Peptidien synteesi: kiinteän faasin menetelmä, liuoksessa tapahtuva menetelmä ja tuotantomenetelmät

Peptidien synteesi on hallittu prosessi, jossa muodostetaan tietyn sekvenssin omaavia aminohappoketjuja. Kemiallisessa synteesissä valitut aminohapot yhdistetään peptidirakenteita, samalla kun hallitaan näissä molekyyleissä esiintyviä muita reaktiivisia ryhmiä. Tavoitteena ei siis ole pelkästään aminohappojen liittäminen toisiinsa, vaan tietyn molekyylirakenteen aikaansaaminen, jolla on määritelty sekvenssi, stereokemia, ketjun päiden rakenne ja – tarvittaessa – muita rakenteellisia ominaisuuksia.

Tärkeimpiä menetelmiä ovat peptidien kiinteävaihesynteesi (SPPS), perinteinen liuossynteesi sekä uudemmat nestevaihepeptidisyntetisointimenetelmät (LPPS), joissa käytetään liukoisia kantajia tai molekyylimerkkejä. Tutkimuslaboratoriot ja tuotantolaitokset voivat myös yhdistellä erilaisia lähestymistapoja, valmistaa lyhyempiä fragmentteja erikseen ja liittää ne sitten toisiinsa tai käyttää biologista ilmentymistä, jos se sopii paremmin kyseiselle sekvenssille.

Kun verrataan kemiallista synteesiä ja bakteereissa tapahtuvaa 20–40 aminohappotähteestä koostuvien polypeptidien ilmentymistä, käy ilmi tärkeä periaate: tuotantomenetelmän käytännön valinta riippuu kyseisestä molekyylistä, sen sekvenssistä, taipumuksesta aggregoitua, vaadituista modifikaatioista, tuotantomittakaavasta sekä analyyttisistä vaatimuksista. [1]

Halutun aminohapposekvenssin saaminen on vain yksi peptidin valmistuksen vaiheista.

Koko prosessi voi sisältää seuraavat vaiheet:

sekvenssien suunnittelu → rakennuspalikoiden valmistelu → funktionaalisten ryhmien suojaaminen → kytkentä → suojaryhmien poisto → ketjun kokoaminen → fragmenttien irrottaminen tai yhdistäminen → rakenteen lopullinen muotoilu → puhdistus → identiteetin vahvistaminen → epäpuhtauksien analysointiepäpuhtauksien analyysi → pitoisuuksien määrittäminen → lopullinen karakterisointi.

Joidenkin peptidien valmistuksessa tarvitaan myös lisävaiheita, kuten syklisointi, disulfidisiltojen muodostaminen, taitto, konjugaatio tai muut kemialliset modifikaatiot.

Tästä syystä ketjun oikea rakenne ei tarkoita automaattisesti, että lopputuotteella olisi oikea identiteetti, puhtaus, stereokemia, konformaatio, stabiilisuus tai muut vaaditut ominaisuudet.

Mitä peptidien synteesi on?

Tietyn aminohapposekvenssin muodostaminen

Peptidi koostuu aminohappojen jäännöksistä, jotka on yhdistetty peptidisidoksilla.

Peptidin synteesin tavoitteena on muodostaa nämä sidokset ennalta määritellyssä järjestyksessä, usein samalla kun kontrolloidaan:

• erilaisia aminohappoja;
• aminohappojen järjestys sekvenssissä;
• stereokemia;
• N:n lopun rakenne;
• C-lopun rakenteet;
• sivuketjujen muokkaaminen;
• disulfidisiltojen sijoittelu;
• syklisaatio;
• muut vaaditut rakenteelliset ominaisuudet.

Sekvenssillä on ratkaiseva merkitys, sillä sama aminohappokoostumus voi johtaa erilaisten molekyylien muodostumiseen, jos aminohapot esiintyvät eri järjestyksessä.

Väite, että tietty molekyyli on „viidestä aminohaposta koostuva peptidi”, antaa siis hyvin vähän tietoa sen todellisesta rakenteesta. Jotta molekyyliä voitaisiin kuvata oikein, on tiedettävä aminohappojen tyypit, niiden järjestys, stereokemia, pääteryhmät sekä mahdolliset lisämuunnokset.

Kahdella peptidillä voi siis olla täsmälleen sama aminohappokoostumus, mutta ne voivat silti olla molekyylirakenteeltaan erilaisia.

Muita eroja voi aiheutua ketjun päiden modifikaatioista, disulfidisiltojen esiintymisestä, syklisestä runkorakenteesta, sivuketjujen muutoksista tai erilaisesta stereokemiallisesta konfiguraatiosta.

Peptidien kemiallisessa synteesissä käytetään yleensä aminohappoja, joiden reaktiiviset ryhmät on suojattu selektiivisesti.

Väliaikaiset suojaryhmät mahdollistavat tietyn halutun kemiallisen sidoksen muodostumisen ja rajoittavat samalla kilpailevia reaktioita molekyylin muissa kohdissa.

Seuraavissa suunnitelluissa synteesivaiheissa nämä ryhmät poistetaan tai muutetaan.

Hallittu reaktio spontaanin yhdistymisen sijaan

Perusluonteisissa kemiallisissa kuvauksissa peptidisidoksen muodostuminen esitetään usein kondensaatioreaktiona, jossa kaksi aminohappoa yhdistyy ja samalla vapautuu yksi vesimolekyyli.

Tällainen yhtälö kuvaa reaktion yleistä tasapainoa.

Sitä ei kuitenkaan pidä sekoittaa siihen, miten peptidien kontrolloitu synteesi käytännössä toteutetaan.

Pelkästään vapaiden aminohappojen sekoittaminen ei riittäisi luotettavan määrittämiseen:

• mikä aminoryhmä on tarkoitus saada reagoimaan;
• mikä karboksyyliryhmä on tarkoitus saada reagoimaan;
• mikä aminohappo tulee sijoittaa ensimmäiseksi;
• joka tulee sijoittumaan toiseksi;
• alkavatko sivuketjut reagoida;
• säilyykö stereokemia;
• eikö syntyisi lukuisia ei-toivottuja tuotteita.

Käytännön kemiallisessa synteesissä sovelletaan siis hallittuja strategioita toiminnallisten ryhmien aktivoimiseksi ja suojaamiseksi.

Karboksyyliryhmästä peräisin oleva ryhmä aktivoidaan yleensä siten, että se voi reagoida tehokkaasti valitun amiiniryhmän kanssa. Suojaryhmät, reaktiotilanne, kantajan kemiallinen rakenne, kytkentäreagenssit, liuotinympäristö sekä eristysmenetelmät auttavat yhdessä ohjaamaan reaktiota kohti tavoiteltua tuotetta.

Peptidin tehokas synteesi edellyttää siis sekä tapahtuvan kemiallisen reaktion että estettävän reaktion hallintaa.

Hyvä esimerkki on aspartamidin muodostuminen.

Tutkijat kehittivät vaihtoehtoisen menetelmän karboksyyliryhmän suojaamiseksi, jonka tarkoituksena oli rajoittaa tätä ongelmallista sivureaktiota peptidin muodostumisen aikana. [2]

Tutkimus osoittaa peptidikemian laajemman periaatteen: ei-toivottujen molekyylimuutosten estäminen voi olla yhtä tärkeää kuin oikean peptidisidoksen muodostaminen.

Milloin peptidi voidaan katsoa valmiiksi?

Peptidin lineaarisen rakenteen muodostumisen päättyminen ei aina tarkoita koko synteesin päättymistä.

Kohdemolekyylistä riippuen ketjun kokoamisen jälkeen saatetaan tarvita lisävaiheita.

Niihin voivat kuulua:

• suojaryhmien täydellinen poistaminen;
• peptidin irrottaminen kiinteästä kantajasta;
• väliaikaisten merkintöjen poistaminen;
• syklisaatio;
• hapettuminen;
• disulfidisiltojen muodostuminen;
• taittaminen;
• konjugaatio;
• ketjun päiden muokkaaminen;
• puhdistus;
• analyyttiset ominaisuudet.

Jotkut peptidit vaativat suhteellisen vähän lisärakenteellisia muutoksia ketjun muodostumisen jälkeen.

Muissa tapauksissa myöhemmät vaiheet ovat ratkaisevan tärkeitä.

Hyvä esimerkki on naudan haiman trypsiinin estäjän (BPTI) synteesi. Tutkijat koostivat lineaarisen sekvenssin, puhdistivat materiaalin ja saivat lopulta aikaan poimuisen rakenteen, joka sisälsi disulfidisiltoja. Tutkimuksessa esitettyjen analyysien ja toiminnallisten vertailujen mukaan lopullinen materiaali, jolla oli luonnollinen sekvenssi, vastasi luonnollista proteiinia tutkittujen parametrien osalta. [3]

Tämä esimerkki havainnollistaa eron peptidirungon muodostumisen ja täysin karakterisoidun lopullisen molekyylimuodon saamisen välillä.

Menetelmä, jolla saadaan oikea lineaarinen sekvenssi, ei automaattisesti vahvista:

• oikea taittaminen;
• disulfidisiltojen oikea sijoittelu;
• biologinen aktiivisuus;
• vakauden;
• päästöprofiili;
• soveltuvuus tiettyyn käyttötarkoitukseen.

Jokainen näistä seikoista vaatii erillisiä todisteita.

Kemiallinen synteesi, biologinen ilmentyminen ja yhdistelmämenetelmät

Peptidien kemiallisessa synteesissä aiemmin valmistetut molekyylilohkot yhdistetään kontrolloiduissa laboratorioreaktioissa.

Biologisessa ilmentymisessä puolestaan hyödynnetään solun koneistoa koodatun aminohapposekvenssin tuottamiseksi. Sen jälkeen aineisto on erotettava, puhdistettava ja tarvittaessa käsiteltävä edelleen.

Molemmat menetelmät voivat johtaa peptidien tai polypeptidien muodostumiseen, mutta niihin liittyy erilaisia mahdollisuuksia ja rajoituksia.

Kemiallinen synteesi voi olla erityisen hyödyllistä, kun tarvitaan:

• valitut epätyypilliset aminohapot;
• kemialliset muutokset tietyissä kohdissa;
• tietyt ketjun päiden rakenteet;
• isotooppimerkit;
• peptidirungon modifikaatiot;
• muut ominaisuudet, joita on vaikea saavuttaa tavanomaisella biologisella ilmentymisellä.

Biologinen ilmentyminen voi olla houkutteleva vaihtoehto sopivien pidempien sekvenssien tai tiettyjen merkintästrategioiden tapauksessa, mutta se ei poista myöhemmissä tuotantovaiheissa esiintyviä ongelmia.

Lisäksi on otettava huomioon materiaalin talteenotto, taitto, käsittely, isäntäorganismista peräisin olevat epäpuhtaudet, puhdistus ja analyyttiset ominaisuudet.

Mikään menetelmistä ei siis ole yleisesti ottaen paras.

Kun verrattiin 20–40 aminohappotähteestä koostuvia polypeptidejä, sekä sekvenssin pituus että sen taipumus aggregoitua vaikuttivat kiinteän faasin synteesin ja bakteeriekspression tuloksiin. [1]

Nämä havainnot tukevat lähestymistapaa, jossa tuotantomenetelmä valitaan kunkin molekyylin mukaan.

Tuotantotehoa, kustannuksia, laitteistoa ja tuotantoaikaa koskevia historiallisia tietoja ei tule pitää yleispätevinä nykyarvoina, sillä teknologiat, reagenssit, automaatio, puhdistusmenetelmät ja tuotannon taloudellisuus muuttuvat teknologian kehittyessä.

Peptidien synteesi kiinteässä faasissa

Kasvava ketju on kiinnitetty liukenemattomaan kantajaan

Kiinteän faasin peptidisynteesissä (SPPS) kasvava peptidiketju pysyy kiinnittyneenä liukenemattomaan kantajaan peräkkäisten synteesikierrosten aikana.

Kantajana käytetään useimmiten funktionalisoitua polymeerihartsia.

Linkkeri sitoo peptidin kantajaan ja vaikuttaa muun muassa valmiin ketjun myöhempään vapautumiseen sekä saadun pääteryhmän tyyppiin.

Yksi SPPS:n tärkeimmistä käytännön eduista on materiaalin helpompi erottelu.

Kun tietty reaktiovaihe on päättynyt, liukoiset reagenssit ja monet liukoiset sivutuotteet voidaan poistaa pesemällä, kun taas kasvava peptidi jää sitoutuneena kiinteään faasiin.

Tämän ansiosta kasvavaa peptidiä ei tarvitse eristää ja puhdistaa jokaisen uuden aminohapon lisäämisen jälkeen erillisenä, vapaana yhdisteenä.

Tämä mukavuus voi kuitenkin johtaa merkittävään väärinkäsitykseen.

Hartsin pesu ei tarkoita, että kaikki virheelliset peptidit olisi poistettu.

Jos hartsin kiinnitetty ketju ei reagoi yhden kytkentävaiheen aikana, se voi jäädä edelleen alustalle.

Seuraavissa sykleissä se voi reagoida uudelleen ja pidentyä edelleen.

Tämän seurauksena voi syntyä deleetiosekvenssi, eli molekyyli, joka eroaa kohdepeptidistä yhden tai useamman aminohappotähteen puuttumisen vuoksi.

Vastaavasti kemiallisesti modifioidut tai osittain suojauksesta vapautetut, hartsin kanssa sitoutuneet ketjut voivat osallistua synteesin myöhempiin vaiheisiin.

SPPS helpottaa siis liukoisten aineiden erottamista hartsin sitomasta materiaalista.

Se ei kuitenkaan takaa sekvenssien täydellistä yhteensopivuutta.

Toistuva lukituksen avaamisen ja kiinnittämisen sykli

Tyypillinen vaiheittainen SPPS-synteesi koostuu kolmen perusvaiheen toistamisesta:

irrottaminen → kiinnittäminen → pesu.

Ensin paljastuu kasvavan ketjun päässä oleva reaktiivinen aminoryhmä.

Sen jälkeen ketjuun liitetään seuraava suojattu aminohappo.

Liukoiset reagenssit, ylimääräinen aminohappo ja monet reaktiotuotteet poistetaan ennen seuraavan syklin aloittamista.

Tämän prosessin toistaminen mahdollistaa peptidin rakentamisen yksi aminohappotähde kerrallaan.

Klassisessa SPPS-menetelmässä C-päätyinen jäännös liitetään yleensä ensin kantajaan, minkä jälkeen ketju pitenee N-päätä kohti.

Tämä eroaa tavanomaisesta ribosomaalisesta proteiinisynteesistä, jossa aminohapot liitetään yksi kerrallaan kasvavan ketjun C-päähän.

Aminohappojen lopullinen järjestys voi kuitenkin olla sama, vaikka muodostumisprosessin suunta ja kemialliset mekanismit ovat erilaiset.

Termiä „sykli” ei tule ymmärtää yhtenä yleispätevänä reaktio-olosuhteiden kokonaisuutena, joka sopisi jokaiselle jäännösryhmälle ja jokaiselle sekvenssille.

Reaktion kulku voi riippua seuraavista tekijöistä:

• suojeluryhmien strategiat;
• aminohappotyyppi;
• reaktiopaikan ympäristön tilavaatimukset;
• hartsin tyyppi;
• linkkeri;
• ketjun pituus;
• aggregointi;
• liuotinta;
• konjugaatiokemia;
• kasvavan peptidin rakenteellisen käyttäytymisen.

Reaktio, joka etenee helposti synteesin alkuvaiheessa, voi muuttua huomattavasti vaikeammaksi myöhemmässä vaiheessa.

Siksi prosessin seuranta on edelleen tärkeää jopa pitkälle automatisoiduissa järjestelmissä.

Miksi hartsin ominaisuuksilla on merkitystä?

Kiinteä kiinnike ei ole pelkkä passiivinen pidike.

Sen fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet voivat vaikuttaa suoraan reaktion kulkuun.

Yksi tärkeistä parametreista on turpoaminen.

Jos hartsi turpoaa asianmukaisesti valitussa liuotinympäristössä, reagenssit pääsevät helpommin reaktiivisiin kohtiin, jotka sijaitsevat koko polymeerin rakenteessa.

Riittämätön turpoaminen tai hartsin rakenteen muutokset voivat rajoittaa tätä pääsyä.

Myös seuraavilla voi olla merkitystä:

• istutustiheys;
• polymeerin rakenne;
• linkkerin rakenne;
• yhteensopivuus liuottimien kanssa;
• mekaaninen lujuus;
• huokoisuus;
• diffuusiominaisuudet;
• kasvavien peptidiketjujen väliset vuorovaikutukset.

Peptidin pituuden kasvaessa yksittäiset ketjut voivat myös olla vuorovaikutuksessa keskenään.

Hartsissa tapahtuva aggregaatio voi rajoittaa pääsyä reaktiivisiin kohtiin ja johtaa epätäydelliseen sitoutumiseen tai epätäydelliseen deaktivoitumiseen.

Tämä tarkoittaa, että sekvenssi, joka toimii oikein synteesin alussa, voi muuttua yhä vaikeammaksi ketjun pidentyessä.

Tutkijat kehittivät vaihtelevalla täyttökerroksella varustetun virtausreaktorin, jonka avulla voitiin seurata hartsin turpoamista paineen mittausten perusteella. [4]

Tutkimuksessa tarkasteltiin hartsin aggregaatiota ja epätäydellistä sidosten muodostumista prosessiongelmina, joita muissa olosuhteissa voi olla vaikea havaita suoraan synteesin aikana.

Tämä osoittaa, että kantajan fyysisen käyttäytymisen seuranta voi tuottaa tietoa, joka ulottuu pelkän lisättyjen reagenssien rekisteröinnin ulkopuolelle.

Mihin Wanga-hartsia käytetään?

Wang-tyyppisten linkkerien kemiaa käytetään yleisesti SPPS-menetelmässä, kun peptidin irrottamisen jälkeen halutaan, että C-pää on karboksyylihapon muodossa.

Peptidi on kiinnitetty esteri-sidoksella, joka voidaan myöhemmin katkaista sopivissa olosuhteissa.

Muita linkkerijärjestelmiä voidaan valita, kun tarvitaan erilainen C-pään rakenne, esimerkiksi amidi.

On syytä tehdä ero linkkerin kemiallisen koostumuksen ja koko fyysisen kantajan välillä.

Wang-tyyppisiä linkkereitä voidaan sisällyttää erilaisiin polymeerirakenteisiin.

Tällaisten materiaalien ei tarvitse olla identtisiä:

• turpoamisominaisuudet;
• tilavuudet;
• yhteensopivuus liuottimien kanssa;
• mekaaniset ominaisuudet;
• käyttäytymistä reaktion aikana.

Peptidyl-Wang-TentaGel-kantajia hyödyntävät tutkimukset ovat osoittaneet, että kyseessä on erikoistunut vaihtoehtoinen menetelmä peptidihydratsidien valmistamiseksi, jotka ovat hyödyllisiä välituotteita peptidikemiassa. [5]

Tämä ei tarkoita, että Wangin menetelmän mukainen tavanomainen hajoitus hartsista johtaisi yleensä peptidihydratsidien muodostumiseen.

Se osoittaa kuitenkin tärkeän periaatteen:

kantaja + linkkeri + reaktio-olosuhteet + irrotuskemia määrittävät yhdessä saatavan tuotteen.

SPPS-synteesi jaksollisessa ja virtausprosessissa

SPPS-menetelmää voidaan toteuttaa perinteisissä jaksottaisissa astioissa tai järjestelmissä, joissa reagenssit virtaavat kiinteää kantaja-ainetta sisältävän reaktorin läpi.

Virtausjärjestelmät voivat mahdollistaa reagenssien nopean vaihdon sekä hartsia ympäröivän kemiallisen ympäristön tarkemman hallinnan.

Vuoden 2014 tutkimuksessa esiteltiin peptidien nopea synteesi virtausjärjestelmässä, jossa suoritettiin jatkuvaa seurantaa, ja menetelmää sovellettiin useisiin peptideihin sekä yhteen pieneen proteiiniin. [6]

Myöhemmässä automatisoidussa tutkimuksessa kuvattiin huomattavasti nopeampaa ketjujen muodostumista, jolloin analysoiduissa esimerkeissä raakatuotteen puhtaus ja eristyksen jälkeinen saanto olivat verrattavissa perinteiseen jaksottaiseen synteesiin. [7]

Nämä tutkimukset osoittavat tiettyjen järjestelmien mahdollisuudet tietyissä olosuhteissa.

Ne eivät kuitenkaan osoita, että jokaista peptidiä voitaisiin valmistaa yhtä nopeasti ja yhtä laadukkaasti.

Peptidin valmistamiseen kuluva aika käsittää paljon muutakin kuin pelkän ketjun muodostamisen.

Koko prosessi voi sisältää seuraavaa:

• reagenssien valmistus;
• hartsin valmistus;
• kytkentä;
• lukituksen avaaminen;
• pesu;
• irrottaminen;
• tuotteen käsittely;
• puhdistus;
• liuottimien poistaminen;
• rakenteen lopullinen muotoilu;
• analyyttiset tutkimukset;
• asiakirjat.

Nopea sidosten muodostuminen on siis vain yksi osa tuotannon kokonaistehokkuutta.

Synteesi nestemäisessä faasissa

Mitä tämä termi tarkoittaa?

Ilmausta „peptidien synteesi nestemäisessä faasissa” voidaan käyttää useissa merkityksissä.

Laajassa merkityksessä se voi yksinkertaisesti tarkoittaa liuoksessa suoritettavaa peptidin synteesiä.

Erityisalojen kirjallisuudessa tehdään kuitenkin usein ero seuraavien välillä:

1. perinteisen peptidien synteesin liuoksessa;
2. peptidien synteesi kiinteässä faasissa;
3. uudemmat LPPS-menetelmät, joissa kasvava ketju sisältää liukoisen merkkiaineen tai kantajan.

Tämä ero on tärkeä, koska se vaikuttaa tuotteen lajitteluun ja kierrätykseen.

Vapaasti liuennut, suojattu peptidivälituote saattaa vaatia eristämistä sen omien fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuksien avulla.

Merkityn puolivalmisteen tapauksessa merkkiaine voidaan suunnitella siten, että se helpottaa saostumista, uuttamista, membraanille kiinnittymistä tai muuta erottelumenetelmää.

LPPS:ää koskevassa katsauksessa erotetaan selvästi toisistaan perinteinen liuossynteesi, SPPS ja menetelmät, joissa käytetään liukoisia merkkiaineita. [8]

Julkaisu on hyödyllinen terminologian ja metodologian järjestelemisessä.

Sitä ei kuitenkaan pitäisi tulkita yksittäisenä kokeena, joka todistaisi, että jokin menetelmä olisi paras jokaiselle peptidille.

Perinteinen peptidien synteesi liuoksessa

Perinteisessä liuossynteesissä suojatut aminohapot, peptidivälituotteet tai fragmentit pysyvät liuenneina reaktiympäristössä sen sijaan, että ne kiinnittyisivät kovalenttisesti liukenemattomaan hartsin.

Reaktion päätyttyä kyseinen välituote voidaan eristää, puhdistaa ja tarvittaessa karakterisoida ennen seuraavan vaiheen aloittamista.

Siitä voi olla tiettyjä etuja.

Tutkijat voivat:

• kuvata yksittäiset välituotteet;
• valita puhdistusmenetelmä kunkin välituotteen mukaan;
• optimoida yksittäisiä muunnoksia;
• valmistella osia itsenäisesti;
• muokata synteesireittiä, kun tietty välituote aiheuttaa ongelmia.

Synteesi liuoksessa voi kuitenkin aiheuttaa myös huomattavia vaikeuksia.

Peptidiketjun pidentyessä peptidit voivat:

• tulla huonosti liukoisiksi;
• aggregoida;
• olla vaikea kiteyttää;
• tuottaa läheisesti toisiinsa liittyviä epäpuhtauksia;
• olla vaikea erottaa toisistaan;
• vaatia toistuvia eristystoimenpiteitä;
• aiheuttaa materiaalihukkaa myöhemmissä työstövaiheissa.

Synteesi liuoksessa ei siis ole automaattisesti yksinkertaisempaa tai helpommin skaalattavaa kuin SPPS.

Sen käyttökelpoisuus riippuu kyseisestä sekvenssistä, välituotteiden stabiilisuudesta, liukoisuudesta, synteesireitin pituudesta, käyttäytymisestä puhdistuksen aikana sekä eristämisen seuraavien vaiheiden tehokkuudesta.

LPPS-merkittyjen strategioiden kehittäminen johtuu osittain juuri näiden materiaalin erotteluun ja käsittelyyn liittyvien ongelmien ratkaisemisyrityksistä. [8]

Liukoiset merkkiaineet yhdistävät reaktion suunnittelun ja erottelun suunnittelun

Merkityssä LPPS:ssä kasvavalla peptidillä on väliaikainen molekyylisidos, joka on suunniteltu vaikuttamaan sen fysikaalisiin ominaisuuksiin.

Merkki voi mahdollistaa peptidin riittävän liukoisuuden säilyttämisen reaktion aikana ja helpottaa sen myöhemmin tapahtuvaa selektiivistä talteenottoa.

Teknologiasta riippuen erottelussa voidaan käyttää:

• saostuminen;
• uuttaminen;
• pysäyttäminen kalvolla;
• vaihekäyttäytyminen;
• muut ominaisuudet, jotka johtuvat merkkiaineen läsnäolosta.

Eräässä kokeellisessa strategiassa hyödynnettiin C-päässä sijaitsevaa pitkäketjuista suojaryhmää peptidiamidien valmistuksessa.

Toistuvat reaktiot ja saostusvaiheet mahdollistivat tutkijoille hydrofobisen peptidin valmistamisen, jota heidän vertailussaan oli vaikea saada tyydyttävästi aikaan SPPS-menetelmällä. [9]

Tämä osoittaa, että juuri tämä strategia on hyödyllinen tarkasteltavalle sekvenssille.

Se ei kuitenkaan osoita merkityn synteesin yleistä paremmuutta.

Tunnisteesta tulee osa tuotantoprosessia, ja se herättää omia kysymyksiä:

• Kuinka tehokkaasti se liitetään?
• Muuttaako se reaktion kulkua?
• Kuinka merkitty puolivalmiste voidaan luotettavasti ottaa takaisin?
• Johtaako se uusien epäpuhtauksien syntymiseen?
• Miten se poistetaan?
• Voidaanko täydellinen poisto vahvistaa?
• Mitkä analyysimenetelmät vahvistavat, ettei sitä ole lopputuotteessa?

Liukoiset merkinnät tulisi siis käsitellä prosessisuunnittelun toiminnallisina osina, eikä pelkästään yksinkertaisina etiketteinä.

Tärkeimpien menetelmien vertailu

Vertailussa esitetään kunkin menetelmän yleiset toimintaperiaatteet.

Siinä ei määritellä, mikä niistä tarjoaa parhaan suorituskyvyn, puhtauden, kustannustehokkuuden, ympäristökestävyyden tai skaalautuvuuden tietylle sekvenssille.

Näitä parametreja on arvioitava todellisen molekyylin ja kyseisen tuotantoprosessin perusteella. [4] [8] [9]

Osien yhdistäminen ja hybridituotanto

Peptidiä ei välttämättä tarvitse muodostaa yhtenä yhtenäisenä prosessina, jossa lisätään peräkkäin aminohappotähteitä.

Vaihtoehtoinen strategia on valmistaa lyhyemmät peptidipalat erikseen ja yhdistää ne sitten toisiinsa.

Hybridiprosessissa voidaan esimerkiksi käyttää SPPS-tekniikkaa yksittäisten fragmenttien valmistamiseen ja liuoskemiaa niiden yhdistämiseen.

Fragmentaariset strategiat voivat lieventää joitakin erittäin pitkään vaiheittaiseen synteesiin liittyviä ongelmia.

Ne tuovat kuitenkin mukanaan uusia haasteita, kuten:

• sopivan liitoskohdan valinta;
• fragmenttien liukoisuus;
• liitoskohdan aktivointi;
• kemoselektiivisyys;
• stereokemian säilyminen;
• sivuvaikutukset;
• osien puhdistaminen;
• puhdistus niiden yhdistämisen jälkeen.

Tärkeä esimerkki fragmenttien hallitusta yhdistämisestä on natiivi kemiallinen ligaatio.

Klassisessa versiossa tioesteripeptidi reagoi toisen peptidin kanssa, jonka N-päässä on kysteiini. Tämän jälkeen tapahtuva ryhmänsiirto johtaa oikean sidoksen muodostumiseen peptidirungossa ligaatiokohdassa.

Alustavat tutkimukset ovat osoittaneet, että proteiini, joka sisältää disulfidisiltoja, voidaan saada aikaan ligaation ja taitelun avulla. [10]

Tämä vahvistaa tämän palasten yhdistämisstrategian merkityksen.

Se ei kuitenkaan tarkoita, että kaksi mitä tahansa muokkaamatonta peptidipätkää voisivat yhdistyä spontaanisti.

Kytkentä ja suojaryhmät

Kytkentä muodostaa tarkoituksellisen yhteyden

Kytkentä on reaktion vaihe, jonka aikana valittujen yksiköiden välille muodostuu uusi peptidisidos.

Yleensä karboksyyliryhmästä peräisin oleva ryhmä aktivoidaan siten, että se voi reagoida tehokkaasti vastaavan aminoryhmän kanssa.

Aktivointikemian on oltava seuraavien vaatimusten mukainen:

• kasvava sekvenssi;
• väliaikaisilla suojeluryhmillä;
• sivuketjujen suojaus;
• stereokemia;
• tallennusvälineellä tai tunnisteella;
• liuottimen ympäristössä;
• muiden molekyylissä esiintyvien funktionaalisten ryhmien kanssa.

Tehokas konjugaatio on erityisen tärkeää vaiheittaisessa synteesissä, sillä reaktion jääminen kesken voi johtaa deleetiosekvenssien muodostumiseen.

Jos yksi aminohapon lisäysvaihe epäonnistuu osassa kasvavia ketjuja, nämä ketjut voivat jäädä järjestelmään ja osallistua seuraaviin sykleihin.

Tämän seurauksena voi syntyä molekyylejä, jotka ovat hyvin samankaltaisia kuin kohdepeptidi, mutta joista puuttuu yksi aminohappotähde.

Jopa pienet tehottomuudet voivat siis kumuloitua synteesin monien vaiheiden aikana.

Yksinkertainen matemaattinen esimerkki havainnollistaa tätä ongelmaa hyvin.

Jos jokaisella 50:stä itsenäisestä muodostumisvaiheesta olisi 99%:n onnistumistodennäköisyys, niiden molekyylien osuus, joiden kaikki vaiheet päättyisivät onnistuneesti, olisi:

0,99^50 ≈ 0,605

eli noin 61%.

Tämä on pelkkä matemaattinen esimerkki.

Se ei ole ennuste 50 aminohappoa sisältävän peptidin todellisesta puhtaudesta tai synteesin tehokkuudesta.

Todellinen tuotanto käsittää:

• erilaiset kytkentätehot eri asennoissa;
• turvavarmistuksen poistamisen vaiheet;
• sivuvaikutukset;
• vaikeusasteen mukaan;
• uudelleenkytkentästrategiat;
• irrottamisen yhteydessä syntyvät menetykset;
• puhdistuksen aikana syntyvät menetykset;
• muut prosessimuuttujat.

Laskelma osoittaa vain, miksi jopa näennäisesti vähäinen yksittäisen vaiheen tehottomuus voi saada suuren merkityksen monivaiheisessa synteesissä.

Turvaryhmät valvovat tapahtumapaikkaa

Aminohapossa voi olla useita kemiallisesti reaktiivisia ryhmiä.

Ilman valikoivaa valvontaa kytkentäreaktiot saattaisivat tapahtua ei-toivotuissa paikoissa.

Suojaryhmät estävät väliaikaisesti valittujen reaktiivisten kohtien toiminnan.

Ketjun pidentämiseen käytettävä aminoryhmä vaatii yleensä väliaikaista suojausta, kun taas reaktiiviset sivuketjut saattavat vaatia suojausta, joka pysyy paikallaan useiden synteesikierrosten ajan.

Myös liitoksen on kestettävä nämä vaiheet suunnitellun irrottamisen hetkeen asti.

Suojaryhmien valinta vaikuttaa siis koko synteesistrategiaan.

Seuraavat seikat on otettava huomioon:

• niiden käyttöönottotapa;
• vakaus;
• poistotapa;
• yhteensopivuus muiden suojaryhmien kanssa;
• yhteensopivuus tallennusvälineen kanssa;
• sivuvaikutukset;
• tietyn sekvenssin vaikutus;
• lopulliset vakuutuksen purkamisen ehdot.

Tutkimuksissa, joissa hyödynnettiin syanosulfurylidiin perustuvaa suojausta, tarkasteltiin aspartimidin muodostumista muuttamalla karboksyyliryhmän suojausta. [2]

Tulokset osoittavat, että suojaryhmien strategia vaikuttaa paitsi siihen, voiko tavoiteltu reaktio tapahtua, myös siihen, millaiset ei-toivotut reaktiot tulevat mahdollisiksi.

Fmoc, Boc ja ortogonaalinen suojaus

Fmoc ja Boc kuuluvat laajalti käytettyihin amiiniryhmien suojausryhmiin.

Niiden poistotavat eroavat toisistaan merkittävästi.

Fmoc poistetaan yleensä emäksisissä olosuhteissa, kun taas Boc on herkkä happamille olosuhteille.

Näiden ominaisuuksien ansiosta niitä voidaan käyttää osana laajempia suojelustrategioita.

Suositussa Fmoc-pohjaisessa SPPS-menetelmässä Fmoc-N-päätä suojaava väliaikainen suoja poistetaan useita kertoja, kun taas sivuketjujen valitut suojaryhmät ja sidos hartsin kanssa säilyvät ehjinä myöhemmille vaiheille asti.

Muissa strategioissa voidaan käyttää erilaisia yhdistelmiä.

Erityisen tärkeä käsite on ortogonaalinen suojaus.

Kaksi suojaryhmää katsotaan ortogonaalisiksi, jos toinen niistä voidaan poistaa selektiivisesti olosuhteissa, joissa toinen pysyy riittävän stabiilina, jotta synteesiä voidaan jatkaa.

Ortogonaalisuus on siis käytännöllinen kemiallisen yhteensopivuuden suhde.

Se ei tarkoita, että jokainen suojattu ryhmä pysyisi täysin muuttumattomana, kun se altistetaan rajattomasti kaikille reaktio-olosuhteille.

Sivuvaikutuksia voi edelleen esiintyä.

Fmoc-synteesiä koskevissa tutkimuksissa on kuvattu sekä aspartimidin muodostumista että ei-toivottuja stereokemiallisia muutoksia huolimatta suojausstrategian oletetusta selektiivisyydestä. [11]

Stereokemia on osa molekyylin identiteettiä

Monilla aminohapoilla on kiraalinen keskus.

Tämä tarkoittaa, että niiden atomit voivat muodostaa erilaisia avaruusrakenteita, jotka vastaavat erilaisia stereokemiallisia muotoja.

Yhden stereogeenisen keskuksen konfiguraation muuttaminen voi johtaa toisen peptidirakenteen muodostumiseen ilman, että sen nimellismassaa tarvitsee muuttaa.

Siksi pelkkä massa ei riitä peptidin täydellisen identiteetin vahvistamiseen.

Epimerisaatio tarkoittaa yleensä yhden stereogeenisen keskuksen konfiguraation muutosta molekyylissä, jossa on useita tällaisia keskuksia.

Racemisaatiosta puhutaan usein myös peptidikemiassa, kun tarkastellaan aminohappotähteiden stereokemiallisen eheyden menetystä.

Nämä muutokset ovat merkittäviä, sillä molekyylien tunnistaminen voi riippua suuresti atomien avaruudellisesta järjestyksestä.

Kaksi molekyyliä, joilla on sama alkuainekoostumus ja nimellismassa, voivat siis käyttäytyä eri tavalla, jos niiden stereokemia eroaa toisistaan.

Mikroaaltotukisessa Fmoc-synteesitutkimuksessa havaittiin, että tietyt jäännökset olivat alttiita ei-toivotuille stereokemiallisille muutoksille käytetyissä olosuhteissa. Menetelmän muokkaaminen rajoitti näiden reaktioiden esiintymistä. [11]

Tämä ei tarkoita, että lämmitys vahingoittaisi määritelmänsä mukaan kaikkia peptidejä.

Oikea johtopäätös on, että reaktion nopeutumista on arvioitava yhdessä sekvenssistä riippuvan kemiallisen selektiivisyyden kanssa.

Aspartimidi ja muut siihen liittyvät epäpuhtaudet

Aspartimidin muodostuminen on tunnettu sivureaktio, joka liittyy tiettyihin asparagiinihappoa sisältäviin sekvensseihin.

Saattaa syntyä ei-toivottu syklinen välituote, josta muodostuu myöhemmin yhdisteitä, joiden runkorakenne tai stereokemia on muuttunut.

Tämän reaktion todennäköisyys riippuu sekvenssistä ja prosessin olosuhteista.

Muita synteesiin liittyviä epäpuhtauksia voi aiheutua seuraavista tekijöistä:

• epätäydellinen kytkentä;
• epätäydellinen lukituksen avaaminen;
• deleetiosekvenssien muodostuminen;
• sivuketjujen reaktioita;
• stereokemialliset muutokset;
• reaktio irrottamisen aikana;
• hapettumista;
• uudelleenryhmittelyt;
• tuotteen käsittelyolosuhteet;
• suojaryhmien epätäydellinen poistaminen.

Jotkut epäpuhtaudet aiheuttavat selvästi havaittavan muutoksen molekyylimassassa.

Toiset ovat huomattavasti vaikeampia erottaa toisistaan.

Reniinin substraattina toimivan synteettisen peptidin analyyttisissä tutkimuksissa on tunnistettu useita epäpuhtauksia, mukaan lukien aineosia, joilla on sama massanmuutos, mutta joissa on modifikaatioita eri kohdissa. [12]

Niiden erottamiseksi tarvittiin lisärakenteellinen analyysi.

Tutkijat pitivät myös näiden epäpuhtauksien syntymiseen liittyviä ehdotettuja mekanismeja hypoteeseina.

Tämä on tärkeä ero:

Saastumisen määritteleminen ja sen syntymekanismin tarkka selvittäminen ovat kaksi erillistä tieteellistä kysymystä.

Todennäköistä mekanismia ei pidä esittää vahvistettuna pelkästään sen vuoksi, että se vastaa havaittua molekyylimassaa.

Puhdistus, kalkinpoisto ja tuotannon laatu

Raaka-aine, puhdistettu tuote ja tuotanto

Raakapeptidi on aine, joka on saatu ennen asianmukaisten puhdistusvaiheiden loppuun saattamista.

Saattaa sisältää:

• kohdepeptidi;
• deleetiosekvenssit;
• materiaali ei ole täysin suojattu;
• muokatut sekvenssit;
• reagenssien jäämät;
• erottamiseen liittyvät tuotteet;
• suolat;
• liuottimet;
• muut prosessissa syntyvät aineosat.

Puhdistuksen tarkoituksena on erottaa haluttu peptidi tästä seoksesta.

Kolme käsitettä on erotettava selvästi toisistaan:

raaka-aineen puhtaus — materiaalin koostumus mitattuna ennen lopullista puhdistusta;

puhdistetun tai eristetyn tuotteen saanto — talteenotetun kohdemateriaalin määrä suhteessa tiettyyn lähtöarvoon tai teoreettiseen arvoon;

loppupuhdasuus — eristetyn materiaalin koostumus, joka on määritetty tietyllä analyysimenetelmällä.

Nämä käsitteet eivät ole keskenään vaihdettavissa.

Prosessi voi tuottaa suuren määrän raaka-ainetta, mutta sen avulla voidaan saada suhteellisen pieni määrä puhdistettua tuotetta.

Toinen prosessi saattaa tuottaa vähemmän raaka-ainetta, mutta sille on ominaista kohdeaineen muodostumisen korkea selektiivisyys.

Vastaavasti korkea analyyttinen puhtaus ei välttämättä tarkoita korkeaa tuotantotehokkuutta.

Nopeutetun virtaussynteesin tutkimuksissa raaka-aineen puhtaus ja eristämisen jälkeinen saanto on raportoitu asianmukaisesti erikseen. [7]

Kromatografia erottaa aineosat toisistaan, mutta se ei anna vastausta jokaiseen kysymykseen

Käänteisfaasinen korkean suorituskyvyn nestekromatografia (RP-HPLC) on laajalti käytössä peptidien analysoinnissa ja puhdistuksessa.

Eri molekyylit ovat vuorovaikutuksessa kiinteän ja liikkuvan faasin kanssa eri tavoin.

Sopivissa olosuhteissa nämä erot mahdollistavat seoksen komponenttien erottamisen toisistaan.

Analyyttisellä ja preparatiivisella kromatografialla on toisiinsa liittyviä, mutta erilaisia käyttötarkoituksia.

Analyyttinen HPLC on tarkoitettu ensisijaisesti näytteen koostumuksen tutkimiseen.

HPLC-valmistetta käytetään erotettujen ainesosien fyysiseen keräämiseen.

Kromatogrammi voi tarjota paljon arvokasta tietoa.

Suurta pääpiikkiä tai sen pinta-alasta muodostuvaa suurta prosenttiosuutta ei kuitenkaan pidä pitää molekyylin täydellisenä luonnehdintana.

Kromatografian tulokset riippuvat muun muassa seuraavista tekijöistä:

• sarakkeen tyyppi;
• liikkuvan vaiheen;
• gradientti;
• lämpötilat;
• havaitsemismenetelmät;
• aallonpituus;
• näytteen valmistelu;
• piikkien integrointitapa;
• erottelukyky;
• saasteiden ominaisuudet.

Kaksi yhdistettä voi mahdollisesti eluoitua samanaikaisesti.

Jotkin näytteen aineosat voivat myös reagoida eri tavoin käytettyyn ilmaisimeen.

Siksi HPLC:n korkea pintapuhtaus ei tarkoita molekyylin identiteetin täydellistä vahvistamista.

Isobaaristen peptidipitoisuuksien tutkimukset ja kiraaliset analyysit osoittavat, miksi täydentäviä analyysimenetelmiä saatetaan tarvita. [12] [13]

Analyyttisen menetelmän on vastattava tiettyä rakenteellista kysymystä.

Identiteetti, puhtaus ja sisältö tarkoittavat eri asioita

Peptidien ominaisuuksien kuvauksessa kolme käsitettä ovat erityisen tärkeitä.

Identiteetti vastaa kysymykseen:

Onko näytteessä etsittyä molekyyliä?

Puhtaus vastaa kysymykseen:

Mitä muita komponentteja näytteessä on, tai mikä osa mitatusta signaalista vastaa pääkomponenttia?

Sisältö vastaa seuraavaan kysymykseen:

Kuinka paljon todellista peptidiä näytteessä on?

Näihin kysymyksiin ei aina voida vastata yhden mittauksen avulla.

Peptidiä sisältävä aine voi sisältää myös seuraavia aineita:

• vettä;
• vastustettu;
• suolat;
• liuottimien jäämät;
• muut prosessiin liittyvät aineosat;
• saasteet.

Punnitun aineen kokonaismassan ei siis tarvitse vastata pelkän peptidin massaa.

Vastaavasti mitatun molekyylimassan yhdenmukaisuus teoreettisen arvon kanssa ei vahvista:

• täydellinen aminohapposekvenssi;
• yksittäisten jäännösten oikea yhteys;
• stereokemiallisen eheyden;
• disulfidisiltojen sijoittelu;
• taittaminen;
• isobaaristen epäpuhtauksien puuttuminen.

Massaspektrometria voi tarjota vahvaa näyttöä molekyylimassasta.

Tandem-massaspektrometria ja muut rakenteelliset menetelmät voivat tarjota lisätietoja sekvenssistä.

Kiraaliset menetelmät mahdollistavat sellaisten stereokemiallisten kysymysten analysoinnin, joita ei voida ratkaista tavallisella massamittauksella.

Eräässä analyyttisessä tutkimuksessa otettiin huomioon jopa näytteen valmistuksen aikana syntyvä racemisaatio. Tämä osoittaa toisen tärkeän periaatteen: itse analyysimenetelmä voi aiheuttaa artefakteja, ellei sitä ole suunniteltu asianmukaisesti. [13]

Taitto ja toiminta saattavat edellyttää erillistä vahvistusta

Rakenteellisesti rajoitettujen peptidien ja pienten proteiinien tapauksessa oikea sekvenssi ja molekyylimassa eivät välttämättä riitä vahvistamaan tavoiteltua lopullista rakennetta.

Lisäkysymyksiä voivat olla esimerkiksi:

• Ovatko oikeat disulfidisillat muodostuneet?
• Onko molekyyli ottanut odotetun konformaation?
• Onko syklisaatio valmis?
• Onko rakenteellisia isomeerejä läsnä?
• Osoittaako synteettinen molekyyli odotettua aktiivisuutta tietyssä kokeellisessa testissä?

BPTI:n synteesin tutkimuksessa käytettiin useita analyyttisiä ja biofysikaalisia menetelmiä sekä trypsiinin eston arviointia. [3]

Tulokset kokonaisuudessaan tukivat sitä, että luonnollisen sekvenssin omaava synteettinen materiaali vastasi luonnollista proteiinia tutkittujen kriteerien osalta.

Aktiivisuustesti antaa kuitenkin vastauksen tiettyyn toiminnalliseen kysymykseen.

Se ei korvaa epäpuhtauksien analysointia.

Vastaavasti samanlainen aktiivisuus yhdessä testissä ei osoita, että kaikki biologiset, rakenteelliset tai tuotannolliset ominaisuudet olisivat täysin vastaavia.

Tuotannon laajentaminen vaikuttaa muuhunkin kuin pelkästään materiaalin määrään

Tuotannon laajentaminen ei tarkoita pelkästään kaikkien reagenssien määrän suhteellista lisäämistä.

Fysikaaliset prosessit voivat käyttäytyä eri tavalla suuremmassa mittakaavassa.

Seuraavilla voi olla merkitystä:

• sekoittaminen;
• lämmönvaihto;
• kemikaalien jakelu;
• diffuusio;
• hartsin turpoaminen;
• paine;
• suodatus;
• liuottimien hallinta;
• saostuminen;
• välituotteiden liukoisuus;
• massan kuljetus;
• puhdistusjärjestelmän mahdollisuudet.

Nämä tekijät voivat vaikuttaa sekä reaktion kulkuun että epäpuhtauksien muodostumiseen.

Myös myöhemmissä vaiheissa tapahtuva puhdistus voi muodostua koko tuotannon pullonkaulaksi.

Synteesinopeuden lisäämisellä on vain rajallista merkitystä, jos puhdistusjärjestelmä ei kykene erottamaan syntyviä epäpuhtauksia tehokkaasti tai talteen ottamaan vaaditun laadun mukaista tuotetta.

Teollisessa analyysissä, joka kattoi 40 peptidisynteesiprosessia 14 lääkeyrityksestä, arvioitiin materiaalien kulutusta synteesin, puhdistuksen ja eristämisen aikana. [14]

Tutkimus osoittaa, miksi tuotannon arviointia tulisi suorittaa koko prosessin osalta.

Se ei kuitenkaan tarkoita, että jokainen tehdas, tuotantoprosessi tai tuotantoteknologia saavuttaisi täsmälleen samat tulokset.

Tuotannon laatu on monien valvontatekijöiden tulos

Luotettava peptidien valmistus vaatii muutakin kuin yhden tyydyttävän analyysituloksen saamista.

Valvottu prosessi käsittää yleensä useita toisiinsa liittyviä osia:

määritelty kohdemolekyyli → sopivat lähtöaineet → hallittu synteesi → hallittu puhdistus → asianmukainen näytteenotto → validoitu tai tarkoitukseen sopiva analyysi → erän dokumentointi.

Erän dokumentaatio yhdistää analyysitulokset todellisuudessa tuotettuun materiaaliin.

Analyysitodistus (COA) sisältää yhteenvedon tietyn erän valituista tutkimustuloksista.

Sen informaatioarvo riippuu seuraavista tekijöistä:

• tutkimusten tyyppi;
• käytetyt menetelmät;
• näiden menetelmien käyttökelpoisuus;
• tekniset tiedot;
• näytteen tunnistaminen;
• erän jäljitettävyys;
• varmistus siitä, että raportoidut tulokset koskevat todellakin kyseistä materiaalia.

Yksittäinen arvo, jota kutsutaan „puhtaudeksi”, ei voi yksinään vahvistaa:

• täydellinen molekyyli-identiteetti;
• peptidin pitoisuus;
• stereokemiallisen eheyden;
• liuottimien jäämien pitoisuus;
• vesipitoisuus;
• vastionien koostumus;
• mikrobiologiset ominaisuudet;
• taittaminen;
• biologinen aktiivisuus;
• soveltuvuus tiettyyn tarkoitukseen.

Sopiva analyysivalikoima riippuu materiaalin aiotusta käyttötarkoituksesta.

Analyyttisenä vertailuaineena käytettävä peptidi, solukokeessa käytettävä tutkimusreagenssi sekä lääkekehitysvaiheessa oleva aine voivat edellyttää vastauksia erilaisiin laatuun liittyviin kysymyksiin.

Analyyttisiä todisteita on siis tulkittava selkeästi määritellyssä yhteydessä, eikä niitä pidä pitää yleispätevänä laadun vahvistuksena.

Ympäristön kestävyyden arvioinnin on katettava koko prosessi

Peptidien synteesi voi vaatia huomattavia määriä liuottimia ja reagensseja.

Ympäristövaikutusten arvioinnissa tulisi siis ottaa huomioon paljon muutakin kuin pelkkä kytkentävaihe.

Merkittäviä tekijöitä voivat olla esimerkiksi:

• rakennuspalikoiden valmistus;
• konjugaattireagenssit;
• turvavarmistuksen poistamiseen tarvittavat reagenssit;
• pesu;
• irrottaminen;
• tuotteen käsittely;
• kromatografia;
• liuottimien vaihto;
• eristys;
• kuivaus;
• jätteiden käsittely.

Ympäristökuormituksen vähentäminen saattaa edellyttää useiden vaiheiden samanaikaista parantamista.

Julkaistussa peptidituotantoa koskevassa analyysissä käsiteltiin sekä synteesiin että puhdistukseen liittyviä ongelmia ja tuotiin esiin tarve parantaa koko prosessisuunnittelua. [15]

Koska kyseessä on tulevaisuuteen suuntautuva julkaisu, se ei ole kontrolloitu suora vertailu, joka osoittaisi, että yksi tietty teknologia olisi aina ympäristöystävällisempi.

Samoin:

nopeampi synteesi ei tarkoita automaattisesti ympäristöystävällisempää synteesiä,

ja se, että synteesin aikana käytetään vähemmän liuottimia, ei tarkoita automaattisesti, että koko tuotantoprosessin ympäristövaikutukset olisivat pienemmät.

Ympäristövertailuissa on käytettävä yhdenmukaisia analyysin rajoja, ja niissä olisi mieluiten suhteutettava resurssien kulutus tiettyyn määrään eristettyä ja karakterisoitua lopputuotetta.

Usein kysytyt kysymykset

1. Miten kiinteän faasin peptidisynteesi eroaa nestemäisen faasin synteesistä?

Kiinteän faasin synteesissä kasvava peptidi pysyy kiinnittyneenä liukenemattomaan kantajaan, kun taas klassisessa liuossynteesissä peptidivälituote pysyy liuenneena ja se on yleensä erotettava sen fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuksien perusteella. Kapeammassa merkityksessä LPPS-menetelmässä liuenneessa kasvavassa ketjussa on lisäksi liukoinen merkkiaine tai kantaja-aine, joka helpottaa myöhempää erottelua. Merkittyjen yhdisteiden synteesiä koskevat tutkimukset esittävät yhden strategian liuoksen kemian yhdistämiseksi saannoksen talteenottoon saostuksen avulla, kun taas LPPS:ää käsittelevä kirjallisuus erottaa tällaiset ratkaisut sekä klassisesta liuossynteesistä että SPPS:stä. Mikään menetelmä ei ole määritelmänsä mukaan optimaalinen jokaiselle peptidille. Perusero koskee kasvavan ketjun fyysistä käsittelyä ja erottelua synteesin eri vaiheissa. [8] [9]

2. Miksi peptidien synteesin aikana voi syntyä epäpuhtauksia?

Saasteita voi syntyä, koska tavoitellut reaktiot eivät aina tapahdu määrällisesti, ja muut funktionaaliset ryhmät voivat osallistua ei-toivottuihin reaktioihin. Epätäydellinen kytkentä voi johtaa deleetioihin, epätäydellinen suojan poisto voi häiritä ketjun jatkokokoamista, ja jotkut sekvenssit ovat alttiita stereokemiallisille muutoksille, aspartimidin muodostumiselle, hapettumiselle, uudelleenjärjestelyihin tai irtoamiseen liittyviin sivutuotteisiin. Fmoc-synteesin tutkimukset ja synteettisten peptidien epäpuhtauksien rakenneanalyysit dokumentoivat useita tällaisia esimerkkejä. [11] [12] Yksittäisten epäpuhtauksien esiintymistiheys ja merkitys riippuvat sekvenssistä ja prosessista, minkä vuoksi synteesin automatisointia ei pidä sekoittaa kemiallisten virheiden täydelliseen puuttumiseen.

3. Mikä rooli hartsilla on peptidien synteesissä?

Hartsin avulla kasvava peptidi pysyy paikallaan, kun taas liukoiset reagenssit ja monet sivutuotteet voidaan poistaa synteesin peräkkäisten vaiheiden välillä. Tämä yksinkertaistaa huomattavasti ketjun toistuvaa rakentamista, mutta hartsi ei ole pelkästään mekaaninen kiinnike. Sen turpoaminen, täyttöaste, polymeerin rakenne, yhteensopivuus liuottimien kanssa sekä reaktiopaikkojen saatavuus voivat vaikuttaa siihen, kuinka tehokkaasti reagenssit pääsevät kiinnittyneeseen peptidiin. Tutkimuksissa, joissa käytettiin vaihtelevan sängyn reaktoria, seurattiin hartsin käyttäytymistä aggregaation ja kytkentätehokkuuden analysoinnin aikana. [4] Tällainen seuranta ei poista sekvenssivirheitä, mutta se osoittaa, miksi hartsin fysikaalinen tila voi olla merkittävä prosessimuuttuja.

4. Mihin Wanga-hartsia käytetään peptidien synteesissä?

Wang-tyyppiset kantajat liitetään yleisesti sellaisten peptidien valmistukseen, jotka vapautuvat, kun C-pää irrotetaan karboksyylihapon muodossa. Lopullinen tuote riippuu kuitenkin linkkeristä, kantajan rakenteesta ja käytetystä irrotuskemialla, eikä pelkästään hartsin nimestä. Tutkijat esittelivät myös erikoismenetelmän, jolla peptidyyli-Wang-TentaGel-materiaalia voidaan muuntaa peptidihydratsideiksi, joita voidaan käyttää hyödyllisinä synteettisinä välituotteina. [5] Vaihtoehtoinen reaktio ei muuta Wang-hartsin standardinmukaisen irrottamisen merkitystä. Se osoittaa sen sijaan, miksi tuotetta ennustettaessa on analysoitava koko kantaja-järjestelmä ja reaktio-olosuhteet.

5. Rakentaako SPPS peptidin N-päästä vai C-päästä?

Perinteinen vaiheittainen SPPS alkaa yleensä C-päätä edustavan jäännöksen kiinnittämisellä kantajaan, minkä jälkeen ketjua jatketaan N-päähän päin. Tämä on päinvastainen suunta kuin tavanomaisessa ketjun pidentymisessä ribosomissa, jossa proteiini kasvaa lisäämällä peräkkäisiä aminohappoja C-päähän. BPTI:n synteesi on esimerkki suojattujen rakennuspalikoiden ja kantajan käytöstä ennen tuotteen myöhempää vapauttamista, puhdistamista ja taittoa. [3] On kuitenkin olemassa erikoistuneita peptidikemian strategioita, joissa käytetään muita ratkaisuja, minkä vuoksi rakentaminen C-päästä N-päähän tulisi määritellä klassiseksi SPPS-lähestymistavaksi eikä kaikkia synteesimenetelmiä koskevaksi ehdottomaksi säännöksi.

6. Miksi suojeluryhmiä tarvitaan?

Aminohapot sisältävät usein useita reaktiivisia funktionaalisia ryhmiä. Suojaryhmät estävät tilapäisesti tiettyjen kohtien reagoimisen, jolloin kyseinen kohta pysyy käytettävissä tietyssä synteesivaiheessa. Tämä auttaa hallitsemaan jäännösten liittämisjärjestystä ja -tapaa. Ilman asianmukaista suojausta kilpailevat reaktiot saattaisivat johtaa monimutkaisten seosten tai rakenteeltaan muuttuneiden tuotteiden muodostumiseen. Aspartimidin muodostumista koskevat tutkimukset ovat osoittaneet, että karboksyyliryhmän suojauskemian muuttaminen voi rajoittaa tärkeää sivureaktiota tutkituissa sekvensseissä. [2] Suojaryhmät eivät takaa synteesin täydellistä kulkua, mutta ne tarjoavat selektiivisen kemiallisen hallinnan, jonka on oltava sopusoinnussa prosessin kaikkien olennaisten vaiheiden kanssa.

7. Miten Fmoc ja Boc eroavat toisistaan?

Fmoc ja Boc ovat laajalti käytettyjä väliaikaisia aminoryhmän suojaryhmiä, mutta ne reagoivat erilaisissa kemiallisissa olosuhteissa. Fmoc poistetaan yleensä emäksisessä ympäristössä, kun taas Boc on herkkä hapoille. Tämä ero vaikuttaa siihen, miten ne liitetään sivuketjujen suojaryhmiin, linkkereihin ja muihin synteesivaiheisiin. Fmoc-pohjaista synteesiä käytetään laajalti nykyaikaisessa SPPS:ssä, mutta tutkimukset ovat osoittaneet, että tällaisissa olosuhteissa voi esiintyä sekvenssiriippuvia sivureaktioita. [11] Käytännössä on siis hyödyllisempää verrata kokonaisia suojausstrategioita ja niiden yhteensopivuutta tietyn sekvenssin kanssa kuin tarkastella pelkästään kahden suojaryhmän nimiä.

8. Mitä ortogonaalinen suojaus tarkoittaa?

Ortogonaalinen suojaus tarkoittaa, että yksi suojaryhmä voidaan poistaa olosuhteissa, joissa toinen tarvittava suojaryhmä pysyy riittävän stabiilina, jotta synteesiä voidaan jatkaa. Tämä mahdollistaa eri reaktiivisten kohtien paljastamisen tietyissä vaiheissa. Tämä käsite on keskeisen tärkeä monimutkaisten peptidien hallitussa synteesissä. Ortogonaalisuus on kuitenkin olosuhteista riippuvaista eikä absoluuttista: toistuva altistuminen, sekvenssin luonne ja reaktioparametrit voivat edelleen johtaa sivureaktioihin. Tutkimukset karboksyyliryhmien vaihtoehtoisista suojausmenetelmistä osoittavat, kuinka suojausstrategiaa voidaan muokata vaikean peptidikemian hallitsemiseksi. [2]

9. Mikä on deleetiosekvenssi?

Deleetiosekvenssi on peptidi, josta puuttuu yksi tai useampi, alkuperäisessä kohdesekvenssissä esiintyvä aminohappotähde. Se voi syntyä, kun aminohapon sitoutumisvaihe ei tapahdu kokonaan, vaan reagoimaton ketju jää kiinni kantajaan ja osallistuu seuraaviin sykleihin. Koska virheellinen ketju pysyy edelleen kiinnittyneenä hartsin pinnalla, tavallinen huuhtelu ei välttämättä poista sitä. SPPS-prosessin reaaliaikaiset seurantatutkimukset osoittavat, että amidisidosten epätäydellinen muodostuminen on merkittävä prosessiongelma. [4] Deleetiosekvenssi on siis ongelma, joka liittyy tuotteen rakenteeseen ja identiteettiin, eikä pelkästään reagenssin jäämään.

10. Voiko kahdella peptidipäästöllä olla sama molekyylimassa?

Kyllä. Eri molekyylirakenteilla voi olla identtinen tai erottamaton nimellismassa. Tästä syystä pelkkä massan yhteneväisyys ei riitä vahvistamaan molekyylin täydellistä identiteettiä. Reniinin substraattina toimivan synteettisen peptidin tutkimuksissa tunnistettiin isobaarisia epäpuhtauksia, joissa modifikaatiot sijaitsivat eri kohdissa. Derivatisointi ja tandem-massaspektrometria antoivat lisätietoa rakenteesta. [12] Tämä esimerkki osoittaa, miksi havaitun massan ja odotetun massan yhdenmukaisuus ei yksinään riitä vahvistamaan oikeaa sekvenssiä, sidoksia, stereokemiaa tai rakenteellisesti samankaltaisten isomeerien puuttumista.

11. Mitä ovat epimerisaatio ja racemisaatio peptidien synteesissä?

Epimerisaatio ja racemisaatio liittyvät ei-toivottuihin muutoksiin stereokemiallisessa konfiguraatiossa. Ne voivat tapahtua ilman muutoksia aminohappojärjestyksessä tai molekyylimassassa, minkä vuoksi pelkkä massan mittaus ei välttämättä paljasta rakenteellista eroa. Mikroaaltotukemalla Fmoc-synteesitutkimuksissa on tunnistettu stereokemiallisille muutoksille alttiita jäännöksiä ja osoitettu, että reaktio-olosuhteiden muokkaaminen voi rajoittaa tällaisia prosesseja. [11] Riski riippuu rakennuspalikasta, sekvenssistä ja prosessiolosuhteista. Stereokemiallinen laatu edellyttää siis analyyttisiä menetelmiä, joilla konfiguraatiota voidaan arvioida, eikä sitä voida päätellä pelkästään molekyylimassan perusteella.

12. Mikä on aspartimidin muodostuminen?

Aspartimidin muodostuminen on ei-toivottu reaktio, joka liittyy tiettyihin asparagiinihappoa sisältäviin sekvensseihin. Syklisen välituotteen muodostuminen voi johtaa uusiin tuotteisiin, joiden runkorakenne tai stereokemia on muuttunut, mikä heikentää saantoa ja vaikeuttaa puhdistusta. Tutkijat analysoivat vaihtoehtoisia suojausstrategioita, jotka on suunniteltu rajoittamaan tätä reaktiota valituissa peptideissä ja proteiineissa. [2] Tulokset eivät osoita yhtä yleispätevää ratkaisua kaikille asparagiinihappoa sisältäville sekvensseille. Ne osoittavat sen sijaan, miksi synteesin suunnittelussa ja epäpuhtauksien hallintastrategioissa on otettava huomioon kyseisen sekvenssin spesifinen kemiallinen käyttäytyminen.

13. Vahvistaako HPLC:n korkea puhtausaste peptidin oikean identiteetin?

Ei. HPLC-puhtaus kuvaa näytettä tietyn kromatografisen jakson, käytetyn detektorin ja tietojen analysointitavan puitteissa. Pääpiikin suuri pinta-alaosuus voi olla arvokas osoitus siitä, että näyte koostuu pääasiassa yhdestä kromatografisesti erotetusta komponentista, mutta se ei yksinään riitä vahvistamaan molekyylin täydellistä identiteettiä. Koeliuuntuvat epäpuhtaudet, stereoisomeerit ja muut variantit saattavat vaatia lisätekniikoita. Peptidien kiraalisen analyysin tutkimuksissa käytettiin erityisesti suunniteltua menetelmää, jossa otettiin huomioon myös näytteen valmistuksen aikana syntyvät stereokemialliset muutokset. [13] Identiteettiä ja puhtautta on siis pidettävä toisiinsa liittyvina, mutta erillisinä analyyttisinä kysymyksinä.

14. Tarkoittaako puhdistetun tuotteen suorituskyky samaa kuin puhtaus?

Ei. Puhdistetun tai eristetyn tuotteen saanto määritetään palautetun kohdemateriaalin määrän suhteena määriteltyyn lähtömäärään tai teoreettiseen määrään. Puhtaus puolestaan kuvaa palautetun materiaalin koostumusta tietyn analyysimenetelmän mukaisesti. Synteesi voi johtaa suhteellisen pienen määrän erittäin puhdasta tuotetta tai suuren määrän raaka-ainetta, joka sisältää huomattavan määrän epäpuhtauksia. Automaattisen virtaussynteesin tutkimuksissa raakatuotteen puhtaus ja eristämisen jälkeinen saanto on raportoitu erikseen. [7] Näiden parametrien erottaminen estää sen, että toisen parametrin korkeaa arvoa pidetään virheellisesti todisteena toisen parametrin korkeasta arvosta.

15. Voidaanko pitkiä peptidejä valmistaa yhdistelemällä lyhyempiä fragmentteja?

Kyllä. Fragmenttistrategiassa lyhyemmät peptidisegmentit voidaan valmistaa erikseen ja yhdistää myöhemmin sopivan kemian avulla. Kemiallinen ligaatio oli tärkeä esimerkki, jossa suojaamattomat peptidifragmentit yhdistettiin tavalla, joka johti luonnollisen peptidirungon sidoksen muodostumiseen, minkä jälkeen saatiin taitettu proteiini. [10] Tämä ei tarkoita, että mitkä tahansa peptidifragmentit voisivat liittyä toisiinsa spontaanisti. Huomioon on otettava fragmenttien rakenne, liitoskemia, liitoskohdan valinta, liukoisuus, stereokemia ja puhdistusta koskevat vaatimukset. Fragmenttien kokoaminen on siis vaihtoehtoinen synteesisuunnittelustrategia, ei automaattinen ratkaisu pitkiin peptideihin liittyviin ongelmiin.

16. Poistaako nopeampi automatisoitu synteesi puhdistustarpeen?

Ei. Nopeampi automatisoitu tai virtausmenetelmällä toteutettu synteesi lyhentää tiettyjen synteesivaiheiden kestoa, mutta se ei todista, että jokaisella syntyneellä molekyylillä olisi tavoiteltu rakenne. Nopeaa virtaussynteesiä koskevissa tutkimuksissa raaka-aineen ominaisuudet määritettiin edelleen ja suoritettiin myöhempi puhdistus, ja myöhemmissä automatisointia koskevissa tutkimuksissa verrattiin erikseen raaka-aineen puhtautta ja eristämisen jälkeistä saantoa. [6] [7] Järjestelmän hyvät tulokset tutkituissa sekvensseissä eivät myöskään takaa identtisiä tuloksia jokaiselle uudelle kohteelle. Nopeutettu synteesi on edelleen yhdistettävä asianmukaiseen puhdistukseen, identiteetin vahvistamiseen, epäpuhtauksien analysointiin ja lopputuotteen karakterisointiin.

17. Miksi tuotannon laajentaminen on monimutkaisempaa kuin suuremman erän valmistaminen?

Tuotantomäärän kasvattaminen muuttaa fysikaalisia ja kemiallisia olosuhteita, ei pelkästään materiaalin määrää. Sekoittuminen, lämmönvaihto, hartsin turpoaminen, reagenssien jakautuminen, paine, suodatus, liuottimien käsittely, välituotteiden liukoisuus ja puhdistusjärjestelmän kapasiteetti voivat käyttäytyä eri tavalla suuremmalla tuotantomäärällä. Teollisessa analyysissä, jossa tarkasteltiin 40 peptidiprosessia, arvioitiin synteesiä, puhdistusta ja eristystä erikseen materiaalien kulutuksen analyysin yhteydessä. [14] Tulokset osoittavat, miksi tuotantoa on tarkasteltava kokonaisvaltaisena prosessina. Skaalautuvan menetelmän on johdettava toistettavasti karakterisoidun materiaalin saamiseen kaikissa vaiheissa, ei pelkästään suurempaan raakapeptidimäärään.

18. Onko peptidi valmis heti, kun oikea sekvenssi on koottu?

Ei välttämättä. Ketjun muodostuminen luo sekvenssin rungon vain siinä laajuudessa, kuin prosessi ja analyyttiset tiedot sen vahvistavat. Molekyylistä riippuen saatetaan edelleen tarvita deaktivointia, pilkkomista, syklisointia, hapettamista, disulfidisiltojen muodostamista, taittoa, konjugaatiota, puhdistusta ja karakterisointia. BPTI:n synteesi on hyvä esimerkki prosessista, jossa lineaarisen sekvenssin kokoamisen jälkeen suoritettiin puhdistus ja disulfidisiltoja sisältävän taitetun rakenteen muodostaminen. [3] Termi „valmis peptidi” tulisi siis viitata kyseisessä tieteellisessä yhteydessä vaadittuun molekyylimuotoon, eikä pelkästään aminohappojen vaiheittaisen lisäämisen päättymiseen.

19. Vahvistaako oikea molekyylimassa peptidin sekvenssin oikeellisuuden?

Ei. Molekyylimassan yhteneväisyys on arvokas todiste, mutta se ei voi yksinään vahvistaa täydellistä sekvenssiä eikä molekyylirakennetta. Isobaariset rakenteet voivat olla samamassaisia, eikä stereokemialliset erot välttämättä aiheuta lainkaan muutosta molekyylimassassa. Synteettisten peptidien epäpuhtauksia koskevat tutkimukset ovat osoittaneet, että rakenteellisesti erilaisten komponenttien erottaminen voi edellyttää tandem-massaspektrometriaa ja lisätutkimuksia. [12] Stereokemiallista eheyttä koskevien kysymysten yhteydessä saatetaan tarvita myös kiraalisia menetelmiä. [13] Molekyylimassaa tulisi siis pitää yhtenä osana identiteetin arviointia, ei sen täydellisenä vahvistuksena.

20. Miksi puhdistusta tulisi pitää osana peptidin tuotantoa eikä pelkästään loppuvaiheena?

Puhdistus ratkaisee, voidaanko kohdepeptidi erottaa tehokkaasti deleetiosekvensseistä, sivutuotteista, reagenssien jäämistä, rakenteellisesti samankaltaisista epäpuhtauksista ja muista synteesin aikana syntyneistä aineosista. Menetelmä, jolla voidaan tuottaa suuria määriä raaka-ainetta erittäin nopeasti, voi silti olla epäkäytännöllinen, jos kohdeainetta ei voida tehokkaasti erottaa vaaditulla laadulla. Tästä syystä teollisissa peptidiprosessien analyyseissä otetaan huomioon sekä synteesi että puhdistus ja eristäminen. [14] Tuotannon tehokkuutta on lopulta arvioitava eristetyn lopputuotteen määrän ja ominaisuuksien perusteella, ei pelkästään synteesin nopeuden perusteella.

Peptidisynteesimenetelmien vertailuun liittyvät rajoitukset

Peptidien tuotantoteknologioita vertailevien tutkimusten tulkinnoissa on syytä muistaa muutamia merkittäviä rajoituksia.

Ensinnäkin sekvenssi vaikuttaa merkittävästi synteesin vaikeusasteeseen. Menetelmä, joka toimii yhden peptidin kohdalla, ei välttämättä toimi samalla tavalla toisen peptidin kohdalla. Aggregaatio, hydrofobisuus, aminohappokoostumus, pituus, taipumus muodostaa sekundaarisia rakenteita sekä alttius sivureaktioille voivat muuttaa prosessin kulkua. [1] [4]

Toiseksi raaka-aineen puhtaus, eristämisen jälkeinen saanto, lopputuotteen puhtaus ja peptidipitoisuus ovat erilaisia parametrejä. Menetelmien vertailu pelkästään yhden näistä perusteella voi antaa epätäydellisen kuvan tuotannon tehokkuudesta. [7]

Kolmanneksi ketjun nopea kokoaminen ei tarkoita koko materiaalin nopeaa tuotantoa. Pilkkominen, puhdistaminen, eristäminen, rakenteen lopullinen muotoilu, analyyttiset tutkimukset ja dokumentointi vaikuttavat myös tuotannon kokonaisaikaan. [6] [7]

Neljänneksi, analyyttinen puhtaus riippuu käytetystä menetelmästä. HPLC, massaspektrometria, tandem-massaspektrometria ja kiraalinen analyysi antavat vastauksia eri kysymyksiin. Yksi analyyttinen tulos ei välttämättä vahvista täydellistä rakenteellista identiteettiä. [12] [13]

Viidenneksi mittakaava vaikuttaa prosessin käyttäytymiseen. Laboratoriosynteesin tuloksia ei voida automaattisesti siirtää teolliseen tuotantoon arvioimatta sekoitusta, massan kuljetusta, puhdistusmahdollisuuksia, materiaalien kulutusta ja muita mittakaavasta riippuvia tekijöitä. [14]

Kuudenneksi historialliset taloudelliset vertailut voivat menettää ajantasaisuutensa ajan myötä. Reagenssien kustannukset, automatisoinnin taso, ekspressiotekniikat, puhdistuslaitteet, liuottimien talteenotto ja tuotantoinfrastruktuuri kehittyvät jatkuvasti. Vanhemmat kustannusanalyysit voivat edelleen olla tieteellisesti merkityksellisiä, mutta ne eivät välttämättä heijasta markkinoiden nykyistä taloudellista tilannetta. [1]

Seitsemänneksi ympäristövertailut edellyttävät johdonmukaisia analyysin rajoja. Liuottimien kulutuksen arviointi pelkästään ketjun kokoamisen aikana, jolloin puhdistus ja eristäminen jätetään huomiotta, voi johtaa harhaanjohtaviin johtopäätöksiin prosessin kestävyydestä. [14] [15]

Lopuksi on syytä huomata, että menetelmän nimi itsessään ei määritä tuotteen laatua. SPPS, liuossynteesi, LPPS, fragmenttien ligaatio sekä biologinen ilmentyminen voivat johtaa korkealaatuiseen materiaaliin, jos prosessi on suunniteltu ja valvottu asianmukaisesti. Mikään näistä menetelmistä ei kuitenkaan takaa automaattisesti tuotteen oikeaa identiteettiä, puhtautta, stereokemiaa, taitekuviointia tai sopivuutta tiettyyn käyttötarkoitukseen.

Yhteenveto

Peptidien synteesiä on parasta ymmärtää hallittuna molekyylien valmistusprosessina, ei pelkästään peptidisidosten muodostamisena.

Tavoitteena on rakentaa tietty aminohappojono ja samalla hallita jäännösten sitoutumistapaa, suojaryhmien kemiaa, stereokemiaa, sivureaktioita sekä kaikkia muita rakenteellisia vaatimuksia.

Kiinteän faasin peptidisynteesi pitää kasvavan ketjun liukenemattomalla kantajalla, minkä ansiosta toistuvat kytkentä- ja huuhteluvaiheet soveltuvat hyvin automatisointiin. Toistettavan synteesin edut eivät kuitenkaan poista ongelmia, kuten epätäydellisiä reaktioita, aggregaatiota, sekvenssien deleetioita tai sekvenssistä riippuvia sivureaktioita. [4] [6] [7]

Perinteinen liuossynteesi pitää peptidivälituotteet nestemäisessä faasissa ja voi tarjota suuremman joustavuuden yksittäisten välituotteiden eristämisessä ja karakterisoinnissa. Toistuva erottelu ja liukoisuuden heikkeneminen voivat kuitenkin muodostua vakaviksi rajoitteiksi.

Nestevaiheen synteesimenetelmät, joissa käytetään liukoisia merkkejä, pyrkivät yhdistämään liuoksen kemian suunniteltuihin materiaalin talteenottostrategioihin. Ne voivat siten tarjota lisävaihtoehdon sellaisille sekvensseille ja tuotanto-ongelmille, joihin perinteinen SPPS ei ole optimaalinen ratkaisu. [8] [9]

Pidempiä tai erityisen vaikeita molekyylejä voidaan valmistaa myös yhdistelemällä fragmentteja, mukaan lukien luonnollinen kemiallinen ligaatio, sen sijaan, että luotettaisiin pelkästään peräkkäisten aminohappotähteiden jatkuvaan lisäämiseen. [10]

Valitusta synteesimenetelmästä riippumatta kytkennän tehokkuus ja suojaryhmien kemia ovat edelleen avainasemassa, sillä pienet tehottomuudet ja sivureaktiot voivat kumuloitua synteesin myöhemmissä vaiheissa. Aspartimidin muodostuminen, deleetiosekvenssit ja stereokemialliset muutokset osoittavat, miksi pelkkä suunniteltu sekvenssi ei kuvaa kaikkea, mitä prosessin aikana voi syntyä. [2] [11] [12]

Työ ei myöskään pääty ketjun valmistumiseen.

Puhdistus ratkaisee, voidaanko lopputuote erottaa muista ainesosista.

Tämän jälkeen asianmukaisesti valitut analyysimenetelmät antavat vastauksen erillisiin kysymyksiin, jotka koskevat identiteettiä, puhtautta, pitoisuutta, stereokemiaa, konformaatiota sekä – mikäli sillä on merkitystä – funktionaalista aktiivisuutta. [3] [12] [13]

Tuotannon laajentaminen tuo mukanaan uusia haasteita, jotka liittyvät massan kuljetukseen, hartsin säilyvyyteen, liuottimien kulutukseen, suodatukseen, puhdistusmahdollisuuksiin, prosessin toistettavuuteen ja sen ympäristövaikutuksiin. Tästä syystä teollisessa prosessiarvioinnissa tulisi ottaa huomioon sekä synteesi, puhdistus että eristäminen, eikä keskittyä pelkästään kondensaationopeuteen. [14] [15]

Tärkein sääntö on seuraava:

Peptidin tehokas tuotanto edellyttää koko prosessin hallintaa – molekyylisuunnittelusta ja sidosten muodostamisesta puhdistukseen ja rakenteellisten ominaisuuksien määrittämiseen asti. Odotetun nimellismassan omaavan ketjun tai korkean kromatografisen pääpiikin saaminen on arvokas todiste, mutta mikään näistä parametreistä ei yksinään vahvista molekyylin täydellistä identiteettiä eikä tuotantoprosessin laatua.

Vastuuvapauslauseke

Artikkeli on luonteeltaan yksinomaan opettavainen sekä tieteellinen ja tiedottava. Siinä kuvataan peptidikemian yleisiä periaatteita, kiinteän faasin synteesiä, liuoksessa ja nestemäisessä faasissa tapahtuvaa synteesiä, suojaryhmästrategioita, kytkentää, puhdistusta, analyyttistä karakterisointia, tuotantoprosesseja sekä esimerkkejä julkaistuista tutkimuksista. Se ei ole laboratorioprotokolla, tuotanto-ohje, lääketieteellinen neuvo, annostus- tai antamisopas eikä minkään tietyn peptidituotteen laatutodistus. Kokeelliset tulokset on tulkittava ottaen huomioon sekvenssit, käytetyt menetelmät, prosessin laajuus, analyysitekniikat ja yksittäisten tutkimusten rajoitukset.

Viitteet

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K., & Perczel, A. (2016). 20–40 aminohapon pituisten polypeptidien ja miniproteiinien bakteeriperäinen ilmentyminen ja/tai kiinteän faasin peptidisynteesi: luokan B GPCR-ligandien tapaustutkimus. Current Protein & Peptide Science, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Aspartimidin muodostumisen estäminen peptidisynteesin aikana käyttämällä syanosulfuryylejä karboksyylihapon suojaryhminä. Nature Communications, 11(1), 982 §. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C. ja Barany, G. (1992). Naudan haiman trypsiinin estäjän (BPTI) ja kahden analogin kiinteävaiheinen synteesi. Kemiallinen lähestymistapa disulfidisiltojen roolin arvioimiseksi proteiinien taitossa ja stabiilisuudessa. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. PubMed-tietue
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). Kiinteän faasin peptidisynteesin reaaliaikainen seuranta vaihtelevan kerroksen virtausreaktorilla. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F. ja Becker, C. F. W. (2015). Peptidihydratsidien tehokas tuottaminen Peptidyl-Wang-TentaGel-hartsien suoralla hydratsinolyysillä. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Nopea virtaukseen perustuva peptidisynteesi. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2017). Täysin automatisoitu virtaukseen perustuva menetelmä peptidien synteesin nopeuttamiseksi. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G., & Albericio, F. (2022). Nestevaiheen peptidisynteesi (LPPS): kolmas aalto peptidien valmistuksessa. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T. ja Fukui, T. (2012). Uusi difenyylimetyylistä johdettu amidi-suojaryhmä tehokkaaseen nestevaiheiseen peptidisynteesiin: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., & Kent, S. B. (1994). Proteiinien synteesi natiivilla kemiallisella ligaatiolla. Science, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Racemisoitumisen ja aspartimidin muodostumisen rajoittaminen mikroaaltotehostetussa Fmoc-kiinteävaihepeptidisynteesissä. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Synteettisen reniinisubstraattipeptidin epäpuhtauksien karakterisointi nopean atomipommituksen massaspektrometrian ja hybriditandem-massaspektrometrian avulla. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G., & Crowther, J. B. (1995). Peptidien kiraalisen puhtauden määrittäminen: hydrolyysi deuteroidussa hapossa, derivatisointi Marfeyn reagenssilla ja analyysi suorituskykyisellä nestekromatografialla, elektrospray-ionisaatiolla ja massaspektrometrialla. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Prosessin massaintensiteetti (PMI): Nykyisten peptidien valmistusprosessien kokonaisvaltainen analyysi tukee peptidisynteesin kestävyyttä. The Journal of Organic Chemistry, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Kestävyyshaasteet peptidien synteesissä ja puhdistuksessa: tutkimuksesta ja kehityksestä tuotantoon. The Journal of Organic Chemistry, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001