La pureza del péptido describe la composición de la muestra determinada mediante un método analítico específico. Por sí sola, no confirma la identidad completa del péptido, la cantidad real de péptido en la muestra, la esterilidad, la actividad biológica, la estabilidad ni la seguridad. Un certificado de análisis, comúnmente abreviado como COA, es más útil cuando cada resultado que se indica en él se trata como la respuesta a una pregunta analítica específica.
Por eso, una información como „99% de pureza” requiere un contexto adecuado.
¿Significa «99%» que el pico cromatográfico principal representa el 99% de la respuesta total integrada del detector en el análisis HPLC? ¿Representa este valor la proporción en masa del péptido objetivo tras tener en cuenta el agua, los contraiones y otros componentes? ¿Se ha evaluado la pureza estereoquímica? ¿Qué tipo de impurezas puede detectar este método y cuáles pueden quedar fuera de su alcance?
Estas distinciones son importantes porque varios parámetros diferentes se denominan coloquialmente con la misma palabra „pureza”, a pesar de que en realidad describen propiedades diferentes de la muestra.
Los estudios sobre el análisis de péptidos muestran por qué esto es importante. Las impurezas estructuralmente similares pueden permanecer a veces ocultas en un pico cromatográfico aparentemente sencillo, mientras que el agua, los contraiones, los residuos de otras sustancias y los compuestos afines pueden influir en la masa total del material peptídico aislado. [1] [2]
Estos son problemas analíticos distintos y requieren diferentes tipos de evidencia.
Por eso, a la hora de evaluar el COA de un péptido, resulta más útil que la mera pregunta:
„¿Cuál es el porcentaje de pureza?”
La pregunta es:
„¿Qué se midió exactamente, con qué método, en qué muestra y qué conclusión se desprende realmente de esta medición?”
¿Qué significa exactamente la pureza de un péptido?
La pureza es un resultado basado en un método concreto
La palabra „pureza” puede sugerir una propiedad única y fácilmente mensurable. En la práctica, sin embargo, los laboratorios pueden expresar la pureza del péptido de varias maneras diferentes.
Esto puede ser, entre otras cosas:
- porcentaje de área cromatográfica;
- fracción másica;
- pureza química;
- pureza estereoquímica;
- perfil de contaminación relacionado con la secuencia;
- pureza determinada según un método analítico específico.
Estos valores no deben considerarse intercambiables.
La pureza cromatográfica suele describir la fracción de la respuesta integrada del detector atribuida al componente principal de la muestra.
El porcentaje en masa determina la masa de una sustancia específica en relación con la masa total del material analizado.
La pureza estereoquímica, en cambio, se refiere a la participación de las diferentes configuraciones espaciales de la molécula o de los residuos de aminoácidos que la forman.
Por lo tanto, una información sobre la pureza presentada correctamente debe responder, en la medida de lo posible, a cuatro preguntas:
qué se midió + cómo se midió + cómo se calculó el resultado + qué muestra se estudió.
La mera afirmación:
„99% de pureza”
transmite mucha menos información que:
„99 % de la superficie del pico principal según RP-HPLC-UV”.
Sin embargo, ni siquiera la segunda versión responde a todas las preguntas.
También hay que saber si el método cromatográfico utilizado era capaz de separar los contaminantes relevantes y si el detector empleado era capaz de detectarlos.
¿Qué significa el porcentaje de superficie de pico en el HPLC?
Para simplificar, el cálculo basado en la normalización del área de los picos se puede representar como:
área del pico principal ÷ área total de los picos considerados × 100.
Si al pico principal se le asignaron 990 unidades de área y la suma de la señal cromatográfica considerada es de 1000 unidades, el área del pico principal será:
990 ÷ 1000 × 100 = 99%.
Esta es información sobre la respuesta del detector obtenida bajo condiciones cromatográficas específicas.
Esto no significa automáticamente que:
El 99% de la masa física del polvo corresponde al péptido deseado.
Hay varias razones para esta diferencia.
Diferentes compuestos químicos pueden generar una respuesta de detector diferente por unidad de masa.
Algunos componentes de la muestra pueden absorber débilmente la radiación a la longitud de onda utilizada.
Es posible que otras ni siquiera se tengan en cuenta en los cálculos cromatográficos.
Algunas impurezas también pueden eluir junto con el componente principal.
También es importante la palabra „tenidos en cuenta”.
Los cálculos cromatográficos dependen de las decisiones relativas a:
- integración de picos;
- umbrales de información;
- de la selección de la línea base;
- señales relacionadas con el disolvente;
- picos no separados;
- configuración del detector;
- reglas para la exclusión de determinadas señales.
Por lo tanto, el porcentaje de área de PL debe interpretarse como el resultado de un método cromatográfico específico y no como una descripción universal de toda la composición física de la muestra.
Las impurezas relacionadas pueden ser difíciles de separar
Las impurezas presentes en los péptidos pueden ser estructuralmente muy similares a la molécula deseada.
Pueden incluir, entre otros:
- secuencias de deleción;
- secuencias abreviadas;
- cadenas laterales modificadas;
- formas oxidadas;
- grupos terminales modificados;
- isómeros de posición;
- estereoisomería;
- productos de desagregación incompleta;
- otras variantes que surgen durante síntesis de péptidos lugar de degradación.
Algunas de estas estructuras pueden diferir significativamente en su comportamiento cromatográfico del péptido diana.
Otras pueden comportarse de manera muy similar.
En uno de los estudios se utilizó cromatografía líquida bidimensional acoplada a espectrometría de masas para evaluar la pureza del pico peptídico principal. Los investigadores aplicaron condiciones de separación adicionales porque los isómeros peptídicos con la misma relación masa-carga no se podían distinguir únicamente sobre la base de la medición rutinaria de masa. [1]
En otro estudio que incluyó cuatro péptidos cíclicos sintéticos, se comparó la cromatografía de fase inversa con la cromatografía de interacción hidrofílica.
Ambos métodos separaban los contaminantes de manera diferente. [3]
Esto no significa que una de estas técnicas sea siempre mejor.
Muestra en cambio un fenómeno de selectividad complementaria: dos métodos analíticos pueden separar de diferente manera la misma mezcla, ya que explotan diferentes propiedades fisicoquímicas de las moléculas estudiadas.
Por lo tanto:
Un cromatograma limpio no implica necesariamente la ausencia de todas las impurezas estructuralmente similares.
El agua y los contraiones también influyen en la composición del material
El material peptídico aislado puede contener componentes que no sean secuencias peptídicas adicionales.
Entre los ejemplos importantes se encuentran:
- agua;
- contraión;
- residuos de disolventes;
- sustancias inorgánicas;
- otros ingredientes relacionados con el proceso de producción.
Un contraión es un ion con carga eléctrica opuesta, unido a grupos cargados del péptido.
En la química de péptidos se pueden encontrar, por ejemplo, acetato o trifluoroacetato.
Su presencia no tiene por qué indicar un error de síntesis ni contaminación. El péptido puede encontrarse deliberadamente en una forma de sal específica.
Sin embargo, estos ingredientes tienen importancia cuando queremos responder a la pregunta:
¿Cuánto del péptido objetivo se encuentra realmente en la cantidad pesada de material?
La interpretación depende, por lo tanto, de si el valor reportado se refiere a:
- mismo péptido;
- enlace peptídico;
- material seco;
- material anhidro;
- material en estado de recepción.
En un estudio sobre la sublancina de 2026, los científicos cuantificaron agua, trifluoroacetato, compuestos orgánicos e impurezas inorgánicas como parte de un análisis más amplio del balance de masa. [2]
El porcentaje de péptido finalmente asignado fue notablemente inferior al 100%, a pesar de que las impurezas orgánicas estructuralmente relacionadas constituían una proporción relativamente pequeña del material.
Este es un ejemplo práctico de una diferencia importante:
un perfil cromatográfico limpio del péptido y una alta proporción en masa del péptido objetivo no son el mismo parámetro.
El porcentaje de pureza no es una probabilidad de seguridad
El porcentaje que indica la pureza no dice cuál es la probabilidad de que un determinado material sea seguro.
Por ejemplo, un resultado del 99% de pureza no significa:
„99% de seguridad”.
Tampoco informa sobre el significado biológico de cada sustancia presente en el 1% restante.
Una pequeña cantidad de un compuesto puede tener mayor importancia analítica o biológica que una mayor cantidad de otro compuesto, dependiendo de:
- su identidad;
- actividad biológica;
- concentraciones;
- vías de exposición;
- del uso previsto;
- de otros factores contextuales.
Del mismo modo, una molécula debidamente identificada con una pureza química muy elevada puede poseer por sí misma propiedades biológicas específicas.
Por lo tanto, la pureza química y la seguridad biológica responden a preguntas completamente diferentes.
El análisis de pureza sirve para caracterizar una muestra en cuanto a la aplicabilidad del método analítico utilizado.
No convierte el resultado químico en una evaluación general de la seguridad para su uso en humanos.
HPLC y espectrometría de masas
¿Qué puede decirnos HPLC?
La cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) separa los componentes de una muestra en función de las diferencias en sus interacciones con la fase estacionaria y la fase móvil en circulación.
En el análisis de péptidos se utiliza ampliamente la cromatografía HPLC en fase inversa (RP-HPLC), a menudo en combinación con la detección UV.
El cromatograma muestra la respuesta del detector en función del tiempo.
Se puede obtener de él información importante.
El tiempo de retención indica el momento en que un determinado componente abandona el sistema cromatográfico en condiciones específicas.
El área del pico representa la respuesta integrada del detector.
La forma del pico proporciona información sobre el comportamiento cromatográfico de la sustancia.
La resolución describe con qué eficacia se separan entre sí los componentes adyacentes.
Sin embargo, el tiempo de retención no es una „huella dactilar” molecular única.
Diferentes moléculas pueden a veces eluir en un tiempo similar.
El mismo péptido también puede mostrar diferentes tiempos de retención tras el cambio:
- columnas;
- composición de la fase móvil;
- degradado;
- velocidades de flujo;
- temperaturas;
- configuración del aparato;
- de otros parámetros del método.
Los estudios que comparan diferentes sistemas de separación de péptidos muestran cómo la selectividad cromatográfica depende fuertemente del método utilizado. [1]
Por lo tanto, la concordancia del tiempo de retención puede respaldar la identificación en el contexto adecuado, pero no debe considerarse automáticamente como una confirmación completa de la estructura.
¿Por qué un solo pico no tiene por qué significar una sola sustancia?
La coelución ocurre cuando dos o más componentes abandonan el sistema cromatográfico en un tiempo tan cercano que no se separan adecuadamente.
Como resultado, pueden parecer un solo pico.
Ni siquiera un pico principal visualmente simétrico demuestra por lo tanto automáticamente que toda la señal proviene de un solo tipo de molécula.
La composición del pico se puede estudiar con más detalle mediante:
- el cambio de la selectividad cromatográfica;
- uso de otra fase estacionaria;
- análisis a varias longitudes de onda;
- acoplamiento de cromatografía y espectrometría de masas;
- cromatografía bidimensional;
- aplicación de otra técnica analítica complementaria.
Sin embargo, ninguno de estos métodos detecta automáticamente todos los contaminantes posibles.
Los compuestos estrechamente relacionados pueden tener:
- tiempo de retención similar;
- espectros UV similares;
- masa nominale idéntica;
- otras propiedades analíticas comunes.
Un estudio de péptidos cíclicos, en el que se comparó la cromatografía en fase inversa con la cromatografía de interacción hidrofílica, reveló perfiles de eluación de contaminantes claramente diferentes. [3]
Esto no significa que cada punto principal oculte contaminantes adicionales.
La propuesta es más precisa:
La aparente simplicidad del cromatograma es el resultado de obtenerlo en un único sistema de separación; el uso de otra selectividad puede revelar componentes que la primera metodología no pudo separar.
¿Qué mide la espectrometría de masas?
La espectrometría de masas (MS) detecta los iones basándose en la relación entre su masa y su carga, registrada como m/z.
Durante la analítica, el péptido puede tener más de un iones cargado eléctricamente.
Por eso, una única molécula de péptido puede generar varios mensajes que responden a diferentes estados de carga, en lugar de un único pico directamente relacionado con la masa molecular neutral.
Una interpretación adecuada de los datos permite reconstruir o confirmar la masa atómica fundamental.
La espectrometría de masas puede proporcionar información valiosa sobre:
- masa molecular;
- algunas modificaciones químicas;
- de los contaminantes específicos;
- modelos isotópicos;
- Comportamiento durante la fragmentación.
La espectrometría de masas de alta resolución permite diferenciar más precisamente las partículas con masas muy similares.
La espectrometría de masas en combinación (MS/MS) consiste en fragmentar los iones seleccionados y analizar los productos resultantes, lo que proporciona información estructural adicional.
Sin embargo, existe una regla importante:
Observar la masa molecular esperada ≠ demostrar la estructura molecular completa.
Las diferentes estructuras pueden tener la misma masa.
Los cambios estereoquímicos pueden no afectar la composición del elemento.
Los isómeros posicionales también pueden requerir pruebas adicionales.
Los estudios sobre las contaminaciones con péptido sintético, un sustrato de la renina, mostraron esta limitación. Para diferenciar las modificaciones que se producen en diferentes posiciones de la mezcla isobárica, se necesitaban más información procedente de la fragmentación y la derivatización. [4]
Secuencia, grupos terminales y estereoquímica
La identidad de un péptido abarca mucho más que su nombre.
Entre los rasgos estructurales importantes pueden incluirse:
- secuencia de aminoácidos;
- configuración de las partes individuales;
- estructura del extremo N;
- estructura del extremo C;
- modificaciones en los arcos laterales;
- el emplazamiento de los puentes disiarczicos;
- ciclicidad;
- conjugación;
- otras propiedades covalentes.
Por ejemplo, un péptido que contiene un ácido carboxílico en el extremo C es químicamente una molécula diferente de un péptido con el mismo extremo C que contiene un amidóxido.
Los investigadores desarrollaron la metodología de la espectrometría de masas con derivatización para poder diferenciar estas formas finales de forma más eficaz. [5]
Esto muestra una importante norma:
La metodología analítica debe seleccionarse en función de la pregunta estructural específica.
La estereoquímica representa un desafío adicional.
Un péptido que contiene un aminoácido D y un variante que contiene un aminoácido L pueden tener la misma masa molecular y, al mismo tiempo, diferir en la disposición espacial de los átomos.
En el estudio sobre la pureza estereoquímica de los péptidos se utilizó un método diseñado de manera que tuviera en cuenta la racemización que se produce durante la hidrólisis de la muestra. [6]
Sin dicha verificación, el propio proceso de preparación de la muestra podría alterar la propiedad que se intentaba medir.
La validación de la analítica de péptidos depende, por lo tanto, no solo de los parámetros de la instrumentación, sino también del adecuado preparativo de la muestra y del diseño de la metodología.
El LC-MS combina las ventajas de ambas metodologías, pero no elimina todos los inconvenientes.
La cromatografía líquida combinada con la espectrometría de masas (LC-MS) combina la cromatografía de separación con la análisis de masas.
Esto podría proporcionar mucha más información que cualquiera de estas metodologías utilizadas por separado.
El LC-MS puede ayudar, entre otras cosas:
- asignar masas específicas a los puntos de contaminación;
- distinguir cromatográficamente los componentes similares con diferentes masas;
- investigar los productos de degradación;
- caracterizar las contaminaciones asociadas a la secuencia;
- apoyar las asignaciones estructurales.
En un estudio sobre la oxitocina sintética mediante un método interno validado de LC combinado con espectrometría de masas de alta resolución, se identificaron y cuantificaron cantidades de 18 contaminantes estructuralmente relacionados. [7]
Los investigadores también explicaron por qué estas contaminaciones debían tenerse en cuenta al determinar la pureza del material de referencia.
Sin embargo, estos resultados se refieren a una muestra específica, a un método y a un perfil de contaminantes analizados.
No deben ser considerados una lista universal de contaminantes presentes en cualquier material que contenga oxitocina.
El LC-MS es, por lo tanto, una combinación extremadamente útil de técnicas analíticas.
Sin embargo, un buen informe de LC-MS debería seguir explicando:
- lo que se ha medido;
- cómo se asignan los distintos puntos;
- cómo se identificaron las estructuras propuestas;
- si las atribuciones han sido confirmadas;
- qué método cuantitativo se utilizó;
- ¿Qué limitaciones analíticas quedaron?.
La identidad, la pureza y la cantidad son parámetros diferentes
La identidad responde a la pregunta: ¿qué molécula está presente?
Este estudio de la identidad tiene como objetivo responder a la pregunta de si el material analizado corresponde a la sustancia deseada.
Dependiendo del péptido y del problema que se está analizando, las pruebas de identidad pueden incluir:
- la masa de toda la molécula;
- datos fragmentarios;
- análisis de la secuencia;
- la caracterización de los grupos finales;
- la composición de aminoácidos;
- el emplazamiento de los puentes disiarczicos;
- datos espectroscópicos;
- comparación cromatográfica con el material de referencia;
- La combinación de varias metodologías.
Un método puede confirmar un elemento específico de la identidad sin resolver todas las demás cuestiones estructurales.
Por ejemplo:
„se observó la masa esperada de toda la molécula”
es una conclusión más restringida que:
„Se confirmó la estructura molecular completa”.
Los estudios sobre la amida final y las contaminantes peptídicas isobáricas muestran por qué esta distinción es importante. [4] [5]
En ambos casos, se necesitaban información que excedía la simple observación de un pico masivo cerca del valor esperado.
La pureza responde a la pregunta: ¿qué más hay en la muestra?
El análisis de pureza analiza la composición de la muestra en un rango de análisis específico.
Dependiendo de la metodología, el informe puede presentar:
- el componente principal;
- las distintas contaminaciones;
- la cantidad total de contaminantes detectados;
- porcentaje de la superficie del pico principal;
- contaminación estereoquímica;
- sustancias relacionadas;
- participación total en masa.
Las diferentes clases de contaminantes pueden requerir métodos diferentes.
La metodología cromatográfica optimizada para la detección de secuencias delecionarias no tiene que responder a preguntas relativas a la estereoquímica.
El método basado en la masa no puede diferenciar los isómeros.
La metodología quiral, por su parte, puede proporcionar pocas informaciones sobre el contenido de agua.
El objetivo de utilizar métodos complementarios no es simplemente reunir un mayor número de resultados.
Se trata de obtener respuestas a diversas preguntas analíticas que un método en solitario no es capaz de resolver.
La cantidad responde a la pregunta: ¿cuántas sustancias están presentes?
La cantidad puede referirse a varios parámetros diferentes.
Puede significar:
- la concentración del péptido en el disolvente;
- la cantidad total de péptido en el recipiente;
- La participación masiva del péptido objetivo;
- concentración molar;
- cantidad por unidad de volumen;
- otro parámetro cuantitativo claramente definido.
Cada uno de estos métodos requiere una unidad adecuada y una base de cálculo.
La marcación cromatográfica cuantitativa generalmente requiere una calibración adecuada y no debería basarse únicamente en la normalización de la superficie de los píxeles.
En los métodos elaborados adecuadamente para determinar la cantidad pueden también contribuir:
- análisis de aminoácidos;
- resonancia magnética nuclear cuantitativa;
- métodos de dilución isotópica;
- otros métodos cuantitativos válidos.
Es importante destacar que las contaminaciones peptídicas relacionadas pueden influir en algunas mediciones cuantitativas.
Los estudios sobre la pureza de la oxitocina subrayaron la necesidad de corregir los resultados por estas contaminaciones en lugar de asumir que cada aminoácido medido o señal analítica proviene exclusivamente de la molécula objetivo. [7]
Ejemplo: porcentaje de superficie de HPLC y cantidad real de péptido
Imaginemos un polvo peptídico hipotético para el que se obtuvo:
RP-HPLC-UV, superficie del pico principal = 99,0%
y
La proporción de peso de la molécula peptídica objetivo determinada independientemente = 78,0% en el material en estado recibido.
Estos resultados no tienen por qué ser contradictorios.
Tienen diferentes parámetros y responden a diferentes preguntas analíticas.
Si se añade 10,0 mg de dicha sustancia en polvo hipotética y la cantidad de péptido objetivo de masa valida es de 78,0%, la cantidad de péptido resultante de esta determinación sería:
10,0 mg × 0,780 = 7,80 mg.
No debería aceptarse automáticamente:
10,0 mg × 0,990 = 9,90 mg
exclusivamente porque el punto principal era responsable del 99,0% de la superficie UV incluida.
Esta es una ilustración analítica y no describe ningún producto comercial ni ningún material experimental en particular.
El estudio de la sublancia constituye un ejemplo real de la norma que subyace a este tipo de distinción, ya que durante la evaluación del contenido de la materia se tuvieron en cuenta, entre otras cosas, el agua y el antijonio. [2]
Los valores numéricos de este estudio no deben aplicarse a otros péptidos.
Incerteza de medición y consistencia de medición
El resultado del análisis no debe ser considerado como una medida de precisión infinita.
Se trata de una estimación obtenida mediante un procedimiento de medición específico.
La incertidumbre de la medición describe el rango o la dispersión de los valores que pueden, de manera razonable, relacionarse con el resultado de la medición de acuerdo con la metodología de evaluación utilizada.
Esto no significa que el laboratorio sepa que su resultado es incorrecto.
Sin embargo, informa sobre los límites de la certeza numérica.
La coherencia de medición se refiere a la vinculación documentada del resultado con un referente adecuado a través de un proceso de calibración.
Ayuda a garantizar la comparabilidad de los datos, pero solo para un parámetro específico que realmente se ha medido y dentro de un determinado rango de referencia.
En el estudio sobre la preparación del material de referencia NT-proBNP, se combinaron métodos de dilución isotópica corregidos por contaminantes con una evaluación de la homogeneidad y la estabilidad del material. [8]
Esto muestra por qué una atribución cuantitativa confiable requiere mucho más que el simple lectura de la cantidad generada por el dispositivo.
| Pregunta | Evidencias adecuadas | Lo que estas pruebas no confirman automáticamente |
|---|---|---|
| ¿Es este un péptido intencional? | Investigaciones estructurales y pruebas de identidad adecuadas | Cantidades, esterilidad ni seguridad |
| ¿Qué parte del señal de cromatografía detectado pertenece al pico principal? | Método HPLC definido y forma de integración | La participación del péptido objetivo en masa |
| ¿Cuánta cantidad de péptido objetivo se encuentra en la muestra? | Marcado cuantitativo calibrado o método adecuado para asignar valores | De identidad estructural completa |
| ¿Existen variantes estereoquímicas? | Análisis quiral o estereoquímico adecuado | Todas las demás clases de contaminantes |
| ¿La agua o los iones afectan a la masa de la muestra? | Investigaciones diseñadas específicamente para estos componentes | Actividades biológicas |
| ¿El material es estable durante un cierto tiempo? | Información de estabilidad adecuada | Estabilidad en cualquier condición posible |
| ¿No se detectaron microorganismos vivos según el ensayo especificado? | Investigaciones microbiológicas adecuadas | Identidades químicas ni pureza |
| ¿Se evaluaron los endotoxinas? | Un test endotoxínico adecuado | Estérilidad ni ausencia de todos los pirogenos |
¿Cómo leer el certificado de análisis COA?
Comience identificando la muestra y la partida
Antes de interpretar cualquier resultado analítico, hay que determinar qué material fue realmente analizado.
Un COA útil debería combinar los resultados con información de identificación, como:
- la denominación o la descripción del material;
- identificador de la muestra;
- el número de la partida o serie;
- las fechas correspondientes;
- forma estructural;
- la forma de la sal, si es importante;
- modificaciones en los extremos o otras características estructurales importantes.
Esto es importante porque los resultados analíticos se refieren a una muestra que realmente fue analizada.
El certificado relativo a una sola partida no confirma directamente la composición de otra partida.
De la misma manera, la análisis realizado en una muestra de material acumulado no implica automáticamente la cantidad ni el estado del material en cada recipiente individual que posteriormente se llena, a menos que el sistema de toma de muestras, llenado, evaluación de la homogeneidad y control del proceso justifique tal conclusión.
Son cuestiones relacionadas con la coherencia y la identificabilidad del material.
No significan automáticamente un comportamiento incorrecto ni una calidad inferior.
El lector del informe simplemente necesita una conexión que pueda ser defendida:
informe → muestra analizada → lote o material al que se aplicará el resultado.
Lea la metodología, el resultado, la unidad y la especificación juntas.
El COA a menudo presenta tanto el criterio de aceptación como el resultado real obtenido.
Por ejemplo:
Especificación: no menos de 98,0%
y
Resultado: 99,2%.
Son dos informaciones diferentes.
La especificación define el criterio de aceptación.
El resultado representa el valor medido para una muestra específica.
Igualmente importantes son la unidad y la base de medición.
Se puede encontrar, entre otros:
- área%;
- masa%;
- mg/envase;
- mg/mL;
- µg/mL;
- mol/L;
- el resultado en peso seco;
- El resultado en materia incolora;
- El resultado para el material en el estado recibido.
Estos valores no pueden ser reemplazados libremente.
Por ejemplo, el resultado determinado como „en estado recibido” tiene en cuenta el material en la forma en que fue analizado, mientras que la forma no acuosa o corregida puede eliminar matemáticamente el agua de la base del cálculo.
La información „pass” significa que el resultado indicado cumplió con el criterio de aceptación para el test en cuestión.
No amplía el alcance de este estudio.
Por lo tanto:
Un test de identidad no confirmado ≠ esterilidad confirmada
y
el ensayo de pureza HPLC ≠ la cantidad de péptido determinada,
A menos que estas propiedades hayan sido medidas independientemente.
Interpretación ejemplar de los registros en el COA
Los siguientes artículos son hipotéticos y sirven únicamente para mostrar la forma de interpretar los datos analíticos. No describen la situación real ni proponen criterios de aceptación.
| Un artículo hipotético | Una interpretación sensata | Información adicional |
|---|---|---|
| Identidad: se observó la masa esperada de toda la molécula | El resultado en masa respalda la forma molecular asignada | Masa esperada y medida, método y pruebas estructurales adicionales |
| Pureza RP-HPLC-UV: 99,2 área% | El pico principal es responsable de esa participación de la respuesta del detector incluida en este método. | Cromatograma, identificador de la metodología, longitud de onda, forma de integración |
| Contenido de péptido: 78,0% en el estado obtenido | El resultado cuantitativo se refiere a la masa total del material obtenido. | Método de marcaje, calibración, incertidumbre, forma de tener en cuenta las contaminaciones |
| Agua: reportada por separado | La cantidad de agua fue medida de forma independiente | Unidades, método y base de cálculo |
| Contaminante: identificado y cuantificado | Se evaluó el componente relacionado con la forma de la sal | El tipo de antijonio, su cantidad y la forma de reportarlo |
| Endotoxinas: no se han estudiado | De lo que la COA no revela ningún resultado sobre los endotoxinas | Se necesitaría una prueba específica y adecuada. |
| Estéril: no se ha estudiado | El informe no permite sacar conclusiones sobre la esterilidad | Ni el HPLC ni el MS pueden sustituir este estudio. |
Las distinciones presentadas se basan en estudios sobre la pureza del péptido principal, los antígenos y la determinación del contenido en masa [1] [2] [9]
Las cifras y el formato de la tabla son puramente educativos.
Compruebe el cromatograma y el espectro
Los datos analíticos adicionales ayudan a interpretar correctamente los resultados resumidos en el COA.
En el caso de un cromatograma, vale la pena prestar atención a lo siguiente:
- identificador de la muestra;
- identificador de método;
- espectro cromático;
- el tipo de detector;
- longitud de onda;
- importantes tiempos de retención;
- Marcas de puntos;
- una tabla de contaminantes;
- resultados de la integración;
- límites de notificación.
El cromatograma recortado para mostrar únicamente el gran pico principal puede omitir la información necesaria para una interpretación correcta del resultado de la pureza.
En el caso de la espectrometría de masas, un contexto útil puede incluir:
- la forma molecular deseada;
- la masa esperada;
- iones observados;
- estados de carga asignados;
- desconvolución;
- error de masa;
- datos fragmentarios, si son aplicables;
- la base para asignar la estructura.
El espectro de masa de toda la molécula, la masa molecular desvelada y las evidencias estructurales basadas en la fragmentación están relacionadas entre sí, pero no significan lo mismo.
El COA no tiene que incluir necesariamente todos los archivos RAW de la cámara.
Sin embargo, las conclusiones analíticas resumidas en él deberían poder ser vinculadas a la documentación de origen, que podría verificarse si surgen preguntas sobre la atribución de una estructura o un resultado numérico.
„No se detectó” y „no se estudió” significan algo completamente diferente.
„No detectado” significa que el método analítico utilizado no detectó el componente estudiado en los parámetros específicos y con su sensibilidad.
Esto no significa que el nivel real sea exactamente cero.
„Por debajo del umbral de cuantificación” significa que el componente puede estar presente en un nivel al que un método no puede cuantificar de forma fiable cuantitativamente.
Es otra situación.
„No se ha estudiado” significa que no se ha realizado ningún análisis para dicha propiedad.
No debe interpretarse esto como:
„resultado correcto”
ni:
„sustancia ausente”.
La interpretación correcta de la información sobre detección o cuantificación también requiere conocimiento de:
- límites de detección o cuantificación;
- unidades;
- bases de la presentación de informes;
- la metodología utilizada;
- el método de preparación de la muestra.
¿Qué aporta una investigación de laboratorio independiente?
Un laboratorio independiente puede proporcionar una medición analítica adicional para la muestra enviada.
Esto puede aumentar la cantidad de pruebas disponibles sobre un determinado material.
Solo la definición:
„fue analizado por un laboratorio independiente”
Sin embargo, no explica:
- qué exactamente se examinó;
- ¿Cuántas muestras se analizaron;
- quién eligió la muestra;
- quién la tomó;
- si era representativa;
- de qué partido procedía;
- qué métodos se utilizaron;
- si el informe puede ser verificado;
- si la muestra corresponde al material que posteriormente se distribuirá;
- de las propiedades que el estudio no abarcaba en absoluto.
Las preguntas más útiles, por lo tanto, son las siguientes:
la identidad de la muestra + la identificabilidad de la muestra + el método de obtención de la muestra + el alcance del análisis + la autenticidad del informe de laboratorio.
La investigación independiente no elimina los límites de los métodos utilizados.
El HPLC realizado por un laboratorio externo sigue siendo un estudio de HPLC.
No se convierte en una prueba de esterilidad, un indicador de la cantidad de péptido, una analítica estereoquímica ni un estudio de actividad biológica solo porque haya sido realizada por un organismo independiente.
Por eso, es importante evaluar el COA principalmente en función de su alcance analítico y de las posibilidades de análisis de la muestra, y no únicamente en función del logotipo del laboratorio o de un valor porcentual elevado que figura al principio del documento.
¿Qué no confirman los análisis rutinarios?
HPLC no confirma la esterilidad
La analítica rutinaria del péptido HPLC examina los componentes químicos basándose en su comportamiento cromatográfico.
No es una metodología para detectar microorganismos vivos.
Un cromatograma limpio no puede, por tanto, confirmar que la muestra es estéril.
La esterilidad es un tema microbiológico que requiere métodos adecuados y controles del proceso de producción.
Incluso el propio análisis de la esterilidad tiene limitaciones relacionadas con la obtención de muestras, ya que solo se analiza directamente una parte del material utilizado en el ensayo.
Por esta razón, garantizar la esterilidad en la producción farmacéutica se basa en un sistema de producción y control más amplio, y no solo en la evaluación final del producto.
Las directrices de la FDA sobre la producción aséptica consideran la control microbiológico y la prueba de esterilidad como elementos separados del proceso. [10]
Por lo tanto:
alta pureza de HPLC ≠ esterilidad
y
La ausencia de contaminantes cromatográficos visibles ≠ la ausencia de microorganismos.
El estudio de las endotoxinas responde a otra pregunta
Las endotoxinas son componentes bacterianos, en particular un material relacionado con los lipopolisacáridos de las bacterias Gram-negativas.
No son lo mismo que las bacterias vivas.
El estudio de endotoxinas bacterianas responde, por lo tanto, a una pregunta diferente a la del ensayo de esterilidad.
Teóricamente, una muestra puede no contener bacterias vivas detectables, pero sí contener ciertos componentes de origen bacteriano.
De la misma manera, la prueba de esterilidad no puede reemplazar automáticamente la medición de endotoxinas.
La matriz de la muestra también puede influir en el estudio de los endotoxinas.
Por lo tanto, es importante adaptar la metodología y controlar la interferencia.
Las directrices de la FDA sobre los pirogenos y los endotoxinas abordan los límites analíticos y la diferencia entre los endotoxinas bacterianos y otras sustancias pirogenas. [11]
La analítica rutinaria de la pureza del HPLC no puede sustituir ni la prueba de esterilidad ni la prueba de endotoxinas.
La pureza química no confirma la actividad biológica
La muestra puede tener:
- la masa molecular esperada;
- una superficie elevada del pico principal del cromatógrafo;
- una cantidad relativamente pequeña de contaminantes químicos detectados,
y al mismo tiempo no tener una función biológica determinada confirmada.
La función funcional también puede depender de:
- falta;
- disposición de los puentes disulfuro;
- agregación;
- conformación estructural;
- estado de la modificación;
- condiciones del ensayo;
- del sistema biológico utilizado.
El estudio sobre la síntesis de BPTI muestra bien la utilidad de dividir estas preguntas.
Los científicos combinaron la caracterización analítica y la biofísica con un ensayo de inhibición de la tripsina. [12]
En total, estos resultados proporcionaban pruebas más sólidas sobre el material analizado.
Ningún solo parámetro sustituyó a los demás.
Por lo tanto:
La pureza química ≠ la actividad biológica
y
La actividad biológica en un solo ensayo ≠ la caracterización estructural o productiva completa.
El COA no es una evaluación de la seguridad clínica
El COA presenta los resultados de los análisis realizados en la muestra descrita.
No se fija:
- tolerancia clínica;
- la seguridad de la exposición en humanos;
- de una dosis adecuada;
- interacción;
- efectividad;
- efectos a largo plazo;
- utilidad para una persona en particular.
Estas preguntas requieren otros tipos de pruebas.
Esta regla sigue siendo válida incluso cuando los resultados analíticos son exactos y la identidad del péptido se ha confirmado correctamente.
El análisis de la pureza puede caracterizar ciertos aspectos del contenido químico.
No puede convertir un informe analítico en un estudio clínico ni en una evaluación de la seguridad en humanos.
Un punto temporal no confirma el período de validez
El COA suele describir el material en un momento determinado del estudio.
Los péptidos pueden entonces sufrir cambios relacionados con:
- degradación;
- oxidación;
- hidrólisis;
- desamidación;
- agregación;
- la absorción de la humedad;
- por cambios estructurales;
- Otros procesos dependen de las propiedades de la molécula y de las condiciones ambientales.
El resultado obtenido en un momento dado no confirma, por lo tanto, una estabilidad ilimitada.
El período de conservación requiere datos que vinculen las condiciones de almacenamiento definidas con el mantenimiento analítico del material a lo largo del tiempo.
En el estudio de eksenatida se desarrolló un método cromatográfico que indica la estabilidad y se caracterizaron los productos de degradación que se producen en varios estados de estrés. [13]
Este estudio muestra cómo se puede separar la degradación de los productos de la molécula madre.
Sin embargo, no define un tiempo universal de almacenamiento para todos los péptidos y los estresores artificiales no deben ser automáticamente considerados como condiciones de almacenamiento normales.
La conclusión más fuerte debería corresponder a la fuerza de los argumentos.
Una interpretación científicamente prudente no debe exceder el alcance de los datos obtenidos mediante las mediciones realizadas.
Por ejemplo, la COA puede fundamentar la afirmación:
„En la muestra analizada se obtuvo un resultado de masa de toda la molécula compatible con el péptido asignado, la proporción de superficie principal del pico determinada mediante el método HPLC utilizado y la cantidad de péptido determinada por separado.
Se trata de un valioso conjunto de pruebas analíticas.
Sin embargo, no significa automáticamente:
„El péptido ha sido completamente caracterizado; es estéril, biológicamente activo, seguro, estable indefinidamente y adecuado para su uso en humanos”.
No se trata de cuestionar el valor de los estudios de laboratorio.
No se debe esperar que un método analítico responda a cada pregunta posible.
Lo más importante es la conexión:
cada afirmación → con una medida que realmente pueda justificarlas,
con la clara indicación de las preguntas que no recibieron respuesta.
Preguntas más frecuentes
1. ¿Significa la pureza 99% que el producto es seguro?
No. El porcentaje de pureza describe la composición de la muestra según un método analítico específico, y no la probabilidad de seguridad. Además, este valor puede indicar la proporción del señalamiento cromatográfico, en lugar de la contribución física en masa del péptido objetivo. Los estudios sobre el balance de masa de los péptidos muestran por qué el agua, los antiones y otros componentes pueden causar diferencias entre estos valores.[2] Independientemente de la pureza analítica, la propia molécula objetivo también puede tener sus propias propiedades biológicas. Por lo tanto, un puntaje de alta pureza puede corroborar las características químicas de la muestra objeto de estudio, pero no sustituye a la evidencia toxicológica, farmacológica, microbiológica o clínica sobre la seguridad.
2. ¿El HPLC confirma la esterilidad?
No. La analítica rutinaria de HPLC del péptido separa y detecta los componentes químicos basándose en su comportamiento cromatográfico. No determina si hay microorganismos vivos en la muestra. La esterilidad es una propiedad independiente que requiere estudios microbiológicos adecuados y un control del proceso de producción. Las directrices de la FDA para la producción aséptica contemplan el control microbiológico independientemente del análisis químico. [10] Por lo tanto, un cromatograma limpio, un alto porcentaje de superficie de pico principal o un tiempo de retención esperado del péptido no pueden sustituir la evidencia de esterilidad.
3. ¿Qué significa exactamente el porcentaje de superficie de la HPLC?
El porcentaje de superficie de HPLC generalmente indica la proporción del señal integrado asignado al pico principal en el total del señalamiento cromatográfico considerado. El resultado depende de la calidad de la resolución, la respuesta del detector, la longitud de la onda, las reglas de integración, los márgenes de reporte y otros parámetros de la metodología. Por lo tanto, no significa automáticamente la participación física del péptido de masa en toda la muestra. Los análisis de pureza del pico principal peptídico muestran por qué las isómeras no resolvidas pueden complicar la interpretación. [1] El porcentaje de superficie de HPLC debe, por lo tanto, considerarse como el resultado de una determinada metodología analítica, cuya base de medición debe estar claramente definida.
4. ¿Puede un único pico de HPLC contener varias sustancias?
Sí. Dos o más componentes pueden eluirse lo suficientemente cerca entre sí que, en un determinado sistema de cromatografía, no se podrán separar adecuadamente y parecerían un solo pico. Por lo tanto, incluso un pico visualmente simétrico no es una prueba absoluta de la homogeneidad molecular. El estudio de péptidos cíclicos demostró que un otro modo de cromatografía daba un método de separación diferente de RP-HPLC para la separación de contaminantes. [3] Esto no significa que cada pico principal contenga sustancias ocultas. Sin embargo, indica que la capacidad de separación depende de la selectividad de la metodología y, en el caso de estructuras estrechamente relacionadas, pueden ser necesarias técnicas analíticas complementarias.
5. ¿La masa molecular correcta confirma la secuencia correcta del péptido?
No. La masa de una molécula completa que concuerde con el valor esperado constituye una evidencia valiosa sobre la identidad, pero no confirma necesariamente la secuencia de aminoácidos, la estereoquímica, el tipo de grupos terminales, la posición de las modificaciones ni todas las demás características estructurales. Los estudios de impurezas de péptidos sintéticos han revelado componentes de la misma masa pero con modificaciones ubicadas en posiciones diferentes, lo que requirió información analítica adicional. [4] Por lo tanto, para una evaluación completa de la identidad se requieren métodos adaptados a las ambiguidades estructurales específicas del péptido en cuestión.
6. ¿En qué se diferencia la pureza de la composición del péptido?
La cantidad de péptido determina cuánta del péptido objetivo definido se encuentra en el material según una base cuantitativa específica. La pureza, sin embargo, puede indicar la proporción de señal cromatográfica atribuida al componente principal o otro parámetro de pureza definido. El agua, los antímeros, las residuos procesales y las moléculas estructuralmente similares pueden hacer que estos valores varíen. En el estudio de las sublancinas, varias de estas moléculas se determinaron por separado durante la evaluación del balance de masa. [2] Por lo tanto, el resultado de la cantidad de péptido y el porcentaje de superficie de HPLC debe interpretarse por separado, a menos que un sistema analítico validado determine inequívocamente la relación entre ambos.
7. ¿Pueden la agua y el antiséptico influir en la cantidad de péptido en el polvo?
Sí. El agua y el antión aumentan la masa física total de la muestra y, por lo tanto, pueden reducir la parte de la masa que corresponde al péptido objetivo en sí mismo. Los estudios sobre la sublancina y los antiones peptídicos muestran por qué estos componentes pueden requerir una marcación específica. [2] [9] Su presencia no tiene que indicar un error de síntesis ni contaminación, ya que el antión puede ser parte de la forma deseada de sal. Por lo tanto, las preguntas clave son sobre el tipo de forma molecular analizada, la cantidad de los componentes individuales y la base del cálculo utilizado.
8. ¿Es el antijonio lo mismo que la contaminación peptídica?
No siempre. El antijonio puede ser un componente deseado de la sal del péptido, mientras que la contaminación asociada a la secuencia es otra molécula peptídica. Se trata así de diferentes categorías analíticas, aunque ambas pueden influir en la composición total de la muestra. En los estudios que comparan los antijiones peptídicos se observaron diferencias en los experimentos de permeación por membranas dependientes de la secuencia y la forma de la sal. [9] Si el antijonio tiene importancia para la caracterización del material, su tipo y cantidad deben reportarse por separado y no deducirse a partir de la pureza cromatográfica del pico principal del péptido.
9. ¿Puede la espectrometría de masas convencional distinguir los variantes de aminoácidos D y L?
El propio cálculo de la masa de toda la molécula normalmente no permite distinguir estructuras con una composición elemental idéntica, que solo difieren en la estereoquímica. Por lo tanto, los variantes D y L correspondientes pueden tener una masa molecular idéntica. Si la pregunta se refiere a la configuración espacial, se requiere una análisis ciral o estereoquímico adecuado. En el estudio de la pureza ciral de los péptidos se utilizó un proceso especialmente diseñado que tiene en cuenta los cambios estereoquímicos que se producen durante la preparación de la muestra. [6] El problema tiene un carácter estructural, por lo que el simple aumento de la precisión del cálculo de la masa no resuelve esta ambigüedad.
10. ¿Por qué es importante el número de la agrupación en el COA?
El número de lote o serie ayuda a relacionar los resultados analíticos con el material específico que se ha analizado. Los resultados obtenidos para un mismo lote no se pueden transferir automáticamente a otro lote ni a cada contenedor preparado en un momento diferente. Los ensayos relacionados con los materiales de referencia certificados evalúan propiedades como la homogeneidad y la estabilidad, en lugar de basarse en un solo análisis. [8] Por lo tanto, el número de lote adecuado constituye un elemento importante de la identificabilidad, aunque por sí mismo no prueba la exactitud de la toma de muestras, el almacenamiento, el manejo del material ni todos los demás elementos del sistema de control.
11. ¿Significa „no detectado” cero?
No. „No detectado” significa que el método utilizado no detectó la sustancia analizada en los parámetros y dentro de los límites de su sensibilidad. Esto no implica que la cantidad real sea exactamente cero. El resultado que se encuentra por debajo del límite de detección o cuantificación debe interpretarse junto con el valor límite correspondiente, la unidad, la base de la muestra y los parámetros de análisis. Las directrices sobre los ensayos de endotoxinas también explican la importancia de la sensibilidad de los métodos y las posibles interferencias. [11] Por lo tanto, una conclusión científicamente válida debería referirse a lo que la metodología pudo detectar, y no a una afirmación absoluta de la ausencia total de la sustancia.
12. ¿Qué significa la incertidumbre en la medición en el informe?
La incertidumbre de la medición describe la dispersión de los valores que pueden relacionarse de manera razonable con el resultado obtenido según la evaluación utilizada. No significa que el laboratorio considere su resultado como erróneo. Sin embargo, indica los límites de la incertidumbre numérica de dicho cálculo. En los estudios de materiales, la incertidumbre de la asignación de valores puede tener en cuenta, entre otras cosas, la incertidumbre propia del mismo cálculo, la homogeneidad y la estabilidad. [8] Por lo tanto, la incertidumbre debe interpretarse junto con su definición, las unidades, el nivel de cobertura utilizado y la magnitud exactamente determinada.
13. ¿El análisis realizado por un laboratorio independiente confirma que todos los contenedores contienen el mismo material?
No. Una investigación independiente proporciona pruebas relativas a la muestra o a las muestras de la sustancia que realmente se han entregado para análisis. La posibilidad de transferir estos resultados a cada contenedor depende, entre otras cosas, del método de obtención de las muestras, de la identificabilidad de la lotería, de la homogeneidad del material, del proceso de llenado, del almacenamiento y de otros elementos de control. En la elaboración de materiales de referencia certificados, la homogeneidad se evalúa y no se asume simplemente a partir de un solo análisis. [8] La independencia del laboratorio puede aumentar la independencia del propio análisis, pero no prueba automáticamente la homogeneidad de toda la lotería.
14. ¿Se pueden utilizar de forma alternativa el resultado de la esterilidad y el resultado de los endotoxinas?
No. La prueba de esterilidad se refiere a microorganismos vivos, mientras que la prueba de endotoxinas bacterianas se refiere a componentes bacterianos específicos que pueden permanecer en el material incluso en ausencia de bacterias vivas. Por lo tanto, se trata de dos preguntas analíticas distintas. La interferencia resultante de la matriz de la muestra puede afectar además a la determinación de las endotoxinas, por lo que es importante la adaptación adecuada del método. [11] No se puede inferir ni la esterilidad ni el nivel de endotoxinas a partir de la pureza rutinaria del HPLC. Si se realizan estas pruebas, deben reportarse por separado.
15. ¿La pureza química confirma la actividad biológica?
No. La análisis químico y los ensayos funcionales proporcionan otros tipos de información. Un péptido puede tener una masa molecular esperada y una alta pureza cromatográfica sin demostrar actividad en un ensayo biológico específico. En el estudio BPTI, la caracterización estructural y biofísica se combinó con un ensayo de inhibición por tripsina, en lugar de asumir que un único resultado analítico es suficiente para todas las conclusiones. [12] La evidencia funcional también es específica para la molécula estudiada, el sistema experimental y el ensayo específico. Por lo tanto, las muestras de alta pureza no deben considerarse funcionalmente confirmadas si la actividad relevante no ha sido realmente investigada.
16. ¿El COA confirma que el péptido permanecerá estable indefinidamente?
No. La COA describe la muestra en el momento o en la etapa del estudio indicada en el informe. Durante el almacenamiento posterior, el péptido puede sufrir degradación, oxidación, hidrólisis, agregación, absorción de humedad y otros cambios dependiendo de sus propiedades y del entorno. Los estudios sobre la degradación de la exenatida han demostrado la importancia de métodos que indiquen la estabilidad, capaces de separar los productos de degradación de la molécula madre. [13] Sin embargo, los estudios sobre el estrés no determinan automáticamente el tiempo de almacenamiento en condiciones normales. Cualquier afirmación sobre la vida útil debe estar respaldada por datos de estabilidad apropiados obtenidos en condiciones y tiempos específicos.
17. ¿Qué es lo primero que hay que comprobar al comparar dos COA peptidos?
Primero vale la pena comparar la identidad de las muestras, los números de lotes, los métodos analíticos utilizados, las unidades y la base de medición, en lugar de comparar de inmediato los valores porcentuales más elevados que se muestran en los documentos. Dos informes pueden presentar un valor determinado como „pureza” y, al mismo tiempo, medir otras propiedades o tener una capacidad de separación diferente entre las distintas clases de contaminantes. Los estudios que utilizan métodos cromatográficos ortogonales y la determinación del balance de masa muestran la importancia de estas diferencias. [2] [3] Sin establecer si ambos valores se refieren a la misma magnitud y a métodos suficientemente comparables, una comparación directa de los porcentajes puede ser confusa.
18. ¿Significa la pureza de 99% HPLC una pureza de 99% de la proteína peptídica?
No. El resultado de 99% HPLC más a menudo significa que al detector cromatográfico se le han asignado 99% respuestas. Sin embargo, un resultado de 99% contenido de péptido requeriría una medición cuantitativa que indique que el péptido objetivo representa el 99% de la cantidad de muestra apropiada, basándose en una base claramente definida. El agua, los iones anti, los disolventes residuales y otros componentes pueden aumentar la masa física de la muestra sin afectar proporcionalmente al porcentaje de área superficial de la RP-HPLC-UV.[2] Por lo tanto, ambos valores pueden variar significativamente, aunque ninguna de estas dos mediciones tenga que ser errónea.
19. ¿Puede un péptido pasar la prueba de pureza HPLC y, sin embargo, tener una estereoquímica incorrecta?
Potencialmente sí. La RP-HPLC convencional no tiene que separar todos los estereoisómeros posibles, especialmente cuando las moléculas tienen propiedades físicoquímicas muy similares. De manera similar, un simple análisis de masa de toda la molécula no permite distinguir los estereoisómeros con la misma composición elemental. Los estudios sobre la pureza estereoisomérica de los péptidos muestran por qué pueden ser necesarias métodos especializados y un control preciso del procedimiento de preparación de la muestra. [6] Si bien un método de PLRP-HC específico separa un estereoisómero determinado, depende de la selectividad demostrada de dicho método, y no solo del hecho de que se haya realizado un análisis de RP-HPLC.
20. ¿El COA confirma que toda la partida es idéntica a la muestra analizada?
No por sí mismo. COA presenta los resultados relacionados con la muestra y la lotería indicadas en la documentación analítica. Ampliar estos resultados a toda la lotería requiere un sistema adecuado de muestreo, coherencia en el proceso, uniformidad, identificabilidad y otras medidas de control de calidad. La elaboración de materiales de referencia muestra por qué la uniformidad se evalúa como una cualidad independiente y no simplemente como una premisa. [8] COA puede por lo tanto proporcionar pruebas analíticas importantes sobre la lotería, pero la fuerza de los resultados que incluyen todo el material depende de un sistema de calidad más amplio que vincula la muestra analizada con la lotería representada en el informe.
Restricciones a la interpretación de la pureza de los péptidos y la COA
Al interpretar los informes analíticos sobre péptidos, hay que tener en cuenta algunas limitaciones.
En primer lugar, la pureza depende de la metodología. El resultado del RP-HPLC-UV describe lo que midió un sistema cromatográfico y un detector específicos. Un mecanismo de separación diferente puede revelar componentes que la primera metodología no pudo separar. [1] [3]
En segundo lugar, la superficie cromatográfica y la masa física tienen diferentes bases de medición. El agua, los antipartículas, las partículas de otras sustancias y las diferencias en la respuesta del detector pueden hacer que el porcentaje de superficie de la HPLC no coincida con la masa molar del péptido objetivo. [2]
En tercer lugar, la masa molecular esperada constituye una prueba débil pero incompleta de la identidad. Las isómeras, las variantes posicionales y las diferencias estereoquímicas pueden requerir la aplicación de métodos estructurales adicionales. [4] [5] [6]
Cuarto, los propios métodos analíticos pueden generar artefactos. La preparación de la muestra, la hidrólisis, la derivatización, el almacenamiento y la manipulación del material pueden alterar el analito o la característica analizada. [6]
Cinco: una muestra analizada no es automáticamente equivalente a cada recipiente ni al mismo material en un momento posterior. La uniformidad, la identificabilidad de la lotería y la estabilidad son temas separados. [8]
En sexto lugar, los análisis químicos no responden a las preguntas de microbiología. El HPLC y la espectrometría de masas no confirman la esterilidad ni el nivel de endotoxinas. [10] [11]
Siete, la caracterización química no confirma la actividad biológica ni la seguridad clínica. Estos son temas separados que requieren otros tipos de pruebas. [12]
Finalmente, el resultado obtenido en un momento dado no confirma la estabilidad a largo plazo. La evaluación de la estabilidad requiere datos adecuados obtenidos a lo largo del tiempo y en condiciones específicas. [13]
Estas limitaciones no significan que COA no tenga valor.
Sin embargo, explican cómo debe interpretarse correctamente.
Resumen
El certificado de análisis de un péptido es más útil cuando se lo considera como una colección de medidas analíticas separadas, y no como una sola evaluación de la calidad.
La pureza indicada al principio es solo el comienzo de la interpretación.
Un resultado como 99% RP-HPLC representa el perfil de respuesta del detector en un método cromatográfico específico. No implica automáticamente que las 99% unidades de masa física del polvo constituyan el péptido objetivo. [1] [2]
La espectrometría de masas puede proporcionar fuertes evidencias sobre la masa atómica y algunas características estructurales, pero la concordancia entre la masa de toda la molécula y la masa esperada no confirma por sí sola todos los aspectos de la secuencia, la estructura de los extremos, la estereoquímica ni la interconexión molecular. [4] [5] [6]
La cantidad de un péptido requiere su propia base cuantitativa.
El agua, el antiojo, los residuos de otras sustancias y las contaminaciones peptídicas relacionadas pueden influir en la relación entre la masa del material fundido y la cantidad real de péptido objetivo. [2] [7] [9]
Por eso, al leer el COA, vale la pena hacer varias preguntas separadas:
¿Qué muestra se analizó?
¿A qué partido se aplica?
¿Qué método analítico se utilizó?
¿Qué significa exactamente la tasa porcentual reportada?
¿Qué unidades y qué base de cálculo se utilizaron?
¿Se estudió la identidad molecular independientemente de la pureza cromatográfica?
¿Se ha determinado la verdadera cantidad de péptido?
¿Se midió agua o anticongelante en los casos apropiados?
¿Se ha evaluado la estereoquímica si tiene importancia para la molécula en cuestión?
¿Qué propiedades no se han estudiado?
Es especialmente importante distinguir entre „no se detectó” y „no se estudió”.
La ausencia de un resultado no debe interpretarse como prueba de un paso positivo en el test.
De la misma manera, un estudio realizado por un laboratorio independiente puede constituir una valiosa fuente adicional de información, pero el propio término „third-party tested” no describe el método de obtención de la muestra, su relación con la lotería, el alcance analítico, la homogeneidad ni si el resultado se puede transferir a cada envase.
Los métodos químicos habituales también tienen límites claramente definidos.
El HPLC no confirma la esterilidad.
La pureza de HPLC no confirma el nivel de endotoxinas.
La pureza química no confirma la actividad biológica.
El COA no representa una evaluación de la seguridad clínica.
Un resultado analítico obtenido en un momento determinado no confirma una estabilidad ilimitada. [10] [11] [12] [13]
La interpretación más científicamente fundamentada es, por tanto, siempre la más amplia posible, según lo permitan los datos disponibles, y no más amplia.
Un informe analítico bien documentado puede proporcionar información sólida sobre la identidad, la composición y la cantidad del material que se encuentra en la muestra analizada.
Su valor aumenta cuando se describen claramente los métodos utilizados, la base de medición, la identificabilidad del material y los límites de los distintos ensayos.
La regla más importante es simple:
Identidad, pureza, cantidad, estereoquímica, estado microbiológico, actividad biológica, estabilidad y seguridad son diferentes preguntas. Una certificación de análisis confiable ayuda a responder a las preguntas que realmente se han examinado; no debe ser utilizada para sugerir respuestas a cuestiones que no se han examinado.
Descargo de responsabilidad
El artículo tiene carácter exclusivamente educativo y científico-informacional. Explica las normas generales de la química analítica de los péptidos, la interpretación de los certificados de análisis (COA), la cromatografía de HPLC, la espectrometría de masas, la determinación de la cantidad de péptido, la evaluación de las contaminaciones, la identificabilidad del material y los métodos de investigación relacionados. No constituye una recomendación médica, una recomendación de uso del producto, una evaluación de seguridad, una autorización de producción ni una confirmación de que cualquier péptido o material que lo contenga sea adecuado para su uso en humanos. Los resultados analíticos deben siempre interpretarse en relación con la muestra específica, la lotería, el método utilizado, la base de medición, la especificación, el problema analítico estudiado y los límites del ensayo realizado.
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