Sintesis peptida: metode fase padat, metode larutan, dan metode produksi

Sintesis peptida adalah proses terkendali untuk membentuk rantai asam amino dengan urutan tertentu. Dalam sintesis kimia, asam amino yang dipilih digabungkan menggunakan ikatan peptida, sambil mengendalikan gugus reaktif lain yang terdapat dalam molekul-molekul tersebut. Oleh karena itu, tujuannya bukanlah sekadar menggabungkan asam amino, melainkan memperoleh struktur molekul tertentu dengan urutan, stereokimia, dan bentuk ujung rantai yang spesifik, serta—jika diperlukan—ciri-ciri struktural tambahan.

Metode-metode utamanya meliputi sintesis peptida fase padat (SPPS), sintesis klasik dalam larutan, serta metode sintesis peptida fase cair (LPPS) yang lebih baru, yang memanfaatkan pembawa larut atau penanda molekuler. Laboratorium penelitian dan fasilitas produksi juga dapat menggabungkan berbagai pendekatan, seperti menyiapkan fragmen-fragmen yang lebih pendek secara terpisah dan kemudian menggabungkannya, atau menggunakan ekspresi biologis jika metode tersebut lebih sesuai untuk urutan tertentu.

Perbandingan antara sintesis kimia dan ekspresi bakteri dari polipeptida yang terdiri dari 20–40 residu asam amino menunjukkan prinsip penting: pilihan praktis metode produksi bergantung pada molekul tertentu, urutannya, kecenderungan untuk beragregasi, modifikasi yang diperlukan, skala produksi, serta persyaratan analitis. [1]

Mendapatkan urutan asam amino yang diinginkan hanyalah salah satu tahap dalam produksi peptida.

Seluruh proses tersebut dapat mencakup:

perancangan urutan → persiapan blok pembangun → pelindung gugus fungsi → pengikatan → penghilangan gugus pelindung → perakitan rantai → pemisahan atau penggabungan fragmen → pembentukan struktur akhir → pemurnian → verifikasi identitas → analisiskontaminan → penentuan kadar → karakterisasi akhir.

Untuk beberapa peptida, diperlukan pula tahap-tahap tambahan, seperti siklisasi, pembentukan jembatan disulfida, pelipatan, konjugasi, atau modifikasi kimia lainnya.

Oleh karena itu, susunan rantai yang benar tidak secara otomatis berarti bahwa bahan akhir memiliki identitas, kemurnian, stereokimia, konformasi, stabilitas, atau sifat-sifat lain yang diperlukan.

Apa itu sintesis peptida?

Pembentukan urutan asam amino tertentu

Peptida terdiri dari sisa-sisa asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida.

Tujuan sintesis peptida adalah untuk membentuk ikatan-ikatan tersebut dalam urutan yang telah ditentukan sebelumnya, seringkali sambil mengontrol:

• jenis asam amino;
• urutan asam amino dalam sekuens;
• stereokimia;
• struktur ujung N;
• struktur akhir C;
• modifikasi rantai samping;
• penempatan jembatan disulfida;
• siklisasi;
• ciri-ciri struktural lain yang diperlukan.

Urutan memiliki peran yang sangat penting, karena komposisi asam amino yang identik dapat menghasilkan molekul yang berbeda jika asam amino tersebut tersusun dalam urutan yang berbeda.

Pernyataan bahwa suatu molekul adalah „peptida yang terdiri dari lima asam amino” hanya memberikan sedikit sekali informasi mengenai struktur sebenarnya dari molekul tersebut. Untuk mendeskripsikan molekul tersebut dengan benar, kita perlu mengetahui jenis asam amino yang terkandung di dalamnya, urutannya, stereokimia, gugus terminal, serta modifikasi tambahan yang mungkin ada.

Dengan demikian, dua peptida dapat memiliki komposisi asam amino yang persis sama, namun tetap memiliki struktur molekul yang berbeda.

Perbedaan tambahan dapat disebabkan oleh modifikasi ujung rantai, adanya jembatan disulfida, kerangka siklik, perubahan pada rantai samping, atau konfigurasi stereokimia yang berbeda.

Sintesis kimia peptida biasanya menggunakan asam amino yang gugus reaktifnya telah dilindungi secara selektif.

Gugus pelindung sementara memungkinkan pembentukan ikatan kimia tertentu yang diinginkan, sekaligus membatasi reaksi-reaksi yang bersaing di bagian lain molekul.

Pada tahap-tahap sintesis berikutnya yang telah direncanakan, gugus-gugus tersebut dihilangkan atau diubah.

Reaksi terkendali, bukan penggabungan spontan

Dalam uraian kimia dasar, pembentukan ikatan peptida sering digambarkan sebagai reaksi kondensasi, di mana dua asam amino bergabung dengan pelepasan satu molekul air.

Persamaan tersebut menggambarkan keseimbangan reaksi secara umum.

Namun, hal ini tidak boleh disamakan dengan cara pelaksanaan sintesis peptida terkendali dalam praktiknya.

Hanya dengan mencampurkan asam amino bebas saja tidak akan memungkinkan untuk menentukan secara akurat:

• kelompok amino mana yang akan bereaksi;
• kelompok karboksil mana yang akan bereaksi;
• asam amino mana yang harus ditempatkan di urutan pertama;
• yang akan ditempatkan di urutan kedua;
• apakah rantai samping akan mulai bereaksi;
• apakah stereokimia akan tetap terjaga;
• apakah tidak akan muncul banyak produk sampingan yang tidak diinginkan.

Oleh karena itu, dalam sintesis kimia praktis, digunakan strategi yang terkendali untuk mengaktifkan dan melindungi gugus fungsi.

Gugus yang berasal dari gugus karboksil biasanya diaktifkan sedemikian rupa sehingga dapat bereaksi secara efektif dengan gugus amina yang dipilih. Kelompok pelindung, urutan reaksi, kimia media, reagen pengikat, lingkungan pelarut, serta metode isolasi secara bersama-sama membantu mengarahkan reaksi menuju produk yang diinginkan.

Oleh karena itu, sintesis peptida yang efektif memerlukan pengendalian baik terhadap reaksi kimia yang ingin terjadi maupun yang harus dicegah.

Contoh yang baik adalah pembentukan aspartimid.

Para peneliti telah mengembangkan metode alternatif untuk melindungi gugus karboksil, yang bertujuan untuk membatasi reaksi samping yang bermasalah tersebut selama proses sintesis peptida. [2]

Penelitian ini menunjukkan prinsip yang lebih luas dalam kimia peptida: pencegahan perubahan molekuler yang tidak diinginkan bisa sama pentingnya dengan pembentukan ikatan peptida yang tepat.

Kapan suatu peptida dapat dianggap sudah jadi?

Selesainya pembentukan kerangka linier peptida tidak selalu berarti selesainya seluruh proses sintesis.

Tergantung pada molekul targetnya, mungkin diperlukan langkah-langkah tambahan setelah rantai tersusun.

Hal-hal tersebut dapat mencakup:

• penghapusan total kelompok pelindung;
• pemisahan peptida dari pembawa padat;
• penghapusan penanda sementara;
• siklisasi;
• oksidasi;
• pembentukan jembatan disulfida;
• lipatan;
• konjugasi;
• modifikasi ujung rantai;
• pembersihan;
• karakteristik analitis.

Beberapa peptida hanya memerlukan sedikit perubahan struktural tambahan setelah rantai tersebut terbentuk.

Dalam kasus lain, tahap-tahap selanjutnya sangat penting.

Contoh yang baik adalah sintesis inhibitor tripsin pankreas sapi (BPTI). Para peneliti menyusun urutan linier, memurnikan bahan tersebut, dan kemudian memperoleh struktur bergelombang yang mengandung jembatan disulfida. Berdasarkan analisis dan perbandingan fungsional yang disajikan dalam penelitian tersebut, bahan akhir dengan urutan alami tersebut sesuai dengan protein alami dalam hal parameter yang diteliti. [3]

Contoh ini menunjukkan perbedaan antara penyusunan kerangka peptida dengan diperolehnya bentuk molekul akhir yang telah dikarakterisasi sepenuhnya.

Metode yang memungkinkan diperolehnya urutan linier yang benar tidak secara otomatis membuktikan bahwa:

• lipatan yang benar;
• penempatan jembatan disulfida yang tepat;
• aktivitas biologis;
• stabilitas;
• profil polusi;
• kesesuaian untuk penggunaan tertentu.

Setiap masalah tersebut memerlukan bukti tersendiri.

Sintesis kimia, ekspresi biologis, dan metode terpadu

Dalam sintesis kimia peptida, blok-blok molekul yang telah disiapkan sebelumnya digabungkan melalui reaksi-reaksi laboratorium yang terkendali.

Sementara itu, ekspresi biologis memanfaatkan mesin seluler untuk menghasilkan urutan asam amino yang telah dikodekan. Selanjutnya, bahan tersebut harus diekstraksi, dimurnikan, dan, jika diperlukan, diproses lebih lanjut.

Kedua metode tersebut dapat menghasilkan peptida atau polipeptida, tetapi masing-masing memiliki kelebihan dan keterbatasan yang berbeda.

Sintesis kimia dapat sangat berguna terutama ketika diperlukan:

• asam amino non-standar tertentu;
• modifikasi kimiawi pada bagian-bagian tertentu;
• struktur tertentu pada ujung rantai;
• penanda isotop;
• modifikasi rangka peptida;
• sifat-sifat lain yang sulit diperoleh melalui ekspresi biologis standar.

Ekspresi biologis mungkin menarik untuk urutan yang lebih panjang atau strategi penandaan tertentu, tetapi tidak menghilangkan masalah yang muncul pada tahap-tahap produksi selanjutnya.

Selain itu, perlu juga mempertimbangkan pemulihan bahan, proses pelipatan, pemrosesan, kontaminasi yang berasal dari organisme inang, pemurnian, serta karakteristik analitis.

Jadi, tidak ada satu pun metode yang secara universal merupakan yang terbaik.

Dalam perbandingan polipeptida yang terdiri dari 20–40 residu asam amino, baik panjang urutan maupun kecenderungannya untuk beragregasi memengaruhi hasil sintesis fase padat dan ekspresi bakteri. [1]

Pengamatan ini mendukung pendekatan di mana metode produksi dipilih sesuai dengan molekul tertentu.

Data historis mengenai produktivitas, biaya, peralatan, dan waktu produksi tidak boleh dianggap sebagai nilai-nilai universal pada masa kini, karena teknologi, bahan kimia, otomatisasi, metode pemurnian, serta aspek ekonomi produksi terus berubah seiring dengan perkembangan teknologi.

Sintesis peptida pada fase padat

Rantai yang sedang terbentuk terikat pada pembawa yang tidak larut

Dalam sintesis peptida fase padat (SPPS), rantai peptida yang sedang terbentuk tetap terikat pada pembawa yang tidak larut selama siklus sintesis berikutnya.

Media yang paling sering digunakan adalah resin polimer yang telah difungsionalisasi.

Penghubung, atau linker, mengikat peptida dengan pembawa dan, antara lain, memengaruhi cara pelepasan rantai yang sudah jadi di kemudian hari serta jenis gugus terminal yang dihasilkan.

Salah satu keunggulan praktis utama SPPS adalah pemisahan bahan yang lebih mudah.

Setelah tahap reaksi tertentu selesai, reagen yang larut dan banyak produk sampingan yang larut dapat dihilangkan melalui pencucian, sementara peptida yang sedang terbentuk tetap terikat pada fase padat.

Dengan demikian, setelah penambahan setiap asam amino berikutnya, peptida yang sedang terbentuk tidak perlu diisolasi dan dimurnikan sebagai senyawa bebas yang terpisah.

Namun, kenyamanan ini dapat menimbulkan kesalahpahaman yang serius.

Proses pencucian resin tidak berarti bahwa semua peptida yang tidak sesuai telah dihilangkan.

Jika rantai yang terpasang pada resin tidak bereaksi selama satu tahap penyambungan, rantai tersebut dapat tetap berada di media.

Pada siklus-siklus berikutnya, hal tersebut mungkin akan bereaksi kembali dan terus memanjang.

Akibatnya, dapat terbentuk urutan delesi, yaitu molekul yang berbeda dari peptida target karena kurangnya satu atau lebih residu asam amino.

Demikian pula, rantai yang terikat pada resin dan telah dimodifikasi secara kimiawi atau belum sepenuhnya dilepaskan dari pelindungnya dapat ikut serta dalam tahap-tahap sintesis selanjutnya.

Dengan demikian, SPPS mempermudah pemisahan zat terlarut dari bahan yang terikat pada resin.

Namun, hal ini tidak menjamin kesesuaian urutan yang sempurna.

Siklus berulang pelepasan pengaman dan pengikatan

Sintesis SPPS bertahap yang umum melibatkan pengulangan tiga langkah dasar:

pembukaan → penyambungan → pencucian.

Pertama-tama, gugus amino reaktif yang terletak di ujung rantai yang sedang tumbuh akan terungkap.

Selanjutnya, asam amino yang telah diamankan berikutnya disambungkan ke rantai tersebut.

Reagen yang larut, kelebihan asam amino, dan berbagai produk reaksi dibuang sebelum siklus berikutnya dimulai.

Dengan mengulangi proses ini, peptida dapat dibentuk satu per satu rantai asam amino.

Dalam SPPS klasik, bagian ujung-C biasanya disambungkan ke pembawa terlebih dahulu, kemudian rantai tersebut memanjang ke arah ujung-N.

Hal ini berbeda dengan sintesis protein ribosom standar, di mana asam amino ditambahkan satu per satu ke ujung C rantai yang sedang terbentuk.

Namun, urutan akhir asam amino mungkin tetap sama, meskipun arah dan proses kimiawi pembentukannya berbeda.

Istilah „siklus” tidak boleh dipahami sebagai satu rangkaian kondisi reaksi universal yang cocok untuk setiap gugus dan setiap urutan.

Jalannya reaksi dapat bergantung pada:

• strategi kelompok pelindung;
• jenis asam amino;
• kondisi ruang di sekitar lokasi reaksi;
• jenis resin;
• linker;
• panjang rantai;
• agregasi;
• pelarut;
• kimia konjugasi;
• perilaku struktural peptida yang sedang tumbuh.

Reaksi yang berlangsung dengan mudah pada awal sintesis dapat menjadi jauh lebih sulit pada tahap selanjutnya.

Oleh karena itu, pemantauan proses tetap penting bahkan dalam sistem yang sangat otomatis.

Mengapa sifat-sifat resin itu penting?

Media penyimpanan permanen bukan sekadar wadah pasif.

Sifat-sifat fisik dan kimianya dapat secara langsung memengaruhi jalannya reaksi.

Salah satu parameter penting adalah pembengkakan.

Jika resin mengembang dengan benar dalam lingkungan pelarut yang dipilih, reagen dapat lebih mudah mencapai bagian-bagian reaktif yang tersebar di seluruh struktur polimer.

Pembengkakan yang tidak memadai atau perubahan struktur resin dapat membatasi akses tersebut.

Hal-hal berikut ini juga mungkin memiliki arti:

• kepadatan penanaman;
• arsitektur polimer;
• struktur linker;
• kompatibilitas dengan pelarut;
• stabilitas mekanis;
• porositas;
• sifat difusi;
• interaksi antarrantai peptida yang sedang tumbuh.

Seiring bertambahnya panjang peptida, rantai-rantai tersebut juga dapat saling berinteraksi.

Agregasi pada resin dapat membatasi akses ke situs reaktif dan menyebabkan ikatan yang tidak sempurna atau pelepasan yang tidak sempurna.

Artinya, urutan yang awalnya berfungsi dengan baik pada awal sintesis dapat menjadi semakin sulit seiring dengan bertambahnya panjang rantai.

Para peneliti telah mengembangkan reaktor aliran dengan lapisan yang dapat diubah, yang memungkinkan pemantauan pembengkakan resin berdasarkan pengukuran terkait tekanan. [4]

Penelitian ini membahas agregasi pada resin dan pembentukan ikatan yang tidak sempurna sebagai masalah proses yang, dalam kondisi lain, mungkin sulit diamati secara langsung selama sintesis.

Hal ini menunjukkan bahwa pemantauan perilaku fisik media dapat memberikan informasi yang melampaui sekadar pencatatan reagen yang ditambahkan.

Untuk apa resin Wanga digunakan?

Kimia penghubung tipe Wang umumnya digunakan dalam SPPS, ketika setelah pemisahan peptida, ujung C yang diinginkan berbentuk asam karboksilat.

Peptida tersebut terikat melalui ikatan ester, yang nantinya dapat dipisahkan dalam kondisi yang sesuai.

Sistem penghubung lain dapat dipilih jika diperlukan struktur ujung C yang berbeda, misalnya amida.

Penting untuk membedakan sifat kimia linker dari seluruh media fisiknya.

Linker tipe Wang yang terkait dapat dimasukkan ke dalam berbagai arsitektur polimer.

Bahan-bahan tersebut tidak harus memiliki:

• sifat pembengkakan;
• kapasitas;
• kompatibilitas dengan pelarut;
• sifat mekanis;
• perilaku selama reaksi.

Penelitian yang menggunakan media peptidil-Wang-TentaGel telah menunjukkan metode alternatif khusus untuk memperoleh hidrazida peptida, yang merupakan produk antara yang berguna dalam kimia peptida. [5]

Hal ini tidak berarti bahwa pemisahan standar dari resin Wang biasanya menghasilkan hidrazida peptida.

Sebaliknya, hal ini menunjukkan sebuah prinsip penting:

pembawa + pengikat + kondisi reaksi + kimia pemisahan secara bersama-sama menentukan produk yang dihasilkan.

Sintesis SPPS dalam sistem periodik dan aliran

SPPS dapat dilakukan dalam wadah periodik konvensional atau dalam sistem di mana reagen mengalir melalui reaktor yang berisi media tetap.

Sistem aliran dapat memungkinkan penggantian reagen secara cepat serta pengendalian lingkungan kimia di sekitar resin yang lebih akurat.

Dalam penelitian tahun 2014, disajikan sintesis peptida cepat dalam sistem aliran dengan pemantauan berkelanjutan, dan metode ini diterapkan pada beberapa peptida serta protein kecil. [6]

Dalam penelitian otomatis selanjutnya, dijelaskan bahwa proses penyambungan rantai berlangsung jauh lebih cepat, sehingga untuk contoh-contoh yang dianalisis, kemurnian produk mentah dan hasil isolasi yang diperoleh sebanding dengan sintesis periodik klasik. [7]

Penelitian ini menunjukkan kemampuan sistem-sistem tertentu dalam kondisi-kondisi tertentu.

Namun, hal tersebut tidak membuktikan bahwa setiap peptida dapat diproduksi dengan kecepatan yang sama dan kualitas yang sama.

Waktu yang dibutuhkan untuk memproduksi peptida juga mencakup jauh lebih banyak hal daripada sekadar menyusun rantai tersebut.

Seluruh proses tersebut dapat mencakup:

• persiapan reagen;
• persiapan resin;
• kopling;
• melepaskan pengaman;
• pencucian;
• pemisahan;
• pengolahan produk;
• pembersihan;
• penghilangan pelarut;
• pembentukan struktur akhir;
• penelitian analitis;
• dokumentasi.

Oleh karena itu, pembentukan ikatan yang cepat hanyalah salah satu dari sekian banyak unsur yang membentuk efisiensi produksi secara keseluruhan.

Sintesis dalam fase cair

Apa arti istilah ini?

Istilah „sintesis peptida dalam fase cair” dapat digunakan dalam beberapa arti.

Secara umum, hal ini bisa berarti sintesis peptida yang dilakukan dalam larutan.

Namun, dalam literatur yang lebih khusus, sering kali dibuat pembedaan sebagai berikut:

1. sintesis peptida klasik dalam larutan;
2. sintesis peptida pada fase padat;
3. metode LPPS yang lebih baru, di mana rantai yang sedang tumbuh memiliki penanda atau pembawa yang larut.

Perbedaan ini penting karena memengaruhi cara pendistribusian dan daur ulang produk.

Bahan setengah jadi peptida yang terlarut dengan bebas dan telah dilindungi mungkin perlu diisolasi dengan memanfaatkan sifat fisik dan kimianya sendiri.

Pada produk setengah jadi yang diberi penanda, penanda tersebut dapat dirancang sedemikian rupa sehingga memudahkan proses presipitasi, ekstraksi, penahanan pada membran, atau metode pemisahan lainnya.

Tinjauan mengenai LPPS secara jelas membedakan antara sintesis klasik dalam larutan, SPPS, dan metode yang menggunakan penanda larut. [8]

Publikasi ini berguna untuk mengklarifikasi terminologi dan metodologi.

Namun, hal ini tidak boleh ditafsirkan sebagai eksperimen tunggal yang membuktikan bahwa salah satu metode tersebut adalah yang terbaik untuk setiap peptida.

Sintesis peptida klasik dalam larutan

Dalam sintesis klasik menggunakan larutan, asam amino yang dilindungi, produk antara peptida, atau fragmen tetap larut dalam lingkungan reaksi, alih-alih terikat secara kovalen pada resin yang tidak larut.

Setelah reaksi selesai, senyawa antara yang dimaksud dapat diisolasi, dimurnikan, dan—jika diperlukan—dikarakterisasi sebelum tahap berikutnya dimulai.

Hal ini mungkin memberikan beberapa manfaat.

Para peneliti dapat:

• menggambarkan masing-masing produk setengah jadi;
• memilih metode pemurnian yang sesuai untuk produk setengah jadi tertentu;
• mengoptimalkan masing-masing reaksi;
• menyusun bagian-bagian tersebut secara terpisah;
• memodifikasi jalur sintesis jika suatu produk antara tertentu menimbulkan masalah.

Namun, sintesis dalam larutan juga dapat menimbulkan kesulitan yang cukup besar.

Seiring dengan bertambahnya panjang rantai peptida, peptida tersebut dapat:

• menjadi sulit larut;
• menggabungkan;
• sulit untuk mengkristal;
• menghasilkan polutan yang sangat mirip;
• sulit dipisahkan;
• memerlukan isolasi berulang kali;
• menyebabkan hilangnya bahan selama tahap-tahap pemrosesan selanjutnya.

Dengan demikian, sintesis dalam larutan tidak secara otomatis lebih sederhana atau lebih mudah untuk ditingkatkan skalanya dibandingkan dengan SPPS.

Kegunaannya bergantung pada urutan spesifik, stabilitas produk antara, kelarutan, panjang jalur sintesis, perilaku selama pemurnian, serta efisiensi tahap-tahap isolasi selanjutnya.

Perkembangan strategi LPPS yang ditandai sebagian disebabkan oleh upaya untuk mengatasi masalah-masalah yang berkaitan dengan pemisahan dan penanganan bahan tersebut. [8]

Penanda yang dapat larut menggabungkan perancangan reaksi dengan perancangan pemisahan

Dalam LPPS yang ditandai, peptida yang sedang tumbuh memiliki ikatan molekuler sementara yang dirancang sedemikian rupa untuk memengaruhi sifat fisiknya.

Penanda tersebut dapat memungkinkan peptida tetap memiliki kelarutan yang memadai selama reaksi, dan selanjutnya memudahkan pemulihannya secara selektif.

Tergantung pada teknologinya, proses pemisahan dapat menggunakan:

• pengendapan;
• ekstraksi;
• penyaringan pada membran;
• perilaku fase;
• sifat-sifat lain yang timbul akibat adanya penanda tersebut.

Dalam salah satu strategi eksperimental, digunakan gugus pelindung rantai panjang pada ujung C untuk mensintesis peptida amida.

Reaksi berulang dan tahap-tahap presipitasi memungkinkan para peneliti untuk menyiapkan peptida hidrofobik, yang dalam perbandingan yang mereka gunakan sulit diperoleh dengan hasil yang memuaskan melalui metode SPPS. [9]

Hal ini menunjukkan kegunaan strategi tersebut untuk urutan yang dianalisis.

Namun, hal ini tidak membuktikan keunggulan universal dari sintesis bertanda.

Penanda tersebut menjadi bagian dari proses produksi dan memunculkan pertanyaan-pertanyaan tersendiri:

• Seberapa efektifkah proses penyambungannya?
• Apakah hal itu mengubah jalannya reaksi?
• Bagaimana cara yang paling andal untuk memulihkan bahan setengah jadi yang telah diberi tanda?
• Apakah hal ini menyebabkan timbulnya polusi baru?
• Bagaimana cara menghilangkannya?
• Apakah penghapusan total ini dapat dikonfirmasi?
• Metode analitis apa saja yang dapat memastikan bahwa zat tersebut tidak terdapat dalam produk akhir?

Oleh karena itu, penanda yang dapat larut harus dianggap sebagai elemen fungsional dalam desain proses, bukan sekadar label biasa.

Perbandingan metode-metode utama

Perbandingan ini menggambarkan prinsip-prinsip umum cara kerja masing-masing metode.

Tidak disebutkan mana di antara keduanya yang akan memberikan kinerja, kebersihan, biaya, keberlanjutan lingkungan, atau skalabilitas terbaik untuk urutan tertentu.

Parameter-parameter ini harus dievaluasi berdasarkan molekul yang sebenarnya dan proses produksi yang spesifik. [4] [8] [9]

Penggabungan fragmen dan produksi hibrida

Peptida tidak selalu harus dibentuk melalui satu proses yang berkelanjutan dengan cara menambahkan gugus asam amino satu per satu.

Strategi alternatifnya adalah menyiapkan fragmen peptida yang lebih pendek secara terpisah, lalu menggabungkannya.

Proses hibrida, misalnya, dapat memanfaatkan SPPS untuk menghasilkan fragmen-fragmen tertentu dan kimia larutan untuk menggabungkannya.

Strategi bertahap dapat mengurangi beberapa masalah yang terkait dengan sintesis bertahap yang sangat panjang.

Namun, hal ini juga menimbulkan tantangan baru, seperti:

• pemilihan titik sambungan yang tepat;
• kelarutan fragmen;
• aktivasi titik sambungan;
• kemoselektivitas;
• pemeliharaan stereokimia;
• efek samping;
• pembersihan bagian-bagian;
• pembersihan setelah penggabungan keduanya.

Contoh penting dari penggabungan fragmen yang terkendali adalah ligasi kimiawi alami.

Dalam versi klasik, peptida tioester bereaksi dengan peptida lain yang mengandung sistein pada ujung N-terminal. Pengaturan ulang yang terjadi selanjutnya menyebabkan terbentuknya ikatan yang benar pada rantai peptida di lokasi ligasi.

Penelitian awal menunjukkan kemungkinan diperolehnya protein yang mengandung jembatan disulfida setelah proses ligasi dan pelipatan. [10]

Hal ini menegaskan pentingnya strategi penggabungan fragmen tersebut.

Namun, hal ini tidak berarti bahwa dua fragmen peptida yang belum dimodifikasi apa pun dapat bergabung secara spontan.

Kopling dan kelompok pelindung

Kopling menciptakan sambungan yang disengaja

Kopling adalah tahap reaksi di mana ikatan peptida baru terbentuk di antara unit-unit tertentu.

Biasanya, gugus yang berasal dari gugus karboksil diaktifkan agar dapat bereaksi secara efektif dengan gugus amina yang sesuai.

Bahan kimia aktivasi harus sesuai dengan:

• urutan yang meningkat;
• kelompok perlindungan sementara;
• perlindungan rantai samping;
• stereokimia;
• media atau penanda;
• lingkungan pelarut;
• kelompok fungsi lain yang terdapat dalam molekul tersebut.

Pengikatan yang efektif sangat penting dalam sintesis bertahap, karena reaksi yang tidak tuntas dapat menyebabkan terbentuknya urutan delesi.

Jika salah satu tahap penambahan asam amino gagal pada sebagian rantai yang sedang tumbuh, rantai-rantai tersebut dapat tetap berada dalam sistem dan ikut serta dalam siklus-siklus berikutnya.

Akibatnya, dapat terbentuk molekul-molekul yang sangat mirip dengan peptida target, tetapi kehilangan satu residu.

Oleh karena itu, bahkan ketidakefisienan yang kecil pun dapat terakumulasi selama berbagai tahap sintesis.

Sebuah contoh matematika sederhana dapat menggambarkan masalah ini dengan baik.

Jika masing-masing dari 50 tahap penyusunan yang independen memiliki probabilitas keberhasilan sebesar 99%, persentase molekul yang seluruh tahapnya berakhir dengan keberhasilan adalah:

0,99⁵⁰ ≈ 0,605

yaitu sekitar 61%.

Ini hanyalah ilustrasi matematis.

Hal ini bukanlah perkiraan mengenai kemurnian aktual maupun efisiensi sintesis peptida yang terdiri dari 50 residu.

Produksi aktual meliputi:

• tingkat efisiensi kopling yang berbeda-beda pada masing-masing posisi;
• tahapan pelepasan pengaman;
• efek samping;
• tergantung pada urutan tingkat kesulitannya;
• strategi penyambungan ulang;
• kerugian selama proses pemisahan;
• kerugian selama proses pemurnian;
• variabel proses lainnya.

Perhitungan ini hanya menunjukkan mengapa ketidakefisienan pada satu tahap—meskipun tampak kecil—dapat menjadi sangat signifikan dalam sintesis bertahap.

Tim pengamanan memantau lokasi kejadian

Sebuah asam amino dapat memiliki beberapa gugus yang reaktif secara kimia.

Tanpa pengendalian selektif, reaksi kopling dapat terjadi di tempat-tempat yang tidak diinginkan.

Kelompok pelindung untuk sementara memblokir titik-titik reaktif yang dipilih.

Gugus amino yang digunakan untuk memperpanjang rantai biasanya memerlukan perlindungan sementara, sedangkan rantai samping yang reaktif mungkin memerlukan perlindungan yang tetap menempel selama beberapa siklus sintesis.

Ikatan dengan media juga harus bertahan melalui tahapan-tahapan tersebut hingga saat pemisahan yang telah direncanakan.

Oleh karena itu, pemilihan kelompok pelindung memengaruhi keseluruhan strategi sintesis.

Hal-hal berikut perlu diperhatikan:

• cara penerapannya;
• stabilitas;
• cara penghapusan;
• kesesuaian dengan kelompok perlindungan lainnya;
• kesesuaian dengan media;
• efek samping;
• pengaruh urutan tertentu;
• ketentuan akhir pencabutan perlindungan asuransi.

Penelitian yang memanfaatkan perlindungan berbasis sianosulfurilida berfokus pada pembentukan aspartimid melalui perubahan cara melindungi gugus karboksil. [2]

Hasil penelitian menunjukkan bahwa strategi kelompok pelindung tidak hanya memengaruhi apakah reaksi yang diinginkan dapat terjadi, tetapi juga memengaruhi reaksi-reaksi yang tidak diinginkan mana yang menjadi mungkin terjadi.

Fmoc, Boc, dan perlindungan ortogonal

Fmoc dan Boc termasuk dalam kelompok pelindung gugus amino yang banyak digunakan.

Memang, cara penghilangannya berbeda.

Fmoc biasanya dihilangkan dalam kondisi basa, sedangkan Boc rentan terhadap kondisi asam.

Sifat-sifat tersebut memungkinkan penggunaannya sebagai bagian dari strategi perlindungan yang lebih luas.

Dalam SPPS populer yang didasarkan pada Fmoc, gugus pelindung sementara Fmoc pada ujung N dihilangkan berulang kali, sementara gugus pelindung tertentu pada rantai samping serta ikatan dengan resin tetap utuh hingga tahap-tahap selanjutnya.

Strategi lain mungkin menggunakan kombinasi yang berbeda.

Konsep yang sangat penting adalah perlindungan ortogonal.

Dua kelompok pelindung dianggap ortogonal jika salah satunya dapat dihilangkan secara selektif dalam kondisi di mana kelompok yang lain tetap cukup stabil sehingga sintesis dapat dilanjutkan.

Dengan demikian, ortogonalitas merupakan hubungan kesesuaian kimia yang bersifat praktis.

Hal ini tidak berarti bahwa setiap kelompok yang dilindungi akan tetap sama sekali tidak berubah setelah terpapar dalam jumlah tak terbatas terhadap semua kondisi reaksi.

Efek samping mungkin masih dapat terjadi.

Dalam penelitian sintesis Fmoc, dijelaskan baik pembentukan aspartimid maupun perubahan stereokimia yang tidak diinginkan, meskipun strategi pelindung secara umum diasumsikan memiliki selektivitas. [11]

Stereokimia merupakan bagian dari identitas suatu molekul

Banyak asam amino memiliki pusat kiral.

Artinya, atom-atom tersebut dapat membentuk susunan ruang yang berbeda-beda yang sesuai dengan berbagai bentuk stereokimia.

Perubahan konfigurasi pada satu pusat stereogenik dapat menghasilkan struktur peptida yang berbeda tanpa perlu mengubah massa nominalnya.

Oleh karena itu, massa saja tidak dapat memastikan identitas peptida secara lengkap.

Epimerisasi biasanya mengacu pada perubahan konfigurasi satu pusat stereogenik dalam molekul yang mengandung beberapa pusat semacam itu.

Racemisasi juga sering dibahas dalam kimia peptida dalam konteks hilangnya integritas stereokimia gugus asam amino.

Perubahan-perubahan ini penting karena pengenalan molekuler dapat sangat bergantung pada susunan spasial atom-atom.

Oleh karena itu, dua molekul dengan komposisi unsur dan massa nominal yang sama dapat berperilaku berbeda jika memiliki stereokimia yang berbeda.

Dalam penelitian tentang sintesis Fmoc yang dibantu gelombang mikro, ditemukan bahwa beberapa gugus fungsi rentan terhadap perubahan stereokimia yang tidak diinginkan pada kondisi yang digunakan. Modifikasi metode tersebut berhasil membatasi terjadinya reaksi-reaksi tersebut. [11]

Hal ini tidak berarti bahwa pemanasan, menurut definisinya, merusak semua peptida.

Kesimpulan yang tepat adalah bahwa percepatan reaksi harus dievaluasi bersamaan dengan selektivitas kimia yang bergantung pada urutan.

Aspartimid dan kontaminan terkait lainnya

Pembentukan aspartimid merupakan reaksi sampingan yang sudah diketahui yang terjadi pada urutan tertentu yang mengandung asam asparaginat.

Dapat terbentuk senyawa antara siklik yang tidak diinginkan, yang kemudian membentuk senyawa-senyawa dengan ikatan rangka atau stereokimia yang berubah.

Kemungkinan terjadinya reaksi ini bergantung pada urutan dan kondisi proses.

Polusi lain yang terkait dengan sintesis dapat disebabkan oleh:

• kopling tidak penuh;
• pembukaan pengaman yang tidak sempurna;
• terjadinya urutan delesi;
• reaksi rantai samping;
• perubahan stereokimia;
• reaksi selama proses pemisahan;
• oksidasi;
• penataan ulang;
• syarat-syarat pengolahan produk;
• penghapusan grup pelindung yang tidak tuntas.

Beberapa polutan menyebabkan perubahan massa molekul yang mudah dikenali.

Yang lainnya jauh lebih sulit untuk dibedakan.

Dalam penelitian analitis terhadap peptida sintetis yang berfungsi sebagai substrat renin, telah diidentifikasi sejumlah kontaminan, termasuk senyawa-senyawa yang menunjukkan perubahan massa yang sama, namun memiliki modifikasi pada posisi yang berbeda-beda. [12]

Untuk membedakannya, diperlukan analisis struktural tambahan.

Para peneliti juga menganggap mekanisme yang diusulkan sebagai penyebab timbulnya polutan-polutan tersebut sebagai hipotesis.

Ini adalah perbedaan yang penting:

Menentukan apa itu polusi dan membuktikan mekanisme pasti terjadinya polusi merupakan dua pertanyaan ilmiah yang terpisah.

Mekanisme yang kemungkinan besar terjadi tidak boleh dianggap sebagai hal yang telah terbukti hanya karena sesuai dengan massa molekul yang teramati.

Pembersihan, penskalaan, dan kualitas produksi

Bahan baku, produk yang telah dimurnikan, dan hasil produksi

Peptida mentah adalah bahan yang diperoleh sebelum tahap-tahap pemurnian yang sesuai selesai dilakukan.

Mungkin mengandung:

• peptida target;
• urutan delesi;
• bahan yang belum sepenuhnya dilepas pengamannya;
• urutan yang dimodifikasi;
• sisa-sisa reagen;
• produk yang berkaitan dengan pemisahan;
• garam;
• pelarut;
• bahan-bahan lain yang terbentuk dalam proses tersebut.

Tujuan pemurnian ini adalah untuk memisahkan peptida yang diinginkan dari campuran tersebut.

Tiga konsep berikut ini harus dibedakan dengan jelas:

kemurnian bahan baku — komposisi bahan yang diukur sebelum proses pemurnian akhir;

efisiensi produk yang telah dimurnikan atau diisolasi — jumlah bahan sasaran yang diperoleh dibandingkan dengan nilai awal atau nilai teoretis tertentu;

kemurnian akhir — komposisi bahan yang telah diisolasi, yang ditentukan dengan menggunakan metode analisis tertentu.

Istilah-istilah ini tidak dapat digunakan secara bergantian.

Proses ini mungkin menghasilkan sejumlah besar bahan mentah, tetapi hanya memungkinkan pemulihan sejumlah kecil produk yang telah dimurnikan.

Proses lain mungkin menghasilkan bahan baku yang lebih sedikit, tetapi memiliki tingkat selektivitas yang tinggi dalam menghasilkan produk yang diinginkan.

Demikian pula, kemurnian analitis yang tinggi belum tentu berarti produktivitas produksi yang tinggi.

Dalam penelitian sintesis aliran cepat, kemurnian bahan baku dan hasil isolasi dilaporkan secara terpisah sebagaimana mestinya. [7]

Kromatografi memisahkan komponen-komponen, tetapi tidak menjawab setiap pertanyaan

Kromatografi cair kinerja tinggi dengan sistem fase terbalik (RP-HPLC) banyak digunakan untuk analisis dan pemurnian peptida.

Berbagai molekul berinteraksi dengan fase stasioner dan fase bergerak dengan cara yang berbeda-beda.

Dalam kondisi yang tepat, perbedaan-perbedaan ini memungkinkan pemisahan komponen-komponen campuran.

Kromatografi analitik dan preparatif memiliki aplikasi yang saling terkait, namun berbeda.

Alat Analitik HPLC terutama digunakan untuk menganalisis komposisi sampel.

Preparatif HPLC digunakan untuk mengumpulkan komponen-komponen yang telah dipisahkan secara fisik.

Kromatogram dapat memberikan banyak informasi yang berharga.

Namun, puncak utama yang besar atau persentase yang tinggi dari luasnya tidak boleh dianggap sebagai karakteristik molekuler yang lengkap.

Hasil kromatografi bergantung, antara lain, pada:

• jenis kolom;
• fase gerak;
• gradien;
• suhu;
• metode deteksi;
• panjang gelombang;
• persiapan sampel;
• cara mengintegrasikan puncak;
• resolusi;
• sifat-sifat polutan.

Dua senyawa berpotensi terelusi pada saat yang bersamaan.

Beberapa komponen sampel juga dapat bereaksi secara berbeda terhadap detektor yang digunakan.

Oleh karena itu, kemurnian permukaan yang tinggi pada HPLC tidak berarti identitas molekulnya telah sepenuhnya terkonfirmasi.

Penelitian mengenai kontaminan peptida isobarik serta analisis kiral menunjukkan mengapa metode analitik pelengkap mungkin diperlukan. [12] [13]

Metode analitis harus menjawab pertanyaan struktural tertentu.

Identitas, kemurnian, dan isi memiliki arti yang berbeda-beda

Dalam karakteristik peptida, ada tiga konsep yang sangat penting.

Identitas menjawab pertanyaan:

Apakah molekul yang dimaksud terdapat dalam sampel?

Kebersihan menjawab pertanyaan:

Komponen apa saja yang terdapat dalam sampel, atau berapa besar bagian dari sinyal yang diukur yang merupakan komponen utama?

Isi artikel ini menjawab pertanyaan:

Berapa banyak peptida yang sebenarnya terdapat dalam sampel tersebut?

Pertanyaan-pertanyaan ini tidak selalu dapat dijawab hanya dengan satu kali pengukuran.

Bahan yang mengandung peptida juga dapat mengandung:

• air;
• berlawanan;
• garam;
• sisa pelarut;
• bahan-bahan lain yang terkait dengan proses tersebut;
• polusi.

Oleh karena itu, massa total bahan yang ditimbang tidak harus sama dengan massa peptida itu sendiri.

Demikian pula, kesesuaian massa molekul yang diukur dengan nilai teoretis tidak membuktikan:

• urutan asam amino yang lengkap;
• keterkaitan yang tepat antara masing-masing gugus;
• integritas stereokimia;
• penempatan jembatan disulfida;
• lipatan;
• tidak adanya polutan isobarik.

Spektrometri massa dapat memberikan bukti yang kuat mengenai massa molekul.

Spektrometri massa tandem dan teknik struktural lainnya dapat memberikan informasi tambahan mengenai urutan.

Metode kiral memungkinkan analisis masalah-masalah stereokimia yang tidak dapat diselesaikan hanya dengan pengukuran massa biasa.

Dalam salah satu penelitian analitik, bahkan rasemisasi yang terjadi selama persiapan sampel pun diperhitungkan. Hal ini menunjukkan prinsip penting lainnya: prosedur analitik itu sendiri dapat menimbulkan artefak jika tidak dirancang dengan tepat. [13]

Penyusutan dan aktivitas mungkin memerlukan konfirmasi terpisah

Dalam kasus peptida dan protein kecil yang strukturnya terbatas, urutan yang benar serta massa molekulnya mungkin masih belum cukup untuk memastikan struktur akhir yang diinginkan.

Pertanyaan tambahan dapat mencakup:

• Apakah jembatan disulfida yang tepat telah terbentuk?
• Apakah molekul tersebut telah mengambil konformasi yang diharapkan?
• Apakah siklusnya sudah lengkap?
• Apakah terdapat isomer struktural?
• Apakah molekul sintetis tersebut menunjukkan aktivitas yang diharapkan dalam uji eksperimental tertentu?

Dalam penelitian sintesis BPTI, digunakan beberapa metode analitik dan biofisika, disertai dengan penilaian penghambatan tripsin. [3]

Hasil-hasil tersebut secara keseluruhan menunjukkan kesesuaian bahan sintetis dengan urutan alami terhadap protein alami berdasarkan kriteria yang diteliti.

Namun, tes aktivitas ini menjawab pertanyaan fungsional tertentu.

Hal ini tidak dapat menggantikan analisis polutan.

Demikian pula, aktivitas yang serupa dalam satu uji tidak membuktikan kesetaraan penuh dari semua sifat biologis, struktural, maupun produksi.

Peningkatan skala produksi tidak hanya memengaruhi jumlah bahan saja

Peningkatan skala produksi tidak hanya sekadar meningkatkan jumlah semua bahan kimia secara proporsional.

Proses-proses fisika dapat berperilaku berbeda pada skala yang lebih besar.

Hal-hal berikut ini mungkin memiliki arti:

• pencampuran;
• pertukaran panas;
• distribusi bahan kimia;
• difusi;
• pembengkakan resin;
• tekanan;
• penyaringan;
• pengelolaan pelarut;
• pengendapan;
• kelarutan produk setengah jadi;
• pengangkutan bahan;
• kemampuan sistem pengolahan.

Faktor-faktor tersebut dapat memengaruhi baik jalannya reaksi maupun pembentukan kontaminan.

Proses pemurnian pada tahap-tahap selanjutnya juga dapat menjadi titik kemacetan dalam keseluruhan proses produksi.

Peningkatan laju sintesis tidak terlalu berarti jika sistem pemurnian tidak mampu memisahkan kontaminan yang dihasilkan secara efektif atau memulihkan produk dengan kualitas yang dibutuhkan.

Dalam analisis industri yang mencakup 40 proses sintesis peptida dari 14 perusahaan farmasi, dilakukan penilaian terhadap penggunaan bahan selama proses sintesis, pemurnian, dan isolasi. [14]

Penelitian ini menunjukkan mengapa penilaian produksi harus dilakukan terhadap keseluruhan proses.

Namun, hal ini tidak berarti bahwa setiap pabrik, urutan, atau teknologi produksi menghasilkan hasil yang sama persis.

Kualitas produksi merupakan hasil dari berbagai unsur pengendalian

Produksi peptida yang andal membutuhkan lebih dari sekadar memperoleh satu hasil analisis yang memuaskan.

Proses yang terkendali biasanya mencakup beberapa unsur yang saling terkait:

molekul target yang telah ditentukan → bahan baku yang sesuai → sintesis terkendali → pemurnian terkendali → pengambilan sampel yang tepat → analisis yang telah divalidasi atau sesuai dengan tujuan → dokumentasi batch.

Dokumentasi batch menghubungkan hasil analisis dengan bahan yang benar-benar telah diproduksi.

Sertifikat Analisis (COA) merangkum hasil pengujian terpilih dari suatu batch tertentu.

Nilai informasinya bergantung pada:

• jenis penelitian yang telah dilakukan;
• metode yang digunakan;
• kegunaan metode-metode tersebut;
• spesifikasi;
• identifikasi sampel;
• kemampuan pelacakan batch;
• konfirmasi bahwa hasil yang dilaporkan memang berkaitan dengan bahan tersebut.

Nilai tunggal yang disebut sebagai „kemurnian” tidak dapat secara mandiri membuktikan:

• identitas molekuler yang lengkap;
• kadar peptida;
• integritas stereokimia;
• tingkat sisa pelarut;
• kadar air;
• komposisi kontraion;
• sifat mikrobiologis;
• lipatan;
• aktivitas biologis;
• kesesuaian untuk tujuan tertentu.

Rangkaian analisis yang tepat bergantung pada tujuan penggunaan bahan tersebut.

Peptida yang digunakan sebagai bahan acuan analitis, reagen penelitian yang digunakan dalam eksperimen seluler, serta bahan yang masih dalam tahap pengembangan farmasi mungkin memerlukan jawaban atas pertanyaan-pertanyaan kualitas yang berbeda.

Oleh karena itu, bukti analitis harus ditafsirkan dalam konteks yang jelas, bukan sebagai pembuktian kualitas yang bersifat universal.

Penilaian keberlanjutan lingkungan harus mencakup seluruh proses

Sintesis peptida mungkin memerlukan pelarut dan reagen dalam jumlah yang cukup besar.

Oleh karena itu, penilaian dampak lingkungan seharusnya mempertimbangkan hal-hal yang jauh lebih luas daripada sekadar tahap penggabungan itu sendiri.

Beberapa unsur penting antara lain:

• pembuatan blok bangunan;
• reagen pengikat;
• reagen untuk melepaskan pengaman;
• pencucian;
• pemisahan;
• pengolahan produk;
• kromatografi;
• pertukaran pelarut;
• isolasi;
• pengeringan;
• pengelolaan sampah.

Pengurangan beban lingkungan mungkin memerlukan perbaikan beberapa tahap secara bersamaan.

Dalam analisis yang diterbitkan mengenai produksi peptida, dibahas berbagai masalah yang berkaitan dengan sintesis maupun pemurnian, serta ditekankan perlunya penyempurnaan keseluruhan rancangan proses. [15]

Sebagai publikasi yang bersifat prospektif, publikasi ini bukanlah perbandingan langsung yang terkontrol yang membuktikan bahwa satu teknologi tertentu selalu lebih ramah lingkungan.

Demikian pula:

Sintesis yang lebih cepat tidak secara otomatis berarti sintesis yang lebih ramah lingkungan,

dan penggunaan pelarut yang lebih sedikit selama proses sintesis itu sendiri tidak secara otomatis berarti dampak keseluruhan proses produksi menjadi lebih kecil.

Perbandingan lingkungan memerlukan penerapan batas analisis yang konsisten dan sebaiknya mengaitkan penggunaan sumber daya dengan jumlah tertentu dari produk akhir yang telah diisolasi dan dikarakterisasi.

Pertanyaan yang sering diajukan

1. Apa perbedaan antara sintesis peptida dalam fase padat dengan sintesis dalam fase cair?

Dalam sintesis fase padat, peptida yang sedang terbentuk tetap terikat pada pembawa yang tidak larut, sedangkan dalam sintesis larutan klasik, produk antara peptida tetap berada dalam keadaan terlarut dan biasanya harus dipisahkan berdasarkan sifat fisik dan kimianya. Dalam arti yang lebih sempit, LPPS memiliki rantai yang sedang terbentuk dalam larutan yang dilengkapi dengan penanda atau pembawa yang larut untuk memudahkan pemisahan selanjutnya. Penelitian tentang sintesis berpenanda menunjukkan salah satu strategi untuk menggabungkan kimia larutan dengan pemulihan melalui presipitasi, sedangkan literatur mengenai LPPS membedakan pendekatan tersebut baik dari sintesis klasik dalam larutan maupun dari SPPS. Tidak ada metode yang secara definisi optimal untuk setiap peptida. Perbedaan mendasar terletak pada cara fisik dalam mengelola dan memisahkan rantai yang sedang terbentuk selama tahap-tahap sintesis berikutnya. [8] [9]

2. Mengapa dapat terjadi kontaminasi selama sintesis peptida?

Kontaminasi dapat terjadi karena reaksi yang diinginkan tidak selalu berlangsung secara kuantitatif, dan gugus fungsi lain dapat terlibat dalam reaksi yang tidak diinginkan. Konjugasi yang tidak sempurna dapat menyebabkan urutan delesi, pelepasan pelindung yang tidak sempurna dapat mengganggu proses penyambungan rantai selanjutnya, dan beberapa urutan rentan terhadap perubahan stereokimia, pembentukan aspartimida, oksidasi, pergantian gugus, atau produk sampingan yang terkait dengan pelepasan. Penelitian sintesis Fmoc serta analisis struktural kontaminan peptida sintetis mendokumentasikan beberapa contoh semacam itu. [11] [12] Frekuensi dan signifikansi masing-masing kontaminan bergantung pada urutan dan prosesnya; oleh karena itu, otomatisasi sintesis tidak boleh disamakan dengan tidak adanya kesalahan kimia sama sekali.

3. Apa peran resin dalam sintesis peptida?

Resin menahan peptida yang sedang tumbuh, sementara reagen yang larut dan banyak produk sampingan dapat dihilangkan di antara tahap-tahap sintesis berikutnya. Hal ini sangat menyederhanakan proses perakitan rantai yang berulang, tetapi resin bukan sekadar penahan mekanis. Pembengkakan resin, tingkat keterisi, arsitektur polimer, kompatibilitas dengan pelarut, dan ketersediaan situs reaksi dapat memengaruhi efektivitas penetrasi reagen ke peptida yang terikat. Dalam penelitian yang menggunakan reaktor dengan lapisan variabel, perilaku resin dipantau selama analisis agregasi dan efisiensi konjugasi. [4] Pemantauan semacam itu tidak menghilangkan kesalahan urutan, tetapi menunjukkan mengapa kondisi fisik resin dapat menjadi variabel proses yang penting.

4. Untuk apa resin Wanga digunakan dalam sintesis peptida?

Pembawa jenis Wang umumnya dikaitkan dengan pembuatan peptida yang dilepaskan setelah pemisahan yang tepat dari ujung C dalam bentuk asam karboksilat. Namun, produk akhir yang tepat bergantung pada linker, arsitektur pembawa, dan kimia pemisahan yang digunakan, bukan hanya pada nama resinnya. Para peneliti juga memaparkan metode khusus untuk mengubah bahan peptidil-Wang-TentaGel menjadi peptida hidrazida, yang dapat berfungsi sebagai produk antara sintetis yang berguna. [5] Reaksi alternatif ini tidak mengubah pentingnya pelepasan standar dari resin Wang. Sebaliknya, hal ini menunjukkan mengapa sistem pembawa secara keseluruhan dan kondisi reaksi perlu dianalisis saat memprediksi produk.

5. Apakah SPPS mensintesis peptida dari ujung N atau dari ujung C?

SPPS bertahap klasik biasanya dimulai dengan pengikatan gugus C-terminal ke pembawa, kemudian rantai diperpanjang ke arah N-terminal. Ini merupakan arah yang berlawanan dengan perpanjangan rantai standar pada ribosom, di mana protein terbentuk melalui penambahan asam amino secara berurutan ke ujung C. Sintesis BPTI merupakan contoh penggunaan blok pembangun dan pembawa yang dilindungi sebelum pelepasan, pemurnian, dan pelipatan produk selanjutnya. [3] Namun, terdapat strategi khusus dalam kimia peptida yang menggunakan pendekatan lain; oleh karena itu, sintesis dari ujung C ke ujung N harus dianggap sebagai pendekatan klasik SPPS, bukan sebagai aturan mutlak untuk semua metode sintesis.

6. Mengapa kelompok pelestarian diperlukan?

Asam amino sering kali mengandung beberapa gugus fungsi reaktif. Gugus pelindung untuk sementara mencegah terjadinya reaksi pada bagian-bagian tertentu, sehingga bagian yang diperlukan tetap tersedia pada tahap sintesis tertentu. Hal ini membantu mengontrol urutan dan cara penggabungan gugus-gugus tersebut. Tanpa perlindungan yang tepat, reaksi-reaksi yang bersaing dapat menyebabkan terbentuknya campuran kompleks atau produk dengan struktur yang berubah. Penelitian mengenai pembentukan aspartimid menunjukkan bahwa perubahan kimia pelindung gugus karboksil dapat membatasi reaksi samping penting pada urutan yang dianalisis. [2] Kelompok pelindung tidak menjamin jalannya sintesis yang sempurna, tetapi memastikan kontrol kimiawi selektif yang harus tetap selaras dengan semua tahap penting dalam proses tersebut.

7. Apa perbedaan antara Fmoc dan Boc?

Fmoc dan Boc merupakan gugus pelindung sementara yang banyak digunakan untuk melindungi gugus amino, tetapi keduanya bereaksi terhadap kondisi kimia yang berbeda. Fmoc biasanya dihilangkan dalam lingkungan basa, sedangkan Boc sensitif terhadap asam. Perbedaan ini memengaruhi cara penggabungan keduanya dengan pelindung rantai samping, penghubung, dan tahap sintesis lainnya. Sintesis berbasis Fmoc banyak digunakan dalam SPPS modern, tetapi penelitian juga menunjukkan kemungkinan terjadinya reaksi samping yang bergantung pada urutan dalam kondisi tersebut. [11] Oleh karena itu, dalam praktiknya, lebih bermanfaat untuk membandingkan keseluruhan strategi pelindung dan kesesuaiannya dengan urutan tertentu daripada hanya mempertimbangkan nama kedua gugus pelindung tersebut.

8. Apa yang dimaksud dengan perlindungan ortogonal?

Perlindungan ortogonal berarti bahwa satu gugus pelindung dapat dihilangkan dalam kondisi di mana gugus pelindung lain yang diperlukan tetap cukup stabil sehingga sintesis dapat dilanjutkan. Hal ini memungkinkan untuk mengekspos berbagai situs reaktif pada tahap-tahap tertentu. Konsep ini sangat penting dalam sintesis terkontrol peptida kompleks. Namun, ortogonalitas bergantung pada kondisi dan tidak bersifat absolut: paparan berulang, karakter urutan, dan parameter reaksi tetap dapat menyebabkan reaksi samping. Penelitian mengenai metode alternatif untuk melindungi gugus karboksil menunjukkan bagaimana strategi perlindungan dapat dimodifikasi guna mengendalikan reaksi kimia peptida yang sulit. [2]

9. Apa itu urutan delesi?

Sequence delesi adalah peptida yang kehilangan satu atau beberapa residu yang terdapat dalam urutan target yang dimaksud. Hal ini dapat terjadi ketika tahap pengikatan asam amino tidak berlangsung sepenuhnya, namun rantai yang tidak bereaksi tetap terikat pada media dan ikut serta dalam siklus-siklus berikutnya. Karena rantai yang tidak normal tersebut masih terikat pada resin, pencucian biasa mungkin tidak dapat menghilangkannya. Studi pemantauan SPPS secara real-time menunjukkan pembentukan ikatan amida yang tidak lengkap sebagai masalah proses yang signifikan. [4] Urutan delesi oleh karena itu merupakan masalah yang berkaitan dengan struktur dan identitas produk, bukan sekadar sisa reagen.

10. Apakah dua kontaminan peptida dapat memiliki massa molekul yang sama?

Ya. Struktur molekul yang berbeda dapat memiliki massa nominal yang identik atau tidak dapat dibedakan. Karena alasan ini, kesesuaian massa saja tidak membuktikan identitas molekul yang sepenuhnya sama. Dalam penelitian terhadap peptida sintetis yang berfungsi sebagai substrat renin, teridentifikasi komponen kontaminan isobarik yang mengalami modifikasi pada posisi yang berbeda-beda. Derivatisasi dan spektrometri massa tandem memberikan informasi struktural tambahan. [12] Contoh ini menunjukkan mengapa kesesuaian massa yang diamati dengan massa yang diharapkan tidak dapat secara mandiri memastikan urutan, ikatan, stereokimia, maupun tidak adanya isomer yang secara struktural serupa.

11. Apa itu epimerisasi dan rasemisasi dalam sintesis peptida?

Epimerisasi dan rasemisasi merupakan perubahan konfigurasi stereokimia yang tidak diinginkan. Perubahan ini dapat terjadi tanpa mengubah urutan asam amino nominal atau massa molekul, sehingga pengukuran massa biasa mungkin tidak menunjukkan adanya perbedaan struktural. Dalam penelitian sintesis Fmoc yang dibantu gelombang mikro, telah diidentifikasi gugus-gugus yang rentan terhadap perubahan stereokimia dan ditunjukkan bahwa modifikasi kondisi reaksi dapat membatasi proses-proses tersebut. [11] Risiko bergantung pada blok penyusun, urutan, dan kondisi proses. Oleh karena itu, kualitas stereokimia memerlukan metode analitis yang mampu mengevaluasi konfigurasi, dan tidak dapat disimpulkan semata-mata berdasarkan massa molekul.

12. Apa itu pembentukan aspartimid?

Pembentukan aspartimid merupakan reaksi yang tidak diinginkan yang terkait dengan urutan tertentu yang mengandung asam asparaginat. Pembentukan senyawa antara siklik dapat menyebabkan terbentuknya produk-produk lanjutan dengan ikatan rangka atau stereokimia yang berubah, sehingga menurunkan hasil dan mempersulit proses pemurnian. Para peneliti menganalisis strategi perlindungan alternatif yang dirancang untuk membatasi reaksi ini pada peptida dan protein tertentu. [2] Hasil penelitian tidak menunjukkan satu solusi universal untuk semua urutan yang mengandung asam asparaginat. Sebaliknya, hasil tersebut menunjukkan mengapa perancangan sintesis dan strategi pengendalian kontaminan harus mempertimbangkan perilaku kimiawi spesifik dari urutan tertentu.

13. Apakah kemurnian tinggi HPLC membuktikan keaslian peptida tersebut?

Tidak. Kemurnian HPLC menggambarkan sampel dalam konteks pemisahan kromatografi tertentu, detektor yang digunakan, dan metode analisis data. Persentase luas puncak utama yang tinggi dapat menjadi bukti berharga bahwa sampel didominasi oleh satu komponen yang terpisah secara kromatografis, tetapi hal ini tidak secara otomatis memastikan identitas molekul yang lengkap. Kontaminan yang koelusi, stereoisomer, dan varian lainnya mungkin memerlukan teknik tambahan. Dalam penelitian analisis kiral peptida, digunakan proses yang dirancang khusus, yang juga memperhitungkan perubahan stereokimia yang terjadi selama persiapan sampel. [13] Oleh karena itu, identitas dan kemurnian harus dianggap sebagai pertanyaan analitis yang saling terkait, namun terpisah.

14. Apakah efisiensi produk yang telah dimurnikan sama artinya dengan kemurnian?

Tidak. Efisiensi produk yang telah dimurnikan atau diisolasi menunjukkan jumlah bahan target yang diperoleh dibandingkan dengan jumlah awal atau teoretis yang telah ditentukan. Sementara itu, kemurnian menggambarkan komposisi bahan yang diperoleh berdasarkan metode analitis tertentu. Proses sintesis dapat menghasilkan jumlah produk yang relatif sedikit dengan kemurnian sangat tinggi, atau jumlah besar bahan baku yang mengandung banyak kontaminan. Dalam penelitian sintesis aliran otomatis, kemurnian produk mentah dan efisiensi setelah isolasi dilaporkan secara terpisah. [7] Pemisahan parameter-parameter ini mencegah kesalahpahaman bahwa nilai tinggi salah satunya dianggap sebagai bukti nilai tinggi parameter lainnya.

15. Apakah peptida panjang dapat dihasilkan dengan menggabungkan fragmen-fragmen yang lebih pendek?

Ya. Dalam strategi fragmen, segmen peptida yang lebih pendek dapat disiapkan secara terpisah, kemudian digabungkan menggunakan reaksi kimia yang sesuai. Ligasi kimia secara spontan merupakan contoh penting di mana fragmen peptida yang tidak terlindungi digabungkan sedemikian rupa sehingga menghasilkan ikatan rangka peptida alami, dan kemudian diperoleh protein yang terlipat. [10] Hal ini tidak berarti bahwa fragmen peptida apa pun dapat bergabung secara spontan. Perlu mempertimbangkan struktur fragmen, kimia penggabungan, pemilihan lokasi penggabungan, kelarutan, stereokimia, dan persyaratan pemurnian. Oleh karena itu, perakitan fragmen merupakan strategi alternatif dalam perancangan sintesis, bukan solusi otomatis untuk masalah yang terkait dengan peptida panjang.

16. Apakah sintesis otomatis yang lebih cepat menghilangkan kebutuhan akan proses pemurnian?

Tidak. Proses sintesis otomatis atau aliran yang lebih cepat memang memperpendek waktu tahap-tahap tertentu dalam sintesis, tetapi hal itu tidak membuktikan bahwa setiap molekul yang dihasilkan memiliki struktur yang diinginkan. Dalam penelitian sintesis aliran cepat, bahan baku tetap dikarakterisasi dan dilakukan pemurnian lanjutan, sedangkan dalam penelitian selanjutnya mengenai otomatisasi, kemurnian bahan baku dan hasil setelah isolasi dibandingkan secara terpisah. [6] [7] Hasil yang baik dari sistem ini untuk urutan yang diteliti juga tidak menjamin hasil yang identik untuk setiap target baru. Sintesis yang dipercepat tetap harus dipadukan dengan pemurnian yang sesuai, verifikasi identitas, analisis kontaminan, dan karakterisasi akhir.

17. Mengapa meningkatkan skala produksi lebih rumit daripada menyiapkan batch yang lebih besar?

Peningkatan skala mengubah kondisi fisik dan kimia, bukan hanya jumlah bahan. Proses pencampuran, pertukaran panas, pembengkakan resin, distribusi reagen, tekanan, filtrasi, penanganan pelarut, kelarutan produk antara, dan kapasitas sistem pemurnian dapat berperilaku berbeda pada volume produksi yang lebih besar. Dalam analisis industri terhadap 40 proses peptida, sintesis, pemurnian, dan isolasi dievaluasi secara terpisah selama analisis konsumsi bahan. [14] Hasilnya menunjukkan mengapa produksi harus dipandang sebagai suatu proses yang utuh. Metode yang dapat diskalakan harus secara konsisten menghasilkan bahan yang telah dikarakterisasi pada semua tahap, bukan sekadar jumlah peptida mentah yang lebih banyak.

18. Apakah peptida sudah siap segera setelah urutan yang benar terbentuk?

Tidak selalu demikian. Penyusunan rantai hanya membentuk kerangka urutan sejauh hal tersebut dikonfirmasi oleh proses dan data analitis. Tergantung pada molekulnya, proses seperti pelepasan gugus pelindung, pemisahan, siklisasi, oksidasi, pembentukan jembatan disulfida, pelipatan, konjugasi, pemurnian, dan karakterisasi mungkin masih diperlukan. Sintesis BPTI merupakan contoh yang baik dari proses di mana setelah penyambungan urutan linier, dilanjutkan dengan pemurnian dan pembentukan struktur terlipat yang mengandung jembatan disulfida. [3] Istilah „peptida jadi” seharusnya merujuk pada bentuk molekul yang diperlukan dalam konteks ilmiah tertentu, dan bukan hanya pada penyelesaian tahap penambahan asam amino.

19. Apakah massa molekul yang tepat membuktikan bahwa urutan peptida tersebut benar?

Tidak. Kesesuaian massa molekul memang merupakan bukti yang berharga, tetapi tidak dapat secara mandiri mengonfirmasi urutan lengkap maupun struktur molekul. Struktur isobarik dapat memiliki massa yang sama, dan perbedaan stereokimia mungkin sama sekali tidak menyebabkan perubahan massa molekul. Penelitian mengenai kontaminan pada peptida sintetis menunjukkan bahwa membedakan komponen yang berbeda secara struktural mungkin memerlukan spektrometri massa tandem dan analisis tambahan. [12] Jika ada pertanyaan mengenai integritas stereokimia, metode kiral mungkin juga diperlukan. [13] Oleh karena itu, massa molekul harus dianggap sebagai salah satu unsur penilaian identitas, bukan sebagai konfirmasi penuh.

20. Mengapa proses pemurnian harus dianggap sebagai bagian dari produksi peptida, dan bukan sekadar tahap akhir?

Proses pemurnian menentukan apakah peptida target dapat dipisahkan secara efektif dari urutan delesi, produk sampingan, residu reagen, kontaminan yang secara struktural mirip, dan komponen lain yang terbentuk selama sintesis. Metode yang memungkinkan produksi bahan baku dalam jumlah besar dengan sangat cepat mungkin tetap tidak praktis jika produk target dengan kualitas yang dibutuhkan tidak dapat dipisahkan secara efektif. Oleh karena itu, analisis industri terhadap proses peptida mempertimbangkan sintesis, pemurnian, dan isolasi secara bersamaan. [14] Efisiensi produksi pada akhirnya harus dinilai berdasarkan jumlah dan sifat bahan akhir yang diisolasi, bukan semata-mata berdasarkan kecepatan sintesis.

Keterbatasan dalam membandingkan metode sintesis peptida

Saat menafsirkan penelitian yang membandingkan teknologi produksi peptida, perlu diingat beberapa keterbatasan penting.

Pertama-tama, urutan sangat memengaruhi tingkat kesulitan sintesis. Metode yang berhasil untuk satu peptida belum tentu berlaku sama untuk peptida lainnya. Agregasi, hidrofobisitas, komposisi asam amino, panjang rantai, kecenderungan membentuk struktur sekunder, dan kerentanan terhadap reaksi samping dapat memengaruhi jalannya proses. [1] [4]

Kedua, kemurnian bahan baku, hasil isolasi, kemurnian akhir, dan kandungan peptida merupakan parameter yang berbeda-beda. Membandingkan metode hanya berdasarkan salah satu parameter tersebut dapat memberikan gambaran yang tidak lengkap mengenai efisiensi produksi. [7]

Ketiga, proses perakitan rantai yang cepat tidak berarti produksi seluruh bahan juga cepat. Pemisahan, pemurnian, isolasi, pembentukan akhir struktur, pengujian analitis, dan dokumentasi juga memengaruhi total waktu produksi. [6] [7]

Keempat, kemurnian analitis bergantung pada metode yang digunakan. HPLC, spektrometri massa, spektrometri massa tandem, dan analisis kiral memberikan jawaban atas pertanyaan yang berbeda-beda. Satu hasil analisis tidak selalu dapat memastikan identitas struktural yang sepenuhnya akurat. [12] [13]

Kelima, skala memengaruhi perilaku proses. Hasil sintesis laboratorium tidak dapat secara otomatis diterapkan pada produksi industri tanpa mengevaluasi pencampuran, transportasi massa, kemampuan pemurnian, konsumsi bahan, dan faktor-faktor lain yang bergantung pada skala. [14]

Keenam, perbandingan ekonomi historis dapat menjadi tidak relevan seiring berjalannya waktu. Biaya reagen, tingkat otomatisasi, teknologi ekspresi, peralatan pemurnian, pemulihan pelarut, dan infrastruktur produksi terus berkembang. Analisis biaya yang lebih lama mungkin masih memiliki nilai ilmiah, tetapi belum tentu mencerminkan kondisi ekonomi pasar saat ini. [1]

Ketujuh, perbandingan lingkungan memerlukan batas analisis yang konsisten. Penilaian penggunaan pelarut hanya pada tahap perakitan rantai saja, tanpa memperhitungkan proses pemurnian dan isolasi, dapat menimbulkan kesimpulan yang menyesatkan mengenai keberlanjutan proses tersebut. [14] [15]

Pada akhirnya, nama metode itu sendiri tidak menentukan kualitas produk. SPPS, sintesis dalam larutan, LPPS, ligasi fragmen, dan ekspresi biologis dapat menghasilkan bahan berkualitas tinggi, asalkan prosesnya dirancang dan dikendalikan dengan baik. Namun, tidak ada satu pun dari metode-metode ini yang secara otomatis menjamin keaslian, kemurnian, stereokimia, lipatan, atau kesesuaian untuk aplikasi tertentu.

Ringkasan

Sintesis peptida sebaiknya dipahami sebagai proses terkontrol dalam pembuatan molekul, bukan sekadar pembentukan ikatan peptida.

Tujuannya adalah untuk membentuk urutan asam amino tertentu sambil mengontrol cara pengikatan gugus-gugus tersebut, kimia gugus pelindung, stereokimia, reaksi sampingan, serta segala persyaratan struktural tambahan.

Sintesis peptida pada fase padat menahan rantai yang sedang terbentuk pada pembawa yang tidak larut, sehingga tahap-tahap pengikatan dan pencucian yang berulang sangat cocok untuk diotomatisasi. Namun, keunggulan yang terkait dengan sintesis berulang ini tidak menghilangkan masalah seperti reaksi yang tidak tuntas, agregasi, delesi urutan, atau reaksi samping yang bergantung pada urutan. [4] [6] [7]

Sintesis klasik dalam larutan mempertahankan produk antara peptida dalam fase cair dan dapat memberikan fleksibilitas yang lebih besar dalam mengisolasi serta mengkarakterisasi masing-masing produk antara. Namun, pemisahan berulang serta penurunan kelarutan dapat menjadi kendala yang serius.

Metode sintesis fase cair dengan penanda yang dapat larut berusaha menggabungkan kimia larutan dengan strategi pemulihan bahan yang dirancang khusus. Oleh karena itu, metode ini dapat menjadi alternatif bagi urutan dan masalah produksi yang tidak dapat diatasi secara optimal dengan SPPS klasik. [8] [9]

Molekul yang lebih panjang atau sangat rumit juga dapat disintesis melalui penyambungan fragmen, termasuk ligasi kimia alami, alih-alih hanya mengandalkan penambahan residu asam amino secara berurutan tanpa henti. [10]

Terlepas dari metode sintesis yang dipilih, efisiensi kopelasi dan kimia gugus pelindung tetap menjadi faktor kunci, karena inefisiensi kecil dan reaksi sampingan dapat terakumulasi selama tahap-tahap sintesis berikutnya. Pembentukan aspartimida, urutan delesi, dan perubahan stereokimia menunjukkan mengapa urutan yang direncanakan saja tidak cukup untuk menggambarkan semua yang mungkin terbentuk selama proses tersebut. [2] [11] [12]

Pekerjaan juga tidak berakhir begitu rantai tersebut selesai dipasang.

Proses pemurnian menentukan apakah produk akhir dapat dipisahkan dari bahan-bahan lainnya.

Selanjutnya, metode analitis yang dipilih secara tepat menjawab pertanyaan-pertanyaan terpisah mengenai identitas, kemurnian, kandungan, stereokimia, konformasi, dan—jika relevan—aktivitas fungsional. [3] [12] [13]

Peningkatan skala produksi menimbulkan sejumlah masalah baru terkait transportasi bahan baku, stabilitas resin, konsumsi pelarut, filtrasi, kemampuan pemurnian, konsistensi proses, serta dampaknya terhadap lingkungan. Oleh karena itu, evaluasi proses secara industri harus mencakup secara menyeluruh sintesis, pemurnian, dan isolasi, dan tidak hanya berfokus pada laju reaksi. [14] [15]

Prinsip terpentingnya adalah sebagai berikut:

Produksi peptida yang efektif memerlukan pengendalian seluruh proses – mulai dari desain molekuler dan pembentukan ikatan hingga pemurnian serta karakterisasi struktural. Mendapatkan rantai dengan massa nominal yang diharapkan atau puncak kromatografi utama yang tinggi merupakan bukti yang berharga, tetapi tidak satu pun dari parameter tersebut secara mandiri dapat memastikan identitas molekuler yang lengkap maupun kualitas proses produksi.

Pernyataan Penafian

Artikel ini semata-mata bersifat edukatif serta ilmiah dan informatif. Artikel ini menjelaskan prinsip-prinsip umum kimia peptida, sintesis fase padat, sintesis dalam larutan dan fase cair, strategi kelompok pelindung, konjugasi, pemurnian, karakterisasi analitik, proses produksi, serta contoh-contoh yang diambil dari penelitian yang telah dipublikasikan. Artikel ini bukan protokol laboratorium, petunjuk produksi, saran medis, panduan mengenai dosis atau pemberian, maupun sertifikat kualitas produk peptida tertentu. Hasil eksperimen harus ditafsirkan dalam konteks urutan, metode yang digunakan, skala proses, teknik analitis, dan batasan masing-masing penelitian.

Referensi

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K., & Perczel, A. (2016). Ekspresi bakteri dan/atau sintesis peptida fase padat dari polipeptida dan miniprotein dengan panjang 20–40 asam amino: studi kasus ligan GPCR Kelas B. Ilmu Protein & Peptida Terkini, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Pencegahan pembentukan aspartimida selama sintesis peptida dengan menggunakan sianosulfurilida sebagai gugus pelindung asam karboksilat. Nature Communications, 11(1), Pasal 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). Sintesis fase padat dari inhibitor tripsin pankreas sapi (BPTI) dan dua analognya. Pendekatan kimia untuk mengevaluasi peran jembatan disulfida dalam pelipatan dan stabilitas protein. Jurnal Internasional Penelitian Peptida dan Protein, 40(3–4), 194–207. Catatan PubMed
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). Pemantauan secara real-time terhadap sintesis peptida fase padat menggunakan reaktor aliran lapisan variabel. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F., & Becker, C. F. W. (2015). Pembuatan hidrazida peptida secara efisien melalui hidrazinolisis langsung resin Peptidyl-Wang-TentaGel. Jurnal Ilmu Peptida, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Sintesis peptida berbasis aliran cepat. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2017). Pendekatan berbasis aliran yang sepenuhnya otomatis untuk mempercepat sintesis peptida. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G., & Albericio, F. (2022). Sintesis peptida fase cair (LPPS): Gelombang ketiga dalam pembuatan peptida. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T., & Fukui, T. (2012). Kelompok pelindung amida turunan difenilmetil yang baru untuk sintesis peptida fase cair yang efisien: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., & Kent, S. B. (1994). Sintesis protein melalui ligasi kimiawi alami. Science, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Membatasi rasemisasi dan pembentukan aspartimida dalam sintesis peptida fase padat Fmoc yang ditingkatkan dengan gelombang mikro. Jurnal Ilmu Peptida, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Karakterisasi pengotor dalam peptida substrat renin sintetis dengan spektrometri massa bombardemen atom cepat dan spektrometri massa tandem hibrida. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G., & Crowther, J. B. (1995). Penentuan kemurnian kiral peptida: Hidrolisis dalam asam terdeuterasi, derivatisasi dengan reagen Marfey, dan analisis menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi-ionisasi elektrospray-spektrometri massa. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Intensitas Massa Proses (PMI): Analisis holistik terhadap proses produksi peptida saat ini memberikan wawasan mengenai keberlanjutan dalam sintesis peptida. Jurnal Kimia Organik, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Tantangan keberlanjutan dalam sintesis dan pemurnian peptida: Dari R&D hingga produksi. Jurnal Kimia Organik, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001