La purezza del peptide descrive la composizione di un campione determinata mediante un metodo analitico specifico. Di per sé non conferma la completa identità del peptide, la quantità effettiva del peptide nel campione, la sterilità, l'attività biologica, la stabilità o la sicurezza. Un certificato di analisi, comunemente indicato con l'abbreviazione COA, è più utile quando ogni risultato in esso riportato viene trattato come una risposta a una specifica domanda analitica.
Perciò un'informazione come „purezza al 99%” richiede un contesto adeguato.
Il 99% significa che il picco cromatografico principale rappresenta il 99% della risposta totale del rivelatore integrata nell'analisi HPLC? Tale valore rappresenta la frazione di massa del peptide bersaglio dopo aver tenuto conto di acqua, controioni e altri componenti? È stata valutata la purezza stereochimica? Che tipo di impurezze può rilevare questo metodo e quali potrebbero sfuggire al suo campo di applicazione?
Queste distinzioni sono importanti perché diversi parametri vengono comunemente definiti con la stessa parola „purezza”, nonostante descrivano in realtà proprietà diverse del campione.
La ricerca sull'analisi dei peptidi mostra perché questo è importante. Impurità strutturalmente simili possono talvolta rimanere nascoste in un picco cromatografico apparentemente semplice, mentre acqua, controioni, residui di altre sostanze e composti correlati possono influenzare la massa totale del materiale peptidico isolato. [1] [2]
Questi sono problemi analitici distinti e richiedono diversi tipi di prove.
Pertanto, nel valutare il CoA di un peptide, è più utile della semplice domanda:
„Qual è la percentuale di purezza?”
c'è una domanda:
„Cos'è stato misurato esattamente, con quale metodo, in quale campione e quale conclusione deriva realmente da questa misurazione?”
Che cosa significa realmente la purezza del peptide?
La pulizia è il risultato basato su un metodo specifico
La parola „purezza” può suggerire una proprietà unica e facilmente misurabile. In pratica, tuttavia, i laboratori possono esprimere la purezza del peptide in diversi modi.
Potrebbe essere, tra le altre cose:
- percentuale della superficie cromatografica;
- frazione massica;
- purezza chimica;
- purezza stereochimica;
- profilo di contaminazione correlato alla sequenza;
- purezza determinata secondo un metodo analitico specifico.
Queste non devono essere considerate intercambiabili.
La purezza cromatografica descrive solitamente la percentuale della risposta integrata del rivelatore attribuita al componente principale del campione.
La frazione di massa determina la massa di una specifica sostanza rispetto alla massa totale del materiale esaminato.
La purezza stereochimica riguarda invece la percentuale delle diverse configurazioni spaziali della molecola o dei residui amminoacidici che la costituiscono.
Pertanto, un'informazione sulla purezza correttamente presentata dovrebbe, ove possibile, rispondere a quattro domande:
cosa è stato misurato + come è stato misurato + come è stato calcolato il risultato + quale campione è stato analizzato.
La sola affermazione:
„99% di purezza”
trasmette molte meno informazioni rispetto a:
„99% della superficie del picco principale secondo RP-HPLC-UV”.
Tuttavia, nemmeno la seconda versione risponde a tutte le domande.
Occorre inoltre verificare se il metodo cromatografico utilizzato fosse in grado di separare le impurezze rilevanti e se il rivelatore impiegato fosse in grado di rilevarle.
Cosa significa la percentuale di area del picco in HPLC?
In parole semplici, il calcolo basato sulla normalizzazione dell'area dei picchi può essere rappresentato come:
area del picco principale ÷ area totale dei picchi considerati × 100.
Se al picco principale sono state assegnate 990 unità di area e la somma del segnale cromatografico considerato è di 1000 unità, l'area del picco principale sarà:
990 ÷ 1000 × 100 = 99%.
Si tratta di un'informazione relativa alla risposta del rivelatore ottenuta in determinate condizioni cromatografiche.
Ciò non significa automaticamente che:
Il 99% della massa fisica della polvere è costituito dal peptide bersaglio.
Esistono diversi motivi per questa differenza.
Diversi composti chimici possono generare una risposta del rilevatore diversa per unità di massa.
Alcuni componenti del campione possono assorbire debolmente la radiazione alla lunghezza d'onda utilizzata.
Le altre potrebbero non essere incluse affatto nei calcoli cromatografici.
Alcune impurità possono anche eluire insieme al componente principale.
È anche importante la parola „uwzględnionych”.
I calcoli cromatografici dipendono dalle decisioni relative a:
- integrazione dei picchi;
- delle soglie di rendicontazione;
- della selezione della linea di base;
- dei segnali relativi al solvente;
- picchi non separati;
- impostazioni del rilevatore;
- regola di esclusione di determinati segnali.
Pertanto, la percentuale dell'area di HPLC deve essere interpretata come il risultato di un metodo cromatografico specifico, anziché come una descrizione universale dell'intera composizione fisica del campione.
Le impurtà correlate possono essere difficili da separare
Le impurità presenti nei peptidi possono essere strutturalmente molto simili alla molecola desiderata.
Possono includere, tra gli altri:
- sequenze di delezione;
- sequenze abbreviate;
- catene laterali modificate;
- forme ossidate;
- gruppi terminali modificati;
- isomeri di posizione;
- stereoisomeria;
- prodotti a disattivazione incompleta;
- altre varianti che sorgono durante sintesi dei peptidi o di degrado.
Alcune di queste strutture possono differire significativamente nel comportamento cromatografico dal peptide bersaglio.
Le altre possono comportarsi in modo molto simile.
In uno studio è stata utilizzata la cromatografia liquida bidimensionale accoppiata alla spettrometria di massa per valutare la purezza del picco peptidico principale. I ricercatori hanno applicato ulteriori condizioni di separazione poiché gli isomeri peptidici con lo stesso rapporto massa-carica non potevano essere differenziati esclusivamente sulla base della normale misurazione della massa. [1]
In un altro studio che ha coinvolto quattro peptidi ciclici sintetici, è stata confrontata la cromatografia a fase inversa con la cromatografia a interazione idrofilica.
Entrambi i metodi separavano i contaminanti in modo diverso. [3]
Ciò non significa che una di queste tecniche sia sempre migliore.
Mostra invece il fenomeno della selettività complementare: due metodi analitici possono separare diversamente la stessa miscela poiché sfruttano diverse proprietà chimico-fisiche delle molecole analizzate.
Pertanto:
un singolo cromatogramma pulito non significa necessariamente l'assenza di tutte le impurità strutturalmente simili.
Anche l'acqua e i controioni influenzano la composizione del materiale
Il materiale peptidico isolato può contenere componenti che non sono sequenze peptidiche aggiuntive.
Importanti esempi includono:
- acqua;
- controvento;
- residui di solventi;
- sostanze inorganiche;
- altri componenti legati al processo di produzione.
Il controione è uno ione con carica elettrica opposta, legato ai gruppi carichi del peptide.
Nella chimica dei peptidi si possono incontrare, ad esempio, l'acetato o il trifluoroacetato.
La loro presenza non deve necessariamente indicare un errore di sintesi o una contaminazione. Il peptide potrebbe essere presente deliberatamente in una specifica forma salina.
Questi ingredienti hanno tuttavia importanza quando vogliamo rispondere alla domanda:
Quanto peptide bersaglio si trova effettivamente nella quantità di materiale pesata?
L'interpretazione dipende quindi dal fatto che il valore riportato si riferisca a:
- dello stesso peptide;
- sali peptidici;
- materiale asciutto;
- materiale anidro;
- del materiale allo stato di ricezione.
Nel loro studio sulla sublancina del 2026, i ricercatori hanno quantificato acqua, trifluoroacetato, composti organici e contaminanti inorganici nell'ambito di un'analisi più ampia del bilancio di massa. [2]
L'assegnazione finale del peptide è risultata nettamente inferiore al 100%, nonostante le impurità organiche strutturalmente correlate costituissero una parte relativamente piccola del materiale.
Questo è un esempio pratico di un'importante differenza:
Un profilo cromatografico pulito del peptide e un'alta frazione massica del peptide bersaglio non sono lo stesso parametro.
La percentuale di purezza non è una probabilità di sicurezza
La percentuale di purezza non indica la probabilità che un determinato materiale sia sicuro.
Ad esempio, un risultato del 99% di purezza non significa:
„99% di sicurezza”.
Inoltre, non fornisce informazioni sul significato biologico di ciascuna sostanza presente nel restante 1%.
Una piccola quantità di un composto può avere maggiore importanza analitica o biologica rispetto a una quantità maggiore di un altro composto, a seconda di:
- della sua identità;
- attività biologica;
- concentrazioni;
- vie di esposizione;
- dell'uso previsto;
- di altri fattori contestuali.
Allo stesso modo, una molecola identificata correttamente con altissima purezza chimica può di per sé possedere determinate proprietà biologiche.
La purezza chimica e la sicurezza biologica rispondono quindi a domande completamente diverse.
Il test di purezza serve a caratterizzare un campione rispetto alle possibilità del metodo analitico utilizzato.
Non converte il risultato chimico in una valutazione generale della sicurezza per l'uso umano.
HPLC e spettrometria di massa
Che cosa può dirci HPLC?
La cromatografia liquida ad alta efficacia (HPLC) separa i componenti di un campione in base alle differenze nelle loro interazioni con la fase stazionaria e la fase mobile in scorrimento.
Nell'analisi dei peptidi è ampiamente utilizzata la cromatografia HPLC in fase inversa (RP-HPLC), spesso in combinazione con la rilevazione UV.
Il cromatogramma mostra la risposta del rivelatore in funzione del tempo.
Da esso si possono ricavare diverse informazioni importanti.
Il tempo di ritenzione indica il momento in cui un determinato componente lascia il sistema cromatografico in condizioni specifiche.
L'area del picco rappresenta la risposta integrata del rivelatore.
La forma del picco fornisce informazioni sul comportamento cromatografico della sostanza.
La risoluzione descrive quanto efficacemente i componenti adiacenti siano separati l'uno dall'altro.
Il tempo di ritenzione non è tuttavia un „impronta digitale” molecolare unica.
Diverse molecole possono talvolta eluire in tempi simili.
Lo stesso peptide può anche mostrare tempi di ritenzione differenti dopo la modifica:
- colonne;
- composizione della fase mobile;
- graduato;
- velocità di flusso;
- temperature;
- configurazione dell'apparato;
- di altri parametri del metodo.
Gli studi che confrontano diversi sistemi di separazione dei peptidi mostrano quanto fortemente la selettività cromatografica dipenda dal metodo utilizzato. [1]
La coerenza del tempo di ritenzione può quindi supportare l'identificazione nel contesto appropriato, ma non dovrebbe essere automaticamente trattata come una piena conferma della struttura.
Perché un singolo picco non deve necessariamente corrispondere a una singola sostanza?
La coeluizione si verifica quando due o più componenti lasciano il sistema cromatico in un tempo così ravvicinato da non essere adeguatamente separati.
Di conseguenza, possono sembrare un picco unico.
Anche un picco principale visivamente simmetrico non dimostra quindi automaticamente che l'intero segnale provenga da un unico tipo di molecola.
La composizione del picco può essere studiata più dettagliatamente attraverso:
- modifica della selettività cromatografica;
- impiego di un'altra fase stazionaria;
- analisi a più lunghezze d'onda;
- accoppiamento di cromatografia e spettrometria di massa;
- cromatografia bidimensionale;
- applicazione di un'altra tecnica analitica complementare.
Tuttavia, nessuno di questi metodi rileva automaticamente ogni possibile contaminazione.
I composti strettamente correlati possono avere:
- simile tempo di ritenzione;
- simili spettri UV;
- la stessa massa nominale;
- altre proprietà analitiche comuni.
Lo studio sui peptidi ciclici, che ha confrontato la cromatografia a fase inversa con la cromatografia ad interazione idrofila, ha evidenziato profili di eluzione delle impurezze chiaramente differenti. [3]
Ciò non significa che ogni picco principale nasconda ulteriori impurità.
La conclusione è più precisa:
L'apparente semplicità del cromatogramma è il risultato ottenuto in un unico sistema di separazione, e l'applicazione di una selettività diversa può rivelare componenti che il primo metodo non ha separato.
Cosa misura la spettrometria di massa?
La spettrometria di massa (MS) rileva gli ioni in base al loro rapporto massa-carica, indicato come m/z.
Durante l'analisi, un peptide può possedere più di una carica elettrica.
Perciò una singola molecola di peptide può generare diversi segnali corrispondenti a diversi stati di carica, anziché un singolo picco corrispondente direttamente alla massa molecolare neutra.
La corretta interpretazione dei dati consente di ricostruire o confermare la massa molecolare di base.
La spettrometria di massa può fornire preziose informazioni riguardanti:
- masse molecolari;
- di alcune modificazioni chimiche;
- di determinati inquinanti;
- di pattern isotopici;
- comportamenti durante la frammentazione.
La spettrometria di massa ad alta risoluzione consente di distinguere con maggiore precisione molecole con masse molto simili.
La spettrometria di massa tandem (MS/MS) consiste nel frammentare ioni selezionati e nell'analizzare i prodotti risultanti, fornendo in tal modo ulteriori informazioni strutturali.
Tuttavia rimane valida una regola importante:
l'osservazione della massa molecolare attesa ≠ la prova della struttura molecolare completa.
Diverse strutture possono avere la stessa massa.
Le variazioni stereochimiche possono non influenzare la composizione elementare.
Anche gli isomeri di posizione potrebbero richiedere ulteriori prove.
Gli studi sulle impurità di un peptide sintetico substrato della renina hanno evidenziato questa limitazione. Per distinguere le modifiche presenti in diverse posizioni della miscela isobarica sono state necessarie ulteriori informazioni derivanti dalla frammentazione e dalla derivatizzazione. [4]
Sequenza, gruppi terminali e stereochimica
L'identità di un peptide implica molto più del suo nome.
Tra le caratteristiche strutturali rilevanti possono figurare:
- sequenza amminoacidica;
- configurazione dei singoli residui;
- struttura dell'N-terminale;
- struttura del C-terminale;
- modifiche delle catene laterali;
- disposizione dei ponti disolfuro;
- ciclizzazione;
- coniugazione;
- altre caratteristiche covalenti.
Ad esempio, un peptide con un acido carbossilico C-terminale è una molecola chimicamente diversa rispetto al corrispondente peptide con un'ammide C-terminale.
I ricercatori hanno sviluppato un metodo di spettrometria di massa assistita da derivatizzazione proprio per distinguere più efficacemente queste forme finali. [5]
Questo dimostra un principio importante:
Il metodo analitico dovrebbe essere scelto in base allo specifico quesito strutturale.
La stereochimica rappresenta una sfida aggiuntiva.
Un peptide contenente un D-amminoacido e la corrispondente variante con un L-amminoacido possono avere una massa molecolare identica e tuttavia differire nella disposizione spaziale degli atomi.
In uno studio sulla purezza stereochimica dei peptidi è stato impiegato un metodo progettato in modo da tenere conto della racemizzazione che si verifica durante l'idrolisi del campione. [6]
Senza un tale controllo, la preparazione del campione stesso potrebbe alterare la proprietà che si stava cercando di misurare.
L'analisi affidabile dei peptidi dipende quindi non solo dai parametri della strumentazione, ma anche dalla corretta preparazione del campione e dalla progettazione del metodo.
La LC-MS combina i vantaggi di due metodi, ma non elimina tutte le limitazioni
La cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa (LC-MS) unisce la separazione cromatografica all'analisi di massa.
Questo potrebbe consentire di fornire molte più informazioni rispetto a ciascuno di questi metodi utilizzati separatamente.
La LC-MS può aiutare, tra le altre cose, a:
- assegnare masse specifiche ai picchi di impurità;
- separare cromatograficamente componenti simili con masse diverse;
- analizzare i prodotti di degradazione;
- caratterizzare le impurità correlate alla sequenza;
- supportare le assegnazioni strutturali.
Nell'analisi dell'ossitocina sintetica mediante un metodo validato internamente basato sulla cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione, sono state identificate e quantificate 18 impurezze strutturalmente correlate. [7]
I ricercatori hanno anche spiegato perché questi inquinanti dovevano essere presi in considerazione nel determinare la purezza del materiale di riferimento.
Questi risultati si riferiscono tuttavia a uno specifico campione, metodo e profilo di inquinamento studiato.
Non bisogna considerarli come un elenco universale di impurità presenti in ogni materiale contenente ossitocina.
LC-MS è quindi una combinazione estremamente utile di tecniche analitiche.
Un buon rapporto LC-MS dovrebbe comunque spiegare:
- cosa è stato misurato;
- come sono stati assegnati i singoli picchi;
- in che modo sono state identificate le strutture proposte;
- le assegnazioni sono state confermate;
- quale metodo quantitativo è stato utilizzato;
- quali limitazioni analitiche sono rimaste.
L'identità, la purezza e la quantità sono parametri diversi
L'identità risponde alla domanda: quale molecola è presente?
L'analisi di identità deve rispondere alla domanda se il materiale analizzato corrisponda alla sostanza prevista.
A seconda del peptide e del problema studiato, le prove relative all'identità possono includere:
- massa dell'intera molecola;
- dati frammentari;
- analisi della sequenza;
- la caratteristica dei gruppi terminali;
- profilo amminoacidico;
- disposizione dei ponti disolfuro;
- dati spettroscopici;
- confronto cromatografico con il materiale di riferimento;
- combinazione di diversi metodi.
Un metodo può confermare un determinato elemento di identità senza risolvere tutte le altre questioni strutturali.
Ad esempio:
„è stata osservata la massa attesa dell'intera molecola”
è una conclusione più ristretta rispetto a:
„confermata la struttura molecolare completa”.
Gli studi sull'amidazione C-terminale e sulle impurità peptidiche isobariche mostrano perché questa distinzione è importante. [4] [5]
In entrambi i casi erano necessarie informazioni che andavano oltre la semplice osservazione di un picco di massa vicino al valore atteso.
La purezza risponde alla domanda: cos'altro c'è nel campione?
L'analisi di purezza analizza la composizione di un campione in un determinato intervallo analitico.
A seconda del metodo, il rapporto può presentare:
- ingrediente principale;
- i singoli inquinanti;
- la quantità totale di inquinanti rilevati;
- percentuale dell'area del picco principale;
- impurità stereochimiche;
- sostanze correlate;
- quota di massa totale.
Diverse classi di inquinanti possono richiedere metodi differenti.
Il metodo cromatografico ottimizzato per il rilevamento di sequenze di delezione non deve rispondere a domande riguardanti la stereochimica.
Il metodo basato sulla massa potrebbe non distinguere gli isomeri.
Il metodo chirale può invece fornire poche informazioni sul contenuto di acqua.
L’obiettivo dell’utilizzo dei metodi complementari non è quindi solo il conseguimento di un maggior numero di risultati.
Si tratta di ottenere risposte a diverse domande analitiche che una sola metodologia non è in grado di risolvere da sola.
La quantità corrisponde alla domanda: quante sostanze sono presenti?
La quantità può riferirsi a diversi parametri diversi.
Può significare:
- concentrazione del peptide nel soluto;
- la quantità totale di peptido nel contenitore;
- partecipazione massiva del peptide target;
- concentrazione molare;
- numero per unità di volume;
- un altro parametro quantitativo chiaramente definito.
Ogni di questi metodi richiede un'unità appropriata e una base di calcolo.
La classificazione cromatografica quantitativa richiede solitamente una corretta calibratura e non dovrebbe basarsi esclusivamente sulla normalizzazione della superficie dei pixel.
In metodi adeguatamente sviluppati, anche le seguenti misure possono contribuire a stabilire la quantità:
- analisi aminoacidica;
- risonanza magnetica nucleare quantitativa;
- metodi di diluizione isotopica;
- altre tecniche quantitative validate.
È importante sottolineare che le contaminazioni peptiche correlate possono influire su alcuni parametri quantitativi.
Gli studi sulla purezza dell’ossitocina hanno sottolineato la necessità di correggere i risultati per includere tali contaminanti invece di sostenere che ogni amminoacido misurato o segnale analitico provenga esclusivamente dalla molecola bersaglio. [7]
esempio: percentuale della superficie dell'HPLC e quantità effettiva di peptido
Immaginiamo un composto peptidico ipotetico per il quale è stato ottenuto:
RP-HPLC-UV, superficie del picco principale = 99,0%
e
La percentuale massica del peptide target specificato è uguale a 78,0% nel materiale ottenuto.
Questi risultati non devono essere contraddittori.
Hanno diversi parametri e rispondono a diverse domande analitiche.
Se si avesse dosato 10,0 mg di tale ipotetico polvere, e la massa percentuale del peptide target validata fosse pari a 78,0%, la quantità di peptide risultante da tale misurazione sarebbe stata:
10,0 mg × 0,780 = 7,80 mg.
Non sarebbe necessario accettare automaticamente:
10,0 mg × 0,990 = 9,90 mg
Solo perché il pixel principale rappresentava il 99,0% della superficie UV inclusa.
Si tratta solo di un'illustrazione analitica e non descrive alcun prodotto commerciale specifico né alcun materiale sperimentale.
L'esame della sublunina rappresenta un esempio concreto della regola alla base di tale distinzione, poiché durante la valutazione della composizione del materiale sono stati presi in considerazione, tra l'altro, l'acqua e gli ioni negativi [2].
I valori numerici di questo studio non devono essere trasferiti ad altri peptidi.
Incertitudine della misurazione e coerenza della misurazione
Il risultato dell'analisi non deve essere considerato una misura di precisione infinita.
Si tratta di un'approssimazione ottenuta mediante una procedura di misurazione specifica.
L’incertezza della misurazione descrive la gamma o la dispersione dei valori che possono essere collegati in modo ragionevole al risultato della misurazione secondo la metodologia di valutazione utilizzata.
Non significa che il laboratorio sappia che il suo risultato è errato.
Informazione invece riguarda i limiti della certezza numerica.
La coerenza di misura riguarda il collegamento documentato tra il risultato e il riferimento appropriato attraverso un sistema di calibrazione.
Essa aiuta a garantire la comparabilità dei misuramenti, ma solo per un parametro specifico che è stato effettivamente misurato e nel contesto di un riferimento definito.
Nell’ambito di uno studio relativo alla determinazione del materiale di riferimento NT-proBNP, sono state combinate metodologie di diluizione isotopica, correggendo per le contaminazioni, con valutazioni di uniformità e stabilità del materiale. [8]
Questo dimostra perché un'attribuzione di valore quantitativo affidabile richiede molto di più rispetto al semplice conteggio del numero generato dal dispositivo.
| Domanda | Prove appropriate | Cosa queste prove non confermano automaticamente |
|---|---|---|
| È questo un peptide intenzionale? | Analisi strutturali e test di identità appropriati | Quantità, sterilità e sicurezza |
| Quale parte del segnale cromatografico rilevato appartiene al picco principale? | Metodo HPLC definito e modalità di integrazione | Partecipazione del peptide target a livello di massa |
| Quanti peptidi target sono presenti nella provetta? | Marcatura quantitativa calibrata o metodo di assegnazione dei valori appropriato | Di identità strutturale completa |
| Ci sono varianti stereomiche? | Analisi chirale o stereochimica appropriata | Tutte le altre categorie di inquinamento |
| L’acqua o gli ioni negativi influenzano la massa della provetta? | Gli studi sono stati progettati appositamente per questi componenti | Attività biologiche |
| Il materiale è stabile per un certo periodo di tempo? | Dati di stabilità adeguati | Stabilità in ogni condizione possibile |
| Non è stato rilevato alcun microorganismo vivente secondo un test specifico? | Analisi microbiologiche appropriate | Identità chimica e purezza |
| Sono state valutate le endotossine? | Test endotossico appropriato | Sterilità e assenza di tutti i pirogeni |
Come leggere il certificato di analisi COA?
Iniziare con l'identificazione della campionatura e della partita
Prima di interpretare qualsiasi risultato analitico, è necessario stabilire quale materiale sia effettivamente stato analizzato.
Un COA utile dovrebbe combinare i risultati con informazioni identificative, come ad esempio:
- il nome o la descrizione del materiale;
- identificatore della provetta;
- il numero della partita o della serie;
- le date appropriate;
- forma strutturale;
- la forma della salicina, se ha importanza;
- modifiche alle estremità o altre caratteristiche strutturali importanti.
Questo è importante perché i risultati analitici si riferiscono alla stessa campionatura che è stata effettivamente analizzata.
Un certificato relativo a una partita non conferma direttamente la composizione di un'altra partita.
Analogamente, l'analisi effettuata su una provetta di materiale aggregato non dimostra automaticamente la quantità o lo stato del materiale in ogni singolo contenitore che viene poi riempito, a meno che il sistema di prelievo di campioni, di riempimento, di valutazione della uniformità e di controllo del processo non giustifichi tale conclusione.
Si tratta di questioni legate alla coerenza e all'identità del materiale.
Non significano automaticamente un comportamento inappropriato o una qualità inferiore.
Il lettore del rapporto ha semplicemente bisogno di un collegamento che possa essere difeso:
rapporto → campione analizzato → lotto o materiale cui il risultato deve riguardare.
Leggi la metodologia, il risultato, l'unità e la specifica insieme
Il COA presenta spesso sia il criterio di accettazione che il risultato effettivo ottenuto.
Ad esempio:
Specificazione: non inferiore a 98,0%
e
Risultato: 99,2%.
Si tratta di due informazioni diverse.
La specifica stabilisce il criterio di accettazione.
Il risultato riporta la misura rilevata per una determinata campionatura.
Non meno importanti sono l'unità e la base di misura.
Si possono incontrare, tra gli altri:
- area%;
- massa%;
- mg/flacone;
- mg/mL;
- µg/mL;
- mol/L;
- il risultato in massa secca;
- il risultato in termini di materia inorganica;
- il risultato per il materiale in stato ottenuto.
Queste valute non possono essere sostituite liberamente.
Ad esempio, il risultato definito come „stato ricevuto” tiene conto del materiale nella forma in cui è stato analizzato, mentre la purezza o la correzione matematica possono escludere matematicamente l’acqua dalla base della calcolazione.
La dicitura „pass” indica che il risultato indicato soddisfa un determinato criterio di accettazione per il test in questione.
Non estende il campo di applicazione di tale studio.
Pertanto:
Il test di riconoscimento dell'identità non equivale alla conferma della sterilità
e
il test di purezza HPLC ≠ la concentrazione definita del peptide,
a meno che queste proprietà non siano state misurate in modo indipendente.
Interpretazione esemplificativa degli elementi contenuti nel COA
Le osservazioni seguenti sono ipotetiche e servono esclusivamente a illustrare il modo in cui i dati analitici devono essere interpretati. Non descrivono la partita reale né propongono criteri di accettazione.
| Un commento ipotetico | Una interpretazione ragionevole | Informazioni supplementari |
|---|---|---|
| Identità: è stata osservata la massa prevista per l’intera particella | Il risultato di massa supporta la forma molecolare attribuita | Massa prevista e misurata, metodo e prove strutturali aggiuntive |
| Purezza RP-HPLC-UV: 99,2 area% | Il pic principale è responsabile di tale percentuale della risposta inclusa nel rilevamento del rivelatore in questa metodologia. | Chromatogramma, identificatore della metodologia, lunghezza d’onda, modalità di integrazione |
| Contenuto del peptide: 78,0% nel composto ottenuto | Il risultato quantitativo si riferisce alla massa totale del materiale ottenuto | Metodo di determinazione, calibrazione, incertezza, modo di considerare gli impurità |
| Acqua: riportata separatamente | La quantità di acqua è stata misurata in modo indipendente | Unità, metodo e base di calcolo |
| Controindicazioni: identificati e quantificati | È stato valutato il componente legato alla forma della salina | Il tipo di antiossidante, la sua quantità e il modo di riportarlo |
| Endotossine: non sono state studiate | Dall’COA non risulta alcun suggerimento relativo alle endotossine | Un test specifico e appropriato sarebbe necessario. |
| Sterilità: non è stato studiato | Il rapporto non consente di concludere sulla sterilità | L'HPLC e la MS non possono sostituire questo esame |
Le distinzioni presentate si basano su studi sulla purezza del principale peptitico principale, dei cationi e sulla determinazione della massa molecolare. [1] [2] [9]
Le cifre e il formato della tabella sono forniti esclusivamente a scopo didattico.
Verifica il cromatogramma e il spettro
I dati analitici aggiuntivi aiutano a interpretare correttamente i risultati riassunti nella COA.
Nel caso di un cromatogramma, vale la pena di prestare attenzione a:
- identificatore della provetta;
- identificatore della metodologia;
- asse cromatografico;
- tipo di rivelatore;
- lunghezza d'onda;
- periodi di conservazione significativi;
- indicazione dei punti;
- una tabella delle inquinanti;
- risultati dell’integrazione;
- Livelli di reporting.
Il cromatogramma, tagliato in modo da mostrare solo il grande picchio principale, può omettere informazioni necessarie per una corretta interpretazione del risultato della purezza.
Nel caso della spettrometria di massa, un contesto utile può includere:
- la forma molecolare attesa;
- la massa prevista;
- Ioni osservati;
- valori di carica assegnati;
- la dekonvoluzione;
- errore di massa;
- dati parziali, se applicabili;
- la base per l'attribuzione della struttura.
Il fantasma della massa dell’intera molecola, la massa molecolare dekonvoluta e le prove strutturali basate sulla frammentazione sono interconnesse, ma non significano la stessa cosa.
Il COA non deve necessariamente includere tutti i file crittografati presenti sull'apparecchiatura.
Tuttavia, i risultati analitici riassunti in essa dovrebbero essere accessibili tramite la documentazione di provenienza, che può essere verificata se sorgono domande sull'associazione tra la struttura o il risultato numerico.
„Non rilevato” e „non studiato” significano qualcosa di completamente diverso
„Non rilevato” significa che il metodo analitico utilizzato non ha rilevato il componente in questione nei determinati parametri e alla sua sensibilità.
Questo non significa che il livello reale sia esattamente zero.
„Al di sotto del limite di rilevabilità” significa invece che il componente può essere presente a un livello al quale un dato metodo non è in grado di rilevare in modo affidabile in quantità.
Questa è un'altra situazione.
„Non studiato” significa che per quella particolare proprietà non è stato effettuato alcun calcolo.
Non bisogna interpretare questo come:
„risultato corretto”
né:
„sostanza assente”.
Una corretta interpretazione delle informazioni relative alla rilevazione o alla misurazione quantitativa richiede anche la conoscenza di:
- limite di rilevabilità o di identificabilità;
- unità;
- base della segnalazione;
- la metodologia utilizzata;
- del modo di preparare la mostra.
Cosa rivela un'indagine di laboratorio indipendente?
Un laboratorio indipendente può fornire un ulteriore test analitico per la campionatura inviata.
Questo potrebbe aumentare il numero di prove disponibili relative a un determinato materiale.
Solo la definizione:
„sinteticamente analizzato da un laboratorio indipendente”
non spiega però:
- cosa esattamente è stato analizzato;
- quante prove sono state analizzate;
- chi ha scelto la mostra;
- chi l'ha presa;
- se fosse stata rappresentativa;
- dal quale partito proveniva;
- quali metodi sono stati utilizzati;
- se il rapporto può essere verificato;
- la prova corrisponde al materiale successivamente distribuito;
- di quali proprietà lo studio non ha preso in considerazione affatto.
Le domande più utili riguardano quindi:
l'identità del campione + l'identificazione della partita + il metodo di prelievo del campione + la gamma analitica + l'autenticità del rapporto di laboratorio.
Una analisi indipendente non elimina i limiti delle metodologie utilizzate.
PLL'HC eseguito da un laboratorio esterno rimane comunque un'indagine sull'HPLC.
Non si tratta di un test di sterilità, di un indicatore di contenuto di peptidi, di un'analisi stereomiche o di un test di attività biologica solo perché è stato effettuato da un soggetto indipendente.
Per questo motivo, il COA merita di essere valutato soprattutto in base al campo di analisi e alle possibilità di tracciare la provenienza della campionatura, e non solo in base al logo del laboratorio o a un elevato valore percentuale riportato all'inizio del documento.
Cosa non confermano i test analitici di routine?
L'HPLC non conferma la sterilità
L'analisi rutinaria dei peptidi HPLC esamina i componenti chimici in base alla loro caratteristica cromatografica.
Non è un metodo per rilevare i microrganismi vivi.
Un cromatogramma puro non può quindi confermare che la provetta è sterile.
La sterilità è un aspetto microbiologico che richiede metodi adeguati e controlli del processo produttivo.
Anche la determinazione della sterilità richiede dei limiti legati alla raccolta dei campioni, poiché solo una parte del materiale utilizzato nel test viene analizzata direttamente.
Per questo motivo, la garanzia della sterilità nella produzione farmaceutica si basa su un sistema di produzione e controllo più ampio, e non solo sull’esame finale del prodotto.
Le linee guida della FDA per la produzione asettica trattano la sanificazione e la verifica della sterilità come elementi distinti del processo. [10]
Pertanto:
alta purezza HPLC ≠ sterilità
e
la mancanza di contaminazioni cromatografiche visibili ≠ la mancanza di microrganismi.
L'esame degli endotossine risponde a un'altra domanda
Le endotossine sono componenti batteriche, in particolare un materiale legato alle lipopolisaccaridi delle batterie Gram-negative.
Non sono la stessa cosa delle batteri viventi.
La determinazione delle endotossine batteriche quindi risponde a una domanda diversa da quella del test di sterilità.
In teoria, un campione potrebbe non contenere batteri viventi rilevabili, ma comunque potrebbe contenere determinati componenti di origine batterica.
Analogamente, il test di sterilità non può automaticamente sostituire la misurazione degli endotossini.
La matrice del campione può anche influenzare la determinazione degli endotossine.
Pertanto, è importante adattare la metodologia e controllare l’interferenza.
Le linee guida FDA relative ai pirogeni e agli endotossini trattano i limiti analitici e la differenza tra gli endotossini batterici e altre sostanze pirogeniche. [11]
L'analisi di routine della purezza del HPLC non può sostituire né la prova di sterilità né la prova degli endotossine.
La purezza chimica non conferma l'attività biologica
La provetta può contenere:
- la massa molecolare prevista;
- un'area superficiale elevata del picco principale cromatografico;
- una quantità relativamente piccola di contaminanti chimici rilevati,
e allo stesso tempo non avere una funzione biologica ben definita.
La funzionalità può anche dipendere da:
- pieghe;
- distribuzione dei ponti bisolfurici;
- aggregazione;
- conformità strutturale;
- stato delle modifiche;
- condizioni del test;
- del sistema biologico utilizzato.
L’indagine sulla sintesi del BPTI mostra bene l’importanza di suddividere questi quesiti.
Gli scienziati hanno combinato la caratterizzazione analitica e la biofisica con un test di inibizione della tripsina. [12]
Nel complesso, questi risultati fornivano prove più forti riguardo al materiale studiato.
Nessun singolo misuratore ha sostituito gli altri.
Pertanto:
purezza chimica ≠ attività biologica
e
L'attività biologica in un singolo test ≠ la caratteristica strutturale o produttiva completa.
Il COA non è una valutazione della sicurezza clinica
Il COA presenta i risultati dei test analitici effettuati sulla suddetta campionatura.
Non stabilisce:
- la tolleranza clinica;
- la sicurezza delle esposizioni negli esseri umani;
- la dose corretta;
- interazione;
- efficacia;
- effetti a lungo termine;
- idoneità per una determinata persona.
Queste domande richiedono altri tipi di prove.
Questa regola rimane valida anche quando i risultati analitici sono accurati e l'identità del peptide è stata correttamente confermata.
La determinazione della purezza può caratterizzare determinati aspetti della composizione chimica.
Non può trasformare un rapporto analitico in uno studio clinico né in una valutazione della sicurezza nell'uomo.
Un punto temporale non conferma il periodo di validità
Il COA di solito descrive il materiale in un determinato momento dell’indagine.
I peptidi possono poi subire modifiche associate a:
- Degradazione;
- ossidazione;
- idrolisi;
- deamidazione;
- aggregazione;
- la capacità di assorbire l'umidità;
- con riforme strutturali;
- Altri processi dipendenti dalle proprietà della particella e dalle condizioni ambientali.
Il risultato ottenuto in un momento non conferma quindi un'instabilità illimitata.
Il periodo di validità richiede dati che associno le condizioni di conservazione definite con un mantenimento analitico del materiale nel tempo.
In uno studio sull’exenatide è stata sviluppata una tecnica cromatografica che ha indicato la stabilità e caratterizzato i prodotti di degradazione che si formano in diversi ambienti stressanti. [13]
Questa ricerca mostra come i prodotti della degradazione possano essere separati dal peptide madre.
Non definisce tuttavia un tempo di conservazione universale per tutti i peptidi e i fattori di stress artificiali non devono essere automaticamente considerati come equivalenti ai normali fattori di conservazione.
La conclusione più forte dovrebbe corrispondere alla forza dei dati probatori
Un'interpretazione scientificamente prudente non dovrebbe andare oltre il campo delle misurazioni effettuate.
Ad esempio, la COA può sostenere la seguente affermazione:
„Nella provetta analizzata è stato ottenuto un risultato di massa per l’intera molecola compatibile con il peptide assegnato, l’incidenza della superficie principale del picco determinata mediante il metodo HPLC utilizzato e la concentrazione del peptide individuata separatamente”.
Si tratta di un set di prove analitiche di grande valore.
Tuttavia non significa automaticamente:
„Il peptido è stato completamente caratterizzato; è sterile, biologicamente attivo, sicuro, stabile a lungo termine e adatto all’uso negli esseri umani”.
Non si tratta di mettere in discussione il valore dei test di laboratorio.
Non si deve inoltre aspettarsi che un metodo analitico possa rispondere a ogni possibile domanda.
L'importante è il collegamento:
ogni affermazione → con un calcolo che possa effettivamente giustificarla,
con l'esplicita indicazione dei quesiti per i quali non sono state fornite risposte.
Domande frequenti
1. Il marchio 99% di purezza significa che il prodotto è sicuro?
No. Il percentuale di purezza descrive la composizione della campione secondo una determinata metodologia analitica, e non la probabilità di sicurezza. Inoltre, questo valore può indicare la presenza di un segnale cromatografico e non l’assunzione massica fisica del peptide di destinazione. Gli studi sul bilancio di massa dei peptidi mostrano perché l’acqua, gli antiossidanti e altri componenti possono causare differenze tra questi valori. [2] Indipendentemente dalla purezza analitica, la stessa molecola di destinazione può anche avere proprietà biologiche proprie. Un alto valore di purezza può quindi supportare la caratterizzazione chimica della campione analizzata, ma non sostituisce le prove tossicologiche, farmacologiche, microbiologiche o cliniche relative alla sicurezza.
2. L'HPLC conferma la sterilità?
No. L’analisi standard del peptide HPLC separa e identifica i componenti chimici in base alla loro caratteristica cromatografica. Non determina se la soluzione contiene microrganismi vivi. La sterilità è una proprietà distinta che richiede studi microbiologici adeguati e un controllo del processo produttivo. I principi guida FDA per la produzione asettica trattano la sterilità indipendentemente dall’analisi chimica. [10] Pertanto, un cromatogramma puro, un alto rapporto di superficie del picco principale o un tempo di retentività previsto per il peptide non possono sostituire le prove relative alla sterilità.
3. Cosa significa esattamente il percento della superficie di HPLC?
Il percento di superficie HPLC indica solitamente la proporzione del segnale integrato assegnato al pic principale nel segnale cromatografico totale considerato. Il risultato dipende dalla qualità della separazione, dalla risposta del rivelatore, dalla lunghezza d’onda, dalle regole di integrazione, dai limiti di reporting e da altre condizioni della metodologia. Non significa quindi automaticamente la partecipazione fisica del peptide massivo all’intera campione. Gli studi sulla purezza del pic peptide principale dimostrano perché le isomeri non separate possono complicare l’interpretazione. [1] Il percento di superficie HPLC deve quindi essere considerato come il risultato di una particolare metodologia analitica, la cui base di misura deve essere chiaramente definita.
4. Può un picco di HPLC contenere più sostanze?
Sì. Due o più componenti possono eludere l’elettrofiltrazione in modo così vicino che nel sistema cromatografico non saranno correttamente separati e appariranno come un unico picco. Per questo anche un picco simmetrico non è un assoluto indizio di uniformità molecolare. L’analisi dei peptidi ciclici ha dimostrato che un altro modo di cromatografia dava un modo di separare le impurità diverso rispetto alla RP-HPLC. [3] Ciò non significa che ogni picco principale contenga sostanze nascoste. Tuttavia, indica che la capacità di separazione dipende dalla selettività della metodologia e, in caso di strutture strettamente affini, possono essere necessarie tecniche analitiche complementari.
5. La massa molecolare corretta conferma la sequenza corretta del peptide?
No. Il peso della molecola intera, conforme alla stima prevista, costituisce una valida prova sull’identità, ma non deve confermare l’ordine delle amminoacidi, la stereochimica, il tipo dei gruppi terminali, la posizione delle modifiche o tutte le altre caratteristiche strutturali. Le analisi dei contaminanti peptoidi sintetici hanno rivelato componenti con lo stesso peso, ma con modifiche presenti in posizioni diverse, che ha richiesto ulteriori informazioni analitiche. [4] Perciò, per valutare appieno l’identità, è necessario utilizzare metodi adatti alle specifiche incertezze strutturali del peptide in questione.
6. Come si differenzia la composizione del peptide dalla purezza?
La concentrazione del peptide indica quanti peptidi specifici sono presenti nel materiale secondo una determinata base quantitativa. La purezza può invece significare la percentuale di segnale cromatografico associato al principale componente o altri parametri di purezza definiti. L'acqua, gli antiossidanti, le restanti sostanze e le molecole strutturalmente simili possono causare che questi valori possano variare. Nel caso della sublancina, diversi di questi componenti sono stati misurati separatamente durante l'analisi del bilancio di massa. [2] Il risultato della concentrazione del peptide e del percento di superficie dell'HPLC deve quindi essere interpretato separatamente, a meno che un sistema analitico validato non indichi chiaramente la relazione tra i due parametri.
7. L’acqua e i conservanti possono influire sulla quantità di peptidi nel prodotto in polvere?
Sì. L'acqua e gli ioni aumentano la massa totale della soluzione e possono quindi ridurre la massa relativa del peptide finale, se il risultato è riportato per la sostanza ottenuta. Gli studi sulla sublannina e sugli ioni peptoidi mostrano perché questi componenti possono richiedere un'analisi separata. [2] [9] La loro presenza non deve significare un errore di sintesi o di contaminazione, poiché l'ione può essere parte della forma desiderata della salina. Pertanto, le domande chiave riguardano il tipo della forma molecolare analizzata, la quantità dei singoli componenti e la base dell'analisi utilizzata.
8. L'antijonio è la stessa cosa dell'inquinamento peptidico?
Non sempre. Il controione può essere un componente atteso della salina del peptide, mentre l'inquinamento legato alla sequenza è una diversa molecola peptidica. Si tratta quindi di diverse categorie analitiche, anche se entrambe possono influire sulla composizione complessiva della campione. In studi che confrontano i controioni dei peptidi, sono state osservate differenze in relazione alla sequenza e alla forma delle sale negli esperimenti relativi alla permeabilità delle membrane. [9] Se il controione è importante per la caratterizzazione del materiale, il suo tipo e la sua quantità devono essere riportati separatamente e non dedotti dalla purezza cromatografica del campione principale.
9. La spettrometria di massa può distinguere i vari tipi di amminoacidi D e L?
Il solo calcolo della massa complessiva della molecola non permette di distinguere solitamente le strutture con lo stesso numero atomico, che differiscono solo per la stereochimica. Quindi i varianti D e L possono avere la stessa massa molecolare. Se la domanda riguarda la configurazione spaziale, è necessaria un'analisi chiralica o stereochimica appropriata. Nel caso di studi sulla purezza chirale dei peptidi è stato utilizzato un processo appositamente progettato che tiene conto delle variazioni stereochimiche che si verificano durante la preparazione del campione. [6] Il problema è strutturale, quindi solo un aumento della precisione del calcolo della massa non risolve questa incertezza.
10. Perché il numero del partito sulla COA è importante?
Il numero di lotto o serie aiuta a collegare i risultati analitici con il materiale specifico che è stato analizzato. I risultati ottenuti per un singolo lotto non possono essere automaticamente trasferiti a un altro lotto o a ogni contenitore preparato in un altro momento. Le analisi relative ai materiali di riferimento certificati valutano tali proprietà come uniformità e stabilità, invece di basarsi su un singolo campione. [8] Il numero di lotto corretto costituisce quindi un elemento importante per l’identificazione, sebbene da solo non dimostri la correttezza del prelievo delle prove, della conservazione, del trattamento del materiale o di tutti gli altri elementi del sistema di controllo.
11. Il fatto che non sia stato rilevato significa zero?
No. „Non rilevata” significa che il metodo utilizzato non ha rilevato la sostanza analizzata nei determinati parametri e nei limiti della sua sensibilità. Ciò non significa che la quantità reale sia esattamente zero. Il risultato inferiore al limite di rilevabilità o quantificazione dovrebbe essere interpretato insieme al valore limite appropriato, all’unità, alla base del campione e ai parametri analitici. Le linee guida per i test endotossici trattano anche il significato della sensibilità dei metodi e delle possibili interferenze. [11] Quindi, un’affermazione scientificamente fondata dovrebbe riguardare ciò che la metodologia poteva rilevare, e non un’affermazione assoluta sull’assenza totale della sostanza.
12. Cosa significa l’incertezza di misurazione nel rapporto?
L’incertezza di misura descrive la dispersione dei valori che possono essere giustificatamente associati al risultato ottenuto in base alla valutazione applicata. Non significa che il laboratorio consideri il proprio risultato errato. Significa invece i limiti di certezza numerica di un dato calcolo. Nell’ambito delle analisi dei materiali, la non-concrezione per l’attribuzione dei valori può essere considerata, tra l’altro, l’incertezza del calcolo stesso, l’uniformità e la stabilità. [8] L’incertezza deve quindi essere interpretata insieme alla sua definizione, alle unità utilizzate, al livello di copertura applicato e alla grandezza misurata esattamente.
13. La prova eseguita da un laboratorio indipendente conferma che tutti i contenitori contengono lo stesso materiale?
No. Una analisi indipendente fornisce prove relative a campioni o prove effettivamente consegnate per analisi. La possibilità di trasferire questi risultati su ogni contenitore dipende, tra l’altro, dal modo di prelevare i campioni, dall’identificabilità della partita, dalla uniformità del materiale, dal processo di riempimento, dal deposito e da altri elementi di controllo. Durante la realizzazione dei materiali di riferimento certificati, l’uniformità viene valutata e non semplicemente presunta sulla base di un singolo misuramento. [8] L’indipendenza del laboratorio può aumentare l’indipendenza del singolo misuramento, ma non dimostra automaticamente l’identità dell’intera partita.
14. Possono essere utilizzati alternativamente il risultato di sterilità e quello degli endotossine?
No. La prova di sterilità riguarda i microrganismi vivi, mentre la prova degli endotossini batterici riguarda determinati componenti batterici che possono rimanere nel materiale anche in assenza di batteri viventi. Si tratta quindi di due domande analitiche distinte. L’indicazione degli endotossini può essere ulteriormente influenzata dalle interferenze derivanti dalla matrice del campione, pertanto è importante adattare adeguatamente la metodologia. [11] Non è possibile dedurre né la sterilità né il livello degli endotossini dalla purezza standard dell’HPLC. Se tali prove sono state eseguite, devono essere riportate separatamente.
15. La purezza chimica conferma l’attività biologica?
No. L'analisi chimica e la valutazione funzionale forniscono altri tipi di informazioni. Un peptide può avere una massa molecolare prevista e una purezza cromatografica elevata senza un'attività confermata in un determinato test biologico. Nell'analisi del BPTI, la caratterizzazione strutturale e biofisica è stata combinata con un test di inibizione della tripsina, invece di presupporre che un singolo risultato analitico sia sufficiente per tutte le conclusioni. [12] Inoltre, le prove funzionali sono specifiche per la particella analizzata, il sistema sperimentale e il test specifico. La purezza elevata della provetta non deve quindi essere considerata funzionalmente confermata se l'attività corrispondente non è stata effettivamente studiata.
16. La COA conferma che il peptido rimarrà stabile indefinitamente?
No. Il COA descrive la provetta al momento o durante lo studio indicato nel rapporto. Durante il successivo stoccaggio, i peptidi possono subire degradazione, ossidazione, idrolisi, aggregazione, assorbimento di umidità e altri cambiamenti dipendenti dalle loro proprietà e dallo ambiente. Gli studi sulla degradazione dell’exenatide hanno dimostrato l’importanza di metodi che indichino la stabilità, in grado di distinguere i prodotti di degradazione dalla molecola madre. [13] Tuttavia, gli studi di stress non determinano automaticamente il periodo di conservazione in condizioni normali. Ogni affermazione relativa al periodo di conservazione richiede dati di stabilità adeguati ottenuti in condizioni e tempi specifici.
17. Cosa bisogna verificare prima durante il confronto tra i due peptidi COA?
In primo luogo, è consigliabile confrontare l’identità dei campioni, i numeri delle partite, i metodi analitici utilizzati, le unità e la base di misura, anziché confrontare immediatamente i valori percentuali più elevati presenti nei documenti. Due rapporti possono presentare un valore definito come „purezza”, mentre misurano altre proprietà o hanno una diversa capacità di separare le diverse classi di contaminanti. Le ricerche che utilizzano metodi cromatografici ortogonali e la misurazione del bilancio di massa mostrano l’importanza di queste differenze. [2] [3] Senza stabilire se entrambi i valori riguardano la stessa grandezza e se i metodi sono sufficientemente comparabili, un confronto diretto dei percentuali può essere fuorviante.
18. La purezza 99% HPLC significa una concentrazione di peptidi pari a 99%?
No. Il risultato 99% % HPLC indica più spesso che al pic principale è stato attribuito 99% dei dati rilevati dal rivelatore cromatografico. Il risultato 99% di concentrazione di peptido richiederebbe invece una misurazione quantitativa che dimostri che il peptido obiettivo rappresenta un quantitativo adeguato di campione, secondo una base ben definita. L’acqua, gli anticorpi, le sostanze in sospensione e altri componenti possono aumentare la massa fisica della provetta senza incidere proporzionalmente sul rapporto percentuale di superficie RP-HPLC-UV. [2] Pertanto, entrambe le valori possono differire significativamente, nonostante nessuno dei due valori debba essere errato.
19. Può un peptide superare il test di purezza HPLC e, nonostante ciò, presentare una stereochimica anomala?
Possibilmente sì. La RP-HPLC convenzionale non deve necessariamente distinguere tutti i vari stereoisomeri, soprattutto quando le molecole presentano proprietà fisiche e chimiche molto simili. Allo stesso modo, un semplice calcolo della massa della molecola non consente di distinguere gli stereoisomeri con la stessa composizione elementare. Gli studi sulla purezza stereoisomera dei peptidi mostrano perché possono essere necessarie metodologie specializzate e un controllo accurato della preparazione della provetta. [6] La possibilità che una particolare metodologia di HPLC possa distinguere un determinato stereoisomero dipende dalla selettività dimostrata da tale metodologia, e non solo dal fatto che sia stata eseguita una analisi di HPLC.
20. La COA conferma che l’intera partita è identica alla campionatura analizzata?
Non da solo. Il COA presenta i risultati relativi alla campionatura e alla parte indicata nella documentazione analitica. L’estensione di questi risultati a tutta la parte richiede un sistema di prelievo adeguato, coerenza del processo, uniformità, identificabilità e altre verifiche produttive. La compilazione dei materiali di riferimento mostra perché la uniformità è valutata come una proprietà separata e non semplicemente presupposta. [8] Il COA può quindi fornire prove analitiche importanti relative alla parte, ma la validità delle conclusioni che comprendono l’intero materiale dipende da un sistema di qualità più ampio che collega la parte analizzata alla parte rappresentata nel rapporto.
Restrizioni sull'interpretazione della purezza dei peptidi e del COA
Durante l’interpretazione dei rapporti analitici sui peptidi è necessario tenere conto di alcune limitazioni.
Innanzitutto, la purezza dipende dalla metodologia. Il risultato del RP-HPLC-UV descrive ciò che ha misurato un sistema cromatografico e un rivelatore specifici. Un altro meccanismo di separazione può rivelare componenti che la prima metodologia non ha potuto distinguere. [1] [3]
In secondo luogo, la superficie cromatografica e la massa fisica hanno basi di misura diverse. L'acqua, gli antiossidanti, le sostanze residue e le variazioni nella risposta del rivelatore possono causare che la percentuale della superficie dell'HPLC non corrisponda all'assunzione massica del peptide obiettivo. [2]
In terzo luogo, la massa molecolare attesa rappresenta una prova forte, ma incompleta dell’identità. Le isomerie, le varianti posizionali e le differenze stereiche possono richiedere l’uso di metodi strutturali aggiuntivi. [4] [5] [6]
Quarto, anche le stesse metodologie analitiche possono produrre artefatti. La preparazione del campione, l’idrolisi, la derivatizzazione, la conservazione e il modo di trattare il materiale possono alterare l’analita o la caratteristica analizzata. [6]
Quinto, un campione analizzato non è automaticamente equivalente a ogni contenitore o allo stesso materiale in un secondo momento. L’uniformità, l’identificabilità della partita e la stabilità sono aspetti separati. [8]
Sesto, gli studi chimici non rispondono alle domande microbiologiche. L'HPLC e la spettrometria di massa non confermano né la sterilità né il livello di endotossine. [10] [11]
Sesto, la caratteristica chimica non conferma l’attività biologica né la sicurezza clinica. Si tratta di argomenti distinti che richiedono altri tipi di prove. [12]
Infine, i risultati ottenuti in un singolo momento non confermano la stabilità a lungo termine. La valutazione della stabilità richiede dati adeguati ottenuti nel tempo e in determinati parametri. [13]
Questi limiti non significano che COA non sia molto utile.
Invece, forniscono informazioni su come esso debba essere interpretato correttamente.
Sintesi
Il certificato di analisi del peptide è più utile quando lo consideriamo come un insieme di misurazioni analitiche separate, e non come una singola valutazione della qualità.
La purezza indicata all'inizio è solo l'inizio dell'interpretazione.
Un risultato come 99% RP-HPLC surface descrive il dispiegamento delle risposte del rivelatore in una particolare metodologia cromatografica. Non significa automaticamente che 99% masse fisiche di polvere rappresentino il peptide target. [1] [2]
La spettrometria di massa può fornire prove solide sulla massa delle molecole e su alcune caratteristiche strutturali, ma la conformità della massa dell’intera molecola con la valuta prevista non conferma da sola tutti gli aspetti della sequenza, della struttura delle estremità, della stereochimica o della connettività molecolare. [4] [5] [6]
La quantità del peptide richiede una base quantitativa propria.
L'acqua, i solfati, le sostanze residue e le contaminazioni peptiche correlate possono influire sulla relazione tra la massa del materiale trattato e la quantità effettiva del peptide target. [2] [7] [9]
Per questo motivo, durante la lettura del COA è importante porre alcune domande separate:
Quale campione è stato analizzato?
A quale partito si riferisce?
Quale metodo analitico è stato utilizzato?
Cosa significa esattamente la percentuale riportata?
Quali unità e quale base di calcolo sono state utilizzate?
L'identità molecolare è stata studiata indipendentemente dalla purezza cromatografica?
È stata determinata la reale concentrazione del peptide?
In casi appropriati è stata misurata l’acqua o il pH?
È stata valutata la stereotassia se questo è rilevante per la particella in questione?
Quali proprietà non sono state studiate?
È particolarmente importante distinguere tra „non rilevato” e „non studiato”.
La mancanza di un risultato non deve essere interpretata come prova di un esito positivo del test.
Analogamente, un’analisi eseguita da un laboratorio indipendente può costituire una fonte di informazioni preziosa, ma la semplice indicazione „third-party tested” non descrive il modo in cui la campionatura viene prelevata, il suo rapporto con la partita, la portata dell’analisi, la uniformità né se il risultato può essere trasferito su ogni contenitore.
Le metodologie chimiche standard hanno anche dei limiti ben definiti.
L'HPLC non conferma la sterilità.
La purezza dell'HPLC non conferma il livello di endotossine.
La purezza chimica non conferma l'attività biologica.
Il COA non rappresenta una valutazione della sicurezza clinica.
Un risultato analitico ottenuto in un determinato momento non conferma una stabilità illimitata. [10] [11] [12] [13]
La interpretazione più scientificamente fondata è quindi sempre quella più ampia possibile in base alle prove disponibili – e non più ampia.
Un rapporto analitico ben documentato può fornire informazioni solide sull'identità, sulla composizione e sulla quantità del materiale presente nella campione analizzata.
La sua validità aumenta quando sono chiaramente descritte le metodologie utilizzate, la base di misura, l'identificabilità del materiale e i limiti dei singoli test.
La regola più importante è semplice:
Identità, purezza, quantità, stereochimica, stato microbiologico, attività biologica, stabilità e sicurezza sono diversi aspetti da considerare. Un certificato di analisi affidabile aiuta a rispondere alle domande che sono state effettivamente esaminate; non deve essere utilizzato per suggerire risposte a questioni che non sono state messe in discussione.
Disclaimer
Il presente articolo ha esclusivamente carattere educativo e informativo. Esplica le norme generali della chimica analitica dei peptidi, l’interpretazione dei certificati di analisi (COA), la cromatografia HPLC, la spettrometria di massa, la determinazione della concentrazione di peptidi, la valutazione delle contaminazioni, l’identificazione del materiale e le metodologie di ricerca correlate. Non costituisce una consulenza medica, una raccomandazione di prodotto, una valutazione della sicurezza, un’autorizzazione alla produzione o una conferma che qualsiasi peptido o materiale che lo contiene sia adatto per l’uso nell’uomo. I risultati analitici devono sempre essere interpretati in relazione alla specifica campionatura, alla partita utilizzata, alla metodologia applicata, alla base di misura, alle specifiche, al problema analitico esaminato e alle limitazioni del test eseguito.
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