Синтез на пептиди: метод на твърда фаза, в разтвор и методи за производство

Синтезът на пептиди е контролиран процес на образуване на аминокиселинни вериги с определена последователност. При химическия синтез избраните аминокиселини се свързват чрез пептидни съединения, като същевременно се контролират другите реактивни групи, присъстващи в тези молекули. Целта следователно не е само свързването на аминокиселините, а получаването на конкретна молекулна структура с определена последователност, стереохимия, структура на краищата на веригата и – ако е необходимо – допълнителни структурни характеристики.

Сред основните методи са синтезът на пептиди в твърда фаза (SPPS), класическият синтез в разтвор, както и по-новите методи за синтез на пептиди в течна фаза (LPPS), при които се използват разтворими носители или молекулни маркери. Изследователските лаборатории и производствените предприятия могат също така да комбинират различни подходи, да синтезират поотделно по-къси фрагменти и след това да ги свързват помежду си, или да използват биологична експресия, ако тя е по-подходяща за дадената последователност.

Сравнението между химичната синтеза и бактериалната експресия на полипептиди, състоящи се от 20–40 аминокиселинни остатъци, показва важен принцип: практическият избор на метод за производство зависи от конкретната молекула, нейната последователност, склонността към агрегация, необходимите модификации, мащаба на производството и аналитичните изисквания. [1]

Получаването на желаната аминокиселинна последователност е само един от етапите в производството на пептида.

Целият процес може да включва:

проектиране на последователности → подготовка на градивни блокове → защита на функционалните групи → свързване → отстраняване на защитните групи → сглобяване на веригата → отделяне или свързване на фрагменти → окончателно оформяне на структурата → пречистване → потвърждаване на идентичността → анализ напримеси → определяне на съдържанието → окончателна характеристика.

При някои пептиди са необходими и допълнителни етапи, като циклизация, образуване на дисулфидни мостове, сгъване, конюгация или други химически модификации.

Поради тази причина правилното сглобяване на веригата не означава автоматично, че крайният материал притежава необходимата идентичност, чистота, стереохимия, конформация, стабилност или други изисквани характеристики.

Какво представлява синтезата на пептиди?

Създаване на определена аминокиселинна последователност

Пептид се състои от остатъци от аминокиселини, свързани с пептидни връзки.

Целта на синтеза на пептида е да се създадат тези връзки в предварително определена последователност, често при едновременен контрол на:

• видове аминокиселини;
• редът на аминокиселините в последователността;
• стереохимия;
• структури на края N;
• структури на края на C;
• модификации на страничните вериги;
• разположението на дисулфидните мостове;
• циклизация;
• други изисквани структурни характеристики.

Последователността е от основно значение, тъй като един и същ аминокиселинен състав може да доведе до образуването на различни молекули, ако аминокиселините са подредени в различен ред.

Твърдението, че дадено молекула е „пептид, съставен от пет аминокиселини”, предоставя следователно много малко информация за нейната действителна структура. За да се опише правилно молекулата, е необходимо да се знае видът на аминокиселините, тяхната последователност, стереохимията, крайните групи, както и евентуалните допълнителни модификации.

Следователно два пептида могат да имат абсолютно еднакъв аминокиселинен състав, но въпреки това да представляват различни молекулни структури.

Допълнителни разлики могат да се дължат на модификации на краищата на веригата, наличието на дисулфидни мостове, циклична структура, промени в страничните вериги или различна стереохимична конфигурация.

При химичния синтез на пептиди обикновено се използват аминокиселини, чиито реактивни групи са били селективно защитени.

Временните защитни групи позволяват образуването на конкретна, желана химична връзка, като същевременно ограничават конкурентните реакции в други части на молекулата.

В следващите планирани етапи на синтеза тези групи се отстраняват или променят.

Контролирана реакция вместо спонтанно свързване

В основните химически описания образуването на пептидна връзка често се представя като реакция на кондензация, при която две аминокиселини се свързват с общо отделяне на молекула вода.

Това уравнение описва общия баланс на реакцията.

Не трябва обаче да го приравняваме с начина, по който на практика се извършва контролираният синтез на пептиди.

Самото смесване на свободните аминокиселини не би позволило да се определи с достатъчна точност:

• коя аминогрупа трябва да реагира;
• коя карбоксилна група трябва да реагира;
• коя аминокиселина трябва да бъде на първо място;
• който трябва да бъде на второ място;
• дали страничните вериги ще започнат да реагират;
• дали стереохимията ще се запази;
• дали няма да се образуват множество нежелани продукти.

Следователно в практическата химическа синтеза се прилагат контролирани стратегии за активиране и защита на функционалните групи.

Групата, произхождаща от карбоксилна група, обикновено се активира по такъв начин, че да може ефективно да реагира с избраната аминогрупа. Защитните групи, последователността на реакциите, химията на носителя, свързващите реагенти, разтворителната среда и методите за изолиране съвместно спомагат за насочването на реакцията към желания продукт.

Ефективният синтез на пептида изисква следователно контрол както върху химичните реакции, които трябва да протичат, така и върху тези, които трябва да бъдат предотвратени.

Добър пример за това е образуването на аспартимид.

Изследователите разработиха алтернативен метод за защита на карбоксилната група, чиято цел беше да се ограничи тази проблемна странична реакция по време на синтеза на пептида. [2]

Изследването разкрива един по-общ принцип в пептидната химия: предотвратяването на нежелани молекулни промени може да бъде също толкова важно, колкото и образуването на правилната пептидна връзка.

Кога може да се счита, че пептидът е готов?

Завършването на създаването на линейната структура на пептида не винаги означава, че цялата синтеза е приключила.

В зависимост от целевото молекула след сглобяването на веригата може да се наложат допълнителни етапи.

Те могат да включват:

• пълно премахване на защитните групи;
• отделяне на пептида от твърдия носител;
• премахване на временните маркери;
• циклизация;
• окисляване;
• образуване на дисулфидни мостове;
• нагъване;
• конюгация;
• модифициране на краищата на веригата;
• пречистване;
• аналитични характеристики.

Някои пептиди изискват сравнително малко допълнителни структурни промени след сглобяването на веригата.

В други случаи по-късните етапи са от ключово значение.

Добър пример за това е синтезът на говеждия инхибитор на панкреатичната трипсин (BPTI). Изследователите са синтезирали линейна последователност, пречистили са материала и впоследствие са получили нагъната структура, съдържаща дисулфидни мостове. Съгласно анализите и функционалните сравнения, представени в проучването, крайният материал с естествена последователност съответстваше на естествения протеин по отношение на изследваните параметри. [3]

Този пример илюстрира разликата между сглобяването на пептидния скелет и получаването на напълно характеризирана крайна молекулна форма.

Методът, който позволява да се получи правилна линейна последователност, не потвърждава автоматично:

• правилното сгъване;
• правилното разположение на дисулфидните мостове;
• биологична активност;
• стабилност;
• профил на замърсяването;
• пригодност за конкретно приложение.

Всяка от тези въпроси изисква отделни доказателства.

Химична синтеза, биологична експресия и комбинирани методи

При химичния синтез на пептиди предварително приготвените молекулни блокове се свързват в контролирани лабораторни реакции.

Биологичната експресия, от друга страна, използва клетъчния апарат за синтезиране на кодираната аминокиселинна последователност. След това материалът трябва да бъде извлечен, пречистен и, ако е необходимо, подложен на по-нататъшна обработка.

И двата метода могат да доведат до получаването на пептиди или полипептиди, но са свързани с различни възможности и ограничения.

Химичната синтеза може да бъде особено полезна, когато са необходими:

• избрани нестандартни аминокиселини;
• химични модификации на конкретни места;
• определени структури на краищата на веригата;
• изотопни маркери;
• модификации на пептидния скелет;
• други характеристики, които е трудно да се постигнат чрез стандартна биологична експресия.

Биологичната експресия може да бъде привлекателна при подходящи по-дълги последователности или определени стратегии за маркиране, но не премахва проблемите, възникващи на по-късните етапи от производството.

Освен това трябва да се вземат предвид рециклирането на материала, сгъването, преработката, замърсяванията, произхождащи от организма на гостоприемника, пречистването и аналитичните характеристики.

Следователно нито един от методите не е универсално най-добрият.

При сравнението на полипептиди, състоящи се от 20–40 аминокиселинни остатъци, както дължината на последователността, така и склонността ѝ към агрегация са повлияли на резултатите от синтеза в твърда фаза и от бактериалната експресия. [1]

Тези наблюдения подкрепят подхода, при който методът на производство се подбира според конкретното молекула.

Историческите данни относно производителността, разходите, оборудването и времето за производство не трябва да се разглеждат като универсални съвременни стойности, тъй като технологиите, реактивите, автоматизацията, методите за пречистване и икономиката на производството се променят с развитието на технологиите.

Синтез на пептиди в твърда фаза

Растящата верига е прикрепена към неразтворим носител

При синтеза на пептиди в твърда фаза (SPPS) нарастващата пептидна верига остава прикрепена към неразтворимия носител по време на последователните цикли на синтеза.

Като носител най-често се използва функционализирана полимерна смола.

Свързващият елемент, т.е. линкерът, свързва пептида с носителя и влияе, наред с другото, върху начина на последващото освобождаване на готовата верига, както и върху вида на получената крайна група.

Едно от основните практически предимства на SPPS е по-лесното разделяне на материала.

След приключването на определен етап от реакцията разтворимите реагенти и много от разтворимите странични продукти могат да бъдат отстранени чрез промиване, докато образуващият се пептид остава свързан с твърдата фаза.

По този начин не е необходимо, след добавянето на всяка следваща аминокиселина, растящият пептид да се изолира и пречиства като отделно, свободно съединение.

Това удобство обаче може да доведе до сериозно недоразумение.

Промиването на смолата не означава, че всички неправилни пептиди са били отстранени.

Ако веригата, прикрепена към смолата, не реагира по време на един етап от съединяването, тя може да остане върху носещата повърхност.

В следващите цикли той може отново да реагира и да продължи да се удължава.

В резултат на това може да възникне делеционна последователност, т.е. молекула, която се различава от целевия пептид чрез липсата на един или повече аминокиселинни остатъци.

По същия начин химически модифицираните или не напълно дезактивирани вериги, свързани със смолата, могат да участват в следващите етапи на синтеза.

По този начин SPPS улеснява отделянето на разтворимите вещества от материала, свързан със смолата.

Това обаче не гарантира идеално съвпадение на последователността.

Повтарящ се цикъл на разблокиране и свързване

Типичният поетапен синтез на SPPS включва повтаряне на три основни операции:

отстраняване на защитата → свързване → измиване.

Първо се разкрива реактивната аминогрупа, намираща се в края на нарастващата верига.

След това към веригата се присъединява още една защитена аминокиселина.

Разтворимите реактиви, излишъкът от аминокиселина и много от продуктите на реакцията се отстраняват преди началото на следващия цикъл.

Повтарянето на този процес позволява синтеза на пептида по един аминокиселинен остатък.

При класическата SPPS C-крайната част обикновено се свързва първа с носителя, а след това веригата се удължава в посока към N-края.

Това се различава от стандартната рибозомна синтеза на протеини, при която последователните аминокиселини се присъединяват към С-края на нарастващата верига.

Окончателната последователност на аминокиселините обаче може да бъде идентична, въпреки че посоката и химията на процеса на сглобяване са различни.

Терминът „цикъл” не трябва да се разбира като единен универсален набор от реакционни условия, подходящ за всеки остатък и всяка последователност.

Ходът на реакцията може да зависи от:

• стратегии на защитните групи;
• вид аминокиселина;
• пространствените условия около мястото на реакцията;
• вид смола;
• линкер;
• дължината на веригата;
• агрегиране;
• разтворител;
• химия на съединяването;
• запазване на структурата на растящия пептид.

Реакция, която протича лесно в началото на синтеза, може да стане значително по-трудна на по-късен етап.

Ето защо наблюдението на процеса остава важно дори в силно автоматизираните системи.

Защо свойствата на смолата са от значение?

Твърдият носител не е просто пасивен държач.

Неговите физични и химични свойства могат да оказват пряко влияние върху хода на реакцията.

Един от важните параметри е набъбването.

Ако смолата набъбва правилно в избраната разтворителна среда, реагентите могат по-лесно да достигнат до реактивните участъци, разположени в цялата структура на полимера.

Недостатъчното набъбване или промените в структурата на смолата могат да ограничат този достъп.

Значение могат да имат също:

• плътност на засаждане;
• структурата на полимера;
• структура на линкера;
• съвместимост с разтворители;
• механична устойчивост;
• порестост;
• дифузионни свойства;
• взаимодействия между растящите пептидни вериги.

С увеличаването на дължината на пептида отделните вериги могат също да взаимодействат помежду си.

Агрегацията върху смолата може да ограничи достъпа до реактивните места и да доведе до непълно свързване или непълно деактивиране.

Това означава, че последователността, която се държи правилно в началото на синтеза, може да става все по-трудна с удължаването на веригата.

Изследователите разработиха проточни реактор с променливо легло, който позволяваше наблюдение на набъбването на смолата въз основа на измервания, свързани с налягането. [4]

Изследването се отнасяше до агрегацията върху смолата и непълното образуване на връзки като технологични проблеми, които при други условия може да са трудни за пряко наблюдение по време на синтеза.

Това показва, че наблюдението на физическото поведение на носителя може да предостави информация, която надхвърля самото регистриране на добавените реагенти.

За какво се използва смолата „Wanga“?

Химията на линкерите от типа на Wang се използва широко в SPPS, когато след отделянето на пептида се изисква С-краят да бъде под формата на карбоксилна киселина.

Пептидът е свързан чрез естерна връзка, която по-късно може да бъде разградена при подходящи условия.

Могат да се избират и други системи на линкери, когато е необходима различна структура на С-края, например амидна група.

Добре е да се прави разграничение между химичния състав на линкера и целия физически носител.

Свързващите елементи от типа „Wang“ могат да се внедряват в различни полимерни архитектури.

Тези материали не е необходимо да са идентични:

• свойства на набъбване;
• капацитет;
• съвместимост с разтворители;
• механични свойства;
• поведение по време на реакцията.

Изследванията, при които са използвани носители от типа „пептидил-Wang-TentaGel“, показаха специфичен алтернативен метод за получаване на пептидни хидразиди, които са полезни междинни продукти в пептидната химия. [5]

Това не означава, че стандартното отделяне от смолата на Уанг обикновено води до образуването на пептидни хидразиди.

Това обаче илюстрира един важен принцип:

носителят + линкерът + условията на реакцията + химията на отцепването заедно определят получения продукт.

Синтез на SPPS в периодична и поточна система

SPPS може да се провежда в класически периодични съдове или в системи, в които реагентите преминават през реактор, съдържащ твърд носител.

Системите с непрекъснат поток могат да позволят бърза смяна на реагентите и по-прецизен контрол върху химичната среда около смолата.

В проучване от 2014 г. е представен метод за бързо синтезиране на пептиди в поточна система с непрекъснато наблюдение, който е приложен за няколко пептида и едно малко протеиново съединение. [6]

В по-късно автоматизирано проучване е описано значително по-бързо сглобяване на вериги, като за анализираните примери са постигнати чистота на суровия продукт и добив след изолиране, сравними с тези при класическата периодична синтеза. [7]

Тези изследвания показват възможностите на конкретни системи при определени условия.

Те обаче не доказват, че всеки пептид може да се произвежда еднакво бързо и с еднакво качество.

Времето, необходимо за синтезирането на пептида, включва също така много повече от самото сглобяване на веригата.

Цялостният процес може да включва:

• подготовка на реактиви;
• подготовка на смолата;
• съединяване;
• отключване;
• измиване;
• отделяне;
• обработката на продукта;
• пречистване;
• отстраняване на разтворители;
• окончателно оформяне на структурата;
• аналитични изследвания;
• документацията.

Бързото създаване на връзки е следователно само един от елементите на цялостната ефективност на производството.

Синтез в течна фаза

Какво означава този термин?

Изразът „синтез на пептиди в течна фаза” може да се използва в няколко значения.

В широк смисъл това може просто да означава синтез на пептид, извършван в разтвор.

В по-специализираната литература обаче често се прави разграничение между:

1. класически синтез на пептиди в разтвор;
2. синтез на пептиди в твърда фаза;
3. по-новите методи на LPPS, при които нарастващата верига съдържа разтворим маркер или носител.

Това разграничение е важно, тъй като променя начина на сортиране и рециклиране на продукта.

Свободно разтворен, защитен пептиден полупродукт може да се наложи да бъде изолиран, като се използват неговите собствени физични и химични свойства.

При маркиран полупродукт маркерът може да бъде проектиран така, че да улеснява утаяването, екстракцията, задържането върху мембрана или друг начин на разделяне.

В обзора относно LPPS се прави ясно разграничение между класическата синтеза в разтвор, SPPS и методите, използващи разтворими маркери. [8]

Публикацията е полезна за систематизиране на терминологията и методологията.

Тя обаче не бива да се тълкува като единичен експеримент, доказващ, че един от методите е най-добрият за всеки пептид.

Класически синтез на пептиди в разтвор

При класическата синтеза в разтвор защитените аминокиселини, пептидните междинни продукти или фрагментите остават разтворени в реакционната среда, вместо да бъдат ковалентно свързани с неразтворима смола.

След приключването на реакцията съответният полупродукт може да бъде изолиран, пречистен и, ако е необходимо, охарактеризиран, преди да се пристъпи към следващия етап.

Това може да донесе някои ползи.

Изследователите могат:

• да опише отделните полуготови продукти;
• да подбере метод за пречистване, подходящ за конкретен полупродукт;
• да оптимизира отделните процеси;
• да подготвя отделни части самостоятелно;
• да се промени маршрутът на синтеза, когато даден междинен продукт създава проблеми.

Синтезът в разтвор обаче може да бъде свързан и със значителни трудности.

С удължаването на веригата пептидите могат:

• да станат слаборазтворими;
• да агрегирам;
• да са трудни за кристализиране;
• да създават замърсители, които са близко свързани;
• да е трудно да се разделят;
• да изисква многократна изолация;
• да доведе до загуба на материал по време на следващите етапи на обработката.

Следователно синтезът в разтвор не е автоматично по-прост или по-лесен за мащабиране в сравнение със SPPS.

Нейната приложимост зависи от конкретната последователност, стабилността на междинните продукти, разтворимостта, дължината на синтетичния път, поведението по време на пречистването, както и ефективността на следващите етапи на изолиране.

Развитието на стратегиите за LPPS с маркировка донякъде се дължи на опитите да се решат именно тези проблеми, свързани с разделянето и обработката на материала. [8]

Разтворимите маркери съчетават проектирането на реакциите с проектирането на процесите на разделяне

В маркирания LPPS растящият пептид притежава временна молекулярна връзка, проектирана така, че да повлияе на неговите физични свойства.

Маркерът може да позволи поддържането на достатъчна разтворимост на пептида по време на реакцията, а впоследствие да улесни неговото селективно извличане.

В зависимост от технологията, при разделянето могат да се използват:

• утаяване;
• екстракция;
• задържане върху мембраната;
• фазово поведение;
• други свойства, произтичащи от наличието на маркера.

В една от експерименталните стратегии бе използвана дълговерижна защитна група на С-края за получаване на пептидни амиди.

Повторените реакции и етапите на утаяване позволиха на изследователите да синтезират хидрофобен пептид, който, според сравнението, което те направиха, беше труден за получаване с удовлетворителни резултати чрез метода SPPS. [9]

Това показва, че тази конкретна стратегия е подходяща за анализираната последователност.

Това обаче не доказва всеобщото предимство на маркираната синтеза.

Маркерът се превръща в част от производствения процес и поражда свои собствени въпроси:

• Колко ефективно се свързва?
• Променя ли хода на реакцията?
• Как може да се възстанови надеждно маркираният полуфабрикат?
• Води ли това до образуването на нови замърсители?
• Как се премахва?
• Може ли да се потвърди пълното изтриване?
• Какви аналитични методи потвърждават отсъствието му в крайния продукт?

Следователно разтворимите маркери трябва да се разглеждат като функционални елементи на проекта на процеса, а не само като обикновени етикети.

Сравнение на основните методи

Сравнението представя общите принципи на действие на отделните методи.

Не се посочва коя от тях ще осигури най-добра производителност, чистота, цена, екологична устойчивост или възможност за мащабиране за конкретна последователност.

Тези параметри трябва да се оценяват въз основа на конкретната молекула и конкретния производствен процес. [4] [8] [9]

Съединяване на фрагменти и хибридно производство

Пептидът не винаги трябва да се синтезира в един непрекъснат процес, състоящ се в добавянето на последователни аминокиселинни остатъци.

Алтернативна стратегия е първо да се синтезират по-къси пептидни фрагменти, а след това да се съединят.

Хибридният процес може, например, да използва SPPS за получаване на отделни фрагменти и разтворна химия за тяхното свързване.

Фрагментарните стратегии могат да ограничат някои проблеми, свързани с много дългия поетапен синтез.

Те обаче поставят нови предизвикателства, като например:

• избор на подходящо място за свързване;
• разтворимост на фрагментите;
• активиране на мястото на съединение;
• химиоселективност;
• запазване на стереохимията;
• странични ефекти;
• почистване на части;
• пречистване след тяхното обединяване.

Важен пример за контролирано свързване на фрагменти е естествената химическа лигация.

В класическия вариант пептидният тиоестер реагира с друг пептид, съдържащ N-краен цистеин. Последващото прегрупиране води до образуването на правилна връзка в пептидната верига на мястото на лигацията.

Първоначалните изследвания показаха, че след лигиране и сгъване е възможно да се получи протеин, съдържащ дисулфидни мостове. [10]

Това потвърждава значението на тази стратегия за съединяване на фрагменти.

Това обаче не означава, че произволни два немодифицирани пептидни фрагмента могат спонтанно да се свържат.

Свързване и защитни групи

Свързването създава целенасочена връзка

Свързването е етап от реакцията, по време на който между избрани единици се образува нова пептидна връзка.

Обикновено групата, произхождаща от карбоксилната група, се активира, за да може ефективно да реагира със съответната аминогрупа.

Химичният състав на активатора трябва да отговаря на:

• възходяща последователност;
• временни защитни групи;
• защита на страничните вериги;
• стереохимия;
• носител или маркер;
• среда на разтворителя;
• с други функционални групи, присъстващи в молекулата.

Ефективното свързване е особено важно при поетапната синтеза, тъй като непълната реакция може да доведе до образуването на делеционни последователности.

Ако един етап от добавянето на аминокиселина се провали за част от растящите вериги, тези вериги могат да останат в системата и да участват в следващите цикли.

В резултат на това могат да се образуват молекули, много подобни на целевия пептид, но без един остатък.

Дори и малките неефективности могат да се натрупват по време на многото етапи на синтеза.

Един прост математически пример добре илюстрира този проблем.

Ако всеки от 50-те независими етапа на сглобяването имаше вероятност за успех 99%, процентът на молекулите, при които всички етапи биха приключили успешно, би бил:

0,99^50 ≈ 0,605

или около 61%.

Това е само математическа илюстрация.

Това не представлява прогноза за действителната чистота или ефективността на синтеза на пептид, съдържащ 50 остатъка.

Действителното производство включва:

• различна ефективност на съединяването в отделните позиции;
• етапи на отключване;
• странични ефекти;
• в зависимост от нивото на трудност;
• стратегии за повторно свързване;
• загуби при отделянето;
• загуби при пречистването;
• други променливи на процеса.

Изчислението показва само защо дори на пръв поглед незначителна неефективност на отделен етап може да придобие голямо значение в многоетапния синтез.

Защитните групи контролират мястото на инцидента

Една аминокиселина може да съдържа няколко химически реактивни групи.

Без селективен контрол реакциите на свързване биха могли да протичат на нежелани места.

Защитните групи временно блокират избрани реактивни места.

Аминогрупата, използвана за удължаване на веригата, обикновено се нуждае от временна защита, докато реактивните странични вериги може да се наложи да бъдат защитени по начин, който остава на мястото си през много цикли на синтеза.

Свързването с носителя също трябва да издържи тези етапи до момента на планираното отделяне.

Изборът на защитни групи оказва влияние върху цялата стратегия на синтеза.

Трябва да се вземе предвид:

• начинът на въвеждането им;
• стабилност;
• начин на премахване;
• съвместимост с други защитни групи;
• съвместимост с носителя;
• странични ефекти;
• влиянието на конкретна последователност;
• окончателни условия за отмяна на застраховката.

Изследванията, при които се използва защита на базата на цианосулфурилид, се отнасяха до образуването на аспартимид чрез промяна на начина на защита на карбоксилната група. [2]

Резултатите показват, че стратегията на защитните групи оказва влияние не само върху това дали желаната реакция може да се осъществи, но и върху това какви нежелани реакции стават възможни.

Fmoc, Boc и ортогонална защита

Fmoc и Boc са широко използвани групи за защита на аминогрупи.

Те наистина се различават по начина на премахване.

Fmoc обикновено се отстранява в алкална среда, докато Boc е чувствителен към кисела среда.

Тези свойства позволяват те да се използват като елементи на по-широки стратегии за защита.

При широко използваната SPPS-технология, базирана на Fmoc, временната N-крайна защитна група Fmoc се отстранява многократно, докато избраните защитни групи на страничните вериги и връзката със смолата остават непокътнати до по-късните етапи.

Други стратегии могат да използват различни комбинации.

Особено важно понятие е ортогоналната защита.

Две защитни групи се считат за ортогонални, ако едната може да бъде селективно отстранена при условия, при които другата остава достатъчно стабилна, за да бъде възможно продължаването на синтеза.

Следователно ортогоналността е практическо съотношение на химическата съвместимост.

Това не означава, че всяка защитена група ще остане напълно непроменена след неограничен брой експозиции на всички реакционни условия.

Все още могат да се появят странични ефекти.

В изследванията върху синтеза на Fmoc са описани както образуването на аспартимид, така и нежелани стереохимични промени, въпреки предполагаемата селективност на общата стратегия за защита. [11]

Стереохимията е част от идентичността на молекулата

Много аминокиселини имат хирален център.

Това означава, че техните атоми могат да заемат различни пространствени конфигурации, съответстващи на различни стереохимични форми.

Промяната в конфигурацията на един стереогенни център може да доведе до образуването на друга пептидна структура, без да е необходимо да се променя номиналната му маса.

Ето защо само масата не може да потвърди напълно идентичността на пептида.

Епимеризацията обикновено означава промяна в конфигурацията на един стереогенни център в молекула, съдържаща няколко такива центъра.

Рацемизацията често се обсъжда и в пептидната химия в контекста на загубата на стереохимичната цялост на аминокиселинните остатъци.

Тези промени са важни, тъй като молекулярното разпознаване може да зависи в голяма степен от пространственото разположение на атомите.

Следователно две молекули със същия елементарен състав и номинална маса могат да се държат по различен начин, ако се различават по стереохимия.

В проучването на синтеза на Fmoc с помощта на микровълни бе установено, че някои остатъци са податливи на нежелани стереохимични промени при използваните условия. Модификацията на метода ограничи появата на тези реакции. [11]

Това не означава, че нагряването по дефиниция уврежда всички пептиди.

Правилното заключение е, че ускоряването на реакцията трябва да се оценява заедно с химическата селективност, която зависи от последователността.

Аспартимид и други сродни примеси

Образуването на аспартимид е добре известна странична реакция, свързана с определени последователности, съдържащи аспарагинат.

Може да се образува нежелан цикличен междинен продукт, от който впоследствие се образуват съединения с променена скелетна свързаност или стереохимия.

Вероятността за тази реакция зависи от последователността и условията на процеса.

Други замърсявания, свързани със синтеза, могат да бъдат причинени от:

• непълно съчетание;
• непълно отключване на предпазителя;
• възникването на делеционни последователности;
• реакции на страничните вериги;
• стереохимични промени;
• реакции по време на отделянето;
• окисляване;
• прегрупирания;
• условията за обработка на продукта;
• непълното премахване на защитните групи.

Някои замърсители предизвикват лесно забележима промяна в молекулното тегло.

Другите са значително по-трудни за разграничаване.

При аналитичните изследвания на синтетичния пептид, който служи като субстрат на ренина, бяха идентифицирани множество примеси, включително съставки, които показват една и съща промяна в масата, но съдържат модификации на различни позиции. [12]

За да се направи разграничение между тях, беше необходим допълнителен структурен анализ.

Изследователите също така разглеждаха предложените механизми за образуването на тези замърсители като хипотези.

Това е важно разграничение:

Определянето на това какво представлява замърсяването и доказването на точния механизъм на неговото възникване са два отделни научни въпроса.

Не трябва да се представя вероятният механизъм като доказан само защото съответства на наблюдаваната молекулна маса.

Пречистване, отстраняване на котлен камък и качество на производството

Суров продукт, пречистен продукт и производителност

Суровият пептид е вещество, получено преди завършването на съответните етапи на пречистване.

Може да съдържа:

• целеви пептид;
• делеционни последователности;
• материалът не е напълно обезвреден;
• модифицирани последователности;
• остатъци от реагенти;
• продукти, свързани с отделянето;
• соли;
• разтворители;
• други съставки, образуващи се в процеса.

Целта на пречистването е да се отдели желаният пептид от тази смес.

Трябва ясно да се разграничат три понятия:

чистота на суровината — измерен състав на материала преди окончателното пречистване;

добив на пречистения или изолирания продукт — количеството на извлечения целеви материал спрямо определена начална или теоретична стойност;

крайна чистота — съставът на изолирания материал, определен чрез конкретен аналитичен метод.

Тези понятия не са взаимозаменяеми.

Процесът може да доведе до образуването на голямо количество суров материал, но позволява да се получи сравнително малко количество пречистен продукт.

Друг процес може да дава по-малко суровина, но да се характеризира с висока селективност при получаването на целевия продукт.

По същия начин високата аналитична чистота не означава непременно висока производствена производителност.

В проучванията за ускорена поточна синтеза чистотата на суровината и добивът след изолиране са били правилно отчетени поотделно. [7]

Хроматографията разделя съставките, но не дава отговор на всеки въпрос

Високоефективната течна хроматография с обърната фазова система (RP-HPLC) се използва широко за анализ и пречистване на пептиди.

Различните молекули взаимодействат по различен начин със стационарната и подвижната фаза.

При подходящи условия тези разлики позволяват разделянето на съставките на сместа.

Аналитичната и препаративната хроматография имат свързани, но различни приложения.

Анализаторът HPLC се използва предимно за изследване на състава на пробата.

Устройството HPLC се използва за физическо събиране на разделилите се съставки.

Хроматограмата може да предостави много ценна информация.

Големият основен пик или високият процентен дял от неговата площ обаче не трябва да се разглеждат като пълна молекулярна характеристика.

Резултатите от хроматографията зависят, наред с другото, от:

• тип на колоната;
• фазата на движение;
• наклона;
• температури;
• методи за откриване;
• дължина на вълната;
• подготовка на пробата;
• начинът на интегриране на върховете;
• разделителна способност;
• свойствата на замърсителите.

Две съединения потенциално могат да се елуират едновременно.

Някои съставки на пробата също могат да реагират по различен начин на използвания детектор.

Ето защо високата повърхностна чистота при HPLC не е равнозначна на пълно потвърждение на молекулярната идентичност.

Изследванията на изобарните пептидни замърсители и хиралните анализи показват защо може да се наложи използването на допълнителни аналитични методи. [12] [13]

Аналитичният метод трябва да отговаря на конкретен структурен въпрос.

Идентичността, чистотата и съдържанието означават различни неща

В характеристиките на пептидите три понятия са от особено значение.

Идентичността отговаря на въпроса:

Налице ли е целевото молекула в пробата?

„Чистотата“ отговаря на въпроса:

Какви други компоненти се съдържат в пробата или коя част от измервания сигнал съответства на основния компонент?

Съдържанието отговаря на въпроса:

Колко от действителния пептид се съдържа в пробата?

На тези въпроси не винаги може да се отговори с едно-единствено измерване.

Материалът, съдържащ пептид, може също да съдържа:

• вода;
• противопоставени;
• соли;
• остатъци от разтворители;
• други съставки, свързани с процеса;
• замърсявания.

Следователно общата маса на претегления материал не е задължително да съответства на масата на самия пептид.

По същия начин съответствието на измерената молекулна маса с теоретичната стойност не се потвърждава:

• пълната аминокиселинна последователност;
• правилното свързване на отделните остатъци;
• стереохимична цялост;
• разположението на дисулфидните мостове;
• нагъвания;
• липса на изобарични замърсители.

Масовата спектрометрия може да предостави убедителни доказателства относно молекулното тегло.

Тандемната масова спектрометрия и други методи за определяне на структурата могат да предоставят допълнителна информация за последователността.

Хиралните методи позволяват да се анализират стереохимични въпроси, които не могат да бъдат решени чрез обикновено измерване на масата.

В едно от аналитичните изследвания дори е взета предвид рацемизацията, възникваща по време на подготовката на пробата. Това показва още един важен принцип: самата аналитична процедура може да доведе до артефакти, ако не е правилно проектирана. [13]

Настройките и дейностите може да изискват отделно потвърждение

При пептидите със структурно ограничена форма и малките протеини правилната аминокиселинна последователност и молекулното тегло все още може да не са достатъчни за потвърждаване на желаната крайна структура.

Допълнителните въпроси могат да включват:

• Създадени ли са правилните дисулфидни мостове?
• Приела ли е молекулата очакваната конформация?
• Циклизацията завършена ли е?
• Има ли структурни изомери?
• Проявява ли синтетичното съединение очакваната активност в даден експериментален тест?

В проучването на синтеза на BPTI бяха използвани няколко аналитични и биофизични методи, както и оценка на инхибирането на трипсина. [3]

Общите резултати потвърдиха съответствието на синтетичния материал с естествена последователност с естествения протеин по отношение на изследваните критерии.

Тестът за активност обаче дава отговор на конкретен функционален въпрос.

Не замества анализа на замърсителите.

По същия начин подобната активност в един тест не потвърждава пълната равностойност на всички биологични, структурни или производствени свойства.

Мащабирането на производството променя не само количеството на материала

Увеличаването на мащаба на производството не се състои единствено в пропорционално увеличаване на количеството на всички реактиви.

Физичните процеси могат да се проявяват по различен начин при по-голям мащаб.

Значение могат да имат:

• разбъркване;
• топлообмен;
• разпространение на реагенти;
• дифузия;
• набъбване на смолата;
• налягане;
• филтриране;
• управление на разтворителите;
• утаяване;
• разтворимост на полуготовите продукти;
• превоз на маса;
• възможностите на пречиствателната система.

Тези фактори могат да повлияят както на хода на реакцията, така и на образуването на замърсители.

Пречистването на по-късните етапи също може да се превърне в „тесно гърло“ на цялото производство.

Увеличаването на скоростта на синтеза има ограничено значение, ако пречиствателната система не е в състояние ефективно да отделя образуващите се замърсители или да извлича продукта с необходимото качество.

В промишлен анализ, обхващащ 40 процеса за синтез на пептиди от 14 фармацевтични компании, бе оценено потреблението на материали по време на синтеза, пречистването и изолирането. [14]

Проучването показва защо оценката на производството трябва да се извършва за целия процес.

Това обаче не означава, че всяка фабрика, производствена последователност или технология постига същите резултати.

Качеството на производството е резултат от редица елементи на контрола

Надеждното производство на пептиди изисква нещо повече от получаването на един задоволителен аналитичен резултат.

Контролираният процес обикновено включва няколко взаимосвързани елемента:

определено целево съединение → подходящи изходни материали → контролирана синтеза → контролирано пречистване → правилно вземане на проби → валидиран или подходящ за целта анализ → документация за партидата.

Документацията на партидата свързва аналитичните резултати с материала, който действително е бил произведен.

Сертификатът за анализ (COA) обобщава избрани резултати от изследванията на конкретна партида.

Информативната му стойност зависи от:

• видът на проведените изследвания;
• приложените методи;
• приложимостта на тези методи;
• спецификации;
• идентифициране на пробата;
• възможности за проследяване на партидите;
• потвърждение, че отчетените резултати действително се отнасят за съответния материал.

Една единствена стойност, определяна като „чистота”, сама по себе си не може да потвърди:

• пълна молекулярна идентичност;
• съдържание на пептида;
• стереохимична цялост;
• нивото на остатъците от разтворители;
• водно съдържание;
• състава на противойоните;
• микробиологични свойства;
• нагъвания;
• биологична активност;
• пригодност за определена цел.

Подходящият набор от анализи зависи от предвиденото приложение на материала.

Пептидът, използван като аналитичен референтен материал, реагент за изследване в клетъчен експеримент, както и материал, намиращ се на етап на фармацевтично разработване, може да наложи отговори на различни въпроси, свързани с качеството.

Следователно аналитичните данни трябва да се тълкуват в ясно определен контекст, а не като универсално потвърждение на качеството.

Оценката на екологичната устойчивост трябва да обхваща целия процес

Синтезът на пептиди може да изисква значителни количества разтворители и реагенти.

Следователно оценката на въздействието върху околната среда трябва да обхваща много повече от самия етап на свързване.

Сред важните елементи могат да бъдат:

• производство на строителни блокове;
• съединителни реагенти;
• реактиви за отключване;
• измиване;
• отделяне;
• обработка на продукта;
• хроматография;
• замяна на разтворители;
• изолация;
• сушене;
• управление на отпадъците.

Намаляването на въздействието върху околната среда може да изисква едновременно подобрение на няколко етапа.

В публикуваната анализа относно производството на пептиди се разглеждат проблемите, свързани както със синтеза, така и с пречистването, и се посочва необходимостта от усъвършенстване на целия проект на процеса. [15]

Като проучване с перспективен характер, то не представлява контролирано пряко сравнение, което да докаже, че една конкретна технология винаги е по-екологична.

По същия начин:

по-бързата синтеза не означава автоматично по-екологична синтеза,

а по-малкото потребление на разтворители по време на самата синтеза не означава автоматично по-малко въздействие на целия производствен процес.

Екологичните сравнения изискват използването на последователни граници на анализа и най-добре е потреблението на ресурси да се отнася към определено количество изолиран и характеризиран краен продукт.

Често задавани въпроси

1. С какво се различава синтезът на пептиди в твърда фаза от синтеза в течна фаза?

При синтеза в твърда фаза растящият пептид остава свързан с неразтворим носител, докато при класическия синтез в разтвор пептидният полупродукт остава разтворен и обикновено трябва да бъде извлечен въз основа на неговите физични и химични свойства. В по-тесен смисъл при LPPS разтворената растяща верига притежава допълнително разтворим маркер или носител, улесняващ последващото разделяне. Изследванията в областта на маркираната синтеза показват една от стратегиите за съчетаване на разтворната химия с извличане чрез утаяване, докато литературата относно LPPS разграничава такива решения както от класическата синтеза в разтвор, така и от SPPS. Нито един метод по дефиниция не е оптимален за всеки пептид. Основната разлика се отнася до начина на физическото провеждане и разделяне на нарастващата верига по време на последователните етапи на синтеза. [8] [9]

2. Защо при синтеза на пептиди могат да възникнат примеси?

Замърсяванията могат да възникнат, защото желаните реакции не винаги протичат количествено, а други функционални групи могат да участват в нежелани реакции. Непълното свързване може да доведе до делеционни последователности, непълното дезактивиране може да наруши по-нататъшното сглобяване на веригата, а някои последователности са податливи на стереохимични промени, образуване на аспартимид, окисляване, прегрупиране или странични продукти, свързани с отцепване. Изследванията на Fmoc-синтезата и структурният анализ на синтетичните пептидни примеси документират няколко такива примера. [11] [12] Честотата и значимостта на отделните примеси зависят от последователността и процеса, поради което автоматизацията на синтеза не трябва да се приравнява на пълна липса на химически грешки.

3. Каква роля играе смолата в синтеза на пептидите?

Смолата задържа нарастващия пептид, докато разтворимите реагенти и много от страничните продукти могат да се отстраняват между последователните етапи на синтеза. Това значително опростява повтарящото се съединяване на веригата, но смолата не е само механично укрепване. Нейното набъбване, степента на запълване, архитектурата на полимера, съвместимостта с разтворителите и достъпността на реакционните места могат да повлияят на ефективността на достигането на реагентите до прикрепения пептид. В изследвания, използващи реактор с променливо легло, е наблюдавано поведението на смолата по време на анализ на агрегацията и ефективността на свързването. [4] Такова наблюдение не елиминира грешките в последователността, но показва защо физическото състояние на смолата може да бъде важна променлива в процеса.

4. За какво се използва смолата „Ванга“ при синтеза на пептиди?

Носителите от типа „Wang“ обикновено се свързват с получаването на пептиди, които се освобождават след съответното отцепване от С-края под формата на карбоксилна киселина. Точният краен продукт обаче зависи от линкера, архитектурата на носителя и използваната химия на отцепването, а не само от наименованието на смолата. Изследователите представиха също така специализирана методика за превръщане на пептидил-Wang-TentaGel в пептидни хидразиди, които могат да служат като полезни синтетични междинни продукти. [5] Алтернативната реакция не променя значението на стандартното отделяне от смолата на Уанг. Тя обаче показва защо при прогнозирането на продукта трябва да се анализира цялата система от носител и реакционни условия.

5. SPPS синтезира ли пептида от N-края или от C-края?

Класическият етапен SPPS обикновено започва с присъединяването на C-крайния остатък към носителя, след което веригата се удължава в посока към N-края. Това е посока, обратна на стандартното удължаване на веригата в рибозомата, където протеинът се синтезира чрез добавяне на последователни аминокиселини към С-края. Синтезът на BPTI е пример за използване на защитени градивни блокове и носител, последвано от освобождаване, пречистване и сгъване на продукта. [3] Съществуват обаче специализирани стратегии в пептидната химия, които използват други решения, поради което синтезът от С-къца към Н-къца трябва да се определя като класически подход на SPPS, а не като абсолютно правило за всички методи на синтеза.

6. Защо са необходими защитните групи?

Аминокиселините често съдържат няколко реактивни функционални групи. Защитните групи временно предотвратяват реакцията на определени места, като оставят съответното място достъпно на конкретен етап от синтеза. Това помага да се контролира последователността и начинът на свързване на остатъците. Без подходяща защита конкурентните реакции биха могли да доведат до образуването на сложни смеси или продукти с променена структура. Изследванията относно образуването на аспартимид показаха, че промяната в химията на защитата на карбоксилната група може да ограничи важна странична реакция в анализираните последователности. [2] Защитните групи не гарантират идеален ход на синтеза, но осигуряват селективен химичен контрол, който трябва да остане съобразен с всички съществени етапи на процеса.

7. Какво е разликата между Fmoc и Boc?

Fmoc и Boc са широко използвани временни защитни групи за аминогрупата, но реагират при различни химични условия. Fmoc обикновено се отстранява в алкална среда, докато Boc е чувствителен към киселини. Тази разлика влияе върху начина, по който те се свързват със защитата на страничните вериги, линкерите и останалите етапи на синтеза. Синтезът, базиран на Fmoc, се използва широко в съвременната SPPS, но проучванията показаха също така, че при такива условия е възможно да възникнат странични реакции, зависещи от последователността. [11] На практика е по-полезно да се сравняват цялостните стратегии за защита и тяхната съвместимост с дадена последователност, отколкото да се разглеждат единствено наименованията на двете защитни групи.

8. Какво означава „ортогонална защита“?

Ортогоналната защита означава, че една защитна група може да бъде отстранена при условия, при които друга необходима защитна група остава достатъчно стабилна, за да може синтезът да продължи. Това позволява разкриването на различни реактивни места на определени етапи. Тази концепция е от основно значение при контролираната синтеза на сложни пептиди. Ортогоналността обаче зависи от условията и не е абсолютна: многократното излагане, характерът на последователността и параметрите на реакцията все пак могат да доведат до странични реакции. Изследванията на алтернативни начини за защита на карбоксилните групи показват как стратегията за защита може да бъде модифицирана с цел контролиране на сложната пептидна химия. [2]

9. Какво представлява делеционната последователност?

Делеционната последователност е пептид, в който липсват един или няколко остатъка, присъстващи в желаната целева последователност. Тя може да възникне, когато етапът на свързване на аминокиселината не протича докрай, но нереагиралата верига остава свързана с носителя и участва в следващите цикли. Тъй като неправилната верига остава свързана със смолата, обикновеното промиване не е достатъчно, за да я отстрани. Изследванията за мониторинг на SPPS в реално време сочат, че непълното образуване на амидни връзки е сериозен проблем в процеса. [4] Делеционната последователност следователно е проблем, свързан със структурата и идентичността на продукта, а не просто остатък от реагента.

10. Възможно ли е две пептидни примеси да имат една и съща молекулна маса?

Да. Различните молекулни структури могат да имат идентична или неразличима номинална маса. Поради това самото съвпадение на масата не потвърждава пълната идентичност на молекулата. При изследвания на синтетичен пептид, който е субстрат на ренина, бяха идентифицирани изобарични примеси, при които модификациите се намираха на различни позиции. Дериватизацията и тандемната масова спектрометрия предоставиха допълнителна структурна информация. [12] Този пример показва защо съвпадението на наблюдаваната маса с очакваната не може само по себе си да потвърди правилната последователност, свързване, стереохимия или липсата на структурно сходни изомери.

11. Какво представляват епимеризацията и рацемизацията при синтеза на пептиди?

Епимеризацията и рацемизацията са нежелани промени в стереохимичната конфигурация. Те могат да настъпват без промяна в номиналната аминокиселинна последователност или молекулното тегло, поради което обикновеното измерване на теглото може да не покаже структурна разлика. При изследвания на Fmoc-синтеза, подпомаган от микровълни, бяха идентифицирани остатъци, податливи на стереохимични промени, и беше показано, че модифицирането на реакционните условия може да ограничи такива процеси. [11] Рискът зависи от градивния блок, последователността и условията на процеса. Следователно стереохимичното качество изисква аналитични методи, способни да оценят конфигурацията, и не може да се заключава единствено въз основа на молекулното тегло.

12. Какво представлява образуването на аспартимид?

Образуването на аспартимид е нежелана реакция, свързана с определени последователности, съдържащи аспарагинат. Образуването на цикличен междинен продукт може да доведе до по-нататъшни продукти с променена скелетна свързаност или стереохимия, което намалява добива и затруднява пречистването. Изследователите анализираха алтернативни стратегии за защита, разработени с цел ограничаване на тази реакция в избрани пептиди и протеини. [2] Резултатите не сочат едно универсално решение за всички последователности, съдържащи аспарагинат. Те обаче показват защо проектирането на синтеза и стратегиите за контрол на примесите трябва да отчитат специфичното химично поведение на дадената последователност.

13. Потвърждава ли високата чистота на HPLC правилната идентичност на пептида?

Не. Чистотата HPLC описва пробата в рамките на конкретен хроматографски раздел, използвания детектор и метода за анализ на данните. Големият дял от площта на главния пик може да бъде ценен доказателствен материал, че пробата се състои предимно от един хроматографски разделен компонент, но сам по себе си не потвърждава пълната молекулярна идентичност. Коелуиращите примеси, стереоизомерите и другите варианти могат да изискват допълнителни техники. При изследванията за хирална анализ на пептидите е използван специално разработен процес, който е отчел и стереохимичните промени, възникващи по време на подготовката на пробата. [13] Идентичността и чистотата следва да се разглеждат като свързани, но отделни аналитични въпроси.

14. Ефективността на пречистения продукт означава ли същото като чистотата?

Не. Добивът на пречистения или изолирания продукт се определя от количеството на извлечения целеви материал спрямо определено начално или теоретично количество. Чистотата, от друга страна, описва състава на извлечения материал според определена аналитична метода. Синтезът може да доведе до получаване на сравнително малко количество продукт с много висока чистота или на голямо количество суров материал, съдържащ значително количество примеси. В изследванията на автоматичния поточен синтез чистотата на суровия продукт и добивът след изолиране са отчитани отделно. [7] Разделянето на тези параметри предотвратява погрешното тълкуване на високата стойност на единия от тях като доказателство за високата стойност на другия.

15. Могат ли дългите пептиди да се синтезират чрез съединяване на по-къси фрагменти?

Да. При фрагментарната стратегия по-късите пептидни сегменти могат да бъдат синтезирани поотделно, а след това да бъдат съединени чрез подходяща химична реакция. Естествената химична лигация беше важен пример, при който незащитени пептидни фрагменти бяха съединени по начин, водещ до образуването на естествена връзка в пептидния скелет, след което беше получен нагънат протеин. [10] Това не означава, че произволни пептидни фрагменти могат да се свързват спонтанно. Трябва да се вземат предвид структурата на фрагментите, химията на свързването, изборът на мястото на свързване, разтворимостта, стереохимията и изискванията за пречистване. Сглобяването на фрагменти е следователно алтернативна стратегия за проектиране на синтеза, а не автоматично решение на проблемите, свързани с дългите пептиди.

16. По-бързата автоматизирана синтеза премахва ли необходимостта от пречистване?

Не. По-бързото автоматизирано или поточно синтезиране съкращава времето на определени етапи от синтеза, но не доказва, че всяка получена молекула има желаната структура. В изследванията за бърза поточна синтеза суровината продължава да се характеризира и да се подлага на последващо пречистване, а в последващите работи, свързани с автоматизацията, се сравняват отделно чистотата на суровината и добивът след изолиране. [6] [7] Добрите резултати на системата за изследваните последователности също не гарантират идентични резултати за всяка нова цел. Ускорената синтеза все още трябва да бъде съчетана с подходящо пречистване, потвърждаване на идентичността, анализ на примесите и окончателна характеристика.

17. Защо увеличаването на мащаба на производството е по-сложно от подготовката на по-голяма партида?

Увеличаването на мащаба променя физичните и химичните условия, а не само количеството на материала. Смесването, топлообменът, набъбването на смолата, разпределението на реагентите, налягането, филтрирането, работата с разтворители, разтворимостта на междинните продукти и възможностите на системата за пречистване могат да се променят при по-голям производствен обем. В промишления анализ на 40 пептидни процеса синтезът, пречистването и изолирането бяха оценени поотделно при анализа на потреблението на материали. [14] Резултатите показват защо производството трябва да се разглежда като цялостен процес. Мащабируемият метод трябва да води до получаване на характеризиран материал на всички етапи, а не само до по-голямо количество суров пептид.

18. Пептидът готов ли е веднага след съставянето на правилната аминокиселинна последователност?

Не непременно. Сглобяването на веригата създава скелета на последователността само дотолкова, доколкото това се потвърждава от процеса и аналитичните данни. В зависимост от молекулата може да са необходими допълнителни етапи като дезактивиране, отцепване, циклизация, окисляване, образуване на дисулфидни мостове, нагъване, конюгация, пречистване и характеризиране. Синтезът на BPTI е добър пример за процес, при който след сглобяването на линейната последователност е последвало пречистване и образуване на сгъната структура, съдържаща дисулфидни мостове. [3] Терминът „готов пептид” следва да се отнася до молекулярната форма, изисквана в дадения научен контекст, а не само до завършването на поетапното добавяне на аминокиселини.

19. Правилното молекулно тегло потвърждава ли правилната последователност на пептида?

Не. Съвпадението на молекулното тегло е ценно доказателство, но само по себе си не може да потвърди пълната последователност или молекулната структура. Изобарните структури могат да имат една и съща маса, а стереохимичните разлики може изобщо да не водят до промяна в молекулното тегло. Изследвания на замърсители в синтетични пептиди показаха, че разграничаването на структурно различни съставки може да изисква тандемна масова спектрометрия и допълнителни анализи. [12] При въпроси, свързани със стереохимичната цялост, може да се наложи използването и на хирални методи. [13] Следователно молекулното тегло трябва да се разглежда като един от елементите при оценката на идентичността, а не като нейното пълно потвърждение.

20. Защо пречистването трябва да се разглежда като част от производството на пептида, а не само като краен етап?

Пречистването определя дали целевият пептид може ефективно да бъде отделен от делеционните последователности, страничните продукти, остатъците от реагенти, структурно сходните примеси и други съставки, образувани по време на синтеза. Метод, позволяващ много бързо получаване на големи количества суров материал, може да остане неприложим, ако не е възможно ефективното извличане на целевия продукт с изискваното качество. Поради тази причина промишлените анализи на пептидните процеси разглеждат синтеза, пречистването и изолирането като едно цяло. [14] Ефективността на производството трябва в крайна сметка да се оценява въз основа на количеството и свойствата на изолирания краен материал, а не само въз основа на скоростта на синтеза.

Ограничения при сравняването на методите за синтез на пептиди

При интерпретирането на проучвания, сравняващи технологиите за производство на пептиди, трябва да се имат предвид няколко съществени ограничения.

На първо място, последователността оказва силно влияние върху сложността на синтеза. Метод, който дава добри резултати при един пептид, не е задължително да работи по същия начин при друг. Агрегацията, хидрофобността, аминокиселинният състав, дължината, склонността към образуване на вторични структури и податливостта към странични реакции могат да променят хода на процеса. [1] [4]

На второ място, чистотата на суровината, добивът след изолиране, крайната чистота и съдържанието на пептид са различни параметри. Сравняването на методите единствено въз основа на един от тях може да даде непълна представа за ефективността на производството. [7]

На трето място, бързото сглобяване на веригата не означава бързо производство на целия материал. Отделянето, пречистването, изолирането, окончателното оформяне на структурата, аналитичните изследвания и документацията също оказват влияние върху общото време за производство. [6] [7]

Четвърто, аналитичната чистота зависи от използваната метода. HPLC, масова спектрометрия, тандемна масова спектрометрия и хирална анализ дават отговор на различни въпроси. Един аналитичен резултат не е задължително да потвърждава пълната структурна идентичност. [12] [13]

Пето, мащабът оказва влияние върху протичането на процеса. Резултатите от лабораторната синтеза не могат автоматично да се пренесат към промишленото производство без оценка на смесването, транспортирането на масата, възможностите за пречистване, разхода на материали и други фактори, зависещи от мащаба. [14]

Шесто, историческите икономически сравнения могат с времето да загубят актуалността си. Разходите за реагенти, нивото на автоматизация, технологиите за експресия, оборудването за пречистване, рециклирането на разтворители и производствената инфраструктура непрекъснато се развиват. По-старите анализи на разходите може да продължат да имат научна стойност, но не е задължително да отразяват актуалната икономика на пазара. [1]

Седмо, сравненията по отношение на въздействието върху околната среда изискват последователни граници на анализа. Оценката на потреблението на разтворители само по време на сглобяването на веригата, като същевременно се пренебрегват процесите на пречистване и изолиране, може да доведе до подвеждащи заключения относно устойчивостта на процеса. [14] [15]

Накрая, самото наименование на метода не определя качеството на продукта. SPPS, синтез в разтвор, LPPS, лигация на фрагменти и биологична експресия могат да доведат до получаване на материал с високо качество, ако процесът е бил правилно проектиран и контролиран. Никой от тези методи обаче не гарантира автоматично правилната идентичност, чистота, стереохимия, сгъване или пригодност за конкретно приложение.

Резюме

Синтезът на пептиди се разбира най-добре като контролиран процес на получаване на молекули, а не просто като образуване на пептидни връзки.

Целта е да се синтезира определена аминокиселинна последователност, като едновременно с това се контролират начинът на свързване на остатъците, химията на защитните групи, стереохимията, страничните реакции и всички допълнителни структурни изисквания.

Синтезът на пептиди в твърда фаза задържа нарастващата верига върху неразтворим носител, благодарение на което повтарящите се етапи на свързване и промиване се поддават добре на автоматизация. Предимствата, свързани с повтаряемото синтезиране, обаче не елиминират проблеми като непълни реакции, агрегация, делеционни последователности или странични реакции, зависещи от последователността. [4] [6] [7]

Класическият синтез в разтвор поддържа пептидните междинни продукти в течна фаза и може да осигури по-голяма гъвкавост при изолирането и характеризирането на отделните междинни продукти. Многократното разделяне и влошаващата се разтворимост обаче могат да се превърнат в сериозни ограничения.

Методите за синтез в течна фаза с разтворими маркери се опитват да съчетаят разтворната химия с проектирани стратегии за възстановяване на материала. По този начин те могат да представляват допълнителна възможност в случаите на последователности и производствени проблеми, за които класическият SPPS не е оптимален. [8] [9]

По-дългите или особено сложни молекули могат да се синтезират и чрез съединяване на фрагменти, включително чрез естествена химична лигация, вместо да се разчита изцяло на непрекъснатото добавяне на последователни аминокиселинни остатъци. [10]

Независимо от избрания метод на синтез, ефективността на свързването и химията на защитните групи остават от ключово значение, тъй като дори и малки неефективности и странични реакции могат да се натрупват по време на следващите етапи на синтеза. Образуването на аспартимид, делеционните последователности и стереохимичните промени показват защо самата целева последователност не обяснява всичко, което може да възникне по време на процеса. [2] [11] [12]

Работата не приключва и със сглобяването на веригата.

Процесът на пречистване определя дали крайният продукт може да бъде отделен от останалите съставки.

След това подходящо подбраните аналитични методи дават отговор на конкретни въпроси, свързани с идентичността, чистотата, съдържанието, стереохимията, конформацията и – ако това има значение – функционалната активност. [3] [12] [13]

Увеличаването на мащаба на производството поставя нови въпроси, свързани с транспортирането на масата, съхранението на смолата, разхода на разтворители, филтрацията, възможностите за пречистване, повторяемостта на процеса и неговото въздействие върху околната среда. Поради тази причина индустриалната оценка на процеса трябва да обхваща едновременно синтеза, пречистването и изолирането, а не да се фокусира единствено върху скоростта на свързване. [14] [15]

Най-важното правило е следното:

Ефективното производство на пептиди изисква контрол върху целия процес – от молекулярния дизайн и образуването на връзки до пречистването и структурната характеристика. Получаването на верига с очакваната номинална маса или висок основен хроматографски пик представлява ценно доказателство, но нито един от тези параметри сам по себе си не потвърждава пълната молекулярна идентичност, нито качеството на производствения процес.

Забележка

Статията има изцяло образователен и научно-информационен характер. В него се описват общите принципи на пептидната химия, синтеза в твърда фаза, синтеза в разтвор и в течна фаза, стратегиите за защитни групи, свързване, пречистване, аналитични характеристики, производствени процеси, както и примери от публикувани изследвания. Той не представлява лабораторен протокол, производствена инструкция, медицински съвет, ръководство за дозиране или прилагане, нито сертификат за качество на какъвто и да е конкретен пептиден продукт. Експерименталните резултати трябва да се тълкуват в контекста на последователността, използваните методи, мащаба на процеса, аналитичните техники и ограниченията на отделните изследвания.

Препратки

1. Странер, П., Тарицка, Н., Сабо, М., Тот, Г. К. и Перцел, А. (2016). Бактериална експресия и/или синтез на пептиди в твърда фаза на полипептиди с дължина 20–40 аминокиселини и минипротеини: казус на лиганди на GPCR от клас B. „Current Protein & Peptide Science“, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Предотвратяване на образуването на аспартимид по време на синтеза на пептиди чрез използване на цианосулфурилиди като защитни групи на карбоксилната киселина. Nature Communications, 11(1), член 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ферер, М., Уудърд, К. и Барани, Г. (1992). Твърдофазен синтез на инхибитор на говеждата панкреатична трипсин (BPTI) и два негови аналога. Химичен подход за оценка на ролята на дисулфидните мостове в сгъването и стабилността на протеините. Международно списание за изследвания на пептидите и протеините, 40(3–4), 194–207. Запис в PubMed
4. Слетен, Е. Т., Нуньо, М., Гътри, Д. и Зеебергер, П. Х. (2019). Мониторинг в реално време на синтеза на пептиди в твърда фаза с помощта на реактор с променливо легло. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F. и Becker, C. F. W. (2015). Ефективно получаване на пептидни хидразиди чрез пряка хидразинолиза на смоли от типа „Peptidyl-Wang-TentaGel“. Списание „Journal of Peptide Science“, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Зоу, Й., Ляо, С., Спокойни, А. М., Йенсен, К. Ф., & Пентелуте, Б. Л. (2014). Бърза синтеза на пептиди чрез поточна технология. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Миялис, А. Дж., Томас, Д. А., III, Саймън, М. Д., Адамо, А., Бомонт, Р., Дженсен, К. Ф. и Пентелуте, Б. Л. (2017). Напълно автоматизиран подход, базиран на поточна технология, за ускорена синтеза на пептиди. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Шарма, А., Кумар, А., де ла Торе, Б. Г. и Алберисио, Ф. (2022). Синтез на пептиди в течна фаза (LPPS): Трета вълна в получаването на пептиди. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Такахаши, Д., Яно, Т. и Фукуи, Т. (2012). Нова защитна група от типа на амидите, производни на дифенилметил, за ефективна синтеза на пептиди в течна фаза: AJIPHASE. „Organic Letters“, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Доусън, П. Е., Мюър, Т. У., Кларк-Луис, И. и Кент, С. Б. (1994). Синтез на протеини чрез естествена химическа лигация. Science, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Паласек, С. А., Кокс, З. Дж. и Колинс, Дж. М. (2007). Ограничаване на рацемизацията и образуването на аспартимид при синтеза на пептиди в твърда фаза по метода Fmoc, подсилен с микровълнова енергия. Списание „Journal of Peptide Science“, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E. и Gaskell, S. J. (1989). Характеристика на примесите в синтетичен пептид-субстрат на ренина чрез масова спектрометрия с бързо бомбардиране с атоми и хибридна тандемна масова спектрометрия. „Rapid Communications in Mass Spectrometry“, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G., & Кроутър, Дж. Б. (1995). Определяне на хиралната чистота на пептидите: хидролиза в деутерирана киселина, дериватизация с реагент на Марфи и анализ чрез високоефективна течна хроматография – електроспрей йонизация – мас-спектрометрия. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Кекеси, И., Вегнер, К., Мартинес, И., Копах, М. Е., Уайт, Т. Д., Том, Дж. К., Кенуърди, М. Н., Галу, Ф., Лопес, Дж., Кьониг, С. Г., Пейн, П. Р., Айслер, С., Арумугам, Б., Ли, Ц., Мукерджи, С., Исидро-Ллобет, А., Лудеман-Хомбургер, О., Ричардсън, П., Кителман, Дж., … ван ден Бос, Л. Дж. (2024). Интензивност на масовия процес (PMI): Цялостен анализ на съвременните процеси за производство на пептиди, който дава информация за устойчивостта при синтеза на пептиди. Списание „The Journal of Organic Chemistry“, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Исидро-Ллобет, А., Кенуърди, М. Н., Мукерджи, С., Копач, М. Е., Вегнер, К., Галу, Ф., Смит, А. Г., & Рошчангър, Ф. (2019). Предизвикателства пред устойчивостта при синтеза и пречистването на пептиди: От научноизследователска и развойна дейност до производство. Списание „The Journal of Organic Chemistry“, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001