Peptidesynthese: vastefase-methode, in oplossing en productiemethoden

Peptidesynthese is een gecontroleerd proces waarbij aminozuurketens met een specifieke sequentie worden gevormd. Bij chemische synthese worden geselecteerde aminozuren met elkaar verbonden door middel van peptidebindingen, waarbij tegelijkertijd andere reactieve groepen in deze moleculen worden gecontroleerd. Het doel is dus niet alleen om aminozuren te koppelen, maar om een specifieke moleculaire structuur te verkrijgen met een bepaalde sequentie, stereochemie, structuur van de ketenuiteinden en – indien nodig – extra structurele kenmerken.

Tot de belangrijkste methoden behoren de vastefase-peptidesynthese (SPPS), de klassieke synthese in oplossing en nieuwere methoden voor vloeistoffase-peptidesynthese (LPPS) die gebruikmaken van oplosbare dragers of moleculaire tags. Onderzoekslaboratoria en productiefaciliteiten kunnen ook verschillende benaderingen combineren, kortere fragmenten afzonderlijk bereiden en deze vervolgens aan elkaar koppelen, of biologische expressie gebruiken als dat geschikter is voor een bepaalde sequentie.

Vergelijking van chemische synthese met bacteriële expressie van polypeptiden bestaande uit 20-40 aminozuurresiduen toont een belangrijk principe aan: de praktische keuze van de productiemethode hangt af van het specifieke molecuul, de sequentie ervan, de neiging tot aggregatie, vereiste modificaties, productieschaal en analytische eisen. [1]

Het verkrijgen van de beoogde aminozuursequentie is slechts één van de fasen bij de productie van een peptide.

Het gehele proces kan het volgende omvatten:

sequentie-ontwerp → voorbereiding van bouwstenen → beschermen van functionele groepen → koppeling → verwijderen van beschermende groepen → kettingmontage → afsplitsing of koppeling van fragmenten → finale structuurvorming → zuivering → identiteitsbevestiging → onzuiverheidsanalyse → gehaltebepaling → eindkarakterisering.

Voor sommige peptiden zijn bovendien extra stappen nodig, zoals cyclisatie, de vorming van disulfidebruggen, vouwing, conjugatie of andere chemische modificaties.

Om deze reden betekent een correcte assemblage van de keten niet automatisch dat het uiteindelijke materiaal de juiste identiteit, zuiverheid, stereochemie, conformatie, stabiliteit of andere vereiste eigenschappen heeft.

Wat is peptidesynthese?

Het creëren van een specifiek aminozuurzuursequentie

Peptide bestaat uit aminozuurresiduen die door peptidebindingen met elkaar zijn verbonden.

Het doel van peptidesynthese is om deze bindingen in een vooraf bepaalde volgorde te vormen, vaak met gelijktijdige controle over:

• soorten aminozuren;
• volgorde van aminozuren in de sequens;
• stereochemie;
• N-uiteindelijke structuren;
• C-uiteinde structuren;
• modificatie van zijketens;
• disulfidebrugformaties;
• cyclisatie;
• van andere vereiste structurele kenmerken.

De sequentie is van fundamenteel belang, omdat een identieke aminozuursamenstelling kan leiden tot verschillende moleculen als de aminozuren in een andere volgorde voorkomen.

De bewering dat een bepaald molecuul een „peptide bestaande uit vijf aminozuren” is, biedt dan ook erg weinig informatie over de daadwerkelijke structuur ervan. Om het molecuul correct te beschrijven, moet men het type aminozuren, hun volgorde, stereochemie, eindgroepen en eventuele extra modificaties kennen.

Twee peptiden kunnen daarom precies dezelfde aminozuursamenstelling hebben en toch verschillende moleculaire structuren zijn.

Aanvullende verschillen kunnen voortvloeien uit modificaties van de ketenuiteinden, de aanwezigheid van disulfidebruggen, een cyclisch skelet, veranderingen in zijketens of een afwijkende stereochemische configuratie.

Chemische peptidesynthese maakt gewoonlijk gebruik van aminozuren waarvan de reactieve groepen selectief zijn beschermd.

Tijdelijke beschermingsgroepen maken de vorming van een specifieke beoogde chemische verbinding mogelijk, terwijl concurrerende reacties op andere plaatsen in het molecuul worden beperkt.

In volgende geplande synthesestadia worden deze groepen verwijderd of gewijzigd.

Gecontroleerde reactie in plaats van spontane koppeling

In elementaire chemische beschrijvingen wordt de vorming van eenpeptidebinding vaak voorgesteld als een condensatiereactie, waarbij twee aminozuren zich verbinden onder netto afscheiding van een watermolecuul.

Een dergelijke vergelijking beschrijft de algemene reactiebalans.

Dit moet echter niet worden verward met de manier waarop gecontroleerde peptidesynthese in de praktijk wordt uitgevoerd.

Alleen het mengen van vrije aminozuren zou het niet mogelijk maken om betrouwbaar te bepalen:

• welke aminogroep moet reageren;
• welke carboxylgroep moet reageren;
• welk aminozuur moet als eerste komen;
• dat als tweede moet komen;
• zullen de zijketens beginnen te reageren;
• wordt de stereochemie behouden;
• zullen er niet tal van ongewenste producten ontstaan.

Daarom worden bij praktische chemische synthese gecontroleerde strategieën voor activering en bescherming van functionele groepen toegepast.

Een van de carboxylgroep afgeleide groep wordt gewoonlijk zo geactiveerd dat deze effectief kan reageren met een gekozen aminogroep. Beschermgroepen, de reactievolgorde, dragerschemie, koppelingsreagens, het oplosmiddelmilieu en isolatiemethoden helpen samen om de reactie in de richting van het beoogde product te sturen.

Effectieve peptidesynthese vereist dus controle over zowel de chemie die moet plaatsvinden als de chemie die moet worden voorkomen.

Een goed voorbeeld is de vorming van aspartimide.

Onderzoekers hebben een alternatieve methode voor de bescherming van de carboxylgroep ontwikkeld, met als doel deze problematische nevenreactie tijdens de peptidesynthese te beperken. [2]

Uit onderzoek blijkt een breder principe van de peptidechemie: het voorkomen van ongewenste moleculaire transformaties kan net zo belangrijk zijn als het vormen van de juiste peptidebinding.

Wanneer kan een peptide als klaar worden beschouwd?

Het voltooien van de lineaire peptideketen betekent niet altijd dat de hele synthese klaar is.

Afhankelijk van het doelmolecuul kunnen er na de ketenmontage extra stappen nodig zijn.

Deze kunnen het volgende omvatten:

• volledige deprotectie van beschermende groepen;
• splitsing van het peptide van de vaste drager;
• verwijderen van tijdelijke markeringen;
• cyclisatie;
• oxidatie;
• het vormen van disulfidebruggen;
• plooiing;
• vervoeging;
• kettinguiteinden modificatie;
• zuivering;
• analytische kenmerken.

Sommige peptiden vereisen relatief weinig extra structurele veranderingen nadat de keten is samengesteld.

Voor anderen zijn de latere fasen van cruciaal belang.

Een goed voorbeeld is de synthese van boviene pancreatische trypsineremmer (BPTI). Onderzoekers assembleerden de lineaire sequentie, zuiverden het materiaal en verkregen vervolgens een gevouwen structuur die disulfidebindingen bevat. Volgens de analyses en functionele vergelijkingen gepresenteerd in de studie kwam het uiteindelijke materiaal met de natuurlijke sequentie overeen met het natuurlijk voorkomende eiwit qua onderzochte parameters. [3]

Dit voorbeeld laat het verschil zien tussen het assembleren van het peptide-ruggengraat en het verkrijgen van de volledig gekarakteriseerde uiteindelijke moleculaire vorm.

Een methode waarmee een correcte lineaire reeks kan worden verkregen, bevestigt niet automatisch:

• correct vouwen;
• van de juiste vorming van disulfidebindingen;
• biologische activiteit;
• stabiliteit;
• verontreinigingsprofiel;
• geschiktheid voor een bepaald doel.

Elk van deze kwesties vereist afzonderlijk bewijs.

Chemische synthese, biologische expressie en gecombineerde methoden

Bij de chemische synthese van peptiden worden de eerder bereide moleculaire bouwstenen in gecontroleerde laboratoriumreacties met elkaar verbonden.

Bij biologische expressie wordt daarentegen gebruikgemaakt van het cellulaire apparaat om de gecodeerde aminozuursequentie te produceren. Vervolgens moet het materiaal worden teruggewonnen, gezuiverd en, indien nodig, verder verwerkt.

Beide methoden kunnen leiden tot de vorming van peptiden of polypeptiden, maar hebben elk hun eigen mogelijkheden en beperkingen.

Chemische synthese kan bijzonder nuttig zijn wanneer het volgende nodig is:

• geselecteerde niet-standaard aminozuren;
• chemische wijzigingen op specifieke plaatsen;
• specifieke keteneindstrukturen;
• isotopische markers;
• wijzigingen in het peptide-skelet;
• andere eigenschappen die moeilijk te verkrijgen zijn via standaard biologische expressie.

Biologische expressie kan aantrekkelijk zijn bij geschikte langere sequenties of specifieke markeringsstrategieën, maar het elimineert de problemen in latere productiestadia niet.

Materiaalherwinning, vouwing, verwerking, gastheerverontreinigingen, zuivering en analytische karakterisatie moeten nog steeds in aanmerking worden genomen.

Geen van de methoden is dus in alle gevallen de beste.

Bij de vergelijking van polypeptiden bestaande uit 20–40 aminozuurresiduen hadden zowel de lengte van de sequenties als hun neiging tot aggregatie invloed op de resultaten van de synthese in vaste fase en de bacteriële expressie. [1]

Deze waarnemingen ondersteunen de benadering waarbij de productiemethode wordt afgestemd op een specifieke molecule.

Historische gegevens over productiviteit, kosten, uitrusting en productietijd mogen niet worden beschouwd als universele hedendaagse waarden, aangezien technologieën, reagentia, automatisering, zuiveringsmethoden en productie-economie veranderen naarmate de technologie zich verder ontwikkelt.

Peptidesynthese in vaste fase

De groeiende keten is gehecht aan een onoplosbare drager

Bij solid-phase peptide synthesis (SPPS) blijft de groeiende peptideketen tijdens opeenvolgende synthesjecycli gehecht aan een onoplosbare drager.

Als drager wordt meestal een gefunctionaliseerd polymeerhars gebruikt.

De koppelaar, oftewel de linker, bindt het peptide aan de drager en beïnvloedt onder andere de manier waarop de voltooide keten later vrijkomt en het soort eindgroep dat wordt verkregen.

Een van de belangrijkste praktische voordelen van SPPS is het gemakkelijker scheiden van het materiaal.

Na afloop van een bepaalde reactiefase kunnen de oplosbare reagentia en veel van de oplosbare bijproducten door middel van spoelen worden verwijderd, terwijl het groeiende peptide aan de vaste fase gebonden blijft.

Hierdoor is het niet nodig om na toevoeging van elk volgend aminozuur het groeiende peptide te isoleren en te zuiveren als een afzonderlijke, vrije verbinding.

Dit gemak kan echter tot een belangrijk misverstand leiden.

Het wassen van de hars betekent niet dat alle onjuiste peptiden zijn verwijderd.

Als de aan de hars bevestigde ketting tijdens één koppelingsfase niet reageert, kan deze op de drager blijven zitten.

In volgende cycli kan hij opnieuw reageren en zich verder verlengen.

Als gevolg hiervan kan een deletiesequentie ontstaan, dat wil zeggen een molecuul dat verschilt van het doelpeptide door het ontbreken van één of meer aminozuurresiduen.

Chemisch vergelijkbare of onvolledig ontgrendelde ketens die aan de hars zijn gebonden, kunnen deelnemen aan volgende synthesestadia.

SPPS vereenvoudigt dus de scheiding van oplosbare stoffen van aan hars gebonden materiaal.

Dit garandeert echter geen perfecte sequentie-overeenkomst.

Herhalende cyclus van ontgrendelen en koppelen

Een typische stapsgewijze SPPS-synthese omvat het herhalen van drie basishandelingen:

ontgrendeling → koppelen → spoelen.

Eerst wordt de reactieve aminogroep aan het uiteinde van de groeiende keten blootgesteld.

Vervolgens wordt het volgende beschermde aminozuur aan de keten gekoppeld.

Oplosbare reagentia, een overmaat aan aminozuur en vele reactieproducten worden verwijderd voordat de volgende cyclus begint.

Het herhalen van dit proces maakt het mogelijk om het peptide aminozuur voor aminozuur op te bouwen.

In de klassieke SPPS wordt de C-terminale rest meestal als eerste aan de drager gekoppeld, waarna de ketting in de richting van de N-terminus wordt verlengd.

Dit verschilt van de standaard ribosomale eiwitsynthese, waarbij opeenvolgende aminozuren worden toegevoegd aan de C-terminus van de groeiende keten.

De uiteindelijke aminozuurvolgorde kan echter identiek zijn, ook al zijn de richting en de chemie van het vouwproces anders.

De term „cyclus” moet niet worden opgevat als één universele set reactievoorwaarden die geschikt is voor elk residu en elke sequentie.

Het verloop van de reactie kan afhangen van:

• strategieën van beschermende groepen;
• type aminozuur;
• ruimtelijke omstandigheden rond de reactieplaats;
• type hars;
• linkera;
• kettinglengten;
• agregatie;
• oplosmiddel;
• koppelingschemie;
• van het structurele gedrag van het groeiende peptide.

Een reactie die in het begin van de synthese gemakkelijk verloopt, kan in een later stadium aanzienlijk moeilijker worden.

Daarom blijft procesmonitoring essentieel, zelfs in sterk geautomatiseerde systemen.

Waarom zijn de eigenschappen van hars belangrijk?

Een duurzaam medium is niet slechts een passieve drager.

De fysische en chemische eigenschappen ervan kunnen het verloop van de reactie direct beïnvloeden.

Een belangrijke parameter is de zwellingscapaciteit.

Als de hars correct opzwelt in het gekozen oplosmiddel, kunnen de reagentia gemakkelijker de reactieve plaatsen bereiken die zich overal in de polymeerstructuur bevinden.

Onvoldoende zwelling of structuurveranderingen van de hars kunnen deze toegang beperken.

Ook van betekenis kunnen zijn:

• bezettingsdichtheid;
• polymeerarchitectuur;
• linkerstructuur;
• oplosmiddelcompatibiliteit;
• mechanische stabiliteit;
• porositeit;
• diffusie-eigenschappen;
• interacties tussen groeiende peptideketens.

Naarmate de lengte van het peptide toenemen, kunnen afzonderlijke ketens ook met elkaar interageren.

Aggregatie op de hars kan de toegang tot reactieve plaatsen beperken en leiden tot onvolledige koppeling of onvolledige ontscherping.

Dit betekent dat een sequentie die zich aan het begin van de syntyse correct gedraagt, na verloop van tijd naarmate de keten langer wordt, steeds moeilijker kan worden.

Onderzoekers hebben een stroomreactor met een variabel bed ontwikkeld waarmee de uitzetting van de hars kon worden gemonitord op basis van drukgerelateerde metingen. [4]

Het onderzoek richtte zich op harsaggregatie en onvolledige cross-linking als procesproblemen die onder andere omstandigheden tijdens de synthese moeilijk direct te observeren kunnen zijn.

Dit toont aan dat het bewaken van het fysieke gedrag van de drager informatie kan opleveren die verder gaat dan alleen het registreren van de toegevoegde reagentia.

Waar dient Wang-hars voor?

Wang-linkerchemie wordt algemeen toegepast in SPPS wanneer na afsplitsing van het peptide een C-eindstandige carbonzuurgroep gewenst is.

Het peptide is gehecht via een esterbinding, die later onder geschikte omstandigheden kan worden gesplitst.

Andere linker-systemen kunnen worden gekozen wanneer een andere C-uiteinde-structuur nodig is, bijvoorbeeld een amide.

Het is de moeite waard om onderscheid te maken tussen de linkerchemie en de fysieke drager als geheel.

Verwante Wang-type linkers kunnen worden geïntroduceerd in verschillende polymeerarchitecturen.

Dergelijke materialen hoeven niet identiek te zijn:

• zwelvermogen;
• capaciteiten;
• oplosmiddelcompatibiliteit;
• mechanische eigenschappen;
• gedrag tijdens reacties.

Onderzoek met peptidyl-Wang-TentaGel-harsen toonde een gespecialiseerde alternatieve methode aan voor de bereiding van peptidehydraziden, die nuttige tussenproducten zijn in de peptidechemie. [5]

Dit betekent niet dat standaard afsplitsing van Wang-hars doorgaans leidt tot de vorming van peptidehydraziden.

Het laat echter een belangrijke regel zien:

drager + linker + reactieomstandigheden + afsplitsingschemie bepalen gezamenlijk het verkregen product.

Synthese van SPPS in batch- en continu systeem

SPPS kan worden uitgevoerd in klassieke batchreactoren of in systemen waarin reagentia door een reactor stromen die een vaste drager bevat.

Flowsystems kunnen een snelle uitwisseling van reagentia en een nauwkeurigere controle van de chemische omgeving rond de hars mogelijk maken.

In een studie uit 2014 werd een snelle peptide-synthese in een doorstroomsysteem met continue monitoring gepresenteerd en toegepast op verschillende peptiden en een klein eiwit. [6]

In een latere geautomatiseerde studie werd een aanzienlijk snellere ketenassemblage beschreven, waarbij voor de geanalyseerde voorbeelden een zuiverheid van het ruwe product en een geïsoleerde opbrengst werden verkregen die vergelijkbaar zijn met klassieke batchsynthese. [7]

Deze onderzoeken tonen de mogelijkheden van specifieke systemen onder bepaalde omstandigheden.

Ze bewijzen echter niet dat elk peptide even snel en met dezelfde kwaliteit kan worden geproduceerd.

De tijd die nodig is om een peptide te produceren omvat ook aanzienlijk meer dan alleen het samenstellen van de keten.

Het totale proces kan omvatten:

• bereiding van reagentia;
• harsbereiding;
• koppeling;
• ontgrendeling;
• spoelen;
• afscheiding;
• productverwerking;
• zuivering;
• verwijderen van oplosmiddelen;
• de uiteindelijke vorming van de structuur;
• analytisch onderzoek;
• documentatie.

Snelle verbindingen vormen dus slechts één van de elementen van de totale productie-efficiëntie.

Synthese in vloeibare fase

Wat betekent deze term?

De term „vloeibare-faselytidesynthese” kan in verschillende betekenissen worden gebruikt.

In brede zin kan het eenvoudigweg betekenen dat het om een peptidesynthese in oplossing gaat.

In meer gespecialiseerde literatuur wordt echter vaak onderscheid gemaakt tussen:

1. klassieke peptidesynthese in oplossing;
2. vastefase-peptidesynthese;
3. nieuwere LPPS-methoden, waarbij de groeiende keten een oplosbaar label of drager bezit.

Dit onderscheid is belangrijk omdat de manier waarop het product wordt gescheiden en teruggewonnen, verandert.

Een vrij opgelost, beschermd peptide-tussenproduct kan isolatie vereisen op basis van zijn eigen fysische en chemische eigenschappen.

In het geval van een gelabeld semi-afgewerkt product kan de label zo worden ontworpen dat het neerslaan, de extractie, het vasthouden op een membraan of een andere wijze van scheiding wordt vergemakkelijkt.

Het overzicht over LPPS maakt een duidelijk onderscheid tussen klassieke oplossingssynthese, SPPS en methoden waarbij gebruik wordt gemaakt van oplosbare tags. [8]

De publicatie is nuttig om de terminologie en methodologie op een rijtje te zetten.

Het moet echter niet worden geïnterpreteerd als een enkel experiment dat bewijst dat de ene methode het beste is voor elk peptide.

Klassieke peptide-synthese in oplossing

Bij klassieke in-oploplossingssynthese blijven beschermde aminozuren, peptide-tussenproducten of fragmenten opgelost in het reactiemedium in plaats van covalent te zijn gebonden aan een onoplosbare hars.

Na afloop van de reactie kan het betreffende tussenproduct worden geïsoleerd, gezuiverd en indien nodig gekarakteriseerd voordat met de volgende stap wordt begonnen.

Dit kan bepaalde voordelen opleveren.

Onderzoekers kunnen:

• de afzonderlijke halffabricaten karakteriseren;
• de zuiveringsmethode afstemmen op een specifiek halffabricaat;
• individuele transformaties optimaliseren;
• fragmenten onafhankelijk voorbereiden;
• de synteseroute wijzigen wanneer een bepaald tussenproduct problemen oplevert.

Synthese in oplossing kan echter ook gepaard gaan met aanzienlijke moeilijkheden.

Naarmate de keten langer wordt, kunnen peptiden:

• moeilijk oplosbaar worden;
• aggregeren;
• moeilijk te kristalliseren;
• nauw verwante onzuiverheden creëren;
• moeilijk te scheiden;
• meerdere keren isoleren;
• materiële verliezen veroorzaken tijdens volgende bewerkingsstappen.

Synthese in oplossing is daarom niet automatisch eenvoudiger of gemakkelijker op te schalen dan SPPS.

Haar bruikbaarheid hangt af van de specifieke sequentie, de stabiliteit van de tussenproducten, de oplosbaarheid, de lengte van de syntheseroute, het gedrag tijdens de zuivering en de efficiëntie van volgende isolatiestappen.

De ontwikkeling van gelabelde LPPS-strategieën is gedeeltelijk het gevolg van pogingen om juist deze problemen met betrekking tot scheiding en materiaalbehandeling op te lossen. [8]

Oplosbare labels koppelen reactieontwerp aan scheidingsontwerp

In het gelabelde LPPS heeft het groeiende peptide een tijdelijke moleculaire aanhechting die zo is ontworpen dat deze de fysieke eigenschappen ervan beïnvloedt.

Het label kan ervoor zorgen dat de peptide voldoende oplosbaar blijft tijdens de reactie en vervolgens de selectieve terugwinning ervan vergemakkelijken.

Afhankelijk van de technologie kan bij de scheiding gebruik worden gemaakt van:

• neerslag;
• extractie;
• membraanretentie;
• fasegedrag;
• overige eigenschappen die voortvloeien uit de aanwezigheid van de marker.

Bij een van de experimentele strategieën werd een langketenige beschermende groep aan de C-terminus gebruikt voor de bereiding van peptide-amiden.

Herhaalde reacties en precipitatiestappen stelden onderzoekers in staat om een hydrofoob peptide te bereiden dat in de door hen gemaakte vergelijking moeilijk op bevredigende wijze te verkrijgen was via de SPPS-methode. [9]

Dit toont de bruikbaarheid van deze specifieke strategie voor de geanalyseerde sequentie.

Dit bewijst echter niet de universele superioriteit van gelabelde synthese.

De marker wordt onderdeel van het productieproces en roept eigen vragen op:

• Hoe effectief wordt het aangesloten?
• Verandert het het verloop van de reactie?
• Hoe kan een gemerkt halffabricaat betrouwbaar worden teruggewonnen?
• Leidt dit tot het ontstaan van nieuwe verontreinigingen?
• Hoe wordt het verwijderd?
• Kan de volledige verwijdering worden bevestigd?
• Welke analytische methoden bevestigen de afwezigheid ervan in het eindproduct?

Losbare markeringen moeten daarom worden beschouwd als functionele elementen van het procesontwerp en niet uitsluitend als eenvoudige etiketten.

Vergelijking van de belangrijkste methoden

De vergelijking toont de algemene werkingsprincipes van de verschillende methoden.

Het specificeert niet welke daarvan de beste prestaties, reinheid, kosten, milieuduurzaamheid of schaalbaarheid zal opleveren voor een specifiekesequentie.

Deze parameters moeten worden beoordeeld op basis van het daadwerkelijke molecuul en het specifieke productieproces. [4] [8] [9]

Fragmentvermenigvuldiging en hybride productie

Een peptide hoeft niet altijd te worden gevormd in één ononderbroken proces waarbij opeenvolgende aminozuurresiduen worden toegevoegd.

Een alternatieve strategie is het afzonderlijk bereiden van kortere peptidefragmenten en deze vervolgens te koppelen.

Een hybride proces kan bijvoorbeeld SPPS gebruiken voor het verkrijgen van afzonderlijke fragmenten en oplossingstransformatiechemie om deze te combineren.

Fragmentstrategieën kunnen sommige problemen beperken die gepaard gaan met zeer lange stapsgewijze synthese.

Ze introduceren echter nieuwe uitdagingen, zoals:

• het kiezen van de juiste verbindingslocatie;
• oplosbaarheid van fragmenten;
• activering van de verbindingsplaats;
• chemoselectiviteit;
• behoud van stereochemie;
• bijwerkingen;
• fragmenten opschonen;
• opruiming na hun samenvoeging.

Een belangrijk voorbeeld van gecontroleerde fragmentkoppeling is natieve chemische ligatie.

In de klassieke versie reageert een peptide-thioester met een tweede peptide dat een N-terminale cysteïne bevat. Een daaropvolgende hergroepering leidt tot de vorming van een normale binding in het peptide-ruggegraat op de ligatieplaats.

Eerste onderzoeken toonden aan dat het mogelijk was om na ligatie en vouwing een eiwit met disulfidebindingen te verkrijgen. [10]

Dit bevestigt het belang van deze fragmentatiestrategie.

Dit betekent echter niet dat willekeurige twee ongemodificeerde peptidefragmenten spontaan kunnen samensmelten.

Koppeling en beschermgroepen

Koppeling creëert een opzettelijke verbinding

Koppeling is een reactiestap waarbij een nieuwe peptidebinding wordt gevormd tussen geselecteerde eenheden.

Meestal wordt de groep die afkomstig is van de carboxylgroep geactiveerd zodat deze effectief kan reageren met de juiste aminogroep.

De activeringschemie moet compatibel zijn met:

• stijgende reeks;
• tijdelijke beschermingsgroepen;
• bescherming van zijketens;
• stereochemie;
• drager of merkteken;
• oplosmiddelomgeving;
• met andere functionele groepen in het molecuul.

Effectieve koppeling is met name belangrijk bij stapsgewijze synthese, omdat een onvolledige reactie kan leiden tot de vorming van deletiesequenties.

Als één stap van de toevoeging van een aminozuur mislukt voor een deel van de groeiende ketens, kunnen dergelijke ketens in het systeem achterblijven en deelnemen aan volgende cycli.

Als gevolg hiervan kunnen moleculen ontstaan die sterk lijken op het doelpeptide, maar één residu missen.

Zelfs kleine inefficiënties kunnen zich dus opstapelen tijdens vele synthesestadia.

Een eenvoudig wiskundig voorbeeld illustreert dit probleem goed.

Als elk van de 50 onafhankelijke fasen van het samenstellen een kans van 99% op succes zou hebben, zou het percentage moleculen waarbij alle fasen succesvol zouden zijn, als volgt zijn:

0,99^50 ≈ 0,605

dat wil zeggen ongeveer 61%.

Dit is uitsluitend een wiskundige illustratie.

Dit vormt geen voorspelling van de werkelijke zuiverheid of synthese-opbrengst van het peptide dat 50 residuen bevat.

De daadwerkelijke productie omvat:

• verschillende koppelingsrendementen in de verschillende posities;
• fasen van decontaminatie;
• bijwerkingen;
• sequentie-afhankelijke moeilijkheid;
• herkoppelingsstrategie;
• verliezen bij het afscheiden;
• verliezen tijdens de reiniging;
• andere procesvariabelen.

Uit de berekening blijkt alleen maar waarom zelfs een ogenschijnlijk kleine inefficiëntie in een enkele stap van groot belang kan worden in een synthese die uit meerdere stappen bestaat.

Beschermende groepen controleren de reactieplaats

Een aminozuur kan verschillende chemisch reactieve groepen bezitten.

Zonder selectieve controle zouden de koppelingsreacties op ongewenste plaatsen kunnen plaatsvinden.

Beschermende groepen blokkeren tijdelijk geselecteerde reactieve plaatsen.

De aminogroep die wordt gebruikt voor ketenverlenging vereist meestal tijdelijke bescherming, terwijl reactieve zijketens mogelijk bescherming vereisen die gedurende vele synthesecycli op hun plaats blijft.

De verbinding met de drager moet deze fasen eveneens doorstaan tot het geplande afkoppelen.

De keuze van beschermgroepen beïnvloedt dus de hele synthesestrategie.

Er moet rekening worden gehouden met:

• de manier waarop ze worden ingevoerd;
• stabiliteit;
• verwijderingsmethode;
• verenigbaarheid met andere beschermende groepen;
• geschiktheid voor de drager;
• bijwerkingen;
• de invloed van een specifieke sequentie;
• definitieve ontgrendelingsvoorwaarden.

Onderzoek waarbij gebruik werd gemaakt van op cyanosulfurylide gebaseerde bescherming betrof de vorming van aspartimide door de manier van bescherming van de carboxylgroep te veranderen. [2]

Uit de resultaten blijkt dat de strategie van beschermende groepen niet alleen van invloed is op de vraag of de beoogde reactie kan plaatsvinden, maar ook op welke ongewenste reacties mogelijk worden.

Fmoc, Boc en orthogonale bescherming

Fmoc en Boc behoren tot veelgebruikte beschermgroepen voor aminogroepen.

Ze verschillen wezenlijk in de manier waarop ze worden verwijderd.

Fmoc wordt meestal verwijderd onder basische omstandigheden, terwijl Boc gevoelig is voor zure omstandigheden.

Deze eigenschappen maken het mogelijk om ze te gebruiken als onderdelen van brede beschermingsstrategieën.

In de populaire op Fmoc gebaseerde SPPS wordt de tijdelijke Fmoc-bescherming aan de N-terminus herhaaldelijk verwijderd, terwijl geselecteerde zijketenbeschermingsgroepen en de hechting aan de hars intact blijven tot latere stadia.

Andere strategieën kunnen andere combinaties gebruiken.

Een bijzonder belangrijk begrip is ortogonale bescherming.

Twee beschermgroepen worden als orthogonaal beschouwd als de ene selectief kan worden verwijderd onder omstandigheden waarin de andere stabiel genoeg blijft om verdere synthese mogelijk te maken.

Orthogonaliteit is dus een praktische relatie van chemische compatibiliteit.

Dit betekent niet dat elke beschermde groep na een onbeperkt aantal blootstellingen aan alle reactieomstandigheden volledig onveranderd blijft.

Bijwerkingen kunnen nog steeds optreden.

In Fmoc-syntheseonderzoek zijn zowel de vorming van aspartimide als ongewenste stereochemische veranderingen beschreven, ondanks de veronderstelde selectiviteit van de algemene beschermingsstrategie. [11]

Stereochemie is een deel van de identiteit van een molecuul

Hoeveel aminozuren hebben een chiraal centrum?.

Dit betekent dat hun atomen verschillende ruimtelijke rangschikkingen kunnen aannemen die overeenkomen met verschillende stereochemische vormen.

Het wijzigen van de configuratie van één stereogeen centrum kan leiden tot de vorming van een andere peptidestructuur zonder dat de nominale massa hoeft te worden gewijzigd.

Daarom kan de massa alleen niet de volledige identiteit van het peptide bevestigen.

Epimerisatie betekent meestal de verandering van de configuratie van één stereogeen centrum in een molecuul dat er meerdere bevat.

Racemisatie wordt in de peptidechemie ook vaak besproken in de context van het verlies van de stereochemische integriteit van aminozuurresiduen.

Deze wijzigingen zijn belangrijk omdat moleculaire herkenning sterk kan afhangen van de ruimtelijke rangschikking van atomen.

Twee moleculen met dezelfde elementaire samenstelling en nominale massa kunnen zich dus anders gedragen als ze in stereochemie verschillen.

In de studie naar door microgolven ondersteunde Fmoc-synthese werd vastgesteld dat sommige residuen gevoelig waren voor ongewenste stereochemische verandering onder de toegepaste omstandigheden. Aanpassing van de methode beperkte het optreden van deze reacties. [11]

Dit betekent niet dat verwarming per definitie alle peptiden beschadigt.

De juiste conclusie is dat het versnellen van de reactie samen moet worden beoordeeld met de sequentieafhankelijke chemische selectiviteit.

Aspartimide en verwante onzuiverheden

De vorming van aspartimide is een bekende bijwerking met betrekking tot bepaalde asparaginaatbevattende sequenties.

Er kan een ongewenst cyclisch tussenproduct ontstaan, waaruit vervolgens verbindingen met een veranderde skeletconnectiviteit of stereochemie worden gevormd.

De waarschijnlijkheid van deze reactie hangt af van de sequentie en de procesomstandigheden.

Andere onzuiverheden die verband houden met de synthese kunnen het gevolg zijn van:

• incompleta koppeling;
• gedeeltelijke ontgrendeling;
• het ontstaan van deletiesequenties;
• reacties van zijketens;
• stereochemische veranderingen;
• reactie tijdens het afsplitsen;
• oxidatie;
• herschikkingen;
• verwerkingsvoorwaarden van het product;
• onvolledige ontbreking van beschermingsgroepen.

Sommige verontreinigingen veroorzaken een gemakkelijk waarneembare verandering in de moleculaire massa.

Andere zijn veel moeilijker te onderscheiden.

Bij analytisch onderzoek van een synthetisch peptide dat als reninesubstraat dient, werden talrijke onzuiverheden geïdentificeerd, waaronder componenten met dezelfde massaverandering maar met modificaties op verschillende posities. [12]

Om ze van elkaar te onderscheiden, was een aanvullende structurele analyse nodig.

Onderzoekers behandelden de voorgestelde mechanismen voor het ontstaan van deze verontreinigingen eveneens als hypothesen.

Dit is een belangrijk onderscheid:

Het vaststellen wat vervuiling is en het bewijzen van het exacte mechanisme van het ontstaan ervan zijn twee afzonderlijke wetenschappelijke vraagstukken.

Een waarschijnlijk mechanisme mag niet worden gepresenteerd als bevestigd louter omdat het overeenkomt met de waargenomen moleculaire massa.

Opschoning, schaling en productiekwaliteit

Ruw product, gezuiverd product en opbrengst

Ruw peptide is een materiaal verkregen voordat de juiste zuiveringsstappen zijn voltooid.

Kan bevatten:

• doelpeptide;
• deletiesequenties;
• materiaal niet volledig ontgrendeld;
• gewijzigde sequenties;
• reagensresten;
• ontginningsproducten;
• zool;
• oplosmiddelen;
• andere componenten die in het proces ontstaan.

Zuivering is bedoeld om het juiste peptide van dit mengsel te scheiden.

Er moet duidelijk onderscheid worden gemaakt tussen drie begrippen:

zuiverheid van het ruwe product — gemeten materiaalsamenstelling vóór de uiteindelijke zuivering;

opbrengst van het gezuiverde of geïsoleerde product — de hoeveelheid teruggewonnen doelmateriaal ten opzichte van een bepaalde beginwaarde of theoretische waarde;

eindzuiverheid — de samenstelling van het geïsoleerde materiaal bepaald met behulp van een specifieke analytische methode.

Deze begrippen zijn niet uitwisselbaar.

Het proces kan leiden tot de vorming van een grote hoeveelheid ruw materiaal, maar maakt het mogelijk om een relatief kleine hoeveelheid gezuiverd product terug te winnen.

Een ander proces levert mogelijk minder grondstof op, maar kenmerkt zich door een hoge selectiviteit voor de vorming van het doelproduct.

Een vergelijkbaar hoge analytische zuiverheid hoeft geen hoge productieopbrengst te betekenen.

Bij studies naar versnelde flow-synthese werden de zuiverheid van het ruwe materiaal en de geïsoleerde opbrengst correct apart gerapporteerd. [7]

Chromatografie scheidt componenten, maar beantwoordt niet elke vraag

High-performance vloeistofchromatografie met omgekeerde fase (RP-HPLC) wordt veel gebruikt voor de analyse en zuivering van peptiden.

Verschillende moleculen wisselwerking op verschillende wijze met de stationaire en de mobiele fase.

Onder de juiste omstandigheden maken deze verschillen het mogelijk om de componenten van het mengsel te scheiden.

Analytische en preparatieve chromatografie hebben gerelateerde, maar verschillende toepassingen.

De analytische HPLC wordt voornamelijk gebruikt voor het onderzoeken van de samenstelling van een monster.

Preparat HPLC wordt gebruikt voor het fysiek verzamelen van gescheiden componenten.

Een chromatogram kan veel waardevolle informatie verschaffen.

Een grote hoofdpiek of een hoog percentage van het oppervlak ervan mag echter niet worden beschouwd als een volledige moleculaire karakterisering.

De chromatografieresultaten zijn onder andere afhankelijk van:

• kolomtype;
• bewegende fasen;
• verloop;
• temperaturen;
• detectiemethoden;
• golflengten;
• monsterbereiding;
• methoden voor piekintegratie;
• resoluties;
• eigenschappen van verontreinigingen.

Twee verbindingen kunnen potentieel op hetzelfde moment elueren.

Sommige componenten van het monster kunnen ook verschillend reageren op de gebruikte detector.

Daarom staat een hoge oppervlaktazuiverheid bij HPLC niet gelijk aan een volledige bevestiging van de moleculaire identiteit.

Onderzoek naar isobare peptide-onzuiverheden en chirale analyse laten zien waarom aanvullende analytische methoden nodig kunnen zijn. [12] [13]

De analytische methode moet aansluiten bij een concrete structurele vraag.

Identiteit, zuiverheid en gehalte betekenen verschillende dingen

Bij de karakterisering van peptiden zijn drie begrippen bijzonder belangrijk.

Identiteit beantwoordt de vraag:

Bevat het monster het beoogde deeltje?

Netheid beantwoordt de vraag:

Welke andere componenten bevinden zich in het monster of welk deel van het gemeten signaal komt overeen met de hoofdcomponent?

De inhoud beantwoordt de vraag:

Hoeveel werkelijk peptide bevindt zich in het monster?

Op deze vragen kan niet altijd met één enkele meting worden geantwoord.

Materiaal dat een peptide bevat, kan ook het volgende bevatten:

• water;
• tegenovergesteld;
• zool;
• oplosmiddelresten;
• andere ingrediënten die met het proces te maken hebben;
• vervuiling.

De totale massa van het afgewogen materiaal hoeft dus niet overeen te komen met de massa van het peptide zelf.

Evenmin bevestigt de overeenstemming van de gemeten molecuulmassa met de theorie:

• volledige aminozuursequentie;
• correcte koppeling van de afzonderlijke residuen;
• stereochemische integriteit;
• disulfidebrugformaties;
• plooien;
• gebrek aan isobare verontreinigingen.

Massaspectrometrie kan sterk bewijs leveren met betrekking tot de molecuulmassa.

Tandemmassaspectrometrie en andere structurele technieken kunnen aanvullende informatie over de sequentie verschaffen.

Chirale methoden maken het mogelijk stereochemische vraagstukken te analyseren die niet kunnen worden opgelost met een eenvoudige massabepaling.

W jednym z badań analitycznych uwzględniono nawet racemizację powstającą podczas przygotowania próbki. Pokazuje to kolejną ważną zasadę: sama procedura analityczna może powodować artefakty, jeśli nie zostanie odpowiednio zaprojektowana. [13]

Fałdowanie i aktywność mogą wymagać osobnego potwierdzenia

W przypadku strukturalnie ograniczonych peptydów i małych białek prawidłowa sekwencja oraz masa cząsteczkowa nadal mogą być niewystarczające do potwierdzenia zamierzonej struktury końcowej.

Dodatkowe pytania mogą obejmować:

• Czy powstały właściwe mostki disiarczkowe?
• Czy cząsteczka przyjęła oczekiwaną konformację?
• Czy cyklizacja jest kompletna?
• Czy obecne są izomery strukturalne?
• Czy syntetyczna cząsteczka wykazuje oczekiwaną aktywność w określonym teście eksperymentalnym?

W badaniu syntezy BPTI wykorzystano kilka metod analitycznych i biofizycznych wraz z oceną hamowania trypsyny. [3]

Łączne wyniki wspierały zgodność syntetycznego materiału o naturalnej sekwencji z naturalnym białkiem w zakresie badanych kryteriów.

Test aktywności odpowiada jednak na określone pytanie funkcjonalne.

Nie zastępuje analizy zanieczyszczeń.

Podobnie podobna aktywność w jednym teście nie potwierdza pełnej równoważności wszystkich właściwości biologicznych, strukturalnych czy produkcyjnych.

Skalowanie produkcji zmienia więcej niż tylko ilość materiału

Zwiększenie skali produkcji nie polega wyłącznie na proporcjonalnym zwiększeniu ilości wszystkich odczynników.

Procesy fizyczne mogą zachowywać się inaczej przy większej skali.

Znaczenie mogą mieć:

• mieszanie;
• wymiana ciepła;
• rozprowadzanie odczynników;
• dyfuzja;
• pęcznienie żywicy;
• ciśnienie;
• filtracja;
• gospodarka rozpuszczalnikami;
• neerslag;
• rozpuszczalność półproduktów;
• transport masy;
• możliwości systemu oczyszczania.

Czynniki te mogą wpływać zarówno na przebieg reakcji, jak i na powstawanie zanieczyszczeń.

Oczyszczanie na późniejszych etapach również może stać się wąskim gardłem całej produkcji.

Zwiększenie szybkości syntezy ma ograniczone znaczenie, jeśli system oczyszczania nie jest w stanie skutecznie rozdzielić powstających zanieczyszczeń lub odzyskać produktu o wymaganej jakości.

W analizie przemysłowej obejmującej 40 procesów syntezy peptydów z 14 firm farmaceutycznych oceniano zużycie materiałów podczas syntezy, oczyszczania i izolacji. [14]

Badanie pokazuje, dlaczego ocenę produkcji należy prowadzić dla całego procesu.

Nie oznacza jednak, że każda fabryka, sekwencja lub technologia produkcyjna osiąga identyczne wyniki.

Jakość produkcji jest wynikiem wielu elementów kontroli

Wiarygodna produkcja peptydów wymaga czegoś więcej niż uzyskania jednego satysfakcjonującego wyniku analitycznego.

Kontrolowany proces zazwyczaj obejmuje kilka powiązanych elementów:

zdefiniowana cząsteczka docelowa → odpowiednie materiały wyjściowe → kontrolowana synteza → kontrolowane oczyszczanie → właściwe pobieranie próbek → zwalidowana lub odpowiednia do celu analiza → dokumentacja partii.

Dokumentacja partii łączy wyniki analityczne z materiałem, który rzeczywiście został wyprodukowany.

Certyfikat analizy (COA) podsumowuje wybrane wyniki badań określonej partii.

Jego wartość informacyjna zależy od:

• rodzaju wykonanych badań;
• zastosowanych metod;
• przydatności tych metod;
• specyfikacji;
• identyfikacji próbki;
• możliwości prześledzenia partii;
• potwierdzenia, że raportowane wyniki rzeczywiście dotyczą danego materiału.

Pojedyncza wartość określana jako „czystość” nie może samodzielnie potwierdzić:

• pełnej tożsamości molekularnej;
• zawartości peptydu;
• stereochemische integriteit;
• poziomu pozostałości rozpuszczalników;
• zawartości wody;
• składu przeciwjonów;
• właściwości mikrobiologicznych;
• plooien;
• biologische activiteit;
• przydatności do określonego celu.

Odpowiedni zestaw analiz zależy od zamierzonego zastosowania materiału.

Peptyd wykorzystywany jako analityczny materiał odniesienia, odczynnik badawczy stosowany w eksperymencie komórkowym oraz materiał znajdujący się na etapie rozwoju farmaceutycznego mogą wymagać odpowiedzi na inne pytania jakościowe.

Dowody analityczne należy więc interpretować w jasno określonym kontekście, a nie jako uniwersalne potwierdzenie jakości.

Ocena zrównoważenia środowiskowego musi obejmować cały proces

Synteza peptydów może wymagać znacznych ilości rozpuszczalników i odczynników.

Ocena wpływu środowiskowego powinna więc uwzględniać znacznie więcej niż sam etap sprzęgania.

Do istotnych elementów mogą należeć:

• przygotowanie bloków budulcowych;
• odczynniki sprzęgające;
• odczynniki do odbezpieczania;
• spoelen;
• afscheiding;
• obróbka produktu;
• chromatografia;
• wymiana rozpuszczalników;
• izolacja;
• drogen;
• gospodarowanie odpadami.

Zmniejszenie obciążenia środowiskowego może wymagać równoczesnej poprawy kilku etapów.

W opublikowanej analizie dotyczącej produkcji peptydów omówiono problemy związane zarówno z syntezą, jak i oczyszczaniem oraz wskazano potrzebę ulepszania całego projektu procesu. [15]

Jako publikacja perspektywiczna nie stanowi ona kontrolowanego bezpośredniego porównania dowodzącego, że jedna konkretna technologia zawsze jest bardziej przyjazna środowisku.

Vergelijkbaar:

szybsza synteza nie oznacza automatycznie bardziej ekologicznej syntezy,

a mniejsze zużycie rozpuszczalników podczas samej syntezy nie oznacza automatycznie mniejszego wpływu całego procesu produkcyjnego.

Porównania środowiskowe wymagają stosowania spójnych granic analizy i najlepiej powinny odnosić zużycie zasobów do określonej ilości wyizolowanego i scharakteryzowanego produktu końcowego.

Veelgestelde vragen

1. Czym różni się synteza peptydów na fazie stałej od syntezy w fazie ciekłej?

W syntezie na fazie stałej rosnący peptyd pozostaje przyłączony do nierozpuszczalnego nośnika, natomiast w klasycznej syntezie w roztworze półprodukt peptydowy pozostaje rozpuszczony i zazwyczaj musi być odzyskiwany na podstawie swoich właściwości fizycznych i chemicznych. W węższym znaczeniu LPPS rozpuszczony rosnący łańcuch posiada dodatkowo rozpuszczalny znacznik lub nośnik ułatwiający późniejsze rozdzielanie. Badania syntezy znakowanej pokazują jedną ze strategii łączenia chemii roztworowej z odzyskiwaniem poprzez wytrącanie, natomiast literatura dotycząca LPPS odróżnia takie rozwiązania zarówno od klasycznej syntezy w roztworze, jak i od SPPS. Żadna metoda nie jest z definicji optymalna dla każdego peptydu. Podstawowa różnica dotyczy sposobu fizycznego prowadzenia i rozdzielania rosnącego łańcucha podczas kolejnych etapów syntezy. [8] [9]

2. Dlaczego podczas syntezy peptydów mogą powstawać zanieczyszczenia?

Zanieczyszczenia mogą powstawać dlatego, że zamierzone reakcje nie zawsze zachodzą ilościowo, a inne grupy funkcyjne mogą uczestniczyć w niepożądanych reakcjach. Niepełne sprzęganie może prowadzić do sekwencji delecyjnych, niepełne odbezpieczanie może zakłócać dalsze składanie łańcucha, a niektóre sekwencje są podatne na zmiany stereochemiczne, powstawanie aspartimidu, utlenianie, przegrupowania lub produkty uboczne związane z odszczepianiem. Badania syntezy Fmoc oraz analizy strukturalnej syntetycznych zanieczyszczeń peptydowych dokumentują kilka takich przykładów. [11] [12] Częstość i znaczenie poszczególnych zanieczyszczeń zależą od sekwencji i procesu, dlatego automatyzacji syntezy nie należy utożsamiać z całkowitym brakiem błędów chemicznych.

3. Jaką rolę pełni żywica w syntezie peptydów?

Żywica utrzymuje rosnący peptyd, podczas gdy rozpuszczalne odczynniki i wiele produktów ubocznych można usuwać pomiędzy kolejnymi etapami syntezy. Znacznie upraszcza to powtarzające się składanie łańcucha, ale żywica nie jest wyłącznie mechanicznym uchwytem. Jej pęcznienie, stopień obsadzenia, architektura polimeru, zgodność z rozpuszczalnikami i dostępność miejsc reakcji mogą wpływać na skuteczność docierania odczynników do przyłączonego peptydu. W badaniach z wykorzystaniem reaktora ze zmiennym złożem monitorowano zachowanie żywicy podczas analizy agregacji i efektywności sprzęgania. [4] Takie monitorowanie nie eliminuje błędów sekwencji, ale pokazuje, dlaczego fizyczny stan żywicy może być istotną zmienną procesową.

4. Do czego służy żywica Wanga w syntezie peptydów?

Nośniki typu Wang są powszechnie związane z przygotowywaniem peptydów uwalnianych po odpowiednim odszczepieniu z C-końcem w postaci kwasu karboksylowego. Dokładny produkt końcowy zależy jednak od linkera, architektury nośnika i zastosowanej chemii odszczepiania, a nie tylko od nazwy żywicy. Badacze przedstawili również specjalistyczną metodę przekształcania materiału peptydyl-Wang-TentaGel w hydrazydy peptydowe, które mogą służyć jako użyteczne półprodukty syntetyczne. [5] Alternatywna reakcja nie zmienia znaczenia standardowego odszczepiania z żywicy Wanga. Pokazuje natomiast, dlaczego podczas przewidywania produktu należy analizować cały system nośnika i warunki reakcji.

5. Czy SPPS buduje peptyd od N-końca czy od C-końca?

Klasyczna etapowa SPPS zazwyczaj rozpoczyna się od przyłączenia C-końcowej reszty do nośnika, po czym łańcuch jest wydłużany w kierunku N-końca. Jest to kierunek przeciwny do standardowego wydłużania łańcucha na rybosomie, gdzie białko rośnie poprzez dodawanie kolejnych aminokwasów do C-końca. Synteza BPTI jest przykładem wykorzystania zabezpieczonych bloków budulcowych i nośnika przed późniejszym uwolnieniem, oczyszczaniem i fałdowaniem produktu. [3] Istnieją jednak specjalistyczne strategie chemii peptydów wykorzystujące inne rozwiązania, dlatego budowanie od C- do N-końca należy określać jako klasyczne podejście SPPS, a nie bezwzględną zasadę wszystkich metod syntezy.

6. Dlaczego grupy ochronne są potrzebne?

Aminokwasy często zawierają kilka reaktywnych grup funkcyjnych. Grupy ochronne tymczasowo zapobiegają reakcji wybranych miejsc, pozostawiając odpowiednie miejsce dostępne w konkretnym etapie syntezy. Pomaga to kontrolować kolejność i sposób łączenia reszt. Bez właściwej ochrony konkurencyjne reakcje mogłyby prowadzić do powstawania złożonych mieszanin lub produktów o zmienionej strukturze. Badania dotyczące powstawania aspartimidu pokazały, że zmiana chemii ochrony grupy karboksylowej może ograniczać ważną reakcję uboczną w analizowanych sekwencjach. [2] Grupy ochronne nie gwarantują idealnego przebiegu syntezy, lecz zapewniają selektywną kontrolę chemiczną, która musi pozostać zgodna ze wszystkimi istotnymi etapami procesu.

7. Czym różnią się Fmoc i Boc?

Fmoc i Boc są szeroko stosowanymi tymczasowymi grupami chroniącymi grupę aminową, ale reagują na inne warunki chemiczne. Fmoc jest zazwyczaj usuwany w środowisku zasadowym, natomiast Boc jest wrażliwy na kwasy. Różnica ta wpływa na sposób łączenia ich z ochroną łańcuchów bocznych, linkerami i pozostałymi etapami syntezy. Synteza oparta na Fmoc jest szeroko wykorzystywana we współczesnej SPPS, ale badania wykazały również możliwość występowania zależnych od sekwencji reakcji ubocznych w takich warunkach. [11] W praktyce bardziej użyteczne jest więc porównywanie całych strategii ochrony i ich zgodności z daną sekwencją niż rozpatrywanie wyłącznie nazw dwóch grup ochronnych.

8. Co oznacza ochrona ortogonalna?

Ochrona ortogonalna oznacza, że jedną grupę ochronną można usunąć w warunkach, w których inna potrzebna grupa ochronna pozostaje wystarczająco stabilna, aby można było kontynuować syntezę. Pozwala to odsłaniać różne miejsca reaktywne na określonych etapach. Koncepcja ta ma podstawowe znaczenie podczas kontrolowanej syntezy złożonych peptydów. Ortogonalność jest jednak zależna od warunków, a nie absolutna: wielokrotna ekspozycja, charakter sekwencji i parametry reakcji nadal mogą prowadzić do reakcji ubocznych. Badania alternatywnych sposobów ochrony grup karboksylowych pokazują, jak strategię ochrony można modyfikować w celu kontrolowania trudnej chemii peptydowej. [2]

9. Czym jest sekwencja delecyjna?

Sekwencja delecyjna to peptyd pozbawiony jednej lub kilku reszt obecnych w zamierzonej sekwencji docelowej. Może powstać, gdy etap sprzęgania aminokwasu nie zachodzi całkowicie, ale nieprzereagowany łańcuch pozostaje przyłączony do nośnika i uczestniczy w kolejnych cyklach. Ponieważ nieprawidłowy łańcuch nadal pozostaje związany z żywicą, zwykłe przemywanie nie musi go usunąć. Badania monitorowania SPPS w czasie rzeczywistym wskazują niepełne tworzenie wiązań amidowych jako ważny problem procesowy. [4] Sekwencja delecyjna jest więc problemem związanym ze strukturą i tożsamością produktu, a nie jedynie pozostałością odczynnika.

10. Czy dwa zanieczyszczenia peptydowe mogą mieć taką samą masę cząsteczkową?

Tak. Różne struktury molekularne mogą mieć identyczną lub nierozróżnialną masę nominalną. Z tego powodu sama zgodność masy nie potwierdza pełnej tożsamości cząsteczki. W badaniach syntetycznego peptydu będącego substratem reniny zidentyfikowano izobaryczne składniki zanieczyszczeń, w których modyfikacje występowały w różnych pozycjach. Derywatyzacja i tandemowa spektrometria mas dostarczyły dodatkowych informacji strukturalnych. [12] Przykład ten pokazuje, dlaczego zgodność obserwowanej masy z oczekiwaną nie może samodzielnie potwierdzić właściwej sekwencji, łączności, stereochemii ani braku strukturalnie podobnych izomerów.

11. Czym są epimeryzacja i racemizacja w syntezie peptydów?

Epimeryzacja i racemizacja dotyczą niepożądanych zmian konfiguracji stereochemicznej. Mogą one zachodzić bez zmiany nominalnej sekwencji aminokwasowej lub masy cząsteczkowej, dlatego zwykły pomiar masy może nie wykazać różnicy strukturalnej. W badaniach syntezy Fmoc wspomaganej mikrofalami zidentyfikowano reszty podatne na zmiany stereochemiczne i wykazano, że modyfikacja warunków reakcji może ograniczać takie procesy. [11] Ryzyko zależy od bloku budulcowego, sekwencji i warunków procesu. Jakość stereochemiczna wymaga więc metod analitycznych zdolnych do oceny konfiguracji, a nie może być wnioskowana wyłącznie na podstawie masy cząsteczkowej.

12. Czym jest powstawanie aspartimidu?

Powstawanie aspartimidu jest niepożądaną reakcją związaną z określonymi sekwencjami zawierającymi asparaginian. Powstanie cyklicznego półproduktu może prowadzić do kolejnych produktów o zmienionej łączności szkieletu lub stereochemii, zmniejszając wydajność i utrudniając oczyszczanie. Badacze analizowali alternatywne strategie ochrony zaprojektowane w celu ograniczenia tej reakcji w wybranych peptydach i białkach. [2] Wyniki nie wskazują jednego uniwersalnego rozwiązania dla wszystkich sekwencji zawierających asparaginian. Pokazują natomiast, dlaczego projektowanie syntezy i strategii kontroli zanieczyszczeń musi uwzględniać specyficzne zachowanie chemiczne danej sekwencji.

13. Czy wysoka czystość HPLC potwierdza prawidłową tożsamość peptydu?

Nie. Czystość HPLC opisuje próbkę w ramach konkretnego rozdziału chromatograficznego, zastosowanego detektora i sposobu analizy danych. Wysoki udział powierzchni głównego piku może być wartościowym dowodem, że próbka jest zdominowana przez jeden chromatograficznie rozdzielony składnik, ale nie potwierdza samodzielnie pełnej tożsamości molekularnej. Współeluujące zanieczyszczenia, stereoizomery i inne warianty mogą wymagać dodatkowych technik. W badaniach analizy chiralnej peptydów wykorzystano specjalnie zaprojektowany proces, który uwzględniał również zmiany stereochemiczne powstające podczas przygotowania próbki. [13] Tożsamość i czystość należy więc traktować jako powiązane, ale odrębne pytania analityczne.

14. Czy wydajność produktu oczyszczonego oznacza to samo co czystość?

Nie. Wydajność produktu oczyszczonego lub wyizolowanego określa ilość odzyskanego materiału docelowego względem zdefiniowanej ilości początkowej lub teoretycznej. Czystość opisuje natomiast skład odzyskanego materiału według określonej metody analitycznej. Synteza może prowadzić do uzyskania stosunkowo niewielkiej ilości produktu o bardzo wysokiej czystości albo dużej ilości materiału surowego zawierającego znaczną ilość zanieczyszczeń. W badaniach automatycznej syntezy przepływowej czystość surowego produktu i wydajność po izolacji raportowano oddzielnie. [7] Rozdzielenie tych parametrów zapobiega błędnemu traktowaniu wysokiej wartości jednego z nich jako dowodu wysokiej wartości drugiego.

15. Czy długie peptydy można wytwarzać poprzez łączenie krótszych fragmentów?

Tak. W strategii fragmentowej krótsze segmenty peptydowe mogą zostać przygotowane oddzielnie, a następnie połączone za pomocą odpowiedniej chemii. Natwywna ligacja chemiczna była ważnym przykładem, w którym niezabezpieczone fragmenty peptydowe połączono w sposób prowadzący do powstania naturalnego wiązania szkieletu peptydowego, a następnie uzyskano pofałdowane białko. [10] Nie oznacza to, że dowolne fragmenty peptydowe mogą łączyć się spontanicznie. Należy uwzględnić strukturę fragmentów, chemię łączenia, wybór miejsca połączenia, rozpuszczalność, stereochemię i wymagania dotyczące oczyszczania. Składanie fragmentów jest więc alternatywną strategią projektowania syntezy, a nie automatycznym rozwiązaniem problemów związanych z długimi peptydami.

16. Czy szybsza zautomatyzowana synteza eliminuje potrzebę oczyszczania?

Nie. Szybsze zautomatyzowane lub przepływowe składanie skraca czas określonych etapów syntezy, ale nie dowodzi, że każda powstała cząsteczka ma zamierzoną strukturę. W badaniach szybkiej syntezy przepływowej nadal charakteryzowano materiał surowy i stosowano późniejsze oczyszczanie, a w kolejnych pracach dotyczących automatyzacji osobno porównywano czystość surowego materiału i wydajność po izolacji. [6] [7] Dobre wyniki systemu dla badanych sekwencji nie gwarantują również identycznych rezultatów dla każdego nowego celu. Przyspieszona synteza nadal musi być połączona z odpowiednim oczyszczaniem, potwierdzeniem tożsamości, analizą zanieczyszczeń i charakterystyką końcową.

17. Dlaczego zwiększenie skali produkcji jest bardziej skomplikowane niż przygotowanie większej partii?

Zwiększenie skali zmienia warunki fizyczne i chemiczne, a nie tylko ilość materiału. Mieszanie, wymiana ciepła, pęcznienie żywicy, dystrybucja odczynników, ciśnienie, filtracja, obsługa rozpuszczalników, rozpuszczalność półproduktów i możliwości systemu oczyszczania mogą zachowywać się inaczej przy większej objętości produkcji. W analizie przemysłowej 40 procesów peptydowych osobno oceniano syntezę, oczyszczanie i izolację podczas analizy zużycia materiałów. [14] Wyniki pokazują, dlaczego produkcję trzeba rozpatrywać jako kompletny proces. Skalowalna metoda musi powtarzalnie prowadzić do uzyskania scharakteryzowanego materiału na wszystkich etapach, a nie tylko większej ilości surowego peptydu.

18. Czy peptyd jest gotowy od razu po złożeniu prawidłowej sekwencji?

Niekoniecznie. Złożenie łańcucha tworzy szkielet sekwencji tylko w takim zakresie, w jakim potwierdzają to proces i dane analityczne. W zależności od cząsteczki mogą być nadal potrzebne odbezpieczanie, odszczepianie, cyklizacja, utlenianie, tworzenie mostków disiarczkowych, fałdowanie, koniugacja, oczyszczanie i charakterystyka. Synteza BPTI stanowi dobry przykład procesu, w którym po złożeniu liniowej sekwencji następowało oczyszczanie i tworzenie pofałdowanej struktury zawierającej mostki disiarczkowe. [3] Określenie „gotowy peptyd” powinno więc odnosić się do formy molekularnej wymaganej w danym kontekście naukowym, a nie tylko do zakończenia etapowego dodawania aminokwasów.

19. Czy prawidłowa masa cząsteczkowa potwierdza prawidłową sekwencję peptydu?

Nie. Zgodność masy cząsteczkowej jest wartościowym dowodem, ale nie może samodzielnie potwierdzić pełnej sekwencji ani struktury molekularnej. Struktury izobaryczne mogą mieć tę samą masę, a różnice stereochemiczne mogą w ogóle nie powodować zmiany masy cząsteczkowej. Badania zanieczyszczeń syntetycznych peptydów pokazały, że rozróżnienie strukturalnie odmiennych składników może wymagać tandemowej spektrometrii mas i dodatkowych analiz. [12] W przypadku pytań dotyczących integralności stereochemicznej mogą być potrzebne również metody chiralne. [13] Masę cząsteczkową należy więc traktować jako jeden z elementów oceny tożsamości, a nie jej pełne potwierdzenie.

20. Dlaczego oczyszczanie należy traktować jako część produkcji peptydu, a nie tylko końcowy dodatek?

Oczyszczanie decyduje o tym, czy docelowy peptyd można skutecznie oddzielić od sekwencji delecyjnych, produktów ubocznych, pozostałości odczynników, strukturalnie podobnych zanieczyszczeń i innych składników powstałych podczas syntezy. Metoda pozwalająca bardzo szybko wytwarzać duże ilości surowego materiału może nadal być niepraktyczna, jeśli nie da się skutecznie odzyskać docelowego produktu o wymaganej jakości. Z tego powodu analizy przemysłowe procesów peptydowych uwzględniają razem syntezę, oczyszczanie i izolację. [14] Efektywność produkcji należy ostatecznie oceniać na podstawie ilości i właściwości wyizolowanego materiału końcowego, a nie wyłącznie szybkości syntezy.

Ograniczenia przy porównywaniu metod syntezy peptydów

Podczas interpretowania badań porównujących technologie produkcji peptydów należy pamiętać o kilku istotnych ograniczeniach.

Po pierwsze, sekwencja silnie wpływa na trudność syntezy. Metoda sprawdzająca się dla jednego peptydu nie musi działać tak samo dla innego. Agregacja, hydrofobowość, skład aminokwasowy, długość, tendencja do tworzenia struktur drugorzędowych i podatność na reakcje uboczne mogą zmieniać zachowanie procesu. [1] [4]

Po drugie, czystość materiału surowego, wydajność po izolacji, czystość końcowa i zawartość peptydu są różnymi parametrami. Porównywanie metod wyłącznie na podstawie jednego z nich może dawać niepełny obraz efektywności produkcji. [7]

Po trzecie, szybkie składanie łańcucha nie oznacza szybkiej produkcji całego materiału. Odszczepianie, oczyszczanie, izolacja, końcowe kształtowanie struktury, badania analityczne i dokumentacja również wpływają na całkowity czas produkcji. [6] [7]

Po czwarte, czystość analityczna zależy od zastosowanej metody. HPLC, spektrometria mas, tandemowa spektrometria mas i analiza chiralna odpowiadają na różne pytania. Jeden wynik analityczny nie musi potwierdzać pełnej tożsamości strukturalnej. [12] [13]

Po piąte, skala wpływa na zachowanie procesu. Wyników syntezy laboratoryjnej nie można automatycznie przenosić na produkcję przemysłową bez oceny mieszania, transportu masy, możliwości oczyszczania, zużycia materiałów i innych czynników zależnych od skali. [14]

Po szóste, historyczne porównania ekonomiczne mogą z czasem tracić aktualność. Koszty odczynników, poziom automatyzacji, technologie ekspresji, wyposażenie do oczyszczania, odzyskiwanie rozpuszczalników i infrastruktura produkcyjna stale się rozwijają. Starsze analizy kosztów mogą nadal mieć znaczenie naukowe, ale nie muszą odzwierciedlać aktualnej ekonomiki rynku. [1]

Po siódme, porównania środowiskowe wymagają spójnych granic analizy. Ocena zużycia rozpuszczalników podczas samego składania łańcucha przy jednoczesnym pominięciu oczyszczania i izolacji może prowadzić do mylących wniosków dotyczących zrównoważenia procesu. [14] [15]

Wreszcie sama nazwa metody nie określa jakości produktu. SPPS, synteza w roztworze, LPPS, ligacja fragmentów oraz ekspresja biologiczna mogą prowadzić do uzyskania materiału wysokiej jakości, jeśli proces został odpowiednio zaprojektowany i kontrolowany. Żadna z tych metod nie gwarantuje jednak automatycznie właściwej tożsamości, czystości, stereochemii, fałdowania czy przydatności do konkretnego zastosowania.

Samenvatting

Syntezę peptydów najlepiej rozumieć jako kontrolowany proces wytwarzania cząsteczek, a nie po prostu tworzenie wiązań peptydowych.

Celem jest zbudowanie określonej sekwencji aminokwasowej przy jednoczesnym kontrolowaniu sposobu połączenia reszt, chemii grup ochronnych, stereochemii, reakcji ubocznych i wszelkich dodatkowych wymagań strukturalnych.

Synteza peptydów na fazie stałej utrzymuje rosnący łańcuch na nierozpuszczalnym nośniku, dzięki czemu powtarzane etapy sprzęgania i przemywania dobrze nadają się do automatyzacji. Zalety związane z powtarzalnym składaniem nie eliminują jednak problemów takich jak niepełne reakcje, agregacja, sekwencje delecyjne czy zależne od sekwencji reakcje uboczne. [4] [6] [7]

Klasyczna synteza w roztworze utrzymuje półprodukty peptydowe w fazie ciekłej i może zapewniać większą elastyczność w izolowaniu oraz charakteryzowaniu poszczególnych produktów pośrednich. Wielokrotne rozdzielanie oraz pogarszająca się rozpuszczalność mogą jednak stać się poważnymi ograniczeniami.

Metody syntezy w fazie ciekłej z rozpuszczalnymi znacznikami próbują połączyć chemię roztworową z zaprojektowanymi strategiami odzyskiwania materiału. Mogą więc stanowić dodatkową możliwość w przypadku sekwencji i problemów produkcyjnych, dla których klasyczna SPPS nie jest optymalna. [8] [9]

Dłuższe lub szczególnie trudne cząsteczki można również przygotowywać poprzez składanie fragmentów, w tym natywną ligację chemiczną, zamiast polegać wyłącznie na nieprzerwanym dodawaniu kolejnych reszt aminokwasowych. [10]

Niezależnie od wybranej metody składania efektywność sprzęgania i chemia grup ochronnych pozostają kluczowe, ponieważ niewielkie nieefektywności i reakcje uboczne mogą kumulować się podczas kolejnych etapów syntezy. Powstawanie aspartimidu, sekwencje delecyjne i zmiany stereochemiczne pokazują, dlaczego sama zamierzona sekwencja nie opisuje wszystkiego, co może powstać podczas procesu. [2] [11] [12]

Praca nie kończy się również wraz ze złożeniem łańcucha.

Oczyszczanie decyduje o tym, czy produkt docelowy można oddzielić od innych składników.

Następnie odpowiednio dobrane metody analityczne odpowiadają na odrębne pytania dotyczące tożsamości, czystości, zawartości, stereochemii, konformacji oraz – jeśli ma to znaczenie – aktywności funkcjonalnej. [3] [12] [13]

Zwiększenie skali produkcji wprowadza kolejne zagadnienia dotyczące transportu masy, zachowania żywicy, zużycia rozpuszczalników, filtracji, możliwości oczyszczania, powtarzalności procesu i jego wpływu środowiskowego. Z tego powodu przemysłowa ocena procesu powinna obejmować razem syntezę, oczyszczanie i izolację, a nie koncentrować się wyłącznie na szybkości sprzęgania. [14] [15]

Najważniejsza zasada jest następująca:

skuteczna produkcja peptydu wymaga kontroli całego procesu – od projektu molekularnego i tworzenia wiązań aż po oczyszczanie oraz charakterystykę strukturalną. Uzyskanie łańcucha o oczekiwanej nominalnej masie lub wysokiego głównego piku chromatograficznego stanowi wartościowy dowód, ale żaden z tych parametrów samodzielnie nie potwierdza pełnej tożsamości molekularnej ani jakości procesu produkcyjnego.

Disclaimer

Artykuł ma wyłącznie charakter edukacyjny i naukowo-informacyjny. Opisuje ogólne zasady chemii peptydów, syntezy na fazie stałej, syntezy w roztworze i w fazie ciekłej, strategii grup ochronnych, sprzęgania, oczyszczania, charakterystyki analitycznej, procesów produkcyjnych oraz przykłady pochodzące z opublikowanych badań. Nie jest protokołem laboratoryjnym, instrukcją produkcyjną, poradą medyczną, przewodnikiem dotyczącym dawkowania lub podawania ani certyfikatem jakości jakiegokolwiek konkretnego produktu peptydowego. Wyniki eksperymentalne należy interpretować w kontekście sekwencji, zastosowanych metod, skali procesu, technik analitycznych i ograniczeń poszczególnych badań.

Referenties

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K., & Perczel, A. (2016). Bacterial expression and/or solid phase peptide synthesis of 20-40 amino acid long polypeptides and miniproteins, the case study of Class B GPCR ligands. Current Protein & Peptide Science, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Prevention of aspartimide formation during peptide synthesis using cyanosulfurylides as carboxylic acid-protecting groups. Nature Communications, 11(1), Article 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). Solid-phase synthesis of bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) and two analogues. A chemical approach for evaluating the role of disulfide bridges in protein folding and stability. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. PubMed record
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). Real-time monitoring of solid-phase peptide synthesis using a variable bed flow reactor. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F., & Becker, C. F. W. (2015). Efficient generation of peptide hydrazides via direct hydrazinolysis of Peptidyl-Wang-TentaGel resins. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Rapid flow-based peptide synthesis. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2017). A fully automated flow-based approach for accelerated peptide synthesis. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G., & Albericio, F. (2022). Liquid-phase peptide synthesis (LPPS): A third wave for the preparation of peptides. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T., & Fukui, T. (2012). Novel diphenylmethyl-derived amide protecting group for efficient liquid-phase peptide synthesis: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., & Kent, S. B. (1994). Synthesis of proteins by native chemical ligation. Science, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Characterization of impurities in a synthetic renin substrate peptide by fast-atom bombardment mass spectrometry and hybrid tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G., & Crowther, J. B. (1995). Peptide chiral purity determination: Hydrolysis in deuterated acid, derivatization with Marfey’s reagent and analysis using high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Process mass intensity (PMI): A holistic analysis of current peptide manufacturing processes informs sustainability in peptide synthesis. The Journal of Organic Chemistry, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Sustainability challenges in peptide synthesis and purification: From R&D to production. The Journal of Organic Chemistry, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001