Peptiidide süntees: tahkefaasiline meetod, lahusmeetod ja tootmismeetodid

Peptiidide süntees on kontrollitud protsess, mille käigus moodustatakse kindla järjestusega aminohappeahelad. Keemilises sünteesis ühendatakse valitud aminohapped abil peptiidseoseid, kontrollides samal ajal teisi nendes molekulides esinevaid reaktiivseid rühmi. Eesmärgiks ei ole seega mitte lihtsalt aminohapete ühendamine, vaid konkreetse molekulaarstruktuuri saavutamine, millel on kindel järjestus, stereokeemia, ahela otsade ehitus ning – vajaduse korral – täiendavad struktuurilised omadused.

Peamiste meetodite hulka kuuluvad peptiidide süntees tahkes faasis (SPPS), klassikaline süntees lahuses ning uuemad peptiidide sünteesimeetodid vedelas faasis (LPPS), milles kasutatakse lahustuvaid kandjaid või molekulaarseid markereid. Teaduslaborid ja tootmisettevõtted võivad ka erinevaid lähenemisviise kombineerida, valmistada lühemad fragmendid eraldi ette ja seejärel need omavahel ühendada või kasutada bioloogilist ekspressiooni, kui see on antud järjestuse puhul sobivam.

20–40 aminohappejäägist koosnevate polüpeptiidide keemilise sünteesi ja bakteriaalset ekspressiooni võrdlemine toob esile olulise põhimõtte: tootmismeetodi praktiline valik sõltub konkreetsest molekulist, selle järjestusest, agregatsiooni kalduvusest, vajalikest modifikatsioonidest, tootmismahust ja analüütilistest nõuetest. [1]

Soovitud aminohapete jada saavutamine on vaid üks peptiidi tootmise etappidest.

Kogu protsess võib hõlmata järgmist:

järjestuse kavandamine → ehitusplokkide ettevalmistamine → funktsionaalsete rühmade kaitsmine → ühendamine → kaitsegruppide eemaldamine → ahela kokkupanemine → fragmentide eraldamine või ühendamine → struktuuri lõplik kujundamine → puhastamine → identiteedi kinnitamine → saasteainete analüüssaasteainete analüüs → sisalduse määramine → lõplikud omadused.

Teatavate peptiidide puhul on vaja ka täiendavaid etappe, nagu tsükliseerimine, disulfiidsildade moodustamine, kokkupakkimine, konjugatsioon või muud keemilised modifikatsioonid.

Seetõttu ei tähenda ahela õige kokkupanek automaatselt, et lõppmaterjalil on õige identiteet, puhtus, stereokeemia, konformatsioon, stabiilsus või muud nõutavad omadused.

Mis on peptiidide süntees?

Teatava aminohapete järjestuse loomine

Peptiid koosneb peptiidsidemetega ühendatud aminohapete jääkidest.

Peptiidi sünteesi eesmärk on luua need ühendused eelnevalt kindlaksmääratud järjekorras, sageli kontrollides samal ajal:

• aminohapete tüüpi;
• aminohapete järjestus jadas;
• stereokeemia;
• N-lõpu struktuurid;
• C-lõpu struktuurid;
• kõrvalketi modifikatsioonid;
• disulfidsidemete paigutus;
• tsükliseerimine;
• muud nõutavad struktuurilised omadused.

Jada on äärmiselt oluline, sest identne aminohapete koostis võib viia erinevate molekulide tekkeni, kui aminohapped on järjestatud teises järjekorras.

Seega annab väide, et tegemist on „viiest aminohappest koosneva peptiidiga”, väga vähe teavet selle tegeliku struktuuri kohta. Molekuli õigeks kirjeldamiseks tuleb teada aminohapete liiki, nende järjestust, stereokeemiat, lõpprühmi ning võimalikke täiendavaid modifikatsioone.

Seega võivad kaks peptiidi omada täpselt sama aminohappe koostist, kuid olla siiski erineva molekulaarstruktuuriga.

Täiendavad erinevused võivad tuleneda ahela otsade modifikatsioonidest, disulfiidsildade olemasolust, tsüklilisest skelettist, külgahelate muutustest või erinevast stereokeemilisest konfiguratsioonist.

Peptiidide keemilises sünteesis kasutatakse tavaliselt aminohappeid, mille reaktiivsed rühmad on selektiivselt kaitstud.

Ajutised kaitserühmad võimaldavad luua konkreetse soovitud keemilise sideme, piirates samal ajal konkureerivaid reaktsioone molekuli teistes osades.

Järgnevates kavandatud sünteesietappides eemaldatakse või muudetakse neid rühmi.

Kontrollitud reaktsioon spontaanse ühinemise asemel

Keemia alusteadmistes kirjeldatakse peptiidsideme tekkimist sageli kondensatsioonireaktsioonina, mille käigus kaks aminohapet ühinevad, vabastades kokku ühe veemolekuli.

Selline võrrand kirjeldab reaktsiooni üldist tasakaalu.

Seda ei tohiks siiski samastada viisiga, kuidas peptiidide kontrollitud sünteesi praktikas läbi viiakse.

Vabade aminohapete lihtne segamine ei võimaldaks usaldusväärselt kindlaks teha:

• milline aminorühm peab reageerima;
• milline karboksüülrühm peab reageerima;
• milline aminohape peab olema esimesena;
• mis peaks olema teisel kohal;
• kas hakkavad reageerima külgahelad;
• kas stereokeemia säilib;
• kas ei teki palju soovimatuid saadusi.

Seega kasutatakse praktilises keemilises sünteesis funktsionaalsete rühmade kontrollitud aktiveerimise ja kaitsmise strateegiaid.

Karboksüülrühmast pärinev rühm aktiveeritakse tavaliselt nii, et see saaks tõhusalt reageerida valitud amiinrühmaga. Kaitsegrupid, reaktsiooni järjekord, kandja keemia, konjugeerivad reagendid, lahusti keskkond ja eraldamismeetodid aitavad üheskoos suunata reaktsiooni soovitud saaduse suunas.

Peptiidi tõhus süntees nõuab seega nii toimuva keemilise reaktsiooni kui ka vältida tahtva reaktsiooni kontrolli.

Hea näide on aspartamiidi tekkimine.

Teadlased töötasid välja alternatiivse meetodi karboksüülrühma kaitsmiseks, mille eesmärk oli piirata seda problemaatilist kõrvalreaktsiooni peptiidi sünteesi käigus. [2]

Uuring näitab peptiidide keemia laiemat põhimõtet: soovimatute molekulaarsete muutuste vältimine võib olla sama oluline kui õige peptiidsideme moodustamine.

Millal võib peptiidi lugeda valmis olevaks?

Peptiidi lineaarsete raamistikute moodustamise lõpp ei tähenda alati kogu sünteesi lõppu.

Sõltuvalt sihtmolekulist võivad pärast ahela kokkupanemist olla vajalikud täiendavad etapid.

Need võivad hõlmata:

• kaitsegruppide täielik eemaldamine;
• peptiidi eraldamine tahkest kandjast;
• ajutiste märgiste eemaldamine;
• tsükliseerimine;
• oksüdeerimine;
• disulfiidsildade moodustumine;
• voltimine;
• konjugatsioon;
• keti otste modifitseerimine;
• puhastamine;
• analüütilised omadused.

Mõned peptiidid vajavad pärast ahela kokkupanemist suhteliselt vähe täiendavaid struktuurilisi muudatusi.

Teiste puhul on hilisemad etapid otsustava tähtsusega.

Heaks näiteks on veise pankrease trüpsiini inhibiitori (BPTI) süntees. Teadlased koostasid lineaarset järjestust, puhastasid materjali ja said seejärel kortsulise struktuuri, mis sisaldas disulfiidsidemeid. Uuringus esitatud analüüside ja funktsionaalsete võrdluste kohaselt vastas loodusliku järjestusega lõppmaterjal uuritud parameetrite osas looduslikule valgule. [3]

See näide illustreerib erinevust peptiidskeleti kokkupaneku ja täielikult iseloomustatud lõpliku molekulaarvormi saamise vahel.

Meetod, mis võimaldab saada õige lineaarset jada, ei kinnita automaatselt:

• õige kokkuvoltimine;
• disulfidsidemete õige paigutus;
• bioloogiline aktiivsus;
• stabiilsus;
• saasteprofiil;
• sobivus konkreetsele kasutusotstarbele.

Igaüks neist küsimustest nõuab eraldi tõendeid.

Keemiline süntees, bioloogiline ekspressioon ja kombineeritud meetodid

Peptiidide keemilises sünteesis ühendatakse eelnevalt valmistatud molekulaarsed plokid kontrollitud laboratoorsete reaktsioonide käigus.

Bioloogiline ekspressioon kasutab aga rakulist masinavärki kodeeritud aminohappejada tootmiseks. Seejärel tuleb materjal koguda, puhastada ja vajaduse korral edasi töödelda.

Mõlemad meetodid võivad viia peptiidide või polüpeptiidide saamiseni, kuid nendega kaasnevad erinevad võimalused ja piirangud.

Keemiline süntees võib olla eriti kasulik, kui on vaja:

• valitud mittestandardsed aminohapped;
• keemilised muudatused kindlates kohtades;
• teatavad ahela otsade struktuurid;
• isotoobimärgid;
• peptiidistruktuuri modifikatsioonid;
• muud omadused, mida on raske saavutada tavapärase bioloogilise ekspressiooni abil.

Bioloogiline ekspressioon võib olla atraktiivne sobivate pikemate järjestuste või teatud märgistamisstrateegiate puhul, kuid see ei kõrvalda tootmise hilisemates etappides esinevaid probleeme.

Endiselt tuleb arvesse võtta materjali taaskasutamist, voltimist, töötlemist, peremeesorganismist pärinevaid saasteaineid, puhastamist ja analüütilisi omadusi.

Seega ei ole ükski neist meetoditest universaalselt parim.

20–40 aminohappejäägist koosnevate polüpeptiidide võrdluses mõjutasid nii järjestuse pikkus kui ka selle agregatsioonikalduvus tulemusi tahkes faasis toimuva sünteesi ja bakteriaalses ekspressioonis. [1]

Need tähelepanekud toetavad lähenemisviisi, mille kohaselt valitakse tootmismeetod konkreetse molekuli jaoks.

Ajaloolisi andmeid tootlikkuse, kulude, seadmete ja tootmisaja kohta ei tohiks käsitleda universaalsete tänapäevaste väärtustena, kuna tehnoloogiad, reaktiivid, automatiseerimine, puhastusmeetodid ja tootmise ökonoomsus muutuvad tehnoloogia arenguga.

Peptiidide süntees tahkes faasis

Kasvav ahel on kinnitatud lahustumatu kandjale

Tahkes faasis toimuva peptiidide sünteesi (SPPS) puhul jääb kasvav peptiidahel järgnevate sünteesitsüklite jooksul lahustumatu kandjaga seotuks.

Kandjaks on enamasti funktsionaliseeritud polümeervaik.

Lüliti ehk linker seob peptiidi kandjaga ning mõjutab muu hulgas valmis ahela hilisemat vabanemist ja saadava lõpprühma tüüpi.

Üks SPPS-i peamisi praktilisi eeliseid on materjali lihtsam eraldamine.

Pärast reaktsiooni teatud etapi lõppu saab lahustuvaid reaktiive ja paljusid lahustuvaid kõrvalsaadusi eemaldada pesemise teel, samal ajal kui kasvav peptiid jääb seotuks tahke faasiga.

Selle tõttu ei ole vaja iga järgmise aminohappe lisamise järel kasvavat peptiidi eraldada ja puhastada eraldi vaba ühendina.

See mugavus võib aga kaasa tuua olulise arusaamatuse.

Vaigu läbipesu ei tähenda, et kõik ebaõiged peptiidid oleksid eemaldatud.

Kui vaiguga ühendatud kett ei reageeri ühe ühendamisetapi jooksul, võib see jääda kandjale.

Järgmistes tsüklites võib see uuesti reageerida ja veelgi pikeneda.

Selle tulemusena võib tekkida deleetsioonijada, st molekul, mis erineb sihtpeptiidist ühe või mitme aminohappe jäägi puudumise poolest.

Samamoodi võivad keemiliselt modifitseeritud või mittetäielikult deaktiveeritud vaiguga seotud ahelad osaleda sünteesi järgmistes etappides.

Seega lihtsustab SPPS lahustuvate ainete eraldamist vaiguga seotud materjalist.

See ei taga siiski järjestuste täiuslikku ühtivust.

Korduv lukustuse vabastamise ja lukustamise tsükkel

Tüüpiline SPPS-i etapiviisiline süntees hõlmab kolme põhilise toimingu kordamist:

lahtipakkimine → kokkupanemine → pesemine.

Esmalt paljastub kasvava ahela otsas asuv reaktiivne aminorühm.

Seejärel liidetakse ahelale järgmine kaitstud aminohape.

Lahustuvad reagendid, aminohappe ülejääk ja paljud reaktsioonisaadused eemaldatakse enne järgmise tsükli algust.

Selle protsessi kordamine võimaldab peptiidi ehitada ühe aminohappejäägi kaupa.

Klassikalises SPPS-meetodis ühendatakse C-otsa jääk tavaliselt kandjaga esimesena, seejärel pikendatakse ahelat N-otsa suunas.

See erineb tavapärasest ribosomaalsest valkude sünteesist, mille käigus lisatakse järjestikku aminohappeid kasvava ahela C-otsa külge.

Aminohapete lõplik järjestus võib siiski olla identne, kuigi protsessi suund ja keemiline olemus on erinevad.

Mõistet „tsükkel” ei tohi mõista kui üht universaalset reaktsioonitingimuste kogumit, mis sobiks iga jäägi ja iga järjestuse puhul.

Reaktsiooni kulg võib sõltuda järgmistest teguritest:

• kaitsegruppide strateegiad;
• aminohappe tüüp;
• reaktsioonikoha ümbruse ruumilised tingimused;
• vaigu liik;
• linker;
• keti pikkus;
• agregatsioon;
• lahusti;
• sidumiskeemia;
• kasvava peptiidi struktuurilise säilimise kohta.

Reaktsioon, mis sünteesi alguses kulgeb sujuvalt, võib hilisemas etapis muutuda märkimisväärselt raskemaks.

Seetõttu on protsessi jälgimine oluline isegi väga automatiseeritud süsteemides.

Miks on vaigu omadused olulised?

Püsikandja ei ole pelgalt passiivne hoidik.

Selle füüsikalised ja keemilised omadused võivad otseselt mõjutada reaktsiooni kulgu.

Üks olulisemaid parameetreid on paisumine.

Kui vaik paisub valitud lahustikeskkonnas nõuetekohaselt, pääsevad reaktiivained kergemini polümeeri kogu struktuuris asuvatesse reaktiivsetesse kohtadesse.

Ebapiisav paisumine või vaigu struktuuri muutused võivad seda juurdepääsu piirata.

Olulised võivad olla ka järgmised:

• istutustihedus;
• polümeeri struktuur;
• linkeri struktuur;
• ühilduvus lahustitega;
• mehaaniline stabiilsus;
• poorsus;
• difusioonivõime;
• kasvavate peptiidahelate vahelised vastastikused mõjud.

Peptiidi pikkuse suurenemisega võivad ka üksikud ahelad omavahel vastastikku mõjutada.

Vaigu peal toimuv agregatsioon võib piirata juurdepääsu reaktiivsetele kohtadele ning põhjustada mittetäielikku sidumist või mittetäielikku deaktiveerimist.

See tähendab, et järjestus, mis käitub sünteesi alguses korrektselt, võib ahela pikenemisel muutuda üha keerulisemaks.

Teadlased töötasid välja muutuva voodiga voolureaktori, mis võimaldas jälgida vaigu paisumist rõhu mõõtmiste põhjal. [4]

Uuring käsitles vaigu peal toimuvat agregatsiooni ja mittetäielikku sidemete moodustumist kui protsessiprobleeme, mida teistes tingimustes võib sünteesi käigus olla raske otseselt täheldada.

See näitab, et kandja füüsilise käitumise jälgimine võib anda teavet, mis ulatub kaugemale kui lihtsalt lisatud reaktiivide registreerimine.

Milleks kasutatakse Wanga vaik?

Wang-tüüpi linkerite keemilist koostist kasutatakse laialdaselt SPPS-is, kui peptiidi eraldamise järel on soovitud, et C-ots oleks karboksüülhappe kujul.

Peptiid on seotud estrisideme abil, mida saab hiljem sobivates tingimustes lõhustada.

Muid linkerisüsteeme võib valida juhul, kui on vaja teistsugust C-otsa struktuuri, näiteks amiidi.

Tasub teha vahet linkeri keemilisel koostisel ja kogu füüsilisel kandjal.

Wang-tüüpi seotud lingid võib viia erinevatesse polümeerarhitektuuridesse.

Sellised materjalid ei pea olema identsed:

• paisumise omadused;
• mahutavus;
• lahustitega kokkusobivus;
• mehaanilised omadused;
• käitumine reaktsiooni ajal.

Peptidüül-Wang-TentaGel-kandjaid kasutades läbi viidud uuringud on näidanud spetsiifilist alternatiivset meetodit peptiidhüdrasiidide saamiseks, mis on kasulikud vaheühendid peptiidikeemias. [5]

See ei tähenda, et Wang’i vaigu abil toimuv tavapärane hüdrolüüs viib tavaliselt peptiidhüdrasiidide tekkeni.

See näitab aga üht olulist põhimõtet:

kandja + linker + reaktsioonitingimused + eraldumisreaktsioon määravad ühiselt saadava toote.

SPPS-süntees perioodilises ja voolusüsteemis

SPPS-i võib läbi viia klassikalistes perioodilistes anumates või süsteemides, kus reagendid voolavad läbi reaktori, mis sisaldab tahket kandjat.

Läbivoolusüsteemid võimaldavad reaktiivide kiiret vahetamist ning vaigu ümbritseva keemilise keskkonna täpsemat kontrolli.

2014. aasta uuringus tutvustati peptiidide kiiret sünteesi voolusüsteemis koos pideva seirega ning seda rakendati mitme peptiidi ja ühe väikese valgu puhul. [6]

Hilisemas automatiseeritud uuringus kirjeldati märkimisväärselt kiiremat ahelate kokkupanekut, mille tulemusena saavutati analüüsitud näidiste puhul toorprodukti puhtus ja eraldamisjärgne saagis, mis olid võrreldavad klassikalise tsüklilise sünteesiga. [7]

Need uuringud näitavad konkreetsete süsteemide võimalusi kindlates tingimustes.

Need ei tõesta siiski, et iga peptiidi on võimalik toota sama kiiresti ja sama kvaliteediga.

Peptiidi tootmiseks kuluv aeg hõlmab märksa enamat kui ainult ahela kokkupanekut.

Kogu protsess võib hõlmata järgmist:

• reaktiivide ettevalmistamine;
• vaigu ettevalmistamine;
• sidumine;
• lukustuse vabastamine;
• pesemine;
• eraldamine;
• toote töötlemine;
• puhastamine;
• lahustite eemaldamine;
• struktuuri lõplik kujundamine;
• analüütilised uuringud;
• dokumendid.

Seega on sidemete kiire loomine vaid üks osa tootmise üldisest tõhususest.

Süntees vedelafaasis

Mida see mõiste tähendab?

Mõistet „peptiidide süntees vedelas faasis” võib kasutada mitmes tähenduses.

Laiemas mõttes võib see lihtsalt tähendada lahuses toimuvat peptiidi sünteesi.

Spetsialiseeritumates väljaannetes tehakse aga sageli vahet järgmiselt:

1. klassikaline peptiidide süntees lahuses;
2. peptiidide süntees tahkes faasis;
3. uued LPPS-meetodid, milles kasvav ahel sisaldab lahustuvat märgistust või kandjat.

See eristus on oluline, kuna see mõjutab toote sorteerimise ja taaskasutamise viisi.

Vabalt lahustunud ja kaitstud peptiidivaheaine võib vajada eraldamist, kasutades selle enda füüsikalisi ja keemilisi omadusi.

Märgistatud vahetoote puhul võib märgistusaine olla kavandatud nii, et see hõlbustaks sadestamist, ekstraheerimist, membraanile kinnitumist või muud eraldamisviisi.

LPPS-i ülevaates tehakse selget vahet klassikalise lahuses toimuva sünteesi, SPPS-i ja lahustuvatel märgistusainetel põhinevate meetodite vahel. [8]

Käesolev väljaanne on kasulik terminoloogia ja metoodika selgemaks muutmiseks.

Seda ei tohiks siiski tõlgendada kui üksikut katset, mis tõestaks, et üks meetoditest on iga peptiidi jaoks parim.

Peptiidide klassikaline süntees lahuses

Klassikalises lahuses toimuva sünteesi puhul jäävad kaitstud aminohapped, peptiidide vaheühendid või fragmentid lahustunud olekusse reaktsioonikeskkonnas, selle asemel et olla kovalentselt seotud lahustumatu vaiguga.

Pärast reaktsiooni lõppu võib vastava vaheühendi eraldada, puhastada ja vajaduse korral iseloomustada enne järgmise etapi alustamist.

See võib tuua kaasa teatud eeliseid.

Teadlased võivad:

• kirjeldada üksikuid pooltooteid;
• valida konkreetse pooltoote jaoks sobiv puhastusmeetod;
• optimeerida üksikuid protsesse;
• valmistada lõigud iseseisvalt ette;
• muuta sünteesimarsruuti, kui teatud vaheprodukt tekitab probleeme.

Süntees lahuses võib aga kaasa tuua ka märkimisväärseid raskusi.

Peptiidahela pikenemisel võivad peptiidid:

• muutuma raskesti lahustuvaks;
• koondama;
• võivad olla raskesti kristalliseeruvad;
• tekitada sarnaseid saasteaineid;
• olla raske eraldada;
• nõuab korduvat isoleerimist;
• põhjustada materjalikadu järgnevate töötlemisetappide käigus.

Seega ei ole lahuses toimuv süntees automaatselt lihtsam ega kergem mastaapsustada kui SPPS.

Selle kasulikkus sõltub konkreetsest järjestusest, vaheühendite stabiilsusest, lahustuvusest, sünteesi pikkusest, käitumisest puhastamise käigus ning järgnevate eraldamisetappide tõhususest.

LPPS-i märgistatud strateegiate areng tuleneb osaliselt just nende materjali eraldamise ja käitlemisega seotud probleemide lahendamise püüdlustest. [8]

Lahustuvad märgistusained ühendavad reaktsiooni kavandamise ja eraldamise kavandamise

Märgistatud LPPS-is on kasvavale peptiidile loodud ajutine molekulaarne side, mis on kavandatud nii, et see mõjutaks selle füüsikalisi omadusi.

Märgistus võib tagada peptiidi piisava lahustuvuse reaktsiooni ajal ning hõlbustada seejärel selle selektiivset taaskasutamist.

Sõltuvalt tehnoloogiast võib eraldamisel kasutada:

• sadestamine;
• ekstraheerimine;
• kinnihoidmine membraanil;
• faasikäitumine;
• muud omadused, mis tulenevad märgise olemasolust.

Ühes eksperimentaalses strateegias kasutati C-otsas asuvat pika ahelaga kaitsegruppi peptiidamiidide valmistamiseks.

Korduvad reaktsioonid ja sadestamisetapid võimaldasid teadlastel valmistada hüdrofoobset peptiidi, mida nende kasutatud võrdluses oli SPPS-meetodiga raske rahuldavalt saada. [9]

See näitab, et just see strateegia on analüüsitava jada puhul sobiv.

See ei tõesta siiski märgistatud sünteesi üldist eelist.

Märgis muutub tootmisprotsessi osaks ja tekitab omakorda küsimusi:

• Kui tõhusalt see ühendatakse?
• Kas see muudab reaktsiooni kulgu?
• Kuidas saab märgistatud pooltoodet kindlalt tagasi saada?
• Kas see põhjustab uute saasteainete tekkimist?
• Kuidas seda eemaldatakse?
• Kas on võimalik kinnitada, et andmed on täielikult kustutatud?
• Millised analüüsimeetodid kinnitavad selle puudumist lõpptootes?

Seega tuleks lahustuvaid märgiseid käsitleda protsessi kavandamise funktsionaalsete elementidena, mitte pelgalt lihtsate etikettidena.

Peamiste meetodite võrdlus

Võrdlus annab ülevaate üksikute meetodite toimimise üldpõhimõtetest.

Selles ei täpsustata, milline neist tagab konkreetse järjestuse puhul parima jõudluse, puhtuse, kulutõhususe, keskkonnasäästlikkuse või skaleeritavuse.

Neid parameetreid tuleb hinnata tegeliku molekuli ja konkreetse tootmisprotsessi põhjal. [4] [8] [9]

Fragmentide ühendamine ja hübriidtootmine

Peptiidi ei pea alati moodustama üheainsa katkematu protsessina, mille käigus lisatakse järjestikku aminohappejääke.

Teine võimalus on valmistada lühemad peptiidifragmendid eraldi ja seejärel need ühendada.

Hübriidprotsessis võib näiteks kasutada SPPS-i üksikute fragmentide saamiseks ja lahuskeemiat nende ühendamiseks.

Fragmentaarsed strateegiad võivad leevendada mõningaid väga pika etapiviisilise sünteesiga seotud probleeme.

Siiski toovad need kaasa uusi väljakutseid, nagu näiteks:

• sobiva ühenduskoha valik;
• fragmentide lahustuvus;
• ühenduskohtade aktiveerimine;
• kemoselektiivsus;
• stereokeemia säilitamine;
• kõrvaltoimed;
• osade puhastamine;
• puhastamine pärast nende ühendamist.

Oluline näide fragmentide kontrollitud ühendamisest on loomulik keemiline ligatsioon.

Klassikalises versioonis reageerib tioesterpeptiid teise peptiidiga, mis sisaldab N-otsas tsüsteiini. Sellele järgnev ümberrühmitumine viib õige sideme tekkeni peptiidiskelettis ligatsioonikohas.

Esialgsed uuringud näitasid, et pärast ligatsiooni ja kokkukerimist on võimalik saada disulfiidsidemeid sisaldavat valku. [10]

See kinnitab selle tükkide ühendamise strateegia tähtsust.

See ei tähenda aga, et mis tahes kaks muutmata peptiidifragmenti võiksid spontaanselt ühineda.

Ühendamine ja kaitsegrupid

Sidumine loob taotletud ühenduse

Kopulatsioon on reaktsiooni etapp, mille käigus tekib valitud molekulide vahel uus peptiidside.

Tavaliselt aktiveeritakse karboksüülrühmast pärinev rühm nii, et see saaks tõhusalt reageerida vastava amiinirühmaga.

Aktiveerimisainete koostis peab vastama järgmistele nõuetele:

• tõusva jada;
• ajutised kaitsegrupid;
• külgahelate kaitse;
• stereokeemia;
• andmekandja või märgistusega;
• lahusti keskkonnas;
• muude molekulis esinevate funktsionaalsete rühmadega.

Tõhus seostumine on eriti oluline etapiviisilises sünteesis, kuna reaktsiooni mittetäielik läbiviimine võib põhjustada deleetsioonide tekkimist.

Kui mõne kasvava ahela puhul ebaõnnestub üks aminohappe lisamise etapp, võivad sellised ahelad süsteemis püsida ja osaleda järgmistes tsüklites.

Selle tulemusena võivad tekkida molekulid, mis on sihtpeptiidiga väga sarnased, kuid millest puudub üks jääk.

Seega võivad isegi väikesed ebaefektiivsused sünteesi mitmete etappide jooksul kuhjuda.

Lihtne matemaatiline näide illustreerib seda probleemi hästi.

Kui igaühel 50-st sõltumatust etapist oleks 99% tõenäosus õnnestumiseks, oleks nende molekulide protsent, mille puhul kõik etapid lõppeksid edukalt, järgmine:

0,99^50 ≈ 0,605

st umbes 61%.

See on üksnes matemaatiline illustratsioon.

See ei ole prognoos 50 aminohapet sisaldava peptiidi tegeliku puhtuse ega sünteesi saagikuse kohta.

Tegelik toodang hõlmab:

• erinevad sidumise tõhususnäitajad eri asendites;
• turvamehhanismi vabastamise etapid;
• kõrvaltoimed;
• sõltuvad raskusastmetest;
• taasühendamise strateegiad;
• lahutamisel tekkinud kaod;
• puhastamisel tekkinud kaod;
• muud protsessimuutujad.

Arvutus näitab vaid seda, miks isegi ühe etapi näiliselt väike ebaefektiivsus võib mitmeetapilises sünteesis omandada suure tähtsuse.

Kaitserühmad kontrollivad reageerimiskohta

Aminohappel võib sisaldada mitut keemiliselt reaktiivset rühma.

Ilma selektiivse kontrollita võiksid sidumisreaktsioonid toimuda soovimatutes kohtades.

Kaitserühmad blokeerivad ajutiselt valitud reaktiivsed kohad.

Ahela pikendamiseks kasutatav amino rühm vajab tavaliselt ajutist kaitset, samas kui reaktiivsed külgahelad võivad vajada kaitset, mis püsib paigal mitme sünteetsükli jooksul.

Ühendus kandjaga peab samuti need etapid läbima kuni kavandatud eraldumiseni.

Seega mõjutab kaitsegruppide valik kogu sünteesistrateegiat.

Tuleb arvesse võtta:

• nende rakendamise viis;
• stabiilsus;
• eemaldamise viis;
• kooskõla teiste kaitserühmadega;
• ühilduvus andmekandjaga;
• kõrvaltoimed;
• konkreetse järjestuse mõju;
• lõplikud kindlustuskaitse tühistamise tingimused.

Tsüanosulfurilidiidil põhinevat kaitset kasutavad uuringud käsitlesid aspartimidiidi teket karboksüülrühma kaitseviisi muutmise kaudu. [2]

Tulemused näitavad, et kaitsegruppide strateegia mõjutab mitte ainult seda, kas soovitud reaktsioon võib toimuda, vaid ka seda, millised soovimatud reaktsioonid muutuvad võimalikuks.

Fmoc, Boc ja ortogonaalne kaitse

Fmoc ja Boc kuuluvad laialdaselt kasutatavate amiinirühmi kaitsvate rühmade hulka.

Need erinevad tõepoolest eemaldamisviisi poolest.

Fmoc eemaldatakse tavaliselt aluselistes tingimustes, samas kui Boc on tundlik happeliste tingimuste suhtes.

Need omadused võimaldavad neid kasutada osana laiematest kaitse strateegiatest.

Populaarses Fmoc-põhises SPPS-meetodis eemaldatakse ajutine Fmoc-N-otsa kaitserühm korduvalt, samas kui valitud külgahelate kaitserühmad ja ühendus vaiguga jäävad puutumatuks kuni hilisemate etappideni.

Muud strateegiad võivad kasutada erinevaid kombinatsioone.

Eriti oluline mõiste on ortogonaalne kaitse.

Kaks kaitserühma loetakse ortogonaalseteks, kui ühte neist on võimalik selektiivselt eemaldada tingimustes, kus teine jääb piisavalt stabiilseks, et sünteesi saaks jätkata.

Ortogonaalsus on seega praktiline keemilise ühilduvuse suhe.

See ei tähenda, et iga kaitstud rühm jääks täiesti muutumatuks pärast piiramatu arvu kokkupuuteid kõigi reaktsioonitingimustega.

Kõrvaltoimed võivad endiselt esineda.

Fmoc-sünteesi uuringutes on kirjeldatud nii aspartimidi tekkimist kui ka soovimatuid stereokeemilisi muutusi, hoolimata kaitse strateegia eeldatavast selektiivsusest. [11]

Stereokeemia on molekuli identiteedi osa

Paljudel aminohapetel on kiraalne keskpunkt.

See tähendab, et nende aatomid võivad võtta erinevaid ruumilisi paigutusi, mis vastavad erinevatele stereokeemilistele vormidele.

Ühe stereogeense keskuse konfiguratsiooni muutmine võib viia teise peptiidistruktuuri tekkeni, ilma et selle nominaalmassi oleks vaja muuta.

Seetõttu ei saa mass üksi kinnitada peptiidi täielikku identiteeti.

Epimerisatsioon tähendab tavaliselt ühe stereogeense keskuse konfiguratsiooni muutust molekulis, mis sisaldab mitut sellist keskust.

Ratsemiseerumist käsitletakse sageli ka peptiidikeemias seoses aminohappejääkide stereokeemilise terviklikkuse kaotusega.

Need muudatused on olulised, kuna molekulaarne tuvastamine võib sõltuda tugevalt aatomite ruumilisest paigutusest.

Kaks molekuli, millel on sama elementkoostis ja nimimass, võivad seega käituda erinevalt, kui nende stereokeemia on erinev.

Mikrolaineid kasutava Fmoc-sünteesi uuringus leiti, et mõned jäägid olid kasutatud tingimustes vastuvõtlikud soovimatutele stereokeemilistele muutustele. Meetodi modifitseerimine piiras nende reaktsioonide esinemist. [11]

See ei tähenda, et kuumutamine kahjustab määratluse järgi kõiki peptide.

Õige järeldus on, et reaktsiooni kiirendamist tuleb hinnata koos järjestusest sõltuva keemilise selektiivsusega.

Aspartimiid ja muud sellega seotud lisandid

Aspartimidi tekkimine on tuntud kõrvalreaktsioon, mis on seotud teatud asparagiinhapet sisaldavate järjestustega.

Võib tekkida soovimatu tsükliline vaheühend, millest moodustuvad seejärel ühendid, mille skeleti sidemed või stereokeemia on muutunud.

Selle reaktsiooni tõenäosus sõltub järjestusest ja protsessi tingimustest.

Muud sünteesiga seotud saasteained võivad tuleneda:

• osaline sidumine;
• ebapiisav turvalisus;
• deleetsioonijadade tekkimine;
• kõrvalketi reaktsioonid;
• stereokeemilised muutused;
• reaktsioonid eraldamise ajal;
• oksüdatsioon;
• ümberpaigutused;
• toote töötlemise tingimused;
• kaitsegruppide ebatäielik eemaldamine.

Mõned saasteained põhjustavad selgelt märgatavat muutust molekulmassis.

Mõned on palju raskem eristada.

Reniini substraadiks oleva sünteetilise peptiidi analüütilistes uuringutes tuvastati mitmeid lisandeid, sealhulgas komponente, millel oli sama massimuutus, kuid mis sisaldasid modifikatsioone erinevates positsioonides. [12]

Nende eristamiseks oli vaja täiendavat struktuurianalüüsi.

Teadlased käsitlesid ka nende saasteainete tekkimise pakutud mehhanisme hüpoteesidena.

See on oluline eristus:

Saaste olemuse kindlaksmääramine ja selle tekkimise täpse mehhanismi tõendamine on kaks eraldi teaduslikku küsimust.

Tõenäolist mehhanismi ei tohiks esitada kinnitatuks ainult seetõttu, et see vastab täheldatud molekulmassile.

Puhastamine, katlakivi eemaldamine ja tootmise kvaliteet

Tooraine, puhastatud toode ja tootlikkus

Toorpeptiid on aine, mis on saadud enne asjakohaste puhastamisetappide lõpetamist.

Võib sisaldada:

• sihtpeptiid;
• deleetsioonijadad;
• materjal pole täielikult ohutuks muudetud;
• muudetud järjestused;
• reaktiivide jäägid;
• eraldamisega seotud tooted;
• soolad;
• lahustid;
• muud protsessi käigus tekkivad koostisosad.

Puhastamise eesmärk on eraldada soovitud peptiid sellest segust.

Tuleb selgelt eristada kolme mõistet:

tooraine puhtus — materjali koostis enne lõplikku puhastamist;

puhastatud või eraldatud toote saagis — sihtmaterjali saadud kogus võrreldes kindlaksmääratud alg- või teoreetilise väärtusega;

lõplik puhtus — isoleeritud materjali koostis, mis on määratud kindla analüüsimeetodi abil.

Need mõisted ei ole omavahel asendatavad.

See protsess võib tekitada suures koguses toormaterjali, kuid võimaldab saada suhteliselt väikese koguse puhastatud toodet.

Teine protsess võib anda küll vähem toormaterjali, kuid selle puhul on sihttoote moodustumise selektiivsus kõrge.

Samamoodi ei pruugi kõrge analüütiline puhtus tähendada suurt tootmisvõimsust.

Kiirendatud voolusünteesi uuringutes on tooraine puhtust ja eraldamise saagikust nõuetekohaselt eraldi esitatud. [7]

Kromatograafia eraldab koostisosad, kuid ei anna vastust igale küsimusele

Kõrge läbilaskevõimega pöördfase-vedelikkromatograafia (RP-HPLC) on laialdaselt kasutusel peptiidide analüüsimisel ja puhastamisel.

Erinevad molekulid mõjutavad staatilist ja liikuvat faasi erineval viisil.

Sobivates tingimustes võimaldavad need erinevused segus sisalduvaid komponente eraldada.

Analüütiline ja preparatiivne kromatograafia on omavahel seotud, kuid neil on erinevad rakendused.

Analüsaator HPLC on mõeldud eelkõige proovi koostise uurimiseks.

Preparatiivset HPLC kasutatakse eraldatud komponentide füüsiliseks kogumiseks.

Kromatogramm võib anda palju väärtuslikku teavet.

Suurt peamist piiki või selle pindala suurt protsentuaalset osakaalu ei tohiks siiski käsitada molekuli täieliku iseloomustusena.

Kromatograafia tulemused sõltuvad muu hulgas järgmistest teguritest:

• veeru tüüp;
• liikuv faas;
• gradient;
• temperatuurid;
• avastamismeetodid;
• lainepikkus;
• proovi ettevalmistamine;
• piikide integreerimise viis;
• eraldusvõime;
• saasteainete omadused.

Kaks ühendit võivad potentsiaalselt elueeruda samal ajal.

Mõned proovi koostisosad võivad reageerida kasutatud detektorile erinevalt.

Seetõttu ei tähenda HPLC puhul pindade kõrge puhtusaste veel molekulaarse identiteedi täielikku kinnitamist.

Isobaarsete peptiidsaasteainete uuringud ja kiraalsed analüüsid näitavad, miks võib olla vaja täiendavaid analüüsimeetodeid. [12] [13]

Analüütiline meetod peab vastama konkreetsele struktuurilisele küsimusele.

Identiteet, puhtus ja sisu tähendavad erinevaid asju

Peptiidide iseloomustamisel on eriti olulised kolm mõistet.

Identiteet vastab järgmisele küsimusele:

Kas proovis on soovitud molekul?

„Puhtus“ vastab järgmisele küsimusele:

Millised muud komponendid on proovis olemas või milline osa mõõdetavast signaalist vastab põhikomponendile?

Sisu vastab järgmisele küsimusele:

Kui palju tegelikku peptiidi on proovis?

Nendele küsimustele ei ole alati võimalik vastata üheainsa mõõtmise abil.

Peptiidi sisaldav materjal võib sisaldada ka järgmisi aineid:

• vesi;
• vastandatud;
• soolad;
• lahustite jäägid;
• muud protsessiga seotud koostisosad;
• saasteained.

Seega ei pea kaalutud materjali kogumass tingimata vastama peptiidi enda massile.

Samuti ei tõenda mõõdetud molekulmassi vastavus teoreetilisele väärtusele:

• täielik aminohapete järjestus;
• üksikute jääkide õige ühendamine;
• stereokeemiline terviklikkus;
• disulfidsidemete paigutus;
• kortsud;
• isobaariliste saasteainete puudumine.

Massispektromeetria võib anda veenvaid tõendeid molekulmassi kohta.

Tandem-massispektromeetria ja muud struktuurianalüüsi meetodid võivad anda täiendavat teavet järjestuse kohta.

Kiraalsed meetodid võimaldavad analüüsida stereokeemilisi küsimusi, mida tavalise massimõõtmisega ei ole võimalik lahendada.

Ühes analüütilises uuringus võeti arvesse isegi proovi ettevalmistamise käigus tekkivat ratsemiseerumist. See näitab veel üht olulist põhimõtet: analüüsiprotseduur ise võib põhjustada artefakte, kui seda ei ole asjakohaselt kavandatud. [13]

Kokkuvoldimine ja aktiivsus võivad nõuda eraldi kinnitust

Struktuuriliselt piiratud peptiidide ja väikeste valkude puhul võivad õige järjestus ja molekulmass ikkagi osutuda ebapiisavaks kavandatud lõpliku struktuuri kinnitamiseks.

Lisaküsimused võivad hõlmata järgmist:

• Kas tekkisid õiged disulfiidsillad?
• Kas molekul on võtnud oodatud konformatsiooni?
• Kas tsükliseerimine on lõpule viidud?
• Kas esineb struktuurisisomeere?
• Kas sünteetiline molekul ilmutab oodatud aktiivsust teatavas eksperimentaalses katses?

BPTI sünteesi uuringus kasutati mitmeid analüütilisi ja biofüüsikalisi meetodeid, sealhulgas trüpsiini inhibeerimise hindamist. [3]

Kokkuvõttes kinnitasid tulemused, et loodusliku järjestusega sünteetiline materjal vastab uuritud kriteeriumide alusel looduslikule valgule.

Aktiivsustest annab siiski vastuse konkreetsele funktsionaalsele küsimusele.

See ei asenda saasteainete analüüsi.

Samamoodi ei tõenda sarnane aktiivsus ühes katses kõigi bioloogiliste, struktuuriliste või tootmisomaduste täielikku võrdväärsust.

Tootmise mastaabisuse muutmine ei mõjuta ainult materjali kogust

Tootmismahu suurendamine ei tähenda üksnes kõigi reaktiivide koguse proportsionaalset suurendamist.

Füüsikalised protsessid võivad suuremas mastaabis käituda teisiti.

Olulised võivad olla:

• segamine;
• soojusvahetus;
• reaktiivide turustamine;
• difusioon;
• vaigu paisumine;
• rõhk;
• filtreerimine;
• lahustite käitlemine;
• sadestamine;
• vahetoodete lahustuvus;
• materjali transport;
• puhastussüsteemi võimalused.

Need tegurid võivad mõjutada nii reaktsiooni kulgu kui ka saasteainete tekkimist.

Ka hilisemate etappide puhastamine võib muutuda kogu tootmise kitsaskohaks.

Sünteesi kiiruse suurendamisel on piiratud tähtsus, kui puhastussüsteem ei suuda tekkivaid saasteaineid tõhusalt eraldada ega nõutava kvaliteediga toodet tagasi võtta.

Tööstuslikus analüüsis, mis hõlmas 40 peptiidide sünteesiprotsessi 14 farmaatsiaettevõttes, hinnati materjalide kulu sünteesi, puhastamise ja eraldamise käigus. [14]

Uuring näitab, miks tootmise hindamine peaks hõlmama kogu protsessi.

See ei tähenda siiski, et iga tehas, tootmisprotsess või tehnoloogia annaksid ühesuguseid tulemusi.

Tootmise kvaliteet on mitmete kontrollimeetmete tulemus

Usaldusväärne peptiidide tootmine nõuab enamat kui ühe rahuldava analüüsitulemuse saamist.

Kontrollitud protsess hõlmab tavaliselt mitut omavahel seotud elementi:

määratletud sihtmolekul → sobivad lähteained → kontrollitud süntees → kontrollitud puhastamine → nõuetekohane proovivõtt → valideeritud või otstarbekohane analüüs → partii dokumentatsioon.

Partii dokumentatsioon seob analüüsitulemused tegelikult toodetud materjaliga.

Analüüsisertifikaat (COA) annab ülevaate konkreetse partii valitud analüüsitulemustest.

Selle informatiivsus sõltub järgmistest teguritest:

• tehtud uuringute liik;
• kasutatud meetodid;
• nende meetodite kasulikkus;
• spetsifikatsioonid;
• proovi identifitseerimine;
• partii jälgitavus;
• kinnitus, et esitatud tulemused puudutavad tõepoolest kõnealust materjali.

Üksik näitaja, mida nimetatakse „puhtuseks”, ei saa iseenesest kinnitada:

• täieliku molekulaarse identiteedi;
• peptiidi sisaldus;
• stereokeemiline terviklikkus;
• lahustite jääkide tase;
• veesisaldus;
• vastioonide koostis;
• mikrobioloogilised omadused;
• kortsud;
• bioloogiline aktiivsus;
• sobivus teatud otstarbeks.

Sobiv analüüside kogum sõltub materjali kavandatud kasutusotstarbest.

Analüütilise võrdlusmaterjalina kasutatav peptiid, rakukatses kasutatav uurimisreaktiiv ning farmaatsiatoote arendusetapis olev materjal võivad nõuda vastuseid teistele kvaliteediküsimustele.

Analüütilisi tõendeid tuleks seega tõlgendada selgelt määratletud kontekstis, mitte aga universaalse kvaliteedikinnitusena.

Keskkonnasäästlikkuse hindamine peab hõlmama kogu protsessi

Peptiidide süntees võib nõuda märkimisväärseid koguseid lahusteid ja reagente.

Keskkonnamõju hindamisel tuleks seega arvesse võtta palju enamat kui ainult ühendamisetapp.

Oluliste elementide hulka võivad kuuluda:

• ehitusplokkide valmistamine;
• konjugeerimisreaktiivid;
• reaktiivid turvalukustuse eemaldamiseks;
• pesemine;
• eraldamine;
• toote töötlemine;
• kromatograafia;
• lahustite vahetamine;
• isolatsioon;
• kuivatamine;
• jäätmekäitlus.

Keskkonnakoormuse vähendamine võib nõuda mitme etapi samaaegset parandamist.

Avaldatud analüüsis, mis käsitleb peptiidide tootmist, arutati nii sünteesi kui ka puhastamisega seotud probleeme ning toodi esile vajadus kogu protsessi kavandamise täiustamiseks. [15]

Kuna tegemist on tulevikku suunatud väljaandega, ei kujuta see endast kontrollitud otsest võrdlust, mis tõestaks, et üks konkreetne tehnoloogia on alati keskkonnasõbralikum.

Samamoodi:

kiirem süntees ei tähenda automaatselt, et see oleks keskkonnasõbralikum,

kuid lahustite väiksem tarbimine sünteesi käigus ei tähenda automaatselt, et kogu tootmisprotsessi mõju oleks väiksem.

Keskkonnavõrdluste puhul tuleb kasutada ühtseid analüüsi piire ning ressursikasutust tuleks eelistatavalt seostada kindla koguse eraldatud ja iseloomustatud lõpptootega.

Korduma kippuvad küsimused

1. Mille poolest erineb peptiidide süntees tahkes faasis vedelas faasis toimuvast sünteesist?

Tahkes faasis toimuva sünteesi puhul jääb kasvav peptiid seotuks lahustumatu kandjaga, samas kui klassikalises lahuses toimuva sünteesi puhul jääb peptiidivaheprodukt lahustunuks ja seda tuleb tavaliselt eraldada selle füüsikaliste ja keemiliste omaduste alusel. Kitsamas tähenduses on LPPS-i lahustunud kasvaval ahelal lisaks lahustuv märgistus või kandja, mis hõlbustab hilisemat eraldamist. Märgistatud sünteesi uuringud näitavad ühte strateegiat lahuses toimuva keemia ühendamiseks sadestamise teel toimuva eraldamisega, samas kui LPPS-i käsitlev kirjandus eristab selliseid lahendusi nii klassikalisest lahuses toimuvast sünteesist kui ka SPPS-ist. Ükski meetod ei ole definitsiooni järgi optimaalne iga peptiidi jaoks. Põhiline erinevus puudutab kasvava ahela füüsilist juhtimist ja eraldamist sünteesi järgnevate etappide jooksul. [8] [9]

2. Miks võivad peptiidide sünteesi käigus tekkida lisandid?

Saasteained võivad tekkida seetõttu, et soovitud reaktsioonid ei toimu alati kvantitatiivselt ning teised funktsionaalsed rühmad võivad osaleda soovimatutes reaktsioonides. Ebapiisav konjugeerimine võib viia deleetsioonideni, ebapiisav desproteineerimine võib häirida ahela edasist kokkupanekut ning mõned järjestused on vastuvõtlikud stereokeemilistele muutustele, aspartimidi tekkele, oksüdeerumisele, ümberrühmitumisele või eraldumisega seotud kõrvalsaadustele. Fmoc-sünteesi uuringud ja sünteetiliste peptiidiliste lisandite struktuurianalüüsid dokumenteerivad mitmeid selliseid näiteid. [11] [12] Üksikute lisandite esinemissagedus ja tähtsus sõltuvad järjestusest ja protsessist, mistõttu ei tohi sünteesi automatiseerimist samastada keemiliste vigade täieliku puudumisega.

3. Millist rolli täidab vaik peptiidide sünteesis?

Vaik hoiab kasvavat peptiidi paigal, samal ajal kui lahustuvad reaktiivid ja paljud kõrvalsaadused saab eemaldada sünteesi järgmiste etappide vahel. See lihtsustab oluliselt ahela korduvat kokkupanemist, kuid vaik ei ole pelgalt mehaaniline kinnitus. Selle paisumine, täitumusaste, polümeeri struktuur, sobivus lahustitega ja reaktsioonikohtade kättesaadavus võivad mõjutada reaktiivide jõudmist seotud peptiidini. Uuringutes, kus kasutati muutuva voodiga reaktorit, jälgiti vaigu käitumist agregatsiooni ja sidumise efektiivsuse analüüsi käigus. [4] Selline jälgimine ei kõrvalda järjestusvigu, kuid näitab, miks vaigu füüsiline seisund võib olla oluline protsessimuutuja.

4. Milliseks otstarbeks kasutatakse Wanga vaik peptiidide sünteesis?

Wang-tüüpi kandjaid seostatakse tavaliselt selliste peptiidide valmistamisega, mis vabanevad pärast asjakohast C-otsast karboksüülhappe kujul eraldamist. Täpne lõppprodukt sõltub aga pigem linkerist, kandja struktuurist ja kasutatud eraldamiskeemiast, mitte ainult vaigu nimetusest. Teadlased tutvustasid ka spetsiaalset meetodit peptidüül-Wang-TentaGel-materjali muundamiseks peptiidhüdrasidideks, mida saab kasutada kasulike sünteetiliste vaheproduktidena. [5] Alternatiivne reaktsioon ei muuda Wangi vaigu standardse eraldamise tähtsust. See näitab aga, miks tuleb toote ennustamisel analüüsida kogu kandja süsteemi ja reaktsioonitingimusi.

5. Kas SPPS sünteesib peptiidi N-otsast või C-otsast?

Klassikaline etapiviisiline SPPS algab tavaliselt C-otsa jäägi kinnitamisega kandjale, mille järel ahelat pikendatakse N-otsa suunas. See on vastupidine suund võrreldes ahela tavapärase pikendamisega ribosoolis, kus valk kasvab järgmiste aminohapete lisamisega C-otsa poole. BPTI süntees on näide kaitstud ehitusplokkide ja kandja kasutamisest enne toote hilisemat vabastamist, puhastamist ja kokkupakkimist. [3] Siiski on olemas spetsialiseeritud peptiidkeemia strateegiad, mis kasutavad teisi lahendusi, mistõttu tuleks C-otsast N-otsa suunas ehitamist määratleda kui klassikalist SPPS-lähenemist, mitte aga kõigi sünteesimeetodite absoluutset reeglit.

6. Miks on kaitsealad vajalikud?

Aminohapped sisaldavad sageli mitut reaktiivset funktsionaalrühma. Kaitserühmad takistavad ajutiselt valitud kohtade reaktsiooni, jättes vastava koha kättesaadavaks sünteesi konkreetses etapis. See aitab kontrollida jääkide ühendamise järjekorda ja viisi. Ilma nõuetekohase kaitseta võiksid konkureerivad reaktsioonid viia keeruliste segude või muudetud struktuuriga produktide tekkeni. Aspartimiidi tekkimist käsitlevad uuringud on näidanud, et karboksüülrühma kaitsekeemia muutmine võib piirata olulist kõrvalreaktsiooni uuritud järjestustes. [2] Kaitsegrupid ei taga sünteesi ideaalset kulgu, kuid tagavad selektiivse keemilise kontrolli, mis peab olema kooskõlas kõigi protsessi oluliste etappidega.

7. Millised on Fmoc ja Boc erinevused?

Fmoc ja Boc on laialt kasutatavad ajutised aminorühma kaitsvad rühmad, kuid need reageerivad erinevatele keemilistele tingimustele. Fmoc eemaldatakse tavaliselt aluselises keskkonnas, samas kui Boc on tundlik hapete suhtes. See erinevus mõjutab nende ühendamist külgahelate kaitsjatega, linkeritega ja sünteesi ülejäänud etappidega. Fmoc-põhine süntees on laialdaselt kasutusel tänapäevases SPPS-is, kuid uuringud on näidanud ka sellistes tingimustes järjestusest sõltuvate kõrvalreaktsioonide võimalikkust. [11] Seega on praktikas kasulikum võrrelda terviklikke kaitse strateegiaid ja nende sobivust konkreetse järjestusega, kui vaadelda üksnes kahe kaitsegrupi nimetusi.

8. Mida tähendab ortogonaalne kaitse?

Ortogonaalne kaitse tähendab, et üht kaitserühma on võimalik eemaldada tingimustes, kus teine vajalik kaitserühm jääb piisavalt stabiilseks, et sünteesi saaks jätkata. See võimaldab teatud etappidel paljastada erinevaid reaktiivseid kohti. See kontseptsioon on keerukate peptiidide kontrollitud sünteesi puhul ülioluline. Ortogonaalsus sõltub siiski tingimustest ega ole absoluutne: korduv eksponeerimine, järjestuse iseloom ja reaktsiooniparameetrid võivad ikkagi põhjustada kõrvalreaktsioone. Uuringud karboksüülrühmade alternatiivsete kaitseviiside kohta näitavad, kuidas kaitse strateegiat saab modifitseerida, et kontrollida keerulist peptiidkeemiat. [2]

9. Mis on deleetsioonijada?

Deleetsioonijada on peptiid, millest puudub üks või mitu sihtjadas esinevat jääki. See võib tekkida, kui aminohappe sidumise etapp ei toimu täielikult, kuid reageerimata jäänud ahel jääb kandjaga seotuks ja osaleb järgmistes tsüklites. Kuna ebaõige ahel jääb endiselt seotuks kandjaga, ei pruugi tavaline pesemine seda eemaldada. SPPS-i reaalajas jälgimise uuringud näitavad, et amidisidemete mittetäielik moodustumine on oluline protsessiprobleem. [4] Seega on deleetsioonijada probleem, mis on seotud toote struktuuri ja identiteediga, mitte ainult reaktsioonisaadusega.

10. Kas kahel peptiidilisel saasteainel võib olla sama molekulmass?

Jah. Erinevatel molekulistruktuuridel võib olla identne või eristamatu nimimass. Seetõttu ei kinnita massi ühtivus iseenesest molekuli täielikku identsust. Reniini substraadiks oleva sünteetilise peptiidi uuringutes identifitseeriti isobaarsed saasteained, milles modifikatsioonid esinesid erinevates positsioonides. Derivatiseerimine ja tandem-massispektromeetria andsid täiendavat teavet struktuuri kohta. [12] See näide illustreerib, miks vaadeldud massi vastavus oodatavale ei saa iseenesest kinnitada õiget järjestust, sidemeid, stereokeemiat ega struktuuriliselt sarnaste isomeeride puudumist.

11. Mis on epimerisatsioon ja ratsemiseerimine peptiidide sünteesis?

Epimerisatsioon ja ratsemiseerumine on seotud soovimatute muutustega stereokeemilises konfiguratsioonis. Need võivad toimuda ilma, et muutuks aminohapete nominaalne järjestus või molekulmass, mistõttu tavaline massimõõtmine ei pruugi struktuurilist erinevust näidata. Mikrolaineid kasutava Fmoc-sünteesi uuringutes on tuvastatud stereokeemilistele muutustele altis olevad jäägid ning näidatud, et reaktsioonitingimuste muutmine võib selliseid protsesse piirata. [11] Risk sõltub ehitusplokist, järjestusest ja protsessi tingimustest. Stereokeemiline kvaliteet nõuab seega analüüsimeetodeid, mis suudavad konfiguratsiooni hinnata, ning seda ei saa järeldada ainult molekulmassi põhjal.

12. Mis on aspartimiidi tekkimine?

Aspartimidi tekkimine on soovimatu reaktsioon, mis on seotud teatud asparagiinihappeid sisaldavate järjestustega. Tsüklilise vaheühendi tekkimine võib viia järgnevate saadusteni, millel on muutunud skeleti sidemed või stereokeemia, vähendades saagikust ja raskendades puhastamist. Teadlased analüüsisid alternatiivseid kaitse strateegiaid, mis on kavandatud selle reaktsiooni piiramiseks valitud peptiidides ja valkudes. [2] Tulemused ei näita üht universaalset lahendust kõigi asparagiinhapet sisaldavate järjestuste jaoks. Need näitavad aga, miks sünteesi kavandamisel ja saasteainete kontrolli strateegiate väljatöötamisel tuleb arvesse võtta konkreetse järjestuse spetsiifilist keemilist käitumist.

13. Kas HPLC kõrge puhtusaste kinnitab peptiidi õiget identiteeti?

Ei. HPLC puhtusaste kirjeldab proovi konkreetse kromatograafilise eraldamise, kasutatud detektori ja andmete analüüsimise meetodi raames. Peamise piigi suur pindala võib olla väärtuslik tõend selle kohta, et proovi domineerib üks kromatograafiliselt eraldatud komponent, kuid see ei kinnita iseenesest molekuli täielikku identiteeti. Kooselueeruvad lisandid, stereoisomeerid ja muud variandid võivad nõuda täiendavaid meetodeid. Peptiidide kiraalsuse analüüsimisel kasutati spetsiaalselt välja töötatud protsessi, mis võttis arvesse ka proovi ettevalmistamise käigus tekkivaid stereokeemilisi muutusi. [13] Seega tuleb identiteeti ja puhtust käsitleda seotud, kuid eraldiseisvate analüütiliste küsimustena.

14. Kas puhastatud toote tootlikkus tähendab sama mis puhtus?

Ei. Puhastatud või eraldatud toote saagis määratletakse sihtmaterjali saadud koguse suhtena määratletud alg- või teoreetilisse kogusesse. Puhtus aga kirjeldab saadud materjali koostist vastavalt kindlaksmääratud analüüsimeetodile. Süntees võib anda tulemuseks suhteliselt väikese koguse väga kõrge puhtusastmega toodet või suure koguse toormaterjali, mis sisaldab märkimisväärset hulka lisandeid. Automaatse voolusünteesi uuringutes on tooretoote puhtust ja eraldamisjärgset saagist käsitletud eraldi. [7] Nende parameetrite eraldamine hoiab ära olukorra, kus ühe parameetri kõrget väärtust käsitletakse ekslikult teise parameetri kõrge väärtuse tõendina.

15. Kas pikki peptideid on võimalik toota lühemate fragmentide ühendamise teel?

Jah. Fragmentaarses strateegias saab lühemad peptiidsegmendid valmistada eraldi ja seejärel ühendada sobiva keemilise meetodi abil. Ligatsioon oli oluline näide, kus kaitseaineteta peptiidifragmendid ühendati viisil, mis viis peptiidiraami loomuliku sideme tekkeni, mille tulemusena saadi kokkupakitud valk. [10] See ei tähenda, et mis tahes peptiidifragmendid võiksid spontaanselt ühineda. Arvesse tuleb võtta fragmentide struktuuri, ühendamise keemiat, ühenduskoha valikut, lahustuvust, stereokeemiat ja puhastamisnõudeid. Fragmentide kokkupanek on seega alternatiivne sünteesi kavandamise strateegia, mitte aga automaatne lahendus pikkade peptiididega seotud probleemidele.

16. Kas kiirem automatiseeritud süntees muudab puhastamise tarbetuks?

Ei. Kiirem automatiseeritud või voolusüntees lühendab sünteesi teatud etappide aega, kuid ei tõenda, et igal tekkinud molekulil oleks soovitud struktuur. Kiire voolusünteesi uuringutes iseloomustati endiselt lähteainet ja kasutati hilisemat puhastamist, ning järgnevates automatiseerimist käsitlevates töödes võrreldi eraldi lähteaine puhtust ja saagikust pärast eraldamist. [6] [7] Süsteemi head tulemused uuritud järjestuste puhul ei taga samasuguseid tulemusi iga uue sihtmärgi puhul. Kiirendatud süntees peab endiselt olema seotud asjakohase puhastamise, identiteedi kinnitamise, lisandite analüüsi ja lõpliku iseloomustamisega.

17. Miks on tootmise mahu suurendamine keerulisem kui suurema partii valmistamine?

Tootmismahu suurendamine muudab füüsikalisi ja keemilisi tingimusi, mitte ainult materjali kogust. Segamine, soojusvahetus, vaigu paisumine, reagentide jaotumine, rõhk, filtreerimine, lahustite käitlemine, vaheproduktide lahustuvus ja puhastussüsteemi võimsus võivad suurema tootmismahu korral käituda teisiti. 40 peptiidiprotsessi tööstuslikus analüüsis hinnati materjalikulu analüüsi käigus eraldi sünteesi, puhastamist ja isoleerimist. [14] Tulemused näitavad, miks tootmist tuleb käsitleda tervikliku protsessina. Skaleeritav meetod peab korduvalt viima iseloomustatud materjali saamiseni kõigis etappides, mitte ainult suurema koguse toorpeptiidi saamiseni.

18. Kas peptiid on valmis kohe pärast õige järjestuse moodustamist?

Mitte tingimata. Ahela kokkupanek moodustab järjestuse raamistiku ainult sel määral, mil seda kinnitavad protsess ja analüütilised andmed. Sõltuvalt molekulist võivad endiselt vajalikuks osutuda deprotectimine, hüdrolüüs, tsükliseerimine, oksüdeerimine, disulfiidsildade moodustamine, voldimine, konjugatsioon, puhastamine ja iseloomustamine. BPTI süntees on hea näide protsessist, kus lineaarsele järjestusele järgnes puhastamine ja disulfiidsilde sisaldava volditud struktuuri moodustamine. [3] Mõiste „valmis peptiid” peaks seega viitama teaduslikus kontekstis nõutavale molekulaarsele vormile, mitte ainult aminohapete järkjärgulise lisamise lõpetamisele.

19. Kas õige molekulmass kinnitab peptiidi õiget järjestust?

Ei. Molekulmassi vastavus on väärtuslik tõend, kuid see ei suuda üksi kinnitada täielikku järjestust ega molekulaarstruktuuri. Isobaarsed struktuurid võivad omada sama massi ning stereokeemilised erinevused ei pruugi molekulmassi üldse muuta. Sünteetiliste peptiidide saasteainete uuringud on näidanud, et struktuuriliselt erinevate komponentide eristamiseks võib olla vaja kasutada tandem-massispektromeetriat ja täiendavaid analüüse. [12] Stereokeemilise terviklikkuse küsimuste korral võivad vajalikuks osutuda ka kiraalsed meetodid. [13] Molekulmassi tuleks seega käsitleda ühe identiteedi hindamise elemendina, mitte aga selle täieliku kinnitusena.

20. Miks tuleks puhastamist käsitleda peptiidi tootmise osana, mitte lihtsalt lõppetapina?

Puhastamine määrab, kas sihtpeptiidi on võimalik tõhusalt eraldada deleetsioonijärjestustest, kõrvalsaadustest, reaktiivide jääkidest, struktuuriliselt sarnastest lisanditest ja muudest sünteesi käigus tekkinud komponentidest. Meetod, mis võimaldab väga kiiresti toota suuri koguseid toormaterjali, võib siiski osutuda ebapraktiliseks, kui sihtprodukti nõutava kvaliteediga ei ole võimalik tõhusalt eraldada. Seetõttu võetakse peptiidiprotsesside tööstuslikus analüüsis arvesse nii sünteesi, puhastamist kui ka eraldamist. [14] Tootmise efektiivsust tuleb lõppkokkuvõttes hinnata isoleeritud lõppmaterjali koguse ja omaduste põhjal, mitte ainult sünteesi kiiruse alusel.

Peptiidide sünteesimeetodite võrdlemise piirangud

Peptiidide tootmistehnoloogiaid võrdlevate uuringute tõlgendamisel tuleb silmas pidada mitmeid olulisi piiranguid.

Esiteks mõjutab järjestus oluliselt sünteesi raskusastet. Ühe peptiidi puhul toimiv meetod ei pruugi teise puhul samamoodi toimida. Aгреgeerumine, hüdrofoobsus, aminohapete koostis, pikkus, kalduvus moodustada sekundaarstruktuure ja vastuvõtlikkus kõrvalreaktsioonidele võivad protsessi kulgu muuta. [1] [4]

Teiseks on tooraine puhtus, saagis pärast isoleerimist, lõplik puhtus ja peptiidisisaldus erinevad parameetrid. Meetodite võrdlemine ainult ühe neist lähtuvalt võib anda tootmise efektiivsusest ebatäieliku ülevaate. [7]

Kolmandaks ei tähenda ahela kiire kokkupanek kogu materjali kiiret tootmist. Lõikamine, puhastamine, isoleerimine, struktuuri lõplik vormimine, analüütilised uuringud ja dokumenteerimine mõjutavad samuti tootmise koguaega. [6] [7]

Neljandaks sõltub analüütiline puhtus kasutatud meetodist. HPLC, massispektromeetria, tandem-massispektromeetria ja kiraalne analüüs annavad vastuseid erinevatele küsimustele. Üks analüütiline tulemus ei pruugi kinnitada täielikku struktuurilist identiteeti. [12] [13]

Viiendaks mõjutab tootmismahust protsessi käitumist. Laboratoorsete sünteesitulemusi ei saa automaatselt üle kanda tööstuslikule tootmisele, ilma et hinnataks segamist, massi transporti, puhastamisvõimalusi, materjalikulu ja muid tootmismahust sõltuvaid tegureid. [14]

Kuuendaks võivad ajaloolised majanduslikud võrdlused aja jooksul kaotada oma aktuaalsuse. Reaktiivide kulud, automatiseerituse tase, ekspressioonitehnoloogiad, puhastusseadmed, lahustite taaskasutamine ja tootmisinfrastruktuur arenevad pidevalt. Vanemad kuluanalüüsid võivad küll endiselt omada teaduslikku tähtsust, kuid need ei pruugi kajastada turu praegust majanduslikku olukorda. [1]

Seitsmendaks nõuavad keskkonnavõrdlused ühtseid analüüsi piire. Lahustite tarbimise hindamine üksnes ahela kokkupaneku etapis, jättes samal ajal kõrvale puhastamise ja isoleerimise, võib viia eksitavate järeldusteni protsessi jätkusuutlikkuse kohta. [14] [15]

Lõpuks ei määra meetodi nimetus ise toote kvaliteeti. SPPS, lahuses süntees, LPPS, fragmentide liitmine ja bioloogiline ekspressioon võivad viia kõrgekvaliteedilise materjali saamiseni, kui protsess on asjakohaselt kavandatud ja kontrollitud. Kuid ükski neist meetoditest ei taga automaatselt õiget identiteeti, puhtust, stereokeemiat, voldumist ega sobivust konkreetsele rakendusele.

Kokkuvõte

Peptiidide sünteesi on kõige parem mõista kui molekulide tootmise kontrollitud protsessi, mitte lihtsalt peptiidsidemete moodustamist.

Eesmärk on luua kindel aminohapete jada, kontrollides samal ajal jääkide ühendamise viisi, kaitserühmade keemilist koostist, stereokeemiat, kõrvalreaktsioone ja kõiki täiendavaid struktuurilisi nõudeid.

Peptiidide süntees tahkes faasis hoiab kasvavat ahelat lahustumatu kandjal, mistõttu sobivad korduvad ühendamis- ja pesemisetapid hästi automatiseerimiseks. Korduvate sünteesietappidega seotud eelised ei kõrvalda siiski selliseid probleeme nagu mittetäielikud reaktsioonid, agregatsioon, sekvenside deletsioonid või sekvensist sõltuvad kõrvalreaktsioonid. [4] [6] [7]

Klassikaline lahuses toimuv süntees hoiab peptiidide vaheühendeid vedelal kujul ning võib pakkuda suuremat paindlikkust üksikute vaheühendite eraldamisel ja iseloomustamisel. Korduv eraldamine ja lahustuvuse halvenemine võivad aga kujuneda tõsisteks piiranguteks.

Vedelafaasis sünteesimeetodid, milles kasutatakse lahustuvaid märgiseid, püüavad ühendada lahuskeemiat spetsiaalselt kavandatud materjali taaskasutamise strateegiatega. Seega võivad need pakkuda täiendavat võimalust nende järjestuste ja tootmisprobleemide puhul, mille jaoks klassikaline SPPS ei ole optimaalne. [8] [9]

Pikemaid või eriti keerukaid molekule on võimalik valmistada ka fragmentide ühendamise teel, sealhulgas loomuliku keemilise ligatsiooni abil, selle asemel et tugineda ainult järjestikuste aminohappejääkide pidevale lisamisele. [10]

Sõltumata valitud sünteesimeetodist jäävad sidumise efektiivsus ja kaitsegruppide keemia endiselt otsustavaks, kuna väikesed ebatõhusused ja kõrvalreaktsioonid võivad järgnevate sünteesietappide käigus kuhjuda. Aspartimidi teke, deleetsioonijadad ja stereokeemilised muutused näitavad, miks kavandatud järjestus üksi ei kirjeldagi kõike, mis protsessi käigus tekkida võib. [2] [11] [12]

Töö ei lõpe ka ahela kokkupanekuga.

Puhastamine määrab, kas lõpptoodet on võimalik teistest koostisosadest eraldada.

Seejärel annavad asjakohaselt valitud analüüsimeetodid vastused konkreetsetele küsimustele, mis puudutavad identiteeti, puhtust, sisaldust, stereokeemiat, konformatsiooni ning – kui see on oluline – funktsionaalset aktiivsust. [3] [12] [13]

Tootmismahu suurendamine toob kaasa uusi probleeme, mis puudutavad massi transporti, vaigu säilitamist, lahustite tarbimist, filtreerimist, puhastamisvõimalusi, protsessi korratavust ja selle keskkonnamõju. Seetõttu peaks tööstuslik protsessi hindamine hõlmama nii sünteesi, puhastamist kui ka isoleerimist, mitte keskenduma ainult sidumiskiirusele. [14] [15]

Kõige olulisem reegel on järgmine:

Peptiidi tõhus tootmine nõuab kogu protsessi kontrolli – alates molekulaarsest disainist ja sidemete moodustamisest kuni puhastamiseni ja struktuuriliste omaduste kindlaksmääramiseni. Oodatava nominaalse massiga ahela või kõrge peamise kromatograafilise piigi saamine on väärtuslik tõend, kuid ükski neist parameetritest ei kinnita eraldi molekuli täielikku identiteeti ega tootmisprotsessi kvaliteeti.

Vastutusest loobumine

Artikkel on puhtalt hariduslik ja teaduslik-informatiivne. Selles kirjeldatakse peptiidide keemia üldpõhimõtteid, tahkes faasis, lahuses ja vedelas faasis toimuvat sünteesi, kaitserühmade kasutamise strateegiaid, konjugeerimist, puhastamist, analüütilist iseloomustamist, tootmisprotsesse ning avaldatud uuringutest pärinevaid näiteid. See ei ole laboriprotokoll, tootmisjuhend, meditsiiniline nõuanne, annustamise või manustamise juhend ega ühegi konkreetse peptiiditoote kvaliteedisertifikaat. Eksperimentaalseid tulemusi tuleb tõlgendada, arvestades järjestusi, kasutatud meetodeid, protsessi ulatust, analüüsimeetodeid ja iga uuringu piiranguid.

Viited

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K. ja Perczel, A. (2016). 20–40 aminohappest koosnevate polüpeptiidide ja miniproteiinide bakteriaalne ekspressioon ja/või tahkfaasi peptiidisüntees: B-klassi GPCR-ligandide juhtumiuuring. „Current Protein & Peptide Science”, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S. ja Bode, J. W. (2020). Aspartimiidi tekke vältimine peptiidide sünteesi käigus, kasutades tsüanosulfurüüleide karboksüülhappe kaitserühmadena. Nature Communications, 11(1), artikkel 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C. ja Barany, G. (1992). Veiste pankrease trüpsiini inhibiitori (BPTI) ja kahe analoogi tahkes faasis süntees. Keemiline lähenemisviis disulfiidsidemete rolli hindamiseks valkude kokkupakkimisel ja stabiilsuses. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. PubMed-kirje
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D. ja Seeberger, P. H. (2019). Tahkfaasi peptiidisünteesi reaalajas jälgimine muutuva voodiga voolureaktori abil. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F. ja Becker, C. F. W. (2015). Peptiidhüdrasiidide tõhus süntees Peptidyl-Wang-TentaGel-vaikude otsese hüdrasinolüüsi teel. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Kiire voolupõhine peptiidide süntees. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F. ja Pentelute, B. L. (2017). Täielikult automatiseeritud voolupõhine meetod peptiidide kiirendatud sünteesiks. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G. ja Albericio, F. (2022). Vedelafaasiline peptiidisüntees (LPPS): kolmas laine peptiidide valmistamisel. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T. ja Fukui, T. (2012). Uus difenüülmetüülist tuletatud amiid-kaitsegrupp tõhusaks vedelafaasiliseks peptiidisünteesiks: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I. ja Kent, S. B. (1994). Valkude süntees loodusliku keemilise ligatsiooni teel. Science, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J. ja Collins, J. M. (2007). Ratsemiseerumise ja aspartimiidi tekke piiramine mikrolaineahjus kiirendatud Fmoc-tahkfaasi peptiidisünteesis. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E. ja Gaskell, S. J. (1989). Sünteetilise reniini substraadi peptiidis sisalduvate lisandite iseloomustamine kiire aatomipommitamise massispektromeetria ja hübriid-tandem-massispektromeetria abil. „Rapid Communications in Mass Spectrometry”, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G., & Crowther, J. B. (1995). Peptiidide kiralse puhtuse määramine: hüdrolüüs deuteeritud happes, derivatiseerimine Marfey reagendiga ja analüüs kõrge jõudlusega vedelikkromatograafia-elektrospray-ionisatsiooni-massispektromeetria abil. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Protsessi massiintensiivsus (PMI): praeguste peptiidide tootmisprotsesside terviklik analüüs annab teavet peptiidide sünteesi jätkusuutlikkuse kohta. Ajakiri „The Journal of Organic Chemistry”, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Peptiidide sünteesi ja puhastamise jätkusuutlikkuse väljakutsed: uurimis- ja arendustegevusest tootmiseni. Ajakiri „The Journal of Organic Chemistry”, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001