Sinteza peptidov: metoda na trdni fazi, v raztopini in metode proizvodnje

Sinteza peptidov je nadzorovan proces nastajanja verig aminokislin z določenim zaporedjem. Pri kemijski sintezi so izbrane aminokisline povezane z peptidnih vezi, hkrati pa nadzoruje druge reaktivne skupine, prisotne v teh molekulah. Cilj torej ni samo povezovanje aminokislin, temveč pridobitev specifične molekularne strukture z določeno zaporedjem, stereokemijo, zgradbo koncev verige in – če je to potrebno – dodatnimi strukturnimi značilnostmi.

Glavne metode vključujejo trdnofazno sintezo peptidov (SPPS), klasično sintezo v raztopini in novejše metode tekočnofazne sinteze peptidov (LPPS), ki uporabljajo topne nosilce ali molekularne označevalce. Raziskovalni laboratoriji in proizvodni obrati lahko prav tako kombinirajo različne pristope, pripravljajo krajše fragmente posebej in jih nato med seboj združujejo ali pa uporabljajo biološko ekspresijo, če je ta primernejša za dano zaporedje.

Primerjava kemijske sinteze in bakterijske ekspresije polipeptidov, ki obsegajo 20–40 aminokislinskih ostankov, prikazuje pomembno načelo: praktična izbira metode proizvodnje je odvisna od posamezne molekule, njene zaporedja, nagnjenosti k agregaciji, zahtevanih modifikacij, obsega proizvodnje in analitskih zahtev. [1]

Pridobitev želene aminokislunske zaporedja je samo ena od stopenj v proizvodnji peptida.

Celotni postopek lahko vključuje:

načrtovanje zaporedja → priprava gradnikov → zaščita funkcionalnih skupin → spajanje → odstranjevanje zaščitnih skupin → sestavljanje verige → odcep ali povezovanje fragmentov → končno oblikovanje strukture → čiščenje → potrditev identitete → analiza nečistoč → določanje vsebnosti → končna karakterizacija.

Pri nekaterih peptidih so potrebni tudi dodatni koraki, kot so ciklizacija, tvorba disulfidnih vezi, zvijanje, konjugacija ali druge kemijske modifikacije.

Iz tega razloga pravilna sestava verige ne pomeni samodejno, da ima končni material ustrezno identiteto, čistost, stereokemijo, konformacijo, stabilnost ali druge zahtevane lastnosti.

Kaj je sinteza peptidov?

Sestavljanje določene aminokislote zaporedja

Peptid sestavljen je iz aminokislinskih ostankov, povezanih s peptidnimi vezmi.

Cilj sinteze peptidov je vzpostavitev teh vezi v vnaprej določenem vrstnem redu, pogosto ob istočasnem nadzoru:

• vrste aminokislin;
• vrstni red aminokislin v zaporedju;
• stereokemiji;
• strukture na koncu N;
• strukture C-konca;
• modifikacij stranskih verig;
• razporeditev disulfidnih mostičkov;
• ciklizaciji;
• drugih zahtevanih strukturnih značilnosti.

Zaporedje je temeljnega pomena, ker lahko enak aminokislinski sestav privede do nastanka različnih molekul, če so aminoklasine v drugačnem vrstnem redu.

Trditev, da je določena molekula „peptid, sestavljen iz petih aminokislin”, tako ponuja zelo malo podatkov o njeni dejanski strukturi. Za pravilen opis molekule je treba poznati vrstni red aminoklasin, njihov vrstni red, stereokemijo, končne skupine in morebitne dodatne modifikacije.

Dva peptida imata lahko tako natanko enako aminokislinsko sestavo, pa sta kljub temu različni molekularni strukturi.

Dodatne razlike lahko izvirajo iz modifikacij koncev verige, prisotnosti disulfidnih mostičkov, cikličnega skeleta, sprememb v stranskih verigah ali drugačne stereokemične konfiguracije.

Kemična sinteza peptidov običajno uporablja aminokisline, katerih reaktivne skupine so selektivno zaščitene.

Zaščitne skupine omogočajo tvorbo specifične želene kemijske vezi ob hkratnem omejevanju konkurenčnih reakcij na drugih mestih v molekuli.

V naslednjih načrtovanih stopnjah sinteze se te skupine odstranijo ali spremenijo.

Nadzorovana reakcija namesto spontanskega združevanja

V osnovnih kemijskih opisih je nastajanje peptidne vezi pogosto prikazano kot kondenzacijska reakcija, pri kateri se dva aminokisline združita ob hkratnem izločanju molekule vode.

Takšna enačba opisuje splošni bilans reakcije.

Vendar ga ni treba enačiti z načinom, kako se v praksi izvaja nadzorovana sinteza peptidov.

Samo mešanje proste aminokisline ne bi omogočilo zanesljive določitve:

• katera amino skupina naj reagira;
• katera karboksilna skupina naj reagira;
• katera aminokislina naj bo prva;
• ki naj bi bil drugi;
• ali se bodo stranske verige začele odzivati;
• Ali bo stereokemija ohranjena?;
• ali ne bodo nastali številni neželeni produkti.

V praktični kemijski sintézi se zato uporabljajo nadzorovane strategije aktivacije in zaščite funkcionalnih skupin.

Skupina, ki izhaja iz karboksilne skupine, je običajno aktivirana tako, da lahko učinkovito reagira z izbrano aminsko skupino. Zaščitne skupine, vrstni red reakcij, kemija nosilca, reagenti za spajanje, topilno okolje in metode izolacije skupaj pomagajo usmeriti reakcijo proti želenemu produktu.

Učinkovita sinteza peptidov zato zahteva nadzor nad kemijo, ki naj bi potekala, kot tudi nad tisto, ki jo je treba preprečiti.

Dober primer je nastanek aspartimida.

Raziskovalci so razvili alternativno metodo za zaščito karboksilne skupine, katere cilj je bil zmanjšati to problematično stransko reakcijo med sestavljanjem peptida. [2]

Raziskava prikazuje širše načelo kemije peptidov: preprečevanje neželenih molekularnih pretvorb je lahko prav tako pomembno kot tvorba ustrezne peptidne vezi.

Kdaj lahko peptide štejemo za končane?

Zaključek izgradnje linearnega skeleta peptida ne pomeni vedno zaključka celotne sinteze.

Glede na ciljno molekulo bodo morda po sestavi verige potrebni dodatni koraki.

Te lahko vključujejo:

• popolna odstranitev zaščitnih skupin;
• odcepitev peptida od trdne nosilke;
• odstranitev začasnih oznak;
• ciklizacijo;
• oksidacija;
• tvorjenje disulfidnih vezi;
• gubanje;
• spatežitev;
• modifikacijo koncev verige;
• čiščenje;
• analitično karakteristiko.

Nekateri peptidi zahtevajo relativno malo dodatnih strukturnih sprememb po sestavitvi verige.

Za druge so poznejše faze ključnega pomena.

Dober primer je sinteza govejega trebušnomalčnega zaviralca tripsina (BPTI). Raziskovalci so sestavili linearno zaporedje, očistili material in nato pridobili zvito strukturo, ki vsebuje disulfidne mostiče. V skladu z analizami in funkcionalnimi primerjavami, predstavljenimi v študiji, je končni material z naravnim zaporedjem ustrezal naravnemu beljakovinu glede na preučevane parametre. [3]

Ta primer prikazuje razliko med sestavo peptidnega ogrodja in pridobitvijo v celoti okarakterizirane končne molekularne oblike.

Metoda, ki omogoča pridobitev pravilnega linearnega zaporedja, samodejno ne potrjuje:

• pravilnega gubanja;
• pravilne razporeditve disulfidnih vezi;
• biološke aktivnosti;
• stabilnosti;
• profila onesnaženja;
• primernosti za določeno uporabo.

Vsako od teh vprašanj zahteva posebne dokaze.

Kemična sinteza, biološka ekspresija in kombinirane metode

Pri kemijski sintezi peptidov se vnaprej pripravljeni molekulski gradniki združujejo v nadzorovanih laboratorijskih reakcijah.

Biološka ekspresija pa izkoristi celični mehanizem za nastanek kodiranega zaporedja aminokislin. Nato je treba material pridobiti, očistiti in ga po potrebi nadalje obdelati.

Obbe metodi lahko privedeta do pridobitve peptidov ali polipeptidov, vendar sta povezani z različnimi možnostmi in omejitvami.

Kemična sinteza je lahko še posebej uporabna, kadar so potrebni:

• izbrane nestandardne aminokisline;
• specifične kemijske modifikacije;
• določene strukture koncev verige;
• izotopske oznake;
• spremembe peptidne hrbtenice;
• druge lastnosti, ki jih je težko doseči s standardno biološko ekspresijo.

Biološka ekspresija je lahko privlačna pri ustreznih daljših zaporedjih ali določenih strategijah označevanja, vendar ne odpravlja težav, ki se pojavljajo v kasnejših fazah proizvodnje.

Upoštevati je treba tudi pridobivanje materiala, gubanje, predelavo, onesnaženja iz gostiteljskega organizma, čiščenje in analitsko karakterizacijo.

Nobena od metod ni torej univerzalno najboljša.

Pri primerjavi polipeptidov, sestavljenih iz 20–40 aminokislinskih ostankov, so dolžina zaporedja in njegova nagnjenost k agregaciji vplivali na rezultate sinteze na trdni fazi ter bakterijske ekspresije. [1]

Te ugotovitve podpirajo pristop, pri katerem se metoda proizvodnje izbere za posamezno molekulo.

Zgodovinskih podatkov o zmogljivosti, stroških, opremi in času proizvodnje ne smemo obravnavati kot univerzalnih sodobnih vrednosti, ker se tehnologije, reagenti, avtomatizacija, metode čiščenja in proizvodna ekonomika spreminjajo z razvojem tehnologije.

Sinteza peptidov na trdni fazi

Rastoča veriga je pritrjena na netopni nosilec

Pri sintezi peptidov na trdni fazi (SPPS) rastoča peptidna veriga med zaporednimi cikli sinteze ostaja pritrjena na netopni nosilec.

Nosilec je najpogosteje funkcionalizirana polimerna smola.

Vmesni člen ali veznik povezuje peptid z nosilcem in med drugim vpliva na način poznejšega sproščanja končne verige ter na vrsto nastale končne skupine.

Ena glavnih praktičnih prednosti SPPS je lažje ločevanje materiala.

Po zaključku določene stopnje reakcije je mogoče topne reagente in številne topne stranske produkte odstraniti s pranjem, medtem ko rastoči peptid ostane vezan na trdno fazo.

Zaradi tega po dodajanju vsakega naslednjega aminokisline ni treba izolirati in čistiti rastočega peptida kot posamezne, proste spojine.

Vendar pa lahko ta priročnost vodi do pomembnega nesporazuma.

Izpiranje smole ne pomeni, da so bili vsi nepravilni peptidi odstranjeni.

Če veriga, pritrjena na smolo, med enim korakom spajanja ne reagira, lahko še naprej ostane na nosilcu.

V naslednjih ciklih lahko ponovno reagira in se še bolj podaljša.

Posledično lahko nastane delecijska sekvenca, to je molekula, ki se od ciljnega peptida razlikuje v odsotnosti enega ali več aminokislinskih ostankov.

Enako kemijsko spremenjeni ali nepopolno razrešeni verižniki vezani na živico lahko sodelujejo v nadaljnjih fazah sinteze.

SPPS torej poenostavlja ločevanje topnih snovi od materiala, povezanega z živico.

Vendar pa ne zagotavlja popolne skladnosti zaporedja.

Ponavljajoči se cikel odcepitev in povezovanja

Tipična faza sinteze SPPS vključuje ponavljanje treh osnovnih operacij:

odklepanje → spojitev → pranje.

Najprej se razkriva reaktivna aminokislinska skupina, ki se nahaja na koncu rastočega verige.

Nato se v verigo vključi še en zavarovan aminokislina.

Topni v vodi reagirajoči reagenti, presežek aminokisline in številni produkti reakcije se odstranijo pred začetkom naslednjega ciklusa.

Ponavljanje tega procesa omogoča gradnjo peptida po eni aminokislinski sekvenci.

V klasični SPPS je preostanek C-konca običajno pritrjen na nosilec prvi, nato pa se verižica podaljša proti N-koncu.

To se razlikuje od običajne ribozomalne sinteze beljakovin, pri kateri se dodatne aminokisline dodajajo na C-koncu rastnega veriga.

Končna sestava aminokislin pa lahko ostane enaka, čeprav je smer in kemija procesa sinteze drugačna.

Izraz „ciklus” se ne sme razlagati kot enega univerzalnega nabora pogojev reakcije, ki veljajo za vsako ostalo snov in vsako sekvenco.

Trajanje reakcije lahko odvisno od:

• strategij zaščitne skupine;
• vrste aminokisline;
• prostorskih pogojev okoli mesta reakcije;
• vrste živice;
• levica;
• dolžine verige;
• agregacije;
• topila;
• kemija vezav;
• strukturalno vedenje rastočega peptida.

Reakcija, ki je na začetku sinteze lahko preprosta, lahko postane veliko težja v poznejšem obdobju.

Zato je spremljanje procesa še vedno pomembno tudi v zelo avtomatiziranih sistemih.

Zakaj so lastnosti živice pomembne?

Stalni nosilec ni le pasivni nosilec.

Njeni fizikalni in kemični lastnosti lahko neposredno vplivajo na potek reakcije.

Eden od pomembnih parametrov je raztezanje.

Če se žvepla pravilno raztopi v izbrani raztopini, lahko reagenti lažje dosežejo reaktivna mesta v celotni strukturi polimera.

Neprimerna zategljivost ali spremembe strukture žveplove mase lahko omejijo ta dostop.

Pomembno je tudi:

• zahvaljujoč gostoti prebivalstva;
• arhitektura polimerov;
• struktura linkera;
• združljivost z topilnimi sredstvi;
• mehanska stabilnost;
• poroznost;
• difuzijske lastnosti;
• vplivov med rastnimi peptidnimi verigami.

Zaradi podaljšanja dolžine peptida lahko posamezni verigi delujejo tudi med seboj.

Agregacija na vezivnem sredstvu lahko omejuje dostop do reaktivnih mest in vodi do nepopolnega vezanja ali nepopolnega razreza.

To pomeni, da sekvenca, ki se pravilno obnaša na začetku sinteze, lahko postane vse težja s podaljševanjem verige.

Raziskovalci so razvili pretokovni reaktor s spremenljivim kompleksom, ki je omogočal spremljanje raztezanja smole na podlagi meritev tlaka. [4]

Raziskava se je nanašala na agregacijo na vezivnem polimernem mešanju in nepopolno tvorjenje vezi kot na procesne težave, ki jih v drugih pogojih je morda težko neposredno opaziti med sintezo.

To kaže, da lahko spremljanje fizičnega vedenja nosilca zagotavlja informacije, ki presegajo samo evidentiranje dodanih dodatkov.

Kaj služi živica Wanga?

Kemična struktura Wangovih ligatorjev se pogosto uporablja v SPPS, ko po odcepitvi peptida želimo pridobiti C-končni del v obliki karboksilne kisline.

Peptid je vezan s esternim vezivom, ki ga je mogoče kasneje razgraditi v ustreznih pogojih.

Drugi sistemi vezavnikov se lahko izbereta, kadar je potrebna drugačna struktura C-konca, na primer amid.

Dober je razločiti kemijo veziva od celotnega fizičnega nosilca.

Vzdrževalni programi Wang lahko vključujejo različne arhitekture polimerov.

Takšni materiali ne morajo biti enaki:

• lastnosti raztezanja;
• kapaciteta;
• združljivost z topilnimi sredstvi;
• mehanske lastnosti;
• Obnašanje med reakcijo.

Raziskave z uporabo nosilcev peptidil-Wang-TentaGel so pokazale specialno alternativno metodo za pridobivanje peptidnih hidrazidov, ki so uporabni polizdelki v peptidni kemiji. [5]

To ne pomeni, da običajno standardno odstranjevanje vezave z vanko vpliva na nastanek peptidnih hidrazidov.

Na drugi strani pa kaže na pomembno načelo:

nosilec + vezivnik + pogoji reakcije + kemija razbijanja skupaj določajo pridobljen izdelek.

Sinteza SPPS v periodičnem in pretokovitem sistemu

SPPS se lahko izvaja v klasičnih periodičnih posodah ali v sistemih, v katerih reagenti tečejo skozi reaktor, ki vsebuje stalni nosilec.

Tehnične rešitve lahko omogočajo hitro menjavo reagentov in natančnejšo kontrolo kemičnega okolja, v katerem se živica nahaja.

V raziskavi iz leta 2014 je bila predstavljena hitra sinteza peptidov v pretoku z nenehnim spremljanjem in bila uporabljena za več peptidov ter majhnega proteina. [6]

V kasnejšem avtomatiziranem pregledu je opisana veliko hitrejša izdelava verig, pri čemer je za analizirane primere za izolacijo dosežena čistost surovega izdelka in učinkovitost, primerljiva s klasično periodično sintezo. [7]

Te raziskave kažejo na možnosti konkretnih sistemov v določenih pogojih.

Vendar ne dokazujejo, da je mogoče vsak peptid proizvajati enako hitro in z enako kakovostjo.

Čas potreben za izdelavo peptida vključuje tudi veliko več kot zgolj sestavljanje verige.

Celoten proces lahko vključuje:

• priprava reagentov;
• priprava živice;
• spajanje;
• odblokiranje;
• pranje;
• odcepitev;
• obdelavo izdelka;
• čiščenje;
• odstranjevanje topil;
• končno oblikovanje strukture;
• analitične preiskave;
• dokumentacijo.

Hitro ustvarjanje vezi je torej le eden od elementov popolne učinkovitosti proizvodnje.

Sinteza v tekočem stanju

Kaj pomeni ta izraz?

Izraz „sinteza peptidov v tekočem stanju” se lahko uporablja v več pomenih.

V širšem smislu lahko preprosto pomeni sintezo peptida, ki poteka v raztopini.

V bolj specializirani literaturi pa se pogosto razlikuje med:

1. klasično sintezo peptidov v raztopini;
2. sintezo peptidov v stalni fazi;
3. nove metode LPPS, v katerih ima rastlinski lančnik topen marker ali nosilec.

Ta razlika je pomembna, ker se spreminja način razdeljevanja in pridobivanja proizvoda.

Prosti raztopljeni, zavarovani peptidni polizdelek lahko zahteva izolacijo z uporabo njegovih lastnih fizikalnih in kemijskih lastnosti.

Pri označenem polizdelku se lahko oznaka zasnovi tako, da omogoča odstranjevanje, ekstrakcijo, zadrževanje na membrani ali druge načine razdelitve.

Pregled o LPPS jasno razlikuje klasično sintezo v raztopini, SPPS in metode, ki uporabljajo topne označevalce. [8]

Publikacija je koristna za urejanje terminologije in metodologije.

Vendar pa ne bi smela biti interpretirana kot posamičen eksperiment, ki bi dokazoval, da je ena od metod najboljša za vsak peptid.

Klasična sinteza peptidov v raztopini

V klasični sintezi v reološkem raztopu so zavarovana aminokisline, peptidni produkti ali fragmenti raztopljeni v reakcijskem okolju, namesto da bi bili kovalentno vezani na neraztopljivo vezivo.

Po koncu reakcije se ustrezni polizomer lahko izolira, očisti in po potrebi karakterizira, preden se začne naslednji korak.

To lahko prinaša določene koristi.

Raziskovalci lahko:

• opredeliti posamezne polizdelke;
• izbrati metodo čiščenja za določen polizdelek;
• optimizirati posamezne procese;
• pripravljati odlomke neodvisno;
• modificirati pot sinteze, kadar določen polizomer povzroča težave.

Sinteza v raztopini pa lahko povzroča tudi velike težave.

Z razširitvijo verige peptidov lahko:

• postajati slabo topni;
• zbrati;
• bistvo težko kristalizira;
• ustvarjati blizu sorodne onesnaženje;
• bodo težko razdeliti;
• zahteva večkratno izolacijo;
• povzročati izgubo materiala v nadaljnjih fazah obdelave.

Sinteza v raztopini torej ni samodejno enostavnejša ali lažje skalabilna kot SPPS.

Njena uporabnost je odvisna od specifične sekvence, stabilnosti polprevodnikov, topnosti, dolžine poti sinteze, obstojnosti med čiščenjem in učinkovitosti nadaljnjih faz izolacije.

Razvoj označene strategije LPPS deloma izvira iz poskusov rešitve prav teh težav, povezanih s ločevanjem in upravljanjem materiala. [8]

Topne označevalniki združujejo načrtovanje reakcij z načrtovanjem ločevanja

V označeni LPPS se rastni peptid nahaja v molekularnem spoju, ki je zasnovan tako, da vpliva na njegove fizikalne lastnosti.

Znacznik lahko omogoča ohranitev zadostne raztopljivosti peptida med reakcijo in nato olajša njegovo selektivno pridobivanje.

Od tehnologije odvisno se lahko razdelitev uporablja za:

• odstranjevanje;
• ekstrahiranje;
• zadrževanje na membrani;
• faze vedenja;
• druge lastnosti, ki izhajajo iz prisotnosti oznake.

V eni od eksperimentalnih strategij so za pripravo peptidnih amidov uporabili dolgoročno verigo za zaščito na C-koncu.

Ponavljajoče se reakcije in faze ekstrakcije so raziskovalcem omogočile pripravo hidrofilnega peptida, ki je v primerjavi z uporabljenim v njihovi raziskavi bil težko pridobiti z zadovoljivo metodo SPPS. [9]

To kaže na uporabnost te specifične strategije za obravnavano zaporedje.

Vendar pa ne dokazuje univerzalne prednosti sinteze z označeno kemijsko strukturo.

Označevalnik postane del proizvodnega procesa in povzroča lastna vprašanja:

• Kako učinkovito se priklapa?
• Ali spremeni potek reakcije?
• Kako zanesljivo lahko dobite naznačen polizdelek nazaj?
• Ali povzroča nastanek novih onesnaževal?
• Kako se odstrani?
• Ali je mogoče potrditi popolno odstranitev?
• Katere analitske metode potrjujejo njegovo odsotnost v končnem izdelku?

Topne označevalce je torej treba obravnavati kot funkcionalne elemente procesa, in ne le kot preproste etikete.

Primerjava glavnih metod

Primerjava prikazuje splošna pravila delovanja posameznih metod.

Ne določa, katera od njih zagotavlja najboljšo učinkovitost, čistost, stroške, okoljsko ravnovesje ali možnost razširitve za določeno sekvenco.

Te parametre je treba ocenjevati na podlagi dejanske molekule in konkretnega proizvodnega procesa. [4] [8] [9]

Spojenje fragmentov in hibridna proizvodnja

Peptid ni vedno treba tvoriti v enem neprekinjenem procesu, ki vključuje dodajanje novih aminokislinskih ostankov.

Alternativna strategija je ločeno pripravljanje krajših fragmentov peptidov in njihovo nato združitev.

Hibridni proces lahko na primer uporablja SPPS za pridobivanje posameznih fragmentov ter kemijo v raztopini za njihovo združitev.

Strategije fragmenta lahko omejijo nekatere težave, povezane z zelo dolgim predhodnim fazo sinteze.

Vendar pa prinašajo nove izzive, kot so:

• izbira ustreznega mesta povezave;
• topnost fragmentov;
• aktivacija mesta povezovanja;
• kemijska selektivnost;
• držanje stereotipa;
• Neželeni učinki;
• čiščenje fragmentov;
• čiščenje po njihovem združitvi.

Pomemben primer nadzorovanega združevanja fragmentov je kemična ligacija.

V klasični različici peptidni tioester reagira z drugim peptidom, ki vsebuje N-končno cistein. Naslednje preurejanje povzroči nastanek pravilnega vezanja v peptidnem skeletu na mestu ligacije.

Prvotni raziskovalni podatki so pokazali možnost pridobitve po ligaciji in faldiranju proteina, ki vsebuje disiarčne mostove. [10]

To potrjuje pomen te strategije združevanja fragmentov.

To pa ne pomeni, da se lahko kateri koli dva nepreuredjena peptidna fragmenta spontano združita.

Oprema in zaščitne skupine

Združevanje ustvarja namerno povezano skupino

Spojenje je stopnjo reakcije, v kateri se med izbranimi enotami ustvari nov peptidni vez.

Običajno je skupina, ki izvira iz karboksilne skupine, aktivirana tako, da lahko učinkovito reagira z ustrezno aminno skupino.

Kemija aktiviranja mora biti skladna z:

• rastno zaporedje;
• začasnimi zaščitnimi skupinami;
• zaščito stranskih verig;
• stereokemijo;
• nosilec ali označevalec;
• okolju topila;
• drugimi funkcionalnimi skupinami, prisotnimi v molekuli.

Učinkovito združevanje je še posebej pomembno v fazni sintezi, saj lahko nepopolna reakcija povzroči nastanek delecijskih sekvenc.

Če eden od korakov dodajanja aminokisline ne bo uspešen za del rastočih verig, lahko ti verigi ostanejo v sistemu in sodelujejo v nadaljnjih ciklih.

Posledično lahko nastanejo molekule, ki so zelo podobne ciljnemu peptidu, vendar brez ene od njegovih ostankov.

Torej lahko majhne neuspešnosti kumulirajo med številnimi fazami sinteze.

Preprost matematični primer dobro ponazarja ta problem.

Če bi imela vsaka od 50 neodvisnih faz oddaje 99% -odstotno verjetnost za uspeh, bi odstotek delcev, pri katerih bi vse faze končale z uspehom, znašal:

0,99^50 ≈ 0,605

tj. približno 61%.

To je izključno matematična ilustracija.

Ne predstavlja ocene dejanske čistosti ali učinkovitosti sinteze peptida, ki vsebuje 50 ostankov.

Stvarna proizvodnja vključuje:

• različne zmogljivosti povezovanja na posameznih položajih;
• faze razreševanja;
• Neželeni učinki;
• odvisno od zaporedja težavnosti;
• strategije ponovnega združevanja;
• izgube med odstranjevanjem;
• izgube med čiščenjem;
• drugi procesni spremenljivki.

Izračun kaže le, zakaj lahko celo navidezno majhna neučinkovitost posameznega koraka znatno vpliva na večstopenjsko sintezo.

Opremni skupini nadzirajo kraj dogodka

Aminokislina lahko ima več kemijsko reaktivnih skupin.

Če ne bi bilo selektivnega nadzora, bi se lahko reakcije vezave zgodile na neprimernih mestih.

Zaščitne skupine začasno blokirajo izbrane reaktivne lokacije.

Aminokislina, ki se uporablja za podaljšanje verige, običajno potrebuje začasno zaščito, medtem ko lahko reaktivne stranske verige zahtevajo zaščito, ki ostane na mestu skozi več ciklov sinteze.

Spoj z nosilcem mora tudi preživeti te faze do načrtovanega odcepitve.

Izbira zaščitnih skupin torej vpliva na celotno strategijo sinteze.

Moramo upoštevati:

• način njihove uvedbe;
• stabilnost;
• način odstranjevanja;
• skladnost z drugimi zaščitnimi skupinami;
• usklajenost z nosilcem;
• Neželeni učinki;
• vpliv konkretne sekvence;
• Končne pogoje razreševanja.

Raziskave, ki so uporabljale zaščito na osnovi cianosulfurilida, so se nanašale na nastanek aspartimidov s spremembo načina zavarovanja karboksilne skupine. [2]

Rezultati kažejo, da strategija zaščitnih skupin vpliva ne le na to, ali lahko pride do predvidenega odziva, temveč tudi na to, katere neželene reakcije so možne.

Fmoc, Boc in ortogonalna zaščita

Fmoc in Boc sta med pogosto uporabljanima skupinama za zaščito aminokislinskih skupin.

Res se razlikujejo v načinu odstranjevanja.

Fmoc se običajno odstrani v alkalnih pogojih, Boc pa je občutljiv na kisla okolja.

Te lastnosti omogočajo njihovo uporabo kot elemente širših strategij zaščite.

V priljubljeni SPPS, ki temelji na Fmoc, se začasna zaščita N-konca Fmoc večkrat odstrani, medtem ko so izbrana zaščitna skupina stranskih verig in vez z vezivom ohranjena do poznejših faz.

Druge strategije lahko uporabljajo drugačne kombinacije.

Posebej pomembna je ortogonalna zaščita.

Dve zaščitniške skupine se štejejo za ortogonalne, če je mogoče eno selektivno odstraniti pod pogoji, v katerih druga ostane dovolj stabilna, da je mogoče nadaljevati s sintezo.

Ortogonalnost je torej praktična relacija kemijske skladnosti.

To ne pomeni, da bo vsaka zaščitena skupina ostala popolnoma nespremenjena po neomejenem številu izpostavljenosti vsem pogojem reakcije.

Stranski učinki lahko še vedno pridejo do izraza.

V raziskavah sinteze Fmoc sta opisana tako nastanek aspartimidija kot tudi neželeni stereokemijski preobrati kljub predvideni splošni selektivnosti zaščitne strategije. [11]

Stereokemija je del identitete molekule

Več aminokislin ima kiralni center.

To pomeni, da lahko njihovi atomi sprejemajo različne prostorske konfiguracije, ki ustrezajo različnim stereokemijskim oblikam.

Modificiranje konfiguracije enega stereogenega centra lahko povzroči nastanek drugega peptidnega strukture brez potrebe po spremembi njegove nominalne mase.

Zato sama masa ne more potrditi popolne identitete peptida.

Epimerizacija običajno pomeni spremembo konfiguracije enega stereogenega centra v molekuli, ki vsebuje več takih centrov.

Rasemacija se pogosto obravnava tudi v kemiji peptidov v kontekstu izgube stereokemijske integritete aminokislinskih ostankov.

Te spremembe so pomembne, saj je molekularno zaznavanje lahko močno odvisno od prostorskega položaja atomov.

Dve molekule z enakim atomskim številom in nominalno maso lahko torej delujejo drugače, če se razlikujeta po stereokemični strukturi.

V raziskavi sinteze Fmoc z uporabo mikrovalov je bilo ugotovljeno, da so bile nekatere ostanke dovzetne za neželene stereokemijske spremembe v uporabljenih pogojih. Modifikacija metode je omejila pojav teh reakcij. [11]

To ne pomeni, da ogrevanje po definiciji poškoduje vse peptide.

Ustrezen je argument, da je pospeševanje reakcije treba ocenjevati skupaj s selektivnostjo kemične vrste, ki je odvisna od sekvence.

Aspartamid in druge sorodne onesnaževale

Ustvarjanje aspartimida je znana stranska reakcija, povezana z določenimi sekvencami, ki vsebujejo asparagin.

Lahko nastane neželeni ciklični produkt, iz katerega se nato tvorijo spojine z spremenjeno strukturo sklope ali stereokemijo.

Verjetnost te reakcije je odvisna od sekvence in pogojev procesa.

Drugi onesnaževalci, povezani s sintezo, lahko izvirajo iz:

• nepopolnega združevanja;
• nepopolnega razstavljanja;
• nastajanja delektivnih sekvenc;
• reakcije stranskih verig;
• stereotipnih sprememb;
• reakcije med odsekavanjem;
• oksidacije;
• premeščanj;
• pogojev obdelave izdelka;
• nepopolnega odstranjevanja zaščitnih skupin.

Nekatere onesnaževalce povzročajo enostavno opazno spremembo masne mase molekule.

Drugi so veliko težje razločiti.

V analitičnih raziskavah sintetičnega peptida, ki je substrat renina, so identificirali veliko onesnaževal, vključno s sestavinami, ki kažejo enako spremembo mase, vendar vsebujejo modifikacije na različnih mestih. [12]

Za razločitev teh je bila potrebna dodatna strukturna analiza.

Raziskovalci so predlagane mehanizme nastajanja teh onesnaževal tudi obravnavali kot hipoteze.

To je pomembno razlikovanje:

Ugotovitev, kaj je onesnaženje, in dokazovanje natančnega mehanizma njegovega nastanka sta dva ločena znanstvena vprašanja.

Verjetnega mehanizma ni mogoče predstaviti kot potrjenega le zato, ker ustreza opazovani masni koncentraciji delcev.

Čiščenje, skaliranje in kakovost izdelkov

Surovi proizvod, očiščeni proizvod in učinkovitost

Surowi peptid je material, pridobljen pred koncem ustreznih faz čiščenja.

Lahko vsebuje:

• ciljni peptid;
• zaporedja delecij;
• material popolnoma neodstranjen;
• modificirane sekvence;
• ostanki reagentov;
• proizvodi, povezani z razbijanjem;
• enološko razvrščeno vino;
• topila;
• drugi sestavni deli, ki nastanejo v procesu.

Čiščenje ima za cilj ločitev ustreznega peptida od te mešanice.

Treh pojmov je treba jasno razlikovati:

Čistoča surovega izdelka — merjeno sestavo materiala pred končnim čiščenjem;

učinkovitost očiščenega ali izoliranega proizvoda – količina pridobljenega končnega materiala glede na določeno začetno ali teoretično vrednost;

končna čistost — sestava izoliranega materiala, določena z uporabo posebne analitske metode.

Ti pojmi niso zamenljivi.

Postopek lahko povzroči nastanek velike količine surovega materiala, vendar omogoča pridobitev relativno majhne količine očiščenega proizvoda.

Drug proces lahko proizvaja manj surovin, vendar ima visoko selektivnost pri ustvarjanju končnega izdelka.

Enako visoka analitska čistost ne mora pomeniti visoke proizvodne učinkovitosti.

V raziskavah pospešene sinteze pretoka je bilo pravilno poročano o ločeni čistosti surovih materialov in učinkovitosti po izolaciji. [7]

Kromatografija razdeli sestavine, vendar ne odgovarja na vsa vprašanja.

Visokozmogljiva tekočinsko-tekoča kromatografija v obratnem faznem sistemu (RP-HPLC) se pogosto uporablja za analizo in čiščenje peptidov.

Različne molekule se na drugačen način odzivajo na fazo statične in gibljive molekule.

V ustreznih pogojih te razlike omogočajo ločevanje sestavin mešanice.

Analitična in preparativna kromatografija imata povezane, vendar različne uporabe.

Analitična HPLC služi predvsem za preučevanje sestave vzorca.

Predhodna HPLC se uporablja za fizično zbiranje razdeljenih sestavin.

Kromatogram lahko prinaša veliko koristnih informacij.

Velikega glavnega deleža ali visokega odstotnega deleža njegove površine pa ni mogoče obravnavati kot popolne molekularne karakteristike.

Rezultati kromatografije so odvisni med drugim od:

• vrste stolpcev;
• faza gibanja;
• gradientu;
• temperature;
• metode odkrivanja;
• dolžina valov;
• priprema vzorca;
• načina integracije pikov;
• razmerje ločljivosti;
• lastnosti onesnaževanja.

Dva spojina lahko potencialno iztečeta hkrati.

Nekatere sestavine vzorca lahko tudi različno reagirajo na uporabljen detektor.

Zato visoka površinska čistost v HPLC ni enaka popolnemu potrdilu molekularne identitete.

Raziskave izobarskih peptidnih onesnaževal in analize chiralnosti kažejo, zakaj so lahko potrebne dodatne analitske metode. [12] [13]

Analitična metoda mora ustrezati konkretnemu strukturnemu vprašanju.

Identiteta, čistost in vsebina pomenijo različne stvari

V karakteristiki peptidov je še posebej pomembno trije pojmi.

Identiteta odgovarja na vprašanje:

Ali v vzorcu obstaja namenjena molekula?

Čistost odgovarja na vprašanje:

Katere druge sestavine so v vzorcu ali katera del merjenega signala predstavlja glavni sestavni del?

Vsebina odgovarja na vprašanje:

Koliko realnega peptida je v vzorcu?

Na ta vprašanja ni vedno mogoče odgovoriti z enim samim merilom.

Material, ki vsebuje peptid, lahko vsebuje tudi:

• vodo;
• hipotenusa;
• enološko razvrščeno vino;
• ostanki topil;
• drugi sestavni deli, povezani s procesom;
• onesnaženje.

Skupna masa odločne snovi torej ne sme biti enaka masi samega peptida.

Podobno skladnost med izmerjeno maso molekule in teoretično vrednostjo ne potrjuje:

• popolne aminokislinske sekvence;
• ustreznega povezovanja posameznih delov;
• stereokemijske integritete;
• razporeditev disulfidnih mostičkov;
• fleksibilnost;
• neobstoju izobarskih onesnaževal.

Masna spektrometrija lahko zagotavlja močne dokaze glede masne mase molekule.

Tandemska masna spektrometrija in druge strukturne tehnike lahko zagotovijo dodatne informacije o sekvenci.

Kiralne metode omogočajo analizo stereokemijskih zadev, ki jih ni mogoče razjasniti z običajnimi meritvami mase.

V enem od analitičnih raziskav je bila upoštevana tudi rafinacija, ki nastane med pripravljanjem vzorca. To kaže na še eno pomembno načelo: sama analitska procedura lahko povzroči artefakte, če ni ustrezno zasnovana. [13]

Škrob in aktivnost lahko zahtevata ločeno potrditev

Pri strukturno omejenih peptidih in majhnih beljakovinah lahko pravilna sekvenca in molekulska masa še vedno nista zadostna za potrditev predvidene končne strukture.

Dodatna vprašanja lahko vključujejo:

• Ali so nastali ustrezni disiarčni mostovi?
• Ali je molekula sprejela pričakovano obliko?
• Ali je cikličnost popolna?
• Ali obstajajo strukturne izomere?
• Ali je sintetična molekula pokazala pričakovano delovanje v določenem eksperimentalnem testu?

V raziskavi sinteze BPTI so bile uporabljene več analitskih in biofizikalnih metod skupaj z ocenjevanjem zaviranja tripsina. [3]

Skupni rezultati podpirajo skladnost sintetičnega materiala z naravno sekvenco v razponu preučevanih meril.

Test aktivacije pa odgovarja na določeno funkcionalno vprašanje.

Ne nadomešča analize onesnaženosti zraka.

Podobno podobna aktivnost v enem testu ne potrjuje popolne enakovrednosti vseh bioloških, strukturnih ali proizvodnih lastnosti.

Razvijanje proizvodnje spreminja več kot le količino materiala

Povečanje obsega proizvodnje ne temelji le na sorazmernem povečanju količine vseh reagentov.

Fizični procesi se lahko ob večji skali obnašajo drugače.

Imajo lahko pomen:

• mešanje;
• izmenjava toplote;
• distribucija reagentov;
• difuzija;
• raztezanje žveplove kisline;
• tlak;
• filtracija;
• gospodarstvo raztopin;
• odstranjevanje;
• topnost polizdelkov;
• prevoz mase;
• možnosti sistema za čiščenje.

Ti dejavniki lahko vplivajo tako na potek reakcije kot tudi na nastanek onesnaženja.

Čiščenje v poznejših fazah lahko tudi postane težava za celotno proizvodnjo.

Povečanje hitrosti sinteze je omejeno, če sistem za čiščenje ne more učinkovito ločiti nastalih onesnaževal ali pridobiti proizvoda potrebne kakovosti.

V industrijski analizi, ki je zajela 40 procesov sinteze peptidov pri 14 farmacevtskih podjetjih, so ocenili porabo materialov med sintezo, čiščenjem in izolacijo. [14]

Raziskava kaže, zakaj je treba ocenjevanje proizvodnje izvajati za celoten proces.

To pa še ne pomeni, da bi vsaka tovarna, sekvenca ali proizvodna tehnologija dosegala enake rezultate.

Kakovost proizvodnje je rezultat številnih kontrolnih elementov

Zanesljiva proizvodnja peptidov zahteva več kot le pridobitev enega zadovoljivega analitskega rezultata.

Kontroliran proces običajno vključuje več povezanih elementov:

opredeljena ciljna molekula → ustrezni vhodni materiali → kontrolirana sinteza → kontrolirano čiščenje → ustrezna odvzema vzorcev → validirana ali ustrezna za namen analize → dokumentacija o seriji.

Dokumentacija stranke združuje analitične rezultate z gradivom, ki je dejansko bil izdelan.

Certifikat analize (COA) povzema izbrane rezultate testov določene serije.

Njegova informativna vrednost je odvisna od:

• vrste opravljenih raziskav;
• uporabljenih metod;
• uporabnosti teh metod;
• specifikacije;
• identifikacijo vzorca;
• možnosti sledenja stranki;
• potrditev, da poročani rezultati dejansko veljajo za določen material.

Enostavna vrednost, označena kot „čistoča”, sama po sebi ne more potrditi:

• polne molekularne identitete;
• vsebnosti peptida;
• stereokemijske integritete;
• stopnje ostankov topil;
• vsebnost vode;
• skupino antiparazitikov;
• mikrobiološke lastnosti;
• fleksibilnost;
• biološke aktivnosti;
• uporabnosti za določen namen.

Ustrezna vrsta analiz je odvisna od predvidenega namena uporabe materiala.

Peptid, ki se uporablja kot analitični referenčni material, reagent v preskusu na celicah ter snov v fazi farmacevtskega razvoja lahko zahteva odgovore na druge kvalitativne vprašanja.

Analitične dokaze je torej treba interpretirati v jasno določenem kontekstu in ne kot splošno potrditev kakovosti.

Ocena okoljskega ravnovesja mora vključevati celoten proces

Sinteza peptidov lahko zahteva velike količine topil in reagentov.

Ocena vpliva na okolje bi torej morala upoštevati veliko več kot le sam fazo povezovanja.

Med pomembnejšimi elementi lahko sodijo:

• priprava gradbenih blokov;
• spojna sredstva;
• razredčila sredstva;
• pranje;
• odcepitev;
• obdelava izdelka;
• kromatografija;
• menjava topil;
• izolacija;
• sušenje;
• Upravljanje z odpadki.

Zmanjšanje okoljskega bremena lahko zahteva hkratno izboljšanje več faz.

V objavljeni analizi o proizvodnji peptidov so opisani problemi, povezani tako s sintezo kot tudi s čiščenjem, ter je poudarjena potreba po izboljšanju celotnega procesa. [15]

Ker gre za pregledno publikacijo, ne predstavlja nadzorovanega neposrednega primerjave, ki bi dokazoval, da je ena konkretna tehnologija vedno bolj okolju prijazna.

Podobno:

hitrejša sinteza ne pomeni nujno bolj okolju prijazne sinteze,

in ker manjša poraba topil med samim sintezo ne pomeni samodejno manjše vpliva celotnega proizvodnega procesa.

Ekološka primerjava zahteva uporabo doslednih meril za analizo in naj bi najbolje upoštevala porabo virov glede na določeno količino izoliranega in karakteriziranega končnega izdelka.

Pogosto zastavljena vprašanja

1. Kakšna je razlika med sintezo peptidov v stalni fazi in sintezo v tekoči fazi?

V sintezi v stalni fazi rastel peptid ostaja vezan na neraztopno nosilno sredstvo, medtem ko v klasični sintezi v raztopini je rastel peptid raztopljen in običajno ga je treba pridobiti na podlagi njegovih fizikalnih in kemijskih lastnosti. V širšem smislu LPPS raztopljen rastlinski verigasti del ima dodatno topen marker ali nosilec, ki omogoča kasnejše ločevanje. Raziskave sinteze označene s kemijsko metodo prikazujejo eno od strategij povezovanja raztopinske kemije z pridobivanjem s filtracijo, medtem ko literatura o LPPS razlikuje takšne rešitve tako od klasične sinteze v raztopini kot tudi od SPPS. Ni nobena metoda po definiciji optimalna za vsak peptid. Osnovna razlika se nanaša na način fizičnega vodenja in pridobivanja rastlinskega verigastega dela med nadaljnjimi fazami sinteze. [8] [9]

2. Zakaj se med sintezo peptidov lahko pojavijo kontaminanti?

One se lahko tvorijo zato, ker namerjene reakcije niso vedno izvedene v kvantitativnem smislu, in druge funkcionalne skupine lahko sodelujejo pri neželenih reakcijah. Nepopolno vezanje lahko vodi v delecijske sekvence, nepopolno razčlenjevanje lahko moti nadaljnje tvorjenje verige, nekaterim sekvencam pa je lahko značilno stereokemijsko spreminjanje, nastanek aspartimida, oksidacija, preurejanje ali stranski produkti vezave. Testiranje sinteze Fmoc in analize strukturne strukture peptidnih onesnaževal dokazuje nekaj takih primerov. [11] [12] Pogostost in pomen posameznih onesnaževal sta odvisna od sekvence in procesa, zato avtomatizacije sinteze ne smemo enačiti s popolnim izogibanjem kemijskim napakam.

3. Kakšno vlogo ima živica pri sintezi peptidov?

Smole zadržuje rastajoči peptid, medtem ko se topni reagensi in številni stranski produkti lahko odstranijo med naslednjimi fazami sinteze. To znatno poenostavlja ponavljajoče se vezanje verige, vendar smola ni zgolj mehanski nosilec. Njena struktura, stopnja polnjenja, arhitektura polimera, skladnost z topili in razpoložljivost reakcijskih mest lahko vplivajo na učinkovitost dostopa reagensov do povezanega peptida. V raziskavah z uporabo reaktora z spremenjenim kompleksom so spremljali vedenje smole med analizami agregacije in učinkovitost vezave. [4] Takšno spremljanje ne odpravlja napak v sekvenci, vendar kaže, zakaj lahko fizični stanek smole predstavlja pomembno procesno spremenljivko.

4. Kaj služi živica Wanga pri sintezi peptidov?

Nosilci Wang so pogosto povezani z izdelavo peptidov, ki se sproščajo po ustrezni odstranitvi konca C-konec v obliki karboksilne kisline. Dokaj končni produkt pa je odvisen od veziva, arhitekture nosilca in uporabljenega razbijalnega kemijskega sredstva, ne pa le od imena smole. Raziskovalci so predstavili tudi specializirano metodo pretvorbe peptidnega nosilca Wang-TentaGel v peptidne hidrazide, ki lahko služijo kot koristni sintezni polizdelki. [5] Alternativna reakcija ne spreminja pomena standardnega razbijanja s Wangovo smole. Vendar pa kaže, zakaj je pri predvidevanju proizvoda treba analizirati celoten nosilec in pogoje reakcije.

5. Ali SPPS gradi peptid od N-konca ali od C-konca?

Klasična etapna SPPS običajno začne s priključitvijo končnega dela C-polmera na nosilec, nato pa se verižica podaljša proti N-polmeru. To je nasprotni smerej kot standardno podaljševanje verige na ribosomu, kjer se beljakovina razvija z dodajanjem dodatnih aminokislin do C-polmera. Sintetizacija BPTI je primer uporabe zavarovanih gradnikov in nosilca pred kasnejšim sproščanjem, čiščenjem in falkiranjem izdelka. [3] Vendar pa obstajajo specializirane strategije peptidne kemije, ki uporabljajo druge rešitve, zato je graditev od C- do N-polmera treba opredeliti kot klasičen pristop SPPS in ne kot absolutno pravilo vseh metod sinteze.

6. Zakaj so potrebne zaščitne skupine?

Aminokisline pogosto vsebujejo več reaktivnih funkcionalnih skupin. Zaščitne skupine začasno preprečujejo reakcijo na določenih mestih in pustijo ustrezno mesto na voljo v določenem trenutku sinteze. To pomaga nadzirati vrstni red in način združevanja ostankov. Brez ustrezne zaščite lahko konkurenčne reakcije povzročijo nastanek zapletenih mešanic ali produktov z spremenjeno strukturo. Raziskave o nastanku aspartimidina so pokazale, da lahko sprememba kemijske zaščitne skupine omeji pomembno stransko reakcijo v analiziranih sekvencah. [2] Zaščitne skupine ne zagotavljajo popolnega poteka sinteze, temveč zagotavljajo selektivno kemijsko kontrolo, ki mora ostati skladna z vsemi pomembnimi fazami procesa.

7. Kakšna sta razlika med Fmoc in Boc?

Fmoc in Boc sta pogosto uporabljena za zaščito aminokislinskega loka, vendar reagirata tudi na druga kemijska okolja. Fmoc običajno odstranjujejo v alkalnem okolju, Boc pa je občutljiv na kisline. Ta razlika vpliva na način povezovanja z zaščitnimi verigami, ligandi in drugimi fazami sinteze. Sintetična strategija, ki temelji na Fmocu, je široko razširjena v sodobni SPPS, vendar so raziskave pokazale tudi možnost pojavljanja sekvenčnih stranskih reakcij v takih pogojih. [11] V praksi je torej bolj koristno primerjati celotne strategije zaščite in njihovo skladnost z določeno sekvenco, kot pa razpravljati le o imenih dveh zaščitnih skupin.

8. Kaj pomeni ortogonalna zaščita?

Ortogonalna zaščita pomeni, da je mogoče eno zaščitno skupino odstraniti pod pogoji, v katerih ostane druga potrebna zaščitna skupina dovolj stabilna, da lahko nadaljujemo s sintezo. To omogoča odkrivanje različnih reaktivnih mest v določenih fazah. Ta koncept je ključen pri nadzorovani sintezi kompleksnih peptidov. Ortogonalnost pa je odvisna od pogojev in ne od absolutne vrednosti: večkratna izpostavljenost, struktura sekvence in parametri reakcije lahko še vedno povzročijo stranske reakcije. Pri raziskavah alternativnih metod za zaščito karboksilnih skupin je razvidno, kako je mogoče strategijo zaščite prilagoditi za nadzor težke kemije peptida. [2]

9. Kaj je sekvenca delecije?

Delecijska veriga je peptid brez ene ali več ostankov, prisotnih v predvideni ciljni verigi. Lahko nastane, ko stopnja vezave aminokislinskega ostanka ne poteka popolnoma, ampak nepreoblikovan lančnik ostane pritrjen na nosilec in sodeluje v nadaljnjih ciklih. Ker je nepravilen lančnik še vedno vezan na nosilec, običajno čiščenje ne more odstraniti njega. Raziskave v realnem času spremljanja SPPS kažejo na nepopolno tvorjenje amidnih vezi kot pomemben procesni problem. [4] Delecijska veriga je torej problem, povezan s strukturo in identiteto izdelka, in ne zgolj z ostanki reagenta.

10. Ali lahko dva peptidna onesnaženja imata enako maso molekule?

Da. Različne molekulske strukture lahko imajo enako ali nerazločno nominalno maso. Zaradi tega sama skladnost mase ne potrjuje popolne identitete molekule. V raziskavah s sintetičnim peptidom, ki je substrat renina, so identificirali izobarne sestavine onesnaženja, pri čemer so bile spremembe v različnih položajih. Derivacija in tandemna masna spektrometrija sta zagotovila dodatne strukturne informacije. [12] Ta primer kaže, zakaj skladnost opazovane mase z pričakovano ne more sama potrditi ustrezne sekvence, povezljivosti, stereokemije ali odsotnosti strukturno podobnih izomerov.

11. Kaj sta epimeroza in racemizacija pri sintezi peptidov?

Epimerizacija in racemizacija sta neželeni spremembe stereokemijske konfiguracije. Lahko se dogodita brez spremembe nominalne aminokislinske sekvence ali masne koncentracije, zato običajni meritve mase morda ne kažejo strukturne razlike. V raziskavah sinteze mikrofalno podprte Fmoc so identificirali ostanke, občutljive na spremembe stereokemije, in pokazali, da lahko sprememba pogojev reakcije omeji te procese. [11] Tveganje je odvisno od strukture molekule, sekvence in pogojev procesa. Zato kakovost stereokemije zahteva analitske metode, ki lahko ocenjujejo konfiguracijo, in ne more se sklepati izključno na maso molekule.

12. Kaj je nastanek aspartimida?

Vzroki aspartimida so neželena reakcija, povezana z določenimi sekvencami, ki vsebujejo aspartin. Vzroki cikličnega polprodukta lahko vodijo do nadaljnjih produktov z spremenjeno strukturo ali stereokemično, kar zmanjšuje učinkovitost in otežuje čiščenje. Raziskovalci so analizirali alternativne zaščitne strategije, zasnovane za omejitev te reakcije v izbranih peptidih in beljakovinah. [2] Rezultati ne kažejo na enega univerzalnega rešitev za vse sekvence, ki vsebujejo aspartin. Namesto tega kažejo, zakaj mora načrtovanje sinteze in strategij kontrole onesnaženja upoštevati specifično kemijsko vedenje določene sekvence.

13. Ali visoka čistost HPLC potrjuje pravilno identiteto peptida?

Ne. Čistost HPLC opisuje vzorec v okviru specifičnega kromatografskega razdelka, uporabljenega detektorja in načina analize podatkov. Visok delež površine glavnega vzorca je lahko koristno dokazilo, da je vzorec dominiran s samo enim kromatografsko razdeljenim sestavnim delom, vendar sam po sebi ne potrjuje popolne molekularne identitete. Komplementarni onesnaževalci, stereoizomeri in drugi različici lahko zahtevajo dodatne tehnike. V raziskavah analize kiralnih peptidov se je uporabil posebej zasnovan proces, ki je upošteval tudi stereokemijske spremembe, ki nastajajo med pripravljanjem vzorca. [13] Identiteta in čistost je torej treba obravnavati kot povezana, vendar ločena analitična vprašanja.

14. Ali zmogljivost očiščenega izdelka pomeni isto kot čistost?

Ne. Performanca očiščenega ali izoliranega izdelka določa količino pridobljenega končnega materiala glede na določeno začetno ali teoretično količino. Čistost pa opisuje sestavo pridobljenega materiala po določeni analitski metodi. Sintetična tehnologija lahko privede do pridobitve relativno majhnega volumna izdelka z zelo visoko čistostjo ali velike količine surovih materialov, ki vsebujejo veliko količino onesnaževal. V raziskavah avtomatske pretokovne sinteze se čistoća surovih izdelkov in performanca po izolaciji poročata ločeno. [7] Razvrščanje teh parametrov preprečuje napačno obravnavanje visoke vrednosti enega od njih kot dokaza o visoki vrednosti drugega.

15. Ali je mogoče dolge peptide proizvajati z združevanjem krajših fragmentov?

Da. V fragmentni strategiji se lahko krajši peptidi pripravijo ločeno in nato združijo z ustrezno kemijo. Ligacija z nevarnim spojem je bil pomemben primer, kjer so nezaščiteni peptidi združili na način, ki je vodil do nastanka naravnega vezanja peptidnega skeleta, nato pa so dobili deformirano beljakovino. [10] To ne pomeni, da se lahko kateri koli peptidi spontano združijo. Morajo se upoštevati struktura peptidov, kemija vezave, izbira mesta vezave, topnost, stereokemija in zahteve za čiščenje. Zato je sestavljanje peptidov alternativa strategiji projektiranja sinteze in ne avtomatsko rešitev težav z dolgimi peptidi.

16. Ali hitrejša avtomatizirana sinteza odpravlja potrebo po čiščenju?

Ne. Hitrejši avtomatizirani ali pretokoviti postopki izdelave skrajšajo čas določenih faz sinteze, vendar ne dokazujejo, da ima vsaka nastala molekula namenjeno strukturo. V raziskavah hitrega pretokovnega sinteze so še vedno značilni surov material in poznejše čiščenje, v nadaljnjih delih o avtomatizaciji pa so ločeno primerjali čistost surovega materiala in učinkovitost po izolaciji. [6] [7] Dobri rezultati sistema za raziskane sekvence pa ne zagotavljajo enakih rezultatov za vsak nov cilj. Pospešena sinteza mora še vedno biti povezana z ustreznim čiščenjem, potrditvijo identitete, analizo onesnaženja in končno karakterizacijo.

17. Zakaj je povečanje obsega proizvodnje bolj zapleteno kot izdelava večjih serij?

Povečanje obsega spremeni fizikalne in kemične razmere, ne le količino materiala. Mešanje, izmenjava toplote, raztezanje smole, porazdelitev reagentov, tlak, filtracija, uporaba topil, topnost polizdelkov in zmogljivosti čistilnega sistema se lahko ob večji proizvodni količini obnašajo drugače. V industrijski analizi je bilo 40 peptidnih procesov posebej ocenjeno sintezo, čiščenje in izolacijo med analiziranjem porabe materiala. [14] Rezultati kažejo, zakaj je treba proizvodnjo obravnavati kot celoten proces. Skalabilna metoda mora ponavljati doseganje karakteriziranega materiala na vseh stopnjah, ne le pri večji količini surovega peptida.

18. Ali je peptid pripravljen takoj po sestavljanju pravilne sekvence?

Ne nujno. Zložitev verige ustvari strukturo sekvence le v obsegu, v katerem to potrjujejo proces in analitični podatki. Glede na molekulo lahko še vedno potrebujete razbijanje vezi, odvajanje spojin, cikloizomerizacijo, oksidiranje, tvorbo disiarčnih mostičkov, faldiranje, konjugacijo, čiščenje in karakterizacijo. Sintetizacija BPTI je dober primer procesa, v katerem po sestavljanju linearne verige sledi čiščenje in tvorba deformirane strukture, ki vsebuje disiarčne mostičke. [3] Zato bi izraz „končen peptid” moral pomeniti molekularno obliko, ki je potrebna v danem znanstvenem kontekstu, in ne le končni rezultat postopka dodajanja aminokislin.

19. Ali pravilna molekulska masa potrjuje pravilno sekvenco peptida?

Ne. Združljivost masne mase je dragocen dokaz, vendar ne more samostojno potrditi popolne sekvence ali molekularne strukture. Izobarične strukture lahko imajo enako maso, medtem ko lahko razlike v stereokemičnih strukturah povzročijo spremembo masne mase. Raziskave onesnaženja s sintetičnimi peptidi so pokazale, da je razlikovanje strukturno različnih sestavin lahko zahtevalo tandemno masno spektrometrijo in dodatne analize. [12] V primeru vprašanj glede stereokemijske integritete so lahko potrebne tudi kiralne metode. [13] Maso molekule je torej treba obravnavati kot enega od elementov ocene identitete in ne kot njeno popolno potrditev.

20. Zakaj je čiščenje treba obravnavati kot del proizvodnje peptida in ne le kot končni dodatek?

Čiščenje odloča o tem, ali je ciljni peptid lahko učinkovito ločen od delektivnih sekvenc, stranskih produktov, ostankov reagenc, strukturno podobnih onesnaževal in drugih sestavin, nastalih med sintezo. Metoda, ki omogoča zelo hitro proizvodnjo velikih količin surovega materiala, lahko še vedno ni praktična, če ni mogoče učinkovito pridobiti želene kakovosti končnega proizvoda. Zaradi tega industrijske analize peptidnih procesov vključujejo skupaj sintezo, čiščenje in izolacijo. [14] Učinkovitost proizvodnje se na koncu ocenjuje na podlagi količine in lastnosti izoliranega končnega materiala, ne pa le hitrosti sinteze.

Omejitve pri primerjavi metod sinteze peptidov

Pri interpretaciji raziskav, ki primerjajo tehnologije proizvodnje peptidov, je treba upoštevati nekaj pomembnih omejitev.

Prvič, sekvenca močno vpliva na težavnost sinteze. Metoda, ki deluje za en peptid, ne sme delovati enako za drugega. Agregacija, hidrofilnost, aminokislinski sestavek, dolžina, nagnjenost k tvorjenju sekundarnih struktur in dovzetnost za stranske reakcije lahko spreminjajo vedenje procesa. [1] [4]

Drugič, čistost surovih materialov, učinkovitost po izolaciji, končna čistost in vsebnost peptida so različni parametri. Primerjava metod le na podlagi enega od njih lahko daje nepopolno sliko učinkovitosti proizvodnje. [7]

Po tretjini pomeni hitro sestavljanje verige hitro proizvodnjo celotnega materiala. Odstranjevanje, čiščenje, izolacija, končno oblikovanje strukture, analitske preiskave in dokumentiranje prav tako vplivajo na celoten čas izdelave. [6] [7]

Štiri, analitska čistost je odvisna od uporabljenega metode. HPLC, masna spektrometrija, tandemna masna spektrometrija in kiralna analiza odgovarjajo na različna vprašanja. Ena analitska vrednost ne potrebuje potrditve popolne strukturne identitete. [12] [13]

Po peti, razsežnost vpliva na potek procesa. Rezultate laboratorijske sinteze ni mogoče avtomatično prenesti na industrijsko proizvodnjo brez ocene mešanja, prenašanja mase, možnosti čiščenja, porabe materialov in drugih dejavnikov, odvisnih od razsežnosti. [14]

Šestič, zgodovinske ekonomske primerjave lahko sčasoma izgubijo svojo aktualnost. Stroški reagentov, raven avtomatizacije, tehnologije ekstrakcije, oprema za čiščenje, pridobivanje topil in proizvodna infrastruktura nenehno se razvijajo. Stare analize stroškov lahko še vedno imajo znanstveni pomen, vendar ne morajo odražati aktualne ekonomike trga. [1]

Po sedmo, okoljska primerjava zahteva dosledne meje analize. Ocena porabe topil med samim izdelavo verige, pri čemer pa se izpušča čiščenje in izolacija, lahko vodi do zavajajočih zaključkov glede ravnovesja procesa. [14] [15]

Končno, sama imena metod ne določajo kakovosti izdelka. SPPS, sinteza v raztopini, LPPS, ligacija fragmentov in biološka ekspresija lahko privedejo do pridobivanja visokokakovostnega materiala, če je proces ustrezno zasnovan in kontroliran. Nobena od teh metod pa ne zagotavlja samodejno ustrezne identitete, čistosti, stereokemije, flokulacije ali uporabnosti za določen namen.

Povzetek

Sintezo peptidov je najbolje razumeti kot nadzorovan proces tvorbe molekul, in ne le kot tvorjenje peptidnih vezi.

Cilj je zgraditi določeno aminokislinsko sekvenco ob hkem nadziranju načina povezovanja ostankov, kemije zaščitnih skupin, stereokemije, stranskih reakcij in vseh dodatnih strukturnih zahtev.

Sinteza peptidov v trdnem stanju ohranja rastlinski verigo na neraztopnem nosilcu, zaradi česar se ponavljajoči koraki vezave in prečiščenja dobro podajo za avtomatizacijo. Vendar pa prednosti, povezane s ponavljajočim se postopkom, ne odpravljajo težav, kot so nepopolne reakcije, agregacija, sekvence delecije ali stranski reakciji, odvisni od sekvence reakcije. [4] [6] [7]

Klasična sinteza v raztopini ohranja peptidne polprevodnike v tekočem stanju in lahko zagotavlja večjo prilagodljivost pri izolaciji in karakterizaciji posameznih posrednih produktov. Vendar pa lahko večkratno razdelitev in slabša topnost predstavljata resne omejitve.

Metode sinteze v tekočem stanju z topili, ki vsebujejo označevalce, poskušajo združiti kemijo raztopine z zasnovanimi strategijami za pridobivanje materiala. Zato lahko predstavljajo dodatno možnost v primeru zaporedij in proizvodnih težav, za katere klasična SPPS ni optimalna. [8] [9]

Dolgčasne ali posebej zahtevne molekule je mogoče pripraviti tudi z dodajanjem fragmentov, vključno z nativno kemično ligacijo, namesto da bi se zanašali le na neprekinjeno dodajanje novih aminokislinskih ostankov. [10]

Ne glede na izbrano metodo formulacije ostajajo učinkovitost vezave in kemija zaščitnih skupin ključni, saj lahko majhne neučinkovitosti in stranski učinki med nadaljnjimi fazami sinteze kumulirajo. Vzpostavitev aspartimidov, delecijske sekvence in stereokemijske spremembe kažejo, zakaj sama predvidena sekvenca ne opisuje vsega, kar se lahko med procesom pojavi. [2] [11] [12]

Delo se tudi ne konča z vložitvijo verige.

Čiščenje odloča o tem, ali je ciljni izdelek mogoče ločiti od drugih sestavin.

Nato ustrezno izbrani analitski postopki odgovarjajo na posebna vprašanja o identiteti, čistosti, vsebnosti, stereokemiji, konformaciji in – če je to pomembno – funkcionalni aktivnosti. [3] [12] [13]

Povečanje obsega proizvodnje uvaja nove vidike v zvezi s prevozom mase, ohranjanjem smole, porabo topil, filtracijo, možnostmi čiščenja, ponovljivostjo procesa in njegovim vplivom na okolje. Zaradi tega mora industrijska ocena procesa vključevati sintezo, čiščenje in izolacijo skupaj in ne omejevati se le na hitrost vezave. [14] [15]

Najpomembnejša načela so naslednja:

učinkovita proizvodnja peptida zahteva nadzor celotnega procesa – od molekularnega projekta in tvorbe vezi do čiščenja in strukturne karakterizacije. Doseganje verjetne nominalne mase verige ali visokega glavnega piketa v kromatografiji predstavlja dragocen dokaz, vendar noben od teh parametrov sam po sebi ne potrjuje popolne molekularne identitete ali kakovosti proizvodnega procesa.

Zavrnitev odgovornosti

Članek ima izključno izobraževalni in znanstveno-informacijski namen. Opisuje splošna načela peptidne kemije, sinteze v stalni fazi, sinteze v raztopini in v tekoči fazi, strategije za zaščitne skupine, vezave, čiščenje, analitske karakteristike, proizvodne procese ter primere, ki izhajajo iz objavljenih raziskav. Ni laboratorijski protokol, proizvodna navodila, zdravniška navodila, vodnik za odmerjanje ali dajanje, niti certifikat kakovosti katerega koli konkretnega peptidnega izdelka. Rezultati eksperimentov je treba interpretirati v kontekstu sekvence, uporabljenih metod, obsega procesa, analitskih tehnik in omejitev posameznih raziskav.

Reference

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K., & Perczel, A. (2016). Bakterijska ekspresija in/ali sinteza peptidov v trdni fazi za 20–40 aminokislinskih polipeptidev in miniproteinov, primer raziskave ligandov GPCR razreda B. Current Protein & Peptide Science, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Preprečevanje nastajanja aspartimida med sintezo peptidov z uporabo cianosulfurilidov kot skupin za zaščito karboksilne kisline. Nature Communications, 11(1), člen 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). Sinteza snovi v trdni fazi inzulinskega inhibitorja trebušnega pankreasa (BPTI) in dveh njegovih analogov. Kemijski pristop za oceno vloge disulfidnih mostov pri zložitvi in stabilnosti beljakovin. Mednarodni časopis za peptidne in proteinske raziskave, 40(3–4), 194–207. Dokument v zbirki PubMed
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). V realnem času spremljanje sinteze peptidov v trdni fazi z uporabo reaktorja z variabilnim tokom. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F., & Becker, C. F. W. (2015). Učinkovita proizvodnja peptidnih hidrazidov z neposredno hidrazolizo Peptidyl-Wang-TentaGel smol. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Hitra sinteza peptidov na podlagi hitrosti pretoka. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2017). Polno avtomatiziran pristop na podlagi toka za pospešeno sintezo peptidov. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G., & Albericio, F. (2022). Tekočina za sintezo peptidov (LPPS): tretja val za pripravo peptidov. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T. in Fukui, T. (2012). Novo amidno zaščitno skupino, pridobljeno iz difenilmetila, za učinkovito sintezo peptidov v tekočem stanju: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., & Kent, S. B. (1994). Sinteza proteinov z uporabo naravne kemijske ligacije. Znanost, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Zmanjšanje racemizacije in tvorbe aspartimida pri sintezi peptidov v trdni fazi z uporabo mikrovalovnega sistema Fmoc. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Opredelitev nečistoč v sintetičnem peptidu z bazalnim reninom z masno spektrometrijo s hitrim bombardiranjem atomov in hibridno tandemno masno spektrometrijo. Rapidne komunikacije v masnem spektrometriji, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G. & Crowther, J. B. (1995). Določanje kiralne čistosti peptidov: hidroliza v deuteriranem kislinskem mediju, derivatizacija z Marfeyjevim reagentom in analiza z visoko zmogljivo tekočinsko kromatografijo – elektroplinsko ionizacijo – masno spektrometrijo. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Intenzivnost procesov (PMI): celostna analiza trenutnih proizvodnih procesov peptidov informira o trajnosti sinteze peptidov. Journal of Organic Chemistry, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Izzivi trajnosti pri sintezi in prečiščevanju peptidov: od raziskav in razvoja do proizvodnje. Journal of Organic Chemistry, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001