La síntesis de péptidos es un proceso controlado de creación de cadenas de aminoácidos con una secuencia específica. En la síntesis química, los aminoácidos seleccionados se unen mediante enlaces peptídicos, al mismo tiempo que se controlan otros grupos reactivos presentes en estas moléculas. El objetivo no es, por tanto, la mera unión de aminoácidos, sino la obtención de una estructura molecular específica con una secuencia, estereoquímica, estructura de los extremos de la cadena y, si es necesario, características estructurales adicionales determinadas.
Entre los métodos principales se encuentran la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS), la síntesis clásica en solución y los métodos más recientes de síntesis de péptidos en fase líquida (LPPS), que utilizan soportes solubles o marcadores moleculares. Los laboratorios de investigación y las plantas de producción también pueden combinar diferentes enfoques, preparar fragmentos más cortos por separado y luego unirlos, o utilizar la expresión biológica si resulta más adecuada para una secuencia determinada.
La comparación entre la síntesis química y la expresión bacteriana de polipéptidos que constan de 20 a 40 residuos de aminoácidos muestra un principio importante: la elección práctica del método de producción depende de la molécula específica, su secuencia, su propensión a la agregación, las modificaciones requeridas, la escala de producción y los requisitos analíticos. [1]
Obtener la secuencia de aminoácidos deseada es solo una de las etapas de la producción del péptido.
Todo el proceso puede incluir:
diseño de secuencias → preparación de bloques de construcción → protección de grupos funcionales → acoplamiento → desprotección → ensamblaje de la cadena → escisión o unión de fragmentos → conformación estructural final → purificación → confirmación de identidad → análisis de impurezas → determinación del contenido → caracterización final.
Para algunos péptidos también son necesarios pasos adicionales, como la ciclación, la formación de puentes disulfuro, el plegamiento, la conjugación u otras modificaciones químicas.
Por esta razón, el correcto ensamblaje de la cadena no significa automáticamente que el material final posea la identidad, pureza, estereoquímica, conformación, estabilidad u otras características requeridas adecuadas.
La síntesis de péptidos es la producción de péptidos, que son compuestos orgánicos formados por aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.
Creación de una secuencia específica de aminoácidos
Péptido consiste en residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.
El objetivo de la síntesis de péptidos es crear estos enlaces en un orden predeterminado, a menudo controlando simultáneamente:
- de aminoácidos;
- orden de los aminoácidos en la secuencia;
- esterequímica;
- estructuras del extremo N;
- estructuras del extremo C;
- modificación de cadenas laterales;
- disposición de los puentes disulfuro;
- ciclización;
- de otras características estructurales requeridas.
La secuencia es fundamental, ya que una composición de aminoácidos idéntica puede dar lugar a moléculas diferentes si los aminoácidos se encuentran en un orden distinto.
Afirmar que una molécula dada es „un péptido compuesto de cinco aminoácidos” proporciona, por tanto, muy poca información sobre su estructura real. Para describir correctamente la molécula, es necesario conocer el tipo de aminoácidos, su orden, la estereoquímica, los grupos terminales y las posibles modificaciones adicionales.
Dos péptidos pueden, por tanto, tener exactamente la misma composición de aminoácidos y, sin embargo, ser estructuras moleculares diferentes.
Las diferencias adicionales pueden derivar de la modificación de los extremos de la cadena, la presencia de puentes disulfuro, un esqueleto cíclico, cambios en las cadenas laterales o una configuración estereoquímica diferente.
La síntesis química de péptidos utiliza habitualmente aminoácidos cuyas grupos reactivos han sido protegidos selectivamente.
Los grupos protectores temporales permiten la creación de un enlace químico específico deseado al tiempo que limitan las reacciones competitivas en otras partes de la molécula.
En las siguientes etapas planificadas de la síntesis, estos grupos se eliminan o modifican.
Reacción controlada en lugar de combinación espontánea
En las descripciones químicas básicas, la formación de un enlace peptídico se presenta a menudo como una reacción de condensación, en la cual dos aminoácidos se unen con la liberación neta de una molécula de agua.
Tal ecuación describe el balance general de la reacción.
Sin embargo, no debe equipararse con la forma en que se lleva a cabo en la práctica la síntesis peptídica controlada.
Solo mezclar aminoácidos libres no permitiría determinar de forma fiable:
- qué grupo amino debe reaccionar;
- qué grupo carboxilo debe reaccionar;
- cuál aminoácido debe ser el primero;
- el cual debe encontrarse el segundo;
- ¿empezarán a reaccionar las cadenas laterales?;
- ¿se conservará la estereoquímica?;
- ¿no se formarán numerosos productos no deseados?.
Por lo tanto, en la síntesis química práctica se aplican estrategias controladas de activación y protección de grupos funcionales.
Un grupo derivado de un grupo carboxilo se activa normalmente de tal manera que pueda reaccionar eficazmente con el grupo amino elegido. Los grupos protectores, el orden de las reacciones, la química del soporte, los reactivos de acoplamiento, el medio disolvente y los métodos de aislamiento ayudan conjuntamente a dirigir la reacción hacia el producto deseado.
La síntesis eficaz de péptidos requiere, por tanto, el control tanto de la química que debe producirse como de la que debe evitarse.
Un buen ejemplo es la formación de aspartimida.
Los investigadores desarrollaron un método alternativo de protección del grupo carboxilo cuyo objetivo era reducir esta reacción secundaria problemática durante el ensamblaje del péptido. [2]
El estudio muestra un principio más amplio de la química de péptidos: prevenir transformaciones moleculares no deseadas puede ser tan importante como crear el enlace peptídico correcto.
¿Cuándo se puede considerar que un péptido está listo?
La finalización de la creación del esqueleto lineal del péptido no siempre significa el final de toda la síntesis.
Dependiendo de la molécula de destino, tras el ensamblaje de la cadena pueden ser necesarios pasos adicionales.
Pueden incluir:
- desprotección total;
- escisión del péptido del soporte sólido;
- eliminación de marcadores temporales;
- ciclización;
- oxidación;
- formación de puentes disulfuro;
- plegamiento;
- conjugación;
- modificación de los extremos de la cadena;
- purificación;
- característica analítica.
Algunos péptidos requieren relativamente pocos cambios estructurales adicionales después del ensamblaje de la cadena.
Para otros, las etapas posteriores son de crucial importancia.
Un buen ejemplo es la síntesis del inhibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI). Los investigadores ensamblaron la secuencia lineal, purificaron el material y luego obtuvieron la estructura plegada que contiene puentes disulfuro. De acuerdo con los análisis y las comparaciones funcionales presentadas en el estudio, el material final con la secuencia natural correspondía a la proteína natural en el rango de los parámetros estudiados. [3]
Este ejemplo muestra la diferencia entre el ensamblaje de la cadena peptídica y la obtención de la forma molecular final completamente caracterizada.
El método que permite obtener una secuencia lineal correcta no confirma automáticamente:
- del plegamiento correcto;
- del correcto posicionamiento de los puentes disulfuro;
- actividad biológica;
- estabilidad;
- del perfil de contaminación;
- idoneidad para un fin determinado.
Cada una de estas cuestiones requiere pruebas independientes.
Síntesis química, expresión biológica y métodos combinados
En la síntesis química de péptidos, los bloques moleculares preparados previamente se unen en reacciones de laboratorio controladas.
Por otro lado, la expresión biológica utiliza la maquinaria celular para producir la secuencia de aminoácidos codificada. A continuación, el material debe ser recuperado, purificado y, si es necesario, sometido a un procesamiento adicional.
Ambos métodos pueden conducir a la obtención de péptidos o polipéptidos, pero conllevan diferentes posibilidades y limitaciones.
La síntesis química puede ser especialmente útil cuando se necesitan:
- aminoácidos no estándar seleccionados;
- modificaciones químicas en sitios específicos;
- estructuras específicas de los extremos de la cadena;
- marcadores isotópicos;
- modificaciones del esqueleto peptídico;
- otras características difíciles de obtener mediante la expresión biológica estándar.
La expresión biológica puede ser atractiva en el caso de secuencias más largas adecuadas o estrategias de marcaje específicas, pero no elimina los problemas que surgen en las etapas posteriores de producción.
Aún se deben tener en cuenta la recuperación de material, el plegado, el procesamiento, las impurezas procedentes del organismo hospedador, la purificación y la caracterización analítica.
Por lo tanto, ninguno de los métodos es universalmente el mejor.
En la comparación de polipéptidos formados por 20–40 residuos de aminoácidos, tanto la longitud de la secuencia como su propensión a la agregación influyeron en los resultados de la síntesis en fase sólida y de la expresión bacteriana. [1]
Estas observaciones respaldan un enfoque en el que el método de producción se selecciona para una molécula específica.
Los datos históricos sobre rendimiento, costes, equipamiento y tiempo de producción no deben considerarse valores contemporáneos universales, ya que las tecnologías, los reactivos, la automatización, los métodos de purificación y la economía de producción cambian con el desarrollo tecnológico.
Síntesis de péptidos en fase sólida
La cadena en crecimiento está unida a un soporte insoluble
En la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS), la cadena peptídica en crecimiento permanece unida a un soporte insoluble durante los ciclos sucesivos de síntesis.
El soporte suele ser una resina polimérica funcionalizada.
El espaciador, o conector, une el péptido al soporte e influye, entre otras cosas, en la forma en que se liberará posteriormente la cadena final y en el tipo de grupo terminal obtenido.
Una de las principales ventajas prácticas de SPPS es la separación más fácil del material.
Una vez finalizada una etapa determinada de la reacción, los reactivos solubles y muchos subproductos solubles se pueden eliminar mediante lavado, mientras que el péptido en crecimiento permanece unido a la fase sólida.
Gracias a esto, no es necesario aislar y purificar el péptido en crecimiento como un compuesto libre independiente tras la adición de cada aminoácido sucesivo.
Sin embargo, esta comodidad puede dar lugar a un malentendido importante.
El lavado de la resina no significa que se hayan eliminado todos los péptidos incorrectos.
Si la cadena unida a la resina no reacciona durante una etapa de acoplamiento, aún puede permanecer en el soporte.
En los siguientes ciclos puede volver a reaccionar y seguir alargándose.
Como resultado, se puede formar una secuencia de deleción, es decir, una molécula que se diferencia del péptido diana por la ausencia de uno o más residuos de aminoácidos.
Cadenas químicamente modificadas de manera similar o liberadas de manera incompleta unidas a la resina pueden participar en etapas posteriores de la síntesis.
Por lo tanto, el SPPS simplifica la separación de sustancias solubles del material unido a la resina.
Sin embargo, no garantiza una concordancia de secuencias perfecta.
Ciclo repetitivo de desbloqueo y acoplamiento
La síntesis peptídica en fase sólida (SPPS) escalonada típica comprende la repetición de tres operaciones básicas:
desaseguro → acoplamiento → lavado.
Primero se desprotege el grupo amino reactivo situado en el extremo de la cadena en crecimiento.
Luego, se une otro aminoácido protegido a la cadena.
Los reactivos solubles, el exceso de aminoácido y muchos productos de la reacción se eliminan antes de que comience el siguiente ciclo.
La repetición de este proceso permite construir el péptido un residuo de aminoácido a la vez.
En la SPPS clásica, el residuo C-terminal suele unirse al soporte en primer lugar y, a continuación, la cadena se alarga en dirección N-terminal.
Esto difiere de la síntesis de proteínas ribosómica estándar, durante la cual se añaden aminoácidos sucesivos al extremo C terminal de la cadena en crecimiento.
Sin embargo, la secuencia final de aminoácidos puede ser idéntica, a pesar de que la dirección y la química del proceso de plegamiento sean diferentes.
El término „ciclo” no debe entenderse como un único conjunto universal de condiciones de reacción adecuado para cada residuo y cada secuencia.
El curso de la reacción puede depender de:
- estrategias de grupos de protección;
- de tipo aminoácido;
- de las condiciones espaciales alrededor del lugar de la reacción;
- tipo de resina;
- enlace;
- longitudes de cadena;
- agregación;
- del disolvente;
- química de acoplamiento;
- comportamiento estructural del péptido creciente.
Una reacción que transcurre fácilmente al principio de la síntesis puede volverse mucho más difícil en una etapa posterior.
Por eso el monitoreo del proceso sigue siendo esencial incluso en sistemas altamente automatizados.
¿Por qué importan las propiedades de la resina?
El medio fijo no es simplemente un soporte pasivo.
Sus propiedades físicas y químicas pueden influir directamente en el curso de la reacción.
Uno de los parámetros importantes es la tumefacción.
Si la resina se hincha correctamente en el entorno de disolvente elegido, los reactivos pueden llegar más fácilmente a los sitios reactivos ubicados en toda la estructura del polímero.
La hinchazón insuficiente o los cambios en la estructura de la resina pueden limitar este acceso.
También pueden tener importancia:
- densidad de población;
- arquitectura de polímeros;
- estructura del enlazador;
- compatibilidad con disolventes;
- estabilidad mecánica;
- porosidad;
- propiedades de difusión;
- interacciones entre cadenas peptídicas en crecimiento.
A medida que aumenta la longitud del péptido, las cadenas individuales también pueden interactuar entre sí.
La agregación en la resina puede limitar el acceso a los sitios reactivos y provocar un acoplamiento incompleto o una desprotección incompleta.
Esto significa que una secuencia que se comporta correctamente al principio de la síntesis puede volverse cada vez más difícil a medida que se alarga la cadena.
Los investigadores desarrollaron un reactor de flujo con lecho variable que permitía monitorizar la hinchazón de la resina basándose en mediciones relacionadas con la presión. [4]
El estudio se centró en la agregación en la resina y la formación incompleta de enlaces como problemas de proceso que, en otras condiciones, pueden ser difíciles de observar directamente durante la síntesis.
Esto demuestra que el seguimiento del comportamiento físico del medio puede proporcionar información que va más allá del simple registro de los reactivos añadidos.
¿Para qué sirve la resina Wang?
La química de los conectores tipo Wang se utiliza ampliamente en la SPPS cuando, tras la escisión del péptido, se desea un extremo C en forma de ácido carboxílico.
El péptido está unido mediante un enlace de tipo éster, que posteriormente puede escindirse en las condiciones adecuadas.
Otros sistemas de conectores pueden seleccionarse cuando se necesita una estructura C-terminal diferente, por ejemplo, una amida.
Vale la pena distinguir la química del enlazador de todo el soporte físico.
Los enlazadores tipo Wang relacionados se pueden introducir en varias arquitecturas poliméricas.
Tales materiales no necesitan tener idénticos:
- propiedades de hinchamiento;
- capacidades;
- compatibilidad con disolventes;
- propiedades mecánicas;
- comportamientos durante la reacción.
Los estudios que utilizaron soportes de peptidil-Wang-TentaGel demostraron un método alternativo especializado para la obtención de hidrazidas peptídicas, las cuales son intermedios útiles en la química de péptidos. [5]
Esto no significa que la escisión estándar de la resina de Wang conduzca habitualmente a la formación de hidrazidas peptídicas.
Sin embargo, muestra un principio importante:
el soporte + el enlace + las condiciones de reacción + la química de escisión determinan conjuntamente el producto obtenido.
Síntesis de SPPS en sistema periódico y de flujo
La SPPS se puede llevar a cabo en recipientes discontinuos clásicos o en sistemas en los que los reactivos fluyen a través de un reactor que contiene un soporte sólido.
Los sistemas de flujo pueden permitir un intercambio rápido de reactivos y un control más preciso del entorno químico que rodea a la resina.
Un estudio de 2014 presentó la síntesis rápida de péptidos en flujo con monitorización continua y se aplicó a varios péptidos y a una proteína pequeña. [6]
En un estudio automatizado posterior se describió un ensamblaje de cadenas significativamente más rápido, logrando para los ejemplos analizados una pureza del producto crudo y un rendimiento tras el aislamiento comparables a los de la síntesis discontinua clásica. [7]
Estos estudios muestran las capacidades de sistemas específicos en condiciones determinadas.
Sin embargo, no demuestran que todos los péptidos puedan producirse con la misma rapidez y calidad.
El tiempo necesario para producir un péptido también abarca mucho más que la mera síntesis de la cadena.
El proceso completo puede incluir:
- preparación de reactivos;
- preparación de la resina;
- acoplamiento;
- desbloqueo;
- lavado;
- desviación;
- procesamiento del producto;
- purificación;
- eliminación de disolventes;
- conformado final de la estructura;
- análisis de laboratorio;
- documentación.
Por lo tanto, la creación rápida de mazos es solo un elemento de la eficiencia general de la producción.
Síntesis en fase líquida
¿Qué significa este término?
El término „síntesis de péptidos en fase líquida” puede utilizarse en varios sentidos.
En un sentido amplio, puede significar simplemente la síntesis de péptidos en solución.
Sin embargo, en la literatura más especializada se suele distinguir entre:
- la síntesis clásica de péptidos en solución;
- síntesis de péptidos en fase sólida;
- nuevos métodos de LPPS, en los cuales la cadena en crecimiento posee un marcador o soporte soluble.
Esta distinción es importante porque cambia la forma en que se separa y recupera el producto.
Un intermedio peptídico protegido, libremente disuelto, puede requerir su aislamiento utilizando sus propias propiedades físicas y químicas.
En el caso de un producto intermedio marcado, el marcador puede diseñarse para facilitar la precipitación, la extracción, la retención en membrana u otro método de separación.
Una revisión sobre la LPPS distingue claramente entre la síntesis clásica en solución, la SPPS y los métodos que utilizan marcadores solubles. [8]
La publicación es útil para ordenar la terminología y la metodología.
Nie powinna jednak być interpretowana jako pojedynczy eksperyment dowodzący, że jedna z metod jest najlepsza dla każdego peptydu.
Klasyczna synteza peptydów w roztworze
W klasycznej syntezie w roztworze zabezpieczone aminokwasy, półprodukty peptydowe lub fragmenty pozostają rozpuszczone w środowisku reakcji zamiast być kowalencyjnie przyłączone do nierozpuszczalnej żywicy.
Po zakończeniu reakcji odpowiedni półprodukt może zostać wyizolowany, oczyszczony i w razie potrzeby scharakteryzowany przed rozpoczęciem kolejnego etapu.
Może to przynosić pewne korzyści.
Badacze mogą:
- charakteryzować poszczególne półprodukty;
- dobierać metodę oczyszczania do konkretnego półproduktu;
- optymalizować poszczególne przemiany;
- przygotowywać fragmenty niezależnie;
- modyfikować trasę syntezy, gdy określony półprodukt sprawia problemy.
Synteza w roztworze może jednak wiązać się również ze znacznymi trudnościami.
Wraz z wydłużaniem łańcucha peptydy mogą:
- stawać się słabo rozpuszczalne;
- agregować;
- być trudne do krystalizacji;
- tworzyć blisko spokrewnione zanieczyszczenia;
- być trudne do rozdzielenia;
- wymagać wielokrotnej izolacji;
- powodować straty materiału podczas kolejnych etapów obróbki.
Synteza w roztworze nie jest więc automatycznie prostsza ani łatwiejsza do skalowania niż SPPS.
Jej przydatność zależy od konkretnej sekwencji, stabilności półproduktów, rozpuszczalności, długości trasy syntezy, zachowania podczas oczyszczania oraz efektywności kolejnych etapów izolacji.
Rozwój znakowanych strategii LPPS częściowo wynika z prób rozwiązania właśnie tych problemów związanych z separacją i obsługą materiału. [8]
Rozpuszczalne znaczniki łączą projektowanie reakcji z projektowaniem separacji
W znakowanej LPPS rosnący peptyd posiada tymczasowe przyłączenie molekularne zaprojektowane w taki sposób, aby wpływać na jego właściwości fizyczne.
Znacznik może umożliwiać utrzymanie wystarczającej rozpuszczalności peptydu podczas reakcji, a następnie ułatwiać jego selektywne odzyskanie.
W zależności od technologii rozdzielanie może wykorzystywać:
- wytrącanie;
- ekstrakcję;
- zatrzymywanie na membranie;
- zachowanie fazowe;
- inne właściwości wynikające z obecności znacznika.
W jednej z eksperymentalnych strategii wykorzystano długołańcuchową grupę ochronną na C-końcu do przygotowania amidów peptydowych.
Powtarzane reakcje i etapy wytrącania umożliwiły badaczom przygotowanie hydrofobowego peptydu, który w zastosowanym przez nich porównaniu był trudny do uzyskania zadowalająco metodą SPPS. [9]
Pokazuje to przydatność tej konkretnej strategii dla analizowanej sekwencji.
Nie dowodzi jednak uniwersalnej przewagi syntezy znakowanej.
Znacznik staje się elementem procesu produkcyjnego i rodzi własne pytania:
- Jak skutecznie jest przyłączany?
- Czy zmienia przebieg reakcji?
- Jak niezawodnie można odzyskać znakowany półprodukt?
- Czy prowadzi do powstawania nowych zanieczyszczeń?
- W jaki sposób jest usuwany?
- Czy można potwierdzić całkowite usunięcie?
- Jakie metody analityczne potwierdzają jego brak w produkcie końcowym?
Rozpuszczalne znaczniki należy więc traktować jako funkcjonalne elementy projektu procesu, a nie wyłącznie jako proste etykiety.
Porównanie głównych metod
| cecha | Synteza na fazie stałej | Klasyczna synteza w roztworze | Synteza w fazie ciekłej z rozpuszczalnym znacznikiem |
|---|---|---|---|
| Położenie rosnącego peptydu | Przyłączony do nierozpuszczalnego nośnika | Rozpuszczony jako półprodukt molekularny | Rozpuszczony z przyłączonym znacznikiem lub rozpuszczalnym nośnikiem |
| Główna zasada separacji | Zatrzymanie nośnika i wypłukanie rozpuszczalnych składników | Izolowanie półproduktów na podstawie ich właściwości fizycznych i chemicznych | Odzyskiwanie zależne od właściwości znacznika |
| Główna zaleta praktyczna | Powtarzalne cykle dobrze nadają się do automatyzacji | Możliwość izolowania półproduktów i elastycznego projektowania trasy | Łączy reakcje w roztworze z zaprojektowanym systemem odzyskiwania |
| Potencjalne trudności | Agregacja, dostępność miejsc reakcji, błędy sekwencji związane z żywicą | Rozpuszczalność i wielokrotna izolacja | Zgodność znacznika, jego usuwanie i efektywność odzysku |
| Czy nadal potrzebne jest końcowe oczyszczanie? | Toma | Toma | Toma |
Porównanie przedstawia ogólne zasady działania poszczególnych metod.
Nie określa, która z nich zapewni najlepszą wydajność, czystość, koszt, zrównoważenie środowiskowe czy możliwość skalowania dla konkretnej sekwencji.
Parametry te należy oceniać na podstawie rzeczywistej cząsteczki i konkretnego procesu produkcyjnego. [4] [8] [9]
Łączenie fragmentów i produkcja hybrydowa
Peptyd nie zawsze musi być tworzony w jednym nieprzerwanym procesie polegającym na dodawaniu kolejnych reszt aminokwasowych.
Alternatywną strategią jest oddzielne przygotowanie krótszych fragmentów peptydowych, a następnie ich połączenie.
Proces hybrydowy może na przykład wykorzystywać SPPS do otrzymywania poszczególnych fragmentów oraz chemię w roztworze do ich łączenia.
Strategie fragmentowe mogą ograniczać niektóre problemy związane z bardzo długą syntezą etapową.
Wprowadzają jednak nowe wyzwania, takie jak:
- wybór odpowiedniego miejsca połączenia;
- rozpuszczalność fragmentów;
- aktywacja miejsca łączenia;
- chemoselektywność;
- zachowanie stereochemii;
- reacciones adversas;
- oczyszczanie fragmentów;
- oczyszczanie po ich połączeniu.
Ważnym przykładem kontrolowanego łączenia fragmentów jest natywna ligacja chemiczna.
W klasycznej wersji tioester peptydowy reaguje z drugim peptydem zawierającym N-końcową cysteinę. Następujące później przegrupowanie prowadzi do utworzenia prawidłowego wiązania w szkielecie peptydowym w miejscu ligacji.
Pierwotne badania wykazały możliwość uzyskania po ligacji i fałdowaniu białka zawierającego mostki disiarczkowe. [10]
Potwierdza to znaczenie tej strategii łączenia fragmentów.
Nie oznacza jednak, że dowolne dwa niezmodyfikowane fragmenty peptydowe mogą spontanicznie się połączyć.
Sprzęganie i grupy ochronne
Sprzęganie tworzy zamierzone połączenie
Sprzęganie jest etapem reakcji, podczas którego pomiędzy wybranymi jednostkami powstaje nowe wiązanie peptydowe.
Zazwyczaj grupa pochodząca od grupy karboksylowej jest aktywowana tak, aby mogła skutecznie reagować z odpowiednią grupą aminową.
Chemia aktywacji musi być zgodna z:
- rosnącą sekwencją;
- tymczasowymi grupami ochronnymi;
- ochroną łańcuchów bocznych;
- stereochemią;
- nośnikiem lub znacznikiem;
- środowiskiem rozpuszczalnika;
- innymi grupami funkcyjnymi obecnymi w cząsteczce.
Skuteczne sprzęganie jest szczególnie ważne w syntezie etapowej, ponieważ niepełna reakcja może prowadzić do powstawania sekwencji delecyjnych.
Jeżeli jeden etap dodawania aminokwasu nie powiedzie się dla części rosnących łańcuchów, takie łańcuchy mogą pozostać w układzie i uczestniczyć w kolejnych cyklach.
W efekcie mogą powstać cząsteczki bardzo podobne do docelowego peptydu, ale pozbawione jednej reszty.
Nawet niewielkie nieefektywności mogą więc kumulować się podczas wielu etapów syntezy.
Prosty przykład matematyczny dobrze ilustruje ten problem.
Jeżeli każdy z 50 niezależnych etapów składania miałby 99% prawdopodobieństwa powodzenia, odsetek cząsteczek, dla których wszystkie etapy zakończyłyby się sukcesem, wynosiłby:
0,99^50 ≈ 0,605
czyli około 61%.
Jest to wyłącznie ilustracja matematyczna.
Nie stanowi prognozy rzeczywistej czystości ani wydajności syntezy peptydu zawierającego 50 reszt.
Rzeczywista produkcja obejmuje:
- różne wydajności sprzęgania w poszczególnych pozycjach;
- etapy odbezpieczania;
- reacciones adversas;
- zależne od sekwencji trudności;
- strategie ponownego sprzęgania;
- straty podczas odszczepiania;
- straty podczas oczyszczania;
- inne zmienne procesowe.
Obliczenie pokazuje jedynie, dlaczego nawet pozornie niewielka nieefektywność pojedynczego etapu może nabrać dużego znaczenia w wieloetapowej syntezie.
Grupy ochronne kontrolują miejsce reakcji
Aminokwas może posiadać kilka chemicznie reaktywnych grup.
Bez selektywnej kontroli reakcje sprzęgania mogłyby zachodzić w niepożądanych miejscach.
Grupy ochronne tymczasowo blokują wybrane miejsca reaktywne.
Grupa aminowa wykorzystywana do wydłużania łańcucha zazwyczaj wymaga tymczasowej ochrony, natomiast reaktywne łańcuchy boczne mogą wymagać zabezpieczenia pozostającego na miejscu przez wiele cykli syntezy.
Połączenie z nośnikiem również musi przetrwać te etapy aż do momentu zaplanowanego odszczepienia.
Wybór grup ochronnych wpływa więc na całą strategię syntezy.
Należy uwzględnić:
- sposób ich wprowadzania;
- estabilidad;
- sposób usuwania;
- zgodność z innymi grupami ochronnymi;
- zgodność z nośnikiem;
- reacciones adversas;
- wpływ konkretnej sekwencji;
- końcowe warunki odbezpieczania.
Badania wykorzystujące ochronę opartą na cyjanosulfurylidzie dotyczyły powstawania aspartimidu poprzez zmianę sposobu zabezpieczenia grupy karboksylowej. [2]
Wyniki pokazują, że strategia grup ochronnych wpływa nie tylko na to, czy zamierzona reakcja może zajść, ale również na to, jakie niepożądane reakcje stają się możliwe.
Fmoc, Boc i ochrona ortogonalna
Fmoc i Boc należą do szeroko stosowanych grup chroniących grupy aminowe.
Istotnie różnią się sposobem usuwania.
Fmoc jest zazwyczaj usuwany w warunkach zasadowych, natomiast Boc jest wrażliwy na warunki kwaśne.
Właściwości te pozwalają stosować je jako elementy szerszych strategii ochrony.
W popularnej SPPS opartej na Fmoc tymczasowa ochrona N-końcowa Fmoc jest wielokrotnie usuwana, podczas gdy wybrane grupy ochronne łańcuchów bocznych oraz połączenie z żywicą pozostają nienaruszone do późniejszych etapów.
Inne strategie mogą wykorzystywać odmienne kombinacje.
Szczególnie ważnym pojęciem jest ochrona ortogonalna.
Dwie grupy ochronne są uznawane za ortogonalne, jeśli jedną można selektywnie usunąć w warunkach, w których druga pozostaje wystarczająco stabilna, aby możliwe było dalsze prowadzenie syntezy.
Ortogonalność jest więc praktyczną relacją zgodności chemicznej.
Nie oznacza, że każda zabezpieczona grupa pozostanie całkowicie niezmieniona po nieograniczonej liczbie ekspozycji na wszystkie warunki reakcji.
Reakcje uboczne nadal mogą występować.
W badaniach syntezy Fmoc opisano zarówno powstawanie aspartimidu, jak i niepożądane zmiany stereochemiczne mimo zakładanej selektywności ogólnej strategii ochronnej. [11]
Stereochemia jest częścią tożsamości cząsteczki
Wiele aminokwasów posiada centrum chiralne.
Oznacza to, że ich atomy mogą przyjmować różne układy przestrzenne odpowiadające różnym formom stereochemicznym.
Zmiana konfiguracji jednego centrum stereogenicznego może prowadzić do powstania innej struktury peptydu bez konieczności zmiany jego nominalnej masy.
Dlatego sama masa nie może potwierdzić pełnej tożsamości peptydu.
Epimeryzacja zazwyczaj oznacza zmianę konfiguracji jednego centrum stereogenicznego w cząsteczce zawierającej kilka takich centrów.
Racemizacja jest również często omawiana w chemii peptydów w kontekście utraty integralności stereochemicznej reszt aminokwasowych.
Zmiany te są istotne, ponieważ rozpoznawanie molekularne może silnie zależeć od przestrzennego ułożenia atomów.
Dwie cząsteczki o tym samym składzie pierwiastkowym i nominalnej masie mogą więc zachowywać się inaczej, jeśli różnią się stereochemią.
W badaniu syntezy Fmoc wspomaganej mikrofalami stwierdzono, że niektóre reszty były podatne na niepożądane zmiany stereochemiczne w zastosowanych warunkach. Modyfikacja metody ograniczała występowanie tych reakcji. [11]
Nie oznacza to, że ogrzewanie z definicji uszkadza wszystkie peptydy.
Prawidłowy wniosek jest taki, że przyspieszanie reakcji należy oceniać razem z zależną od sekwencji selektywnością chemiczną.
Aspartimid i inne pokrewne zanieczyszczenia
Powstawanie aspartimidu jest znaną reakcją uboczną dotyczącą określonych sekwencji zawierających asparaginian.
Może powstać niepożądany cykliczny półprodukt, z którego następnie tworzą się związki o zmienionej łączności szkieletu lub stereochemii.
Prawdopodobieństwo tej reakcji zależy od sekwencji oraz warunków procesu.
Inne zanieczyszczenia związane z syntezą mogą wynikać z:
- niepełnego sprzęgania;
- niepełnego odbezpieczania;
- powstawania sekwencji delecyjnych;
- reakcji łańcuchów bocznych;
- zmian stereochemicznych;
- reakcji podczas odszczepiania;
- utleniania;
- przegrupowań;
- warunków obróbki produktu;
- niepełnego usunięcia grup ochronnych.
Niektóre zanieczyszczenia powodują łatwo zauważalną zmianę masy cząsteczkowej.
Inne są znacznie trudniejsze do rozróżnienia.
W badaniach analitycznych syntetycznego peptydu będącego substratem reniny zidentyfikowano wiele zanieczyszczeń, w tym składniki wykazujące taką samą zmianę masy, ale zawierające modyfikacje w różnych pozycjach. [12]
Do ich rozróżnienia potrzebna była dodatkowa analiza strukturalna.
Badacze traktowali również proponowane mechanizmy powstawania tych zanieczyszczeń jako hipotezy.
Jest to ważne rozróżnienie:
ustalenie, czym jest zanieczyszczenie, oraz udowodnienie dokładnego mechanizmu jego powstania to dwa odrębne pytania naukowe.
Nie należy przedstawiać prawdopodobnego mechanizmu jako potwierdzonego wyłącznie dlatego, że odpowiada obserwowanej masie cząsteczkowej.
Oczyszczanie, skalowanie i jakość produkcji
Produkt surowy, produkt oczyszczony i wydajność
Surowy peptyd to materiał otrzymany przed zakończeniem odpowiednich etapów oczyszczania.
Może zawierać:
- docelowy peptyd;
- secuencias de deleción;
- materiał niecałkowicie odbezpieczony;
- zmodyfikowane sekwencje;
- pozostałości odczynników;
- produkty związane z odszczepianiem;
- sole;
- disolventes;
- inne składniki powstające w procesie.
Oczyszczanie ma na celu oddzielenie właściwego peptydu od tej mieszaniny.
Należy wyraźnie rozróżnić trzy pojęcia:
czystość produktu surowego — zmierzony skład materiału przed końcowym oczyszczaniem;
wydajność produktu oczyszczonego lub wyizolowanego — ilość odzyskanego materiału docelowego względem określonej wartości początkowej lub teoretycznej;
czystość końcowa — skład wyizolowanego materiału określony za pomocą konkretnej metody analitycznej.
Pojęcia te nie są wymienne.
Proces może prowadzić do powstania dużej ilości surowego materiału, ale umożliwiać odzyskanie stosunkowo niewielkiej ilości oczyszczonego produktu.
Inny proces może dawać mniej materiału surowego, ale charakteryzować się wysoką selektywnością tworzenia produktu docelowego.
Podobnie wysoka czystość analityczna nie musi oznaczać wysokiej wydajności produkcyjnej.
W badaniach przyspieszonej syntezy przepływowej prawidłowo raportowano osobno czystość materiału surowego i wydajność po izolacji. [7]
Chromatografia rozdziela składniki, ale nie odpowiada na każde pytanie
Wysokosprawna chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) jest szeroko stosowana do analizy i oczyszczania peptydów.
Różne cząsteczki w odmienny sposób oddziałują z fazą stacjonarną i ruchomą.
W odpowiednich warunkach różnice te umożliwiają rozdzielanie składników mieszaniny.
Chromatografia analityczna i preparatywna mają powiązane, ale odmienne zastosowania.
Analityczna HPLC służy przede wszystkim do badania składu próbki.
Preparatywna HPLC jest wykorzystywana do fizycznego zbierania rozdzielonych składników.
Chromatogram może dostarczać wielu wartościowych informacji.
Dużego głównego piku lub wysokiego procentowego udziału jego powierzchni nie należy jednak traktować jako pełnej charakterystyki molekularnej.
Wyniki chromatografii zależą między innymi od:
- rodzaju kolumny;
- fazy ruchomej;
- degradado;
- temperaturas;
- metody detekcji;
- długości fali;
- przygotowania próbki;
- sposobu integracji pików;
- rozdzielczości;
- właściwości zanieczyszczeń.
Dwa związki mogą potencjalnie eluować w tym samym czasie.
Niektóre składniki próbki mogą również różnie reagować na zastosowany detektor.
Dlatego wysoka czystość powierzchniowa w HPLC nie jest równoznaczna z pełnym potwierdzeniem tożsamości molekularnej.
Badania izobarycznych zanieczyszczeń peptydowych oraz analizy chiralnej pokazują, dlaczego mogą być potrzebne uzupełniające metody analityczne. [12] [13]
Metoda analityczna musi odpowiadać konkretnemu pytaniu strukturalnemu.
Tożsamość, czystość i zawartość oznaczają różne rzeczy
W charakterystyce peptydów szczególnie ważne są trzy pojęcia.
La identidad responde a la pregunta:
Czy w próbce znajduje się zamierzona cząsteczka?
La limpieza responde a la pregunta:
Jakie inne składniki znajdują się w próbce lub jaka część mierzonego sygnału odpowiada głównemu składnikowi?
Zawartość odpowiada na pytanie:
Ile rzeczywistego peptydu znajduje się w próbce?
Na te pytania nie zawsze można odpowiedzieć za pomocą jednego pomiaru.
Materiał zawierający peptyd może również zawierać:
- wodę;
- contraión;
- sole;
- residuos de disolventes;
- inne składniki związane z procesem;
- zanieczyszczenia.
Całkowita masa odważonego materiału nie musi więc odpowiadać masie samego peptydu.
Podobnie zgodność zmierzonej masy cząsteczkowej z wartością teoretyczną nie potwierdza:
- kompletnej sekwencji aminokwasowej;
- prawidłowej łączności poszczególnych reszt;
- integralności stereochemicznej;
- disposición de los puentes disulfuro;
- fałdowania;
- braku izobarycznych zanieczyszczeń.
Spektrometria mas może dostarczać silnych dowodów dotyczących masy cząsteczkowej.
Tandemowa spektrometria mas i inne techniki strukturalne mogą dostarczać dodatkowych informacji o sekwencji.
Metody chiralne pozwalają analizować zagadnienia stereochemiczne, których nie można rozstrzygnąć zwykłym pomiarem masy.
W jednym z badań analitycznych uwzględniono nawet racemizację powstającą podczas przygotowania próbki. Pokazuje to kolejną ważną zasadę: sama procedura analityczna może powodować artefakty, jeśli nie zostanie odpowiednio zaprojektowana. [13]
Fałdowanie i aktywność mogą wymagać osobnego potwierdzenia
W przypadku strukturalnie ograniczonych peptydów i małych białek prawidłowa sekwencja oraz masa cząsteczkowa nadal mogą być niewystarczające do potwierdzenia zamierzonej struktury końcowej.
Dodatkowe pytania mogą obejmować:
- Czy powstały właściwe mostki disiarczkowe?
- Czy cząsteczka przyjęła oczekiwaną konformację?
- Czy cyklizacja jest kompletna?
- Czy obecne są izomery strukturalne?
- Czy syntetyczna cząsteczka wykazuje oczekiwaną aktywność w określonym teście eksperymentalnym?
W badaniu syntezy BPTI wykorzystano kilka metod analitycznych i biofizycznych wraz z oceną hamowania trypsyny. [3]
Łączne wyniki wspierały zgodność syntetycznego materiału o naturalnej sekwencji z naturalnym białkiem w zakresie badanych kryteriów.
Test aktywności odpowiada jednak na określone pytanie funkcjonalne.
Nie zastępuje analizy zanieczyszczeń.
Podobnie podobna aktywność w jednym teście nie potwierdza pełnej równoważności wszystkich właściwości biologicznych, strukturalnych czy produkcyjnych.
Skalowanie produkcji zmienia więcej niż tylko ilość materiału
Zwiększenie skali produkcji nie polega wyłącznie na proporcjonalnym zwiększeniu ilości wszystkich odczynników.
Procesy fizyczne mogą zachowywać się inaczej przy większej skali.
Znaczenie mogą mieć:
- mieszanie;
- wymiana ciepła;
- rozprowadzanie odczynników;
- dyfuzja;
- pęcznienie żywicy;
- ciśnienie;
- filtracja;
- gospodarka rozpuszczalnikami;
- wytrącanie;
- rozpuszczalność półproduktów;
- transport masy;
- możliwości systemu oczyszczania.
Czynniki te mogą wpływać zarówno na przebieg reakcji, jak i na powstawanie zanieczyszczeń.
Oczyszczanie na późniejszych etapach również może stać się wąskim gardłem całej produkcji.
Zwiększenie szybkości syntezy ma ograniczone znaczenie, jeśli system oczyszczania nie jest w stanie skutecznie rozdzielić powstających zanieczyszczeń lub odzyskać produktu o wymaganej jakości.
W analizie przemysłowej obejmującej 40 procesów syntezy peptydów z 14 firm farmaceutycznych oceniano zużycie materiałów podczas syntezy, oczyszczania i izolacji. [14]
Badanie pokazuje, dlaczego ocenę produkcji należy prowadzić dla całego procesu.
Nie oznacza jednak, że każda fabryka, sekwencja lub technologia produkcyjna osiąga identyczne wyniki.
Jakość produkcji jest wynikiem wielu elementów kontroli
Wiarygodna produkcja peptydów wymaga czegoś więcej niż uzyskania jednego satysfakcjonującego wyniku analitycznego.
Kontrolowany proces zazwyczaj obejmuje kilka powiązanych elementów:
zdefiniowana cząsteczka docelowa → odpowiednie materiały wyjściowe → kontrolowana synteza → kontrolowane oczyszczanie → właściwe pobieranie próbek → zwalidowana lub odpowiednia do celu analiza → dokumentacja partii.
Dokumentacja partii łączy wyniki analityczne z materiałem, który rzeczywiście został wyprodukowany.
Certyfikat analizy (COA) podsumowuje wybrane wyniki badań określonej partii.
Jego wartość informacyjna zależy od:
- rodzaju wykonanych badań;
- zastosowanych metod;
- przydatności tych metod;
- specyfikacji;
- identyfikacji próbki;
- możliwości prześledzenia partii;
- potwierdzenia, że raportowane wyniki rzeczywiście dotyczą danego materiału.
Pojedyncza wartość określana jako „czystość” nie może samodzielnie potwierdzić:
- pełnej tożsamości molekularnej;
- zawartości peptydu;
- integralności stereochemicznej;
- poziomu pozostałości rozpuszczalników;
- zawartości wody;
- składu przeciwjonów;
- właściwości mikrobiologicznych;
- fałdowania;
- actividad biológica;
- przydatności do określonego celu.
Odpowiedni zestaw analiz zależy od zamierzonego zastosowania materiału.
Peptyd wykorzystywany jako analityczny materiał odniesienia, odczynnik badawczy stosowany w eksperymencie komórkowym oraz materiał znajdujący się na etapie rozwoju farmaceutycznego mogą wymagać odpowiedzi na inne pytania jakościowe.
Dowody analityczne należy więc interpretować w jasno określonym kontekście, a nie jako uniwersalne potwierdzenie jakości.
Ocena zrównoważenia środowiskowego musi obejmować cały proces
Synteza peptydów może wymagać znacznych ilości rozpuszczalników i odczynników.
Ocena wpływu środowiskowego powinna więc uwzględniać znacznie więcej niż sam etap sprzęgania.
Do istotnych elementów mogą należeć:
- przygotowanie bloków budulcowych;
- odczynniki sprzęgające;
- odczynniki do odbezpieczania;
- lavado;
- desviación;
- obróbka produktu;
- chromatografia;
- wymiana rozpuszczalników;
- izolacja;
- secado;
- gospodarowanie odpadami.
Zmniejszenie obciążenia środowiskowego może wymagać równoczesnej poprawy kilku etapów.
W opublikowanej analizie dotyczącej produkcji peptydów omówiono problemy związane zarówno z syntezą, jak i oczyszczaniem oraz wskazano potrzebę ulepszania całego projektu procesu. [15]
Jako publikacja perspektywiczna nie stanowi ona kontrolowanego bezpośredniego porównania dowodzącego, że jedna konkretna technologia zawsze jest bardziej przyjazna środowisku.
Igualmente:
szybsza synteza nie oznacza automatycznie bardziej ekologicznej syntezy,
a mniejsze zużycie rozpuszczalników podczas samej syntezy nie oznacza automatycznie mniejszego wpływu całego procesu produkcyjnego.
Porównania środowiskowe wymagają stosowania spójnych granic analizy i najlepiej powinny odnosić zużycie zasobów do określonej ilości wyizolowanego i scharakteryzowanego produktu końcowego.
Preguntas más frecuentes
1. Czym różni się synteza peptydów na fazie stałej od syntezy w fazie ciekłej?
W syntezie na fazie stałej rosnący peptyd pozostaje przyłączony do nierozpuszczalnego nośnika, natomiast w klasycznej syntezie w roztworze półprodukt peptydowy pozostaje rozpuszczony i zazwyczaj musi być odzyskiwany na podstawie swoich właściwości fizycznych i chemicznych. W węższym znaczeniu LPPS rozpuszczony rosnący łańcuch posiada dodatkowo rozpuszczalny znacznik lub nośnik ułatwiający późniejsze rozdzielanie. Badania syntezy znakowanej pokazują jedną ze strategii łączenia chemii roztworowej z odzyskiwaniem poprzez wytrącanie, natomiast literatura dotycząca LPPS odróżnia takie rozwiązania zarówno od klasycznej syntezy w roztworze, jak i od SPPS. Żadna metoda nie jest z definicji optymalna dla każdego peptydu. Podstawowa różnica dotyczy sposobu fizycznego prowadzenia i rozdzielania rosnącego łańcucha podczas kolejnych etapów syntezy. [8] [9]
2. Dlaczego podczas syntezy peptydów mogą powstawać zanieczyszczenia?
Zanieczyszczenia mogą powstawać dlatego, że zamierzone reakcje nie zawsze zachodzą ilościowo, a inne grupy funkcyjne mogą uczestniczyć w niepożądanych reakcjach. Niepełne sprzęganie może prowadzić do sekwencji delecyjnych, niepełne odbezpieczanie może zakłócać dalsze składanie łańcucha, a niektóre sekwencje są podatne na zmiany stereochemiczne, powstawanie aspartimidu, utlenianie, przegrupowania lub produkty uboczne związane z odszczepianiem. Badania syntezy Fmoc oraz analizy strukturalnej syntetycznych zanieczyszczeń peptydowych dokumentują kilka takich przykładów. [11] [12] Częstość i znaczenie poszczególnych zanieczyszczeń zależą od sekwencji i procesu, dlatego automatyzacji syntezy nie należy utożsamiać z całkowitym brakiem błędów chemicznych.
3. Jaką rolę pełni żywica w syntezie peptydów?
Żywica utrzymuje rosnący peptyd, podczas gdy rozpuszczalne odczynniki i wiele produktów ubocznych można usuwać pomiędzy kolejnymi etapami syntezy. Znacznie upraszcza to powtarzające się składanie łańcucha, ale żywica nie jest wyłącznie mechanicznym uchwytem. Jej pęcznienie, stopień obsadzenia, architektura polimeru, zgodność z rozpuszczalnikami i dostępność miejsc reakcji mogą wpływać na skuteczność docierania odczynników do przyłączonego peptydu. W badaniach z wykorzystaniem reaktora ze zmiennym złożem monitorowano zachowanie żywicy podczas analizy agregacji i efektywności sprzęgania. [4] Takie monitorowanie nie eliminuje błędów sekwencji, ale pokazuje, dlaczego fizyczny stan żywicy może być istotną zmienną procesową.
4. Do czego służy żywica Wanga w syntezie peptydów?
Nośniki typu Wang są powszechnie związane z przygotowywaniem peptydów uwalnianych po odpowiednim odszczepieniu z C-końcem w postaci kwasu karboksylowego. Dokładny produkt końcowy zależy jednak od linkera, architektury nośnika i zastosowanej chemii odszczepiania, a nie tylko od nazwy żywicy. Badacze przedstawili również specjalistyczną metodę przekształcania materiału peptydyl-Wang-TentaGel w hydrazydy peptydowe, które mogą służyć jako użyteczne półprodukty syntetyczne. [5] Alternatywna reakcja nie zmienia znaczenia standardowego odszczepiania z żywicy Wanga. Pokazuje natomiast, dlaczego podczas przewidywania produktu należy analizować cały system nośnika i warunki reakcji.
5. Czy SPPS buduje peptyd od N-końca czy od C-końca?
Klasyczna etapowa SPPS zazwyczaj rozpoczyna się od przyłączenia C-końcowej reszty do nośnika, po czym łańcuch jest wydłużany w kierunku N-końca. Jest to kierunek przeciwny do standardowego wydłużania łańcucha na rybosomie, gdzie białko rośnie poprzez dodawanie kolejnych aminokwasów do C-końca. Synteza BPTI jest przykładem wykorzystania zabezpieczonych bloków budulcowych i nośnika przed późniejszym uwolnieniem, oczyszczaniem i fałdowaniem produktu. [3] Istnieją jednak specjalistyczne strategie chemii peptydów wykorzystujące inne rozwiązania, dlatego budowanie od C- do N-końca należy określać jako klasyczne podejście SPPS, a nie bezwzględną zasadę wszystkich metod syntezy.
6. Dlaczego grupy ochronne są potrzebne?
Aminokwasy często zawierają kilka reaktywnych grup funkcyjnych. Grupy ochronne tymczasowo zapobiegają reakcji wybranych miejsc, pozostawiając odpowiednie miejsce dostępne w konkretnym etapie syntezy. Pomaga to kontrolować kolejność i sposób łączenia reszt. Bez właściwej ochrony konkurencyjne reakcje mogłyby prowadzić do powstawania złożonych mieszanin lub produktów o zmienionej strukturze. Badania dotyczące powstawania aspartimidu pokazały, że zmiana chemii ochrony grupy karboksylowej może ograniczać ważną reakcję uboczną w analizowanych sekwencjach. [2] Grupy ochronne nie gwarantują idealnego przebiegu syntezy, lecz zapewniają selektywną kontrolę chemiczną, która musi pozostać zgodna ze wszystkimi istotnymi etapami procesu.
7. Czym różnią się Fmoc i Boc?
Fmoc i Boc są szeroko stosowanymi tymczasowymi grupami chroniącymi grupę aminową, ale reagują na inne warunki chemiczne. Fmoc jest zazwyczaj usuwany w środowisku zasadowym, natomiast Boc jest wrażliwy na kwasy. Różnica ta wpływa na sposób łączenia ich z ochroną łańcuchów bocznych, linkerami i pozostałymi etapami syntezy. Synteza oparta na Fmoc jest szeroko wykorzystywana we współczesnej SPPS, ale badania wykazały również możliwość występowania zależnych od sekwencji reakcji ubocznych w takich warunkach. [11] W praktyce bardziej użyteczne jest więc porównywanie całych strategii ochrony i ich zgodności z daną sekwencją niż rozpatrywanie wyłącznie nazw dwóch grup ochronnych.
8. Co oznacza ochrona ortogonalna?
Ochrona ortogonalna oznacza, że jedną grupę ochronną można usunąć w warunkach, w których inna potrzebna grupa ochronna pozostaje wystarczająco stabilna, aby można było kontynuować syntezę. Pozwala to odsłaniać różne miejsca reaktywne na określonych etapach. Koncepcja ta ma podstawowe znaczenie podczas kontrolowanej syntezy złożonych peptydów. Ortogonalność jest jednak zależna od warunków, a nie absolutna: wielokrotna ekspozycja, charakter sekwencji i parametry reakcji nadal mogą prowadzić do reakcji ubocznych. Badania alternatywnych sposobów ochrony grup karboksylowych pokazują, jak strategię ochrony można modyfikować w celu kontrolowania trudnej chemii peptydowej. [2]
9. Czym jest sekwencja delecyjna?
Sekwencja delecyjna to peptyd pozbawiony jednej lub kilku reszt obecnych w zamierzonej sekwencji docelowej. Może powstać, gdy etap sprzęgania aminokwasu nie zachodzi całkowicie, ale nieprzereagowany łańcuch pozostaje przyłączony do nośnika i uczestniczy w kolejnych cyklach. Ponieważ nieprawidłowy łańcuch nadal pozostaje związany z żywicą, zwykłe przemywanie nie musi go usunąć. Badania monitorowania SPPS w czasie rzeczywistym wskazują niepełne tworzenie wiązań amidowych jako ważny problem procesowy. [4] Sekwencja delecyjna jest więc problemem związanym ze strukturą i tożsamością produktu, a nie jedynie pozostałością odczynnika.
10. Czy dwa zanieczyszczenia peptydowe mogą mieć taką samą masę cząsteczkową?
Tak. Różne struktury molekularne mogą mieć identyczną lub nierozróżnialną masę nominalną. Z tego powodu sama zgodność masy nie potwierdza pełnej tożsamości cząsteczki. W badaniach syntetycznego peptydu będącego substratem reniny zidentyfikowano izobaryczne składniki zanieczyszczeń, w których modyfikacje występowały w różnych pozycjach. Derywatyzacja i tandemowa spektrometria mas dostarczyły dodatkowych informacji strukturalnych. [12] Przykład ten pokazuje, dlaczego zgodność obserwowanej masy z oczekiwaną nie może samodzielnie potwierdzić właściwej sekwencji, łączności, stereochemii ani braku strukturalnie podobnych izomerów.
11. Czym są epimeryzacja i racemizacja w syntezie peptydów?
Epimeryzacja i racemizacja dotyczą niepożądanych zmian konfiguracji stereochemicznej. Mogą one zachodzić bez zmiany nominalnej sekwencji aminokwasowej lub masy cząsteczkowej, dlatego zwykły pomiar masy może nie wykazać różnicy strukturalnej. W badaniach syntezy Fmoc wspomaganej mikrofalami zidentyfikowano reszty podatne na zmiany stereochemiczne i wykazano, że modyfikacja warunków reakcji może ograniczać takie procesy. [11] Ryzyko zależy od bloku budulcowego, sekwencji i warunków procesu. Jakość stereochemiczna wymaga więc metod analitycznych zdolnych do oceny konfiguracji, a nie może być wnioskowana wyłącznie na podstawie masy cząsteczkowej.
12. Czym jest powstawanie aspartimidu?
Powstawanie aspartimidu jest niepożądaną reakcją związaną z określonymi sekwencjami zawierającymi asparaginian. Powstanie cyklicznego półproduktu może prowadzić do kolejnych produktów o zmienionej łączności szkieletu lub stereochemii, zmniejszając wydajność i utrudniając oczyszczanie. Badacze analizowali alternatywne strategie ochrony zaprojektowane w celu ograniczenia tej reakcji w wybranych peptydach i białkach. [2] Wyniki nie wskazują jednego uniwersalnego rozwiązania dla wszystkich sekwencji zawierających asparaginian. Pokazują natomiast, dlaczego projektowanie syntezy i strategii kontroli zanieczyszczeń musi uwzględniać specyficzne zachowanie chemiczne danej sekwencji.
13. Czy wysoka czystość HPLC potwierdza prawidłową tożsamość peptydu?
Nie. Czystość HPLC opisuje próbkę w ramach konkretnego rozdziału chromatograficznego, zastosowanego detektora i sposobu analizy danych. Wysoki udział powierzchni głównego piku może być wartościowym dowodem, że próbka jest zdominowana przez jeden chromatograficznie rozdzielony składnik, ale nie potwierdza samodzielnie pełnej tożsamości molekularnej. Współeluujące zanieczyszczenia, stereoizomery i inne warianty mogą wymagać dodatkowych technik. W badaniach analizy chiralnej peptydów wykorzystano specjalnie zaprojektowany proces, który uwzględniał również zmiany stereochemiczne powstające podczas przygotowania próbki. [13] Tożsamość i czystość należy więc traktować jako powiązane, ale odrębne pytania analityczne.
14. Czy wydajność produktu oczyszczonego oznacza to samo co czystość?
Nie. Wydajność produktu oczyszczonego lub wyizolowanego określa ilość odzyskanego materiału docelowego względem zdefiniowanej ilości początkowej lub teoretycznej. Czystość opisuje natomiast skład odzyskanego materiału według określonej metody analitycznej. Synteza może prowadzić do uzyskania stosunkowo niewielkiej ilości produktu o bardzo wysokiej czystości albo dużej ilości materiału surowego zawierającego znaczną ilość zanieczyszczeń. W badaniach automatycznej syntezy przepływowej czystość surowego produktu i wydajność po izolacji raportowano oddzielnie. [7] Rozdzielenie tych parametrów zapobiega błędnemu traktowaniu wysokiej wartości jednego z nich jako dowodu wysokiej wartości drugiego.
15. Czy długie peptydy można wytwarzać poprzez łączenie krótszych fragmentów?
Tak. W strategii fragmentowej krótsze segmenty peptydowe mogą zostać przygotowane oddzielnie, a następnie połączone za pomocą odpowiedniej chemii. Natwywna ligacja chemiczna była ważnym przykładem, w którym niezabezpieczone fragmenty peptydowe połączono w sposób prowadzący do powstania naturalnego wiązania szkieletu peptydowego, a następnie uzyskano pofałdowane białko. [10] Nie oznacza to, że dowolne fragmenty peptydowe mogą łączyć się spontanicznie. Należy uwzględnić strukturę fragmentów, chemię łączenia, wybór miejsca połączenia, rozpuszczalność, stereochemię i wymagania dotyczące oczyszczania. Składanie fragmentów jest więc alternatywną strategią projektowania syntezy, a nie automatycznym rozwiązaniem problemów związanych z długimi peptydami.
16. Czy szybsza zautomatyzowana synteza eliminuje potrzebę oczyszczania?
Nie. Szybsze zautomatyzowane lub przepływowe składanie skraca czas określonych etapów syntezy, ale nie dowodzi, że każda powstała cząsteczka ma zamierzoną strukturę. W badaniach szybkiej syntezy przepływowej nadal charakteryzowano materiał surowy i stosowano późniejsze oczyszczanie, a w kolejnych pracach dotyczących automatyzacji osobno porównywano czystość surowego materiału i wydajność po izolacji. [6] [7] Dobre wyniki systemu dla badanych sekwencji nie gwarantują również identycznych rezultatów dla każdego nowego celu. Przyspieszona synteza nadal musi być połączona z odpowiednim oczyszczaniem, potwierdzeniem tożsamości, analizą zanieczyszczeń i charakterystyką końcową.
17. Dlaczego zwiększenie skali produkcji jest bardziej skomplikowane niż przygotowanie większej partii?
Zwiększenie skali zmienia warunki fizyczne i chemiczne, a nie tylko ilość materiału. Mieszanie, wymiana ciepła, pęcznienie żywicy, dystrybucja odczynników, ciśnienie, filtracja, obsługa rozpuszczalników, rozpuszczalność półproduktów i możliwości systemu oczyszczania mogą zachowywać się inaczej przy większej objętości produkcji. W analizie przemysłowej 40 procesów peptydowych osobno oceniano syntezę, oczyszczanie i izolację podczas analizy zużycia materiałów. [14] Wyniki pokazują, dlaczego produkcję trzeba rozpatrywać jako kompletny proces. Skalowalna metoda musi powtarzalnie prowadzić do uzyskania scharakteryzowanego materiału na wszystkich etapach, a nie tylko większej ilości surowego peptydu.
18. Czy peptyd jest gotowy od razu po złożeniu prawidłowej sekwencji?
Niekoniecznie. Złożenie łańcucha tworzy szkielet sekwencji tylko w takim zakresie, w jakim potwierdzają to proces i dane analityczne. W zależności od cząsteczki mogą być nadal potrzebne odbezpieczanie, odszczepianie, cyklizacja, utlenianie, tworzenie mostków disiarczkowych, fałdowanie, koniugacja, oczyszczanie i charakterystyka. Synteza BPTI stanowi dobry przykład procesu, w którym po złożeniu liniowej sekwencji następowało oczyszczanie i tworzenie pofałdowanej struktury zawierającej mostki disiarczkowe. [3] Określenie „gotowy peptyd” powinno więc odnosić się do formy molekularnej wymaganej w danym kontekście naukowym, a nie tylko do zakończenia etapowego dodawania aminokwasów.
19. Czy prawidłowa masa cząsteczkowa potwierdza prawidłową sekwencję peptydu?
Nie. Zgodność masy cząsteczkowej jest wartościowym dowodem, ale nie może samodzielnie potwierdzić pełnej sekwencji ani struktury molekularnej. Struktury izobaryczne mogą mieć tę samą masę, a różnice stereochemiczne mogą w ogóle nie powodować zmiany masy cząsteczkowej. Badania zanieczyszczeń syntetycznych peptydów pokazały, że rozróżnienie strukturalnie odmiennych składników może wymagać tandemowej spektrometrii mas i dodatkowych analiz. [12] W przypadku pytań dotyczących integralności stereochemicznej mogą być potrzebne również metody chiralne. [13] Masę cząsteczkową należy więc traktować jako jeden z elementów oceny tożsamości, a nie jej pełne potwierdzenie.
20. Dlaczego oczyszczanie należy traktować jako część produkcji peptydu, a nie tylko końcowy dodatek?
Oczyszczanie decyduje o tym, czy docelowy peptyd można skutecznie oddzielić od sekwencji delecyjnych, produktów ubocznych, pozostałości odczynników, strukturalnie podobnych zanieczyszczeń i innych składników powstałych podczas syntezy. Metoda pozwalająca bardzo szybko wytwarzać duże ilości surowego materiału może nadal być niepraktyczna, jeśli nie da się skutecznie odzyskać docelowego produktu o wymaganej jakości. Z tego powodu analizy przemysłowe procesów peptydowych uwzględniają razem syntezę, oczyszczanie i izolację. [14] Efektywność produkcji należy ostatecznie oceniać na podstawie ilości i właściwości wyizolowanego materiału końcowego, a nie wyłącznie szybkości syntezy.
Ograniczenia przy porównywaniu metod syntezy peptydów
Podczas interpretowania badań porównujących technologie produkcji peptydów należy pamiętać o kilku istotnych ograniczeniach.
Po pierwsze, sekwencja silnie wpływa na trudność syntezy. Metoda sprawdzająca się dla jednego peptydu nie musi działać tak samo dla innego. Agregacja, hydrofobowość, skład aminokwasowy, długość, tendencja do tworzenia struktur drugorzędowych i podatność na reakcje uboczne mogą zmieniać zachowanie procesu. [1] [4]
Po drugie, czystość materiału surowego, wydajność po izolacji, czystość końcowa i zawartość peptydu są różnymi parametrami. Porównywanie metod wyłącznie na podstawie jednego z nich może dawać niepełny obraz efektywności produkcji. [7]
Po trzecie, szybkie składanie łańcucha nie oznacza szybkiej produkcji całego materiału. Odszczepianie, oczyszczanie, izolacja, końcowe kształtowanie struktury, badania analityczne i dokumentacja również wpływają na całkowity czas produkcji. [6] [7]
Po czwarte, czystość analityczna zależy od zastosowanej metody. HPLC, spektrometria mas, tandemowa spektrometria mas i analiza chiralna odpowiadają na różne pytania. Jeden wynik analityczny nie musi potwierdzać pełnej tożsamości strukturalnej. [12] [13]
Po piąte, skala wpływa na zachowanie procesu. Wyników syntezy laboratoryjnej nie można automatycznie przenosić na produkcję przemysłową bez oceny mieszania, transportu masy, możliwości oczyszczania, zużycia materiałów i innych czynników zależnych od skali. [14]
Po szóste, historyczne porównania ekonomiczne mogą z czasem tracić aktualność. Koszty odczynników, poziom automatyzacji, technologie ekspresji, wyposażenie do oczyszczania, odzyskiwanie rozpuszczalników i infrastruktura produkcyjna stale się rozwijają. Starsze analizy kosztów mogą nadal mieć znaczenie naukowe, ale nie muszą odzwierciedlać aktualnej ekonomiki rynku. [1]
Po siódme, porównania środowiskowe wymagają spójnych granic analizy. Ocena zużycia rozpuszczalników podczas samego składania łańcucha przy jednoczesnym pominięciu oczyszczania i izolacji może prowadzić do mylących wniosków dotyczących zrównoważenia procesu. [14] [15]
Wreszcie sama nazwa metody nie określa jakości produktu. SPPS, synteza w roztworze, LPPS, ligacja fragmentów oraz ekspresja biologiczna mogą prowadzić do uzyskania materiału wysokiej jakości, jeśli proces został odpowiednio zaprojektowany i kontrolowany. Żadna z tych metod nie gwarantuje jednak automatycznie właściwej tożsamości, czystości, stereochemii, fałdowania czy przydatności do konkretnego zastosowania.
Resumen
Syntezę peptydów najlepiej rozumieć jako kontrolowany proces wytwarzania cząsteczek, a nie po prostu tworzenie wiązań peptydowych.
Celem jest zbudowanie określonej sekwencji aminokwasowej przy jednoczesnym kontrolowaniu sposobu połączenia reszt, chemii grup ochronnych, stereochemii, reakcji ubocznych i wszelkich dodatkowych wymagań strukturalnych.
Synteza peptydów na fazie stałej utrzymuje rosnący łańcuch na nierozpuszczalnym nośniku, dzięki czemu powtarzane etapy sprzęgania i przemywania dobrze nadają się do automatyzacji. Zalety związane z powtarzalnym składaniem nie eliminują jednak problemów takich jak niepełne reakcje, agregacja, sekwencje delecyjne czy zależne od sekwencji reakcje uboczne. [4] [6] [7]
Klasyczna synteza w roztworze utrzymuje półprodukty peptydowe w fazie ciekłej i może zapewniać większą elastyczność w izolowaniu oraz charakteryzowaniu poszczególnych produktów pośrednich. Wielokrotne rozdzielanie oraz pogarszająca się rozpuszczalność mogą jednak stać się poważnymi ograniczeniami.
Metody syntezy w fazie ciekłej z rozpuszczalnymi znacznikami próbują połączyć chemię roztworową z zaprojektowanymi strategiami odzyskiwania materiału. Mogą więc stanowić dodatkową możliwość w przypadku sekwencji i problemów produkcyjnych, dla których klasyczna SPPS nie jest optymalna. [8] [9]
Dłuższe lub szczególnie trudne cząsteczki można również przygotowywać poprzez składanie fragmentów, w tym natywną ligację chemiczną, zamiast polegać wyłącznie na nieprzerwanym dodawaniu kolejnych reszt aminokwasowych. [10]
Niezależnie od wybranej metody składania efektywność sprzęgania i chemia grup ochronnych pozostają kluczowe, ponieważ niewielkie nieefektywności i reakcje uboczne mogą kumulować się podczas kolejnych etapów syntezy. Powstawanie aspartimidu, sekwencje delecyjne i zmiany stereochemiczne pokazują, dlaczego sama zamierzona sekwencja nie opisuje wszystkiego, co może powstać podczas procesu. [2] [11] [12]
Praca nie kończy się również wraz ze złożeniem łańcucha.
Oczyszczanie decyduje o tym, czy produkt docelowy można oddzielić od innych składników.
Następnie odpowiednio dobrane metody analityczne odpowiadają na odrębne pytania dotyczące tożsamości, czystości, zawartości, stereochemii, konformacji oraz – jeśli ma to znaczenie – aktywności funkcjonalnej. [3] [12] [13]
Zwiększenie skali produkcji wprowadza kolejne zagadnienia dotyczące transportu masy, zachowania żywicy, zużycia rozpuszczalników, filtracji, możliwości oczyszczania, powtarzalności procesu i jego wpływu środowiskowego. Z tego powodu przemysłowa ocena procesu powinna obejmować razem syntezę, oczyszczanie i izolację, a nie koncentrować się wyłącznie na szybkości sprzęgania. [14] [15]
Najważniejsza zasada jest następująca:
skuteczna produkcja peptydu wymaga kontroli całego procesu – od projektu molekularnego i tworzenia wiązań aż po oczyszczanie oraz charakterystykę strukturalną. Uzyskanie łańcucha o oczekiwanej nominalnej masie lub wysokiego głównego piku chromatograficznego stanowi wartościowy dowód, ale żaden z tych parametrów samodzielnie nie potwierdza pełnej tożsamości molekularnej ani jakości procesu produkcyjnego.
Descargo de responsabilidad
Artykuł ma wyłącznie charakter edukacyjny i naukowo-informacyjny. Opisuje ogólne zasady chemii peptydów, syntezy na fazie stałej, syntezy w roztworze i w fazie ciekłej, strategii grup ochronnych, sprzęgania, oczyszczania, charakterystyki analitycznej, procesów produkcyjnych oraz przykłady pochodzące z opublikowanych badań. Nie jest protokołem laboratoryjnym, instrukcją produkcyjną, poradą medyczną, przewodnikiem dotyczącym dawkowania lub podawania ani certyfikatem jakości jakiegokolwiek konkretnego produktu peptydowego. Wyniki eksperymentalne należy interpretować w kontekście sekwencji, zastosowanych metod, skali procesu, technik analitycznych i ograniczeń poszczególnych badań.
Referencias
- Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K., & Perczel, A. (2016). Bacterial expression and/or solid phase peptide synthesis of 20-40 amino acid long polypeptides and miniproteins, the case study of Class B GPCR ligands. Current Protein & Peptide Science, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
- Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Prevention of aspartimide formation during peptide synthesis using cyanosulfurylides as carboxylic acid-protecting groups. Nature Communications, 11(1), Article 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
- Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). Solid-phase synthesis of bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) and two analogues. A chemical approach for evaluating the role of disulfide bridges in protein folding and stability. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. PubMed record
- Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). Real-time monitoring of solid-phase peptide synthesis using a variable bed flow reactor. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
- Bello, C., Kikul, F., & Becker, C. F. W. (2015). Efficient generation of peptide hydrazides via direct hydrazinolysis of Peptidyl-Wang-TentaGel resins. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
- Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Rapid flow-based peptide synthesis. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
- Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2017). A fully automated flow-based approach for accelerated peptide synthesis. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
- Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G., & Albericio, F. (2022). Liquid-phase peptide synthesis (LPPS): A third wave for the preparation of peptides. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
- Takahashi, D., Yano, T., & Fukui, T. (2012). Novel diphenylmethyl-derived amide protecting group for efficient liquid-phase peptide synthesis: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
- Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., & Kent, S. B. (1994). Synthesis of proteins by native chemical ligation. Science, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Characterization of impurities in a synthetic renin substrate peptide by fast-atom bombardment mass spectrometry and hybrid tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
- Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G., & Crowther, J. B. (1995). Peptide chiral purity determination: Hydrolysis in deuterated acid, derivatization with Marfey’s reagent and analysis using high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
- Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Process mass intensity (PMI): A holistic analysis of current peptide manufacturing processes informs sustainability in peptide synthesis. The Journal of Organic Chemistry, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
- Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Sustainability challenges in peptide synthesis and purification: From R&D to production. The Journal of Organic Chemistry, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001