Sintesi dei peptidi: metodo in fase solida, in soluzione e metodi di produzione

La sintesi dei peptidi è un processo controllato di creazione di catene di amminoacidi con una sequenza specifica. Nella sintesi chimica gli amminoacidi selezionati vengono uniti mediante legami peptidici, pur controllando al contempo altri gruppi reattivi presenti in queste molecole. L'obiettivo non è quindi semplicemente la combinazione degli amminoacidi, ma l'ottenimento di una struttura molecolare specifica con una determinata sequenza, stereochimica, struttura delle estremità della catena e – se richiesto – ulteriori caratteristiche strutturali.

Tra i metodi principali vi sono la sintesi peptidica in fase solida (SPPS), la classica sintesi in soluzione e i metodi più recenti di sintesi peptidica in fase liquida (LPPS), che utilizzano supporti solubili o etichette molecolari. I laboratori di ricerca e gli impianti di produzione possono anche combinare diversi approcci, preparando frammenti più brevi separatamente e poi unendoli tra loro, oppure utilizzare l'espressione biologica, se risulta più adatta per una determinata sequenza.

Il confronto tra la sintesi chimica e l'espressione batterica di polipeptidi costituiti da 20-40 residui amminoacidici mostra un principio importante: la scelta pratica del metodo di produzione dipende dalla molecola specifica, dalla sua sequenza, dalla propensione all'aggregazione, dalle modifiche richieste, dalla scala di produzione e dai requisiti analitici. [1]

L'ottenimento della sequenza amminoacidica desiderata è solo una delle fasi della produzione del peptide.

L'intero processo può comprendere:

progettazione della sequenza → preparazione dei blocchi costitutivi → protezione dei gruppi funzionali → accoppiamento → rimozione dei gruppi protettivi → assemblaggio della catena → scissione o unione dei frammenti → modellamento strutturale finale → purificazione → conferma dell'identità → analisi delle impurità → determinazione del contenuto → caratterizzazione finale.

Per alcuni peptidi sono necessari anche passaggi aggiuntivi, come la ciclizzazione, la formazione di ponti disolfuro, il folding, la coniugazione o altre modifiche chimiche.

Per questo motivo, il corretto assemblaggio della catena non significa automaticamente che il materiale finale possieda la giusta identità, purezza, stereochimica, conformazione, stabilità o altre caratteristiche richieste.

Cos'è la sintesi dei peptidi?

Creazione di una specifica sequenza amminoacidica

Peptide è costituito da residui di amminoacidi legati da legami peptidici.

Lo scopo della sintesi peptidica è quello di creare questi legami in un ordine predeterminato, spesso controllando contemporaneamente:

• tipi di aminoacidi;
• sequenza degli amminoacidi;
• stereochimica;
• strutture dell'estremità N;
• strutture di fine C;
• modifiche alle catene laterali;
• distribuzione dei ponti bisolfurici;
• ciclizzazione;
• altre caratteristiche strutturali richieste.

La sequenza è fondamentale, poiché un identico corredo amminoacidico può portare alla formazione di molecole diverse se gli amminoacidi si susseguono in un ordine differente.

Affermare che una determinata molecola sia „un peptide composto da cinque aminoacidi” fornisce quindi pochissime informazioni sulla sua struttura effettiva. Per descrivere correttamente una molecola, è necessario conoscere il tipo di aminoacidi, la loro sequenza, la stereochimica, i gruppi terminali ed eventuali ulteriori modificazioni.

Due peptidi possono quindi avere esattamente la stessa composizione amminoacidica e tuttavia essere strutture molecolari differenti.

Ulteriori differenze possono derivare da modifiche delle estremità della catena, dalla presenza di ponti disolfuro, da uno scheletro ciclico, da variazioni nelle catene laterali o da una diversa configurazione stereochimica.

La sintesi chimica dei peptidi utilizza solitamente aminoacidi i cui gruppi reattivi sono stati protetti in modo selettivo.

I gruppi protettivi temporanei consentono la creazione di uno specifico legame chimico desiderato, limitando al contempo le reazioni competitive in altri punti della molecola.

Nelle successive fasi previste della sintesi, questi gruppi vengono rimossi o modificati.

Una reazione controllata anziché una fusione spontanea

Nelle descrizioni chimiche di base, la formazione del legame peptidico viene spesso rappresentata come una reazione di condensazione, in cui due amminoacidi si uniscono con la formazione complessiva di una molecola d'acqua.

Tale equazione descrive il bilancio generale della reazione.

Tuttavia, non bisogna assimilarlo al modo in cui viene effettuata in pratica la sintesi peptidica controllata.

La semplice miscelazione di aminoacidi liberi non consentirebbe di determinare in modo attendibile:

• quale gruppo amminico deve reagire;
• quale gruppo carbossilico deve reagire;
• quale aminoacido deve essere il primo;
• che deve trovarsi per secondo;
• se le catene laterali inizieranno a reagire;
• la stereochimica verrà conservata?;
• se non si formeranno numerosi prodotti indesiderati.

Nella sintesi chimica pratica si ricorre quindi a strategie controllate di attivazione e protezione dei gruppi funzionali.

Il gruppo derivante dal gruppo carbossilico viene solitamente attivato in modo tale da poter reagire efficacemente con il gruppo amminico prescelto. I gruppi protettivi, l’ordine di reazione, la chimica del supporto, gli agenti di accoppiamento, l’ambiente del solvente e i metodi di isolamento contribuiscono insieme a orientare la reazione verso il prodotto desiderato.

Una sintesi efficace del peptide richiede quindi il controllo sia delle reazioni chimiche che devono avvenire, sia di quelle che devono essere evitate.

Un buon esempio è la formazione dell'aspartimmide.

I ricercatori hanno messo a punto un metodo alternativo per la protezione del gruppo carbossilico, con l'obiettivo di limitare questa reazione collaterale problematica durante la sintesi del peptide. [2]

Lo studio evidenzia un principio più ampio della chimica dei peptidi: prevenire trasformazioni molecolari indesiderate può essere importante tanto quanto creare il giusto legame peptidico.

Quando si può considerare un peptide pronto?

Il completamento della creazione dello scheletro peptidico lineare non significa sempre la fine dell'intera sintesi.

A seconda della molecola di destinazione, una volta assemblata la catena potrebbero essere necessarie ulteriori fasi.

Possono includere:

• deprotezione totale;
• cleψamento del peptide dal supporto solido;
• rimozione dei segnalini temporanei;
• ciclizzazione;
• ossidazione;
• formazione di ponti disolfuro;
• piega;
• coniugazione;
• modifica delle estremità della catena;
• purificazione;
• caratteristica analitica.

Alcuni peptidi richiedono relativamente poche modifiche strutturali aggiuntive dopo l'assemblaggio della catena.

Per altri, le fasi successive sono fondamentali.

Un buon esempio è la sintesi dell'inibitore della tripsina pancreatica bovina (BPTI). I ricercatori hanno assemblato la sequenza lineare, purificato il materiale e quindi ottenuto la struttura ripiegata contenente ponti disolfuro. Sulla base delle analisi e dei confronti funzionali presentati nello studio, il materiale finale con sequenza naturale corrispondeva alla proteina naturale in termini di parametri studiati. [3]

Questo esempio mostra la differenza tra l'assemblaggio dello scheletro peptidico e l'ottenimento della forma molecolare finale completamente caratterizzata.

Il metodo che permette di ottenere una sequenza lineare corretta non conferma automaticamente:

• del corretto piegamento;
• del corretto posizionamento dei ponti disolfuro;
• attività biologica;
• stabilità;
• profilo di inquinamento;
• idoneità a un determinato scopo.

Ognuna di queste questioni richiede prove separate.

Sintesi chimica, espressione biologica e metodi combinati

Nella sintesi chimica dei peptidi, i blocchi molecolari precedentemente preparati vengono uniti in reazioni di laboratorio controllate.

L'espressione biologica utilizza invece il macchinario cellulare per produrre la sequenza amminoacidica codificata. Successivamente, il materiale deve essere recuperato, purificato e, se necessario, sottoposto a un'ulteriore lavorazione.

Entrambi i metodi possono portare all'ottenimento di peptidi o polipeptidi, ma comportano diverse possibilità e limitazioni.

La sintesi chimica può essere particolarmente utile quando sono necessari:

• amminoacidi non standard selezionati;
• modificazioni chimiche in punti specifici;
• specifiche strutture terminali della catena;
• traccianti isotopici;
• modificazioni dello scheletro peptidico;
• altre caratteristiche difficili da ottenere tramite la normale espressione biologica.

L'espressione biologica può essere interessante per sequenze più lunghe adeguate o per specifiche strategie di marcatura, ma non elimina i problemi che si presentano nelle fasi successive della produzione.

Si devono ancora considerare il recupero del materiale, il ripiegamento, la lavorazione, i contaminanti derivati dall'ospite, la purificazione e la caratterizzazione analitica.

Nessuna delle due/dei metodi è quindi universalmente il migliore.

Nel confronto di polipeptidi costituiti da 20-40 residui amminoacidici, sia la lunghezza della sequenza sia la sua propensione all'aggregazione hanno influenzato i risultati della sintesi in fase solida e dell'espressione batterica. [1]

Queste osservazioni supportano un approccio in cui il metodo di produzione viene scelto in base alla specifica molecola.

I dati storici relativi a prestazioni, costi, attrezzature e tempi di produzione non devono essere considerati come valori contemporanei universali, poiché le tecnologie, i reagenti, l'automazione, i metodi di purificazione e l'economia della produzione cambiano con lo sviluppo tecnologico.

Sintesi peptidica in fase solida

La catena in crescita è legata a un supporto insolubile

Nella sintesi dei peptidi in fase solida (SPPS), la catena peptidica in crescita rimane legata a un supporto insolubile durante i successivi cicli di sintesi.

Il supporto è più comunemente una resina polimerica funzionalizzata.

Il linker, ovvero il connettore, lega il peptide al supporto e influenza, tra le altre cose, le modalità di successivo rilascio della catena finita e il tipo di gruppo terminale ottenuto.

Uno dei principali vantaggi pratici dell'SPPS è la più facile separazione del materiale.

Al termine di una determinata fase della reazione, i reagenti solubili e molti sottoprodotti solubili possono essere rimossi mediante lavaggio, mentre il peptide in crescita rimane legato alla fase solida.

Grazie a ciò, dopo l'aggiunta di ciascun amminoacido successivo, non è necessario isolare e purificare il peptide in crescita come composto libero e separato.

Questa comodità può tuttavia portare a un importante malinteso.

Il lavaggio della resina non significa che tutti i peptidi anomali siano stati rimossi.

Se la catena legata alla resina non reagisce durante una fase di accoppiamento, può comunque rimanere sul supporto.

Nei cicli successivi potrebbe reagire nuovamente e allungarsi ulteriormente.

Di conseguenza, può formarsi una sequenza di delezione, ovvero una molecola che differisce dal peptide bersaglio per l'assenza di uno o più residui amminoacidici.

Catene legate alla resina, chimicamente modificate in modo simile o non completamente sbloccate, possono partecipare alle fasi successive della sintesi.

L'SPPS semplifica quindi la separazione delle sostanze solubili dal materiale legato alla resina.

Tuttavia, non garantisco la perfetta corrispondenza della sequenza.

Il ciclo ripetuto di sblocco e innesto

La tipica sintesi peptidica in fase solida (SPPS) a tappe prevede la ripetizione di tre operazioni fondamentali:

disinserimento → innesto → lavaggio.

Per prima cosa viene svelato il gruppo amminico reattivo situato all'estremità della catena in crescita.

Successivamente, un altro amminoacido protetto viene legato alla catena.

I reagenti solubili, l'eccesso di amminoacidi e molti prodotti di reazione vengono rimossi prima dell'inizio del ciclo successivo.

La ripetizione di questo processo consente di costruire il peptide un residuo amminoacidico alla volta.

Nella SPPS classica, il residuo C-terminale viene solitamente legato per primo al supporto, e successivamente la catena viene allungata verso l'estremità N-terminale.

Questo differisce dalla sintesi proteica ribosomale standard, durante la quale amminoacidi successivi vengono aggiunti all'estremità C-terminale della catena in crescita.

La sequenza finale degli amminoacidi può tuttavia essere identica, nonostante la direzione e la chimica del processo di ripiegamento siano diverse.

Il termine „ciclo” non deve essere inteso come un unico set universale di condizioni di reazione adatto a ogni residuo e a ogni sequenza.

Il decorso della reazione può dipendere da:

• strategie dei gruppi di protezione;
• del tipo di amminoacido;
• delle condizioni spaziali intorno al luogo della reazione;
• del tipo di resina;
• collegherà;
• lunghezze della catena;
• aggregazione;
• del solvente;
• chimica di accoppiamento;
• comportamento strutturale del peptide in crescita.

Una reazione che procede facilmente all'inizio della sintesi può diventare molto più difficile in una fase successiva.

Per questo motivo il monitoraggio del processo rimane fondamentale anche nei sistemi altamente automatizzati.

Perché le proprietà della resina sono importanti?

Il supporto fisso non è un semplice supporto passivo.

Le sue proprietà fisiche e chimiche possono influenzare direttamente il corso della reazione.

Uno dei parametri importanti è il gonfiore.

Se la resina si gonfia correttamente nell'ambiente di solvente scelto, i reagenti possono raggiungere più facilmente i siti reattivi distribuiti in tutta la struttura del polimero.

Un gonfiore insufficiente o alterazioni della struttura della resina possono limitare questo accesso.

Potrebbero avere un'importanza anche:

• densità di impianto;
• architettura dei polimeri;
• struttura del linker;
• compatibilità con i solventi;
• stabilità meccanica;
• porosità;
• proprietà diffusive;
• interazioni tra le catene peptidiche in crescita.

Con l'aumentare della lunghezza del peptide, le singole catene possono anche interagire tra loro.

L'aggregazione sulla resina può limitare l'accesso ai siti reattivi e portare a un accoppiamento incompleto o a una deprotezione incompleta.

Ciò significa che una sequenza che si comporta correttamente all'inizio della sintesi può diventare sempre più difficile man mano che la catena si allunga.

I ricercatori hanno sviluppato un reattore a flusso a letto variabile che ha consentito di monitorare il gonfiaggio della resina sulla base di misurazioni correlate alla pressione. [4]

Lo studio si è concentrato sull'aggregazione sulla resina e sulla formazione incompleta di legami come problemi di processo che, in altre condizioni, potrebbero essere difficili da osservare direttamente durante la sintesi.

Ciò dimostra che il monitoraggio del comportamento fisico del supporto può fornire informazioni che vanno oltre la semplice registrazione dei reagenti aggiunti.

A cosa serve la resina Wang?

La chimica dei linker di tipo Wang è ampiamente utilizzata nella SPPS quando, dopo il distacco del peptide, si desidera un C-terminale sotto forma di acido carbossilico.

Il peptide è legato tramite un legame di natura esterea, che può essere successivamente scisso in condizioni adeguate.

Si possono scegliere altri sistemi di linker quando è necessaria una diversa struttura del C-terminale, ad esempio un ammide.

Vale la pena distinguere la chimica del linker dall'intero vettore fisico.

I linker di tipo Wang correlati possono essere introdotti in diverse architetture polimeriche.

Tali materiali non devono necessariamente avere identici:

• proprietà di gonfiamento;
• capacità;
• compatibilità con i solventi;
• proprietà meccaniche;
• comportamenti durante la reazione.

Gli studi che utilizzano supporti di peptidyl-Wang-TentaGel hanno dimostrato un metodo alternativo specializzato per la preparazione di idrazidi peptidiche, che sono intermedi utili nella chimica dei peptidi. [5]

Ciò non significa che il distacco standard dalla resina di Wang porti solitamente alla formazione di idrazidi peptidiche.

Dimostra invece un principio importante:

supporto + linker + condizioni di reazione + chimica di scissione determinano congiuntamente il prodotto ottenuto.

Sintesi SPPS in regime discontinuo e a flusso

La SPPS può essere condotta in classici reattori discontinui o in sistemi in cui i reagenti fluiscono attraverso un reattore contenente il supporto solido.

I sistemi a flusso possono consentire un rapido scambio di reagenti e un controllo più accurato dell'ambiente chimico che circonda la resina.

Uno studio del 2014 ha presentato una rapida sintesi peptidica in flusso con monitoraggio continuo ed è stata applicata a diversi peptidi e a una piccola proteina. [6]

In un successivo studio automatizzato è stata descritta una sintesi di catene notevolmente più rapida, ottenendo per gli esempi analizzati una purezza del prodotto grezzo e una resa dopo l'isolamento comparabili con la classica sintesi batch. [7]

Questi studi mostrano le capacità di specifici sistemi in determinate condizioni.

Tuttavia, non dimostrano che ogni peptide possa essere prodotto con la stessa rapidità e con la stessa qualità.

Il tempo necessario per produrre un peptide include anche molto di più della sola sintesi della catena.

L'intero processo può includere:

• preparazione dei reagenti;
• preparazione della resina;
• accoppiamento;
• disattivazione della sicura;
• lavaggio;
• distacco;
• lavorazione del prodotto;
• purificazione;
• rimozione dei solventi;
• definizione finale della struttura;
• esami di laboratorio;
• documentazione.

La rapida creazione di fasci è quindi solo uno degli elementi dell'efficienza produttiva complessiva.

Sintesi in fase liquida

Che cosa significa questo termine?

L'espressione „sintesi peptidica in fase liquida” può essere usata con diversi significati.

In senso lato, può semplicemente significare la sintesi peptidica in soluzione.

Tuttavia, nella letteratura più specialistica si distingue spesso tra:

1. classica sintesi dei peptidi in soluzione;
2. sintesi dei peptidi in fase solida;
3. i metodi LPPS più recenti, in cui la catena in crescita possiede un marcatore o un supporto solubile.

Questa distinzione è importante perché cambia il modo in cui il prodotto viene separato e recuperato.

Un semiprodotto peptidico liberamente disciolto e protetto può richiedere l'isolamento sfruttando le sue stesse proprietà fisiche e chimiche.

Nel caso di un semilavorato marcato, il marcatore può essere progettato per facilitare la precipitazione, l'estrazione, la ritenzione su membrana o un altro metodo di separazione.

La rassegna sull'LPPS distingue chiaramente la classica sintesi in soluzione, la SPPS e i metodi che utilizzano marcatori solubili. [8]

La pubblicazione è utile per riordinare la terminologia e la metodologia.

Non dovrebbe tuttavia essere interpretata come un singolo esperimento che dimostra che un metodo è il migliore per ogni peptide.

Sintesi peptidica classica in soluzione

Nella sintesi classica in soluzione, gli amminoacidi protetti, i semi-prodotti peptidici o i frammenti rimangono sciolti nell'ambiente di reazione invece di essere legati covalentemente a una resina insolubile.

Al termine della reazione, l'intermediario corrispondente può essere isolato, purificato e, se necessario, caratterizzato prima di iniziare la fase successiva.

Questo potrebbe comportare alcuni benefici.

I ricercatori possono:

• caratterizzare i singoli semilavorati;
• scegliere il metodo di purificazione per il singolo semilavorato;
• ottimizzare le singole trasformazioni;
• preparare i frammenti indipendentemente;
• modificare la via di sintesi quando un determinato intermediario crea problemi.

Tuttavia, la sintesi in soluzione può comportare anche notevoli difficoltà.

Con l'allungamento della catena, i peptidi possono:

• diventare poco solubile;
• aggregare;
• essere difficile da cristallizzare;
• generare impurità strettamente correlate;
• essere difficili da separare;
• richiedere un isolamento multiplo;
• causare perdite di materiale durante le successive fasi di lavorazione.

La sintesi in soluzione non è quindi automaticamente più semplice o più facile da scalare rispetto alla SPPS.

La sua utilità dipende dalla specifica sequenza, dalla stabilità dei intermedi, dalla solubilità, dalla lunghezza della via di sintesi, dal comportamento durante la purificazione e dall'efficienza delle successive fasi di isolamento.

Lo sviluppo di strategie LPPS marcate deriva in parte dai tentativi di risolvere proprio questi problemi legati alla separazione e alla gestione del materiale. [8]

I marcatori solubili collegano la progettazione della reazione con la progettazione della separazione

Nel LPPS marcato, il peptide in crescita presenta un attacco molecolare temporaneo progettato in modo da influenzarne le proprietà fisiche.

Il marcatore può consentire di mantenere una sufficiente solubilità del peptide durante la reazione e facilitarne successivamente il recupero selettivo.

A seconda della tecnologia, la separazione può utilizzare:

• precipitazione;
• estrazione;
• ritenzione su membrana;
• comportamento di fase;
• altre proprietà derivanti dalla presenza del marcatore.

Una delle strategie sperimentali ha utilizzato un gruppo protettivo a catena lunga all'estremità C per la preparazione di ammidi peptidiche.

Le reazioni ripetute e le fasi di precipitazione hanno permesso ai ricercatori di preparare un peptide idrofobico che, nel confronto da loro effettuato, era difficile da ottenere in modo soddisfacente con il metodo SPPS. [9]

Ciò dimostra l'utilità di questa specifica strategia per la sequenza analizzata.

Non dimostra tuttavia la superiorità universale della sintesi marcata.

Il marcatore diventa parte del processo produttivo e solleva nuovi interrogativi:

• Come viene collegato efficacemente?
• Cambia il corso della reazione?
• Come si può recuperare in modo affidabile un semilavorato marcato?
• Porta alla formazione di nuovi inquinanti?
• Come viene rimosso?
• È possibile confermare la completa eliminazione?
• Quali metodi analitici ne confermano l'assenza nel prodotto finale?

I marker solubili vanno quindi considerati come elementi funzionali della progettazione del processo e non semplicemente come semplici etichette.

Confronto dei metodi principali

Il confronto illustra i principi generali di funzionamento dei singoli metodi.

Non specifica quale di esse garantirà le migliori prestazioni, purezza, costo, sostenibilità ambientale o scalabilità per una specifica sequenza.

Questi parametri devono essere valutati sulla base della molecola reale e dello specifico processo di produzione. [4] [8] [9]

Unione di frammenti e produzione ibrida

Un peptide non deve necessariamente essere sempre creato in un unico processo ininterrotto che consiste nell'aggiunta di successivi residui amminoacidici.

Una strategia alternativa consiste nel preparare separatamente frammenti peptidici più corti e poi unirli.

Ad esempio, un processo ibrido può utilizzare la SPPS per ottenere i singoli frammenti e la chimica in soluzione per E l'unione.

Le strategie convergenti possono limitare alcuni dei problemi legati a una sintesi a stadi molto lunga.

Tuttavia, introducono nuove sfide, come:

• scelta del punto di connessione appropriato;
• solubilità dei frammenti;
• attivazione del punto di giunzione;
• chemoselettività;
• mantenimento della stereochimica;
• effetti collaterali;
• pulizia dei frammenti;
• pulizia dopo la loro unione.

Un importante esempio di giunzione controllata di frammenti è la ligazione chimica nativa.

Nella versione classica, il tioestere peptidico reagisce con un secondo peptide contenente una cisteina N-terminale. Il successivo riarrangiamento porta alla formazione di un legame corretto nello scheletro peptidico nel sito di ligazione.

La ricerca preliminare ha dimostrato la possibilità di ottenere, dopo legazione e ripiegamento, una proteina contenente ponti disolfuro. [10]

Ciò conferma l'importanza di questa strategia di concatenazione di frammenti.

Ciò non significa tuttavia che due qualsiasi frammenti peptidici non modificati possano unirsi spontaneamente.

Accoppiamento e gruppi protettivi

L'accoppiamento crea una connessione intenzionale

L'accoppiamento è la fase della reazione durante la quale si forma un nuovo legame peptidico tra le unità selezionate.

Di solito il gruppo derivato dal gruppo carbossilico viene attivato in modo da poter reagire efficacemente con il gruppo amminico corrispondente.

La chimica di attivazione deve essere compatibile con:

• sequenza crescente;
• con gruppi di protezione temporanei;
• protezione delle catene laterali;
• stereochimica;
• supporto o marcatore;
• ambiente solvente;
• con altri gruppi funzionali presenti nella molecola.

L'accoppiamento efficiente è particolarmente importante nella sintesi graduale, poiché una reazione incompleta può portare alla formazione di sequenze di delezione.

Se una fase di aggiunta di amminoacido fallisce per parte delle catene in crescita, tali catene possono rimanere nel sistema e partecipare ai cicli successivi.

Di conseguenza, possono formarsi molecole molto simili al peptide bersaglio, ma prive di un residuo.

Anche piccole inefficienze possono quindi accumularsi durante molte fasi della sintesi.

Un semplice esempio matematico illustra bene questo problema.

Se ciascuna delle 50 fasi indipendenti del processo di assemblaggio avesse una probabilità di successo pari a 99%, la percentuale di molecole per le quali tutte le fasi si concludessero con successo sarebbe pari a:

0,99^50 ≈ 0,605

ovvero circa 61%.

Questa è esclusivamente un'illustrazione matematica.

Non costituisce una previsione della reale purezza o del rendimento della sintesi di un peptide contenente 50 residui.

La produzione effettiva comprende:

• diverse efficienze di accoppiamento nelle singole posizioni;
• fasi di disinserimento della sicura;
• effetti collaterali;
• difficoltà dipendente dalla sequenza;
• strategie di riconnessione;
• perdite durante la separazione;
• perdite durante la pulizia;
• altre variabili di processo.

Il calcolo mostra solo il motivo per cui anche una inefficienza apparentemente minima di una singola fase può assumere grande importanza in una sintesi a più fasi.

I gruppi protettivi controllano il sito di reazione

Un amminoacido può presentare diverse gruppi chimicamente reattivi.

Senza un controllo selettivo, le reazioni di accoppiamento potrebbero avvenire in punti indesiderati.

I gruppi di protezione bloccano temporaneamente i punti reattivi selezionati.

Il gruppo amminico utilizzato per l'allungamento della catena richiede solitamente una protezione temporanea, mentre le catene laterali reattive possono necessitare di una protezione che rimanga in sede per numerosi cicli di sintesi.

Anche il collegamento con il vettore deve sopravvivere a queste fasi fino al momento del distacco pianificato.

La scelta dei gruppi protettivi influisce quindi sull'intera strategia di sintesi.

È necessario tenere conto di quanto segue:

• il modo in cui vengono introdotti;
• stabilità;
• metodo di rimozione;
• compatibilità con altri gruppi di protezione;
• compatibilità con il supporto;
• effetti collaterali;
• effetto di una determinata sequenza;
• condizioni finali di sblocco.

Le ricerche che hanno utilizzato la protezione a base di cianosolfurilide hanno riguardato la formazione dell'aspartimide attraverso la modifica del metodo di protezione del gruppo carbossilico. [2]

I risultati dimostrano che la strategia dei gruppi di protezione influisce non solo sulla possibilità che si verifichi la reazione desiderata, ma anche sul tipo di reazioni indesiderate che possono verificarsi.

Fmoc, Boc e protezione ortogonale

L'Fmoc e il Boc sono due gruppi protettivi delle ammine ampiamente utilizzati.

Differiscono notevolmente nel modo in cui vengono rimossi.

L'Fmoc viene solitamente eliminato in condizioni basiche, mentre il Boc è sensibile alle condizioni acide.

Queste caratteristiche consentono di utilizzarli come elementi di strategie di protezione più ampie.

Nel diffuso processo SPPS basato su Fmoc, la protezione provvisoria N-terminale Fmoc viene rimossa più volte, mentre i gruppi protettivi selezionati delle catene laterali e il legame con la resina rimangono intatti fino alle fasi successive.

Altre strategie possono utilizzare combinazioni diverse.

Un concetto particolarmente importante è quello di protezione ortogonale.

Due gruppi protettivi sono considerati ortogonali se uno dei due può essere rimosso selettivamente in condizioni tali che l'altro rimanga sufficientemente stabile da consentire il proseguimento della sintesi.

L'ortogonalità è quindi una relazione pratica di compatibilità chimica.

Ciò non significa che ogni gruppo protetto rimanga del tutto inalterato dopo un numero illimitato di esposizioni a tutte le condizioni di reazione.

Possono comunque verificarsi effetti collaterali.

Negli studi sulla sintesi Fmoc sono stati descritti sia la formazione di aspartimide sia alterazioni stereochimiche indesiderate, nonostante la selettività prevista dalla strategia protettiva generale. [11]

La stereochimica è parte integrante dell'identità di una molecola

Molti aminoacidi presentano un centro chirale.

Ciò significa che i loro atomi possono assumere diverse configurazioni spaziali corrispondenti a diverse forme stereochimiche.

La modifica della configurazione di un singolo centro stereogenico può portare alla formazione di una struttura peptidica diversa senza che sia necessario modificare la sua massa nominale.

Pertanto, la massa da sola non è sufficiente a confermare l'identità completa del peptide.

L'epimerizzazione di solito significa la configurazione di un solo centro stereogenico in una molecola che ne contiene diversi.

La racemizzazione è anche spesso discussa nella chimica dei peptidi nel contesto della perdita di integrità stereochimica dei residui di amminoacidi.

Questi cambiamenti sono importanti perché il riconoscimento molecolare può dipendere fortemente dalla disposizione spaziale degli atomi.

Due molecole con la stessa composizione elementare e massa nominale possono quindi comportarsi in modo diverso se differiscono per la stereochimica.

Uno studio sulla sintesi Fmoc assistita da microonde ha rilevato che alcuni residui erano soggetti a modifiche stereochemiche indesiderate nelle condizioni applicate. La modifica del metodo ha limitato il verificarsi di queste reazioni. [11]

Ciò non significa che il riscaldamento danneggi per definizione tutti i peptidi.

La conclusione corretta è che l'accelerazione della reazione deve essere valutata insieme alla selettività chimica dipendente dalla sequenza.

Aspartimide e altre impurezze correlate

La formazione di aspartimmide è una nota reazione collaterale riguardante specifiche sequenze contenenti asparagina.

Può formarsi un intermedio ciclico indesiderato, da cui successivamente si generano composti con connettività dello scheletro o stereochimica alterate.

La probabilità di questa reazione dipende dalla sequenza e dalle condizioni del processo.

Altre impurità legate alla sintesi possono derivare da:

• accoppiamento incompleto;
• sblocco incompleto;
• formazione di sequenze di delezione;
• reazioni delle catene laterali;
• di modifiche stereochimiche;
• reazioni durante il distacco;
• ossidazione;
• raggruppamenti;
• delle condizioni di lavorazione del prodotto;
• rimozione incompleta dei gruppi protettivi.

Alcuni inquinanti causano una variazione facilmente percepibile della massa molecolare.

Le altre sono molto più difficili da distinguere.

Nelle analisi analitiche di un peptide sintetico substrato della renina sono state identificate molteplici impurità, compresi componenti che mostrano la stessa variazione di massa ma contenenti modifiche in posizioni diverse. [12]

Per la loro distinzione era necessaria un'ulteriore analisi strutturale.

I ricercatori hanno anche trattato i meccanismi proposti per la formazione di questi inquinanti come ipotesi.

Questa è una distinzione importante:

Stabilire cosa sia l'inquinamento e dimostrare l'esatto meccanismo della sua origine sono due questioni scientifiche distinte.

Non si deve presentare un meccanismo probabile come confermato solo perché corrisponde alla massa molecolare osservata.

Pulizia, ridimensionamento e qualità di produzione

Prodotto grezzo, prodotto purificato e resa

Il peptide grezzo è un materiale ottenuto prima del completamento delle fasi appropriate di purificazione.

Può contenere:

• peptide bersaglio;
• sequenze di delezione;
• materiale non completamente disattivato;
• sequenze modificate;
• residui di reagenti;
• prodotti per la decornazione;
• sole;
• solventi;
• altri ingredienti che si formano durante il processo.

La purificazione mira a separare il peptide desiderato da questa miscela.

È necessario distinguere chiaramente tre concetti:

purezza del prodotto grezzo — composizione del materiale misurata prima della purificazione finale;

resa di un prodotto purificato o isolato — quantità di materiale bersaglio recuperato rispetto a un determinato valore iniziale o teorico;

purezza finale — composizione del materiale isolato determinata mediante un metodo analitico specifico.

Questi concetti non sono intercambiabili.

Il processo può portare alla generazione di una grande quantità di materiale grezzo, ma consentire il recupero di una quantità relativamente ridotta di prodotto purificato.

Un altro processo può produrre meno materia prima, ma essere caratterizzato da un'elevata selettività nella formazione del prodotto desiderato.

Una purezza analitica altrettanto elevata non deve necessariamente significare un'alta produttività.

Negli studi di sintesi in flusso accelerata sono stati correttamente riportati separatamente la purezza del materiale grezzo e la resa dopo l'isolamento. [7]

La cromatografia separa i componenti, ma non risponde a ogni domanda

La cromatografia liquida ad alta prestazione in fase inversa (RP-HPLC) è ampiamente utilizzata per l'analisi e la purificazione dei peptidi.

Diverse molecole interagiscono in modo diverso con la fase stazionaria e mobile.

In condizioni adeguate, queste differenze consentono di separare i componenti della miscela.

La cromatografia analitica e preparativa hanno applicazioni correlate, ma differenti.

L'HPLC analitica serve principalmente per analizzare la composizione del campione.

La PLC preparativa viene utilizzata per la raccolta fisica dei componenti separati.

Il cromatogramma può fornire molte informazioni preziose.

Un grande picco principale o un'alta percentuale della sua area non devono tuttavia essere considerati come una caratterizzazione molecolare completa.

I risultati della cromatografia dipendono, tra le altre cose, da:

• tipo di colonna;
• fasi mobili;
• graduato;
• temperature;
• metodi di rilevamento;
• lunghezze d'onda;
• preparazione del campione;
• metodo di integrazione dei picchi;
• risoluzioni;
• proprietà degli inquinanti.

Due composti potrebbero potenzialmente eluire nello stesso momento.

Alcuni componenti del campione possono anche reagire diversamente al rilevatore utilizzato.

Pertanto, un'alta purezza superficiale in HPLC non equivale alla piena conferma dell'identità molecolare.

Studi sulle impurità peptidiche isobare e analisi chirali mostrano perché potrebbero essere necessari metodi analitici complementari. [12] [13]

Il metodo analitico deve corrispondere a una specifica domanda strutturale.

Identità, purezza e contenuto significano cose diverse

Nella caratteristica dei peptidi sono particolarmente importanti tre concetti.

L'identità risponde alla domanda:

La molecola desiderata è presente nel campione?

La purezza risponde alla domanda:

Quali altri componenti sono presenti nel campione o quale parte del segnale misurato corrisponde al componente principale?

Il contenuto risponde alla domanda:

Quanto peptide effettivo è presente nel campione?

Queste domande non possono sempre essere risposte con una sola misurazione.

Il materiale contenente peptidi può anche contenere:

• l'acqua;
• controvento;
• sole;
• residui di solventi;
• altri ingredienti legati al processo;
• inquinamento.

Di conseguenza, la massa totale del materiale pesato non deve necessariamente corrispondere alla massa del peptide stesso.

Allo stesso modo, la conformità della massa molecolare misurata con il valore teorico non conferma:

• completa sequenza amminoacidica;
• corretta connettività dei singoli residui;
• dell'integrità stereochimica;
• distribuzione dei ponti bisolfurici;
• pieghe;
• assenza di contaminanti isobarici.

La spettrometria di massa può fornire prove solide riguardo alla massa molecolare.

La spettrometria di massa tandem e altre tecniche strutturali possono fornire ulteriori informazioni sulla sequenza.

I metodi chirali consentono di analizzare questioni stereochimiche che non possono essere risolte con una normale misurazione della massa.

In uno degli studi analitici è stata presa in considerazione persino la racemizzazione che si verifica durante la preparazione del campione. Ciò dimostra un altro principio importante: la procedura analitica stessa può causare artefatti se non viene progettata adeguatamente. [13]

Il ripiegamento e l'attività potrebbero richiedere una conferma separata

Nel caso di peptidi strutturalmente vincolati e piccole proteine, la corretta sequenza e la massa molecolare potrebbero comunque non essere sufficienti per confermare la struttura finale desiderata.

Le domande aggiuntive possono includere:

• Si sono formati i ponti disolfuro corretti?
• La molecola ha assunto la conformazione attesa?
• La ciclizzazione è completa?
• Sono presenti isomeri strutturali?
• La molecola sintetica mostra l'attività attesa in un determinato saggio sperimentale?

Nello studio sulla sintesi del BPTI sono stati utilizzati diversi metodi analitici e biofizici insieme alla valutazione dell'inibizione della tripsina. [3]

I risultati complessivi hanno supportato la coerenza del materiale sintetico a sequenza naturale con la proteina naturale rispetto ai criteri studiati.

Il test di attività risponde tuttavia a una specifica domanda funzionale.

Non sostituisce l'analisi degli inquinanti.

Attività simile in un singolo test non conferma la piena equivalenza di tutte le proprietà biologiche, strutturali o produttive.

Lo scaling della produzione cambia più della sola quantità di materiale

L'aumento della scala di produzione non consiste esclusivamente nell'aumentare proporzionalmente la quantità di tutti i reagenti.

I processi fisici possono comportarsi diversamente a scala maggiore.

Potrebbero avere un significato:

• miscelazione;
• scambio termico;
• distribuzione di reagenti;
• diffusione;
• gonfiaggio della resina;
• pressione;
• filtrazione;
• gestione dei solventi;
• precipitazione;
• solubilità dei semilavorati;
• trasporto di massa;
• le capacità del sistema di purificazione.

Questi fattori possono influenzare sia il decorso della reazione che la formazione di impurità.

La purificazione nelle fasi successive può anche diventare un collo di bottiglia dell'intera produzione.

L'aumento della velocità di sintesi ha un'importanza limitata se il sistema di purificazione non è in grado di separare efficacemente le impurità generate o di recuperare il prodotto della qualità richiesta.

In un'analisi industriale che ha coinvolto 40 processi di sintesi peptidica provenienti da 14 aziende farmaceutiche, è stato valutato il consumo di materiali durante la sintesi, la purificazione e l'isolamento. [14]

Lo studio mostra perché la valutazione della produzione deve essere condotta per l'intero processo.

Ciò non significa tuttavia che ogni fabbrica, sequenza o tecnologia di produzione raggiunga risultati identici.

La qualità della produzione è il risultato di molti elementi di controllo

Una produzione affidabile di peptidi richiede molto di più del semplice raggiungimento di un unico risultato analitico soddisfacente.

Un processo controllato di solito comprende diversi elementi correlati:

molecola bersaglio definita → materiali di partenza appropriati → sintesi controllata → purificazione controllata → campionamento adeguato → analisi convalidata o idonea allo scopo → documentazione del lotto.

La documentazione del lotto collega i risultati analitici con il materiale che è stato effettivamente prodotto.

Il certificato di analisi (COA) riassume i risultati di analisi selezionati di un determinato lotto.

Il suo valore informativo dipende da:

• del tipo di esami effettuati;
• dei metodi applicati;
• l'utilità di questi metodi;
• specifica;
• identificazione del campione;
• tracciabilità dei lotti;
• conferme che i risultati riportati si riferiscano effettivamente al materiale in questione.

Un singolo valore definito come „purezza” non può confermare autonomamente:

• completa identità molecolare;
• contenuto di peptidi;
• dell'integrità stereochimica;
• livello di residui di solventi;
• contenuto di acqua;
• la massa di antiossidanti;
• caratteristiche microbiologiche;
• pieghe;
• attività biologica;
• idoneità per uno scopo specifico.

L'insieme delle analisi appropriate dipende dall'utilizzo previsto del materiale.

I peptidi utilizzati come riferimento analitico, l'agente sperimentale utilizzato nell'esperimento cellulare e il materiale in fase di sviluppo farmaceutico possono richiedere risposte a altre domande di natura qualitativa.

Le prove analitiche devono quindi essere interpretate in un contesto ben definito, e non come una conferma universale della qualità.

La valutazione del bilancio ambientale deve comprendere l'intero processo.

La sintesi dei peptidi può richiedere grandi quantità di solventi e reagenti.

La valutazione dell’impatto ambientale dovrebbe quindi considerare molto più che solo lo stadio di assemblaggio.

Tra gli elementi importanti possono includersi:

• la preparazione dei blocchi di costruzione;
• Agenti di legatura;
• Agenti per la disinfezione;
• lavaggio;
• distacco;
• trattamento del prodotto;
• chromatografia;
• scambio dei solventi;
• isolamento;
• asciugatura;
• gestione dei rifiuti.

La riduzione dell'impatto ambientale può richiedere un miglioramento simultaneo di diversi aspetti.

Nell'analisi pubblicata sulla produzione di peptidi sono state trattate le problematiche legate sia alla sintesi che al trattamento e è stato indicato il bisogno di migliorare l'intero progetto del processo. [15]

In quanto pubblicazione prospettica, non rappresenta un confronto diretto e controllato che dimostri che una particolare tecnologia è sempre più ecocompatibile.

Similmente:

Una sintesi più rapida non significa automaticamente una sintesi più ecologica,

e la minore quantità di solventi durante la stessa sintesi non significa automaticamente un impatto inferiore dell’intero processo produttivo.

Le analisi ambientali richiedono l'utilizzo di limiti coerenti e, per quanto possibile, devono riferirsi al consumo di risorse rispetto a una determinata quantità di prodotto finale isolato e caratterizzato.

Domande frequenti

1. In che modo la sintesi dei peptidi a fase solida differisce dalla sintesi a fase liquida?

Nella sintesi a fase stazionaria, il peptido in crescita rimane legato al vettore insolubile, mentre nella sintesi classica, nel soluto, il peptido in crescita rimane disciolto e solitamente deve essere recuperato in base alle sue proprietà fisiche e chimiche. In senso più ristretto, l’LPPS disciolto in crescita presenta inoltre un marcatore solubile o un vettore che facilita la successiva separazione. Gli studi sulla sintesi marcata mostrano una strategia di unione della chimica del soluto con il recupero tramite espulsione, mentre la letteratura sulla LPPS distingue tali soluzioni sia dalla sintesi classica in soluto che dalla SPPS. Nessuna metodologia è per definizione ottimale per ogni peptidico. La differenza fondamentale riguarda il modo fisico di movimentazione e separazione del peptide in crescita durante le successive fasi della sintesi. [8] [9]

2. Perché durante la sintesi dei peptidi possono verificarsi contaminazioni?

Le contaminazioni possono verificarsi perché le reazioni previste non sempre avvengono in quantità sufficiente e altre funzioni chimiche possono partecipare alle reazioni indesiderate. L’incompatibilità completa può portare a sequenze deleterie, l’indesiderato deossigenamento può interrompere la successiva formazione della catena e alcune sequenze sono suscettibili di modifiche stereomiche, l’assorbimento di aspartimidio, l’ossidazione, la ricombinazione o i prodotti derivati dal deossigenamento. Gli studi sulla sintesi Fmoc e le analisi strutturali dei contaminanti peptidici sinteticamente prodotti documentano diversi esempi di questo tipo.[11][12] La frequenza e l’importanza dei singoli contaminanti dipendono dalla sequenza e dal processo, pertanto l’automazione della sintesi non deve essere considerata come un assoluto assenza di errori chimici.

3. Quale ruolo svolge la resina nella sintesi dei peptidi?

La resina mantiene un peptide in crescita, mentre i reagenti solubili e molte delle sostanze secondarie possono essere eliminate tra le fasi successive della sintesi. Ciò semplifica notevolmente la ripetizione della catena, ma la resina non è solo un dispositivo meccanico. La sua espansione, il grado di aderenza, l’architettura del polimero, la compatibilità con i solventi e la disponibilità dei siti di reazione possono influire sulla efficacia del raggiungimento degli agenti reattivi al peptide collegato. In studi utilizzando un reattore con fase variabile, è stato monitorato il comportamento della resina durante l’analisi dell’aggregazione e l’efficienza di legame. [4] Questo monitoraggio non elimina gli errori della sequenza, ma mostra perché lo stato fisico della resina può essere una variabile processuale importante.

4. Qual è il ruolo della resina Wanga nella sintesi dei peptidi?

I supporti di tipo Wang sono comunemente associati alla preparazione di peptidi rilasciati dopo un adeguato scissione del C-terminale in acido carbossilico. Tuttavia, il prodotto finale dipende dal ligatore, dall'architettura del supporto e dalla chimica di scissione utilizzata, e non solo dalla denominazione della resina. Gli studiosi hanno anche presentato un metodo specializzato per trasformare il materiale peptidil-Wang-TentaGel in idrazidi peptidici che possono servire come prodotti intermedi sintetici utili. [5] La reazione alternativa non cambia il significato del tradizionale scissione della resina Wang. Tuttavia, dimostra perché durante la previsione del prodotto è necessario analizzare l'intero sistema di supporto e le condizioni della reazione.

5. La SPPS costruisce il peptide dal lato N o dal lato C?

La SPPS classica inizia solitamente con l'accoppiamento della parte C-terminale alla molecola portante, dopodiché il filamento viene allungato verso il N-terminale. Questo è il senso opposto rispetto all'allungamento standard del filamento nella ribosomia, dove il proteina cresce aggiungendo ulteriori amminoacidi al C-terminale. La sintesi di BPTI è un esempio di utilizzo di blocchi strutturali e del portatore protetti per la successiva separazione, purificazione e frazionamento del prodotto. [3] Tuttavia, esistono strategie chimiche specializzate per la chimica peptidica che utilizzano altre soluzioni, pertanto l'allungamento da C- a N-terminale deve essere considerato un approccio SPPS classico e non una regola assoluta per tutte le metodologie di sintesi.

6. Perché sono necessarie le squadre di protezione?

Le amminoacidi spesso contengono diverse gruppi funzionali reattivi. I gruppi di protezione impediscono temporaneamente la reazione in determinati punti, lasciando il luogo corrispondente disponibile in un particolare stadio della sintesi. Ciò aiuta a controllare l'ordine e il modo in cui vengono legati i residui. Senza una corretta protezione, le reazioni competitive potrebbero portare alla formazione di miscele complesse o prodotti con strutture modificate. Le ricerche relative alla formazione dell'aspartimide hanno dimostrato che una modifica della chimica del gruppo di protezione sulla carbossilazione può limitare una reazione secondaria importante nelle sequenze analizzate. [2] I gruppi di protezione non garantiscono un esito ottimale della sintesi, ma forniscono una controlla chimica selettiva che deve rimanere coerente con tutti gli stadi importanti del processo.

7. Come differiscono Fmoc e Boc?

L’Fmoc e il Boc sono gruppi temporanei comunemente utilizzati per proteggere il gruppo amminico, ma reagiscono anche a altre condizioni chimiche. L’Fmoc è solitamente eliminato in un ambiente acido, mentre il Boc è sensibile agli acidi. Questa differenza influisce sul modo in cui vengono legati alla protezione dei cateni laterali, ai ligandi e agli altri stadi della sintesi. La sintesi basata sull’Fmoc è ampiamente utilizzata nella SPPS moderna, ma gli studi hanno anche evidenziato la possibilità di reazioni secondarie sequenziali dipendenti dalla sequenza nelle suddette condizioni. [11] In pratica, quindi, è più utile confrontare le strategie di protezione complete e verificarne la conformità con la sequenza in questione piuttosto che considerare esclusivamente le denominazioni delle due protezioni.

8. Cosa significa la protezione ortogonale?

La protezione ortogonale significa che un gruppo di protezione può essere eliminato in condizioni in cui un altro gruppo di protezione necessario rimane sufficientemente stabile per consentire la continuazione della sintesi. Ciò consente di rivelare diversi siti reattivi in determinati stadi. Questa concezione è fondamentale durante la sintesi controllata di peptidi complessi. Tuttavia, la protezione ortogonale dipende dalle condizioni e non è assoluta: l'esposizione ripetuta, la natura della sequenza e i parametri della reazione possono ancora portare a reazioni secondarie. La ricerca su metodi alternativi per proteggere i gruppi carbossilici mostra come la strategia di protezione possa essere modificata per controllare la chimica difficile della peptidica. [2]

9. Cos'è una sequenza delecettiva?

La sequenza delecificante è un peptide privo di una o più restrizioni presenti nella sequenza di destinazione prevista. Può essere formata quando l'azione di legame dell'aminoacido non avviene completamente, ma il catenaccio non attivato rimane attaccato al supporto e partecipa ai cicli successivi. Poiché il catenaccio non funzionante rimane ancora legato alla matrice, il normale lavaggio non è necessario per eliminarlo. I test di monitoraggio SPPS in tempo reale indicano la formazione incompleta di legami amidici come un problema processuale importante. [4] La sequenza delecificante è quindi un problema legato alla struttura e all'identità del prodotto, e non solo alle restrizioni dell'attivo.

10. Possono due contaminanti peptoidi avere la stessa massa molecolare?

Sì. Diverse strutture molecolari possono avere una massa nominale identica o indistinguibile. Per questo motivo, la stessa conformazione della massa non conferma l’identità completa della particella. Negli studi sul peptide sintetico che è substrato della renina, sono stati identificati componenti isotopici di contaminanti in cui le modifiche si sono verificate in diverse posizioni. La dereazionalizzazione e la spettrometria di massa tandem hanno fornito ulteriori informazioni strutturali. [12] Questo esempio dimostra perché la conformazione osservata della massa non può da sola confermare la sequenza corretta, la compatibilità, la stereochimica o l’assenza di isomeri strutturalmente simili.

11. Cos’è l’epimerizzazione e la racemizzazione nella sintesi dei peptidi?

L’epimerizzazione e la racemizzazione riguardano alterazioni indesiderate della configurazione stereochimica. Possono verificarsi senza alterazione della sequenza amminoacidica nominale o della massa molecolare, pertanto il semplice calcolo della massa può non rivelare alcuna differenza strutturale. In studi di sintesi Fmoc supportata da microonde, sono stati identificati residui suscettibili di alterazioni stereochimiche e si è dimostrato che la modifica delle condizioni del processo può limitare tali processi. [11] Il rischio dipende dal blocco strutturale, dalla sequenza e dalle condizioni del processo. La qualità stereochimica richiede quindi metodi analitici in grado di valutare la configurazione e non può essere dedotta esclusivamente in base alla massa molecolare.

12. Qual è la formazione dell'aspartimide?

La formazione di aspartimidio è una reazione indesiderata associata a determinati segmenti contenenti asparaginina. La formazione di un semiconduttore ciclico può portare a prodotti con una struttura ramificata o stereochimica alterata, riducendo la produttività e rendendo più difficile la purificazione. Gli studiosi hanno analizzato strategie di protezione alternative progettate per ridurre questa reazione nei peptidi e nelle proteine selezionati. [2] I risultati non indicano una soluzione universale per tutte le sequenze contenenti asparaginina. Tuttavia, dimostrano perché la progettazione della sintesi e delle strategie di controllo delle contaminazioni deve tenere conto della specificità chimica della sequenza in questione.

13. La purezza elevata dell'HPLC conferma l'identità corretta del peptide?

No. La purezza dell'HPLC descrive la provetta all'interno di un particolare capitolo cromatografico, del rivelatore utilizzato e del modo di analizzare i dati. Una percentuale elevata di superficie principale del campione può essere un valido indizio che la provetta è dominata da un singolo componente cromatograficamente separato, ma non conferisce da sola l'identità molecolare completa. Le contaminazioni concomitanti, le stereoizomerie e altre varianti possono richiedere tecniche aggiuntive. Nell'analisi cromatografica dei peptidi, è stato utilizzato un processo appositamente progettato che ha incluso anche le variazioni stereomiche che si verificano durante la preparazione della provetta. [13] Pertanto, l'identità e la purezza devono essere considerate questioni analitiche correlate ma distinte.

14. La qualità del prodotto purificato significa la stessa cosa della purezza?

No. La produttività del prodotto purificato o isolato indica la quantità di materiale finale recuperato rispetto alla quantità iniziale o teorica definita. La purezza invece descrive la composizione del materiale recuperato secondo un metodo analitico specificato. La sintesi può portare a ottenere una quantità relativamente piccola di prodotto di elevata purezza oppure una grande quantità di materiale greggio contenente una significativa quantità di impurità. Negli studi di sintesi automatica a flusso continuo, la purezza del prodotto greggio e la produttività dopo l'isolamento sono riportate separatamente. [7] La separazione di questi parametri evita di trattare erroneamente un valore elevato di uno di essi come prova di un altro valore elevato.

15. È possibile produrre peptidi lunghi unendo frammenti più brevi?

Sì. Nella strategia frammentata, i segmenti peptidici più brevi possono essere preparati separatamente e poi combinati mediante una chimica appropriata. La ligazione chimica non proteica è stata un esempio importante in cui i segmenti peptidici non proticati sono stati combinati in modo da indurre l’associazione naturale dello scheletro peptidico e quindi si è ottenuto un proteina deformata. [10] Ciò non significa che qualsiasi segmento peptidico possa legarsi spontaneamente. È necessario considerare la struttura dei segmenti, la chimica della legatura, la scelta del punto di legatura, la solubilità, la stereochimica e i requisiti di purificazione. La costruzione dei segmenti è quindi una strategia alternativa per progettare la sintesi, non una soluzione automatica ai problemi associati ai peptidi lunghi.

16. La sintesi automatizzata più veloce elimina la necessità di purificazione?

No. La sintesi automatizzata più veloce o basata su flussi riduce il tempo dei singoli passaggi della sintesi, ma non dimostra che ogni molecola risultante abbia la struttura prevista. Negli studi sulla sintesi a flusso rapido, la materia prima è stata ancora caratterizzata e applicata una purificazione successiva, e nelle successive opere relative all’automazione, la purezza della materia prima e il rendimento dopo l’isolamento sono stati confrontati separatamente. [6] [7] I buoni risultati del sistema per le sequenze studiate non garantiscono risultati identici per ogni nuovo target. La sintesi accelerata deve ancora essere combinata con una purificazione appropriata, la conferma dell’identità, l’analisi delle impurità e la caratterizzazione finale.

17. Perché aumentare la scala della produzione è più complicato che preparare una produzione maggiore?

L’aumento della scala modifica le condizioni fisiche e chimiche, e non solo la quantità di materiale. Il mescolamento, il trasferimento di calore, la compressione della resina, la distribuzione degli additivi, la pressione, la filtrazione, la manipolazione dei solventi, la solubilità dei semi prodotti e le possibilità del sistema di purificazione possono comportarsi in modo diverso con una maggiore quantità di produzione. Nell’analisi industriale, 40 processi peptidici sono stati valutati separatamente: la sintesi, il trattamento e l’isolamento durante l’analisi del consumo di materiale. [14] I risultati dimostrano perché la produzione deve essere considerata un processo completo. Un metodo scalabile deve portare ripetutamente a ottenere un materiale caratterizzato in tutti i suoi stadi, e non solo una maggiore quantità di peptido grezzo.

18. Il peptide è pronto subito dopo la formazione della sequenza corretta?

Non necessariamente. La formazione del reticolo della sequenza crea lo scheletro della stessa solo nella misura in cui i dati analitici e il processo lo confermano. A seconda della molecola, potrebbero ancora essere necessarie operazioni di disidratazione, deprotonazione, ciclicazione, ossidazione, formazione di ponti disiarici, folding, coniugazione, purificazione e caratterizzazione. La sintesi di BPTI rappresenta un buon esempio di processo in cui, dopo la formazione della sequenza lineare, seguono la purificazione e la formazione di una struttura foderata contenente ponti disiarici. [3] Pertanto, il termine „peptido pronto” dovrebbe riferirsi alla forma molecolare richiesta nel contesto scientifico specifico e non solo alla fine del processo di aggiunta di aminoacidi.

19. La massa molecolare corretta conferma la sequenza corretta del peptide?

No. La massa molecolare è un valido indizio, ma non può da sola confermare la sequenza completa né la struttura molecolare. Le strutture izoarie possono avere la stessa massa, mentre le differenze sterechimiche potrebbero non causare alcuna variazione della massa molecolare. Le ricerche sui contaminanti peptoidi sintetici hanno dimostrato che la distinzione strutturalmente fra componenti diversi può richiedere spettrometria di massa tandem e ulteriori analisi. [12] In caso di domande relative all’integrità sterechimica, possono essere necessarie anche metodologie chirali. [13] La massa molecolare deve quindi essere considerata come uno degli elementi di valutazione dell’identità, e non come la sua conferma completa.

20. Perché il trattamento di depurazione deve essere considerato una parte della produzione del peptido, e non solo un additivo finale?

La purificazione è determinante per determinare se il peptido finale possa essere efficacemente separato dalla sequenza delle molecole di partenza, dai prodotti secondari, dalle restanti sostanze reattive, dalle contaminazioni strutturalmente simili e da altri componenti prodotti durante la sintesi. Una metodologia che consenta di produrre rapidamente grandi quantità di materiale greggio può continuare a essere poco pratico se non è possibile recuperare efficacemente il prodotto finale richiesto. Per questo motivo, le analisi industriali dei processi peptidici includono insieme la sintesi, la purificazione e l'isolamento. [14] L'efficienza della produzione deve essere valutata in definitiva in base alle quantità e alle proprietà del materiale finale isolato, e non solo alla velocità di sintesi.

Restrizioni nel confronto delle metodologie di sintesi dei peptidi

Durante l’interpretazione dei risultati dei test che confrontano le tecnologie di produzione dei peptidi, è necessario tenere conto di alcune importanti limitazioni.

Innanzitutto, la sequenza influenza fortemente la difficoltà della sintesi. Una metodologia che funziona per un singolo peptide non deve necessariamente funzionare allo stesso modo per un altro. L'aggregazione, l'idrofobicità, la composizione aminoacidica, la lunghezza, la tendenza a formare strutture secondarie e la suscettibilità alle reazioni secondarie possono cambiare il comportamento del processo. [1] [4]

In secondo luogo, la purezza del materiale greggio, la resa dopo l'isolamento, la purezza finale e la concentrazione di peptidi sono diversi parametri. Confrontare i metodi basandosi esclusivamente su uno di essi può fornire un'immagine incompleta dell'efficienza della produzione. [7]

In terzo luogo, la rapida produzione del filato non significa una produzione rapida dell’intero materiale. Lo scissione, la pulizia, l’isolamento, la finitura strutturale, le analisi e la documentazione influiscono anche sul tempo complessivo di produzione. [6] [7]

Quarto, la purezza analitica dipende dalla metodologia utilizzata. L'HPLC, la spettrometria di massa, la spettrometria di massa tandem e l'analisi chirale rispondono a domande diverse. Un unico risultato analitico non deve confermare l'identità strutturale completa. [12] [13]

Quinto, la scala influenza il comportamento del processo. I risultati della sintesi in laboratorio non possono essere automaticamente trasferiti alla produzione industriale senza valutare il processo di miscelazione, il trasporto della massa, le possibilità di purificazione, il consumo di materiali e altri fattori dipendenti dalla scala. [14]

Sesto, i confronti economici storici possono perdere la loro attualità nel tempo. I costi degli agenti di reagire, il livello di automazione, le tecnologie di espressione, l’equipaggiamento per la purificazione, il recupero dei solventi e le infrastrutture produttive continuano a evolversi. Le analisi di costo più vecchie possono ancora avere importanza scientifica, ma non devono più riflettere l’economia attuale del mercato. [1]

Sesto, i confronti ambientali richiedono limiti coerenti per l’analisi. La valutazione del consumo di solventi durante la produzione stessa del filato, pur ignorando la purificazione e l’isolamento, può portare a conclusioni fuorvianti riguardo al bilanciamento del processo. [14] [15]

Infine, il nome della stessa metodologia non definisce la qualità del prodotto. L'SPPS, la sintesi in soluzione, l'LPPS, la ligazione dei frammenti e l'espressione biologica possono portare a ottenere un materiale di alta qualità se il processo è stato progettato e controllato correttamente. Tuttavia, nessuna di queste metodologie garantisce automaticamente la corretta identità, purezza, stereochimica, conformazione o utilità per un particolare utilizzo.

Sintesi

La sintesi dei peptidi può essere meglio compresa come un processo controllato di produzione di molecole, e non semplicemente come la formazione di legami peptidici.

L'obiettivo è costruire una determinata sequenza di amminoacidi, controllando allo stesso tempo il modo in cui le restanti parti si collegano, la chimica dei gruppi di protezione, la stereochimica, le reazioni secondarie e tutti gli altri requisiti strutturali.

La sintesi dei peptidi a fase solida mantiene il filamento in crescita su un supporto insolubile, rendendo così le fasi ripetute di legame e lavaggio particolarmente adatte all’automazione. Tuttavia, i vantaggi associati alla ripetibilità di questa procedura non eliminano problemi come reazioni incomplete, aggregazione, sequenze deleciche o reazioni secondarie dipendenti dalla sequenza. [4] [6] [7]

La sintesi classica in soluzione mantiene le frazioni peptoidi nella fase liquida e può garantire una maggiore flessibilità nell’isolamento e nella caratterizzazione dei singoli prodotti intermedi. Tuttavia, la separazione ripetuta e la diminuzione della solubilità possono rappresentare gravi limitazioni.

Le metodologie di sintesi in fase liquida con marcatori solubili cercano di combinare la chimica della soluzione con strategie progettate per il recupero del materiale. Possono quindi rappresentare una possibilità aggiuntiva in caso di sequenze e problemi di produzione per i quali la SPPS classica non è ottimale. [8] [9]

Le molecole più lunghe o particolarmente complesse possono anche essere preparate mediante la sintesi di frammenti, tra cui la ligazione chimica nativa, invece di affidarsi esclusivamente all'aggiunta continua di ulteriori residui aminoacidici.[10]

Indipendentemente dalla metodologia scelta per la sintesi, l’efficienza dell’accoppiamento e la chimica dei gruppi di protezione rimangono fondamentali poiché piccole inefficienze e reazioni secondarie possono accumularsi durante le fasi successive della sintesi. La formazione di aspartimidio, le sequenze deleciche e le modifiche stereospettriche dimostrano perché la sequenza stessa non descrive tutto ciò che può essere prodotto durante il processo. [2] [11] [12]

Il lavoro non termina nemmeno con il deposito del nastro.

La purificazione determina se il prodotto finale può essere separato dagli altri componenti.

Successivamente, le metodologie analitiche appropriate rispondono a domande specifiche riguardanti l'identità, la purezza, la composizione, la stereochimica, la conformazione e, se pertinente, l'attività funzionale. [3] [12] [13]

L’aumento della scala produttiva introduce ulteriori aspetti relativi al trasporto della massa, alla conservazione della resina, all’utilizzo dei solventi, alla filtrazione, alle possibilità di purificazione, alla ripetibilità del processo e al suo impatto ambientale. Per questo motivo, la valutazione industriale del processo dovrebbe includere insieme la sintesi, il trattamento e l’isolamento, anziché concentrarsi esclusivamente sulla velocità di legame. [14] [15]

La regola più importante è la seguente:

La produzione efficace di un peptide richiede il controllo dell’intero processo, dalla progettazione molecolare e dalla formazione dei legami fino al processo di purificazione e alla caratterizzazione strutturale. L’ottenimento di un filamento con la massa nominale prevista o un alto picco cromatografico principale rappresenta una prova valida, ma nessuno di questi parametri in sé non conferma la completezza dell’identità molecolare né la qualità del processo produttivo.

Disclaimer

L'articolo ha esclusivamente carattere educativo e informativo. Descrive le norme generali della chimica dei peptidi, la sintesi a fase stazionaria, la sintesi in soluzione e in fase liquida, le strategie dei gruppi di protezione, l'associazione, la purificazione, le caratteristiche analitiche, i processi produttivi e gli esempi tratti da studi pubblicati. Non è un protocollo di laboratorio, una istruzione di produzione, una consulenza medica, una guida sulla dosaggio o l'assunzione, né un certificato di qualità per alcun prodotto peptidico specifico. I risultati sperimentali devono essere interpretati nel contesto della sequenza, delle metodologie utilizzate, della scala del processo, delle tecniche analitiche e delle limitazioni dei singoli studi.

Riferimenti

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