Peptide synthesis: solid-phase method, solution-phase method, and production methods

Peptide synthesis is a controlled process of creating amino acid chains with a specific sequence. In chemical synthesis, selected amino acids are linked using peptide bonds, while simultaneously controlling other reactive groups present in these molecules. The goal is therefore not just to join amino acids, but to obtain a specific molecular structure with a defined sequence, stereochemistry, chain-end architecture, and—if required—additional structural features.

The main methods include solid-phase peptide synthesis (SPPS), classical solution-phase synthesis, and newer liquid-phase peptide synthesis (LPPS) methods using soluble supports or molecular tags. Research laboratories and manufacturing facilities can also combine different approaches, prepare shorter fragments separately and then join them together, or use biological expression if it is more suitable for a given sequence.

Comparison of chemical synthesis with bacterial expression of polypeptides consisting of 20–40 amino acid residues demonstrates an important principle: the practical choice of the production method depends on the specific molecule, its sequence, propensity for aggregation, required modifications, production scale, and analytical requirements. [1]

Obtaining the intended amino acid sequence is only one of the stages of peptide production.

The entire process may include:

sequence design → preparation of building blocks → protection of functional groups → coupling → deprotection → chain assembly → cleavage or fragment condensation → final structural shaping → purification → identity confirmation → impurity analysis → potency determination → final characterization.

For some peptides, additional steps such as cyclization, disulfide bond formation, folding, conjugation, or other chemical modifications are also necessary.

For this reason, the correct assembly of the chain does not automatically mean that the final material has the proper identity, purity, stereochemistry, conformation, stability, or other required characteristics.

What is peptide synthesis?

Creating a specific amino acid sequence

Peptide consists of amino acid residues joined by peptide bonds.

The goal of peptide synthesis is to create these bonds in a predetermined order, often while simultaneously controlling:

• types of amino acids;
• amino acid sequence order;
• stereochemistry;
• N-terminal structures;
• C-terminal structures;
• side chain modifications;
• disulfide bond distribution;
• cyclization;
• of other required structural features.

The sequence is of fundamental importance because an identical amino acid composition can lead to the formation of different molecules if the amino acids occur in a different order.

Stating that a given molecule is „a peptide composed of five amino acids” therefore provides very little information about its actual structure. To properly describe the molecule, one must know the type of amino acids, their sequence, stereochemistry, end groups, and any potential additional modifications.

Two peptides can therefore have the exact same amino acid composition and yet be different molecular structures.

Additional differences may result from chain end modifications, the presence of disulfide bridges, a cyclic backbone, side chain alterations, or different stereochemical configurations.

Chemical peptide synthesis typically uses amino acids whose reactive groups have been selectively protected.

Temporary protecting groups enable the formation of a specific intended chemical bond while limiting competing reactions at other sites of the molecule.

In the subsequent planned stages of synthesis, these groups are removed or modified.

Controlled reaction instead of spontaneous merging

In basic chemical descriptions, the formation of a peptide bond is often presented as a condensation reaction in which two amino acids combine with the net release of a water molecule.

Such an equation describes the overall reaction balance.

However, it should not be equated with the way in which controlled peptide synthesis is carried out in practice.

Simply mixing free amino acids would not allow to reliably determine:

• which amino group is to react;
• which carboxylic group is supposed to react;
• which amino acid should be first;
• which is to be the second;
• will side chains start reacting;
• will the stereochemistry be retained;
• will numerous undesired products not be formed.

Therefore, controlled strategies of activation and protection of functional groups are used in practical chemical synthesis.

A group derived from a carboxyl group is typically activated in such a way that it can react efficiently with a chosen amino group. Protecting groups, reaction sequence, carrier chemistry, coupling reagents, solvent environment, and isolation methods work together to direct the reaction toward the intended product.

Effective peptide synthesis therefore requires control over both the chemistry that is to take place and that which must be prevented.

A good example is the formation of aspartimide.

Researchers developed an alternative method for protecting the carboxyl group, aimed at limiting this problematic side reaction during peptide assembly. [2]

The study shows a broader principle of peptide chemistry: preventing undesired molecular transformations can be just as important as forming the correct peptide bond.

When can a peptide be considered ready?

Finishing the creation of the linear peptide backbone does not always mean the end of the entire synthesis.

Depending on the target molecule, additional steps may be required after chain assembly.

They may include:

• complete removal of protective groups;
• cleavage of the peptide from the solid support;
• removal of temporary markers;
• cyclization;
• oxidation;
• formation of disulfide bonds;
• folding;
• conjugation;
• chain end modification;
• purification;
• analytical characterization.

Some peptides require relatively few additional structural modifications after chain assembly.

For others, the later stages are crucial.

A good example is the synthesis of bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI). The researchers assembled the linear sequence, purified the material, and then obtained a folded structure containing disulfide bonds. According to the analyses and functional comparisons presented in the study, the final material with the natural sequence corresponded to the natural protein within the range of the studied parameters. [3]

This example shows the difference between the assembly of the peptide backbone and the production of a fully characterized final molecular form.

A method that allows obtaining the correct linear sequence does not automatically confirm:

• proper folding;
• proper formation of disulfide bonds;
• biological activity;
• stability;
• pollution profile;
• fitness for a particular purpose.

Each of these issues requires separate evidence.

Chemical synthesis, biological expression, and combined methods

In chemical peptide synthesis, previously prepared molecular blocks are joined in controlled laboratory reactions.

Biological expression, on the other hand, utilizes cellular machinery to produce the encoded amino acid sequence. Subsequently, the material must be recovered, purified, and, if necessary, subjected to further processing.

Both methods can lead to the production of peptides or polypeptides, but they involve different possibilities and limitations.

Chemical synthesis can be particularly useful when needed:

• selected non-standard amino acids;
• site-specific chemical modifications;
• specific chain end structures;
• isotope tracers;
• peptide backbone modifications;
• other traits difficult to obtain through standard biological expression.

Biological expression can be attractive in the case of suitable longer sequences or specific labeling strategies, but it does not eliminate problems occurring at later stages of production.

Material recovery, folding, processing, host-related impurities, purification, and analytical characterization must still be taken into account.

Therefore, none of the methods is universally the best.

In the comparison of polypeptides consisting of 20–40 amino acid residues, both sequence length and its propensity for aggregation affected the results of solid-phase synthesis and bacterial expression. [1]

These observations support an approach where the production method is selected for a specific molecule.

Historical data on performance, costs, equipment, and production time should not be treated as universal modern values, because technologies, reagents, automation, purification methods, and production economics change with technological development.

Solid-phase peptide synthesis

The growing chain is attached to an insoluble support

In solid-phase peptide synthesis (SPPS), the growing peptide chain remains attached to an insoluble support during successive synthesis cycles.

The carrier is most often a functionalized polymer resin.

A linker binds the peptide to the carrier and influences, among other things, the manner in which the final chain is subsequently released and the type of end group obtained.

One of the main practical advantages of SPPS is easier material separation.

Upon completion of a specific reaction step, soluble reagents and many soluble by-products can be removed by washing, while the growing peptide remains bound to the solid phase.

Because of this, there is no need to isolate and purify the growing peptide as a separate, free compound after the addition of each successive amino acid.

However, this convenience can lead to a significant misunderstanding.

Washing the resin does not mean that all incorrect peptides have been removed.

If the chain attached to the resin does not react during one coupling step, it may still remain on the support.

In subsequent cycles, it may react again and elongate further.

As a result, a deletion sequence may be formed, which is a molecule differing from the target peptide by the absence of one or more amino acid residues.

Similarly chemically modified or incompletely unblocked chains bound to the resin can participate in subsequent synthesis steps.

Therefore, SPPS simplifies the separation of soluble substances from the resin-bound material.

However, it does not guarantee perfect sequence alignment.

A repeating cycle of uncoupling and coupling

A typical stepwise SPPS synthesis involves repeating three basic operations:

disengaging → coupling → flushing.

First, the reactive amino group located at the end of the growing chain is uncovered.

Next, another protected amino acid is attached to the chain.

Soluble reagents, excess amino acid, and many reaction products are removed before the next cycle begins.

Repeating this process makes it possible to build the peptide one amino acid residue at a time.

In classical SPPS, the C-terminal residue is usually attached to the support first, and then the chain is elongated towards the N-terminus.

This differs from standard ribosomal protein synthesis, during which successive amino acids are added to the C-terminus of the growing chain.

However, the final amino acid sequence can be identical even though the direction and chemistry of the folding process are different.

The term „cycle” should not be understood as a single universal set of reaction conditions suitable for every residue and every sequence.

The course of the reaction may depend on:

• protective group strategies;
• amino acid type;
• spatial conditions around the reaction site;
• resin type;
• Linker;
• chain lengths;
• aggregation;
• solvent;
• coupling chemistry;
• structural behavior of the growing peptide.

A reaction that proceeds easily at the beginning of the synthesis can become significantly more difficult at a later stage.

Therefore, process monitoring remains important even in highly automated systems.

Why do resin properties matter?

A durable medium is not merely a passive holder.

Its physical and chemical properties can directly affect the course of the reaction.

One of the important parameters is swelling.

If the resin swells properly in the chosen solvent environment, reagents can more easily reach the reactive sites located throughout the polymer structure.

Insufficient swelling or structural changes in the resin may limit this access.

The following may also be important:

• stocking density;
• polymer architecture;
• linker script;
• solvent compatibility;
• mechanical stability;
• porosity;
• diffusion properties;
• interactions between growing peptide chains.

As the peptide length increases, individual chains can also interact with each other.

Aggregation on the resin can restrict access to reactive sites and lead to incomplete coupling or incomplete deprotection.

This means that a sequence that behaves correctly at the beginning of the synthesis may become increasingly difficult as the chain lengthens.

Researchers have developed a variable-bed flow reactor that enabled monitoring of resin swelling based on pressure-related measurements. [4]

The study focused on resin aggregation and incomplete bonding as process issues that might otherwise be difficult to directly observe during synthesis.

This shows that monitoring the physical behavior of the medium can provide information that goes beyond merely recording the added reagents.

What is Wang resin used for?

Wang linker chemistry is widely used in SPPS when a C-terminal carboxylic acid is desired after peptide cleavage.

The peptide is attached via an ester-type bond, which can later be cleaved under appropriate conditions.

Other linker systems may be selected when a different C-terminal structure is required, for example an amide.

It is worth distinguishing the linker chemistry from the entire physical carrier.

Wang-type linkers can be incorporated into various polymer architectures.

Such materials do not have to have identical:

• swelling properties;
• capacities;
• solvent compatibility;
• mechanical properties;
• behaviors during a reaction.

Studies using peptidyl-Wang-TentaGel resins demonstrated a specialized alternative method for obtaining peptide hydrazides, which are useful intermediates in peptide chemistry. [5]

This does not mean that standard cleavage from Wang resin usually leads to the formation of peptide hydrazides.

It shows, however, an important principle:

support + linker + reaction conditions + cleavage chemistry together determine the resulting product.

SPPS synthesis in batch and flow systems

SPPS can be carried out in conventional batch vessels or in systems where reagents flow through a reactor containing a solid support.

Flow systems can enable rapid reagent exchange and more precise control of the chemical environment surrounding the resin.

A 2014 study presented rapid flow-based peptide synthesis with continuous monitoring and applied it to several peptides and a small protein. [6]

A later automated study described significantly faster chain assembly, yielding crude product purity and isolated yields comparable to classical batch synthesis for the analyzed examples. [7]

These studies show the capabilities of specific systems under defined conditions.

They do not prove, however, that every peptide can be produced equally quickly and with the same quality.

The time required to produce the peptide also involves much more than just chain assembly.

The entire process may include:

• reagent preparation;
• resin preparation;
• coupling;
• disengaging the safety;
• rinsing;
• schism;
• product processing;
• purification;
• solvent removal;
• final structural shaping;
• analytical tests;
• documentation.

Rapid binding is therefore only one element of overall production efficiency.

Liquid-phase synthesis

What does this term mean?

The term „solution-phase peptide synthesis” can be used in several senses.

In a broad sense, it may simply mean peptide synthesis carried out in solution.

However, in more specialized literature, a distinction is often made between:

1. classical solution-phase peptide synthesis;
2. solid-phase peptide synthesis;
3. newer LPPS methods, in which the growing chain possesses a soluble tag or support.

This distinction is important because the method of product separation and recovery changes.

A freely dissolved, protected peptide intermediate may require isolation utilizing its own physical and chemical properties.

In the case of a labeled intermediate, the label can be designed to facilitate precipitation, extraction, membrane retention, or another method of separation.

The review on LPPS clearly distinguishes between classical solution-phase synthesis, SPPS, and methods utilizing soluble tags. [8]

The publication is useful for organizing terminology and methodology.

However, it should not be interpreted as a single experiment proving that one method is the best for every peptide.

Classical solution-phase peptide synthesis

In classical solution-phase synthesis, protected amino acids, peptide intermediates, or fragments remain dissolved in the reaction medium instead of being covalently attached to an insoluble resin.

Upon completion of the reaction, the corresponding intermediate can be isolated, purified, and, if necessary, characterized before initiating the next step.

This may bring certain benefits.

Researchers can:

• characterize individual intermediates;
• tailor the purification method to a specific intermediate;
• optimize individual transformations;
• prepare fragments independently;
• modify the synthesis route when a specific intermediate causes problems.

However, solution-phase synthesis can also be associated with significant difficulties.

As the peptide chain lengthens, they can:

• become poorly soluble;
• aggregate;
• be difficult to crystallize;
• to generate closely related impurities;
• hard to separate;
• require multiple isolation;
• cause material losses during subsequent processing stages.

Solution-phase synthesis is therefore not automatically simpler or easier to scale than SPPS.

Its utility depends on the specific sequence, intermediate stability, solubility, length of the synthesis route, purification behavior, and the efficiency of subsequent isolation steps.

The development of labeled LPPS strategies stems in part from attempts to solve these very problems related to separation and material handling. [8]

Soluble tags bridge reaction design and separation design

In labeled LPPS, the growing peptide possesses a temporary molecular attachment designed in such a way as to influence its physical properties.

The tag may enable maintaining sufficient solubility of the peptide during the reaction and then facilitate its selective recovery.

Depending on the technology, separation can use:

• precipitation;
• extraction;
• retention on the membrane;
• phase behavior;
• other properties resulting from the presence of the tag.

One of the experimental strategies used a long-chain C-terminal protecting group to prepare peptide amides.

Repeated reactions and precipitation steps enabled the researchers to prepare a hydrophobic peptide, which, in the comparison performed by them, was difficult to obtain satisfactorily using the SPPS method. [9]

This demonstrates the usefulness of this specific strategy for the analyzed sequence.

However, it does not prove the universal superiority of tagged synthesis.

The tag becomes part of the manufacturing process and raises its own questions:

• How effectively is it connected?
• Does it change the course of the reaction?
• How can a labeled semi-finished product be reliably recovered?
• Does it lead to the creation of new pollution?
• How is it removed?
• Can complete deletion be confirmed?
• Which analytical methods confirm its absence in the final product?

Dissolvable markers should therefore be treated as functional elements of the process design, rather than merely as simple labels.

Comparison of main methods

The comparison presents the general principles of operation of the individual methods.

It does not specify which of them will provide the best performance, cleanliness, cost, environmental sustainability, or scalability for a particular sequence.

These parameters should be evaluated based on the actual molecule and the specific manufacturing process. [4] [8] [9]

Fragment joining and hybrid production

A peptide does not always have to be created in a single uninterrupted process consisting of the addition of successive amino acid residues.

An alternative strategy is to separately prepare shorter peptide fragments and then join them.

For example, a hybrid process can use SPPS to obtain individual fragments and solution-phase chemistry to ligate them.

Fragment-based strategies can limit some of the problems associated with very long multi-step synthesis.

However, they introduce new challenges, such as:

• selection of the appropriate connection location;
• solubility of fragments;
• activation of the junction site;
• chemoselectivity;
• retention of stereochemistry;
• side effects;
• fragment purification;
• purification after their combination.

An important example of controlled fragment joining is native chemical ligation.

In the classical version, a peptide thioester reacts with a second peptide containing an N-terminal cysteine. A subsequent rearrangement leads to the formation of a native peptide backbone bond at the ligation site.

Initial research demonstrated the possibility of obtaining, after ligation and folding, a protein containing disulfide bonds. [10]

This confirms the importance of this fragment-linking strategy.

However, this does not mean that any two unmodified peptide fragments can spontaneously join together.

Coupling and protecting groups

Coupling creates an intended connection

Coupling is a reaction stage during which a new peptide bond is formed between selected units.

Usually, the group derived from the carboxyl group is activated so that it can effectively react with the corresponding amino group.

The activation chemistry must be compatible with:

• increasing sequence;
• temporary protective groups;
• side-chain protection;
• stereochemistry;
• carrier or marker;
• solvent environment;
• with other functional groups present in the molecule.

Effective coupling is particularly important in stepwise synthesis because incomplete reaction can lead to the formation of deletion sequences.

If a single amino acid addition step fails for some of the growing chains, such chains may remain in the system and participate in subsequent cycles.

As a result, molecules very similar to the target peptide, but lacking a single residue, may be formed.

Even minor inefficiencies can therefore accumulate over many synthesis steps.

A simple mathematical example illustrates this problem well.

If each of the 50 independent assembly stages had a 99% probability of success, the percentage of molecules for which all stages would be successful would be:

0.99^50 ≈ 0.605

that is about 61%.

This is exclusively a mathematical illustration.

It does not constitute a prediction of the actual purity or synthesis yield of a 50-residue peptide.

Actual production includes:

• different coupling efficiencies in individual positions;
• steps to disarm;
• side effects;
• sequence-dependent difficulty;
• re-engagement strategy;
• cleavage losses;
• purification losses;
• other process variables.

The calculation shows only why even a seemingly minor inefficiency of a single step can take on great significance in a multi-step synthesis.

Protecting groups control the reaction site

An amino acid can possess several chemically reactive groups.

Without selective control, coupling reactions could occur at undesired sites.

Protecting groups temporarily block selected reactive sites.

The amino group used for chain elongation typically requires temporary protection, whereas reactive side chains may require protection that remains in place throughout multiple synthesis cycles.

The connection to the carrier must also survive these stages until the planned separation.

The choice of protecting groups therefore affects the entire synthesis strategy.

The following must be taken into account:

• the method of introducing them;
• stability;
• removal method;
• compatibility with other protective groups;
• compatibility with the medium;
• side effects;
• impact of a specific sequence;
• final disarming conditions.

Studies utilizing cyanosulfurylid-based protection focused on the formation of aspartimide by altering the protection method of the carboxyl group. [2]

The results show that the protecting group strategy influences not only whether the intended reaction can take place, but also which side reactions become possible.

Fmoc, Boc and orthogonal protection

Fmoc and Boc belong to widely used amino-protecting groups.

They differ significantly in the way they are removed.

Fmoc is typically removed under basic conditions, whereas Boc is sensitive to acidic conditions.

These properties allow them to be used as elements of broader protection strategies.

In popular Fmoc-based SPPS, the temporary Fmoc N-terminal protecting group is repeatedly removed, while selected side-chain protecting groups and the resin linkage remain intact for later stages.

Other strategies may use different combinations.

A particularly important concept is orthogonal protection.

Two protecting groups are considered orthogonal if one can be selectively removed under conditions in which the other remains sufficiently stable to allow further synthesis to proceed.

Orthogonality is therefore a practical relationship of chemical compatibility.

It does not mean that every protected group will remain completely unchanged after an unlimited number of exposures to all reaction conditions.

Side effects can still occur.

Fmoc synthesis studies have described both aspartimide formation and undesired stereochemical changes despite the assumed selectivity of the general protection strategy. [11]

Stereochemia jest częścią tożsamości cząsteczki

Wiele aminokwasów posiada centrum chiralne.

Oznacza to, że ich atomy mogą przyjmować różne układy przestrzenne odpowiadające różnym formom stereochemicznym.

Zmiana konfiguracji jednego centrum stereogenicznego może prowadzić do powstania innej struktury peptydu bez konieczności zmiany jego nominalnej masy.

Dlatego sama masa nie może potwierdzić pełnej tożsamości peptydu.

Epimeryzacja zazwyczaj oznacza zmianę konfiguracji jednego centrum stereogenicznego w cząsteczce zawierającej kilka takich centrów.

Racemizacja jest również często omawiana w chemii peptydów w kontekście utraty integralności stereochemicznej reszt aminokwasowych.

Zmiany te są istotne, ponieważ rozpoznawanie molekularne może silnie zależeć od przestrzennego ułożenia atomów.

Dwie cząsteczki o tym samym składzie pierwiastkowym i nominalnej masie mogą więc zachowywać się inaczej, jeśli różnią się stereochemią.

W badaniu syntezy Fmoc wspomaganej mikrofalami stwierdzono, że niektóre reszty były podatne na niepożądane zmiany stereochemiczne w zastosowanych warunkach. Modyfikacja metody ograniczała występowanie tych reakcji. [11]

Nie oznacza to, że ogrzewanie z definicji uszkadza wszystkie peptydy.

Prawidłowy wniosek jest taki, że przyspieszanie reakcji należy oceniać razem z zależną od sekwencji selektywnością chemiczną.

Aspartimid i inne pokrewne zanieczyszczenia

Powstawanie aspartimidu jest znaną reakcją uboczną dotyczącą określonych sekwencji zawierających asparaginian.

Może powstać niepożądany cykliczny półprodukt, z którego następnie tworzą się związki o zmienionej łączności szkieletu lub stereochemii.

Prawdopodobieństwo tej reakcji zależy od sekwencji oraz warunków procesu.

Inne zanieczyszczenia związane z syntezą mogą wynikać z:

• niepełnego sprzęgania;
• niepełnego odbezpieczania;
• powstawania sekwencji delecyjnych;
• reakcji łańcuchów bocznych;
• zmian stereochemicznych;
• reakcji podczas odszczepiania;
• utleniania;
• przegrupowań;
• warunków obróbki produktu;
• niepełnego usunięcia grup ochronnych.

Niektóre zanieczyszczenia powodują łatwo zauważalną zmianę masy cząsteczkowej.

Inne są znacznie trudniejsze do rozróżnienia.

W badaniach analitycznych syntetycznego peptydu będącego substratem reniny zidentyfikowano wiele zanieczyszczeń, w tym składniki wykazujące taką samą zmianę masy, ale zawierające modyfikacje w różnych pozycjach. [12]

Do ich rozróżnienia potrzebna była dodatkowa analiza strukturalna.

Badacze traktowali również proponowane mechanizmy powstawania tych zanieczyszczeń jako hipotezy.

Jest to ważne rozróżnienie:

ustalenie, czym jest zanieczyszczenie, oraz udowodnienie dokładnego mechanizmu jego powstania to dwa odrębne pytania naukowe.

Nie należy przedstawiać prawdopodobnego mechanizmu jako potwierdzonego wyłącznie dlatego, że odpowiada obserwowanej masie cząsteczkowej.

Oczyszczanie, skalowanie i jakość produkcji

Produkt surowy, produkt oczyszczony i wydajność

Surowy peptyd to materiał otrzymany przed zakończeniem odpowiednich etapów oczyszczania.

Może zawierać:

• docelowy peptyd;
• deletion sequences;
• materiał niecałkowicie odbezpieczony;
• zmodyfikowane sekwencje;
• pozostałości odczynników;
• produkty związane z odszczepianiem;
• sole;
• solvents;
• inne składniki powstające w procesie.

Oczyszczanie ma na celu oddzielenie właściwego peptydu od tej mieszaniny.

Należy wyraźnie rozróżnić trzy pojęcia:

czystość produktu surowego — zmierzony skład materiału przed końcowym oczyszczaniem;

wydajność produktu oczyszczonego lub wyizolowanego — ilość odzyskanego materiału docelowego względem określonej wartości początkowej lub teoretycznej;

czystość końcowa — skład wyizolowanego materiału określony za pomocą konkretnej metody analitycznej.

Pojęcia te nie są wymienne.

Proces może prowadzić do powstania dużej ilości surowego materiału, ale umożliwiać odzyskanie stosunkowo niewielkiej ilości oczyszczonego produktu.

Inny proces może dawać mniej materiału surowego, ale charakteryzować się wysoką selektywnością tworzenia produktu docelowego.

Podobnie wysoka czystość analityczna nie musi oznaczać wysokiej wydajności produkcyjnej.

W badaniach przyspieszonej syntezy przepływowej prawidłowo raportowano osobno czystość materiału surowego i wydajność po izolacji. [7]

Chromatografia rozdziela składniki, ale nie odpowiada na każde pytanie

Wysokosprawna chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) jest szeroko stosowana do analizy i oczyszczania peptydów.

Różne cząsteczki w odmienny sposób oddziałują z fazą stacjonarną i ruchomą.

W odpowiednich warunkach różnice te umożliwiają rozdzielanie składników mieszaniny.

Chromatografia analityczna i preparatywna mają powiązane, ale odmienne zastosowania.

Analityczna HPLC służy przede wszystkim do badania składu próbki.

Preparatywna HPLC jest wykorzystywana do fizycznego zbierania rozdzielonych składników.

Chromatogram może dostarczać wielu wartościowych informacji.

Dużego głównego piku lub wysokiego procentowego udziału jego powierzchni nie należy jednak traktować jako pełnej charakterystyki molekularnej.

Wyniki chromatografii zależą między innymi od:

• rodzaju kolumny;
• fazy ruchomej;
• gradient;
• temperatures;
• metody detekcji;
• długości fali;
• przygotowania próbki;
• sposobu integracji pików;
• rozdzielczości;
• właściwości zanieczyszczeń.

Dwa związki mogą potencjalnie eluować w tym samym czasie.

Niektóre składniki próbki mogą również różnie reagować na zastosowany detektor.

Dlatego wysoka czystość powierzchniowa w HPLC nie jest równoznaczna z pełnym potwierdzeniem tożsamości molekularnej.

Badania izobarycznych zanieczyszczeń peptydowych oraz analizy chiralnej pokazują, dlaczego mogą być potrzebne uzupełniające metody analityczne. [12] [13]

Metoda analityczna musi odpowiadać konkretnemu pytaniu strukturalnemu.

Tożsamość, czystość i zawartość oznaczają różne rzeczy

W charakterystyce peptydów szczególnie ważne są trzy pojęcia.

Tożsamość odpowiada na pytanie:

Czy w próbce znajduje się zamierzona cząsteczka?

Czystość odpowiada na pytanie:

Jakie inne składniki znajdują się w próbce lub jaka część mierzonego sygnału odpowiada głównemu składnikowi?

Zawartość odpowiada na pytanie:

Ile rzeczywistego peptydu znajduje się w próbce?

Na te pytania nie zawsze można odpowiedzieć za pomocą jednego pomiaru.

Materiał zawierający peptyd może również zawierać:

• wodę;
• hypotenuses;
• sole;
• solvent residues;
• inne składniki związane z procesem;
• zanieczyszczenia.

Całkowita masa odważonego materiału nie musi więc odpowiadać masie samego peptydu.

Podobnie zgodność zmierzonej masy cząsteczkowej z wartością teoretyczną nie potwierdza:

• kompletnej sekwencji aminokwasowej;
• prawidłowej łączności poszczególnych reszt;
• integralności stereochemicznej;
• disulfide bond distribution;
• fałdowania;
• braku izobarycznych zanieczyszczeń.

Spektrometria mas może dostarczać silnych dowodów dotyczących masy cząsteczkowej.

Tandemowa spektrometria mas i inne techniki strukturalne mogą dostarczać dodatkowych informacji o sekwencji.

Metody chiralne pozwalają analizować zagadnienia stereochemiczne, których nie można rozstrzygnąć zwykłym pomiarem masy.

W jednym z badań analitycznych uwzględniono nawet racemizację powstającą podczas przygotowania próbki. Pokazuje to kolejną ważną zasadę: sama procedura analityczna może powodować artefakty, jeśli nie zostanie odpowiednio zaprojektowana. [13]

Fałdowanie i aktywność mogą wymagać osobnego potwierdzenia

W przypadku strukturalnie ograniczonych peptydów i małych białek prawidłowa sekwencja oraz masa cząsteczkowa nadal mogą być niewystarczające do potwierdzenia zamierzonej struktury końcowej.

Dodatkowe pytania mogą obejmować:

• Czy powstały właściwe mostki disiarczkowe?
• Czy cząsteczka przyjęła oczekiwaną konformację?
• Czy cyklizacja jest kompletna?
• Czy obecne są izomery strukturalne?
• Czy syntetyczna cząsteczka wykazuje oczekiwaną aktywność w określonym teście eksperymentalnym?

W badaniu syntezy BPTI wykorzystano kilka metod analitycznych i biofizycznych wraz z oceną hamowania trypsyny. [3]

Łączne wyniki wspierały zgodność syntetycznego materiału o naturalnej sekwencji z naturalnym białkiem w zakresie badanych kryteriów.

Test aktywności odpowiada jednak na określone pytanie funkcjonalne.

Nie zastępuje analizy zanieczyszczeń.

Podobnie podobna aktywność w jednym teście nie potwierdza pełnej równoważności wszystkich właściwości biologicznych, strukturalnych czy produkcyjnych.

Skalowanie produkcji zmienia więcej niż tylko ilość materiału

Zwiększenie skali produkcji nie polega wyłącznie na proporcjonalnym zwiększeniu ilości wszystkich odczynników.

Procesy fizyczne mogą zachowywać się inaczej przy większej skali.

Znaczenie mogą mieć:

• mieszanie;
• wymiana ciepła;
• rozprowadzanie odczynników;
• dyfuzja;
• pęcznienie żywicy;
• ciśnienie;
• filtracja;
• gospodarka rozpuszczalnikami;
• precipitation;
• rozpuszczalność półproduktów;
• transport masy;
• możliwości systemu oczyszczania.

Czynniki te mogą wpływać zarówno na przebieg reakcji, jak i na powstawanie zanieczyszczeń.

Oczyszczanie na późniejszych etapach również może stać się wąskim gardłem całej produkcji.

Zwiększenie szybkości syntezy ma ograniczone znaczenie, jeśli system oczyszczania nie jest w stanie skutecznie rozdzielić powstających zanieczyszczeń lub odzyskać produktu o wymaganej jakości.

W analizie przemysłowej obejmującej 40 procesów syntezy peptydów z 14 firm farmaceutycznych oceniano zużycie materiałów podczas syntezy, oczyszczania i izolacji. [14]

Badanie pokazuje, dlaczego ocenę produkcji należy prowadzić dla całego procesu.

Nie oznacza jednak, że każda fabryka, sekwencja lub technologia produkcyjna osiąga identyczne wyniki.

Jakość produkcji jest wynikiem wielu elementów kontroli

Wiarygodna produkcja peptydów wymaga czegoś więcej niż uzyskania jednego satysfakcjonującego wyniku analitycznego.

Kontrolowany proces zazwyczaj obejmuje kilka powiązanych elementów:

zdefiniowana cząsteczka docelowa → odpowiednie materiały wyjściowe → kontrolowana synteza → kontrolowane oczyszczanie → właściwe pobieranie próbek → zwalidowana lub odpowiednia do celu analiza → dokumentacja partii.

Dokumentacja partii łączy wyniki analityczne z materiałem, który rzeczywiście został wyprodukowany.

Certyfikat analizy (COA) podsumowuje wybrane wyniki badań określonej partii.

Jego wartość informacyjna zależy od:

• rodzaju wykonanych badań;
• zastosowanych metod;
• przydatności tych metod;
• specyfikacji;
• identyfikacji próbki;
• możliwości prześledzenia partii;
• potwierdzenia, że raportowane wyniki rzeczywiście dotyczą danego materiału.

Pojedyncza wartość określana jako „czystość” nie może samodzielnie potwierdzić:

• pełnej tożsamości molekularnej;
• zawartości peptydu;
• integralności stereochemicznej;
• poziomu pozostałości rozpuszczalników;
• zawartości wody;
• składu przeciwjonów;
• właściwości mikrobiologicznych;
• fałdowania;
• biological activity;
• przydatności do określonego celu.

Odpowiedni zestaw analiz zależy od zamierzonego zastosowania materiału.

Peptyd wykorzystywany jako analityczny materiał odniesienia, odczynnik badawczy stosowany w eksperymencie komórkowym oraz materiał znajdujący się na etapie rozwoju farmaceutycznego mogą wymagać odpowiedzi na inne pytania jakościowe.

Dowody analityczne należy więc interpretować w jasno określonym kontekście, a nie jako uniwersalne potwierdzenie jakości.

Ocena zrównoważenia środowiskowego musi obejmować cały proces

Synteza peptydów może wymagać znacznych ilości rozpuszczalników i odczynników.

Ocena wpływu środowiskowego powinna więc uwzględniać znacznie więcej niż sam etap sprzęgania.

Do istotnych elementów mogą należeć:

• przygotowanie bloków budulcowych;
• odczynniki sprzęgające;
• odczynniki do odbezpieczania;
• rinsing;
• schism;
• obróbka produktu;
• chromatografia;
• wymiana rozpuszczalników;
• izolacja;
• drying;
• gospodarowanie odpadami.

Zmniejszenie obciążenia środowiskowego może wymagać równoczesnej poprawy kilku etapów.

W opublikowanej analizie dotyczącej produkcji peptydów omówiono problemy związane zarówno z syntezą, jak i oczyszczaniem oraz wskazano potrzebę ulepszania całego projektu procesu. [15]

Jako publikacja perspektywiczna nie stanowi ona kontrolowanego bezpośredniego porównania dowodzącego, że jedna konkretna technologia zawsze jest bardziej przyjazna środowisku.

Similarly:

szybsza synteza nie oznacza automatycznie bardziej ekologicznej syntezy,

a mniejsze zużycie rozpuszczalników podczas samej syntezy nie oznacza automatycznie mniejszego wpływu całego procesu produkcyjnego.

Porównania środowiskowe wymagają stosowania spójnych granic analizy i najlepiej powinny odnosić zużycie zasobów do określonej ilości wyizolowanego i scharakteryzowanego produktu końcowego.

Frequently asked questions

1. Czym różni się synteza peptydów na fazie stałej od syntezy w fazie ciekłej?

W syntezie na fazie stałej rosnący peptyd pozostaje przyłączony do nierozpuszczalnego nośnika, natomiast w klasycznej syntezie w roztworze półprodukt peptydowy pozostaje rozpuszczony i zazwyczaj musi być odzyskiwany na podstawie swoich właściwości fizycznych i chemicznych. W węższym znaczeniu LPPS rozpuszczony rosnący łańcuch posiada dodatkowo rozpuszczalny znacznik lub nośnik ułatwiający późniejsze rozdzielanie. Badania syntezy znakowanej pokazują jedną ze strategii łączenia chemii roztworowej z odzyskiwaniem poprzez wytrącanie, natomiast literatura dotycząca LPPS odróżnia takie rozwiązania zarówno od klasycznej syntezy w roztworze, jak i od SPPS. Żadna metoda nie jest z definicji optymalna dla każdego peptydu. Podstawowa różnica dotyczy sposobu fizycznego prowadzenia i rozdzielania rosnącego łańcucha podczas kolejnych etapów syntezy. [8] [9]

2. Dlaczego podczas syntezy peptydów mogą powstawać zanieczyszczenia?

Zanieczyszczenia mogą powstawać dlatego, że zamierzone reakcje nie zawsze zachodzą ilościowo, a inne grupy funkcyjne mogą uczestniczyć w niepożądanych reakcjach. Niepełne sprzęganie może prowadzić do sekwencji delecyjnych, niepełne odbezpieczanie może zakłócać dalsze składanie łańcucha, a niektóre sekwencje są podatne na zmiany stereochemiczne, powstawanie aspartimidu, utlenianie, przegrupowania lub produkty uboczne związane z odszczepianiem. Badania syntezy Fmoc oraz analizy strukturalnej syntetycznych zanieczyszczeń peptydowych dokumentują kilka takich przykładów. [11] [12] Częstość i znaczenie poszczególnych zanieczyszczeń zależą od sekwencji i procesu, dlatego automatyzacji syntezy nie należy utożsamiać z całkowitym brakiem błędów chemicznych.

3. Jaką rolę pełni żywica w syntezie peptydów?

Żywica utrzymuje rosnący peptyd, podczas gdy rozpuszczalne odczynniki i wiele produktów ubocznych można usuwać pomiędzy kolejnymi etapami syntezy. Znacznie upraszcza to powtarzające się składanie łańcucha, ale żywica nie jest wyłącznie mechanicznym uchwytem. Jej pęcznienie, stopień obsadzenia, architektura polimeru, zgodność z rozpuszczalnikami i dostępność miejsc reakcji mogą wpływać na skuteczność docierania odczynników do przyłączonego peptydu. W badaniach z wykorzystaniem reaktora ze zmiennym złożem monitorowano zachowanie żywicy podczas analizy agregacji i efektywności sprzęgania. [4] Takie monitorowanie nie eliminuje błędów sekwencji, ale pokazuje, dlaczego fizyczny stan żywicy może być istotną zmienną procesową.

4. Do czego służy żywica Wanga w syntezie peptydów?

Nośniki typu Wang są powszechnie związane z przygotowywaniem peptydów uwalnianych po odpowiednim odszczepieniu z C-końcem w postaci kwasu karboksylowego. Dokładny produkt końcowy zależy jednak od linkera, architektury nośnika i zastosowanej chemii odszczepiania, a nie tylko od nazwy żywicy. Badacze przedstawili również specjalistyczną metodę przekształcania materiału peptydyl-Wang-TentaGel w hydrazydy peptydowe, które mogą służyć jako użyteczne półprodukty syntetyczne. [5] Alternatywna reakcja nie zmienia znaczenia standardowego odszczepiania z żywicy Wanga. Pokazuje natomiast, dlaczego podczas przewidywania produktu należy analizować cały system nośnika i warunki reakcji.

5. Czy SPPS buduje peptyd od N-końca czy od C-końca?

Klasyczna etapowa SPPS zazwyczaj rozpoczyna się od przyłączenia C-końcowej reszty do nośnika, po czym łańcuch jest wydłużany w kierunku N-końca. Jest to kierunek przeciwny do standardowego wydłużania łańcucha na rybosomie, gdzie białko rośnie poprzez dodawanie kolejnych aminokwasów do C-końca. Synteza BPTI jest przykładem wykorzystania zabezpieczonych bloków budulcowych i nośnika przed późniejszym uwolnieniem, oczyszczaniem i fałdowaniem produktu. [3] Istnieją jednak specjalistyczne strategie chemii peptydów wykorzystujące inne rozwiązania, dlatego budowanie od C- do N-końca należy określać jako klasyczne podejście SPPS, a nie bezwzględną zasadę wszystkich metod syntezy.

6. Dlaczego grupy ochronne są potrzebne?

Aminokwasy często zawierają kilka reaktywnych grup funkcyjnych. Grupy ochronne tymczasowo zapobiegają reakcji wybranych miejsc, pozostawiając odpowiednie miejsce dostępne w konkretnym etapie syntezy. Pomaga to kontrolować kolejność i sposób łączenia reszt. Bez właściwej ochrony konkurencyjne reakcje mogłyby prowadzić do powstawania złożonych mieszanin lub produktów o zmienionej strukturze. Badania dotyczące powstawania aspartimidu pokazały, że zmiana chemii ochrony grupy karboksylowej może ograniczać ważną reakcję uboczną w analizowanych sekwencjach. [2] Grupy ochronne nie gwarantują idealnego przebiegu syntezy, lecz zapewniają selektywną kontrolę chemiczną, która musi pozostać zgodna ze wszystkimi istotnymi etapami procesu.

7. Czym różnią się Fmoc i Boc?

Fmoc i Boc są szeroko stosowanymi tymczasowymi grupami chroniącymi grupę aminową, ale reagują na inne warunki chemiczne. Fmoc jest zazwyczaj usuwany w środowisku zasadowym, natomiast Boc jest wrażliwy na kwasy. Różnica ta wpływa na sposób łączenia ich z ochroną łańcuchów bocznych, linkerami i pozostałymi etapami syntezy. Synteza oparta na Fmoc jest szeroko wykorzystywana we współczesnej SPPS, ale badania wykazały również możliwość występowania zależnych od sekwencji reakcji ubocznych w takich warunkach. [11] W praktyce bardziej użyteczne jest więc porównywanie całych strategii ochrony i ich zgodności z daną sekwencją niż rozpatrywanie wyłącznie nazw dwóch grup ochronnych.

8. Co oznacza ochrona ortogonalna?

Ochrona ortogonalna oznacza, że jedną grupę ochronną można usunąć w warunkach, w których inna potrzebna grupa ochronna pozostaje wystarczająco stabilna, aby można było kontynuować syntezę. Pozwala to odsłaniać różne miejsca reaktywne na określonych etapach. Koncepcja ta ma podstawowe znaczenie podczas kontrolowanej syntezy złożonych peptydów. Ortogonalność jest jednak zależna od warunków, a nie absolutna: wielokrotna ekspozycja, charakter sekwencji i parametry reakcji nadal mogą prowadzić do reakcji ubocznych. Badania alternatywnych sposobów ochrony grup karboksylowych pokazują, jak strategię ochrony można modyfikować w celu kontrolowania trudnej chemii peptydowej. [2]

9. Czym jest sekwencja delecyjna?

Sekwencja delecyjna to peptyd pozbawiony jednej lub kilku reszt obecnych w zamierzonej sekwencji docelowej. Może powstać, gdy etap sprzęgania aminokwasu nie zachodzi całkowicie, ale nieprzereagowany łańcuch pozostaje przyłączony do nośnika i uczestniczy w kolejnych cyklach. Ponieważ nieprawidłowy łańcuch nadal pozostaje związany z żywicą, zwykłe przemywanie nie musi go usunąć. Badania monitorowania SPPS w czasie rzeczywistym wskazują niepełne tworzenie wiązań amidowych jako ważny problem procesowy. [4] Sekwencja delecyjna jest więc problemem związanym ze strukturą i tożsamością produktu, a nie jedynie pozostałością odczynnika.

10. Czy dwa zanieczyszczenia peptydowe mogą mieć taką samą masę cząsteczkową?

Tak. Różne struktury molekularne mogą mieć identyczną lub nierozróżnialną masę nominalną. Z tego powodu sama zgodność masy nie potwierdza pełnej tożsamości cząsteczki. W badaniach syntetycznego peptydu będącego substratem reniny zidentyfikowano izobaryczne składniki zanieczyszczeń, w których modyfikacje występowały w różnych pozycjach. Derywatyzacja i tandemowa spektrometria mas dostarczyły dodatkowych informacji strukturalnych. [12] Przykład ten pokazuje, dlaczego zgodność obserwowanej masy z oczekiwaną nie może samodzielnie potwierdzić właściwej sekwencji, łączności, stereochemii ani braku strukturalnie podobnych izomerów.

11. Czym są epimeryzacja i racemizacja w syntezie peptydów?

Epimeryzacja i racemizacja dotyczą niepożądanych zmian konfiguracji stereochemicznej. Mogą one zachodzić bez zmiany nominalnej sekwencji aminokwasowej lub masy cząsteczkowej, dlatego zwykły pomiar masy może nie wykazać różnicy strukturalnej. W badaniach syntezy Fmoc wspomaganej mikrofalami zidentyfikowano reszty podatne na zmiany stereochemiczne i wykazano, że modyfikacja warunków reakcji może ograniczać takie procesy. [11] Ryzyko zależy od bloku budulcowego, sekwencji i warunków procesu. Jakość stereochemiczna wymaga więc metod analitycznych zdolnych do oceny konfiguracji, a nie może być wnioskowana wyłącznie na podstawie masy cząsteczkowej.

12. Czym jest powstawanie aspartimidu?

Powstawanie aspartimidu jest niepożądaną reakcją związaną z określonymi sekwencjami zawierającymi asparaginian. Powstanie cyklicznego półproduktu może prowadzić do kolejnych produktów o zmienionej łączności szkieletu lub stereochemii, zmniejszając wydajność i utrudniając oczyszczanie. Badacze analizowali alternatywne strategie ochrony zaprojektowane w celu ograniczenia tej reakcji w wybranych peptydach i białkach. [2] Wyniki nie wskazują jednego uniwersalnego rozwiązania dla wszystkich sekwencji zawierających asparaginian. Pokazują natomiast, dlaczego projektowanie syntezy i strategii kontroli zanieczyszczeń musi uwzględniać specyficzne zachowanie chemiczne danej sekwencji.

13. Czy wysoka czystość HPLC potwierdza prawidłową tożsamość peptydu?

Nie. Czystość HPLC opisuje próbkę w ramach konkretnego rozdziału chromatograficznego, zastosowanego detektora i sposobu analizy danych. Wysoki udział powierzchni głównego piku może być wartościowym dowodem, że próbka jest zdominowana przez jeden chromatograficznie rozdzielony składnik, ale nie potwierdza samodzielnie pełnej tożsamości molekularnej. Współeluujące zanieczyszczenia, stereoizomery i inne warianty mogą wymagać dodatkowych technik. W badaniach analizy chiralnej peptydów wykorzystano specjalnie zaprojektowany proces, który uwzględniał również zmiany stereochemiczne powstające podczas przygotowania próbki. [13] Tożsamość i czystość należy więc traktować jako powiązane, ale odrębne pytania analityczne.

14. Czy wydajność produktu oczyszczonego oznacza to samo co czystość?

Nie. Wydajność produktu oczyszczonego lub wyizolowanego określa ilość odzyskanego materiału docelowego względem zdefiniowanej ilości początkowej lub teoretycznej. Czystość opisuje natomiast skład odzyskanego materiału według określonej metody analitycznej. Synteza może prowadzić do uzyskania stosunkowo niewielkiej ilości produktu o bardzo wysokiej czystości albo dużej ilości materiału surowego zawierającego znaczną ilość zanieczyszczeń. W badaniach automatycznej syntezy przepływowej czystość surowego produktu i wydajność po izolacji raportowano oddzielnie. [7] Rozdzielenie tych parametrów zapobiega błędnemu traktowaniu wysokiej wartości jednego z nich jako dowodu wysokiej wartości drugiego.

15. Czy długie peptydy można wytwarzać poprzez łączenie krótszych fragmentów?

Tak. W strategii fragmentowej krótsze segmenty peptydowe mogą zostać przygotowane oddzielnie, a następnie połączone za pomocą odpowiedniej chemii. Natwywna ligacja chemiczna była ważnym przykładem, w którym niezabezpieczone fragmenty peptydowe połączono w sposób prowadzący do powstania naturalnego wiązania szkieletu peptydowego, a następnie uzyskano pofałdowane białko. [10] Nie oznacza to, że dowolne fragmenty peptydowe mogą łączyć się spontanicznie. Należy uwzględnić strukturę fragmentów, chemię łączenia, wybór miejsca połączenia, rozpuszczalność, stereochemię i wymagania dotyczące oczyszczania. Składanie fragmentów jest więc alternatywną strategią projektowania syntezy, a nie automatycznym rozwiązaniem problemów związanych z długimi peptydami.

16. Czy szybsza zautomatyzowana synteza eliminuje potrzebę oczyszczania?

Nie. Szybsze zautomatyzowane lub przepływowe składanie skraca czas określonych etapów syntezy, ale nie dowodzi, że każda powstała cząsteczka ma zamierzoną strukturę. W badaniach szybkiej syntezy przepływowej nadal charakteryzowano materiał surowy i stosowano późniejsze oczyszczanie, a w kolejnych pracach dotyczących automatyzacji osobno porównywano czystość surowego materiału i wydajność po izolacji. [6] [7] Dobre wyniki systemu dla badanych sekwencji nie gwarantują również identycznych rezultatów dla każdego nowego celu. Przyspieszona synteza nadal musi być połączona z odpowiednim oczyszczaniem, potwierdzeniem tożsamości, analizą zanieczyszczeń i charakterystyką końcową.

17. Dlaczego zwiększenie skali produkcji jest bardziej skomplikowane niż przygotowanie większej partii?

Zwiększenie skali zmienia warunki fizyczne i chemiczne, a nie tylko ilość materiału. Mieszanie, wymiana ciepła, pęcznienie żywicy, dystrybucja odczynników, ciśnienie, filtracja, obsługa rozpuszczalników, rozpuszczalność półproduktów i możliwości systemu oczyszczania mogą zachowywać się inaczej przy większej objętości produkcji. W analizie przemysłowej 40 procesów peptydowych osobno oceniano syntezę, oczyszczanie i izolację podczas analizy zużycia materiałów. [14] Wyniki pokazują, dlaczego produkcję trzeba rozpatrywać jako kompletny proces. Skalowalna metoda musi powtarzalnie prowadzić do uzyskania scharakteryzowanego materiału na wszystkich etapach, a nie tylko większej ilości surowego peptydu.

18. Czy peptyd jest gotowy od razu po złożeniu prawidłowej sekwencji?

Niekoniecznie. Złożenie łańcucha tworzy szkielet sekwencji tylko w takim zakresie, w jakim potwierdzają to proces i dane analityczne. W zależności od cząsteczki mogą być nadal potrzebne odbezpieczanie, odszczepianie, cyklizacja, utlenianie, tworzenie mostków disiarczkowych, fałdowanie, koniugacja, oczyszczanie i charakterystyka. Synteza BPTI stanowi dobry przykład procesu, w którym po złożeniu liniowej sekwencji następowało oczyszczanie i tworzenie pofałdowanej struktury zawierającej mostki disiarczkowe. [3] Określenie „gotowy peptyd” powinno więc odnosić się do formy molekularnej wymaganej w danym kontekście naukowym, a nie tylko do zakończenia etapowego dodawania aminokwasów.

19. Czy prawidłowa masa cząsteczkowa potwierdza prawidłową sekwencję peptydu?

Nie. Zgodność masy cząsteczkowej jest wartościowym dowodem, ale nie może samodzielnie potwierdzić pełnej sekwencji ani struktury molekularnej. Struktury izobaryczne mogą mieć tę samą masę, a różnice stereochemiczne mogą w ogóle nie powodować zmiany masy cząsteczkowej. Badania zanieczyszczeń syntetycznych peptydów pokazały, że rozróżnienie strukturalnie odmiennych składników może wymagać tandemowej spektrometrii mas i dodatkowych analiz. [12] W przypadku pytań dotyczących integralności stereochemicznej mogą być potrzebne również metody chiralne. [13] Masę cząsteczkową należy więc traktować jako jeden z elementów oceny tożsamości, a nie jej pełne potwierdzenie.

20. Dlaczego oczyszczanie należy traktować jako część produkcji peptydu, a nie tylko końcowy dodatek?

Oczyszczanie decyduje o tym, czy docelowy peptyd można skutecznie oddzielić od sekwencji delecyjnych, produktów ubocznych, pozostałości odczynników, strukturalnie podobnych zanieczyszczeń i innych składników powstałych podczas syntezy. Metoda pozwalająca bardzo szybko wytwarzać duże ilości surowego materiału może nadal być niepraktyczna, jeśli nie da się skutecznie odzyskać docelowego produktu o wymaganej jakości. Z tego powodu analizy przemysłowe procesów peptydowych uwzględniają razem syntezę, oczyszczanie i izolację. [14] Efektywność produkcji należy ostatecznie oceniać na podstawie ilości i właściwości wyizolowanego materiału końcowego, a nie wyłącznie szybkości syntezy.

Ograniczenia przy porównywaniu metod syntezy peptydów

Podczas interpretowania badań porównujących technologie produkcji peptydów należy pamiętać o kilku istotnych ograniczeniach.

Po pierwsze, sekwencja silnie wpływa na trudność syntezy. Metoda sprawdzająca się dla jednego peptydu nie musi działać tak samo dla innego. Agregacja, hydrofobowość, skład aminokwasowy, długość, tendencja do tworzenia struktur drugorzędowych i podatność na reakcje uboczne mogą zmieniać zachowanie procesu. [1] [4]

Po drugie, czystość materiału surowego, wydajność po izolacji, czystość końcowa i zawartość peptydu są różnymi parametrami. Porównywanie metod wyłącznie na podstawie jednego z nich może dawać niepełny obraz efektywności produkcji. [7]

Po trzecie, szybkie składanie łańcucha nie oznacza szybkiej produkcji całego materiału. Odszczepianie, oczyszczanie, izolacja, końcowe kształtowanie struktury, badania analityczne i dokumentacja również wpływają na całkowity czas produkcji. [6] [7]

Po czwarte, czystość analityczna zależy od zastosowanej metody. HPLC, spektrometria mas, tandemowa spektrometria mas i analiza chiralna odpowiadają na różne pytania. Jeden wynik analityczny nie musi potwierdzać pełnej tożsamości strukturalnej. [12] [13]

Po piąte, skala wpływa na zachowanie procesu. Wyników syntezy laboratoryjnej nie można automatycznie przenosić na produkcję przemysłową bez oceny mieszania, transportu masy, możliwości oczyszczania, zużycia materiałów i innych czynników zależnych od skali. [14]

Po szóste, historyczne porównania ekonomiczne mogą z czasem tracić aktualność. Koszty odczynników, poziom automatyzacji, technologie ekspresji, wyposażenie do oczyszczania, odzyskiwanie rozpuszczalników i infrastruktura produkcyjna stale się rozwijają. Starsze analizy kosztów mogą nadal mieć znaczenie naukowe, ale nie muszą odzwierciedlać aktualnej ekonomiki rynku. [1]

Po siódme, porównania środowiskowe wymagają spójnych granic analizy. Ocena zużycia rozpuszczalników podczas samego składania łańcucha przy jednoczesnym pominięciu oczyszczania i izolacji może prowadzić do mylących wniosków dotyczących zrównoważenia procesu. [14] [15]

Wreszcie sama nazwa metody nie określa jakości produktu. SPPS, synteza w roztworze, LPPS, ligacja fragmentów oraz ekspresja biologiczna mogą prowadzić do uzyskania materiału wysokiej jakości, jeśli proces został odpowiednio zaprojektowany i kontrolowany. Żadna z tych metod nie gwarantuje jednak automatycznie właściwej tożsamości, czystości, stereochemii, fałdowania czy przydatności do konkretnego zastosowania.

Summary

Syntezę peptydów najlepiej rozumieć jako kontrolowany proces wytwarzania cząsteczek, a nie po prostu tworzenie wiązań peptydowych.

Celem jest zbudowanie określonej sekwencji aminokwasowej przy jednoczesnym kontrolowaniu sposobu połączenia reszt, chemii grup ochronnych, stereochemii, reakcji ubocznych i wszelkich dodatkowych wymagań strukturalnych.

Synteza peptydów na fazie stałej utrzymuje rosnący łańcuch na nierozpuszczalnym nośniku, dzięki czemu powtarzane etapy sprzęgania i przemywania dobrze nadają się do automatyzacji. Zalety związane z powtarzalnym składaniem nie eliminują jednak problemów takich jak niepełne reakcje, agregacja, sekwencje delecyjne czy zależne od sekwencji reakcje uboczne. [4] [6] [7]

Klasyczna synteza w roztworze utrzymuje półprodukty peptydowe w fazie ciekłej i może zapewniać większą elastyczność w izolowaniu oraz charakteryzowaniu poszczególnych produktów pośrednich. Wielokrotne rozdzielanie oraz pogarszająca się rozpuszczalność mogą jednak stać się poważnymi ograniczeniami.

Metody syntezy w fazie ciekłej z rozpuszczalnymi znacznikami próbują połączyć chemię roztworową z zaprojektowanymi strategiami odzyskiwania materiału. Mogą więc stanowić dodatkową możliwość w przypadku sekwencji i problemów produkcyjnych, dla których klasyczna SPPS nie jest optymalna. [8] [9]

Dłuższe lub szczególnie trudne cząsteczki można również przygotowywać poprzez składanie fragmentów, w tym natywną ligację chemiczną, zamiast polegać wyłącznie na nieprzerwanym dodawaniu kolejnych reszt aminokwasowych. [10]

Niezależnie od wybranej metody składania efektywność sprzęgania i chemia grup ochronnych pozostają kluczowe, ponieważ niewielkie nieefektywności i reakcje uboczne mogą kumulować się podczas kolejnych etapów syntezy. Powstawanie aspartimidu, sekwencje delecyjne i zmiany stereochemiczne pokazują, dlaczego sama zamierzona sekwencja nie opisuje wszystkiego, co może powstać podczas procesu. [2] [11] [12]

Praca nie kończy się również wraz ze złożeniem łańcucha.

Oczyszczanie decyduje o tym, czy produkt docelowy można oddzielić od innych składników.

Następnie odpowiednio dobrane metody analityczne odpowiadają na odrębne pytania dotyczące tożsamości, czystości, zawartości, stereochemii, konformacji oraz – jeśli ma to znaczenie – aktywności funkcjonalnej. [3] [12] [13]

Zwiększenie skali produkcji wprowadza kolejne zagadnienia dotyczące transportu masy, zachowania żywicy, zużycia rozpuszczalników, filtracji, możliwości oczyszczania, powtarzalności procesu i jego wpływu środowiskowego. Z tego powodu przemysłowa ocena procesu powinna obejmować razem syntezę, oczyszczanie i izolację, a nie koncentrować się wyłącznie na szybkości sprzęgania. [14] [15]

Najważniejsza zasada jest następująca:

skuteczna produkcja peptydu wymaga kontroli całego procesu – od projektu molekularnego i tworzenia wiązań aż po oczyszczanie oraz charakterystykę strukturalną. Uzyskanie łańcucha o oczekiwanej nominalnej masie lub wysokiego głównego piku chromatograficznego stanowi wartościowy dowód, ale żaden z tych parametrów samodzielnie nie potwierdza pełnej tożsamości molekularnej ani jakości procesu produkcyjnego.

Disclaimer

Artykuł ma wyłącznie charakter edukacyjny i naukowo-informacyjny. Opisuje ogólne zasady chemii peptydów, syntezy na fazie stałej, syntezy w roztworze i w fazie ciekłej, strategii grup ochronnych, sprzęgania, oczyszczania, charakterystyki analitycznej, procesów produkcyjnych oraz przykłady pochodzące z opublikowanych badań. Nie jest protokołem laboratoryjnym, instrukcją produkcyjną, poradą medyczną, przewodnikiem dotyczącym dawkowania lub podawania ani certyfikatem jakości jakiegokolwiek konkretnego produktu peptydowego. Wyniki eksperymentalne należy interpretować w kontekście sekwencji, zastosowanych metod, skali procesu, technik analitycznych i ograniczeń poszczególnych badań.

References

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K., & Perczel, A. (2016). Bacterial expression and/or solid phase peptide synthesis of 20-40 amino acid long polypeptides and miniproteins, the case study of Class B GPCR ligands. Current Protein & Peptide Science, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Prevention of aspartimide formation during peptide synthesis using cyanosulfurylides as carboxylic acid-protecting groups. Nature Communications, 11(1), Article 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). Solid-phase synthesis of bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) and two analogues. A chemical approach for evaluating the role of disulfide bridges in protein folding and stability. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. PubMed record
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). Real-time monitoring of solid-phase peptide synthesis using a variable bed flow reactor. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F., & Becker, C. F. W. (2015). Efficient generation of peptide hydrazides via direct hydrazinolysis of Peptidyl-Wang-TentaGel resins. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Rapid flow-based peptide synthesis. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2017). A fully automated flow-based approach for accelerated peptide synthesis. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G., & Albericio, F. (2022). Liquid-phase peptide synthesis (LPPS): A third wave for the preparation of peptides. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T., & Fukui, T. (2012). Novel diphenylmethyl-derived amide protecting group for efficient liquid-phase peptide synthesis: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., & Kent, S. B. (1994). Synthesis of proteins by native chemical ligation. Science, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Characterization of impurities in a synthetic renin substrate peptide by fast-atom bombardment mass spectrometry and hybrid tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G., & Crowther, J. B. (1995). Peptide chiral purity determination: Hydrolysis in deuterated acid, derivatization with Marfey’s reagent and analysis using high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Process mass intensity (PMI): A holistic analysis of current peptide manufacturing processes informs sustainability in peptide synthesis. The Journal of Organic Chemistry, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Sustainability challenges in peptide synthesis and purification: From R&D to production. The Journal of Organic Chemistry, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001