Síntesis de péptidos: método en fase sólida, en solución y métodos de producción

La síntesis de péptidos es un proceso controlado de creación de cadenas de aminoácidos con una secuencia específica. En la síntesis química, los aminoácidos seleccionados se unen mediante enlaces peptídicos, al mismo tiempo que se controlan otros grupos reactivos presentes en estas moléculas. El objetivo no es, por tanto, la mera unión de aminoácidos, sino la obtención de una estructura molecular específica con una secuencia, estereoquímica, estructura de los extremos de la cadena y, si es necesario, características estructurales adicionales determinadas.

Entre los métodos principales se encuentran la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS), la síntesis clásica en solución y los métodos más recientes de síntesis de péptidos en fase líquida (LPPS), que utilizan soportes solubles o marcadores moleculares. Los laboratorios de investigación y las plantas de producción también pueden combinar diferentes enfoques, preparar fragmentos más cortos por separado y luego unirlos, o utilizar la expresión biológica si resulta más adecuada para una secuencia determinada.

La comparación entre la síntesis química y la expresión bacteriana de polipéptidos que constan de 20 a 40 residuos de aminoácidos muestra un principio importante: la elección práctica del método de producción depende de la molécula específica, su secuencia, su propensión a la agregación, las modificaciones requeridas, la escala de producción y los requisitos analíticos. [1]

Obtener la secuencia de aminoácidos deseada es solo una de las etapas de la producción del péptido.

Todo el proceso puede incluir:

diseño de secuencias → preparación de bloques de construcción → protección de grupos funcionales → acoplamiento → desprotección → ensamblaje de la cadena → escisión o unión de fragmentos → conformación estructural final → purificación → confirmación de identidad → análisis de impurezas → determinación del contenido → caracterización final.

Para algunos péptidos también son necesarios pasos adicionales, como la ciclación, la formación de puentes disulfuro, el plegamiento, la conjugación u otras modificaciones químicas.

Por esta razón, el correcto ensamblaje de la cadena no significa automáticamente que el material final posea la identidad, pureza, estereoquímica, conformación, estabilidad u otras características requeridas adecuadas.

La síntesis de péptidos es la producción de péptidos, que son compuestos orgánicos formados por aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.

Creación de una secuencia específica de aminoácidos

Péptido consiste en residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.

El objetivo de la síntesis de péptidos es crear estos enlaces en un orden predeterminado, a menudo controlando simultáneamente:

• de aminoácidos;
• orden de los aminoácidos en la secuencia;
• esterequímica;
• estructuras del extremo N;
• estructuras del extremo C;
• modificación de cadenas laterales;
• disposición de los puentes disulfuro;
• ciclización;
• de otras características estructurales requeridas.

La secuencia es fundamental, ya que una composición de aminoácidos idéntica puede dar lugar a moléculas diferentes si los aminoácidos se encuentran en un orden distinto.

Afirmar que una molécula dada es „un péptido compuesto de cinco aminoácidos” proporciona, por tanto, muy poca información sobre su estructura real. Para describir correctamente la molécula, es necesario conocer el tipo de aminoácidos, su orden, la estereoquímica, los grupos terminales y las posibles modificaciones adicionales.

Dos péptidos pueden, por tanto, tener exactamente la misma composición de aminoácidos y, sin embargo, ser estructuras moleculares diferentes.

Las diferencias adicionales pueden derivar de la modificación de los extremos de la cadena, la presencia de puentes disulfuro, un esqueleto cíclico, cambios en las cadenas laterales o una configuración estereoquímica diferente.

La síntesis química de péptidos utiliza habitualmente aminoácidos cuyas grupos reactivos han sido protegidos selectivamente.

Los grupos protectores temporales permiten la creación de un enlace químico específico deseado al tiempo que limitan las reacciones competitivas en otras partes de la molécula.

En las siguientes etapas planificadas de la síntesis, estos grupos se eliminan o modifican.

Reacción controlada en lugar de combinación espontánea

En las descripciones químicas básicas, la formación de un enlace peptídico se presenta a menudo como una reacción de condensación, en la cual dos aminoácidos se unen con la liberación neta de una molécula de agua.

Tal ecuación describe el balance general de la reacción.

Sin embargo, no debe equipararse con la forma en que se lleva a cabo en la práctica la síntesis peptídica controlada.

Solo mezclar aminoácidos libres no permitiría determinar de forma fiable:

• qué grupo amino debe reaccionar;
• qué grupo carboxilo debe reaccionar;
• cuál aminoácido debe ser el primero;
• el cual debe encontrarse el segundo;
• ¿empezarán a reaccionar las cadenas laterales?;
• ¿se conservará la estereoquímica?;
• ¿no se formarán numerosos productos no deseados?.

Por lo tanto, en la síntesis química práctica se aplican estrategias controladas de activación y protección de grupos funcionales.

Un grupo derivado de un grupo carboxilo se activa normalmente de tal manera que pueda reaccionar eficazmente con el grupo amino elegido. Los grupos protectores, el orden de las reacciones, la química del soporte, los reactivos de acoplamiento, el medio disolvente y los métodos de aislamiento ayudan conjuntamente a dirigir la reacción hacia el producto deseado.

La síntesis eficaz de péptidos requiere, por tanto, el control tanto de la química que debe producirse como de la que debe evitarse.

Un buen ejemplo es la formación de aspartimida.

Los investigadores desarrollaron un método alternativo de protección del grupo carboxilo cuyo objetivo era reducir esta reacción secundaria problemática durante el ensamblaje del péptido. [2]

El estudio muestra un principio más amplio de la química de péptidos: prevenir transformaciones moleculares no deseadas puede ser tan importante como crear el enlace peptídico correcto.

¿Cuándo se puede considerar que un péptido está listo?

La finalización de la creación del esqueleto lineal del péptido no siempre significa el final de toda la síntesis.

Dependiendo de la molécula de destino, tras el ensamblaje de la cadena pueden ser necesarios pasos adicionales.

Pueden incluir:

• desprotección total;
• escisión del péptido del soporte sólido;
• eliminación de marcadores temporales;
• ciclización;
• oxidación;
• formación de puentes disulfuro;
• plegamiento;
• conjugación;
• modificación de los extremos de la cadena;
• purificación;
• característica analítica.

Algunos péptidos requieren relativamente pocos cambios estructurales adicionales después del ensamblaje de la cadena.

Para otros, las etapas posteriores son de crucial importancia.

Un buen ejemplo es la síntesis del inhibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI). Los investigadores ensamblaron la secuencia lineal, purificaron el material y luego obtuvieron la estructura plegada que contiene puentes disulfuro. De acuerdo con los análisis y las comparaciones funcionales presentadas en el estudio, el material final con la secuencia natural correspondía a la proteína natural en el rango de los parámetros estudiados. [3]

Este ejemplo muestra la diferencia entre el ensamblaje de la cadena peptídica y la obtención de la forma molecular final completamente caracterizada.

El método que permite obtener una secuencia lineal correcta no confirma automáticamente:

• del plegamiento correcto;
• del correcto posicionamiento de los puentes disulfuro;
• actividad biológica;
• estabilidad;
• del perfil de contaminación;
• idoneidad para un fin determinado.

Cada una de estas cuestiones requiere pruebas independientes.

Síntesis química, expresión biológica y métodos combinados

En la síntesis química de péptidos, los bloques moleculares preparados previamente se unen en reacciones de laboratorio controladas.

Por otro lado, la expresión biológica utiliza la maquinaria celular para producir la secuencia de aminoácidos codificada. A continuación, el material debe ser recuperado, purificado y, si es necesario, sometido a un procesamiento adicional.

Ambos métodos pueden conducir a la obtención de péptidos o polipéptidos, pero conllevan diferentes posibilidades y limitaciones.

La síntesis química puede ser especialmente útil cuando se necesitan:

• aminoácidos no estándar seleccionados;
• modificaciones químicas en sitios específicos;
• estructuras específicas de los extremos de la cadena;
• marcadores isotópicos;
• modificaciones del esqueleto peptídico;
• otras características difíciles de obtener mediante la expresión biológica estándar.

La expresión biológica puede ser atractiva en el caso de secuencias más largas adecuadas o estrategias de marcaje específicas, pero no elimina los problemas que surgen en las etapas posteriores de producción.

Aún se deben tener en cuenta la recuperación de material, el plegado, el procesamiento, las impurezas procedentes del organismo hospedador, la purificación y la caracterización analítica.

Por lo tanto, ninguno de los métodos es universalmente el mejor.

En la comparación de polipéptidos formados por 20–40 residuos de aminoácidos, tanto la longitud de la secuencia como su propensión a la agregación influyeron en los resultados de la síntesis en fase sólida y de la expresión bacteriana. [1]

Estas observaciones respaldan un enfoque en el que el método de producción se selecciona para una molécula específica.

Los datos históricos sobre rendimiento, costes, equipamiento y tiempo de producción no deben considerarse valores contemporáneos universales, ya que las tecnologías, los reactivos, la automatización, los métodos de purificación y la economía de producción cambian con el desarrollo tecnológico.

Síntesis de péptidos en fase sólida

La cadena en crecimiento está unida a un soporte insoluble

En la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS), la cadena peptídica en crecimiento permanece unida a un soporte insoluble durante los ciclos sucesivos de síntesis.

El soporte suele ser una resina polimérica funcionalizada.

El espaciador, o conector, une el péptido al soporte e influye, entre otras cosas, en la forma en que se liberará posteriormente la cadena final y en el tipo de grupo terminal obtenido.

Una de las principales ventajas prácticas de SPPS es la separación más fácil del material.

Una vez finalizada una etapa determinada de la reacción, los reactivos solubles y muchos subproductos solubles se pueden eliminar mediante lavado, mientras que el péptido en crecimiento permanece unido a la fase sólida.

Gracias a esto, no es necesario aislar y purificar el péptido en crecimiento como un compuesto libre independiente tras la adición de cada aminoácido sucesivo.

Sin embargo, esta comodidad puede dar lugar a un malentendido importante.

El lavado de la resina no significa que se hayan eliminado todos los péptidos incorrectos.

Si la cadena unida a la resina no reacciona durante una etapa de acoplamiento, aún puede permanecer en el soporte.

En los siguientes ciclos puede volver a reaccionar y seguir alargándose.

Como resultado, se puede formar una secuencia de deleción, es decir, una molécula que se diferencia del péptido diana por la ausencia de uno o más residuos de aminoácidos.

Cadenas químicamente modificadas de manera similar o liberadas de manera incompleta unidas a la resina pueden participar en etapas posteriores de la síntesis.

Por lo tanto, el SPPS simplifica la separación de sustancias solubles del material unido a la resina.

Sin embargo, no garantiza una concordancia de secuencias perfecta.

Ciclo repetitivo de desbloqueo y acoplamiento

La síntesis peptídica en fase sólida (SPPS) escalonada típica comprende la repetición de tres operaciones básicas:

desaseguro → acoplamiento → lavado.

Primero se desprotege el grupo amino reactivo situado en el extremo de la cadena en crecimiento.

Luego, se une otro aminoácido protegido a la cadena.

Los reactivos solubles, el exceso de aminoácido y muchos productos de la reacción se eliminan antes de que comience el siguiente ciclo.

La repetición de este proceso permite construir el péptido un residuo de aminoácido a la vez.

En la SPPS clásica, el residuo C-terminal suele unirse al soporte en primer lugar y, a continuación, la cadena se alarga en dirección N-terminal.

Esto difiere de la síntesis de proteínas ribosómica estándar, durante la cual se añaden aminoácidos sucesivos al extremo C terminal de la cadena en crecimiento.

Sin embargo, la secuencia final de aminoácidos puede ser idéntica, a pesar de que la dirección y la química del proceso de plegamiento sean diferentes.

El término „ciclo” no debe entenderse como un único conjunto universal de condiciones de reacción adecuado para cada residuo y cada secuencia.

El curso de la reacción puede depender de:

• estrategias de grupos de protección;
• de tipo aminoácido;
• de las condiciones espaciales alrededor del lugar de la reacción;
• tipo de resina;
• enlace;
• longitudes de cadena;
• agregación;
• del disolvente;
• química de acoplamiento;
• comportamiento estructural del péptido creciente.

Una reacción que transcurre fácilmente al principio de la síntesis puede volverse mucho más difícil en una etapa posterior.

Por eso el monitoreo del proceso sigue siendo esencial incluso en sistemas altamente automatizados.

¿Por qué importan las propiedades de la resina?

El medio fijo no es simplemente un soporte pasivo.

Sus propiedades físicas y químicas pueden influir directamente en el curso de la reacción.

Uno de los parámetros importantes es la tumefacción.

Si la resina se hincha correctamente en el entorno de disolvente elegido, los reactivos pueden llegar más fácilmente a los sitios reactivos ubicados en toda la estructura del polímero.

La hinchazón insuficiente o los cambios en la estructura de la resina pueden limitar este acceso.

También pueden tener importancia:

• densidad de población;
• arquitectura de polímeros;
• estructura del enlazador;
• compatibilidad con disolventes;
• estabilidad mecánica;
• porosidad;
• propiedades de difusión;
• interacciones entre cadenas peptídicas en crecimiento.

A medida que aumenta la longitud del péptido, las cadenas individuales también pueden interactuar entre sí.

La agregación en la resina puede limitar el acceso a los sitios reactivos y provocar un acoplamiento incompleto o una desprotección incompleta.

Esto significa que una secuencia que se comporta correctamente al principio de la síntesis puede volverse cada vez más difícil a medida que se alarga la cadena.

Los investigadores desarrollaron un reactor de flujo con lecho variable que permitía monitorizar la hinchazón de la resina basándose en mediciones relacionadas con la presión. [4]

El estudio se centró en la agregación en la resina y la formación incompleta de enlaces como problemas de proceso que, en otras condiciones, pueden ser difíciles de observar directamente durante la síntesis.

Esto demuestra que el seguimiento del comportamiento físico del medio puede proporcionar información que va más allá del simple registro de los reactivos añadidos.

¿Para qué sirve la resina Wang?

La química de los conectores tipo Wang se utiliza ampliamente en la SPPS cuando, tras la escisión del péptido, se desea un extremo C en forma de ácido carboxílico.

El péptido está unido mediante un enlace de tipo éster, que posteriormente puede escindirse en las condiciones adecuadas.

Otros sistemas de conectores pueden seleccionarse cuando se necesita una estructura C-terminal diferente, por ejemplo, una amida.

Vale la pena distinguir la química del enlazador de todo el soporte físico.

Los enlazadores tipo Wang relacionados se pueden introducir en varias arquitecturas poliméricas.

Tales materiales no necesitan tener idénticos:

• propiedades de hinchamiento;
• capacidades;
• compatibilidad con disolventes;
• propiedades mecánicas;
• comportamientos durante la reacción.

Los estudios que utilizaron soportes de peptidil-Wang-TentaGel demostraron un método alternativo especializado para la obtención de hidrazidas peptídicas, las cuales son intermedios útiles en la química de péptidos. [5]

Esto no significa que la escisión estándar de la resina de Wang conduzca habitualmente a la formación de hidrazidas peptídicas.

Sin embargo, muestra un principio importante:

el soporte + el enlace + las condiciones de reacción + la química de escisión determinan conjuntamente el producto obtenido.

Síntesis de SPPS en sistema periódico y de flujo

La SPPS se puede llevar a cabo en recipientes discontinuos clásicos o en sistemas en los que los reactivos fluyen a través de un reactor que contiene un soporte sólido.

Los sistemas de flujo pueden permitir un intercambio rápido de reactivos y un control más preciso del entorno químico que rodea a la resina.

Un estudio de 2014 presentó la síntesis rápida de péptidos en flujo con monitorización continua y se aplicó a varios péptidos y a una proteína pequeña. [6]

En un estudio automatizado posterior se describió un ensamblaje de cadenas significativamente más rápido, logrando para los ejemplos analizados una pureza del producto crudo y un rendimiento tras el aislamiento comparables a los de la síntesis discontinua clásica. [7]

Estos estudios muestran las capacidades de sistemas específicos en condiciones determinadas.

Sin embargo, no demuestran que todos los péptidos puedan producirse con la misma rapidez y calidad.

El tiempo necesario para producir un péptido también abarca mucho más que la mera síntesis de la cadena.

El proceso completo puede incluir:

• preparación de reactivos;
• preparación de la resina;
• acoplamiento;
• desbloqueo;
• lavado;
• desviación;
• procesamiento del producto;
• purificación;
• eliminación de disolventes;
• conformado final de la estructura;
• análisis de laboratorio;
• documentación.

Por lo tanto, la creación rápida de mazos es solo un elemento de la eficiencia general de la producción.

Síntesis en fase líquida

¿Qué significa este término?

El término „síntesis de péptidos en fase líquida” puede utilizarse en varios sentidos.

En un sentido amplio, puede significar simplemente la síntesis de péptidos en solución.

Sin embargo, en la literatura más especializada se suele distinguir entre:

1. la síntesis clásica de péptidos en solución;
2. síntesis de péptidos en fase sólida;
3. nuevos métodos de LPPS, en los cuales la cadena en crecimiento posee un marcador o soporte soluble.

Esta distinción es importante porque cambia la forma en que se separa y recupera el producto.

Un intermedio peptídico protegido, libremente disuelto, puede requerir su aislamiento utilizando sus propias propiedades físicas y químicas.

En el caso de un producto intermedio marcado, el marcador puede diseñarse para facilitar la precipitación, la extracción, la retención en membrana u otro método de separación.

Una revisión sobre la LPPS distingue claramente entre la síntesis clásica en solución, la SPPS y los métodos que utilizan marcadores solubles. [8]

La publicación es útil para ordenar la terminología y la metodología.

Sin embargo, no debe interpretarse como un experimento único que demuestre que un método en particular es el mejor para cada péptido.

La síntesis clásica de péptidos en disolución

En la síntesis clásica, en un disolvente protegido los aminoácidos, los productos peptídicos o los fragmentos permanecen disueltos en el medio de reacción en lugar de unirse covalentemente a la resina insoluble.

Tras finalizada la reacción, el producto intermedio adecuado puede ser aislado, purificado y, si es necesario, caracterizado antes de iniciar la siguiente etapa.

Esto puede traer algunos beneficios.

Los investigadores pueden:

• caracterizar los distintos productos semiacabados;
• elegir la metodología de purificación en función del producto semisólido específico;
• optimizar las distintas transformaciones;
• preparar los fragmentos de forma independiente;
• modificar la ruta de la síntesis cuando un producto intermedio determinado causa problemas.

Sin embargo, la síntesis en solución también puede implicar dificultades significativas.

Al alargarse el enlace peptídico, pueden:

• Atrásar en la disolución;
• agrupar;
• ser difícil de cristalizar;
• crear contaminantes estrechamente relacionados;
• ser difícil de separar;
• requiere aislamiento repetido;
• causar pérdidas de material durante las etapas siguientes del proceso de tratamiento.

La síntesis en un disolvente no es, por tanto, automáticamente más simple ni más fácil de escalar que el SPPS.

Su utilidad depende de la secuencia específica, la estabilidad de los productos intermedios, la solubilidad, la longitud de la ruta de síntesis, la conservación durante la purificación y la eficacia de los siguientes pasos de la separación.

El desarrollo de estrategias LPPS marcadas se debe en parte a los intentos de resolver precisamente estos problemas relacionados con la separación y el manejo de materiales. [8]

Los marcadores solubles combinan el diseño de reacciones con el diseño de separaciones

En el LPPS marcado, el péptido creciente tiene una unión molecular temporal diseñada de tal manera que influya en sus propiedades físicas.

El marcador puede permitir mantener la solubilidad suficiente del péptido durante la reacción y, a continuación, facilitar su recuperación selectiva.

Dependiendo de la tecnología, la división puede utilizar:

• desprendimiento;
• extracción;
• retención en la membrana;
• faseología;
• otras propiedades resultantes de la presencia del marcador.

En una de las estrategias experimentales se utilizó un grupo protector de cadena larga en el extremo C para preparar amidas peptídicas.

Las reacciones repetidas y las etapas de precipitación permitieron a los investigadores preparar un péptido hidrofóbico que, en la comparación utilizada por ellos, era difícil de obtener de forma satisfactoria mediante la metodología SPPS. [9]

Esto demuestra la utilidad de esta estrategia específica para la secuencia analizada.

Sin embargo, no se demuestra una ventaja universal de la síntesis marcada.

El indicador se convierte en un elemento del proceso productivo y da lugar a preguntas propias:

• ¿Cómo se conecta de manera eficaz?
• ¿Cambia el curso de la reacción?
• ¿Cómo se puede recuperar de manera fiable el producto semiacabado marcado?
• ¿Aumenta la formación de nuevas contaminaciones?
• ¿Cómo se elimina?
• ¿Se puede confirmar la eliminación total?
• ¿Qué métodos analíticos confirman su ausencia en el producto final?

Los marcadores solubles deben, por lo tanto, ser considerados como elementos funcionales del proceso, y no simplemente como etiquetas simples.

Comparación de las principales metodologías

La comparación presenta las reglas generales de funcionamiento de cada método.

No especifica cuál de ellas proporcionará la mejor eficiencia, pureza, coste, equilibrio medioambiental o escalabilidad para una determinada secuencia.

Estos parámetros deben evaluarse en función de la molécula real y del proceso de producción específico. [4] [8] [9]

Combinación de fragmentos y producción híbrida

El péptido no siempre debe formarse en un único proceso continuo consistente en la adición de nuevas cadenas de aminoácidos.

Una estrategia alternativa consiste en preparar por separado fragmentos peptídicos más cortos y luego combinarlos.

El proceso híbrido puede, por ejemplo, utilizar SPPS para obtener los fragmentos individuales y la química en solución para su unión.

Las estrategias fragmentarias pueden limitar algunos problemas relacionados con la síntesis de fase muy larga.

Sin embargo, introducen nuevos desafíos, como:

• la elección del lugar adecuado para la conexión;
• la solubilidad de los fragmentos;
• activación del punto de conexión;
• quimioselectividad;
• conservación de la estereotipía;
• reacciones adversas;
• limpieza de fragmentos;
• limpieza después de su combinación.

Un ejemplo importante de unión controlada de fragmentos es la ligación química natural.

En la versión clásica, el tioester peptídico se une a un segundo péptido que contiene una cisteína en el extremo N. La posterior reorganización conduce a la formación de una unión correcta en el esqueleto peptídico en el punto de ligación.

Los estudios originales demostraron la posibilidad de obtenerlo tras ligar y plegar una proteína que contiene puentes disacárridos. [10]

Esto confirma la importancia de esta estrategia de unir los fragmentos.

No significa, sin embargo, que cualquier dos fragmentos peptídicos no modificados puedan unirse espontáneamente.

Equipamiento y grupos de protección

La combinación crea una conexión intencionada

La ligación es un paso de la reacción durante el cual se forma un nuevo enlace peptídico entre las unidades seleccionadas.

Normalmente, el grupo carboxílico de la molécula se activa para que pueda reaccionar eficazmente con el grupo amino correspondiente.

La química de la activación debe ser compatible con:

• una secuencia creciente;
• grupos de protección temporal;
• protección de los cadenas laterales;
• estereoquímica;
• vehículo o indicador;
• medio de disolución;
• con otros grupos funcionales presentes en la molécula.

La unión eficaz es especialmente importante en la síntesis de fase, ya que una reacción incompleta puede dar lugar a la formación de secuencias delecionarias.

Si un paso de la adición de aminoácido no tiene éxito para algunas cadenas en crecimiento, estas cadenas pueden permanecer en el sistema y participar en los siguientes ciclos.

Como resultado, pueden producirse moléculas muy similares al péptido objetivo, pero sin la otra parte.

Así que incluso pequeñas ineficiencias pueden acumularse durante muchos pasos de la síntesis.

Un ejemplo matemático simple ilustra bien este problema.

Si cada uno de los 50 pasos independientes de la formulación tuviera una probabilidad de éxito del 99%, la proporción de moléculas para las que todos los pasos terminaran con éxito sería:

0,99^50 ≈ 0,605

es decir, alrededor de 61%.

Es una ilustración matemática únicamente.

No representa una previsión de la pureza real ni de la eficiencia de la síntesis de un péptido que contenga 50 residuos.

La producción real incluye:

• distintas eficiencias de unión en las distintas posiciones;
• Etapas de desensamblaje;
• reacciones adversas;
• depende de la secuencia de dificultades;
• estrategias de reincorporación;
• Las pérdidas durante la desinfección;
• Las pérdidas durante el proceso de limpieza;
• otros parámetros procesales.

El cálculo solo muestra por qué incluso una aparente poca eficiencia de un único paso puede adquirir gran importancia en una síntesis de múltiples etapas.

Los grupos de protección controlan el lugar de la reacción

Un aminoácido puede tener varios grupos químicamente reactivos.

Sin un control selectivo, las reacciones de unión podrían producirse en lugares no deseados.

Los grupos de protección están temporalmente bloqueando los lugares de reacción seleccionados.

El grupo amino utilizado para alargar el enlace normalmente requiere protección temporal, mientras que los enlaces laterales reactivos pueden requerir una protección permanente durante muchos ciclos de síntesis.

La conexión con el soporte también debe sobrevivir a estas etapas hasta el momento de la desconexión programada.

La selección de grupos protectores influye, por lo tanto, en toda la estrategia de síntesis.

Hay que tener en cuenta:

• la forma en que se introducen;
• estabilidad;
• el método de eliminación;
• compatibilidad con otros grupos de protección;
• compatibilidad con el soporte;
• reacciones adversas;
• el efecto de una secuencia concreta;
• Las condiciones finales de desmantelamiento.

Los estudios que utilizaron la protección basada en el cianosulfurilido trataron la formación de aspartimidina mediante un cambio en la forma de proteger el grupo carboxílico. [2]

Los resultados muestran que la estrategia de los grupos de protección no solo influye en si la reacción prevista puede ocurrir, sino también en qué reacciones indeseables se vuelven posibles.

FMOC, Boc y protección ortogonal

El Fmoc y el Boc son grupos de protección ampliamente utilizados para grupos amino.

En realidad, difieren en el método de eliminación.

El Fmoc generalmente se elimina en condiciones básicas, mientras que el Boc es sensible a condiciones ácidas.

Estas propiedades permiten utilizarlas como elementos de estrategias de protección más amplias.

En la SPPS popular basada en Fmoc, la protección N-terminal temporal se elimina en varias ocasiones, mientras que los grupos protectores seleccionados en los cadenas laterales y la unión con la resina permanecen intactos hasta las etapas posteriores.

Otros métodos pueden utilizar combinaciones diferentes.

Un concepto especialmente importante es la protección ortogonal.

Dos grupos protectores se consideran ortogonales si uno de ellos puede eliminarse selectivamente en condiciones en las que el otro permanece suficientemente estable para que pueda continuar la síntesis.

La ortogonalidad es, por lo tanto, una relación práctica de conformidad química.

Esto no significa que cada grupo protegido permanezca completamente inalterado tras una cantidad ilimitada de exposiciones a todas las condiciones de reacción.

Las reacciones secundarias aún pueden ocurrir.

En los estudios de síntesis de Fmoc se describieron tanto la formación de aspartimidina como los cambios estereoquímicos indeseados a pesar de la selectividad general prevista de la estrategia de protección. [11]

La estereoquímica es parte de la identidad de una molécula

Muchas proteínas contienen un centro quiral.

Esto significa que sus átomos pueden adoptar diferentes sistemas espaciales que corresponden a diferentes formas estereoquímicas.

El cambio de la configuración de un centro estereogénico puede llevar a la formación de otra estructura peptídica sin necesidad de cambiar su masa nominal.

Por eso, la propia masa no puede confirmar la identidad completa del péptido.

La epimerización generalmente implica un cambio en la configuración de un centro estereogénico en una molécula que contiene varios de estos centros.

La racemización también se aborda con frecuencia en la química de los péptidos en el contexto de la pérdida de la integridad estereoquímica de las cadenas de aminoácidos.

Estos cambios son importantes, ya que el reconocimiento molecular puede depender en gran medida del orden espacial de los átomos.

Dos moléculas con el mismo contenido elemental y masa nominal pueden, por tanto, comportarse de manera diferente si presentan una estereoquímica diferente.

En un estudio sobre la síntesis de Fmoc con microondas, se determinó que algunas de las fracciones eran susceptibles a cambios estereoquímicos indeseados en las condiciones utilizadas. La modificación del método limitaba la aparición de estas reacciones. [11]

Esto no significa que el calentamiento, por definición, dañe todos los péptidos.

La conclusión correcta es que la aceleración de las reacciones debe evaluarse junto con la selectividad química dependiente de la secuencia.

Aspartam y otros contaminantes relacionados

La formación de aspartimidina es una reacción secundaria conocida que se produce en algunas secuencias que contienen asparagina.

Puede producirse un semiconduto cíclico no deseado, del cual posteriormente se forman compuestos con una estructura cristalina o estereoquímica modificada.

La probabilidad de esta reacción depende de la secuencia y los parámetros del proceso.

Otros contaminantes relacionados con la síntesis pueden ser consecuencia de:

• incompleteness of integration;
• desconexión incompleta;
• la formación de secuencias de deleción;
• reacción de las cadenas laterales;
• modificaciones estereoquímicas;
• reacciones durante la desincrustación;
• oxidación;
• reestructuraciones;
• las condiciones de tratamiento del producto;
• No eliminación completa de los grupos protectores.

Algunos contaminantes provocan una alteración fácilmente perceptible de la masa molecular.

Otros son mucho más difíciles de distinguir.

En estudios analíticos de un péptido sintético que es un sustrato de la renina, se identificaron muchas contaminantes, incluyendo componentes que muestran la misma variación de masa pero que contienen modificaciones en diferentes posiciones. [12]

Para su distinción era necesaria una análisis estructural adicional.

Los investigadores también consideraron los mecanismos propuestos para la formación de estas contaminantes como hipótesis.

Es importante hacer esta distinción:

Determinar qué es la contaminación y demostrar el mecanismo preciso de su aparición son dos preguntas científicas distintas.

No se debe presentar un mecanismo probable como confirmado únicamente porque corresponde a una masa molecular observada.

Purificación, escalado y calidad de la producción

Producto crudo, producto purificado y rendimiento

El péptido crudo es un material obtenido antes de finalizar las etapas de purificación correspondientes.

Puede contener:

• péptido objetivo;
• secuencias de deleción;
• el material no está completamente desensamblado;
• secuencias modificadas;
• restos de agentes reactivos;
• productos relacionados con la desinfección;
• sal;
• disolventes;
• otros componentes que se forman en el proceso.

El purificación tiene como objetivo separar el péptido adecuado de esta mezcla.

Hay que distinguir claramente entre tres conceptos:

pureza del producto crudo — la composición medida del material antes de la purificación final;

La eficiencia del producto purificado o aislado: la cantidad de material final recuperado en relación con el valor inicial o teórico especificado;

pureza final — la composición del material aislado determinada mediante un método analítico específico.

Estos conceptos no son intercambiables.

El proceso puede conducir a la formación de una gran cantidad de material bruto, pero permite recuperar una cantidad relativamente pequeña de producto purificado.

Otro proceso puede producir menos materia prima, pero ofrecer una alta selectividad en la creación del producto final.

De la misma manera, una alta pureza analítica no tiene por qué significar una alta productividad en la producción.

En los estudios de síntesis acelerada de flujo, se reportó correctamente la pureza del material bruto y la eficiencia después de la separación. [7]

La cromatografía separa los componentes, pero no responde a todas las preguntas.

La cromatografía líquida de alta rendimiento en fase inversa (RP-HPLC) se utiliza ampliamente para la detección y purificación de péptidos.

Las diferentes moléculas interactúan de manera diferente con la fase estacionaria y la fase móvil.

En condiciones adecuadas, estas diferencias permiten separar los componentes de la mezcla.

La cromatografía analítica y la preparativa tienen aplicaciones relacionadas pero distintas.

La HPLC analítica se utiliza principalmente para analizar la composición de la muestra.

La HPLC preparativa se utiliza para la recogida física de los componentes separados.

El cromatograma puede proporcionar muchas informaciones valiosas.

Sin embargo, un gran pico principal o una alta proporción porcentual de su superficie no deben considerarse como una caracterización molecular completa.

Los resultados de la cromatografía dependen, entre otras cosas, de:

• el tipo de columna;
• fase móvil;
• degradado;
• temperaturas;
• métodos de detección;
• longitud de onda;
• Preparación de la muestra;
• el modo de integración de los puntos;
• resolución;
• características de la contaminación.

Dos compuestos pueden potencialmente eluirse al mismo tiempo.

Algunos componentes de la muestra también pueden responder de forma diferente al detector utilizado.

Por eso, la alta pureza superficial en el HPLC no es equivalente a una confirmación completa de la identidad molecular.

Los análisis isotópicos de contaminantes peptídicos y las analíticas quirales muestran por qué pueden ser necesarias metodologías analíticas complementarias. [12] [13]

El método analítico debe responder a una pregunta estructural específica.

La identidad, la pureza y el contenido significan cosas diferentes

En la caracterización de los péptidos son especialmente importantes tres conceptos.

La identidad responde a la pregunta:

¿Existe en la muestra la molécula deseada?

La limpieza responde a la pregunta:

¿Qué otros componentes se encuentran en la muestra o qué parte del señalamiento medido corresponde al componente principal?

El contenido responde a la pregunta:

¿Cuánta cantidad de péptido real está presente en la muestra?

No siempre es posible responder a estas preguntas con un solo parámetro.

El material que contiene el péptido también puede contener:

• agua;
• contraión;
• sal;
• residuos de disolventes;
• otros componentes relacionados con el proceso;
• Contaminación.

La masa total del material valiente no tiene por tanto que corresponder a la masa del propio péptido.

De la misma manera, la concordancia entre la masa molecular medida y la valor teórica no confirma:

• una secuencia completa de aminoácidos;
• una comunicación correcta entre las distintas partes;
• integridad estereoquímica;
• disposición de los puentes disulfuro;
• falta;
• la ausencia de contaminantes isobáricos.

La espectrometría de masas puede proporcionar pruebas sólidas sobre la masa de una molécula.

La espectrometría de masas en tandem y otras técnicas estructurales pueden proporcionar información adicional sobre la secuencia.

Los métodos quirales permiten analizar cuestiones estereoquímicas que no se pueden resolver mediante la medición convencional de la masa.

En uno de los estudios analíticos se incluyó incluso la reticulación que se produce durante la preparación de la muestra. Esto muestra otra importante regla: la propia técnica analítica puede producir artefactos si no se diseña adecuadamente. [13]

El plegamiento y la actividad pueden requerir una confirmación adicional

En el caso de péptidos estructuralmente limitados y proteínas pequeñas, la secuencia correcta y la masa molecular aún pueden ser insuficientes para confirmar la estructura final deseada.

Las preguntas adicionales pueden incluir:

• ¿Se crearon los puentes disiarcicos adecuados?
• ¿La molécula adoptó la conformación esperada?
• ¿Es la ciclicación completa?
• ¿Existen las isómeras estructurales?
• ¿La molécula sintética muestra la actividad esperada en el ensayo experimental específico?

En el estudio de la síntesis de BPTI se utilizaron varias técnicas analíticas y biológicas junto con la evaluación de la inhibición de la tripsina. [3]

Los resultados combinados apoyaron la concordancia del material sintético con la secuencia natural con respecto a los criterios analizados.

Sin embargo, la prueba de actividad responde a una pregunta funcional específica.

No sustituye la análisis de la contaminación.

De la misma manera, una actividad similar en un solo ensayo no confirma la plena equivalencia de todas las propiedades biológicas, estructurales o productivas.

El escalamiento de la producción cambia más que la cantidad de material

El aumento de la escala de producción no se basa únicamente en un aumento proporcional de la cantidad de todos los reactivos.

Los procesos físicos pueden comportarse de manera diferente a mayor escala.

Pueden tener importancia:

• mezcla;
• intercambio de calor;
• distribución de reactivos;
• difusión;
• endurecimiento de la resina;
• la presión;
• filtración;
• la economía de los disolventes;
• desprendimiento;
• la solubilidad de los productos intermedios;
• transport de masa;
• Las posibilidades del sistema de purificación.

Estos factores pueden influir tanto en el curso de la reacción como en la formación de contaminantes.

La purificación en etapas posteriores también puede convertirse en un obstáculo para toda la producción.

El aumento de la velocidad de la síntesis tiene poca importancia si el sistema de purificación no es capaz de separar eficazmente las contaminantes que se generan ni de recuperar el producto de la calidad requerida.

En un análisis industrial que abarcaba 40 procesos de síntesis de péptidos de 14 empresas farmacéuticas, se evaluó el consumo de materiales durante la síntesis, la purificación y la separación. [14]

El estudio muestra por qué la evaluación de la producción debe realizarse para todo el proceso.

No obstante, esto no significa que todas las fábricas, secuencias o tecnologías de producción obtengan resultados idénticos.

La calidad de la producción es resultado de múltiples elementos de control

La producción fiable de péptidos requiere algo más que obtener un único resultado analítico satisfactorio.

El proceso controlado generalmente incluye varios elementos relacionados:

La molécula diana definida → los materiales de partida adecuados → la síntesis controlada → el purificación controlada → la toma de muestras adecuada → la validación o la análisis adecuado a la finalidad → la documentación de la partida.

La documentación del partido combina los resultados analíticos con el material que realmente fue producido.

El certificado de análisis (COA) resume los resultados seleccionados de los análisis realizados sobre una determinada partida.

Su valor informativo depende de:

• el tipo de estudios realizados;
• las metodologías utilizadas;
• la utilidad de estos métodos;
• especificaciones;
• identificación de la muestra;
• posibilidad de rastrear el partido;
• confirmación de que los resultados reportados corresponden realmente al material en cuestión.

Un valor individual definido como „pureza” no puede confirmar por sí solo:

• de identidad molecular completa;
• contenido de péptido;
• integridad estereoquímica;
• el nivel de residuos de los disolventes;
• contenido de agua;
• la composición de los antijóneos;
• características microbiológicas;
• falta;
• actividad biológica;
• idoneidad para un propósito determinado.

El conjunto de análisis adecuado depende del uso previsto del material.

Los péptidos utilizados como material de referencia analítico, el reactivo investigado en un experimento celular y el material en fase de desarrollo farmacéutico pueden requerir respuestas a otras preguntas de carácter cualitativo.

Por lo tanto, las pruebas analíticas deben interpretarse en un contexto claramente definido, y no como una confirmación universal de la calidad.

La evaluación del equilibrio ambiental debe abarcar todo el proceso.

La síntesis de los péptidos puede requerir grandes cantidades de disolventes y reactivos.

La evaluación del impacto ambiental debería, por lo tanto, tener en cuenta mucho más que el propio proceso de integración.

Entre los elementos importantes pueden incluirse:

• Preparación de los bloques constructivos;
• reactivos de unión;
• reactivos para desensibilizar;
• lavado;
• desviación;
• tratamiento del producto;
• cromatografía;
• intercambio de disolventes;
• aislamiento;
• secado;
• gestión de residuos.

La reducción del impacto ambiental puede requerir una mejora simultánea de varios pasos.

En el análisis publicado sobre la producción de péptidos se abordaron los problemas relacionados tanto con la síntesis como con el purificación, y se señaló la necesidad de mejorar todo el diseño del proceso. [15]

Como publicación prospectiva, no representa una comparación directa y controlada que demuestre que una tecnología específica siempre es más respetuosa con el medio ambiente.

Igualmente:

La síntesis más rápida no implica automáticamente una síntesis más ecológica,

y la menor cantidad de disolventes utilizada durante la propia síntesis no implica automáticamente una reducción del impacto del proceso productivo en su conjunto.

Las comparaciones ambientales requieren el uso de límites coherentes para la análisis y, de manera preferible, deben relacionar el consumo de recursos con una cantidad determinada de producto final aislado y caracterizado.

Preguntas más frecuentes

1. ¿Cómo se diferencia la síntesis de péptidos en fase sólida de la síntesis en fase líquida?

En la síntesis en fase fija, la proteína creciente permanece unida al vehículo insoluble, mientras que en la síntesis clásica, el producto peptídico en solución permanece disuelto y normalmente debe ser recuperado basándose en sus propiedades físicas y químicas. En el sentido más restringido, el LPPS disuelto tiene además un marcador soluble o un vehículo que facilita su posterior separación. Los estudios de síntesis marcados muestran una de las estrategias de unión de la química en solución con la recuperación mediante extracción, mientras que la literatura sobre LPPS distingue estas soluciones tanto de la síntesis clásica en solución como de la SPPS. Ninguna de estas metodologías es, por definición, óptima para cada péptido. La diferencia fundamental se refiere al modo físico de administración y separación del péptido creciente durante las etapas posteriores de la síntesis. [8] [9]

2. ¿Por qué pueden producirse contaminantes durante la síntesis de los péptidos?

Las contaminaciones pueden producirse debido a que las reacciones previstas no siempre tienen lugar en cantidades suficientes, y otros grupos funcionales pueden participar en las reacciones no deseadas. La no unión completa puede conducir a secuencias de desaminación, el desacetilación incompleta puede interferir con la formación posterior de la cadena, y algunas secuencias son susceptibles a cambios estereoquímicos, la formación de aspartimidina, la oxidación, la reorganización o los productos secundarios relacionados con la desacetilación. El estudio de la síntesis de Fmoc y la determinación estructural de los contaminantes peptídicos sintéticos documentan varios ejemplos de esto. [11] [12] La frecuencia y la importancia de los distintos contaminantes dependen de la secuencia y el proceso, por lo que la automatización de la síntesis no debe ser confundida con una ausencia total de errores químicos.

3. ¿Cuál es la función de la resina en la síntesis de los péptidos?

La resina retiene el péptido en crecimiento, mientras que los reactivos solubles y muchos productos secundarios pueden eliminarse entre las etapas siguientes de la síntesis. Esto simplifica considerablemente la repetición de la cadena, pero la resina no es únicamente un soporte mecánico. Su reticulación, el grado de adición, la arquitectura del polímero, la compatibilidad con los disolventes y la disponibilidad de sitios de reacción pueden influir en la eficacia del acceso de los reactivos al péptido unido. En los estudios con un reactor de fase variable, se monitoreó la reticulación de la resina durante el análisis de la agregación y la eficacia de la unión. [4] Este monitoreo no elimina los errores de la secuencia, pero muestra por qué el estado físico de la resina puede ser una variable procesal importante.

4. ¿Para qué sirve la resina Wanga en la síntesis de péptidos?

Los sistemas de tipo Wang están generalmente asociados con la preparación de péptidos liberados tras la despolimerización adecuada con el extremo C en forma de ácido carboxílico. Sin embargo, el producto final exacto depende del ligador, la arquitectura del sistema de carga y la química de despolimerización utilizada, y no solo de la denominación de la resina. Los investigadores también presentaron un método especializado para convertir el material peptídil-Wang-TentaGel en hidrazidos peptídicos que pueden servir como productos intermedios sintéticos útiles. [5] La reacción alternativa no altera el significado del despolimerización estándar de la resina de Wang. Sin embargo, muestra por qué al predecir el producto es necesario analizar todo el sistema de carga y las condiciones de reacción.

5. ¿La SPPS forma un péptido desde el extremo N o desde el extremo C?

La SPPS clásica generalmente comienza con la unión de la parte C-terminal a un soporte, después de lo cual el bucle se extiende hacia el extremo N. Este es el sentido opuesto al alargamiento estándar del bucle en la ribosoma, donde la proteína crece añadiendo aminoácidos adicionales al extremo C. La síntesis de BPTI es un ejemplo de la utilización de bloques constructivos y un soporte protegidos para la liberación posterior, la purificación y la despolimerización del producto. [3] Sin embargo, existen estrategias especializadas de química peptídica que utilizan otras soluciones, por lo que el alargamiento desde el extremo C hasta el N debe ser considerado como un enfoque SPPS clásico y no como una regla absoluta para todos los métodos de síntesis.

6. ¿Por qué son necesarias las unidades de protección?

Las aminoácidos a menudo contienen varios grupos funcionales reactivos. Los grupos protectores previene temporalmente la reacción en los sitios seleccionados, dejando el lugar adecuado disponible en un momento específico de la síntesis. Esto ayuda a controlar la secuencia y el modo de unión de las restas. Sin la protección adecuada, las reacciones competitivas podrían llevar a la formación de mezclas complejas o productos con una estructura modificada. Los estudios sobre la formación de aspartimidina han demostrado que un cambio en la química de la protección del grupo carboxilo puede limitar una importante reacción secundaria en las secuencias analizadas. [2] Los grupos protectores no garantizan un curso ideal de la síntesis, sino que proporcionan una control química selectivo que debe mantenerse en consonancia con todos los pasos importantes del proceso.

7. ¿Cómo se diferencian Fmoc y Boc?

La Fmoc y la Boc son grupos temporales ampliamente utilizados que protegen el grupo amino, pero reaccionan a otras condiciones químicas. La Fmoc suele eliminarse en un medio básico, mientras que la Boc es sensible a los ácidos. Esta diferencia afecta a la manera en que se unen a la protección de los cadenas laterales, a los ligadores y a los demás pasos de la síntesis. La síntesis basada en Fmoc se utiliza ampliamente en la SPPS moderna, pero los estudios también han demostrado la posibilidad de la aparición de reacciones secundarias dependientes de la secuencia en estas condiciones. [11] En la práctica, por lo tanto, es más útil comparar las estrategias completas de protección y su conformidad con la secuencia dada que considerar únicamente los nombres de las dos protecciones.

8. ¿Qué significa la protección ortogonal?

La protección ortogonal significa que un grupo protector puede eliminarse en condiciones en las que otro grupo protector necesario permanece lo suficientemente estable como para poder continuar la síntesis. Esto permite revelar diferentes sitios reactivos en etapas específicas. Esta concepción tiene importancia fundamental durante la síntesis controlada de péptidos complejos. Sin embargo, la ortogonalidad depende de las condiciones y no es absoluta: la exposición repetida, el carácter de la secuencia y los parámetros de la reacción pueden seguir conduciendo a reacciones secundarias. Las investigaciones sobre métodos alternativos de protección de los grupos carboxílicos muestran cómo la estrategia de protección puede modificarse para controlar la química complicada de los péptidos. [2]

9. ¿Qué es la secuencia delecional?

La secuencia delecional es un péptido que carece de una o más de las restos presentes en la secuencia objetivo prevista. Puede formarse cuando el paso de unión de aminoácido no se produce completamente, pero una cadena no reactivada permanece unida al soporte y participa en los siguientes ciclos. Dado que el segmento defectuoso sigue estando unido a la fisionadora, el lavado normal no tiene que eliminarlo. Los estudios de monitorización SPPS en tiempo real indican que la formación incompleta de enlaces amidados es un problema procesal importante. [4] La secuencia delecional es, por lo tanto, un problema relacionado con la estructura y la identidad del producto, y no solo con las restos del reactivo.

10. ¿Pueden los dos contaminantes peptídicos tener la misma masa molecular?

Sí. Diferentes estructuras moleculares pueden tener una masa nominal idéntica o indistinguible. Por esta razón, la propia concordancia de masa no confirma la identidad completa de la molécula. En los estudios sobre un péptido sintético que es un sustrato de la renina, se identificaron componentes isobáricos de contaminantes en los que las modificaciones se encontraban en diferentes posiciones. La desdierivación y la espectrometría de masas en tandem proporcionaron información estructural adicional. [12] Este ejemplo muestra por qué la concordancia de masa observada con la esperada no puede confirmar por sí sola la secuencia correcta, la conectividad, la estereoquímica ni la ausencia de isómeros estructuralmente similares.

11. ¿Qué son la epimerización y la racemización en la síntesis de los péptidos?

La epimerización y la racemización son cambios no deseados en la configuración estereoquímica. Pueden ocurrir sin que se modifique la secuencia nominal de aminoácidos ni la masa molecular, por lo que la medición convencional de la masa no puede indicar una diferencia estructural. En los estudios de síntesis de Fmoc con microondas, se identificaron restos susceptibles a cambios estereoquímicos y se demostró que la modificación de los parámetros de reacción puede limitar estos procesos. [11] El riesgo depende del bloque estructural, la secuencia y los parámetros del proceso. Por lo tanto, la calidad estereoquímica requiere métodos analíticos capaces de evaluar la configuración y no se puede inferir únicamente a partir de la masa molecular.

12. ¿Qué es la formación de aspartimidina?

La formación de aspartimidina es una reacción no deseada asociada con secuencias específicas que contienen asparaginina. La formación de un producto cíclico puede conducir a productos con una afinidad de estructura o estereoquímica alterada, lo que reduce la eficiencia y dificulta la purificación. Los investigadores analizaron estrategias de protección alternativas diseñadas para limitar esta reacción en péptidos y proteínas seleccionados. [2] Los resultados no indican una solución universal para todas las secuencias que contienen asparaginina. Sin embargo, revelan por qué la planificación de la síntesis y las estrategias de control de contaminantes debe tener en cuenta la específica conducta química de cada secuencia.

13. ¿La alta pureza de HPLC confirma la identidad correcta del péptido?

No. La pureza del HPLC describe la muestra dentro de un capítulo cromatográfico específico, el detector utilizado y el método de análisis de datos. Una alta proporción de la zona de pico principal puede ser una evidencia valiosa de que la muestra está dominada por un componente separado cromatográficamente, pero por sí sola no confirma la identidad molecular completa. Las impurezas concomitantes, los estereoisómeros y otras variantes pueden requerir técnicas adicionales. En los estudios de análisis quiral de péptidos se utilizó un proceso especialmente diseñado que también tenía en cuenta los cambios estereoquímicos que se producen durante la preparación de la muestra. [13] Por lo tanto, la identidad y la pureza deben ser consideradas como preguntas analíticas relacionadas pero distintas.

14. ¿La eficiencia del producto purificado significa lo mismo que la pureza?

No. La pureza determina la cantidad de material objetivo recuperado en relación con la cantidad inicial o teórica definida. Por otra parte, la pureza describe la composición del material recuperado según un método analítico específico. La síntesis puede dar como resultado la producción de una cantidad relativamente pequeña de producto de muy alta pureza o de una gran cantidad de materia prima que contiene cantidades significativas de impurezas. En los estudios de síntesis de flujo automático, se reporta por separado la pureza del producto bruto y el rendimiento después de la separación. [7] Separar estos parámetros evita que se interprete erróneamente un valor elevado de uno de ellos como evidencia de un valor elevado del otro.

15. ¿Se pueden producir péptidos largos mediante la unión de fragmentos más cortos?

Sí. En la estrategia fragmentaria, los segmentos peptídicos más cortos pueden prepararse por separado y luego combinarse mediante la adición de la correspondiente química. La ligación química de unión fue un ejemplo importante en el que los segmentos peptídicos no protegidos se unieron de manera que produjeran una unión natural del esqueleto peptídico, y luego se obtuvo una proteína deformada. [10] Esto no significa que cualquier segmento peptídico pueda unirse espontáneamente. Se debe tener en cuenta la estructura de los segmentos, la química de unión, la elección del sitio de unión, la solubilidad, la estereoquímica y los requisitos de purificación. Por lo tanto, la plegado de los segmentos es una estrategia alternativa de diseño de síntesis y no una solución automática de los problemas relacionados con los péptidos largos.

16. ¿Elimina la síntesis automatizada más rápida la necesidad de purificación?

No. La síntesis automatizada más rápida o basada en flujos reduce el tiempo requerido para las etapas específicas de la síntesis, pero no demuestra que cada molécula resultante tenga la estructura deseada. En los estudios de síntesis rápida en flujo, la materia prima sigue siendo caracterizada y se aplica una purificación posterior; en trabajos posteriores sobre automatización, se comparan por separado la pureza de la materia prima y el rendimiento tras la separación.[6][7] Un buen rendimiento del sistema para las secuencias estudiadas no garantiza resultados idénticos para cada nuevo objetivo. La síntesis acelerada aún necesita combinarse con una purificación adecuada, la confirmación de la identidad, el análisis de impurezas y la caracterización final.

17. ¿Por qué el aumento de la escala de producción es más complicado que preparar una mayor cantidad de piezas?

El aumento de la escala modifica las condiciones físicas y químicas, y no solo la cantidad de material. La mezcla, la transferencia de calor, la expansión de la resina, la distribución de los reactivos, la presión, la filtración, el manejo de los disolventes, la solubilidad de los semi-productos y las capacidades del sistema de purificación pueden comportarse de manera diferente con una mayor cantidad de producción. En el análisis industrial, 40 procesos peptídicos fueron evaluados por separado: la síntesis, el purificación y la separación durante el análisis del consumo de materiales. [14] Los resultados muestran por qué la producción debe ser considerada como un proceso completo. El método escalable debe llevar a la obtención de un material caracterizado en todos los pasos, y no solo de una mayor cantidad de péptido bruto.

18. ¿El péptido está listo inmediatamente después de la formación de la secuencia correcta?

No necesariamente. La formación de la cadena crea un esqueleto de la secuencia solo en la medida en que el proceso y los datos analíticos lo confirmen. Dependiendo de la molécula, pueden seguir siendo necesarios la desacetilación, la despolimerización, la cicilación, el oxidação, la formación de puentes disiarcicos, la conformación en capas, la conjugación, la purificación y la caracterización. La síntesis de BPTI es un buen ejemplo de un proceso en el que, tras la formación de una secuencia lineal, sigue habiendo una etapa de purificación y formación de una estructura conformada que contiene puentes disiarcicos. [3] Por lo tanto, el término „péptido listo” debería referirse a la forma molecular requerida en un contexto científico determinado, y no solo al final de la adición gradual de aminoácidos.

19. ¿La masa molecular correcta confirma la secuencia correcta del péptido?

No. La masa de una molécula es una evidencia valiosa, pero por sí sola no puede confirmar la secuencia completa ni la estructura molecular. Las estructuras isoárbicas pueden tener la misma masa, y las diferencias en la estereoquímica pueden no conducir en absoluto a un cambio en la masa molecular. Los estudios sobre impurezas de péptidos sintéticos han demostrado que distinguir componentes estructuralmente diferentes puede requerir espectrometría de masas en tandem y análisis adicionales. [12] En casos que implican la integridad estructural de componentes estereoquímicamente distintos, pueden ser necesarias también métodos quirales. [13] Por lo tanto, la masa de una molécula debe considerarse como uno de los elementos de la evaluación de la identidad, y no como su confirmación completa.

20. ¿Por qué el purificación debe considerarse como parte de la producción del péptido, y no solo como un aditivo final?

La purificación determina si el péptido objetivo puede ser efectivamente separado de la secuencia de residuos, productos secundarios, restos de reactivos, contaminantes estructuralmente similares y otros componentes creados durante la síntesis. Una metodología que permita producir cantidades muy grandes de material bruto de forma muy rápida puede seguir siendo poco práctica si no se puede recuperar eficazmente el producto final de calidad requerida. Por esta razón, las analíticas industriales de los procesos peptídicos incluyen simultáneamente la síntesis, la purificación y la separación. [14] La eficiencia de la producción debe ser evaluada en última instancia en función de la cantidad y las propiedades del material final aislado, y no únicamente de la velocidad de síntesis.

Limitaciones al comparar métodos de síntesis de péptidos

Al interpretar los estudios que comparan las tecnologías de producción de péptidos, hay que tener en cuenta algunas limitaciones importantes.

En primer lugar, la secuencia influye significativamente en la dificultad de la síntesis. Una metodología que funcione bien para un péptido no tiene por qué funcionar igualmente para otro. La agregación, la hidrofobicidad, la composición aminoácida, la longitud, la tendencia a formar estructuras secundarias y la sensibilidad a las reacciones secundarias pueden cambiar el comportamiento del proceso. [1] [4]

En segundo lugar, la pureza del material bruto, la eficiencia después de la aislamiento, la pureza final y la concentración de péptido son parámetros diferentes. Comparar los métodos únicamente en función de uno de ellos puede dar una imagen incompleta de la eficiencia de la producción. [7]

En tercer lugar, la fabricación rápida del cordón no significa una producción rápida de todo el material. La desmoldeación, la limpieza, la aislación, la conformación final de la estructura, las pruebas analíticas y la documentación también influyen en el tiempo total de producción. [6] [7]

Cuarto, la pureza analítica depende de la metodología utilizada. El HPLC, la espectrometría de masas, la espectrometría de masas en tandem y la análisis quiral responden a diferentes preguntas. Un único resultado analítico no tiene que confirmar la identidad estructural completa. [12] [13]

En quinto lugar, la escala afecta el comportamiento del proceso. Los resultados de la síntesis en laboratorio no pueden transferirse automáticamente a la producción industrial sin tener en cuenta la mezcla, el transporte de masa, las capacidades de purificación, el consumo de material y otros factores dependientes de la escala [14].

En segundo lugar, las comparaciones económicas históricas pueden perder su actualidad con el tiempo. Los costos de los reactivos, el nivel de automatización, las tecnologías de expresión, el equipo de purificación, la recuperación de disolventes e la infraestructura productiva están en constante evolución. Las analíticas de costos más antiguas pueden seguir teniendo importancia científica, pero no tienen por qué reflejar la economía actual del mercado. [1]

Septimente, las comparaciones ambientales requieren límites coherentes para el análisis. La evaluación del consumo de disolventes durante la propia fabricación de la cadena, mientras se pasa por alto el proceso de purificación e aislamiento, puede llevar a conclusiones confusas sobre el equilibrio del proceso. [14] [15]

Finalmente, el propio nombre de la metodología no determina la calidad del producto. SPPS, síntesis en disolución, LPPS, ligación de fragmentos y expresión biológica pueden llevar a obtener un material de alta calidad si el proceso ha sido diseñado y controlado adecuadamente. Sin embargo, ninguna de estas metodologías garantiza automáticamente la identidad correcta, la pureza, la estereoquímica, el plegamiento o la utilidad para un uso específico.

Resumen

La síntesis de los péptidos se entiende mejor como un proceso controlado de formación de moléculas, y no simplemente como la formación de enlaces peptídicos.

El objetivo es construir una secuencia de aminoácidos específica, al tiempo que se controla el modo de unión de las restas, la química de los grupos protectores, la estereoquímica, las reacciones secundarias y cualquier otro requisito estructural adicional.

La síntesis de péptidos en fase sólida mantiene el cadena creciente en un soporte insoluble, lo que hace que las etapas repetidas de unión y purificación sean bien aptas para la automatización. Sin embargo, las ventajas asociadas con la formación repetida no eliminan problemas como reacciones incompletas, agregación, secuencias delecionales o reacciones secundarias dependientes de la secuencia. [4] [6] [7]

La síntesis clásica en disolución mantiene las mezclas peptídicas en fase líquida y puede proporcionar mayor flexibilidad en la separación y caracterización de los productos intermedios individuales. Sin embargo, la separación repetida y la degradación de la solubilidad pueden convertirse en importantes limitaciones.

Las metodologías de síntesis en fase líquida con marcadores solubles intentan combinar la química de la solución con estrategias diseñadas para recuperar el material. Pueden, por lo tanto, constituir una opción adicional en casos de secuencias y problemas de producción para los que la SPPS clásica no resulta óptima. [8] [9]

Las moléculas más largas o especialmente complejas también pueden prepararse mediante la adición de fragmentos, incluida la ligación química nativa, en lugar de depender únicamente del adición continua de nuevas cadenas de aminoácidos. [10]

Independientemente de la metodología elegida para la formulación, la eficacia de la unión y la química de los grupos protectores siguen siendo fundamentales, ya que pequeñas ineficiencias y reacciones secundarias pueden acumularse durante las etapas posteriores de la síntesis. La formación de aspartimidina, las secuencias delecionales y los cambios estereoquímicos muestran por qué la secuencia intencionada en sí misma no describe todo lo que puede producirse durante el proceso.[2][11][12]

El trabajo también no termina con el plegado del cordón.

El proceso de purificación determina si el producto final se puede separar de los demás componentes.

Luego, los métodos analíticos apropiados responden a preguntas específicas sobre la identidad, la pureza, el contenido, la estereoquímica, la conformación y, si es relevante, la actividad funcional. [3] [12] [13]

El aumento de la escala de producción introduce nuevos aspectos relacionados con el transporte de la masa, el comportamiento de la resina, el consumo de disolventes, la filtración, la posibilidad de purificación, la repetibilidad del proceso y su impacto medioambiental. Por esta razón, la evaluación industrial del proceso debería abarcar la síntesis, el purificación y la separación, en lugar de concentrarse exclusivamente en la velocidad de unión. [14] [15]

La regla más importante es la siguiente:

La producción eficaz de un péptido requiere el control de todo el proceso, desde el diseño molecular y la formación de enlaces hasta el purificación y la caracterización estructural. La obtención de una cadena con una masa nominal esperada o un pico cromatográfico principal alto constituye una valiosa prueba, pero ninguno de estos parámetros por sí solo confirma la identidad molecular completa ni la calidad del proceso de producción.

Descargo de responsabilidad

El artículo tiene carácter exclusivamente educativo y científico-informacional. Describe las normas generales de la química de los péptidos, la síntesis en fase sólida, la síntesis en disolución y en fase líquida, las estrategias de grupos protectores, la unión, la purificación, la caracterización analítica, los procesos de producción y ejemplos procedentes de estudios publicados. No es un protocolo de laboratorio, una guía de producción, una recomendación médica, un manual de dosis o administración ni un certificado de calidad de ningún producto péptido en particular. Los resultados experimentales deben interpretarse en el contexto de la secuencia, los métodos utilizados, la escala del proceso, las técnicas analíticas y los límites de los distintos estudios.

Referencias

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