Чистота на пептидите и лабораторни изследвания: как да се чете сертификатът за анализ (COA)

Чистотата на пептида описва състава на пробата, определен чрез конкретен аналитичен метод. Сама по себе си тя не потвърждава пълната идентичност на пептида, действителното му количество в пробата, стерилността, биологичната активност, стабилността или безопасността. Сертификатът за анализ, най-често обозначаван с абревиатурата COA, е най-полезен, когато всеки резултат, посочен в него, се разглежда като отговор на конкретен аналитичен въпрос.

Ето защо информация като „99% чистота” изисква подходящ контекст.

Означава ли 99%, че основният хроматографски пик съответства на 99% от общата интегрирана реакция на детектора при анализа HPLC? Тази стойност представлява ли масовия дял на целевия пептид, като се отчитат водата, противойоните и другите съставки? Оценена ли е стереохимичната чистота? Какви видове примеси може да открие дадената метода и кои могат да останат извън нейния обхват?

Тези разграничения са важни, тъй като няколко различни параметъра често се обозначават с една и съща дума – „чистота”, въпреки че всъщност те описват различни свойства на пробата.

Изследванията в областта на анализа на пептидите показват защо това е важно. Структурно сходни примеси понякога могат да останат скрити в на пръв поглед прост хроматографски пик, докато вода, противойони, остатъци от други вещества и сродни съединения могат да повлияят на общата маса на изолирания пептиден материал. [1] [2]

Това са отделни аналитични проблеми и изискват различни видове доказателства.

Ето защо при оценката на COA на пептида е по-полезно от самия въпрос:

„Какъв е процентът на чистота?”

Въпросът е:

„Какво точно е било измерено, с какъв метод, върху каква проба и какво всъщност следва от това измерване?”

Какво всъщност означава „чистота“ на пептида?

Чистотата е резултат, получен въз основа на определена методология

Думата „чистота” може да подсказва едно-единствено, лесно измеримо свойство. На практика обаче лабораториите могат да изразяват чистотата на пептида по няколко различни начина.

Това може да бъде, наред с другото:

• процент от хроматографската повърхност;
• масово участие;
• химическа чистота;
• стереохимична чистота;
• профил на замърсителите, свързани с последователността;
• чистота, определена съгласно конкретна аналитична метода.

Тези стойности не трябва да се разглеждат като взаимозаменяеми.

Хроматографската чистота обикновено описва частта от интегрирания отговор на детектора, която се приписва на основния компонент на пробата.

Масовият дял определя масата на дадено вещество спрямо общата маса на изследвания материал.

Стереохимичната чистота, от друга страна, се отнася до съотношението на различните пространствени конфигурации на молекулата или на аминокиселинните остатъци, от които тя се състои.

Ето защо правилно представената информация за чистотата трябва, доколкото е възможно, да дава отговор на четири въпроса:

какво е измерено + как е измерено + как е изчислен резултатът + каква проба е изследвана.

Самото твърдение:

„99% чистота”

предава значително по-малко информация от:

„99% площ на основния пик според RP-HPLC-UV”.

Дори и втората версия обаче не дава отговор на всички въпроси.

Трябва също така да се знае дали използваната хроматографска метода е била в състояние да раздели значимите примеси и дали използваният детектор е бил в състояние да ги открие.

Какво означава процентът на пиковата площ при HPLC?

Опростено казано, изчислението, основано на нормализирането на площта на пиковете, може да се представи по следния начин:

площта на основния пик ÷ общата площ на включените пикове × 100.

Ако на основния пик са присвоени 990 единици площ, а сумата на отчетения хроматографски сигнал е 1000 единици, площта на основния пик ще бъде:

990 ÷ 1000 × 100 = 99%.

Това е информация относно реакцията на детектора, получена при определени хроматографски условия.

Това не означава автоматично, че:

99% от физическата маса на праха представлява целевият пептид.

Има няколко причини за тази разлика.

Различните химични съединения могат да предизвикат различна реакция на детектора, изчислена на единица маса.

Някои съставки на пробата могат да абсорбират слабо лъчението при използваната дължина на вълната.

Други може изобщо да не бъдат включени в хроматографските изчисления.

Някои примеси могат също да се елуират заедно с основния компонент.

Важна е и думата „взети предвид”.

Хроматографските изчисления зависят от решенията относно:

• интегриране на пиковете;
• прагове за отчитане;
• избор на базова линия;
• сигнали, свързани с разтворителя;
• неразделени пикове;
• настройки на детектора;
• правила за изключване на определени сигнали.

Ето защо процентът на площта на HPLC трябва да се тълкува като резултат от конкретен хроматографски метод, а не като универсално описание на целия физически състав на пробата.

Сродните замърсители могат да бъдат трудни за разделяне

Присъстващите в пептидите примеси могат да бъдат структурно много сходни с желаното молекула.

Те могат да включват, наред с другото:

• делеционни последователности;
• съкратени последователности;
• променени странични вериги;
• окислени форми;
• модифицирани крайни групи;
• позиционни изомери;
• стереоизомери;
• продукти с непълно покритие;
• други варианти, възникващи по време на синтез на пептиди или деградация.

Някои от тези структури могат да се различават значително по хроматографското си поведение от целевия пептид.

Другите могат да се държат много подобно.

В едно от изследванията е използвана двуизмерна течна хроматография, съчетана с масова спектрометрия, за оценка на чистотата на основния пептиден пик. Изследователите са приложили допълнителни условия за разделяне, тъй като пептидните изомери със същото съотношение маса/заряд не са могли да бъдат разграничени само въз основа на рутинно измерване на масата. [1]

В друго проучване, обхващащо четири синтетични циклични пептида, бе направено сравнение между хроматографията с обърната фазова система и хроматографията на хидрофилни взаимодействия.

Двата метода разделяха замърсителите по различен начин. [3]

Това не означава, че някоя от тези техники е винаги по-добра.

Това обаче илюстрира феномена на комплементарната селективност: два аналитични метода могат да разделят една и съща смес по различен начин, тъй като използват различни физикохимични свойства на изследваните молекули.

Ето защо:

Един чист хроматограма не означава непременно, че липсват всички структурно сходни примеси.

Водата и противойоните също оказват влияние върху състава на материала

Изолираният пептиден материал може да съдържа съставки, които не са допълнителни пептидни последователности.

Сред важните примери са:

• вода;
• противопоставени;
• остатъци от разтворители;
• неорганични вещества;
• други съставки, свързани с производствения процес.

Противойони са йони с противоположен електрически заряд, свързани с заредените групи на пептида.

В пептидната химия могат да се срещнат, например, оцетна киселина или трифлуорооцетна киселина.

Наличието им не означава непременно грешка в синтеза или замърсяване. Пептидът може умишлено да се намира под определена солева форма.

Тези съставки обаче имат значение, когато искаме да отговорим на въпроса:

колко от целевия пептид действително се съдържа в претегленото количество материал?

Следователно тълкуването зависи от това дали отчетената стойност се отнася до:

• самия пептид;
• пептидна сол;
• сух материал;
• безводен материал;
• материала в състоянието, в което е получен.

В проучването в Субланцин от 2026 г. учените определиха съдържанието на вода, трифлуорооцет, органични съединения и неорганични замърсители в рамките на по-широкообхватен анализ на масовия баланс. [2]

В крайна сметка приписаният дял на пептида беше значително по-нисък от този на 100%, въпреки че структурно сродните органични примеси съставляваха сравнително малка част от материала.

Това е практически пример за важна разлика:

Чистият хроматографски профил на пептида и високият масов дял на целевия пептид не са един и същ параметър.

Процентът на чистота не е показател за вероятността за безопасност

Процентното съотношение, което определя чистотата, не показва колко голяма е вероятността даден материал да е безопасен.

Например, резултатът 99% за чистота не означава:

„99% – безопасност”.

Освен това не се предоставя информация за биологичното значение на всяко вещество, съдържащо се в останалата част от 1%.

Малко количество от едно вещество може да има по-голямо аналитично или биологично значение от по-голямо количество от друго вещество, в зависимост от:

• неговата самоличност;
• биологична активност;
• концентрации;
• начини на излагане;
• предвиденото приложение;
• други контекстуални фактори.

По същия начин правилно идентифицирано молекула с много висока химическа чистота може сама по себе си да притежава определени биологични свойства.

Химичната чистота и биологичната безопасност отговарят следователно на съвсем различни въпроси.

Изследването за чистота служи за охарактеризиране на пробата в рамките на възможностите на използваната аналитична метода.

Не превръща резултата от химичния анализ в обща оценка на безопасността при употреба от хора.

HPLC и масова спектрометрия

Какво може да ни каже HPLC?

Високоефективната течна хроматография (HPLC) разделя съставките на пробата въз основа на разликите в тяхното взаимодействие със стационарната фаза и с протичащата подвижна фаза.

При анализа на пептидите широко се използва хроматография HPLC с обърната фазова система (RP-HPLC), често в комбинация с UV-детекция.

Хроматограмата показва реакцията на детектора във функция на времето.

От него могат да се извлекат няколко важни сведения.

Времето на задържане показва момента, в който даден компонент напуска хроматографската система при определени условия.

Площта на пика представлява интегрирания отговор на детектора.

Формата на пика дава информация за хроматографското поведение на веществото.

Разделителната способност описва колко ефективно се разделят съседните компоненти един от друг.

Времето на задържане обаче не е уникален молекулярен „отпечатък”.

Различните молекули понякога могат да се елюират за сходно време.

Същият пептид може също така да покаже различни времена на задържане след промяна:

• колони;
• състава на подвижната фаза;
• наклона;
• скорост на потока;
• температури;
• конфигурация на апаратурата;
• други параметри на метода.

Изследванията, сравняващи различни системи за разделяне на пептиди, показват до каква степен хроматографската селективност зависи от използваната метода. [1]

Съвпадението на времето на задържане може следователно да подпомогне идентифицирането в съответния контекст, но не трябва автоматично да се приема като пълно потвърждение на структурата.

Защо една пикова стойност не означава непременно едно вещество?

Коелюция възниква, когато две или повече съставки напускат хроматографската система в толкова близко време, че не се разделят достатъчно добре.

В резултат на това те могат да изглеждат като една пика.

Дори визуално симетричният основен пик не доказва автоматично, че целият сигнал произхожда от един и същ вид частици.

Съставът на пика може да се изследва по-подробно чрез:

• промяна на хроматографската селективност;
• използване на друга стационарна фаза;
• анализ при няколко дължини на вълната;
• комбинация от хроматография и масова спектрометрия;
• двуизмерна хроматография;
• прилагане на друга допълваща аналитична техника.

Никой от тези методи обаче не открива автоматично всяко възможно замърсяване.

Сродните съединения могат да имат:

• подобно време на задържане;
• подобни УВ спектри;
• еднаква номинална маса;
• други общи аналитични свойства.

Изследване на циклични пептиди, при което хроматографията с обърната фазова система беше сравнена с хроматографията на хидрофилни взаимодействия, показа ясно различаващи се профили на елуиране на примесите. [3]

Това не означава, че всеки основен източник на пик съдържа допълнителни замърсители.

Изявлението е по-точно:

Привидната простота на хроматограмата е резултат, получен в една система за разделяне, а използването на друга селективност може да разкрие съставки, които първият метод не е разделил.

Какво измерва масова спектрометрия?

Масовата спектрометрия (MS) открива йони въз основа на съотношението между тяхната маса и заряд, което се изразява като m/z.

При анализа пептидът може да има повече от един електрически заряд.

Ето защо едно пептидно молекула може да генерира няколко сигнала, съответстващи на различни състояния на заряд, вместо един пик, който пряко съответства на неутралната молекулна маса.

Правилното тълкуване на данните позволява да се определи или потвърди основната молекулна маса.

Масовата спектрометрия може да предостави ценна информация относно:

• молекулна маса;
• някои химически модификации;
• определени замърсители;
• изотопни модели;
• поведение при фрагментация.

Масовата спектрометрия с висока разделителна способност позволява по-точно разграничаване на молекули с много близки маси.

Тандемната масова спектрометрия (MS/MS) се основава на фрагментирането на избрани йони и анализа на получените продукти, като по този начин предоставя допълнителна информация за структурата.

Все пак обаче важи един важен принцип:

Наблюдаването на очакваната молекулна маса ≠ доказване на пълната молекулна структура.

Различните структури могат да имат една и съща маса.

Стереохимичните промени може да не оказват влияние върху елементния състав.

Позиционните изомери също могат да изискват допълнителни доказателства.

Изследванията, свързани със замърсяванията на синтетичния пептид, който служи като субстрат на ренина, показаха това ограничение. За да се разграничат модификациите, настъпващи на различни позиции в изобаричната смес, бяха необходими допълнителни данни, получени чрез фрагментация и дериватизация. [4]

Последователност, крайни групи и стереохимия

Идентичността на пептида обхваща много повече от просто неговото име.

Сред съществените структурни характеристики могат да бъдат:

• аминокиселинна последователност;
• конфигурация на отделните остатъци;
• структура на N-края;
• структура на С-края;
• модификации на страничните вериги;
• разположението на дисулфидните мостове;
• циклизация;
• конюгация;
• други ковалентни свойства.

Например, пептидът с карбоксилна киселина в С-края е химически различно съединение от съответния пептид с амидна група в С-края.

Изследователите разработиха метод за масова спектрометрия, подпомаган от дериватизация, именно с цел по-ефективно разграничаване на тези крайни форми. [5]

Това илюстрира един важен принцип:

Аналитичният метод трябва да бъде подбран в зависимост от конкретния структурен въпрос.

Стереохимията представлява допълнително предизвикателство.

Пептидът, съдържащ D-аминокиселина, и съответстващият му вариант с L-аминокиселина могат да имат еднаква молекулна маса, но в същото време да се различават по пространственото разположение на атомите.

В проучването относно стереохимичната чистота на пептидите беше приложена методика, разработена така, че да отчита рацемизацията, възникваща по време на хидролизата на пробата. [6]

Без такъв контрол самото подготвяне на пробата би могло да промени характеристиката, която се опитваме да измерим.

Следователно надеждният анализ на пептидите зависи не само от параметрите на апаратурата, но и от правилната подготовка на пробата и от дизайна на метода.

LC-MS съчетава предимствата на двата метода, но не премахва всички ограничения

Течностната хроматография, съчетана с масова спектрометрия (LC-MS), съчетава хроматографското разделяне с масова анализ.

По този начин той може да предостави значително повече информация, отколкото всеки един от тези методи, приложен поотделно.

LC-MS може да бъде от полза, наред с другото, за:

• да се приписват определени количества на пиковете на замърсяване;
• да разграничава хроматографски сходни съставки с различна маса;
• да изследва продуктите на разграждането;
• да опише замърсяванията, свързани с последователността;
• да подкрепя структурните преразпределения.

При изследването на синтетичния окситоцин чрез вътрешно валидиран метод на течна хроматография (LC), съчетан с масова спектрометрия с висока разделителна способност, бяха идентифицирани и количествено определени 18 структурно свързани примеси. [7]

Изследователите обясниха също така защо тези замърсители е трябвало да бъдат взети предвид при определянето на чистотата на референтния материал.

Тези резултати обаче се отнасят до конкретна проба, метод и изследван профил на замърсителите.

Не трябва да се разглеждат като изчерпателен списък на замърсителите, присъстващи във всеки материал, съдържащ окситоцин.

LC-MS е, следователно, изключително полезна комбинация от аналитични техники.

Все пак един добър LC-MS доклад трябва да обясни:

• това, което е било измерено;
• как са присвоени отделните пикове;
• по какъв начин са били идентифицирани предложените структури;
• дали присвояванията са потвърдени;
• какъв количествен метод е бил приложен;
• какви аналитични ограничения остават.

Идентичността, чистотата и количеството са различни параметри

Идентичността отговаря на въпроса: коя молекула е налице?

Изследването за идентичност има за цел да отговори на въпроса дали анализираният материал съответства на желаната субстанция.

В зависимост от пептида и изследвания проблем доказателствата за идентичността могат да включват:

• масата на цялото молекула;
• данни за фрагментацията;
• анализ на последователността;
• характеристики на крайните групи;
• аминокиселинен състав;
• разположението на дисулфидните мостове;
• спектроскопични данни;
• хроматографско сравнение с еталонния материал;
• комбинация от няколко метода.

Един метод може да потвърди определен елемент от идентичността, без да решава всички останали структурни въпроси.

Например:

„беше наблюдавана очакваната маса на цялата молекула”

е по-тесно формулирано твърдение от:

„беше потвърдена пълната молекулярна структура”.

Изследванията, свързани с терминалната амидиране и изобаричните пептидни примеси, показват защо това разграничение е важно. [4] [5]

И в двата случая бяха необходими сведения, които надхвърляха самото наблюдение на пика на масата в близост до очакваната стойност.

Чистотата дава отговор на въпроса: какво друго се съдържа в пробата?

Анализът на чистотата изследва състава на пробата в определен аналитичен диапазон.

В зависимост от метода докладът може да съдържа:

• основна съставка;
• отделни замърсители;
• общото количество на откритите замърсители;
• процент от площта на основния връх;
• стереохимични замърсявания;
• сродни вещества;
• общо масово съотношение.

Различните видове замърсявания може да изискват различни методи.

Хроматографският метод, оптимизиран за откриване на делеционни последователности, не е необходимо да дава отговор на въпроси, свързани със стереохимията.

Методът, основан на масата, може да не прави разграничение между изомерите.

Киралният метод, от друга страна, може да предостави малко информация за съдържанието на вода.

Целта на прилагането на допълващи се методи не е просто да се събере по-голям брой резултати.

Става въпрос за получаване на отговори на различни аналитични въпроси, които не могат да бъдат решени самостоятелно с един-единствен метод.

Количеството отговаря на въпроса: колко от веществото е налично?

Количеството може да се отнася до няколко различни параметъра.

Може да означава:

• концентрацията на пептида в разтвора;
• общото количество пептид в съда;
• масово съотношение на целевия пептид;
• моларна концентрация;
• количество на единица обем;
• друг ясно дефиниран количествен параметър.

Всеки от тези методи изисква подходяща единица и основа за изчисление.

Количественото хроматографско определяне обикновено изисква подходяща калибрация и не трябва да се основава единствено на нормализиране на площта на пиковете.

Към подходящо разработените методи за определяне на количеството могат да допринесат също:

• аминокиселинна анализ;
• количествен ядрен магнитен резонанс;
• методи за изотопно разреждане;
• други валидирани количествени методи.

Важно е да се отбележи, че сродните пептидни примеси могат да повлияят на някои количествени измервания.

Изследванията относно чистотата на окситоцина подчертаха необходимостта резултатите да се коригират с оглед на такива примеси, вместо да се приема, че всяка измерена аминокиселина или аналитичен сигнал произхожда изключително от целевото молекула. [7]

Пример: процент от площта на HPLC спрямо действителното количество пептид

Нека си представим един хипотетичен пептиден прах, за който са получени следните данни:

RP-HPLC-UV, площ на основния пик = 99,0%

и

независимо определено масово съдържание на целевия пептид = 78,0% в материала в полученото състояние.

Тези резултати не е задължително да си противоречат.

Те имат различни знаменатели и отговарят на различни аналитични въпроси.

Ако се отмерят 10,0 mg от такъв хипотетичен прах, а валидираната стойност на масовото съотношение на целевия пептид е 78,0%, количеството пептид, получено в резултат на това определяне, би било:

10,0 мг × 0,780 = 7,80 мг.

Не бива да се приема автоматично, че:

10,0 мг × 0,990 = 9,90 мг

единствено поради факта, че основният пик съответстваше на 99,01 TP30T от отчетената UV площ.

Това е само аналитична илюстрация и не описва нито един конкретен търговски продукт, нито експериментален материал.

Изследването на субланцина представлява реален пример за принципа, който стои в основата на това разграничение, тъй като при оценката на състава на материала се вземаха предвид поотделно, наред с другото, водата и противойоните. [2]

Числовите стойности от това проучване не трябва да се прилагат към други пептиди.

Неопределеност на измерването и измервателна съгласуваност

Резултатът от анализа не трябва да се разглежда като стойност с безкрайна точност.

Това е оценка, получена чрез определена процедура за измерване.

Несигурността на измерването описва диапазона или разпределението на стойностите, които могат обосновано да бъдат свързани с резултата от измерването в съответствие с приложената методология за оценка.

Това не означава, че лабораторията знае, че резултатът ѝ е грешен.

Вместо това дава информация за границите на статистическата достоверност.

Измервателната съгласуваност се отнася до документираната връзка между резултата и съответния еталон чрез веригата на калибриране.

Тя спомага за осигуряването на съпоставимост на измерванията, но единствено за конкретния параметър, който действително е бил измерен, и за установената верига от еталони.

В проучването, свързано с разработването на референтен материал за NT-proBNP, бяха съчетани методи за изотопно разреждане, коригирани с оглед на примесите, с оценка на хомогенността и стабилността на материала. [8]

Това показва защо надеждното определяне на количествена стойност изисква много повече от просто отчитане на числото, генерирано от устройството.

Как се чете сертификатът за анализ (COA)?

Започнете с идентифицирането на пробата и партидата

Преди да се интерпретира какъвто и да е резултат от анализ, трябва да се установи какъв материал всъщност е бил изследван.

Един полезен COA трябва да съчетава резултатите с идентификационна информация, като например:

• наименование или описание на материала;
• идентификатор на пробата;
• номер на партидата или серията;
• съответните дати;
• структурна форма;
• формата на солта, ако това има значение;
• промени в краищата или други съществени структурни характеристики.

Това е важно, тъй като резултатите от анализа се отнасят до пробата, която действително е била изследвана.

Сертификатът за една партида не потвърждава пряко състава на друга партида.

По същия начин анализът, извършен върху проба от смесения материал, не доказва автоматично количеството или състоянието на материала във всеки отделен контейнер, напълнен по-късно, освен ако системата за вземане на проби, пълнене, оценка на еднородността и контрол на процеса не обосновава такова заключение.

Това са въпроси, свързани със съгласуваността и проследимостта на материала.

Това не означава автоматично неправилно поведение или ниско качество.

Читателят на доклада просто се нуждае от обоснована връзка:

доклад → изследвана проба → партида или материал, за който се отнася резултатът.

Прочетете заедно метода, резултата, единицата и спецификацията

COA често представя както критерия за приемане, така и действително получения резултат.

Например:

Спецификация: не по-малко от 98,0%

и

Резултат: 99,21 TP30T.

Това са две различни информации.

Спецификацията определя критериите за приемане.

Резултатът показва измерената стойност за конкретната проба.

Също толкова важни са единицата и базата за измерване.

Могат да се срещнат, наред с другото:

• area%;
• mass%;
• мг/опаковка;
• mg/mL;
• µg/mL;
• mol/L;
• резултат, изчислен на базата на сухата маса;
• резултат, изчислен на базата на безводното вещество;
• резултат за материала в полученото състояние.

Тези стойности не могат да се заменят произволно.

Например, резултатът, определен като „в състоянието, в което е получен”, отразява състоянието на материала в момента на изследването, докато безводната или коригираната стойност може математически да изключи водата от основата за изчисление.

Означението „pass” означава, че посоченият резултат отговаря на определени критерии за приемане за конкретния тест.

Тя не разширява обхвата на това проучване.

Ето защо:

преминат тест за идентичност ≠ потвърдена стерилност

и

преминал тест за чистота HPLC ≠ определено съдържание на пептид,

освен ако тези свойства не са били измерени независимо.

Примерна интерпретация на записите в сертификата за произход (COA)

Посочените по-долу записи са хипотетични и служат единствено за илюстриране на начина на интерпретиране на аналитичните данни. Те не описват реална партида, нито предлагат критерии за приемане.

Представените разграничения се основават на изследвания, свързани с чистотата на основния пептиден пик, противойоните и определянето на масовия дял. [1] [2] [9]

Посочените цифри и форматът на таблицата имат изцяло образователен характер.

Проверете хроматограмата и спектъра

Допълнителните аналитични данни помагат за правилното тълкуване на резултатите, обобщени в COA.

Когато става въпрос за хроматограма, е добре да се обърне внимание на:

• идентификатор на пробата;
• идентификатор на метода;
• осите на хроматограмата;
• тип на детектора;
• дължина на вълната;
• значими периоди на задържане;
• обозначенията на пиковете;
• таблица на замърсителите;
• резултати от интеграцията;
• прагове за отчитане.

Хроматограмата, която е изрязана така, че да показва само големия основен пик, може да пропусне информация, необходима за правилната интерпретация на резултата за чистотата.

При масова спектрометрия полезният контекст може да включва:

• очакваната молекулна форма;
• очакваното тегло;
• наблюдавани йони;
• зададени състояния на заряд;
• деконволюция;
• грешка в масата;
• данни за фрагментацията, ако има такива;
• основа за присвояване на структурата.

Спектърът на масата на цялата молекула, деконволюираната молекулна маса и структурните доказателства, основани на фрагментация, са взаимосвързани, но не означават едно и също нещо.

COA не е задължително да съдържа всички необработени файлове от оборудването.

Въпреки това, аналитичните заключения, обобщени в него, трябва да могат да бъдат свързани с изходната документация, която може да бъде проверена, ако възникнат въпроси относно определянето на структурата или числовия резултат.

„Не е установено” и „не е изследвано” означават нещо съвсем различно

„Не е открит” означава, че прилаганият аналитичен метод не е открил изследвания компонент при определени условия и при съответната си чувствителност.

Това не означава, че действителната концентрация е точно нула.

„Под границата на определяемост” означава, че даден компонент може да присъства в количество, което даденият метод не е в състояние да определи количествено с достатъчна точност.

Това е съвсем друга ситуация.

„Не е изследвано” означава, че за даденото свойство не е извършено измерване.

Това не трябва да се тълкува като:

„правилен резултат”

или:

„липсващо вещество”.

Правилното тълкуване на информацията за откриването или количественото определяне изисква също така познания по:

• границата на откриваемост или определяемост;
• единици;
• основи на отчетността;
• използваната метода;
• начина на подготовка на пробата.

Какво допринася независимото лабораторно изследване?

Независима лаборатория може да предостави допълнителни аналитични измервания за изпратената проба.

Това може да увеличи количеството на наличните доказателства, свързани с конкретен материал.

Самият термин:

„проверено от независима лаборатория”

но не обяснява:

• какво точно е било изследвано;
• колко проби са били изследвани;
• кой е избрал пробата;
• кой я е изтеглил;
• дали е била представителна;
• от коя партия беше;
• какви методи са използвани;
• може ли докладът да бъде проверен;
• дали пробата съответства на материала, който ще бъде разпространен по-късно;
• каквито свойства изобщо не са били включени в изследването.

Следователно най-полезните въпроси се отнасят до:

идентичността на пробата + проследимостта на партидата + начина на вземане на пробата + обхвата на анализа + автентичността на лабораторния доклад.

Независимото проучване не премахва ограниченията на използваните методи.

HPLC, изготвено от външна лаборатория, продължава да бъде изследване HPLC.

Това не се превръща в тест за стерилноста, определяне на съдържанието на пептид, стереохимичен анализ или изследване на биологичната активност само защото е било проведено от независим субект.

Ето защо е добре COA да се оценява преди всичко от гледна точка на аналитичния обхват и възможностите за проследяване на пробата, а не само въз основа на логото на лабораторията или високия процентен дял, посочен в началото на документа.

Какво не потвърждават рутинните лабораторни изследвания?

HPLC не потвърждава стерилността

Рутинният анализ на пептида HPLC изследва химичните съставки въз основа на тяхното хроматографско поведение.

Това не е метод за откриване на живи микроорганизми.

Следователно чистият хроматограма не може да потвърди, че пробата е стерилна.

Стерилността е микробиологичен въпрос, който изисква подходящи методи и контрол на производствения процес.

Дори отделното изследване за стерилност има ограничения, свързани с вземането на проби, тъй като директно се изследва само частта от материала, използвана в теста.

Поради тази причина осигуряването на стерилноста във фармацевтичното производство се основава на по-широка система за производство и контрол, а не само на крайното изпитване на продукта.

Насоките на FDA относно асептичното производство разглеждат микробиологичния контрол и изпитването за стерилност като отделни елементи на процеса. [10]

Ето защо:

висока чистота HPLC ≠ стерилност

и

липса на видими хроматографски примеси ≠ липса на микроорганизми.

Изследването за ендотоксини дава отговор на друг въпрос

Ендотоксините са бактериални съставки, по-конкретно вещества, свързани с липополизахаридите на грамотрицателните бактерии.

Те не са същото като живите бактерии.

Следователно изследването за бактериални ендотоксини дава отговор на друг въпрос, различен от този при теста за стерилност.

Теоретично пробата може да не съдържа откриваеми живи бактерии, но въпреки това да съдържа определени съставки от бактериален произход.

По същия начин тестът за стерилност не може автоматично да замести определянето на ендотоксините.

Матрицата на пробата също може да повлияе на изследването за ендотоксини.

Следователно е важно методът да бъде подходящо адаптиран и да се контролират смущенията.

Насоките на FDA относно пирогените и ендотоксините разглеждат аналитичните ограничения, както и разликата между бактериалните ендотоксини и другите пирогенни вещества. [11]

Рутинният анализ на чистотата на HPLC не може да замести нито теста за стерилност, нито теста за ендотоксини.

Химичната чистота не доказва биологичната активност

Пробата може да има:

• очакваната молекулна маса;
• голяма площ на основния хроматографски пик;
• сравнително малкото количество открити химически замърсители,

и в същото време да няма потвърдена конкретна биологична функция.

Функционалното поведение може да зависи също от:

• нагъвания;
• разположението на дисулфидните мостове;
• агрегиране;
• структурна конформация;
• състоянието на модификацията;
• условията на теста;
• на използваната биологична система.

Изследването относно синтеза на BPTI ясно показва колко е важно тези въпроси да се разглеждат поотделно.

Учените съчетаха аналитичните и биофизичните характеристики с тест за инхибиране на трипсина. [12]

Като цяло тези резултати предоставяха по-солидни доказателства относно изследвания материал.

Никое отделно измерване не заместваше останалите.

Ето защо:

химична чистота ≠ биологична активност

и

биологичната активност в един тест ≠ пълна характеристика на структурата или производството.

COA не представлява оценка на клиничната безопасност

COA представя резултатите от аналитичните изследвания, проведени върху описаната проба.

Не определя:

• клинична поносимост;
• безопасността на експозицията при хора;
• подходяща доза;
• взаимодействия;
• ефективност;
• дългосрочните ефекти;
• полезност за конкретно лице.

Тези въпроси изискват други видове доказателства.

Този принцип важи дори когато аналитичните резултати са точни и идентичността на пептида е била правилно потвърдена.

Анализът на чистотата може да определи някои аспекти на химичния състав.

Това не може да промени аналитичния доклад за клиничното изпитване, нито оценката на безопасността при употреба при хора.

Един момент във времето не е достатъчен, за да се потвърди срокът на годност

COA обикновено описва материала към определен момент от изследването.

След това пептидите могат да претърпят промени, свързани с:

• деградация;
• окисляване;
• хидролиза;
• деамидиране;
• агрегация;
• абсорбиране на влага;
• структурни прегрупирания;
• други процеси, зависещи от свойствата на молекулата и условията на околната среда.

Следователно резултатът, получен в даден момент, не доказва неограничена стабилност.

Срокът на годност изисква данни, които свързват определените условия на съхранение със запазването на аналитичните свойства на материала във времето.

В проучването на ексенатид бе разработен хроматографски метод, който показва стабилността на веществото, и бяха охарактеризирани продуктите на разграждане, образуващи се при няколко стресови условия. [13]

Това проучване показва как могат да се отделят продуктите на разграждането от изходния пептид.

Той обаче не определя универсален срок на съхранение за всички пептиди, а изкуствените стресови условия не трябва автоматично да се приравняват към нормалните условия на съхранение.

Най-силният извод трябва да съответства на силата на доказателствата

Научно обоснованата интерпретация не бива да излиза извън обхвата на извършените измервания.

Например, COA може да обоснове твърдението:

„В изследваната проба беше получен резултат за масата на цялата молекула, съответстващ на приписания пептид, определено съотношение на площта на главния пик при използваната метода HPLC, както и отделно определено съдържание на пептида”.

Това е ценен набор от аналитични доказателства.

Това обаче не означава автоматично:

„Пептидът е напълно охарактеризиран, стерилен, биологично активен, безопасен, стабилен за неограничен период от време и подходящ за употреба при хора”.

Не става въпрос за оспорване на достоверността на лабораторните изследвания.

Не трябва също така да се очаква, че един-единствен аналитичен метод ще даде отговор на всеки възможен въпрос.

Най-важното е съчетанието:

всяко твърдение → с мярка, която действително може да го обоснове,

като същевременно ясно се посочат въпросите, на които не е получен отговор.

Често задавани въпроси

1. Означава ли степента на чистота 99%, че продуктът е безопасен?

Не. Процентът на чистота описва състава на пробата според определена аналитична метода, а не вероятността за безопасност. Освен това тази стойност може да отразява дела на хроматографския сигнал, а не физическото масово съотношение на целевия пептид. Изследванията на масовия баланс на пептидите показват защо водата, противойоните и другите съставки могат да причинят разлики между тези стойности. [2] Независимо от аналитичната чистота, самата целева молекула също може да притежава свои собствени биологични свойства. Следователно високият резултат за чистота може да подкрепи химическите характеристики на изследваната проба, но не замества токсикологичните, фармакологичните, микробиологичните или клиничните доказателства относно безопасността.

2. Потвърждава ли HPLC стерилността?

Не. Рутинният анализ на пептида HPLC разделя и открива химичните съставки въз основа на тяхното хроматографско поведение. Той не установява дали в пробата липсват живи микроорганизми. Стерилността е отделно свойство, което изисква съответни микробиологични изследвания и контрол на производствения процес. Насоките на FDA относно асептичното производство разглеждат микробиологичния контрол независимо от химичния анализ. [10] Ето защо чистият хроматограма, високият процент на площта на главния пик или очакваното време на задържане на пептида не могат да заменят доказателствата за стерилност.

3. Какво всъщност означава процентът на площта на HPLC?

Процентът от площта на HPLC обикновено означава дела на интегрирания сигнал, приписан на основния пик, в общия отчетен хроматографски сигнал. Резултатът зависи от качеството на разделянето, отзивчивостта на детектора, дължината на вълната, правилата за интегриране, праговете за отчитане и други условия на метода. Следователно той не означава автоматично физическия масов дял на пептида в цялата проба. Изследванията на чистотата на основния пептиден пик показват защо неразделените изомери могат да затруднят интерпретацията. [1] Процентът от площта на HPLC трябва следователно да се разглежда като резултат от конкретен аналитичен метод, чиято измервателна основа трябва да бъде ясно определена.

4. Може ли един пик HPLC да съдържа няколко вещества?

Да. Две или повече съставки могат да се елуират толкова близо една до друга, че в дадената хроматографска система да не бъдат разделени адекватно и да изглеждат като един пик. Ето защо дори визуално симетричният пик не е абсолютно доказателство за молекулярна хомогенност. Изследването на циклични пептиди показа, че друг хроматографски режим осигурява различен начин на разделяне на примесите в сравнение с RP-HPLC. [3] Това не означава, че всеки основен пик съдържа скрити вещества. Показва обаче, че способността за разделяне зависи от селективността на метода и в случая на близкородствени структури може да са необходими допълнителни аналитични техники.

5. Правилното молекулно тегло потвърждава ли правилната последователност на пептида?

Не. Масата на цялото молекула, която съответства на очакваната стойност, представлява ценно доказателство за идентичността, но не е задължително да потвърждава последователността на аминокиселините, стереохимията, вида на крайните групи, местоположението на модификациите или всички други структурни характеристики. Изследвания на примесите в синтетични пептиди са показали съставки със същата маса, но с модификации, разположени на различни позиции, което е наложило необходимостта от допълнителна аналитична информация. [4] Пълната оценка на идентичността изисква следователно методи, подбрани според конкретните структурни неясноти на дадения пептид.

6. Какво е разликата между съдържанието на пептида и чистотата?

Съдържанието на пептида определя колко от дефинирания целеви пептид се съдържа в материала според определена количествена основа. Чистотата, от друга страна, може да означава дела на хроматографския сигнал, приписан на основния компонент, или друг дефиниран параметър за чистота. Водата, противойоните, остатъците от производствения процес и структурно сродните съединения могат да доведат до разлики в тези стойности. При изследването на субланцина няколко от тези компоненти бяха определени поотделно при оценката на масата. [2] Резултатът за съдържанието на пептида и процентът на повърхността на HPLC трябва следователно да се тълкуват поотделно, освен ако валидираната аналитична система не определя недвусмислено зависимостта между тях.

7. Могат ли водата и противойоните да повлияят на количеството пептид в праха?

Да. Водата и противойоните увеличават общата физическа маса на пробата и поради това могат да намалят частта от масата, която се пада на самия целеви пептид, ако резултатът се посочва за материала в състоянието, в което е получен. Изследванията на сублинцина и пептидните противойони показват защо тези съставки може да изискват отделно определяне. [2] [9] Тяхното наличие не означава непременно грешка в синтеза или замърсяване, тъй като противойоните могат да бъдат част от предвидената солна форма. Ключовите въпроси се отнасят следователно до вида на анализираната молекулна форма, количеството на отделните съставки и основата, върху която се базира изчислението.

8. Контрайонът същото ли е като пептидното замърсяване?

Не винаги. Противойоните могат да бъдат очаквана съставна част на пептидната сол, докато примесите, свързани със секвенцията, представляват друга пептидна молекула. Следователно това са различни аналитични категории, въпреки че и двете могат да повлияят на общия състав на пробата. В проучвания, сравняващи антийоните на пептидите, са наблюдавани разлики, зависещи от последователността и формата на солта, в експерименти, свързани с проникването през мембрани. [9] Ако противойоните имат значение за характеристиките на материала, техният вид и количество трябва да се отчитат отделно, а не да се извеждат въз основа на хроматографската чистота на основния пик на пептида.

9. Може ли обикновената масова спектрометрия да разграничи D- и L-аминокиселинните варианти?

Самото измерване на масата на цялото молекула обикновено не позволява да се разграничат структури с идентичен елементарен състав, които се различават единствено по стереохимията си. Вариант D и съответстващият му вариант L могат следователно да имат идентична молекулна маса. Ако въпросът засяга пространствената конфигурация, е необходим подходящ хирален или стереохимичен анализ. При изследването на хиралната чистота на пептидите е използван специално разработен процес, който отчита стереохимичните промени, възникващи по време на подготовката на пробата. [6] Проблемът е от структурен характер, поради което самото повишаване на точността на измерването на масата не решава тази двусмисленост.

10. Защо номерът на партидата в сертификата за произход (COA) е важен?

Номерът на партидата или серията помага да се свържат аналитичните резултати с конкретния материал, който е бил изследван. Резултатите, получени за една партида, не могат автоматично да се прехвърлят към друга партида, нито към всеки контейнер, подготвен в различно време. Изследванията, свързани със сертифицирани референтни материали, оценяват свойства като хомогенност и стабилност, вместо да ги приемат за даденост въз основа на еднократно измерване. [8] Съответният номер на партидата представлява следователно важен елемент на проследимостта, макар че сам по себе си не доказва правилността на вземането на проби, съхранението, боравенето с материала, нито на всички останали елементи на системата за контрол.

11. „Не е открито” означава ли нула?

Не. „Не е открито” означава, че прилаганият метод не е открил анализираното вещество при определените условия и в границите на своята чувствителност. Това не доказва, че действителното количество е точно нула. Резултат, който е под границата на откриваемост или определяемост, трябва да се тълкува заедно с съответната гранична стойност, единицата, основата на пробата и аналитичните условия. Насоките за изследване на ендотоксини също разглеждат значението на чувствителността на методите и възможните интерференции. [11] Научно обоснованото заключение следва следователно да се отнася до това, което методът е могъл да открие, а не до абсолютно твърдение за пълната липса на веществото.

12. Какво означава „неточност на измерването“ в доклада?

Неопределеността на измерването описва разпределението на стойностите, които могат обосновано да бъдат свързани с получения резултат в съответствие с приложената оценка. Това не означава, че лабораторията счита своя резултат за грешен. То показва границите на числовата сигурност на дадената оценка. При изследванията на референтни материали при определянето на стойностите могат да се вземат предвид, наред с другото, неточността на самото измерване, хомогенността и стабилността. [8] Несигурността трябва да се тълкува заедно с нейното определение, единиците, приложеното ниво на покритие и точно определената измервана величина.

13. Потвърждава ли изследването, проведено от независима лаборатория, че всички контейнери съдържат един и същ материал?

Не. Независимото изследване предоставя доказателства относно пробата или пробите, които действително са предадени за анализ. Възможността за пренасяне на тези резултати към всеки контейнер зависи, наред с другото, от начина на вземане на пробите, проследимостта на партидата, хомогенността на материала, процеса на пълнене, съхранението и други елементи на контрола. При разработването на сертифицирани референтни материали хомогенността се оценява, а не просто се приема за дадена въз основа на еднократно измерване. [8] Независимостта на лабораторията може да повиши независимостта на самото измерване, но не доказва автоматично идентичността на цялата партида.

14. Могат ли резултатът за стерилност и резултатът за ендотоксини да се използват взаимозаменяемо?

Не. Изследването за стерилност се отнася до живи микроорганизми, докато изследването за бактериални ендотоксини се отнася до определени бактериални съставки, които могат да останат в материала дори при липса на живи бактерии. Следователно това са два отделни аналитични въпроса. Определянето на ендотоксините може допълнително да бъде повлияно от интерференции, произтичащи от матрицата на пробата, поради което е важно методът да бъде подходящо адаптиран. [11] Нито стерилността, нито нивото на ендотоксините могат да бъдат изведени от рутинния тест за чистота HPLC. Ако тези изследвания са проведени, те трябва да бъдат отчетени отделно.

15. Потвърждава ли химическата чистота биологичната активност?

Не. Химичният анализ и функционалното изследване предоставят различни видове информация. Пептидът може да има очакваната молекулна маса и висока хроматографска чистота, без да има потвърдено действие в конкретен биологичен тест. В проучването относно BPTI структурните и биофизичните характеристики бяха съчетани с тест за инхибиране на трипсина, вместо да се приема, че един аналитичен резултат е достатъчен за всички заключения. [12] Освен това функционалните доказателства са специфични за изследваното молекула, експерименталната система и конкретния тест. Следователно проба с висока чистота не трябва да се определя като функционално потвърдена, ако съответната активност не е била действително изследвана.

16. Потвърждава ли сертификатът за анализ (COA), че пептидът ще остане стабилен за неопределен период от време?

Не. Сертификатът за анализ (COA) описва пробата в момента или на етапа на изследването, посочен в доклада. По време на последващото съхранение пептидите могат да претърпят разграждане, окисляване, хидролиза, агрегация, абсорбиране на влага и други промени, зависещи от техните свойства и околната среда. Изследванията на разграждането на ексенатид показаха значението на методите за определяне на стабилността, които могат да разделят продуктите на разграждането от изходното молекула. [13] Изследванията при стресови условия обаче не определят автоматично срока на съхранение при обичайни условия. Всяко твърдение относно срока на годност изисква съответни данни за стабилност, получени при определени условия и за определен период от време.

17. Какво трябва да се провери най-напред при сравняването на два COA на пептиди?

Първо е добре да се сравнят идентичността на пробите, номерата на партидите, използваните аналитични методи, единиците и основата за измерване, вместо веднага да се съпоставят най-високите процентни стойности, посочени в документите. Два доклада могат да представят стойност, определена като „чистота”, а в същото време да измерват различни свойства или да имат различна способност за разделяне на отделните класове замърсители. Изследванията, използващи ортогонални хроматографски методи и определяне на масовия баланс, показват значението на тези разлики. [2] [3] Без да се установи дали двете числа се отнасят към една и съща величина и дали методите са достатъчно съпоставими, прякото сравнение на процентите може да бъде подвеждащо.

18. Означава ли „99% чистота HPLC“ съдържание на пептид 99%?

Не. Резултатът 99% HPLC най-често означава, че на основния пик е присвоен 99% от отчетения сигнал на хроматографския детектор. Резултатът 99% за съдържанието на пептида би изисквал количествено измерване, показващо, че целевият пептид съставлява 99% от съответното количество проба според ясно определена основа. Водата, противойоните, остатъците от разтворители и други съставки могат да увеличат физическата маса на пробата, без да повлияят пропорционално на процента от повърхността на RP-HPLC-UV. [2] Ето защо двете стойности могат да се различават значително, въпреки че нито едно от измерванията не е задължително да е грешно.

19. Може ли даден пептид да премине теста за чистота HPLC и въпреки това да има неправилна стереохимия?

По принцип да. Конвенционалният метод RP-HPLC не е задължително да разделя всички стереохимични варианти, особено когато молекулите имат много сходни физикохимични свойства. По същия начин обикновеното измерване на масата на цялото молекула не позволява да се разграничат стереоизомери с идентичен елементарен състав. Изследванията относно стереохимичната чистота на пептидите показват защо могат да бъдат необходими специализирани методи и прецизен контрол при подготовката на пробата. [6] Дали конкретният метод HPLC ще раздели даден стереоизомер зависи от доказаната селективност на този метод, а не само от факта, че е извършен анализ с HPLC.

20. Потвърждава ли сертификатът за анализ (COA), че цялата партида е идентична с изследваната проба?

Не самостоятелно. Сертификатът за анализ (COA) представя резултати, свързани с пробата и партидата, посочени в аналитичната документация. Екстраполирането на тези резултати към цялата партида изисква подходяща система за вземане на проби, последователност на процеса, еднородност, проследимост и други производствени контроли. Разработването на референтни материали показва защо хомогенността се оценява като отделно свойство, а не просто се приема за даденост. [8] Следователно сертификатът за анализ (COA) може да предостави важни аналитични доказателства относно партидата, но силата на заключенията, обхващащи целия материал, зависи от по-широка система за качество, която свързва изследваната проба с партидата, представена в доклада.

Ограничения при тълкуването на чистотата на пептидите и сертификатите за анализ (COA)

При интерпретирането на аналитичните доклади за пептидите трябва да се имат предвид няколко ограничения.

На първо място, чистотата зависи от метода. Резултатът от RP-HPLC-UV отразява това, което е измерила конкретната хроматографска система и детекторът. Друг механизъм на разделяне може да разкрие съставки, които първият метод не е разделил. [1] [3]

На второ място, хроматографската повърхност и физическата маса се измерват по различни методи. Водата, противойоните, остатъците от други вещества, както и разликите в реакцията на детектора могат да доведат до това процентът на повърхността на HPLC да не съответства на масовия дял на целевия пептид. [2]

На трето място, очакваната молекулна маса представлява силно, но непълно доказателство за идентичността. Изомерите, позиционните варианти и стереохимичните разлики могат да наложат използването на допълнителни методи за определяне на структурата. [4] [5] [6]

Четвърто, самите аналитични методи могат да предизвикат артефакти. Подготовката на пробата, хидролизата, дериватизацията, съхранението и начинът на работа с материала могат да променят аналита или изследваната характеристика. [6]

Пето, изследваната проба не е автоматично равностойна на всеки контейнер, нито на същия материал в по-късен момент. Хомогенността, проследимостта на партидата и стабилността са отделни въпроси. [8]

Шесто, химичните изследвания не дават отговор на микробиологичните въпроси. HPLC и масова спектрометрия не потвърждават стерилността, нито нивото на ендотоксините. [10] [11]

Седмо, химичният профил не потвърждава биологичната активност, нито клиничната безопасност. Това са отделни въпроси, които изискват други видове доказателства. [12]

Накрая, резултатът, получен в даден момент, не е показател за дългосрочна стабилност. Оценката на стабилността изисква подходящи данни, събрани във времето и при определени условия. [13]

Тези ограничения не означават, че COA е с ниска стойност.

Вместо това те обясняват как трябва да се тълкува правилно.

Резюме

Сертификатът за анализ на пептида е най-полезен, когато го разглеждаме като набор от отделни аналитични измервания, а не като единична оценка на качеството.

Посочената в началото стойност на чистотата е само началото на интерпретацията.

Резултат като 99% с повърхност RP-HPLC описва разпределението на отговора на детектора при конкретен хроматографски метод. Това не означава автоматично, че 99% от физическата маса на праха представлява целевия пептид. [1] [2]

Масовата спектрометрия може да предостави убедителни доказателства относно молекулното тегло и някои структурни характеристики, но съответствието на теглото на цялата молекула с очакваната стойност само по себе си не потвърждава всички аспекти на последователността, структурата на краищата, стереохимията или молекулярните връзки. [4] [5] [6]

Съдържанието на пептида изисква собствена количествена основа.

Водата, противойоните, остатъците от други вещества и сродните пептидни примеси могат да повлияят на съотношението между масата на претеглената проба и действителното количество на целевия пептид. [2] [7] [9]

Ето защо, докато четете COA, е добре да си зададете няколко отделни въпроса:

Каква проба беше изследвана?

За коя партия става дума?

Какъв аналитичен метод е използван?

Какво точно означава посоченият процентен дял?

Какви единици и каква изчислителна основа са използвани?

Изследваха ли молекулярната идентичност независимо от хроматографската чистота?

Определено ли е действителното съдържание на пептида?

В съответните случаи измервани ли са водата или противойоните?

Оценена ли е стереохимията, ако тя има значение за съответното молекула?

Кои свойства не са били изследвани?

Особено важно е да се прави разграничение между „не е открито” и „не е изследвано”.

Липсата на резултат не трябва да се тълкува като доказателство за успешно преминаване на теста.

По същия начин изследването, извършено от независима лаборатория, може да представлява ценен допълнителен източник на информация, но самото обозначение „third-party tested” не дава информация за начина на вземане на пробата, нейната връзка с партидата, обхвата на анализа, еднородността, нито дали резултатът може да се приложи за всеки отделен контейнер.

Рутинните химични методи също имат ясно определени ограничения.

HPLC не гарантира стерилитет.

Чистотата на HPLC не потвърждава нивото на ендотоксините.

Химичната чистота не е доказателство за биологична активност.

COA не представлява оценка на клиничната безопасност.

Един аналитичен резултат, получен в определен момент, не доказва неограничена стабилност. [10] [11] [12] [13]

Следователно най-научно обоснованата интерпретация е винаги толкова широка, колкото позволяват наличните доказателства – и не по-широка.

Един добре документиран аналитичен доклад може да предостави надеждна информация за състава, съдържанието и количеството на материала, съдържащ се в изследваната проба.

Неговата стойност се повишава, когато са ясно описани използваните методи, основата за измерване, проследимостта на материала и ограниченията на отделните тестове.

Най-важното правило е просто:

Идентичност, чистота, количество, стереохимия, микробиологичен статус, биологична активност, стабилност и безопасност – това са различни въпроси. Надежден сертификат за анализ помага да се отговори на въпросите, които действително са били изследвани – той не трябва да се използва за даване на отговори по въпроси, които не са били измерени.

Забележка

Статията има изцяло образователен и научно-информационен характер. В нея се обясняват общите принципи на аналитичната химия на пептидите, тълкуването на сертификатите за анализ (COA), хроматографията HPLC, масова спектрометрия, определяне на съдържанието на пептида, оценка на примесите, идентифицируемостта на материала и свързаните с тях изследователски методи. Той не представлява медицински съвет, препоръка за продукт, оценка на безопасността, разрешение за производство, нито потвърждение, че даден пептид или материал, съдържащ пептид, е подходящ за употреба при хора. Аналитичните резултати трябва винаги да се тълкуват във връзка с конкретната проба, партидата, използваната метода, основата за измерване, спецификациите, изследвания аналитичен проблем и ограниченията на извършения тест.

Препратки

1. Петърсон, П., Букенмайер, С., Еуърби, М. Р., и Стол, Д. Р. (2023). Стратегия за оценка на максималната чистота на фармацевтични пептиди при методи за обратнофазова хроматография с използване на двуизмерна течна хроматография, съчетана с мас-спектрометрия. Част I: Избор на колони и подвижни фази. Journal of Chromatography A, 1693, член 463874. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2023.463874
2. Chen, W., Yan, J., Yang, M., Wang, M., Zhou, J., Li, F., & Li, L. (2026). Определяне на чистотата на пептида субланцин с проследимост по SI чрез подход на масов баланс и масова спектрометрия с изотопно разреждане, базирана на анализ на аминокиселините. Journal of Chromatography B, 1277, статия 125038. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2026.125038
3. Йошида, К., Като, С., Нагаи, К., Шимамото, С., Ониши, Т., & Ониши, А. (2025). Профилиране на примесите в синтетични циклични пептиди въз основа на ортогоналността между хидрофилно взаимодействие и обратнофазна течна хроматография. Journal of Chromatography A, 1745, статия 465748. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2025.465748
4. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E. и Gaskell, S. J. (1989). Характеристика на примесите в синтетичен пептид-субстрат на ренина чрез масова спектрометрия с бързо бомбардиране с атоми и хибридна тандемна масова спектрометрия. „Rapid Communications in Mass Spectrometry“, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
5. Куяма, Х., Накаджима, С., Наказава, Т., Нишимура, О. и Цунасава, С. (2009). Нов подход за откриване на С-терминална амидиране на протеини и пептиди чрез масова спектрометрия в съчетание с химична дериватизация. Протеомика, 9(16), 4063–4070. https://doi.org/10.1002/pmic.200900267
6. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G., & Кроутър, Дж. Б. (1995). Определяне на хиралната чистота на пептидите: хидролиза в деутерирана киселина, дериватизация с реагент на Марфи и анализ чрез високоефективна течна хроматография – електроспрей йонизация – мас-спектрометрия. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
7. Ли, М., Джозефс, Р. Д., Дайро, А., Шото, Т., Уестууд, С., Мартос, Г., Виелгош, Р. И., & Ли, Х. (2021). Идентифициране на структурно сродни пептидни примеси и точно количествено определяне на синтетичен окситоцин чрез течна хроматография и масова спектрометрия с висока разделителна способност. „Аналитична и биоаналитична химия“, 413(7), 1861–1870. https://doi.org/10.1007/s00216-021-03154-5
8. Xiao, P., Chen, J., Wu, P., Zhang, W., Sun, Z., Ma, J. и Li, H. (2024). Разработване на сертифициран референтен материал за N-терминален про-B-тип натриуретичен пептид, проследим по SI, чрез използване на подходи за масова спектрометрия с изотопно разреждане, коригирани за примеси и базирани на структурата. „Аналитична и биоаналитична химия“, 416(14), 3447–3458. https://doi.org/10.1007/s00216-024-05295-9
9. Еркес, В., Штреули, А., Чамера Рендуелес, Л., Кремер, С. Д. и Щауер, К. (2025). Към постигане на консенсус относно анализа и обмена на ТФА като противойон в синтетичните пептиди и неговото влияние върху проникването през мембраната. Фармацевтични продукти, 18(8), член 1163. https://doi.org/10.3390/ph18081163
10. Американска агенция за храни и лекарства. (2004). Стерилни лекарствени продукти, произведени чрез асептична обработка — Добра производствена практика: Насоки за промишлеността. Официални указания
11. Американска агенция по храните и лекарствата. (2026). Изпитване за пирогени и ендотоксини: Въпроси и отговори — Насоки за промишлеността. Официални указания
12. Ферер, М., Уудърд, К. и Барани, Г. (1992). Твърдофазен синтез на инхибитор на говеждата панкреатична трипсин (BPTI) и два негови аналога. Химичен подход за оценка на ролята на дисулфидните мостове в сгъването и стабилността на протеините. Международно списание за изследвания на пептидите и протеините, 40(3–4), 194–207. Запис в PubMed
13. Бадгуджар, Д., Маскар, Т., Паритала, С. Т., и Шарма, Н. (2024). Разработване и валидиране на метод за анализ, показващ стабилността, и идентифициране на продуктите на разграждане под въздействието на сила на синтетичния аналог на глюкагоноподобния пептид-1 ексенатид чрез течна хроматография, съчетана с масс-спектрометър Orbitrap. Европейско списание по масова спектрометрия, 30(3–4), 171–186. https://doi.org/10.1177/14690667241262935