Sintesi dei peptidi: metodo in fase solida, in soluzione e metodi di produzione

La sintesi dei peptidi è un processo controllato di creazione di catene di amminoacidi con una sequenza specifica. Nella sintesi chimica gli amminoacidi selezionati vengono uniti mediante legami peptidici, pur controllando al contempo altri gruppi reattivi presenti in queste molecole. L'obiettivo non è quindi semplicemente la combinazione degli amminoacidi, ma l'ottenimento di una struttura molecolare specifica con una determinata sequenza, stereochimica, struttura delle estremità della catena e – se richiesto – ulteriori caratteristiche strutturali.

Tra i metodi principali vi sono la sintesi peptidica in fase solida (SPPS), la classica sintesi in soluzione e i metodi più recenti di sintesi peptidica in fase liquida (LPPS), che utilizzano supporti solubili o etichette molecolari. I laboratori di ricerca e gli impianti di produzione possono anche combinare diversi approcci, preparando frammenti più brevi separatamente e poi unendoli tra loro, oppure utilizzare l'espressione biologica, se risulta più adatta per una determinata sequenza.

Il confronto tra la sintesi chimica e l'espressione batterica di polipeptidi costituiti da 20-40 residui amminoacidici mostra un principio importante: la scelta pratica del metodo di produzione dipende dalla molecola specifica, dalla sua sequenza, dalla propensione all'aggregazione, dalle modifiche richieste, dalla scala di produzione e dai requisiti analitici. [1]

L'ottenimento della sequenza amminoacidica desiderata è solo una delle fasi della produzione del peptide.

L'intero processo può comprendere:

progettazione della sequenza → preparazione dei blocchi costitutivi → protezione dei gruppi funzionali → accoppiamento → rimozione dei gruppi protettivi → assemblaggio della catena → scissione o unione dei frammenti → modellamento strutturale finale → purificazione → conferma dell'identità → analisi delle impurità → determinazione del contenuto → caratterizzazione finale.

Per alcuni peptidi sono necessari anche passaggi aggiuntivi, come la ciclizzazione, la formazione di ponti disolfuro, il folding, la coniugazione o altre modifiche chimiche.

Per questo motivo, il corretto assemblaggio della catena non significa automaticamente che il materiale finale possieda la giusta identità, purezza, stereochimica, conformazione, stabilità o altre caratteristiche richieste.

Cos'è la sintesi dei peptidi?

Creazione di una specifica sequenza amminoacidica

Peptide è costituito da residui di amminoacidi legati da legami peptidici.

Lo scopo della sintesi peptidica è quello di creare questi legami in un ordine predeterminato, spesso controllando contemporaneamente:

• tipi di aminoacidi;
• sequenza degli amminoacidi;
• stereochimica;
• strutture dell'estremità N;
• strutture di fine C;
• modifiche alle catene laterali;
• distribuzione dei ponti bisolfurici;
• ciclizzazione;
• altre caratteristiche strutturali richieste.

La sequenza è fondamentale, poiché un identico corredo amminoacidico può portare alla formazione di molecole diverse se gli amminoacidi si susseguono in un ordine differente.

Affermare che una determinata molecola sia „un peptide composto da cinque aminoacidi” fornisce quindi pochissime informazioni sulla sua struttura effettiva. Per descrivere correttamente una molecola, è necessario conoscere il tipo di aminoacidi, la loro sequenza, la stereochimica, i gruppi terminali ed eventuali ulteriori modificazioni.

Due peptidi possono quindi avere esattamente la stessa composizione amminoacidica e tuttavia essere strutture molecolari differenti.

Ulteriori differenze possono derivare da modifiche delle estremità della catena, dalla presenza di ponti disolfuro, da uno scheletro ciclico, da variazioni nelle catene laterali o da una diversa configurazione stereochimica.

La sintesi chimica dei peptidi utilizza solitamente aminoacidi i cui gruppi reattivi sono stati protetti in modo selettivo.

I gruppi protettivi temporanei consentono la creazione di uno specifico legame chimico desiderato, limitando al contempo le reazioni competitive in altri punti della molecola.

Nelle successive fasi previste della sintesi, questi gruppi vengono rimossi o modificati.

Una reazione controllata anziché una fusione spontanea

Nelle descrizioni chimiche di base, la formazione del legame peptidico viene spesso rappresentata come una reazione di condensazione, in cui due amminoacidi si uniscono con la formazione complessiva di una molecola d'acqua.

Tale equazione descrive il bilancio generale della reazione.

Tuttavia, non bisogna assimilarlo al modo in cui viene effettuata in pratica la sintesi peptidica controllata.

La semplice miscelazione di aminoacidi liberi non consentirebbe di determinare in modo attendibile:

• quale gruppo amminico deve reagire;
• quale gruppo carbossilico deve reagire;
• quale aminoacido deve essere il primo;
• che deve trovarsi per secondo;
• se le catene laterali inizieranno a reagire;
• la stereochimica verrà conservata?;
• se non si formeranno numerosi prodotti indesiderati.

Nella sintesi chimica pratica si ricorre quindi a strategie controllate di attivazione e protezione dei gruppi funzionali.

Il gruppo derivante dal gruppo carbossilico viene solitamente attivato in modo tale da poter reagire efficacemente con il gruppo amminico prescelto. I gruppi protettivi, l’ordine di reazione, la chimica del supporto, gli agenti di accoppiamento, l’ambiente del solvente e i metodi di isolamento contribuiscono insieme a orientare la reazione verso il prodotto desiderato.

Una sintesi efficace del peptide richiede quindi il controllo sia delle reazioni chimiche che devono avvenire, sia di quelle che devono essere evitate.

Un buon esempio è la formazione dell'aspartimmide.

I ricercatori hanno messo a punto un metodo alternativo per la protezione del gruppo carbossilico, con l'obiettivo di limitare questa reazione collaterale problematica durante la sintesi del peptide. [2]

Lo studio evidenzia un principio più ampio della chimica dei peptidi: prevenire trasformazioni molecolari indesiderate può essere importante tanto quanto creare il giusto legame peptidico.

Quando si può considerare un peptide pronto?

Il completamento della creazione dello scheletro peptidico lineare non significa sempre la fine dell'intera sintesi.

A seconda della molecola di destinazione, una volta assemblata la catena potrebbero essere necessarie ulteriori fasi.

Possono includere:

• deprotezione totale;
• cleψamento del peptide dal supporto solido;
• rimozione dei segnalini temporanei;
• ciclizzazione;
• ossidazione;
• formazione di ponti disolfuro;
• piega;
• coniugazione;
• modifica delle estremità della catena;
• purificazione;
• caratteristica analitica.

Alcuni peptidi richiedono relativamente poche modifiche strutturali aggiuntive dopo l'assemblaggio della catena.

Per altri, le fasi successive sono fondamentali.

Un buon esempio è la sintesi dell'inibitore della tripsina pancreatica bovina (BPTI). I ricercatori hanno assemblato la sequenza lineare, purificato il materiale e quindi ottenuto la struttura ripiegata contenente ponti disolfuro. Sulla base delle analisi e dei confronti funzionali presentati nello studio, il materiale finale con sequenza naturale corrispondeva alla proteina naturale in termini di parametri studiati. [3]

Questo esempio mostra la differenza tra l'assemblaggio dello scheletro peptidico e l'ottenimento della forma molecolare finale completamente caratterizzata.

Il metodo che permette di ottenere una sequenza lineare corretta non conferma automaticamente:

• del corretto piegamento;
• del corretto posizionamento dei ponti disolfuro;
• attività biologica;
• stabilità;
• profilo di inquinamento;
• idoneità a un determinato scopo.

Ognuna di queste questioni richiede prove separate.

Sintesi chimica, espressione biologica e metodi combinati

Nella sintesi chimica dei peptidi, i blocchi molecolari precedentemente preparati vengono uniti in reazioni di laboratorio controllate.

L'espressione biologica utilizza invece il macchinario cellulare per produrre la sequenza amminoacidica codificata. Successivamente, il materiale deve essere recuperato, purificato e, se necessario, sottoposto a un'ulteriore lavorazione.

Entrambi i metodi possono portare all'ottenimento di peptidi o polipeptidi, ma comportano diverse possibilità e limitazioni.

La sintesi chimica può essere particolarmente utile quando sono necessari:

• amminoacidi non standard selezionati;
• modificazioni chimiche in punti specifici;
• specifiche strutture terminali della catena;
• traccianti isotopici;
• modificazioni dello scheletro peptidico;
• altre caratteristiche difficili da ottenere tramite la normale espressione biologica.

L'espressione biologica può essere interessante per sequenze più lunghe adeguate o per specifiche strategie di marcatura, ma non elimina i problemi che si presentano nelle fasi successive della produzione.

Si devono ancora considerare il recupero del materiale, il ripiegamento, la lavorazione, i contaminanti derivati dall'ospite, la purificazione e la caratterizzazione analitica.

Nessuna delle due/dei metodi è quindi universalmente il migliore.

Nel confronto di polipeptidi costituiti da 20-40 residui amminoacidici, sia la lunghezza della sequenza sia la sua propensione all'aggregazione hanno influenzato i risultati della sintesi in fase solida e dell'espressione batterica. [1]

Queste osservazioni supportano un approccio in cui il metodo di produzione viene scelto in base alla specifica molecola.

I dati storici relativi a prestazioni, costi, attrezzature e tempi di produzione non devono essere considerati come valori contemporanei universali, poiché le tecnologie, i reagenti, l'automazione, i metodi di purificazione e l'economia della produzione cambiano con lo sviluppo tecnologico.

Sintesi peptidica in fase solida

La catena in crescita è legata a un supporto insolubile

Nella sintesi dei peptidi in fase solida (SPPS), la catena peptidica in crescita rimane legata a un supporto insolubile durante i successivi cicli di sintesi.

Il supporto è più comunemente una resina polimerica funzionalizzata.

Il linker, ovvero il connettore, lega il peptide al supporto e influenza, tra le altre cose, le modalità di successivo rilascio della catena finita e il tipo di gruppo terminale ottenuto.

Uno dei principali vantaggi pratici dell'SPPS è la più facile separazione del materiale.

Al termine di una determinata fase della reazione, i reagenti solubili e molti sottoprodotti solubili possono essere rimossi mediante lavaggio, mentre il peptide in crescita rimane legato alla fase solida.

Grazie a ciò, dopo l'aggiunta di ciascun amminoacido successivo, non è necessario isolare e purificare il peptide in crescita come composto libero e separato.

Questa comodità può tuttavia portare a un importante malinteso.

Il lavaggio della resina non significa che tutti i peptidi anomali siano stati rimossi.

Se la catena legata alla resina non reagisce durante una fase di accoppiamento, può comunque rimanere sul supporto.

Nei cicli successivi potrebbe reagire nuovamente e allungarsi ulteriormente.

Di conseguenza, può formarsi una sequenza di delezione, ovvero una molecola che differisce dal peptide bersaglio per l'assenza di uno o più residui amminoacidici.

Catene legate alla resina, chimicamente modificate in modo simile o non completamente sbloccate, possono partecipare alle fasi successive della sintesi.

L'SPPS semplifica quindi la separazione delle sostanze solubili dal materiale legato alla resina.

Tuttavia, non garantisco la perfetta corrispondenza della sequenza.

Il ciclo ripetuto di sblocco e innesto

La tipica sintesi peptidica in fase solida (SPPS) a tappe prevede la ripetizione di tre operazioni fondamentali:

disinserimento → innesto → lavaggio.

Per prima cosa viene svelato il gruppo amminico reattivo situato all'estremità della catena in crescita.

Successivamente, un altro amminoacido protetto viene legato alla catena.

I reagenti solubili, l'eccesso di amminoacidi e molti prodotti di reazione vengono rimossi prima dell'inizio del ciclo successivo.

La ripetizione di questo processo consente di costruire il peptide un residuo amminoacidico alla volta.

Nella SPPS classica, il residuo C-terminale viene solitamente legato per primo al supporto, e successivamente la catena viene allungata verso l'estremità N-terminale.

Questo differisce dalla sintesi proteica ribosomale standard, durante la quale amminoacidi successivi vengono aggiunti all'estremità C-terminale della catena in crescita.

La sequenza finale degli amminoacidi può tuttavia essere identica, nonostante la direzione e la chimica del processo di ripiegamento siano diverse.

Il termine „ciclo” non deve essere inteso come un unico set universale di condizioni di reazione adatto a ogni residuo e a ogni sequenza.

Il decorso della reazione può dipendere da:

• strategie dei gruppi di protezione;
• del tipo di amminoacido;
• delle condizioni spaziali intorno al luogo della reazione;
• del tipo di resina;
• collegherà;
• lunghezze della catena;
• aggregazione;
• del solvente;
• chimica di accoppiamento;
• comportamento strutturale del peptide in crescita.

Una reazione che procede facilmente all'inizio della sintesi può diventare molto più difficile in una fase successiva.

Per questo motivo il monitoraggio del processo rimane fondamentale anche nei sistemi altamente automatizzati.

Perché le proprietà della resina sono importanti?

Il supporto fisso non è un semplice supporto passivo.

Le sue proprietà fisiche e chimiche possono influenzare direttamente il corso della reazione.

Uno dei parametri importanti è il gonfiore.

Se la resina si gonfia correttamente nell'ambiente di solvente scelto, i reagenti possono raggiungere più facilmente i siti reattivi distribuiti in tutta la struttura del polimero.

Un gonfiore insufficiente o alterazioni della struttura della resina possono limitare questo accesso.

Potrebbero avere un'importanza anche:

• densità di impianto;
• architettura dei polimeri;
• struttura del linker;
• compatibilità con i solventi;
• stabilità meccanica;
• porosità;
• proprietà diffusive;
• interazioni tra le catene peptidiche in crescita.

Con l'aumentare della lunghezza del peptide, le singole catene possono anche interagire tra loro.

L'aggregazione sulla resina può limitare l'accesso ai siti reattivi e portare a un accoppiamento incompleto o a una deprotezione incompleta.

Ciò significa che una sequenza che si comporta correttamente all'inizio della sintesi può diventare sempre più difficile man mano che la catena si allunga.

I ricercatori hanno sviluppato un reattore a flusso a letto variabile che ha consentito di monitorare il gonfiaggio della resina sulla base di misurazioni correlate alla pressione. [4]

Lo studio si è concentrato sull'aggregazione sulla resina e sulla formazione incompleta di legami come problemi di processo che, in altre condizioni, potrebbero essere difficili da osservare direttamente durante la sintesi.

Ciò dimostra che il monitoraggio del comportamento fisico del supporto può fornire informazioni che vanno oltre la semplice registrazione dei reagenti aggiunti.

A cosa serve la resina Wang?

La chimica dei linker di tipo Wang è ampiamente utilizzata nella SPPS quando, dopo il distacco del peptide, si desidera un C-terminale sotto forma di acido carbossilico.

Il peptide è legato tramite un legame di natura esterea, che può essere successivamente scisso in condizioni adeguate.

Si possono scegliere altri sistemi di linker quando è necessaria una diversa struttura del C-terminale, ad esempio un ammide.

Vale la pena distinguere la chimica del linker dall'intero vettore fisico.

I linker di tipo Wang correlati possono essere introdotti in diverse architetture polimeriche.

Tali materiali non devono necessariamente avere identici:

• proprietà di gonfiamento;
• capacità;
• compatibilità con i solventi;
• proprietà meccaniche;
• comportamenti durante la reazione.

Gli studi che utilizzano supporti di peptidyl-Wang-TentaGel hanno dimostrato un metodo alternativo specializzato per la preparazione di idrazidi peptidiche, che sono intermedi utili nella chimica dei peptidi. [5]

Ciò non significa che il distacco standard dalla resina di Wang porti solitamente alla formazione di idrazidi peptidiche.

Dimostra invece un principio importante:

supporto + linker + condizioni di reazione + chimica di scissione determinano congiuntamente il prodotto ottenuto.

Sintesi SPPS in regime discontinuo e a flusso

La SPPS può essere condotta in classici reattori discontinui o in sistemi in cui i reagenti fluiscono attraverso un reattore contenente il supporto solido.

I sistemi a flusso possono consentire un rapido scambio di reagenti e un controllo più accurato dell'ambiente chimico che circonda la resina.

Uno studio del 2014 ha presentato una rapida sintesi peptidica in flusso con monitoraggio continuo ed è stata applicata a diversi peptidi e a una piccola proteina. [6]

In un successivo studio automatizzato è stata descritta una sintesi di catene notevolmente più rapida, ottenendo per gli esempi analizzati una purezza del prodotto grezzo e una resa dopo l'isolamento comparabili con la classica sintesi batch. [7]

Questi studi mostrano le capacità di specifici sistemi in determinate condizioni.

Tuttavia, non dimostrano che ogni peptide possa essere prodotto con la stessa rapidità e con la stessa qualità.

Il tempo necessario per produrre un peptide include anche molto di più della sola sintesi della catena.

L'intero processo può includere:

• preparazione dei reagenti;
• preparazione della resina;
• accoppiamento;
• disattivazione della sicura;
• lavaggio;
• distacco;
• lavorazione del prodotto;
• purificazione;
• rimozione dei solventi;
• definizione finale della struttura;
• esami di laboratorio;
• documentazione.

La rapida creazione di fasci è quindi solo uno degli elementi dell'efficienza produttiva complessiva.

Sintesi in fase liquida

Che cosa significa questo termine?

L'espressione „sintesi peptidica in fase liquida” può essere usata con diversi significati.

In senso lato, può semplicemente significare la sintesi peptidica in soluzione.

Tuttavia, nella letteratura più specialistica si distingue spesso tra:

1. classica sintesi dei peptidi in soluzione;
2. sintesi dei peptidi in fase solida;
3. i metodi LPPS più recenti, in cui la catena in crescita possiede un marcatore o un supporto solubile.

Questa distinzione è importante perché cambia il modo in cui il prodotto viene separato e recuperato.

Un semiprodotto peptidico liberamente disciolto e protetto può richiedere l'isolamento sfruttando le sue stesse proprietà fisiche e chimiche.

Nel caso di un semilavorato marcato, il marcatore può essere progettato per facilitare la precipitazione, l'estrazione, la ritenzione su membrana o un altro metodo di separazione.

La rassegna sull'LPPS distingue chiaramente la classica sintesi in soluzione, la SPPS e i metodi che utilizzano marcatori solubili. [8]

La pubblicazione è utile per riordinare la terminologia e la metodologia.

Non dovrebbe tuttavia essere interpretata come un singolo esperimento che dimostra che un metodo è il migliore per ogni peptide.

Sintesi peptidica classica in soluzione

Nella sintesi classica in soluzione, gli amminoacidi protetti, i semi-prodotti peptidici o i frammenti rimangono sciolti nell'ambiente di reazione invece di essere legati covalentemente a una resina insolubile.

Al termine della reazione, l'intermediario corrispondente può essere isolato, purificato e, se necessario, caratterizzato prima di iniziare la fase successiva.

Questo potrebbe comportare alcuni benefici.

I ricercatori possono:

• caratterizzare i singoli semilavorati;
• scegliere il metodo di purificazione per il singolo semilavorato;
• ottimizzare le singole trasformazioni;
• preparare i frammenti indipendentemente;
• modificare la via di sintesi quando un determinato intermediario crea problemi.

Tuttavia, la sintesi in soluzione può comportare anche notevoli difficoltà.

Con l'allungamento della catena, i peptidi possono:

• diventare poco solubile;
• aggregare;
• essere difficile da cristallizzare;
• generare impurità strettamente correlate;
• essere difficili da separare;
• richiedere un isolamento multiplo;
• causare perdite di materiale durante le successive fasi di lavorazione.

La sintesi in soluzione non è quindi automaticamente più semplice o più facile da scalare rispetto alla SPPS.

La sua utilità dipende dalla specifica sequenza, dalla stabilità dei intermedi, dalla solubilità, dalla lunghezza della via di sintesi, dal comportamento durante la purificazione e dall'efficienza delle successive fasi di isolamento.

Lo sviluppo di strategie LPPS marcate deriva in parte dai tentativi di risolvere proprio questi problemi legati alla separazione e alla gestione del materiale. [8]

I marcatori solubili collegano la progettazione della reazione con la progettazione della separazione

Nel LPPS marcato, il peptide in crescita presenta un attacco molecolare temporaneo progettato in modo da influenzarne le proprietà fisiche.

Il marcatore può consentire di mantenere una sufficiente solubilità del peptide durante la reazione e facilitarne successivamente il recupero selettivo.

A seconda della tecnologia, la separazione può utilizzare:

• precipitazione;
• estrazione;
• ritenzione su membrana;
• comportamento di fase;
• altre proprietà derivanti dalla presenza del marcatore.

Una delle strategie sperimentali ha utilizzato un gruppo protettivo a catena lunga all'estremità C per la preparazione di ammidi peptidiche.

Le reazioni ripetute e le fasi di precipitazione hanno permesso ai ricercatori di preparare un peptide idrofobico che, nel confronto da loro effettuato, era difficile da ottenere in modo soddisfacente con il metodo SPPS. [9]

Ciò dimostra l'utilità di questa specifica strategia per la sequenza analizzata.

Non dimostra tuttavia la superiorità universale della sintesi marcata.

Il marcatore diventa parte del processo produttivo e solleva nuovi interrogativi:

• Come viene collegato efficacemente?
• Cambia il corso della reazione?
• Come si può recuperare in modo affidabile un semilavorato marcato?
• Porta alla formazione di nuovi inquinanti?
• Come viene rimosso?
• È possibile confermare la completa eliminazione?
• Quali metodi analitici ne confermano l'assenza nel prodotto finale?

I marker solubili vanno quindi considerati come elementi funzionali della progettazione del processo e non semplicemente come semplici etichette.

Confronto dei metodi principali

Il confronto illustra i principi generali di funzionamento dei singoli metodi.

Non specifica quale di esse garantirà le migliori prestazioni, purezza, costo, sostenibilità ambientale o scalabilità per una specifica sequenza.

Questi parametri devono essere valutati sulla base della molecola reale e dello specifico processo di produzione. [4] [8] [9]

Unione di frammenti e produzione ibrida

Un peptide non deve necessariamente essere sempre creato in un unico processo ininterrotto che consiste nell'aggiunta di successivi residui amminoacidici.

Una strategia alternativa consiste nel preparare separatamente frammenti peptidici più corti e poi unirli.

Ad esempio, un processo ibrido può utilizzare la SPPS per ottenere i singoli frammenti e la chimica in soluzione per E l'unione.

Le strategie convergenti possono limitare alcuni dei problemi legati a una sintesi a stadi molto lunga.

Tuttavia, introducono nuove sfide, come:

• scelta del punto di connessione appropriato;
• solubilità dei frammenti;
• attivazione del punto di giunzione;
• chemoselettività;
• mantenimento della stereochimica;
• effetti collaterali;
• pulizia dei frammenti;
• pulizia dopo la loro unione.

Un importante esempio di giunzione controllata di frammenti è la ligazione chimica nativa.

Nella versione classica, il tioestere peptidico reagisce con un secondo peptide contenente una cisteina N-terminale. Il successivo riarrangiamento porta alla formazione di un legame corretto nello scheletro peptidico nel sito di ligazione.

La ricerca preliminare ha dimostrato la possibilità di ottenere, dopo legazione e ripiegamento, una proteina contenente ponti disolfuro. [10]

Ciò conferma l'importanza di questa strategia di concatenazione di frammenti.

Ciò non significa tuttavia che due qualsiasi frammenti peptidici non modificati possano unirsi spontaneamente.

Accoppiamento e gruppi protettivi

L'accoppiamento crea una connessione intenzionale

L'accoppiamento è la fase della reazione durante la quale si forma un nuovo legame peptidico tra le unità selezionate.

Di solito il gruppo derivato dal gruppo carbossilico viene attivato in modo da poter reagire efficacemente con il gruppo amminico corrispondente.

La chimica di attivazione deve essere compatibile con:

• sequenza crescente;
• con gruppi di protezione temporanei;
• protezione delle catene laterali;
• stereochimica;
• supporto o marcatore;
• ambiente solvente;
• con altri gruppi funzionali presenti nella molecola.

L'accoppiamento efficiente è particolarmente importante nella sintesi graduale, poiché una reazione incompleta può portare alla formazione di sequenze di delezione.

Se una fase di aggiunta di amminoacido fallisce per parte delle catene in crescita, tali catene possono rimanere nel sistema e partecipare ai cicli successivi.

Di conseguenza, possono formarsi molecole molto simili al peptide bersaglio, ma prive di un residuo.

Anche piccole inefficienze possono quindi accumularsi durante molte fasi della sintesi.

Un semplice esempio matematico illustra bene questo problema.

Se ciascuna delle 50 fasi indipendenti del processo di assemblaggio avesse una probabilità di successo pari a 99%, la percentuale di molecole per le quali tutte le fasi si concludessero con successo sarebbe pari a:

0,99^50 ≈ 0,605

ovvero circa 61%.

Questa è esclusivamente un'illustrazione matematica.

Non costituisce una previsione della reale purezza o del rendimento della sintesi di un peptide contenente 50 residui.

La produzione effettiva comprende:

• diverse efficienze di accoppiamento nelle singole posizioni;
• fasi di disinserimento della sicura;
• effetti collaterali;
• difficoltà dipendente dalla sequenza;
• strategie di riconnessione;
• perdite durante la separazione;
• perdite durante la pulizia;
• altre variabili di processo.

Il calcolo mostra solo il motivo per cui anche una inefficienza apparentemente minima di una singola fase può assumere grande importanza in una sintesi a più fasi.

I gruppi protettivi controllano il sito di reazione

Un amminoacido può presentare diverse gruppi chimicamente reattivi.

Senza un controllo selettivo, le reazioni di accoppiamento potrebbero avvenire in punti indesiderati.

I gruppi di protezione bloccano temporaneamente i punti reattivi selezionati.

Il gruppo amminico utilizzato per l'allungamento della catena richiede solitamente una protezione temporanea, mentre le catene laterali reattive possono necessitare di una protezione che rimanga in sede per numerosi cicli di sintesi.

Anche il collegamento con il vettore deve sopravvivere a queste fasi fino al momento del distacco pianificato.

La scelta dei gruppi protettivi influisce quindi sull'intera strategia di sintesi.

È necessario tenere conto di quanto segue:

• il modo in cui vengono introdotti;
• stabilità;
• metodo di rimozione;
• compatibilità con altri gruppi di protezione;
• compatibilità con il supporto;
• effetti collaterali;
• effetto di una determinata sequenza;
• condizioni finali di sblocco.

Le ricerche che hanno utilizzato la protezione a base di cianosolfurilide hanno riguardato la formazione dell'aspartimide attraverso la modifica del metodo di protezione del gruppo carbossilico. [2]

I risultati dimostrano che la strategia dei gruppi di protezione influisce non solo sulla possibilità che si verifichi la reazione desiderata, ma anche sul tipo di reazioni indesiderate che possono verificarsi.

Fmoc, Boc e protezione ortogonale

L'Fmoc e il Boc sono due gruppi protettivi delle ammine ampiamente utilizzati.

Differiscono notevolmente nel modo in cui vengono rimossi.

L'Fmoc viene solitamente eliminato in condizioni basiche, mentre il Boc è sensibile alle condizioni acide.

Queste caratteristiche consentono di utilizzarli come elementi di strategie di protezione più ampie.

Nel diffuso processo SPPS basato su Fmoc, la protezione provvisoria N-terminale Fmoc viene rimossa più volte, mentre i gruppi protettivi selezionati delle catene laterali e il legame con la resina rimangono intatti fino alle fasi successive.

Altre strategie possono utilizzare combinazioni diverse.

Un concetto particolarmente importante è quello di protezione ortogonale.

Due gruppi protettivi sono considerati ortogonali se uno dei due può essere rimosso selettivamente in condizioni tali che l'altro rimanga sufficientemente stabile da consentire il proseguimento della sintesi.

L'ortogonalità è quindi una relazione pratica di compatibilità chimica.

Ciò non significa che ogni gruppo protetto rimanga del tutto inalterato dopo un numero illimitato di esposizioni a tutte le condizioni di reazione.

Possono comunque verificarsi effetti collaterali.

Negli studi sulla sintesi Fmoc sono stati descritti sia la formazione di aspartimide sia alterazioni stereochimiche indesiderate, nonostante la selettività prevista dalla strategia protettiva generale. [11]

La stereochimica è parte integrante dell'identità di una molecola

Molti aminoacidi presentano un centro chirale.

Ciò significa che i loro atomi possono assumere diverse configurazioni spaziali corrispondenti a diverse forme stereochimiche.

La modifica della configurazione di un singolo centro stereogenico può portare alla formazione di una struttura peptidica diversa senza che sia necessario modificare la sua massa nominale.

Pertanto, la massa da sola non è sufficiente a confermare l'identità completa del peptide.

L'epimerizzazione di solito significa la configurazione di un solo centro stereogenico in una molecola che ne contiene diversi.

La racemizzazione è anche spesso discussa nella chimica dei peptidi nel contesto della perdita di integrità stereochimica dei residui di amminoacidi.

Questi cambiamenti sono importanti perché il riconoscimento molecolare può dipendere fortemente dalla disposizione spaziale degli atomi.

Due molecole con la stessa composizione elementare e massa nominale possono quindi comportarsi in modo diverso se differiscono per la stereochimica.

Uno studio sulla sintesi Fmoc assistita da microonde ha rilevato che alcuni residui erano soggetti a modifiche stereochemiche indesiderate nelle condizioni applicate. La modifica del metodo ha limitato il verificarsi di queste reazioni. [11]

Ciò non significa che il riscaldamento danneggi per definizione tutti i peptidi.

La conclusione corretta è che l'accelerazione della reazione deve essere valutata insieme alla selettività chimica dipendente dalla sequenza.

Aspartimide e altre impurezze correlate

La formazione di aspartimmide è una nota reazione collaterale riguardante specifiche sequenze contenenti asparagina.

Può formarsi un intermedio ciclico indesiderato, da cui successivamente si generano composti con connettività dello scheletro o stereochimica alterate.

La probabilità di questa reazione dipende dalla sequenza e dalle condizioni del processo.

Altre impurità legate alla sintesi possono derivare da:

• accoppiamento incompleto;
• sblocco incompleto;
• formazione di sequenze di delezione;
• reazioni delle catene laterali;
• di modifiche stereochimiche;
• reazioni durante il distacco;
• ossidazione;
• raggruppamenti;
• delle condizioni di lavorazione del prodotto;
• rimozione incompleta dei gruppi protettivi.

Alcuni inquinanti causano una variazione facilmente percepibile della massa molecolare.

Le altre sono molto più difficili da distinguere.

Nelle analisi analitiche di un peptide sintetico substrato della renina sono state identificate molteplici impurità, compresi componenti che mostrano la stessa variazione di massa ma contenenti modifiche in posizioni diverse. [12]

Per la loro distinzione era necessaria un'ulteriore analisi strutturale.

I ricercatori hanno anche trattato i meccanismi proposti per la formazione di questi inquinanti come ipotesi.

Questa è una distinzione importante:

Stabilire cosa sia l'inquinamento e dimostrare l'esatto meccanismo della sua origine sono due questioni scientifiche distinte.

Non si deve presentare un meccanismo probabile come confermato solo perché corrisponde alla massa molecolare osservata.

Pulizia, ridimensionamento e qualità di produzione

Prodotto grezzo, prodotto purificato e resa

Il peptide grezzo è un materiale ottenuto prima del completamento delle fasi appropriate di purificazione.

Può contenere:

• peptide bersaglio;
• sequenze di delezione;
• materiale non completamente disattivato;
• sequenze modificate;
• residui di reagenti;
• prodotti per la decornazione;
• sole;
• solventi;
• altri ingredienti che si formano durante il processo.

La purificazione mira a separare il peptide desiderato da questa miscela.

È necessario distinguere chiaramente tre concetti:

purezza del prodotto grezzo — composizione del materiale misurata prima della purificazione finale;

resa di un prodotto purificato o isolato — quantità di materiale bersaglio recuperato rispetto a un determinato valore iniziale o teorico;

purezza finale — composizione del materiale isolato determinata mediante un metodo analitico specifico.

Questi concetti non sono intercambiabili.

Il processo può portare alla generazione di una grande quantità di materiale grezzo, ma consentire il recupero di una quantità relativamente ridotta di prodotto purificato.

Un altro processo può produrre meno materia prima, ma essere caratterizzato da un'elevata selettività nella formazione del prodotto desiderato.

Una purezza analitica altrettanto elevata non deve necessariamente significare un'alta produttività.

Negli studi di sintesi in flusso accelerata sono stati correttamente riportati separatamente la purezza del materiale grezzo e la resa dopo l'isolamento. [7]

La cromatografia separa i componenti, ma non risponde a ogni domanda

La cromatografia liquida ad alta prestazione in fase inversa (RP-HPLC) è ampiamente utilizzata per l'analisi e la purificazione dei peptidi.

Diverse molecole interagiscono in modo diverso con la fase stazionaria e mobile.

In condizioni adeguate, queste differenze consentono di separare i componenti della miscela.

La cromatografia analitica e preparativa hanno applicazioni correlate, ma differenti.

L'HPLC analitica serve principalmente per analizzare la composizione del campione.

La PLC preparativa viene utilizzata per la raccolta fisica dei componenti separati.

Il cromatogramma può fornire molte informazioni preziose.

Un grande picco principale o un'alta percentuale della sua area non devono tuttavia essere considerati come una caratterizzazione molecolare completa.

I risultati della cromatografia dipendono, tra le altre cose, da:

• tipo di colonna;
• fasi mobili;
• graduato;
• temperature;
• metodi di rilevamento;
• lunghezze d'onda;
• preparazione del campione;
• metodo di integrazione dei picchi;
• risoluzioni;
• proprietà degli inquinanti.

Due composti potrebbero potenzialmente eluire nello stesso momento.

Alcuni componenti del campione possono anche reagire diversamente al rilevatore utilizzato.

Pertanto, un'alta purezza superficiale in HPLC non equivale alla piena conferma dell'identità molecolare.

Studi sulle impurità peptidiche isobare e analisi chirali mostrano perché potrebbero essere necessari metodi analitici complementari. [12] [13]

Il metodo analitico deve corrispondere a una specifica domanda strutturale.

Identità, purezza e contenuto significano cose diverse

Nella caratteristica dei peptidi sono particolarmente importanti tre concetti.

L'identità risponde alla domanda:

La molecola desiderata è presente nel campione?

La purezza risponde alla domanda:

Quali altri componenti sono presenti nel campione o quale parte del segnale misurato corrisponde al componente principale?

Il contenuto risponde alla domanda:

Quanto peptide effettivo è presente nel campione?

Queste domande non possono sempre essere risposte con una sola misurazione.

Il materiale contenente peptidi può anche contenere:

• l'acqua;
• controvento;
• sole;
• residui di solventi;
• altri ingredienti legati al processo;
• inquinamento.

Di conseguenza, la massa totale del materiale pesato non deve necessariamente corrispondere alla massa del peptide stesso.

Allo stesso modo, la conformità della massa molecolare misurata con il valore teorico non conferma:

• completa sequenza amminoacidica;
• corretta connettività dei singoli residui;
• dell'integrità stereochimica;
• distribuzione dei ponti bisolfurici;
• pieghe;
• assenza di contaminanti isobarici.

La spettrometria di massa può fornire prove solide riguardo alla massa molecolare.

La spettrometria di massa tandem e altre tecniche strutturali possono fornire ulteriori informazioni sulla sequenza.

I metodi chirali consentono di analizzare questioni stereochimiche che non possono essere risolte con una normale misurazione della massa.

In uno degli studi analitici è stata presa in considerazione persino la racemizzazione che si verifica durante la preparazione del campione. Ciò dimostra un altro principio importante: la procedura analitica stessa può causare artefatti se non viene progettata adeguatamente. [13]

Il ripiegamento e l'attività potrebbero richiedere una conferma separata

Nel caso di peptidi strutturalmente vincolati e piccole proteine, la corretta sequenza e la massa molecolare potrebbero comunque non essere sufficienti per confermare la struttura finale desiderata.

Le domande aggiuntive possono includere:

• Si sono formati i ponti disolfuro corretti?
• La molecola ha assunto la conformazione attesa?
• La ciclizzazione è completa?
• Sono presenti isomeri strutturali?
• La molecola sintetica mostra l'attività attesa in un determinato saggio sperimentale?

Nello studio sulla sintesi del BPTI sono stati utilizzati diversi metodi analitici e biofizici insieme alla valutazione dell'inibizione della tripsina. [3]

I risultati complessivi hanno supportato la coerenza del materiale sintetico a sequenza naturale con la proteina naturale rispetto ai criteri studiati.

Il test di attività risponde tuttavia a una specifica domanda funzionale.

Non sostituisce l'analisi degli inquinanti.

Attività simile in un singolo test non conferma la piena equivalenza di tutte le proprietà biologiche, strutturali o produttive.

Lo scaling della produzione cambia più della sola quantità di materiale

L'aumento della scala di produzione non consiste esclusivamente nell'aumentare proporzionalmente la quantità di tutti i reagenti.

I processi fisici possono comportarsi diversamente a scala maggiore.

Potrebbero avere un significato:

• miscelazione;
• scambio termico;
• distribuzione di reagenti;
• diffusione;
• gonfiaggio della resina;
• pressione;
• filtrazione;
• gestione dei solventi;
• precipitazione;
• solubilità dei semilavorati;
• trasporto di massa;
• le capacità del sistema di purificazione.

Questi fattori possono influenzare sia il decorso della reazione che la formazione di impurità.

La purificazione nelle fasi successive può anche diventare un collo di bottiglia dell'intera produzione.

L'aumento della velocità di sintesi ha un'importanza limitata se il sistema di purificazione non è in grado di separare efficacemente le impurità generate o di recuperare il prodotto della qualità richiesta.

In un'analisi industriale che ha coinvolto 40 processi di sintesi peptidica provenienti da 14 aziende farmaceutiche, è stato valutato il consumo di materiali durante la sintesi, la purificazione e l'isolamento. [14]

Lo studio mostra perché la valutazione della produzione deve essere condotta per l'intero processo.

Ciò non significa tuttavia che ogni fabbrica, sequenza o tecnologia di produzione raggiunga risultati identici.

La qualità della produzione è il risultato di molti elementi di controllo

Una produzione affidabile di peptidi richiede molto di più del semplice raggiungimento di un unico risultato analitico soddisfacente.

Un processo controllato di solito comprende diversi elementi correlati:

molecola bersaglio definita → materiali di partenza appropriati → sintesi controllata → purificazione controllata → campionamento adeguato → analisi convalidata o idonea allo scopo → documentazione del lotto.

La documentazione del lotto collega i risultati analitici con il materiale che è stato effettivamente prodotto.

Il certificato di analisi (COA) riassume i risultati di analisi selezionati di un determinato lotto.

Il suo valore informativo dipende da:

• del tipo di esami effettuati;
• dei metodi applicati;
• l'utilità di questi metodi;
• specifica;
• identificazione del campione;
• tracciabilità dei lotti;
• conferme che i risultati riportati si riferiscano effettivamente al materiale in questione.

Un singolo valore definito come „purezza” non può confermare autonomamente:

• completa identità molecolare;
• contenuto di peptidi;
• dell'integrità stereochimica;
• livello di residui di solventi;
• zawartości wody;
• składu przeciwjonów;
• właściwości mikrobiologicznych;
• pieghe;
• attività biologica;
• przydatności do określonego celu.

Odpowiedni zestaw analiz zależy od zamierzonego zastosowania materiału.

Peptyd wykorzystywany jako analityczny materiał odniesienia, odczynnik badawczy stosowany w eksperymencie komórkowym oraz materiał znajdujący się na etapie rozwoju farmaceutycznego mogą wymagać odpowiedzi na inne pytania jakościowe.

Dowody analityczne należy więc interpretować w jasno określonym kontekście, a nie jako uniwersalne potwierdzenie jakości.

Ocena zrównoważenia środowiskowego musi obejmować cały proces

Synteza peptydów może wymagać znacznych ilości rozpuszczalników i odczynników.

Ocena wpływu środowiskowego powinna więc uwzględniać znacznie więcej niż sam etap sprzęgania.

Do istotnych elementów mogą należeć:

• przygotowanie bloków budulcowych;
• odczynniki sprzęgające;
• odczynniki do odbezpieczania;
• lavaggio;
• distacco;
• obróbka produktu;
• chromatografia;
• wymiana rozpuszczalników;
• izolacja;
• asciugatura;
• gospodarowanie odpadami.

Zmniejszenie obciążenia środowiskowego może wymagać równoczesnej poprawy kilku etapów.

W opublikowanej analizie dotyczącej produkcji peptydów omówiono problemy związane zarówno z syntezą, jak i oczyszczaniem oraz wskazano potrzebę ulepszania całego projektu procesu. [15]

Jako publikacja perspektywiczna nie stanowi ona kontrolowanego bezpośredniego porównania dowodzącego, że jedna konkretna technologia zawsze jest bardziej przyjazna środowisku.

Similmente:

szybsza synteza nie oznacza automatycznie bardziej ekologicznej syntezy,

a mniejsze zużycie rozpuszczalników podczas samej syntezy nie oznacza automatycznie mniejszego wpływu całego procesu produkcyjnego.

Porównania środowiskowe wymagają stosowania spójnych granic analizy i najlepiej powinny odnosić zużycie zasobów do określonej ilości wyizolowanego i scharakteryzowanego produktu końcowego.

Domande frequenti

1. Czym różni się synteza peptydów na fazie stałej od syntezy w fazie ciekłej?

W syntezie na fazie stałej rosnący peptyd pozostaje przyłączony do nierozpuszczalnego nośnika, natomiast w klasycznej syntezie w roztworze półprodukt peptydowy pozostaje rozpuszczony i zazwyczaj musi być odzyskiwany na podstawie swoich właściwości fizycznych i chemicznych. W węższym znaczeniu LPPS rozpuszczony rosnący łańcuch posiada dodatkowo rozpuszczalny znacznik lub nośnik ułatwiający późniejsze rozdzielanie. Badania syntezy znakowanej pokazują jedną ze strategii łączenia chemii roztworowej z odzyskiwaniem poprzez wytrącanie, natomiast literatura dotycząca LPPS odróżnia takie rozwiązania zarówno od klasycznej syntezy w roztworze, jak i od SPPS. Żadna metoda nie jest z definicji optymalna dla każdego peptydu. Podstawowa różnica dotyczy sposobu fizycznego prowadzenia i rozdzielania rosnącego łańcucha podczas kolejnych etapów syntezy. [8] [9]

2. Dlaczego podczas syntezy peptydów mogą powstawać zanieczyszczenia?

Zanieczyszczenia mogą powstawać dlatego, że zamierzone reakcje nie zawsze zachodzą ilościowo, a inne grupy funkcyjne mogą uczestniczyć w niepożądanych reakcjach. Niepełne sprzęganie może prowadzić do sekwencji delecyjnych, niepełne odbezpieczanie może zakłócać dalsze składanie łańcucha, a niektóre sekwencje są podatne na zmiany stereochemiczne, powstawanie aspartimidu, utlenianie, przegrupowania lub produkty uboczne związane z odszczepianiem. Badania syntezy Fmoc oraz analizy strukturalnej syntetycznych zanieczyszczeń peptydowych dokumentują kilka takich przykładów. [11] [12] Częstość i znaczenie poszczególnych zanieczyszczeń zależą od sekwencji i procesu, dlatego automatyzacji syntezy nie należy utożsamiać z całkowitym brakiem błędów chemicznych.

3. Jaką rolę pełni żywica w syntezie peptydów?

Żywica utrzymuje rosnący peptyd, podczas gdy rozpuszczalne odczynniki i wiele produktów ubocznych można usuwać pomiędzy kolejnymi etapami syntezy. Znacznie upraszcza to powtarzające się składanie łańcucha, ale żywica nie jest wyłącznie mechanicznym uchwytem. Jej pęcznienie, stopień obsadzenia, architektura polimeru, zgodność z rozpuszczalnikami i dostępność miejsc reakcji mogą wpływać na skuteczność docierania odczynników do przyłączonego peptydu. W badaniach z wykorzystaniem reaktora ze zmiennym złożem monitorowano zachowanie żywicy podczas analizy agregacji i efektywności sprzęgania. [4] Takie monitorowanie nie eliminuje błędów sekwencji, ale pokazuje, dlaczego fizyczny stan żywicy może być istotną zmienną procesową.

4. Do czego służy żywica Wanga w syntezie peptydów?

Nośniki typu Wang są powszechnie związane z przygotowywaniem peptydów uwalnianych po odpowiednim odszczepieniu z C-końcem w postaci kwasu karboksylowego. Dokładny produkt końcowy zależy jednak od linkera, architektury nośnika i zastosowanej chemii odszczepiania, a nie tylko od nazwy żywicy. Badacze przedstawili również specjalistyczną metodę przekształcania materiału peptydyl-Wang-TentaGel w hydrazydy peptydowe, które mogą służyć jako użyteczne półprodukty syntetyczne. [5] Alternatywna reakcja nie zmienia znaczenia standardowego odszczepiania z żywicy Wanga. Pokazuje natomiast, dlaczego podczas przewidywania produktu należy analizować cały system nośnika i warunki reakcji.

5. Czy SPPS buduje peptyd od N-końca czy od C-końca?

Klasyczna etapowa SPPS zazwyczaj rozpoczyna się od przyłączenia C-końcowej reszty do nośnika, po czym łańcuch jest wydłużany w kierunku N-końca. Jest to kierunek przeciwny do standardowego wydłużania łańcucha na rybosomie, gdzie białko rośnie poprzez dodawanie kolejnych aminokwasów do C-końca. Synteza BPTI jest przykładem wykorzystania zabezpieczonych bloków budulcowych i nośnika przed późniejszym uwolnieniem, oczyszczaniem i fałdowaniem produktu. [3] Istnieją jednak specjalistyczne strategie chemii peptydów wykorzystujące inne rozwiązania, dlatego budowanie od C- do N-końca należy określać jako klasyczne podejście SPPS, a nie bezwzględną zasadę wszystkich metod syntezy.

6. Dlaczego grupy ochronne są potrzebne?

Aminokwasy często zawierają kilka reaktywnych grup funkcyjnych. Grupy ochronne tymczasowo zapobiegają reakcji wybranych miejsc, pozostawiając odpowiednie miejsce dostępne w konkretnym etapie syntezy. Pomaga to kontrolować kolejność i sposób łączenia reszt. Bez właściwej ochrony konkurencyjne reakcje mogłyby prowadzić do powstawania złożonych mieszanin lub produktów o zmienionej strukturze. Badania dotyczące powstawania aspartimidu pokazały, że zmiana chemii ochrony grupy karboksylowej może ograniczać ważną reakcję uboczną w analizowanych sekwencjach. [2] Grupy ochronne nie gwarantują idealnego przebiegu syntezy, lecz zapewniają selektywną kontrolę chemiczną, która musi pozostać zgodna ze wszystkimi istotnymi etapami procesu.

7. Czym różnią się Fmoc i Boc?

Fmoc i Boc są szeroko stosowanymi tymczasowymi grupami chroniącymi grupę aminową, ale reagują na inne warunki chemiczne. Fmoc jest zazwyczaj usuwany w środowisku zasadowym, natomiast Boc jest wrażliwy na kwasy. Różnica ta wpływa na sposób łączenia ich z ochroną łańcuchów bocznych, linkerami i pozostałymi etapami syntezy. Synteza oparta na Fmoc jest szeroko wykorzystywana we współczesnej SPPS, ale badania wykazały również możliwość występowania zależnych od sekwencji reakcji ubocznych w takich warunkach. [11] W praktyce bardziej użyteczne jest więc porównywanie całych strategii ochrony i ich zgodności z daną sekwencją niż rozpatrywanie wyłącznie nazw dwóch grup ochronnych.

8. Co oznacza ochrona ortogonalna?

Ochrona ortogonalna oznacza, że jedną grupę ochronną można usunąć w warunkach, w których inna potrzebna grupa ochronna pozostaje wystarczająco stabilna, aby można było kontynuować syntezę. Pozwala to odsłaniać różne miejsca reaktywne na określonych etapach. Koncepcja ta ma podstawowe znaczenie podczas kontrolowanej syntezy złożonych peptydów. Ortogonalność jest jednak zależna od warunków, a nie absolutna: wielokrotna ekspozycja, charakter sekwencji i parametry reakcji nadal mogą prowadzić do reakcji ubocznych. Badania alternatywnych sposobów ochrony grup karboksylowych pokazują, jak strategię ochrony można modyfikować w celu kontrolowania trudnej chemii peptydowej. [2]

9. Czym jest sekwencja delecyjna?

Sekwencja delecyjna to peptyd pozbawiony jednej lub kilku reszt obecnych w zamierzonej sekwencji docelowej. Może powstać, gdy etap sprzęgania aminokwasu nie zachodzi całkowicie, ale nieprzereagowany łańcuch pozostaje przyłączony do nośnika i uczestniczy w kolejnych cyklach. Ponieważ nieprawidłowy łańcuch nadal pozostaje związany z żywicą, zwykłe przemywanie nie musi go usunąć. Badania monitorowania SPPS w czasie rzeczywistym wskazują niepełne tworzenie wiązań amidowych jako ważny problem procesowy. [4] Sekwencja delecyjna jest więc problemem związanym ze strukturą i tożsamością produktu, a nie jedynie pozostałością odczynnika.

10. Czy dwa zanieczyszczenia peptydowe mogą mieć taką samą masę cząsteczkową?

Tak. Różne struktury molekularne mogą mieć identyczną lub nierozróżnialną masę nominalną. Z tego powodu sama zgodność masy nie potwierdza pełnej tożsamości cząsteczki. W badaniach syntetycznego peptydu będącego substratem reniny zidentyfikowano izobaryczne składniki zanieczyszczeń, w których modyfikacje występowały w różnych pozycjach. Derywatyzacja i tandemowa spektrometria mas dostarczyły dodatkowych informacji strukturalnych. [12] Przykład ten pokazuje, dlaczego zgodność obserwowanej masy z oczekiwaną nie może samodzielnie potwierdzić właściwej sekwencji, łączności, stereochemii ani braku strukturalnie podobnych izomerów.

11. Czym są epimeryzacja i racemizacja w syntezie peptydów?

Epimeryzacja i racemizacja dotyczą niepożądanych zmian konfiguracji stereochemicznej. Mogą one zachodzić bez zmiany nominalnej sekwencji aminokwasowej lub masy cząsteczkowej, dlatego zwykły pomiar masy może nie wykazać różnicy strukturalnej. W badaniach syntezy Fmoc wspomaganej mikrofalami zidentyfikowano reszty podatne na zmiany stereochemiczne i wykazano, że modyfikacja warunków reakcji może ograniczać takie procesy. [11] Ryzyko zależy od bloku budulcowego, sekwencji i warunków procesu. Jakość stereochemiczna wymaga więc metod analitycznych zdolnych do oceny konfiguracji, a nie może być wnioskowana wyłącznie na podstawie masy cząsteczkowej.

12. Czym jest powstawanie aspartimidu?

Powstawanie aspartimidu jest niepożądaną reakcją związaną z określonymi sekwencjami zawierającymi asparaginian. Powstanie cyklicznego półproduktu może prowadzić do kolejnych produktów o zmienionej łączności szkieletu lub stereochemii, zmniejszając wydajność i utrudniając oczyszczanie. Badacze analizowali alternatywne strategie ochrony zaprojektowane w celu ograniczenia tej reakcji w wybranych peptydach i białkach. [2] Wyniki nie wskazują jednego uniwersalnego rozwiązania dla wszystkich sekwencji zawierających asparaginian. Pokazują natomiast, dlaczego projektowanie syntezy i strategii kontroli zanieczyszczeń musi uwzględniać specyficzne zachowanie chemiczne danej sekwencji.

13. Czy wysoka czystość HPLC potwierdza prawidłową tożsamość peptydu?

Nie. Czystość HPLC opisuje próbkę w ramach konkretnego rozdziału chromatograficznego, zastosowanego detektora i sposobu analizy danych. Wysoki udział powierzchni głównego piku może być wartościowym dowodem, że próbka jest zdominowana przez jeden chromatograficznie rozdzielony składnik, ale nie potwierdza samodzielnie pełnej tożsamości molekularnej. Współeluujące zanieczyszczenia, stereoizomery i inne warianty mogą wymagać dodatkowych technik. W badaniach analizy chiralnej peptydów wykorzystano specjalnie zaprojektowany proces, który uwzględniał również zmiany stereochemiczne powstające podczas przygotowania próbki. [13] Tożsamość i czystość należy więc traktować jako powiązane, ale odrębne pytania analityczne.

14. Czy wydajność produktu oczyszczonego oznacza to samo co czystość?

Nie. Wydajność produktu oczyszczonego lub wyizolowanego określa ilość odzyskanego materiału docelowego względem zdefiniowanej ilości początkowej lub teoretycznej. Czystość opisuje natomiast skład odzyskanego materiału według określonej metody analitycznej. Synteza może prowadzić do uzyskania stosunkowo niewielkiej ilości produktu o bardzo wysokiej czystości albo dużej ilości materiału surowego zawierającego znaczną ilość zanieczyszczeń. W badaniach automatycznej syntezy przepływowej czystość surowego produktu i wydajność po izolacji raportowano oddzielnie. [7] Rozdzielenie tych parametrów zapobiega błędnemu traktowaniu wysokiej wartości jednego z nich jako dowodu wysokiej wartości drugiego.

15. Czy długie peptydy można wytwarzać poprzez łączenie krótszych fragmentów?

Tak. W strategii fragmentowej krótsze segmenty peptydowe mogą zostać przygotowane oddzielnie, a następnie połączone za pomocą odpowiedniej chemii. Natwywna ligacja chemiczna była ważnym przykładem, w którym niezabezpieczone fragmenty peptydowe połączono w sposób prowadzący do powstania naturalnego wiązania szkieletu peptydowego, a następnie uzyskano pofałdowane białko. [10] Nie oznacza to, że dowolne fragmenty peptydowe mogą łączyć się spontanicznie. Należy uwzględnić strukturę fragmentów, chemię łączenia, wybór miejsca połączenia, rozpuszczalność, stereochemię i wymagania dotyczące oczyszczania. Składanie fragmentów jest więc alternatywną strategią projektowania syntezy, a nie automatycznym rozwiązaniem problemów związanych z długimi peptydami.

16. Czy szybsza zautomatyzowana synteza eliminuje potrzebę oczyszczania?

Nie. Szybsze zautomatyzowane lub przepływowe składanie skraca czas określonych etapów syntezy, ale nie dowodzi, że każda powstała cząsteczka ma zamierzoną strukturę. W badaniach szybkiej syntezy przepływowej nadal charakteryzowano materiał surowy i stosowano późniejsze oczyszczanie, a w kolejnych pracach dotyczących automatyzacji osobno porównywano czystość surowego materiału i wydajność po izolacji. [6] [7] Dobre wyniki systemu dla badanych sekwencji nie gwarantują również identycznych rezultatów dla każdego nowego celu. Przyspieszona synteza nadal musi być połączona z odpowiednim oczyszczaniem, potwierdzeniem tożsamości, analizą zanieczyszczeń i charakterystyką końcową.

17. Dlaczego zwiększenie skali produkcji jest bardziej skomplikowane niż przygotowanie większej partii?

Zwiększenie skali zmienia warunki fizyczne i chemiczne, a nie tylko ilość materiału. Mieszanie, wymiana ciepła, pęcznienie żywicy, dystrybucja odczynników, ciśnienie, filtracja, obsługa rozpuszczalników, rozpuszczalność półproduktów i możliwości systemu oczyszczania mogą zachowywać się inaczej przy większej objętości produkcji. W analizie przemysłowej 40 procesów peptydowych osobno oceniano syntezę, oczyszczanie i izolację podczas analizy zużycia materiałów. [14] Wyniki pokazują, dlaczego produkcję trzeba rozpatrywać jako kompletny proces. Skalowalna metoda musi powtarzalnie prowadzić do uzyskania scharakteryzowanego materiału na wszystkich etapach, a nie tylko większej ilości surowego peptydu.

18. Czy peptyd jest gotowy od razu po złożeniu prawidłowej sekwencji?

Niekoniecznie. Złożenie łańcucha tworzy szkielet sekwencji tylko w takim zakresie, w jakim potwierdzają to proces i dane analityczne. W zależności od cząsteczki mogą być nadal potrzebne odbezpieczanie, odszczepianie, cyklizacja, utlenianie, tworzenie mostków disiarczkowych, fałdowanie, koniugacja, oczyszczanie i charakterystyka. Synteza BPTI stanowi dobry przykład procesu, w którym po złożeniu liniowej sekwencji następowało oczyszczanie i tworzenie pofałdowanej struktury zawierającej mostki disiarczkowe. [3] Określenie „gotowy peptyd” powinno więc odnosić się do formy molekularnej wymaganej w danym kontekście naukowym, a nie tylko do zakończenia etapowego dodawania aminokwasów.

19. Czy prawidłowa masa cząsteczkowa potwierdza prawidłową sekwencję peptydu?

Nie. Zgodność masy cząsteczkowej jest wartościowym dowodem, ale nie może samodzielnie potwierdzić pełnej sekwencji ani struktury molekularnej. Struktury izobaryczne mogą mieć tę samą masę, a różnice stereochemiczne mogą w ogóle nie powodować zmiany masy cząsteczkowej. Badania zanieczyszczeń syntetycznych peptydów pokazały, że rozróżnienie strukturalnie odmiennych składników może wymagać tandemowej spektrometrii mas i dodatkowych analiz. [12] W przypadku pytań dotyczących integralności stereochemicznej mogą być potrzebne również metody chiralne. [13] Masę cząsteczkową należy więc traktować jako jeden z elementów oceny tożsamości, a nie jej pełne potwierdzenie.

20. Dlaczego oczyszczanie należy traktować jako część produkcji peptydu, a nie tylko końcowy dodatek?

Oczyszczanie decyduje o tym, czy docelowy peptyd można skutecznie oddzielić od sekwencji delecyjnych, produktów ubocznych, pozostałości odczynników, strukturalnie podobnych zanieczyszczeń i innych składników powstałych podczas syntezy. Metoda pozwalająca bardzo szybko wytwarzać duże ilości surowego materiału może nadal być niepraktyczna, jeśli nie da się skutecznie odzyskać docelowego produktu o wymaganej jakości. Z tego powodu analizy przemysłowe procesów peptydowych uwzględniają razem syntezę, oczyszczanie i izolację. [14] Efektywność produkcji należy ostatecznie oceniać na podstawie ilości i właściwości wyizolowanego materiału końcowego, a nie wyłącznie szybkości syntezy.

Ograniczenia przy porównywaniu metod syntezy peptydów

Podczas interpretowania badań porównujących technologie produkcji peptydów należy pamiętać o kilku istotnych ograniczeniach.

Po pierwsze, sekwencja silnie wpływa na trudność syntezy. Metoda sprawdzająca się dla jednego peptydu nie musi działać tak samo dla innego. Agregacja, hydrofobowość, skład aminokwasowy, długość, tendencja do tworzenia struktur drugorzędowych i podatność na reakcje uboczne mogą zmieniać zachowanie procesu. [1] [4]

Po drugie, czystość materiału surowego, wydajność po izolacji, czystość końcowa i zawartość peptydu są różnymi parametrami. Porównywanie metod wyłącznie na podstawie jednego z nich może dawać niepełny obraz efektywności produkcji. [7]

Po trzecie, szybkie składanie łańcucha nie oznacza szybkiej produkcji całego materiału. Odszczepianie, oczyszczanie, izolacja, końcowe kształtowanie struktury, badania analityczne i dokumentacja również wpływają na całkowity czas produkcji. [6] [7]

Po czwarte, czystość analityczna zależy od zastosowanej metody. HPLC, spektrometria mas, tandemowa spektrometria mas i analiza chiralna odpowiadają na różne pytania. Jeden wynik analityczny nie musi potwierdzać pełnej tożsamości strukturalnej. [12] [13]

Po piąte, skala wpływa na zachowanie procesu. Wyników syntezy laboratoryjnej nie można automatycznie przenosić na produkcję przemysłową bez oceny mieszania, transportu masy, możliwości oczyszczania, zużycia materiałów i innych czynników zależnych od skali. [14]

Po szóste, historyczne porównania ekonomiczne mogą z czasem tracić aktualność. Koszty odczynników, poziom automatyzacji, technologie ekspresji, wyposażenie do oczyszczania, odzyskiwanie rozpuszczalników i infrastruktura produkcyjna stale się rozwijają. Starsze analizy kosztów mogą nadal mieć znaczenie naukowe, ale nie muszą odzwierciedlać aktualnej ekonomiki rynku. [1]

Po siódme, porównania środowiskowe wymagają spójnych granic analizy. Ocena zużycia rozpuszczalników podczas samego składania łańcucha przy jednoczesnym pominięciu oczyszczania i izolacji może prowadzić do mylących wniosków dotyczących zrównoważenia procesu. [14] [15]

Wreszcie sama nazwa metody nie określa jakości produktu. SPPS, synteza w roztworze, LPPS, ligacja fragmentów oraz ekspresja biologiczna mogą prowadzić do uzyskania materiału wysokiej jakości, jeśli proces został odpowiednio zaprojektowany i kontrolowany. Żadna z tych metod nie gwarantuje jednak automatycznie właściwej tożsamości, czystości, stereochemii, fałdowania czy przydatności do konkretnego zastosowania.

Sintesi

Syntezę peptydów najlepiej rozumieć jako kontrolowany proces wytwarzania cząsteczek, a nie po prostu tworzenie wiązań peptydowych.

Celem jest zbudowanie określonej sekwencji aminokwasowej przy jednoczesnym kontrolowaniu sposobu połączenia reszt, chemii grup ochronnych, stereochemii, reakcji ubocznych i wszelkich dodatkowych wymagań strukturalnych.

Synteza peptydów na fazie stałej utrzymuje rosnący łańcuch na nierozpuszczalnym nośniku, dzięki czemu powtarzane etapy sprzęgania i przemywania dobrze nadają się do automatyzacji. Zalety związane z powtarzalnym składaniem nie eliminują jednak problemów takich jak niepełne reakcje, agregacja, sekwencje delecyjne czy zależne od sekwencji reakcje uboczne. [4] [6] [7]

Klasyczna synteza w roztworze utrzymuje półprodukty peptydowe w fazie ciekłej i może zapewniać większą elastyczność w izolowaniu oraz charakteryzowaniu poszczególnych produktów pośrednich. Wielokrotne rozdzielanie oraz pogarszająca się rozpuszczalność mogą jednak stać się poważnymi ograniczeniami.

Metody syntezy w fazie ciekłej z rozpuszczalnymi znacznikami próbują połączyć chemię roztworową z zaprojektowanymi strategiami odzyskiwania materiału. Mogą więc stanowić dodatkową możliwość w przypadku sekwencji i problemów produkcyjnych, dla których klasyczna SPPS nie jest optymalna. [8] [9]

Dłuższe lub szczególnie trudne cząsteczki można również przygotowywać poprzez składanie fragmentów, w tym natywną ligację chemiczną, zamiast polegać wyłącznie na nieprzerwanym dodawaniu kolejnych reszt aminokwasowych. [10]

Niezależnie od wybranej metody składania efektywność sprzęgania i chemia grup ochronnych pozostają kluczowe, ponieważ niewielkie nieefektywności i reakcje uboczne mogą kumulować się podczas kolejnych etapów syntezy. Powstawanie aspartimidu, sekwencje delecyjne i zmiany stereochemiczne pokazują, dlaczego sama zamierzona sekwencja nie opisuje wszystkiego, co może powstać podczas procesu. [2] [11] [12]

Praca nie kończy się również wraz ze złożeniem łańcucha.

Oczyszczanie decyduje o tym, czy produkt docelowy można oddzielić od innych składników.

Następnie odpowiednio dobrane metody analityczne odpowiadają na odrębne pytania dotyczące tożsamości, czystości, zawartości, stereochemii, konformacji oraz – jeśli ma to znaczenie – aktywności funkcjonalnej. [3] [12] [13]

Zwiększenie skali produkcji wprowadza kolejne zagadnienia dotyczące transportu masy, zachowania żywicy, zużycia rozpuszczalników, filtracji, możliwości oczyszczania, powtarzalności procesu i jego wpływu środowiskowego. Z tego powodu przemysłowa ocena procesu powinna obejmować razem syntezę, oczyszczanie i izolację, a nie koncentrować się wyłącznie na szybkości sprzęgania. [14] [15]

Najważniejsza zasada jest następująca:

skuteczna produkcja peptydu wymaga kontroli całego procesu – od projektu molekularnego i tworzenia wiązań aż po oczyszczanie oraz charakterystykę strukturalną. Uzyskanie łańcucha o oczekiwanej nominalnej masie lub wysokiego głównego piku chromatograficznego stanowi wartościowy dowód, ale żaden z tych parametrów samodzielnie nie potwierdza pełnej tożsamości molekularnej ani jakości procesu produkcyjnego.

Disclaimer

Artykuł ma wyłącznie charakter edukacyjny i naukowo-informacyjny. Opisuje ogólne zasady chemii peptydów, syntezy na fazie stałej, syntezy w roztworze i w fazie ciekłej, strategii grup ochronnych, sprzęgania, oczyszczania, charakterystyki analitycznej, procesów produkcyjnych oraz przykłady pochodzące z opublikowanych badań. Nie jest protokołem laboratoryjnym, instrukcją produkcyjną, poradą medyczną, przewodnikiem dotyczącym dawkowania lub podawania ani certyfikatem jakości jakiegokolwiek konkretnego produktu peptydowego. Wyniki eksperymentalne należy interpretować w kontekście sekwencji, zastosowanych metod, skali procesu, technik analitycznych i ograniczeń poszczególnych badań.

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