode hangt af van het specifieke molecuul, de sequentie ervan, de neiging tot aggregatie, vereiste modificaties, productieschaal en analytische eisen. [1]

Het verkrijgen van de beoogde aminozuursequentie is slechts één van de fasen bij de productie van een peptide.

Het gehele proces kan het volgende omvatten:

sequentie-ontwerp → voorbereiding van bouwstenen → beschermen van functionele groepen → koppeling → verwijderen van beschermende groepen → kettingmontage → afsplitsing of koppeling van fragmenten → finale structuurvorming → zuivering → identiteitsbevestiging → onzuiverheidsanalyse → gehaltebepaling → eindkarakterisering.

Voor sommige peptiden zijn bovendien extra stappen nodig, zoals cyclisatie, de vorming van disulfidebruggen, vouwing, conjugatie of andere chemische modificaties.

Om deze reden betekent een correcte assemblage van de keten niet automatisch dat het uiteindelijke materiaal de juiste identiteit, zuiverheid, stereochemie, conformatie, stabiliteit of andere vereiste eigenschappen heeft.

Wat is peptidesynthese?

Het creëren van een specifiek aminozuurzuursequentie

Peptide bestaat uit aminozuurresiduen die door peptidebindingen met elkaar zijn verbonden.

Het doel van peptidesynthese is om deze bindingen in een vooraf bepaalde volgorde te vormen, vaak met gelijktijdige controle over:

• soorten aminozuren;
• volgorde van aminozuren in de sequens;
• stereochemie;
• N-uiteindelijke structuren;
• C-uiteinde structuren;
• modificatie van zijketens;
• disulfidebrugformaties;
• cyclisatie;
• van andere vereiste structurele kenmerken.

De sequentie is van fundamenteel belang, omdat een identieke aminozuursamenstelling kan leiden tot verschillende moleculen als de aminozuren in een andere volgorde voorkomen.

De bewering dat een bepaald molecuul een „peptide bestaande uit vijf aminozuren” is, biedt dan ook erg weinig informatie over de daadwerkelijke structuur ervan. Om het molecuul correct te beschrijven, moet men het type aminozuren, hun volgorde, stereochemie, eindgroepen en eventuele extra modificaties kennen.

Twee peptiden kunnen daarom precies dezelfde aminozuursamenstelling hebben en toch verschillende moleculaire structuren zijn.

Aanvullende verschillen kunnen voortvloeien uit modificaties van de ketenuiteinden, de aanwezigheid van disulfidebruggen, een cyclisch skelet, veranderingen in zijketens of een afwijkende stereochemische configuratie.

Chemische peptidesynthese maakt gewoonlijk gebruik van aminozuren waarvan de reactieve groepen selectief zijn beschermd.

Tijdelijke beschermingsgroepen maken de vorming van een specifieke beoogde chemische verbinding mogelijk, terwijl concurrerende reacties op andere plaatsen in het molecuul worden beperkt.

In volgende geplande synthesestadia worden deze groepen verwijderd of gewijzigd.

Gecontroleerde reactie in plaats van spontane koppeling

In elementaire chemische beschrijvingen wordt de vorming van eenpeptidebinding vaak voorgesteld als een condensatiereactie, waarbij twee aminozuren zich verbinden onder netto afscheiding van een watermolecuul.

Een dergelijke vergelijking beschrijft de algemene reactiebalans.

Dit moet echter niet worden verward met de manier waarop gecontroleerde peptidesynthese in de praktijk wordt uitgevoerd.

Alleen het mengen van vrije aminozuren zou het niet mogelijk maken om betrouwbaar te bepalen:

• welke aminogroep moet reageren;
• welke carboxylgroep moet reageren;
• welk aminozuur moet als eerste komen;
• dat als tweede moet komen;
• zullen de zijketens beginnen te reageren;
• wordt de stereochemie behouden;
• zullen er niet tal van ongewenste producten ontstaan.

Daarom worden bij praktische chemische synthese gecontroleerde strategieën voor activering en bescherming van functionele groepen toegepast.

Een van de carboxylgroep afgeleide groep wordt gewoonlijk zo geactiveerd dat deze effectief kan reageren met een gekozen aminogroep. Beschermgroepen, de reactievolgorde, dragerschemie, koppelingsreagens, het oplosmiddelmilieu en isolatiemethoden helpen samen om de reactie in de richting van het beoogde product te sturen.

Effectieve peptidesynthese vereist dus controle over zowel de chemie die moet plaatsvinden als de chemie die moet worden voorkomen.

Een goed voorbeeld is de vorming van aspartimide.

Onderzoekers hebben een alternatieve methode voor de bescherming van de carboxylgroep ontwikkeld, met als doel deze problematische nevenreactie tijdens de peptidesynthese te beperken. [2]

Uit onderzoek blijkt een breder principe van de peptidechemie: het voorkomen van ongewenste moleculaire transformaties kan net zo belangrijk zijn als het vormen van de juiste peptidebinding.

Wanneer kan een peptide als klaar worden beschouwd?

Het voltooien van de lineaire peptideketen betekent niet altijd dat de hele synthese klaar is.

Afhankelijk van het doelmolecuul kunnen er na de ketenmontage extra stappen nodig zijn.

Deze kunnen het volgende omvatten:

• volledige deprotectie van beschermende groepen;
• splitsing van het peptide van de vaste drager;
• verwijderen van tijdelijke markeringen;
• cyclisatie;
• oxidatie;
• het vormen van disulfidebruggen;
• plooiing;
• vervoeging;
• kettinguiteinden modificatie;
• zuivering;
• analytische kenmerken.

Sommige peptiden vereisen relatief weinig extra structurele veranderingen nadat de keten is samengesteld.

Voor anderen zijn de latere fasen van cruciaal belang.

Een goed voorbeeld is de synthese van boviene pancreatische trypsineremmer (BPTI). Onderzoekers assembleerden de lineaire sequentie, zuiverden het materiaal en verkregen vervolgens een gevouwen structuur die disulfidebindingen bevat. Volgens de analyses en functionele vergelijkingen gepresenteerd in de studie kwam het uiteindelijke materiaal met de natuurlijke sequentie overeen met het natuurlijk voorkomende eiwit qua onderzochte parameters. [3]

Dit voorbeeld laat het verschil zien tussen het assembleren van het peptide-ruggengraat en het verkrijgen van de volledig gekarakteriseerde uiteindelijke moleculaire vorm.

Een methode waarmee een correcte lineaire reeks kan worden verkregen, bevestigt niet automatisch:

• correct vouwen;
• van de juiste vorming van disulfidebindingen;
• biologische activiteit;
• stabiliteit;
• verontreinigingsprofiel;
• geschiktheid voor een bepaald doel.

Elk van deze kwesties vereist afzonderlijk bewijs.

Chemische synthese, biologische expressie en gecombineerde methoden

Bij de chemische synthese van peptiden worden de eerder bereide moleculaire bouwstenen in gecontroleerde laboratoriumreacties met elkaar verbonden.

Bij biologische expressie wordt daarentegen gebruikgemaakt van het cellulaire apparaat om de gecodeerde aminozuursequentie te produceren. Vervolgens moet het materiaal worden teruggewonnen, gezuiverd en, indien nodig, verder verwerkt.

Beide methoden kunnen leiden tot de vorming van peptiden of polypeptiden, maar hebben elk hun eigen mogelijkheden en beperkingen.

Chemische synthese kan bijzonder nuttig zijn wanneer het volgende nodig is:

• geselecteerde niet-standaard aminozuren;
• chemische wijzigingen op specifieke plaatsen;
• specifieke keteneindstrukturen;
• isotopische markers;
• wijzigingen in het peptide-skelet;
• andere eigenschappen die moeilijk te verkrijgen zijn via standaard biologische expressie.

Biologische expressie kan aantrekkelijk zijn bij geschikte langere sequenties of specifieke markeringsstrategieën, maar het elimineert de problemen in latere productiestadia niet.

Materiaalherwinning, vouwing, verwerking, gastheerverontreinigingen, zuivering en analytische karakterisatie moeten nog steeds in aanmerking worden genomen.

Geen van de methoden is dus in alle gevallen de beste.

Bij de vergelijking van polypeptiden bestaande uit 20–40 aminozuurresiduen hadden zowel de lengte van de sequenties als hun neiging tot aggregatie invloed op de resultaten van de synthese in vaste fase en de bacteriële expressie. [1]

Deze waarnemingen ondersteunen de benadering waarbij de productiemethode wordt afgestemd op een specifieke molecule.

Historische gegevens over productiviteit, kosten, uitrusting en productietijd mogen niet worden beschouwd als universele hedendaagse waarden, aangezien technologieën, reagentia, automatisering, zuiveringsmethoden en productie-economie veranderen naarmate de technologie zich verder ontwikkelt.

Peptidesynthese in vaste fase

De groeiende keten is gehecht aan een onoplosbare drager

Bij solid-phase peptide synthesis (SPPS) blijft de groeiende peptideketen tijdens opeenvolgende synthesjecycli gehecht aan een onoplosbare drager.

Als drager wordt meestal een gefunctionaliseerd polymeerhars gebruikt.

De koppelaar, oftewel de linker, bindt het peptide aan de drager en beïnvloedt onder andere de manier waarop de voltooide keten later vrijkomt en het soort eindgroep dat wordt verkregen.

Een van de belangrijkste praktische voordelen van SPPS is het gemakkelijker scheiden van het materiaal.

Na afloop van een bepaalde reactiefase kunnen de oplosbare reagentia en veel van de oplosbare bijproducten door middel van spoelen worden verwijderd, terwijl het groeiende peptide aan de vaste fase gebonden blijft.

Hierdoor is het niet nodig om na toevoeging van elk volgend aminozuur het groeiende peptide te isoleren en te zuiveren als een afzonderlijke, vrije verbinding.

Dit gemak kan echter tot een belangrijk misverstand leiden.

Het wassen van de hars betekent niet dat alle onjuiste peptiden zijn verwijderd.

Als de aan de hars bevestigde ketting tijdens één koppelingsfase niet reageert, kan deze op de drager blijven zitten.

In volgende cycli kan hij opnieuw reageren en zich verder verlengen.

Als gevolg hiervan kan een deletiesequentie ontstaan, dat wil zeggen een molecuul dat verschilt van het doelpeptide door het ontbreken van één of meer aminozuurresiduen.

Chemisch vergelijkbare of onvolledig ontgrendelde ketens die aan de hars zijn gebonden, kunnen deelnemen aan volgende synthesestadia.

SPPS vereenvoudigt dus de scheiding van oplosbare stoffen van aan hars gebonden materiaal.

Dit garandeert echter geen perfecte sequentie-overeenkomst.

Herhalende cyclus van ontgrendelen en koppelen

Een typische stapsgewijze SPPS-synthese omvat het herhalen van drie basishandelingen:

ontgrendeling → koppelen → spoelen.

Eerst wordt de reactieve aminogroep aan het uiteinde van de groeiende keten blootgesteld.

Vervolgens wordt het volgende beschermde aminozuur aan de keten gekoppeld.

Oplosbare reagentia, een overmaat aan aminozuur en vele reactieproducten worden verwijderd voordat de volgende cyclus begint.

Het herhalen van dit proces maakt het mogelijk om het peptide aminozuur voor aminozuur op te bouwen.

In de klassieke SPPS wordt de C-terminale rest meestal als eerste aan de drager gekoppeld, waarna de ketting in de richting van de N-terminus wordt verlengd.

Dit verschilt van de standaard ribosomale eiwitsynthese, waarbij opeenvolgende aminozuren worden toegevoegd aan de C-terminus van de groeiende keten.

De uiteindelijke aminozuurvolgorde kan echter identiek zijn, ook al zijn de richting en de chemie van het vouwproces anders.

De term „cyclus” moet niet worden opgevat als één universele set reactievoorwaarden die geschikt is voor elk residu en elke sequentie.

Het verloop van de reactie kan afhangen van:

• strategieën van beschermende groepen;
• type aminozuur;
• ruimtelijke omstandigheden rond de reactieplaats;
• type hars;
• linkera;
• kettinglengten;
• agregatie;
• oplosmiddel;
• koppelingschemie;
• van het structurele gedrag van het groeiende peptide.

Een reactie die in het begin van de synthese gemakkelijk verloopt, kan in een later stadium aanzienlijk moeilijker worden.

Daarom blijft procesmonitoring essentieel, zelfs in sterk geautomatiseerde systemen.

Waarom zijn de eigenschappen van hars belangrijk?

Een duurzaam medium is niet slechts een passieve drager.

De fysische en chemische eigenschappen ervan kunnen het verloop van de reactie direct beïnvloeden.

Een belangrijke parameter is de zwellingscapaciteit.

Als de hars correct opzwelt in het gekozen oplosmiddel, kunnen de reagentia gemakkelijker de reactieve plaatsen bereiken die zich overal in de polymeerstructuur bevinden.

Onvoldoende zwelling of structuurveranderingen van de hars kunnen deze toegang beperken.

Ook van betekenis kunnen zijn:

• bezettingsdichtheid;
• polymeerarchitectuur;
• linkerstructuur;
• oplosmiddelcompatibiliteit;
• mechanische stabiliteit;
• porositeit;
• diffusie-eigenschappen;
• interacties tussen groeiende peptideketens.

Naarmate de lengte van het peptide toenemen, kunnen afzonderlijke ketens ook met elkaar interageren.

Aggregatie op de hars kan de toegang tot reactieve plaatsen beperken en leiden tot onvolledige koppeling of onvolledige ontscherping.

Dit betekent dat een sequentie die zich aan het begin van de syntyse correct gedraagt, na verloop van tijd naarmate de keten langer wordt, steeds moeilijker kan worden.

Onderzoekers hebben een stroomreactor met een variabel bed ontwikkeld waarmee de uitzetting van de hars kon worden gemonitord op basis van drukgerelateerde metingen. [4]

Het onderzoek richtte zich op harsaggregatie en onvolledige cross-linking als procesproblemen die onder andere omstandigheden tijdens de synthese moeilijk direct te observeren kunnen zijn.

Dit toont aan dat het bewaken van het fysieke gedrag van de drager informatie kan opleveren die verder gaat dan alleen het registreren van de toegevoegde reagentia.

Waar dient Wang-hars voor?

Wang-linkerchemie wordt algemeen toegepast in SPPS wanneer na afsplitsing van het peptide een C-eindstandige carbonzuurgroep gewenst is.

Het peptide is gehecht via een esterbinding, die later onder geschikte omstandigheden kan worden gesplitst.

Andere linker-systemen kunnen worden gekozen wanneer een andere C-uiteinde-structuur nodig is, bijvoorbeeld een amide.

Het is de moeite waard om onderscheid te maken tussen de linkerchemie en de fysieke drager als geheel.

Verwante Wang-type linkers kunnen worden geïntroduceerd in verschillende polymeerarchitecturen.

Dergelijke materialen hoeven niet identiek te zijn:

• zwelvermogen;
• capaciteiten;
• oplosmiddelcompatibiliteit;
• mechanische eigenschappen;
• gedrag tijdens reacties.

Onderzoek met peptidyl-Wang-TentaGel-harsen toonde een gespecialiseerde alternatieve methode aan voor de bereiding van peptidehydraziden, die nuttige tussenproducten zijn in de peptidechemie. [5]

Dit betekent niet dat standaard afsplitsing van Wang-hars doorgaans leidt tot de vorming van peptidehydraziden.

Het laat echter een belangrijke regel zien:

drager + linker + reactieomstandigheden + afsplitsingschemie bepalen gezamenlijk het verkregen product.

Synthese van SPPS in batch- en continu systeem

SPPS kan worden uitgevoerd in klassieke batchreactoren of in systemen waarin reagentia door een reactor stromen die een vaste drager bevat.

Flowsystems kunnen een snelle uitwisseling van reagentia en een nauwkeurigere controle van de chemische omgeving rond de hars mogelijk maken.

In een studie uit 2014 werd een snelle peptide-synthese in een doorstroomsysteem met continue monitoring gepresenteerd en toegepast op verschillende peptiden en een klein eiwit. [6]

In een latere geautomatiseerde studie werd een aanzienlijk snellere ketenassemblage beschreven, waarbij voor de geanalyseerde voorbeelden een zuiverheid van het ruwe product en een geïsoleerde opbrengst werden verkregen die vergelijkbaar zijn met klassieke batchsynthese. [7]

Deze onderzoeken tonen de mogelijkheden van specifieke systemen onder bepaalde omstandigheden.

Ze bewijzen echter niet dat elk peptide even snel en met dezelfde kwaliteit kan worden geproduceerd.

De tijd die nodig is om een peptide te produceren omvat ook aanzienlijk meer dan alleen het samenstellen van de keten.

Het totale proces kan omvatten:

• bereiding van reagentia;
• harsbereiding;
• koppeling;
• ontgrendeling;
• spoelen;
• afscheiding;
• productverwerking;
• zuivering;
• verwijderen van oplosmiddelen;
• de uiteindelijke vorming van de structuur;
• analytisch onderzoek;
• documentatie.

Snelle verbindingen vormen dus slechts één van de elementen van de totale productie-efficiëntie.

Synthese in vloeibare fase

Wat betekent deze term?

De term „vloeibare-faselytidesynthese” kan in verschillende betekenissen worden gebruikt.

In brede zin kan het eenvoudigweg betekenen dat het om een peptidesynthese in oplossing gaat.

In meer gespecialiseerde literatuur wordt echter vaak onderscheid gemaakt tussen:

1. klassieke peptidesynthese in oplossing;
2. vastefase-peptidesynthese;
3. nieuwere LPPS-methoden, waarbij de groeiende keten een oplosbaar label of drager bezit.

Dit onderscheid is belangrijk omdat de manier waarop het product wordt gescheiden en teruggewonnen, verandert.

Een vrij opgelost, beschermd peptide-tussenproduct kan isolatie vereisen op basis van zijn eigen fysische en chemische eigenschappen.

In het geval van een gelabeld semi-afgewerkt product kan de label zo worden ontworpen dat het neerslaan, de extractie, het vasthouden op een membraan of een andere wijze van scheiding wordt vergemakkelijkt.

Het overzicht over LPPS maakt een duidelijk onderscheid tussen klassieke oplossingssynthese, SPPS en methoden waarbij gebruik wordt gemaakt van oplosbare tags. [8]

De publicatie is nuttig om de terminologie en methodologie op een rijtje te zetten.

Het moet echter niet worden geïnterpreteerd als een enkel experiment dat bewijst dat de ene methode het beste is voor elk peptide.

Klassieke peptide-synthese in oplossing

Bij klassieke in-oploplossingssynthese blijven beschermde aminozuren, peptide-tussenproducten of fragmenten opgelost in het reactiemedium in plaats van covalent te zijn gebonden aan een onoplosbare hars.

Na afloop van de reactie kan het betreffende tussenproduct worden geïsoleerd, gezuiverd en indien nodig gekarakteriseerd voordat met de volgende stap wordt begonnen.

Dit kan bepaalde voordelen opleveren.

Onderzoekers kunnen:

• de afzonderlijke halffabricaten karakteriseren;
• de zuiveringsmethode afstemmen op een specifiek halffabricaat;
• individuele transformaties optimaliseren;
• fragmenten onafhankelijk voorbereiden;
• de synteseroute wijzigen wanneer een bepaald tussenproduct problemen oplevert.

Synthese in oplossing kan echter ook gepaard gaan met aanzienlijke moeilijkheden.

Naarmate de keten langer wordt, kunnen peptiden:

• moeilijk oplosbaar worden;
• aggregeren;
• moeilijk te kristalliseren;
• nauw verwante onzuiverheden creëren;
• moeilijk te scheiden;
• meerdere keren isoleren;
• materiële verliezen veroorzaken tijdens volgende bewerkingsstappen.

Synthese in oplossing is daarom niet automatisch eenvoudiger of gemakkelijker op te schalen dan SPPS.

Haar bruikbaarheid hangt af van de specifieke sequentie, de stabiliteit van de tussenproducten, de oplosbaarheid, de lengte van de syntheseroute, het gedrag tijdens de zuivering en de efficiëntie van volgende isolatiestappen.

De ontwikkeling van gelabelde LPPS-strategieën is gedeeltelijk het gevolg van pogingen om juist deze problemen met betrekking tot scheiding en materiaalbehandeling op te lossen. [8]

Oplosbare labels koppelen reactieontwerp aan scheidingsontwerp

In het gelabelde LPPS heeft het groeiende peptide een tijdelijke moleculaire aanhechting die zo is ontworpen dat deze de fysieke eigenschappen ervan beïnvloedt.

Het label kan ervoor zorgen dat de peptide voldoende oplosbaar blijft tijdens de reactie en vervolgens de selectieve terugwinning ervan vergemakkelijken.

Afhankelijk van de technologie kan bij de scheiding gebruik worden gemaakt van:

• neerslag;
• extractie;
• membraanretentie;
• fasegedrag;
• overige eigenschappen die voortvloeien uit de aanwezigheid van de marker.

Bij een van de experimentele strategieën werd een langketenige beschermende groep aan de C-terminus gebruikt voor de bereiding van peptide-amiden.

Herhaalde reacties en precipitatiestappen stelden onderzoekers in staat om een hydrofoob peptide te bereiden dat in de door hen gemaakte vergelijking moeilijk op bevredigende wijze te verkrijgen was via de SPPS-methode. [9]

Dit toont de bruikbaarheid van deze specifieke strategie voor de geanalyseerde sequentie.

Dit bewijst echter niet de universele superioriteit van gelabelde synthese.

De marker wordt onderdeel van het productieproces en roept eigen vragen op:

• Hoe effectief wordt het aangesloten?
• Verandert het het verloop van de reactie?
• Hoe kan een gemerkt halffabricaat betrouwbaar worden teruggewonnen?
• Leidt dit tot het ontstaan van nieuwe verontreinigingen?
• Hoe wordt het verwijderd?
• Kan de volledige verwijdering worden bevestigd?
• Welke analytische methoden bevestigen de afwezigheid ervan in het eindproduct?

Losbare markeringen moeten daarom worden beschouwd als functionele elementen van het procesontwerp en niet uitsluitend als eenvoudige etiketten.

Vergelijking van de belangrijkste methoden

De vergelijking toont de algemene werkingsprincipes van de verschillende methoden.

Het specificeert niet welke daarvan de beste prestaties, reinheid, kosten, milieuduurzaamheid of schaalbaarheid zal opleveren voor een specifiekesequentie.

Deze parameters moeten worden beoordeeld op basis van het daadwerkelijke molecuul en het specifieke productieproces. [4] [8] [9]

Fragmentvermenigvuldiging en hybride productie

Een peptide hoeft niet altijd te worden gevormd in één ononderbroken proces waarbij opeenvolgende aminozuurresiduen worden toegevoegd.

Een alternatieve strategie is het afzonderlijk bereiden van kortere peptidefragmenten en deze vervolgens te koppelen.

Een hybride proces kan bijvoorbeeld SPPS gebruiken voor het verkrijgen van afzonderlijke fragmenten en oplossingstransformatiechemie om deze te combineren.

Fragmentstrategieën kunnen sommige problemen beperken die gepaard gaan met zeer lange stapsgewijze synthese.

Ze introduceren echter nieuwe uitdagingen, zoals:

• het kiezen van de juiste verbindingslocatie;
• oplosbaarheid van fragmenten;
• activering van de verbindingsplaats;
• chemoselectiviteit;
• behoud van stereochemie;
• bijwerkingen;
• fragmenten opschonen;
• opruiming na hun samenvoeging.

Een belangrijk voorbeeld van gecontroleerde fragmentkoppeling is natieve chemische ligatie.

In de klassieke versie reageert een peptide-thioester met een tweede peptide dat een N-terminale cysteïne bevat. Een daaropvolgende hergroepering leidt tot de vorming van een normale binding in het peptide-ruggegraat op de ligatieplaats.

Eerste onderzoeken toonden aan dat het mogelijk was om na ligatie en vouwing een eiwit met disulfidebindingen te verkrijgen. [10]

Dit bevestigt het belang van deze fragmentatiestrategie.

Dit betekent echter niet dat willekeurige twee ongemodificeerde peptidefragmenten spontaan kunnen samensmelten.

Koppeling en beschermgroepen

Koppeling creëert een opzettelijke verbinding

Koppeling is een reactiestap waarbij een nieuwe peptidebinding wordt gevormd tussen geselecteerde eenheden.

Meestal wordt de groep die afkomstig is van de carboxylgroep geactiveerd zodat deze effectief kan reageren met de juiste aminogroep.

De activeringschemie moet compatibel zijn met:

• stijgende reeks;
• tijdelijke beschermingsgroepen;
• bescherming van zijketens;
• stereochemie;
• drager of merkteken;
• oplosmiddelomgeving;
• met andere functionele groepen in het molecuul.

Effectieve koppeling is met name belangrijk bij stapsgewijze synthese, omdat een onvolledige reactie kan leiden tot de vorming van deletiesequenties.

Als één stap van de toevoeging van een aminozuur mislukt voor een deel van de groeiende ketens, kunnen dergelijke ketens in het systeem achterblijven en deelnemen aan volgende cycli.

Als gevolg hiervan kunnen moleculen ontstaan die sterk lijken op het doelpeptide, maar één residu missen.

Zelfs kleine inefficiënties kunnen zich dus opstapelen tijdens vele synthesestadia.

Een eenvoudig wiskundig voorbeeld illustreert dit probleem goed.

Als elk van de 50 onafhankelijke fasen van het samenstellen een kans van 99% op succes zou hebben, zou het percentage moleculen waarbij alle fasen succesvol zouden zijn, als volgt zijn:

0,99^50 ≈ 0,605

dat wil zeggen ongeveer 61%.

Dit is uitsluitend een wiskundige illustratie.

Dit vormt geen voorspelling van de werkelijke zuiverheid of synthese-opbrengst van het peptide dat 50 residuen bevat.

De daadwerkelijke productie omvat:

• verschillende koppelingsrendementen in de verschillende posities;
• fasen van decontaminatie;
• bijwerkingen;
• sequentie-afhankelijke moeilijkheid;
• herkoppelingsstrategie;
• verliezen bij het afscheiden;
• verliezen tijdens de reiniging;
• andere procesvariabelen.

Uit de berekening blijkt alleen maar waarom zelfs een ogenschijnlijk kleine inefficiëntie in een enkele stap van groot belang kan worden in een synthese die uit meerdere stappen bestaat.

Beschermende groepen controleren de reactieplaats

Een aminozuur kan verschillende chemisch reactieve groepen bezitten.

Zonder selectieve controle zouden de koppelingsreacties op ongewenste plaatsen kunnen plaatsvinden.

Beschermende groepen blokkeren tijdelijk geselecteerde reactieve plaatsen.

De aminogroep die wordt gebruikt voor ketenverlenging vereist meestal tijdelijke bescherming, terwijl reactieve zijketens mogelijk bescherming vereisen die gedurende vele synthesecycli op hun plaats blijft.

De verbinding met de drager moet deze fasen eveneens doorstaan tot het geplande afkoppelen.

De keuze van beschermgroepen beïnvloedt dus de hele synthesestrategie.

Er moet rekening worden gehouden met:

• de manier waarop ze worden ingevoerd;
• stabiliteit;
• verwijderingsmethode;
• verenigbaarheid met andere beschermende groepen;
• geschiktheid voor de drager;
• bijwerkingen;
• de invloed van een specifieke sequentie;
• definitieve ontgrendelingsvoorwaarden.

Onderzoek waarbij gebruik werd gemaakt van op cyanosulfurylide gebaseerde bescherming betrof de vorming van aspartimide door de manier van bescherming van de carboxylgroep te veranderen. [2]

Uit de resultaten blijkt dat de strategie van beschermende groepen niet alleen van invloed is op de vraag of de beoogde reactie kan plaatsvinden, maar ook op welke ongewenste reacties mogelijk worden.

Fmoc, Boc en orthogonale bescherming

Fmoc en Boc behoren tot veelgebruikte beschermgroepen voor aminogroepen.

Ze verschillen wezenlijk in de manier waarop ze worden verwijderd.

Fmoc wordt meestal verwijderd onder basische omstandigheden, terwijl Boc gevoelig is voor zure omstandigheden.

Deze eigenschappen maken het mogelijk om ze te gebruiken als onderdelen van brede beschermingsstrategieën.

In de populaire op Fmoc gebaseerde SPPS wordt de tijdelijke Fmoc-bescherming aan de N-terminus herhaaldelijk verwijderd, terwijl geselecteerde zijketenbeschermingsgroepen en de hechting aan de hars intact blijven tot latere stadia.

Andere strategieën kunnen andere combinaties gebruiken.

Een bijzonder belangrijk begrip is ortogonale bescherming.

Twee beschermgroepen worden als orthogonaal beschouwd als de ene selectief kan worden verwijderd onder omstandigheden waarin de andere stabiel genoeg blijft om verdere synthese mogelijk te maken.

Orthogonaliteit is dus een praktische relatie van chemische compatibiliteit.

Dit betekent niet dat elke beschermde groep na een onbeperkt aantal blootstellingen aan alle reactieomstandigheden volledig onveranderd blijft.

Bijwerkingen kunnen nog steeds optreden.

In Fmoc-syntheseonderzoek zijn zowel de vorming van aspartimide als ongewenste stereochemische veranderingen beschreven, ondanks de veronderstelde selectiviteit van de algemene beschermingsstrategie. [11]

Stereochemie is een deel van de identiteit van een molecuul

Hoeveel aminozuren hebben een chiraal centrum?.

Dit betekent dat hun atomen verschillende ruimtelijke rangschikkingen kunnen aannemen die overeenkomen met verschillende stereochemische vormen.

Het wijzigen van de configuratie van één stereogeen centrum kan leiden tot de vorming van een andere peptidestructuur zonder dat de nominale massa hoeft te worden gewijzigd.

Daarom kan de massa alleen niet de volledige identiteit van het peptide bevestigen.

Epimerisatie betekent meestal de verandering van de configuratie van één stereogeen centrum in een molecuul dat er meerdere bevat.

Racemisatie wordt in de peptidechemie ook vaak besproken in de context van het verlies van de stereochemische integriteit van aminozuurresiduen.

Deze wijzigingen zijn belangrijk omdat moleculaire herkenning sterk kan afhangen van de ruimtelijke rangschikking van atomen.

Twee moleculen met dezelfde elementaire samenstelling en nominale massa kunnen zich dus anders gedragen als ze in stereochemie verschillen.

In de studie naar door microgolven ondersteunde Fmoc-synthese werd vastgesteld dat sommige residuen gevoelig waren voor ongewenste stereochemische verandering onder de toegepaste omstandigheden. Aanpassing van de methode beperkte het optreden van deze reacties. [11]

Dit betekent niet dat verwarming per definitie alle peptiden beschadigt.

De juiste conclusie is dat het versnellen van de reactie samen moet worden beoordeeld met de sequentieafhankelijke chemische selectiviteit.

Aspartimide en verwante onzuiverheden

De vorming van aspartimide is een bekende bijwerking met betrekking tot bepaalde asparaginaatbevattende sequenties.

Er kan een ongewenst cyclisch tussenproduct ontstaan, waaruit vervolgens verbindingen met een veranderde skeletconnectiviteit of stereochemie worden gevormd.

De waarschijnlijkheid van deze reactie hangt af van de sequentie en de procesomstandigheden.

Andere onzuiverheden die verband houden met de synthese kunnen het gevolg zijn van:

• incompleta koppeling;
• gedeeltelijke ontgrendeling;
• het ontstaan van deletiesequenties;
• reacties van zijketens;
• stereochemische veranderingen;
• reactie tijdens het afsplitsen;
• oxidatie;
• herschikkingen;
• verwerkingsvoorwaarden van het product;
• onvolledige ontbreking van beschermingsgroepen.

Sommige verontreinigingen veroorzaken een gemakkelijk waarneembare verandering in de moleculaire massa.

Andere zijn veel moeilijker te onderscheiden.

Bij analytisch onderzoek van een synthetisch peptide dat als reninesubstraat dient, werden talrijke onzuiverheden geïdentificeerd, waaronder componenten met dezelfde massaverandering maar met modificaties op verschillende posities. [12]

Om ze van elkaar te onderscheiden, was een aanvullende structurele analyse nodig.

Onderzoekers behandelden de voorgestelde mechanismen voor het ontstaan van deze verontreinigingen eveneens als hypothesen.

Dit is een belangrijk onderscheid:

Het vaststellen wat vervuiling is en het bewijzen van het exacte mechanisme van het ontstaan ervan zijn twee afzonderlijke wetenschappelijke vraagstukken.

Een waarschijnlijk mechanisme mag niet worden gepresenteerd als bevestigd louter omdat het overeenkomt met de waargenomen moleculaire massa.

Opschoning, schaling en productiekwaliteit

Ruw product, gezuiverd product en opbrengst

Ruw peptide is een materiaal verkregen voordat de juiste zuiveringsstappen zijn voltooid.

Kan bevatten:

• doelpeptide;
• deletiesequenties;
• materiaal niet volledig ontgrendeld;
• gewijzigde sequenties;
• reagensresten;
• ontginningsproducten;
• zool;
• oplosmiddelen;
• andere componenten die in het proces ontstaan.

Zuivering is bedoeld om het juiste peptide van dit mengsel te scheiden.

Er moet duidelijk onderscheid worden gemaakt tussen drie begrippen:

zuiverheid van het ruwe product — gemeten materiaalsamenstelling vóór de uiteindelijke zuivering;

opbrengst van het gezuiverde of geïsoleerde product — de hoeveelheid teruggewonnen doelmateriaal ten opzichte van een bepaalde beginwaarde of theoretische waarde;

eindzuiverheid — de samenstelling van het geïsoleerde materiaal bepaald met behulp van een specifieke analytische methode.

Deze begrippen zijn niet uitwisselbaar.

Het proces kan leiden tot de vorming van een grote hoeveelheid ruw materiaal, maar maakt het mogelijk om een relatief kleine hoeveelheid gezuiverd product terug te winnen.

Een ander proces levert mogelijk minder grondstof op, maar kenmerkt zich door een hoge selectiviteit voor de vorming van het doelproduct.

Een vergelijkbaar hoge analytische zuiverheid hoeft geen hoge productieopbrengst te betekenen.

Bij studies naar versnelde flow-synthese werden de zuiverheid van het ruwe materiaal en de geïsoleerde opbrengst correct apart gerapporteerd. [7]

Chromatografie scheidt componenten, maar beantwoordt niet elke vraag

High-performance vloeistofchromatografie met omgekeerde fase (RP-HPLC) wordt veel gebruikt voor de analyse en zuivering van peptiden.

Verschillende moleculen wisselwerking op verschillende wijze met de stationaire en de mobiele fase.

Onder de juiste omstandigheden maken deze verschillen het mogelijk om de componenten van het mengsel te scheiden.

Analytische en preparatieve chromatografie hebben gerelateerde, maar verschillende toepassingen.

De analytische HPLC wordt voornamelijk gebruikt voor het onderzoeken van de samenstelling van een monster.

Preparat HPLC wordt gebruikt voor het fysiek verzamelen van gescheiden componenten.

Een chromatogram kan veel waardevolle informatie verschaffen.

Een grote hoofdpiek of een hoog percentage van het oppervlak ervan mag echter niet worden beschouwd als een volledige moleculaire karakterisering.

De chromatografieresultaten zijn onder andere afhankelijk van:

• kolomtype;
• bewegende fasen;
• verloop;
• temperaturen;
• detectiemethoden;
• golflengten;
• monsterbereiding;
• methoden voor piekintegratie;
• resoluties;
• eigenschappen van verontreinigingen.

Twee verbindingen kunnen potentieel op hetzelfde moment elueren.

Sommige componenten van het monster kunnen ook verschillend reageren op de gebruikte detector.

Daarom staat een hoge oppervlaktazuiverheid bij HPLC niet gelijk aan een volledige bevestiging van de moleculaire identiteit.

Onderzoek naar isobare peptide-onzuiverheden en chirale analyse laten zien waarom aanvullende analytische methoden nodig kunnen zijn. [12] [13]

De analytische methode moet aansluiten bij een concrete structurele vraag.

Identiteit, zuiverheid en gehalte betekenen verschillende dingen

Bij de karakterisering van peptiden zijn drie begrippen bijzonder belangrijk.

Identiteit beantwoordt de vraag:

Bevat het monster het beoogde deeltje?

Netheid beantwoordt de vraag:

Welke andere componenten bevinden zich in het monster of welk deel van het gemeten signaal komt overeen met de hoofdcomponent?

De inhoud beantwoordt de vraag:

Hoeveel werkelijk peptide bevindt zich in het monster?

Op deze vragen kan niet altijd met één enkele meting worden geantwoord.

Materiaal dat een peptide bevat, kan ook het volgende bevatten:

• water;
• tegenovergesteld;
• zool;
• oplosmiddelresten;
• andere ingrediënten die met het proces te maken hebben;
• vervuiling.

De totale massa van het afgewogen materiaal hoeft dus niet overeen te komen met de massa van het peptide zelf.

Evenmin bevestigt de overeenstemming van de gemeten molecuulmassa met de theorie:

• volledige aminozuursequentie;
• correcte koppeling van de afzonderlijke residuen;
• stereochemische integriteit;
• disulfidebrugformaties;
• plooien;
• gebrek aan isobare verontreinigingen.

Massaspectrometrie kan sterk bewijs leveren met betrekking tot de molecuulmassa.

Tandemmassaspectrometrie en andere structurele technieken kunnen aanvullende informatie over de sequentie verschaffen.

Chirale methoden maken het mogelijk stereochemische vraagstukken te analyseren die niet kunnen worden opgelost met een eenvoudige massabepaling.

In één van de analytische studies werd zelfs rekening gehouden met de racemissie die ontstaat bij het prepareren van de monster. Dit illustreert een andere belangrijke regel: de analytische procedure zelf kan artefacten veroorzaken als deze niet op de juiste manier is ontworpen. [13]

Verkleuring en activiteit kunnen een aparte bevestiging vereisen

Voor structureel beperkte peptiden en kleine eiwitten kunnen een juiste sequentie en een molecuulgewicht nog steeds onvoldoende zijn om de beoogde uiteindelijke structuur te bevestigen.

Extra vragen kunnen onder meer bestaan uit:

• Zijn er juiste disiarczische bruggen ontstaan?
• Heeft de molecule de verwachte conformatie aangenomen?
• Is de cyclisatie voltooid?
• Zijn er structurele isomeren aanwezig?
• Bevat het synthetische molecuul de verwachte activiteit in een bepaald experimenteel testonderzoek?

In het onderzoek naar de synthese van BPTI zijn verschillende analytische en biofysische methoden gebruikt, samen met een beoordeling van de remming van tryptase. [3]

De totale resultaten ondersteunden de overeenstemming tussen het synthetische materiaal met een natuurlijke sequentie en het natuurlijke eiwit op de beoordeelde criteria.

De activiteitstest beantwoordt echter wel een bepaald functioneel vraagstuk.

Het vervangt geen analyse van de verontreiniging.

Vergelijkbaar, een vergelijkbare activiteit in één test bevestigt niet de volledige overeenstemming van alle biologische, structurele of productiegerelateerde eigenschappen.

De opschaling van de productie verandert meer dan alleen de hoeveelheid materiaal.

De vergroting van de productieomvang is niet alleen te wijten aan een proportionele verhoging van de hoeveelheid van alle reactiemiddelen.

Fysieke processen kunnen anders gedragen zich bij grotere schaal.

De betekenis kan zijn:

• vermenging;
• warmteoverdracht;
• Verspreiding van reactiemiddelen;
• diffusie;
• verstopping van de hars;
• druk;
• filtratie;
• De economie van oplosmiddelen;
• neerslag;
• oplossend vermogen van de halfproducten;
• overbrengen van massa;
• mogelijkheden van het reinigingssysteem.

Deze factoren kunnen zowel de gang van de reactie als de vorming van verontreinigingen beïnvloeden.

De reiniging in latere fasen kan ook een belemmering voor de hele productie vormen.

De snelheid van de synthese neemt af als het reinigingssysteem niet in staat is om de opkomende verontreinigingen effectief te scheiden of om het product van de vereiste kwaliteit terug te winnen.

In een industriële analyse die 40 processen voor de synthese van peptiden omvatte van 14 farmaceutische bedrijven, werd de consumptie van materialen bij de synthese, het reinigen en isoleren beoordeeld. [14]

Het onderzoek laat zien waarom de productiebeoordeling voor het hele proces moet worden uitgevoerd.

Dat betekent echter niet dat elke fabriek, elke productiefase of elke productietechnologie dezelfde resultaten oplevert.

De kwaliteit van de productie is het resultaat van veel controles.

Een betrouwbare productie van peptiden vereist meer dan het verkrijgen van één bevredigend analytisch resultaat.

Een gecontroleerd proces omvat meestal meerdere onderling verbonden elementen:

Geïdentificeerde doelmolecule → geschikte uitgangsmaterialen → gecontroleerde synthese → gecontroleerde zuivering → geschikte monstermanagements → gevalideerde of doeltreffende analyse → dossier van de partij.

De partijdocumentatie combineert analytische resultaten met materiaal dat daadwerkelijk is geproduceerd.

De Certificate of Analysis (COA) vat de gekozen resultaten van de tests van een bepaalde partij samen.

De informatieve waarde ervan hangt af van:

• soort van onderzoek uitgevoerd;
• de gebruikte methoden;
• de bruikbaarheid van deze methoden;
• specificaties;
• identificatie van het monster;
• mogelijkheden om de partij te traceren;
• een bevestiging dat de gerapporteerde resultaten inderdaad betrekking hebben op het betreffende materiaal.

De individuele waarde die als „zuiverheid” wordt beschreven, kan zelf niet bevestigen:

• volledige moleculaire identiteit;
• de hoeveelheid peptide;
• stereochemische integriteit;
• niveau van de restanten van oplosmiddelen;
• de waterinhoud;
• de samenstelling van de antilichamen;
• microbiologische eigenschappen;
• plooien;
• biologische activiteit;
• geschikt voor een bepaald doel.

De juiste analyse-set hangt af van de beoogde toepassing van het materiaal.

Een peptide dat wordt gebruikt als analytisch referentiemateriaal, een onderzoeksmiddel dat wordt gebruikt in een celexperiment en een bestanddeel dat zich in de fase van de farmaceutische ontwikkeling bevindt, kunnen vragen over andere kwalitatieve aspecten vereisen.

Analytische bewijzen moeten dus worden geïnterpreteerd in een duidelijk omschreven context, en niet als universele bevestiging van de kwaliteit.

De beoordeling van de milieuprestatie moet het volledige proces omvatten.

De synthese van peptiden kan aanzienlijke hoeveelheden oplosmiddelen en reactiemiddelen vereisen.

De milieueffectbeoordeling moet dus veel meer in aanmerking nemen dan alleen het samenstellen van het systeem.

Belangrijke elementen kunnen onder andere bestaan uit:

• Het prepareren van de bouwblokken;
• bindmiddelen;
• ontsmettingsmiddelen;
• spoelen;
• afscheiding;
• bewerking van het product;
• chromatografie;
• verandering van oplosmiddelen;
• isolatie;
• drogen;
• afvalbeheer.

De vermindering van de milieubelasting kan een gelijktijdige verbetering van meerdere fasen vereisen.

In de gepubliceerde analyse over de productie van peptiden wordt aandacht besteed aan de problemen die verband houden met zowel de synthese als de zuivering, en wordt erop gewezen dat er verbeteringen nodig zijn in het gehele procesontwerp. [15]

Als perspectiefdocument vormt het geen gecontroleerde directe vergelijking die aantoont dat één specifieke technologie altijd milieuvriendelijker is.

Vergelijkbaar:

Een snellere synthese betekent niet automatisch een meer ecologische synthese.,

En minder gebruik van oplosmiddelen tijdens de synthese zelf betekent niet automatisch een minder invloed van het gehele productieproces.

Milieuvergelijkingen vereisen het gebruik van samenhangende analysegrenzen en moeten het verbruik van hulpbronnen het best afstemmen op de hoeveelheid geïsoleerde en gekarakteriseerde eindproducten.

Veelgestelde vragen

1. Hoe verschilt de synthese van peptiden in vaste toestand van de synthese in vloeibare toestand?

In de vastefase-synthese blijft de groeiende peptyd aan een onoplosbaar drager gekoppeld, terwijl in de klassieke synthese het groeiende peptyd in een oplosmiddel oplosbaar blijft en meestal moet worden teruggewonnen op basis van zijn fysische en chemische eigenschappen. In een nauwer perspectief heeft de oplosbare groeiende keten van LPPS bovendien een oplosbaar label of drager dat het later verwijderen vergemakkelijkt. Onderzoek naar gemarkeerde synthese toont een van de strategieën voor het combineren van chemische oplosmiddel-synthese met verwijdering door uitdrijving, terwijl de literatuur over LPPS deze oplossingen zowel van de klassieke synthese in oplosmiddel als van SPPS onderscheidt. Niets is per definitie optimaal voor elk peptide. De belangrijkste verschil betreft de fysieke manier waarop de groeiende keten tijdens de volgende stappen van de synthese wordt geleid en verwijderd. [8] [9]

2. Waarom kunnen tijdens de synthese van peptiden verontreinigingen ontstaan?

Verontreinigingen kunnen ontstaan omdat de bedoelde reacties niet altijd in hoeveeliteit plaatsvinden en andere functionele groepen kunnen deelnemen aan ongewenste reacties. Een onvolledige koppeling kan leiden tot deletie-sequenties, een onvolledige afbraak kan de vervolgstap van de keten verstoren en sommige sequenties zijn vatbaar voor stereochemische veranderingen, aspartimideproductie, oxidering, omkadering of bijproducten die samenhangen met de afscheiding. Syntheseonderzoek naar Fmoc-groepen en structurele analyses van synthetische peptidenverontreinigingen documenteren enkele dergelijke voorbeelden. [11] [12] De frequentie en de betekenis van individuele verontreinigingen zijn afhankelijk van de sequentie en het proces, daarom mag automatisering van de synthese niet worden gelijkgesteld met een volledig gebrek aan chemische fouten.

3. Welke rol speelt de hars bij de synthese van peptiden?

De hars behoudt een groeiend peptide, terwijl oplosbare reactiemiddelen en veel bijproducten tussen de volgende synthesefasen kunnen worden verwijderd. Dit vereenvoudigt aanzienlijk het herhaalde aanleggen van de keten, maar de hars is niet uitsluitend een mechanisch vastzittend element. Haar verstrenging, de dichtheid van de verstrengeling, de polymeerstructuur, de compatibiliteit met oplosmiddelen en de beschikbaarheid van reactieplaatsen kunnen invloed hebben op de doeltreffendheid van de toediening van de reactiemiddelen aan het aangrenzende peptide. In studies waarbij een variabele complexreactor werd gebruikt, werd de houdbaarheid van de hars tijdens de aggregatieanalyse en de efficiëntie van de binding geëvalueerd. [4] Deze monitoring elimineert geen sequentiesfouten, maar laat zien waarom de fysieke toestand van de hars een belangrijke procesvariabele kan zijn.

4. Waarvoor wordt Wanga-hars gebruikt bij de synthese van peptiden?

Wang-matrices zijn algemeen gekoppeld aan de preparatie van peptiden die na een passende afbinding aan het C-terminus in de vorm van een carboxyylzuur worden vrijgegeven. De precieze uiteindelijke productsoort is echter afhankelijk van de linker, de matrixarchitectuur en de gebruikte afbindingschemie, en niet alleen van de naam van de hars. De onderzoekers hebben ook een specifieke methode gepresenteerd om materiaal met de peptydyl-Wang-TentaGel-structuur te converteren naar peptydhydraziden, die nuttige synthetische halfproducten kunnen vormen. [5] Een alternatieve reactie verandert de betekenis van de standaard afbinding van Wang-hars niet. Ze laat echter zien waarom bij het voorspellen van het product het hele draagmiddelsysteem en de reactievoorwaarden moeten worden geanalyseerd.

5. Bouwt SPPS een peptyd van de N-kant of van de C-kant?

Een klassieke fase-gebaseerde SPPS begint door het aanbrengen van de C-terminale rest aan het drager, waarna de keten wordt verlengd in de richting van de N-terminus. Dit is het tegenovergestelde van de standaard verlenging van de keten op de ribosoom, waarbij eiwit door toevoeging van nieuwe aminozuren aan de C-terminale kant wordt aangemaakt. De synthese van BPTI is een voorbeeld van het gebruik van beveiligde bouwblokken en drager voor de later vrijlating, reiniging en afbraak van het product. [3] Er zijn echter speciale strategieën voor de chemie van peptiden die andere oplossingen gebruiken, en daarom moet de verlenging van de keten van C- naar N-terminus worden beschouwd als een klassiek SPPS-principe en niet als een absoluut principe voor alle synthesemethoden.

6. Waarom zijn beschermingsgroepen nodig?

Aminozuren bevatten vaak meerdere reactieve functionele groepen. Beschermende groepen voorkomen tijdelijk de reactie op bepaalde plaatsen en laten het betreffende gebied beschikbaar voor een specifieke synthesetriggering. Dit helpt bij het controleren van de volgorde en de manier waarop de restdelen worden verbonden. Zonder de juiste bescherming zouden concurrentierijke reacties kunnen leiden tot het ontstaan van complexe mengsels of producten met een veranderde structuur. Onderzoek naar de vorming van aspartimid heeft aangetoond dat een verandering in de chemische structuur van de beschermende groep de belangrijke bijproductreactie in de onderzochte sequenties kan beperken. [2] Beschermende groepen garanderen niet een perfecte synthese, maar bieden wel een selectieve chemische controle die moet blijven in overeenstemming met alle belangrijke stappen van het proces.

7. Wat zijn het verschil tussen Fmoc en Boc?

FMOC en Boc zijn veelgebruikte tijdelijke beschermgroepen voor de aminogroep, maar reageren ook op andere chemische omstandigheden. FMOC wordt meestal verwijderd in een basische omgeving, terwijl Boc gevoelig is voor zuren. Deze verschillen hebben invloed op de manier waarop ze worden gekoppeld aan de bescherming van de zijketen, linkers en andere synthesefasen. FMOC-gebaseerde synthese wordt veel gebruikt in moderne SPPS, maar studies hebben ook aangetoond dat afhankelijke bijwerkingen kunnen optreden in dergelijke omstandigheden. [11] In de praktijk is het dus nuttiger om de volledige beschermingsstrategieën te vergelijken en hun overeenstemming met de betreffende sequentie te beoordelen dan om uitsluitend naar de namen van de twee beschermgroepen te kijken.

8. Wat betekent orthogonale bescherming?

Orthogonal bescherming betekent dat een beschermende groep kan worden verwijderd onder omstandigheden waarin een andere noodzakelijke beschermende groep voldoende stabiel blijft om de synthese voort te zetten. Dit maakt het mogelijk om verschillende reactiepunten te onthullen op bepaalde stappen. Deze concepten zijn van fundamenteel belang bij gecontroleerde synthese van complexe peptiden. Orthogonaliteit is echter afhankelijk van de omstandigheden en niet van absolute waarden: herhaalde blootstelling, de karakteristieken van de sequentie en de reactieparameters kunnen nog steeds aanverwante reacties veroorzaken. Onderzoek naar alternatieve manieren om de carboxylegroepen te beschermen laat zien hoe de beschermingsstrategie kan worden aangepast om moeilijke peptische chemie te controleren. [2]

9. Wat is een delecyne-sequentie?

Een delecyne-sequentie is een peptide dat één of meerdere restanten bevat die aanwezig zijn in de beoogde doelsequentie. Het kan ontstaan wanneer de aminozuurbinding niet volledig plaatsvindt, maar een onverwerkt deel van de keten blijft aan het drager gekoppeld en neemt deel aan de volgende cycli. Omdat de onjuiste keten nog steeds aan het drager is gekoppeld, hoeft het normale verwijderen van de binding niet plaats te vinden. Onderzoek naar de real-time monitoring van SPPS wijst op het onvolledig vormen van amidbindingen als een belangrijk procesprobleem. [4] Een delecyne-sequentie is dus een probleem gerelateerd aan de structuur en identiteit van het product en niet alleen aan de restanten van het reactief.

10. Kunnen twee peptideverontreinigingen dezelfde molecuulmassa hebben?

Ja. Verschillende moleculaire structuren kunnen een identieke of onherkenbare nominale massa hebben. Daarom bevestigt de zelfstandige massa-compatibiliteit niet de volledige identiteit van het molecule. Bij synthetische peptiden die een renine-substrat zijn, zijn izobareuze componenten van de verontreiniging geïdentificeerd waar de modificaties zich op verschillende posities bevonden. Derivatisatie en tandem-massaspectrometrie leverden aanvullende structurele informatie op. [12] Dit voorbeeld laat zien waarom de overeenstemming tussen de waargenomen massa en de verwachte massa niet alleen de juiste sequentie, samenstelling, stereochemie of het ontbreken van structureel vergelijkbare isomeren kan bevestigen.

11. Wat zijn epimerisatie en racemisatie in de synthese van peptiden?

Epimerisatie en racemisatie betreffen ongewenste veranderingen in de stereochemische configuratie. Deze kunnen optreden zonder dat de nominale aminozuursequentie of de moleculaire massa verandert; daarom kan gewone massa-meting geen structurele verschillen aantonen. In onderzoek naar FMOC-synthese met behulp van microgolven zijn restanten geïdentificeerd die gevoelig zijn voor stereochemische veranderingen en is aangetoond dat de aanpassing van de reactievoorwaarden deze processen kan beperken. [11] Het risico hangt af van het molecuulblok, de sequentie en de procesomstandigheden. De stereochemische kwaliteit vereist analytische methoden die de configuratie kunnen beoordelen en kan niet uitsluitend worden afgeleid uit de moleculaire massa.

12. Wat is de vorming van aspartaam?

De vorming van aspartimidum is een ongewenste reactie die wordt geassocieerd met bepaalde sequenties die asparaginine bevatten. De vorming van het cyclische halfproduct kan leiden tot volgende producten met een veranderde structuur of stereochemie, waardoor de efficiëntie wordt verminderd en het reinigen bemoeilijkt wordt. Onderzoekers analyseerden alternatieve beschermingsstrategieën die zijn ontworpen om deze reactie in geselecteerde peptiden en eiwitten te beperken. [2] De resultaten wijzen niet op één universele oplossing voor alle sequenties die asparaginine bevatten. Ze tonen echter aan waarom het ontwerp van synthese- en contaminatiebeheersstrategieën specifieke chemische eigenschappen van de betreffende sequentie moet meenemen.

13. Ondersteunt de hoge zuiverheid van HPLC de juiste identiteit van het peptide?

Nee. De zuiverheid van een HPLC wordt beschreven in het kader van een specifieke chromatografiediscipline, het gebruikte detectiemiddel en de manier waarop de gegevens worden geanalyseerd. Een hoog percentage van het hoofdvolume van het monster kan een waardevol bewijs zijn dat de sample wordt bepaald door één chromatografisch afzonderlijk bestanddeel, maar het bevestigt niet automatisch de volledige moleculaire identiteit. Co-enzymen, stereoisomeren en andere varianten kunnen aanvullende technieken vereisen. In onderzoek naar de chiraliteit van peptiden werd een speciaal ontworpen proces gebruikt dat ook de stereochemische veranderingen in aanmerking nam die optreden tijdens de preparatie van het monster. [13] Identiteit en zuiverheid moeten dus worden beschouwd als gerelateerde maar afzonderlijke analytische vragen.

14. Betekent de productefficiëntie van het gereinigde product hetzelfde als zuiverheid?

Nee. De efficiëntie van het gereinigde of geïsoleerde product wordt bepaald door de hoeveelheid doelmatig hernieuwde materiaal in vergelijking met de gedefinieerde oorspronkelijke of theoretische hoeveelheid. De zuiverheid beschrijft echter de samenstelling van het hernieuwde materiaal volgens een bepaalde analytische methode. De synthese kan leiden tot het verkrijgen van een relatief kleine hoeveelheid product met een zeer hoge zuiverheid of een grote hoeveelheid ruw materiaal dat een aanzienlijke hoeveelheid verontreinigingen bevat. In studies van automatische stromingssynthese worden de zuiverheid van het ruwe product en de efficiëntie na isolatie afzonderlijk gerapporteerd. [7] Het scheiden van deze parameters voorkomt dat men de hoge waarde van een van beide als bewijs van de hoge waarde van de andere verkeerd interpreteert.

15. Kunnen lange peptiden worden geproduceerd door het samenvoegen van kortere fragmenten?

Ja. In een fragmentstrategie kunnen kortere peptidgebieden afzonderlijk worden geproduceerd en vervolgens met de juiste chemie worden gecombineerd. De chemische ligatie van de niet-geproteaseerde peptidgebieden was een belangrijk voorbeeld waarbij onbeschermde peptidgebieden werden gecombineerd op een manier die leidt tot de vorming van een natuurlijke binding van het peptidgebied, en vervolgens een geformatteerd eiwit werd verkregen. [10] Dit betekent niet dat elke peptidgebieden spontaan kunnen verbinden. De structuur van de fragmenten, de ligatiechemie, de keuze van de ligatieplaats, de oplosbaarheid, de stereochemie en de vereisten voor de reiniging moeten worden overwogen. Het samenstellen van fragmenten is dus een alternatieve strategie voor het ontwerpen van synthese, en niet een automatische oplossing voor problemen met lange peptiden.

16. Verwerpt snellere geautomatiseerde synthese de noodzaak van reiniging?

Nee. Een snellere geautomatiseerde of stromende synthese verkort de tijd die nodig is voor bepaalde stappen van de synthese, maar bewijst niet dat elke opgerichte molecule de gewenste structuur heeft. In studies van snelle stromende synthese werd nog steeds gebruik gemaakt van ruw materiaal en werden latere reinigingen toegepast, en in latere studies over automatisering werden de zuiverheid van het ruwe materiaal en de efficiëntie na isolatie afzonderlijk vergeleken. [6] [7] Goede resultaten van het systeem voor de bestudeerde sequenties garanderen evenwel niet identieke resultaten voor elk nieuw doel. De versnelde synthese moet nog steeds worden gecombineerd met een passende reiniging, bevestiging van de identiteit, analyse van verontreinigingen en een eindanalyse.

17. Waarom is het vergroten van de productieomvang complexer dan het bereiden van een grotere partij?

Een verhoging van de schaal verandert niet alleen de fysieke en chemische omstandigheden, maar ook de hoeveelheid materiaal. Menging, warmteoverdracht, het verdikken van de hars, de distributie van reactieproducten, druk, filtratie, de behandeling van oplosmiddelen, de oplosbaarheid van halfproducten en de mogelijkheden van het reinigingssysteem kunnen anders reageren bij een grotere productiehoeveelheid. In de industriële analyse werden 40 peptiderfaseprocessen afzonderlijk beoordeeld: de synthese, de reiniging en isolatie tijdens de analyse van het materiaalverbruik. [14] De resultaten tonen aan waarom de productie als een volledig proces moet worden beschouwd. Een schaalbare methode moet herhaaldelijk leiden tot het verkrijgen van een gekarakteriseerd materiaal in alle fasen, en niet alleen een grotere hoeveelheid ruw peptide.

18. Is het peptide meteen klaar na het opstellen van de juiste sequentie?

Niet noodzakelijkerwijs. Het vormen van een keten vormt de skeletstructuur van een sequentie slechts in zoverre deze door het proces en de analytische gegevens wordt bevestigd. Afhankelijk van de molecuulsoort kunnen desintegratie, afscheiding, cyclisatie, oxidering, het vormen van disiarczische bruggen, vouwen, conjugatie, reiniging en karakterisering nog steeds nodig zijn. De synthese van BPTI vormt een goed voorbeeld van een proces waarbij na het vormen van een lineaire sequentie de desintegratie en het vormen van een geformatteerde structuur met disiarczische bruggen plaatsvonden. [3] De term „afgeleid peptide” moet dus betrekking hebben op de moleculaire vorm die in een bepaald wetenschappelijk context vereist is, en niet alleen op het einde van het stapsgewijze toevoegen van aminozuren.

19. Ondersteunt de juiste molecuulmassa de juiste peptidssequenties?

Nee. De massa van de molecule is een waardevol bewijs, maar kan niet zelfstandig de volledige sequentie of de moleculaire structuur bevestigen. Isobareuze structuren kunnen dezelfde massa hebben en stereochemische verschillen kunnen überhaupt geen verandering in de massa van de molecule veroorzaken. Onderzoek naar vervuiling met synthetische peptiden heeft aangetoond dat het onderscheid tussen structureel verschillende componenten mogelijk vereist is met tandemmassaspectrometrie en aanvullende analyses. [12] Voor vragen over de stereochemische integriteit kunnen ook chirale methoden nodig zijn. [13] De massa van de molecule moet dus worden beschouwd als een van de elementen bij de beoordeling van de identiteit, en niet als een volledige bevestiging ervan.

20. Waarom moet het reinigen worden beschouwd als onderdeel van de productie van het peptidaal, en niet alleen als een eindtoevoeging?

De zuivering bepaalt of het eindproduct efficiënt kan worden gescheiden van de deleerende sequenties, bijproducten, restanten van reactiemiddelen en structureel vergelijkbare verontreinigingen en andere bestanddelen die tijdens de synthese ontstaan. Een methode waarmee zeer grote hoeveelheden ruw materiaal zeer snel kunnen worden geproduceerd, kan nog steeds niet praktisch zijn als het eindproduct van de vereiste kwaliteit niet effectief kan worden teruggewonnen. Om deze reden zijn industriële analyses van peptyden samen de synthese, de zuivering en de isolatie. [14] De efficiëntie van de productie moet uiteindelijk worden beoordeeld op basis van de hoeveelheid en de eigenschappen van het geïsoleerde eindproduct, en niet alleen op basis van de snelheid van de synthese.

Beperkingen bij het vergelijken van methoden voor de synthese van peptiden

Bij de interpretatie van studies die de productieprocessen van peptiden vergelijken, moet rekening worden gehouden met een aantal belangrijke beperkingen.

Ten eerste heeft de sequentie een sterke invloed op de complexiteit van de synthese. Een methode die voor één peptide werkt, hoeft niet hetzelfde effect te hebben voor een ander peptide. Aggregatie, hydrofoobheid, aminozuurstructuur, lengte, neiging tot secundaire structuren en gevoeligheid voor bijwerkingen kunnen het gedrag van het proces beïnvloeden [1] [4].

Ten tweede zijn de zuiverheid van het grondstofmateriaal, de prestaties na isolatie, de eindzuiverheid en de peptidaantaliteit verschillende parameters. Het vergelijken van methoden op basis van slechts één ervan kan een onvolledig beeld geven van de productiviteit van de productie. [7]

Ten derde betekent het snel samenstellen van een keten niet dat het hele materiaal snel wordt geproduceerd. Het ontmantelen, reinigen, isoleren, het eindelijk vormgeven van de structuur, analytische onderzoeken en documentatie hebben ook invloed op de totale productietijd. [6] [7]

Ten vierde, de analytische zuiverheid hangt af van de gebruikte methode. HPLC, massaspectrometrie, tandemmassaspectrometrie en chiralanalyse beantwoorden aan verschillende vragen. Een analytisch resultaat hoeft niet de volledige structurele identiteit te bevestigen. [12] [13]

Ten vijfde heeft de schaal invloed op de voortgang van het proces. De resultaten van laboratoriumsynthese kunnen niet automatisch worden overgezet naar industriële productie zonder rekening te houden met menging, massa-transport, mogelijkheid tot reiniging, materiaalverbruik en andere schaalafhankelijke factoren. [14]

Ten zesde, historische economische vergelijkingen kunnen na verloop van tijd hun actualiteit verliezen. De kosten van reactieproducten, het niveau van automatisering, technologieën voor expressie, apparatuur voor reiniging, terugwinning van oplosmiddelen en productie-infrastructuur blijven voortdurend ontwikkelen. Oudere kostenanalyses kunnen nog steeds wetenschappelijk relevant zijn, maar moeten niet noodzakelijkerwijs de huidige economie van de markt weerspiegelen. [1]

Zeventiende, milieuvergelijkingen vereisen samenhangende grenzen voor de analyse. Een beoordeling van het verbruik van oplosmiddelen tijdens het vervaardigen van een keten, waarbij het reinigen en isoleren worden genegeerd, kan leiden tot verwarrende conclusies over de balans van het proces. [14] [15]

Ten slotte bepaalt de naam van de methode zelf niet de kwaliteit van het product. SPPS, synthese in een oplosmiddel, LPPS, fragmentbinding en biologische expressie kunnen leiden tot het verkrijgen van materiaal van hoge kwaliteit, als het proces adequaat is ontworpen en gecontroleerd. Echter, geen van deze methoden garandeert automatisch de juiste identiteit, zuiverheid, stereochemie, foldering of bruikbaarheid voor een bepaald gebruik.

Samenvatting

De synthese van peptiden kan het beste worden begrepen als een gecontroleerd proces van moleculen vormen, en niet alleen als het vormen van peptidharen.

Het doel is het opbouwen van een bepaalde aminozuursequentie met het tegelijkertijd controleren van de manier waarop de restdelen worden verbonden, de chemie van de beschermende groepen, de stereochemie, de bijproductreacties en alle andere structurele vereisten.

De synthese van peptiden in vaste toestand houdt de groeiende keten op een niet-opgeloste drager vast, waardoor de herhaalde fasen van samenvoegen en wassen goed geschikt zijn voor automatisering. De voordelen van herhaalbare samenstelling elimineren echter geen problemen zoals incomplete reacties, aggregatie, delecyneën en sequentieafhankelijke bijproductreacties. [4] [6] [7]

De klassieke synthese in een oplosmiddel houdt de peptide-halfproducten in een vloeibare fase en kan meer flexibiliteit bieden bij het isoleren en karakteriseren van de afzonderlijke tussenproducten. Meervoudige scheiding en verslechterende oplosbaarheid kunnen echter ernstige beperkingen vormen.

Methodeën voor de synthese in vloeibare fase met oplosbare markers proberen chemie in oplossing te combineren met ontworpen strategieën voor materiaalherstel. Ze kunnen dus een aanvullende mogelijkheid vormen voor sequenties en productiemoeilijkheden waarvoor de klassieke SPPS niet optimaal is. [8] [9]

Langere of bijzonder complexe moleculen kunnen ook worden geproduceerd door het aanmaken van fragmenten, inclusief natuurlijke chemische ligatie, in plaats van uitsluitend te vertrouwen op het continue toevoegen van nieuwe aminozuren. [10]

Ongeacht de gekozen methode van samenstelling blijven de efficiëntie van de bindingen en de chemie van de beschermende groepen cruciaal, omdat kleine onnauwkeurigheden en bijwerkingen zich tijdens de volgende stappen van de synthese kunnen cumuleren. De vorming van aspartimid, de delecyne-sequenties en de stereochemische veranderingen tonen aan waarom de beoogde sequentie zelf niet alles beschrijft wat tijdens het proces kan ontstaan. [2] [11] [12]

Het werk eindigt ook niet bij het indienen van de ketting.

De zuivering bepaalt of het eindproduct kan worden gescheiden van de andere bestanddelen.

Daarna beantwoorden de adequaat gekozen analytische methoden specifieke vragen over de identiteit, zuiverheid, inhoud, stereochemie, conformatie en – indien van belang – functionele activiteit. [3] [12] [13]

Een grotere productieomvang brengt nieuwe problemen met zich mee met betrekking tot de transport van massa, het behoud van de hars, het verbruik van oplosmiddelen, filtratie, de mogelijkheid tot reiniging, de reproduceerbaarheid van het proces en de milieuvoordelen. Om deze reden moet de industriële beoordeling van het proces samen de synthese, de reiniging en de isolatie omvatten, in plaats van zich uitsluitend te concentreren op de snelheid van de samenstelling. [14] [15]

De belangrijkste regel is als volgt:

Effectieve peptidergistratie vereist controle van het gehele proces – van het moleculaire ontwerp en de vorming van bindingen tot het reinigen en de structurele karakterisering. Het verkrijgen van een keten met de verwachte nominale massa of een hoog hoofdchromatografisch piekvolume is een waardevol bewijs, maar geen van deze parameters kan zelfstandig de volledige moleculaire identiteit of de kwaliteit van het productieproces bevestigen.

Disclaimer

Het artikel heeft uitsluitend educatieve en wetenschappelijke informatieve waarde. Het beschrijft de algemene principes van de chemie van peptiden, de synthese in vaste toestand, de synthese in oplosmiddel en in vloeibare toestand, strategieën voor beschermende groepen, samenstellingen, reiniging, analytische karakterisering, productieprocessen en voorbeelden die afkomstig zijn uit gepubliceerde onderzoeken. Het is geen laboratoriumprotocol, productiehandleiding, medisch advies, richtlijn voor dosering of toediening, noch een certificaat van kwaliteit voor een bepaald peptidenproduct. De experimentele resultaten moeten worden geïnterpreteerd in het kader van de sequentie, de gebruikte methoden, de omvang van het proces, de analytische technieken en de beperkingen van de individuele onderzoeken.

Referenties

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K., & Perczel, A. (2016). Bacteriële expressie en/of vaste-fasen-peptidensynthese van polypeptiden en miniproteïden met een lengte van 20-40 aminozuren, het casusvoorbeeld van Class B GPCR-liganden. Current Protein & Peptide Science, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Preventie van aspartimidevorming tijdens peptide synthese met behulp van cyanosulfuryliden als carboxylzuur-beschermende groepen. Nature Communications, 11(1), Artikel 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). Synthese in vaste fase van het bijnier-trypsinremmer (BPTI) van runderen en twee analoga. Een chemische benadering voor het evalueren van de rol van disulfidebruggen bij de foldering en stabiliteit van eiwitten. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. PubMed-record
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). Real-time monitoring van de peptide synthese in vaste fase met behulp van een variabele bed-flow reactor. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F., & Becker, C. F. W. (2015). Efficiënte synthese van peptidehydraziden via directe hydrazinolyse van Peptidyl-Wang-TentaGel-harsen. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Rapid flow-based peptide synthesis. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2017). Een volledig geautomatiseerd stroomgebaseerd proces voor versnelde peptide synthese. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G., & Albericio, F. (2022). Vloeistoffasepeptidensynthese (LPPS): Een derde golf voor de preparatie van peptiden. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T., & Fukui, T. (2012). Nieuwamide-beschermende groep afkomstig van difenylmethyl voor efficiënte synthese van peptideën in vloeibare fase: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., & Kent, S. B. (1994). Synthese van eiwitten door natuurlijke chemische ligatie. Wetenschap, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Beperking van racemisatie en aspartimidevorming bij microgolfgestuurd Fmoc-solierepolymerisatie van peptiden. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Beschrijving van onzuiverheden in een synthetisch reninsubstraatpeptid door massaspectrometrie met snelle atomaanval en hybride tandemmassaspectrometrie. Rapid communicatie in massaspectrometrie, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G. & Crowther, J. B. (1995). Peptidische chiraliteitsproductbeoordeling: Hydrolyse in gedeterreerde zuur, derivatisatie met Marfey’s reagent en analyse met high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Process mass intensity (PMI): Een holistische analyse van huidige peptideproductieprocessen informeert over duurzaamheid in peptide-synthese. The Journal of Organic Chemistry, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Duurzaamheidsuitdagingen in de peptide-synthese en -zuivering: Van R&D naar productie. The Journal of Organic Chemistry, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001