Syntéza peptidov: metóda na pevnej fáze, v roztoche a výrobné metódy

Syntéza peptidov je kontrolovaný proces tvorby aminokyselinových reťazcov so špecifickou sekvenciou. Pri chemickej syntéze sa vybrané aminokyseliny spájajú pomocou peptidových väzieb, pri súčasnom kontrolovaní iných reaktívnych skupín prítomných v týchto molekulách. Cieľom teda nie je samotné spojenie aminokyselín, ale získanie konkrétnej molekulárnej štruktúry s určitou sekvenciou, stereochémiou, štruktúrou koncov reťazca a – ak sa to vyžaduje – s dodatočnými štruktúrnymi vlastnosťami.

K hlavným metódam patria syntéza peptidov na pevnej fáze (SPPS), klasická syntéza v roztoku a novšie metódy syntézy peptidov v kvapalnej fáze (LPPS), ktoré využívajú rozpustné nosiče alebo molekulárne značkovače. Výskumné laboratóriá a výrobné závody môžu tiež kombinovať rôzne prístupy, pripravovať osobne kratšie fragmenty a následne ich spájať alebo využívať biologickú expresiu, ak je to vhodnejšie pre danú sekvenciu.

Porovnanie chemickej syntézy s bakteriálnou expresiou polypeptidov pozostávajúcich z 20 – 40 aminokyselinových zvyškov ukazuje dôležitý princíp: praktická voľba metódy výroby závisí od konkrétnej molekuly, jej sekvencie, sklonu k agregácii, požadovaných modifikácií, rozsahu výroby a analytických požiadaviek. [1]

Získanie požadovanej aminokyselinovej sekvencie je len jednou z etáp výroby peptidu.

Celý proces môže zahŕňať:

navrhovanie sekvencie → príprava stavebných blokov → ochrana funkčných skupín → spájanie → odstránenie chrániacich skupín → skladanie reťazca → štiepenie alebo spájanie fragmentov → konečné formovanie štruktúry → čistenie → potvrdenie totožnosti → analýza nečistôt → stanovenie obsahu → konečná charakteristika.

V prípade niektorých peptidov sú potrebné aj dodatočné kroky, ako je cyklizácia, tvorba disulfidových mostíkov, zvinutie, konjugácia alebo iné chemické úpravy.

Z tohto dôvodu správne zostavenie reťazca automaticky neznamená, že finálny materiál má správnu identitu, čistotu, stereochémiu, konformáciu, stabilitu alebo iné požadované vlastnosti.

Čo je to peptidová syntéza?

Tvorba špecifickej aminokyselinovej sekvencie

Peptid skladá sa z aminokyselinových zvyškov spojených peptidovými väzbami.

Cieľom syntézy peptidov je vytvorenie týchto väzieb vopred stanoveným spôsobom, často za súčasnej kontroly:

• druhu aminokyselín;
• poradia aminokyselín v sekvencii;
• stereochémii;
• N-koncové štruktúry;
• štruktúry C-konca;
• modifikácií bočných reťazcov;
• rozmistenia disulfidových mostíkov;
• cyklizácie;
• iných požadovaných štrukturálnych vlastností.

Sekvencia má zásadný význam, pretože rovnaké aminokyselinové zloženie môže viesť ku vzniku odlišných molekúl, ak sú aminokyseliny v inom poradí.

Tvrdenie, že daná molekula je „peptidom zloženým z piatich aminokyselín”, poskytuje teda len veľmi málo informácií o jej skutočnej štruktúre. Na správne opísanie molekuly treba poznať typ aminokyselín, ich poradie, stereochémiu, koncové skupiny a prípadné dodatočné úpravy.

Dva peptidy tak môžu mať úplne rovnaké aminokyselinové zloženie a napriek tomu byť odlišnými molekulárnymi štruktúrami.

Ďalšie rozdiely môžu vyplývať z modifikácií koncov reťazca, prítomnosti disulfidových mostíkov, cyklickej kostry, zmien v bočných reťazcoch alebo odlišnej stereochemickej konfigurácie.

Chemická syntéza peptidov zvyčajne využíva aminokyseliny, ktorých reaktívne skupiny boli selektívne chránené.

Dočasné chrániace skupiny umožňujú vytvorenie konkrétnej zamýšľanej chemickej väzby pri súčasnom obmedzení konkurenčných reakcií na iných miestach molekuly.

V ďalších plánovaných etapách syntézy sa tieto skupiny odstraňujú alebo menia.

Kontrolovaná reakcia namiesto spontánneho spájania

V základných chemických opisoch sa tvorba peptidovej väzby často prezentuje ako kondenzačná reakcia, pri ktorej sa dva aminokyseliny spoja za celkového uvoľnenia molekuly vody.

Takáto rovnica opisuje celkovú bilanciu reakcie.

Nemožno ho však stotožňovať so spôsobom, akým sa v praxi vykonáva kontrolovaná syntéza peptidov.

Samotné zmiešanie voľných aminokyselín by neumožnilo dôveryhodne určiť:

• ktorá aminoskupina má reagovať;
• ktorá karboxylová skupina má reagovať;
• ktorá aminokyselina má byť prvá;
• ktorý má byť druhý;
• začnú bočné reťazce reagovať;
• či sa zachová stereochémia;
• či nevzniknú mnohé nežiaduce produkty.

Preto sa v praktickej chemickej syntéze používajú kontrolované stratégie aktivácie a chránenia funkčných skupín.

Skupina pochádzajúca z karboksylovej skupiny sa zvyčajne aktivuje tak, aby mohla účinne reagovať s vybranou aminovou skupinou. Ochranné skupiny, poradie reakcií, chémia nosiča, spojovacie činidlá, prostredie rozpúšťadla a metódy izolácie spoločne pomáhajú nasmerovať reakciu smerom k požadovanému produktu.

Úspešná syntéza peptidov si preto vyžaduje kontrolu jednak chémie, ktorá má prebiehať, jednak tej, ktorej treba zabrániť.

Dobrým príkladom je vznik aspartimidu.

Vedci vyvinuli alternatívnu metódu ochrany karboxylovej skupiny, ktorej cieľom bolo obmedziť túto problematickú vedľajšiu reakciu počas syntézy peptidu. [2]

Výskum poukazuje na širší princíp chémie peptidov: zabránenie nežiadúcim molekulárnym premenám môže byť rovnako dôležité ako vytvorenie správnej peptidovej väzby.

Kedy možno považovať peptid za hotový?

Dokončenie tvorby lineárnej peptidovej kostry nemusí vždy znamenať koniec celej syntézy.

V závislosti od cieľovej molekuly môžu byť po zostavení reťazca potrebné ďalšie kroky.

Môžu zahŕňať:

• úplné odstránenie ochranných skupín;
• odštiepenie peptidu od pevného nosiča;
• odstránenie dočasných značiek;
• cyklizáciu;
• oxidácia;
• tvorba disulfidových mostíkov;
• vrásnenie;
• časovanie;
• modifikáciu koncov reťazca;
• čistenie;
• analytickú charakteristiku.

Niektoré peptydy vyžadujú relatívne málo dodatočných štrukturálnych zmien po zložení reťazca.

V prípade iných sú neskoršie etapy kľúčové.

Dobrým príkladom je syntéza bovinného pankreatického inhibítora trypsínu (BPTI). Vedci zostavili lineárnu sekvenciu, vyčistili materiál a potom získali zbalenú štruktúru obsahujúcu disulfidové mostíky. Podľa analýz a funkčných porovnaní prezentovaných v štúdii, konečný materiál s prirodzenou sekvenciou zodpovedal prírodnému proteínu v rozsahu skúmaných parametrov. [3]

Tento príklad ukazuje rozdiel medzi zostavením peptidovej kostry a získaním plne charakterizovanej konečnej molekulárnej formy.

Metóda, ktorá umožňuje získať správnu lineárnu sekvenciu, automaticky nepotvrdzuje:

• správneho skladania;
• správneho usporiadania disulfidových mostíkov;
• biologickej aktivity;
• stability;
• profilu znečistenia;
• vhodnosti na dané použitie.

Každá z týchto otázok si vyžaduje samostatné dôkazy.

Chemická syntéza, biologická expresia a kombinované metódy

Pri chemickej syntéze peptidov sa vopred pripravené molekulárne bloky spájajú v kontrolovaných laboratórnych reakciách.

Biologická expresia naproti tomu využíva bunkový aparát na vytvorenie zakódovanej aminokyselinovej sekvencie. Materiál sa potom musí získať, vyčistiť a v prípade potreby podrobiť ďalšiemu spracovaniu.

Obidve metódy môžu viesť k získaniu peptidov alebo polypeptidov, ale spájajú sa s inými možnosťami a obmedzeniami.

Chemická syntéza môže byť obzvlášť užitočná, keď sú potrebné:

• vybrané neštandardné aminokyseliny;
• chemické modifikácie na konkrétnych miestach;
• špecifické štruktúry koncov reťazca;
• izotopové ukazovatele;
• modifikácie peptidového kostry;
• iné vlastnosti, ktoré je ťažké dosiahnuť štandardnou biologickou expresiou.

Biologická expresia môže byť atraktívna v prípade vhodných dlhších sekvencií alebo určitých značkovacích stratégií, ale neodstraňuje problémy vyskytujúce sa v neskorších fázach výroby.

Stále je potrebné zohľadniť získavanie materiálu, refolding, spracovanie, nečistoty pochádzajúce z hostiteľského organizmu, čistenie a analytickú charakterizáciu.

Žiadna z metód nie je teda univerzálne najlepšia.

Pri porovnaní polypeptidov pozostávajúcich z 20–40 aminokyselinových zvyškov mali vplyv na výsledky syntézy v pevnej fáze aj na bakteriálnu expresiu nielen dĺžka sekvencie, ale aj jej náchylnosť k agregácii. [1]

Tieto pozorovania podporujú prístup, pri ktorom sa výrobná metóda volí pre konkrétnu molekulu.

Historické údaje týkajúce sa výnosnosti, nákladov, vybavenia a doby výroby by sa nemali považovať za univerzálne súčasné hodnoty, pretože technológie, reagencie, automatizácia, metódy čistenia a ekonomika výroby sa menia spolu s technologickým rozvojom.

Syntéza peptidov na pevnej fáze

Rastúci reťazec je pripojený k nerozpustnému nosiču

Pri solid-phase peptide synthesis (SPPS) zostáva rastúci peptidový reťazec počas po sebe nasledujúcich cyklov syntézy pripojený k nerozpustnému nosiču.

Nosným materiálom je väčšinou funkcionalizovaná polymérna živica.

Spojivo, čiže linker, spája peptid s nosičom a okrem iného ovplyvňuje spôsob neskoršieho uvoľnenia hotového reťazca a typ získanej koncovej skupiny.

Jednou z hlavných praktických výhod SPPS je jednoduchšie oddeľovanie materiálu.

Po ukončení určitého štádia reakcie sa rozpustné činidlá a mnohé rozpustné vedľajšie produkty dajú odstrániť premývaním, zatiaľ čo rastúci peptid zostáva naviazaný na pevnú fázu.

Vďaka tomu nie je potrebné po pridaní každého ďalšieho aminokyseliny izolovať a čistiť rastúci peptid ako samostatnú, voľnú zlúčeninu.

Toto pohodlie však môže viesť k dôležitému nedorozumeniu.

Preplachovanie živice neznamená, že boli odstránené všetky nesprávne peptidy.

Ak reťaz naviazaná na živicu nezreaguje počas jednej fázy spájania, môže naďalej zostať na nosiči.

V ďalších cykloch môže opäť reagovať a ďalej sa predlžovať.

V dôsledku toho môže vzniknúť delečná sekvencia, teda molekula líšiaca sa od cieľového peptidu absenciou jednej alebo viacerých aminokyselinových zvyškov.

Podobne chemicky modifikované alebo neúplne odblokované reťazce viazané na živicu sa môžu účastniť ďalších stupňov syntézy.

SPPS tak zjednodušuje separáciu rozpustných látok od materiálu viazaného na živicu.

Nezaručuje však dokonalú zhodu sekvencií.

Opakujúci sa cyklus odisťovania a spájania

Typická etapová syntéza SPPS zahŕňa opakovanie troch základných operácií:

odistenie → spájanie → preplachovanie.

Najprv sa odkrýva reaktívna aminoskupina nachádzajúca sa na konci rastúceho reťazca.

Potom sa do reťazca pripojí ďalšia chránená aminokyselina.

Rozpustné činidlá, prebytok aminokyseliny a mnohé reakčné produkty sa odstránia pred začiatkom nasledujúceho cyklu.

Opakovanie tohto procesu umožňuje budovať peptid po jednej aminokyselinovej zvyšku.

V klasickej SPPS sa C-koncový zvyšok zvyčajne naviaže na nosič ako prvý a potom sa reťaz predlžuje smerom k N-koncu.

Líši sa to od štandardnej ribozomálnej syntézy bielkovín, počas ktorej sa postupné aminokyseliny pripájajú na C-koniec rastúceho reťazca.

Konečné poradie aminokamin sa však môže zhodovať, napriek tomu, že smer a chémia procesu skladania sú odlišné.

Pojem „cyklus” by sa nemal chápať ako jedna univerzálna sada reakčných podmienok vhodná pre každý zvyšok a každú sekvenciu.

Priebeh reakcie môže závisieť od:

• stratégiu ochranných skupín;
• aminokyseliny;
• priestorových podmienok okolo miesta reakcie;
• druhu živice;
• linkera;
• dĺžky reťaze;
• agregácie;
• rozpúšťadla;
• spojovacej chémie;
• štruktúrne správanie sa rastúceho peptidu.

Reakcia, ktorá prebieha ľahko na začiatku syntézy, sa môže v neskoršom štádiu stať oveľa náročnejšou.

Preto monitorovanie procesu zostáva dôležité aj vo vysoko automatizovaných systémoch.

Prečo na vlastnostiach živice záleží?

Pevné médium nie je len pasívnym držiakom.

Jeho fyzikálne a chemické vlastnosti môžu priamo ovplyvniť priebeh reakcie.

Jedným z dôležitých parametrov je napučiavanie.

Ak živica správne napučiava v zvolenom prostredí rozpúšťadla, činidlá môžu ľahšie prenikať k reaktívnym miestam nachádzajúcim sa v celej štruktúre polyméru.

Nedostatočné napučanie alebo zmeny štruktúry živice môžu obmedzovať tento prístup.

Význam môžu mať aj:

• hustota obsadenia;
• architektúra polyméru;
• štruktúra linkera;
• odolnosť voči rozpúšťadlám;
• mechanická stabilita;
• pórovitosť;
• difúzne vlastnosti;
• interakcie medzi rastúcimi peptidovými reťazcami.

S predlžovaním dĺžky peptidu môžu jednotlivé reťazce taktiež vzájomne interagovať.

Agregácia na živici môže obmedziť prístup k reaktívnym miestam a viesť k neúplnému spájaniu alebo neúplnému dechráneniu.

To znamená, že sekvencia, ktorá sa správa správne na začiatku syntézy, sa môže s predlžovaním reťazca stávať čoraz náročnejšou.

Výskumníci vyvinuli prietokový reaktor s variabilným lôžkom, ktorý umožňoval monitorovanie napučiavania živice na základe meraní súvisiacich s tlakom. [4]

Výskum sa zaoberal agregáciou na živici a neúplnou tvorbou väzieb ako procesnými problémami, ktoré by za iných podmienok mohlo byť ťažké priamo pozorovať počas syntézy.

Ukazuje to, že monitorovanie fyzického správania nosiča môže poskytnúť informácie presahujúce samotnú registráciu pridávaných činidiel.

Na čo slúži Wangova živica?

Chémia Wangových linkerov sa bežne využíva v SPPS, keď sa po odštepení peptidu požaduje C-koniec vo forme karboxylovej kyseliny.

Peptid je pripojený prostredníctvom esterovej väzby, ktorú možno neskôr za vhodných podmienok štiepiť.

Iné systémy linkerov môžu byť vybrané vtedy, keď je potrebná odlišná štruktúra C-konca, napríklad amid.

Je dôležité rozlišovať medzi chémiou linkera a celým fyzickým nosičom.

Súvisiace Wangove linkery môžu byť zavádzané do rôznych polymérnych architektúr.

Takéto materiály nemusia mať identické:

• vlastnosti bobtnania;
• kapacity;
• znášanlivosť s rozpúšťadlami;
• mechanických vlastností;
• správanie počas reakcie.

Výskum s použitím nosičov peptidyl-Wang-TentaGel preukázal špecializovanú alternatívnu metódu prípravy peptidových hydrazidov, ktoré sú užitočnými medziproduktmi v peptidovej chémii. [5]

To neznamená, že štandardné odštepenie z Wangovej živice obvykle vedie ku vzniku peptidových hydrazidov.

Ukazuje však dôležitú zásadu:

nosič + linker + reakčné podmienky + chémia štiepenia spoločne určujú získaný produkt.

Syntéza SPPS v periodickom a prietokovom usporiadaní

SPPS sa môže vykonávať v klasických vsádzových nádobách alebo v systémoch, v ktorých reagencie pretekajú cez reaktor obsahujúci tuhý nosič.

Prietokové systémy môžu umožniť rýchlu výmenu činidiel a presnejšiu kontrolu chemického prostredia obklopujúceho živicu.

Štúdia z roku 2014 prezentovala rýchlu syntézu peptidov v prietokovom systéme s nepretržitým monitorovaním a aplikovala ju na niekoľko peptidov a malý proteín. [6]

V neskoršej automatizovanej štúdii sa opísalo oveľa rýchlejšie zostavovanie reťazcov, pričom sa pre analyzované príklady dosiahla čistota surového produktu a výťažok po izolácii porovnateľné s klasickou dávkovou syntézou. [7]

Tieto štúdie ukazujú možnosti konkrétnych systémov za určitých podmienok.

Nepreukazujú však, že každý peptid sa dá vyrábať rovnako rýchlo a s rovnakou kvalitou.

Čas potrebný na výrobu peptidu zahŕňa oveľa viac než len samotné zostavovanie reťazca.

Celý proces môže zahŕňať:

• príprava činidiel;
• príprava živice;
• spájanie;
• odistenie;
• premývanie;
• odštepovanie;
• spracovanie produktu;
• čistenie;
• odstraňovanie rozpúšťadiel;
• konečné formovanie štruktúry;
• analytické vyšetrenia;
• dokumentáciu.

Rýchla tvorba zväzkov je preto len jedným z prvkov celkovej efektívnosti výroby.

Syntéza v kvapalnej fáze

Čo znamená tento termín?

Termín „synteza peptydów v kvapalnej fáze” sa môže používať vo viacerých významoch.

V širšom zmysle to môže jednoducho znamenať syntézu peptidu prebiehajúcu v roztoku.

V odbornejšej literatúre sa však často rozlišuje:

1. klasickú peptidovú syntézu v roztoku;
2. syntéza peptidov na pevnej fáze;
3. novšie metódy LPPS, v ktorých rastúci reťazec obsahuje rozpustnú značku alebo nosič.

Toto rozlíšenie je dôležité, pretože sa mení spôsob separácie a získavania produktu.

Voľne rozpustený, chránený peptidový medziprodukt si môže vyžadovať izoláciu s využitím jeho vlastných fyzikálnych a chemických vlastností.

V prípade značeného polotovaru môže byť značkovač navrhnutý tak, aby uľahčoval zrážanie, extrakciu, zachytávanie na membráne alebo iný spôsob delenia.

Prehľad týkajúci sa LPPS jasne rozlišuje medzi klasickou syntézou v roztoku, SPPS a metódami využívajúcimi rozpustné značky. [8]

Publikácia je užitočná na utriedenie terminológie a metodológie.

Nemala by sa však interpretovať ako jeden experiment dokazujúci, že jedna z metód je najlepšia pre každý peptid.

Klasická peptidová syntéza v roztoku

Pri klasickej syntéze v roztvores sú chránené aminokyseliny, peptidové medziprodukty alebo fragmenty rozpustené v reakčnom prostredí namiesto toho, aby boli kovalentne pripojené k nerozpustnej živici.

Po ukončení reakcie sa príslušný medziprodukt môže izolovať, vyčistiť a v prípade potreby charakterizovať pred začatím ďalšieho stupňa.

Môže to prinášať určité výhody.

Výskumníci môžu:

• charakterizovať jednotlivé polotovary;
• výber čistiacej metódy podľa konkrétneho poloproduktu;
• optimalizovať jednotlivé procesy;
• pripravovať časti nezávisle;
• modifikovať trasu syntézy, keď konkrétny poloproizvod spôsobuje problémy.

Syntéza v roztoku však môže tiež znamenať významné problémy.

Spolu s predĺžením reťazca peptidov môžu:

• stávať sa slabšie rozpustným;
• zhrnúť;
• je ťažké ho kryštalizovať;
• vytvárať takmer príbuzné znečisťujúce látky;
• bude ťažké ho rozlíšiť;
• vyžaduje opakované izolovanie;
• vytvárať straty materiálu počas ďalších fáz spracovania.

Syntéza v roztoku teda nie je automaticky jednoduchšia ani ľahšie škálovateľná ako SPPS.

Jeho použiteľnosť závisí od konkrétnej sekvencie, stability poloproductov, rozpustnosti, dĺžky syntetického postupu, zachovania počas čistenia a účinnosti ďalších fáz izolácie.

Rozvoj označených stratégií LPPS čiastočne vyplýva z pokusov riešiť práve tieto problémy spojené so separáciou a manipuláciou s materiálom. [8]

Rozpustné značky spájajú návrh reakcií s návrhom separácie

V označenej LPPS má rastúci peptid dočasné molekulárne prepojenie navrhnuté tak, aby ovplyvňovalo jeho fyzikálne vlastnosti.

Znakátor môže umožniť udržanie dostatočnej rozpustnosti peptidu počas reakcie a následne uľahčiť jeho selektívne získanie späť.

V závislosti od technológie môže rozdeľovanie využívať:

• vyťahovanie;
• extrakciu;
• zadržanie na membráne;
• fázové správanie;
• iné vlastnosti vyplývajúce z prítomnosti značenia.

V jednej z experimentálnych stratégií sa na C-konci použila dlhodobo reaktívna ochranná skupina na prípravu peptidových amidov.

Opakovane sa vyskytujúce reakcie a etapy vylučovania umožnili vedcom pripraviť hydrofóbny peptid, ktorý v porovnaní s použitou metódou SPPS bol v nich ťažko získateľný uspokojivým spôsobom. [9]

To poukazuje na užitočnosť tejto konkrétnej stratégie pre analyzovanú sekvenciu.

Nie však dokazuje univerzálnej výhody syntézy označených znakov.

Symbol sa stáva súčasťou výrobného procesu a vyvoláva vlastné otázky:

• Ako efektívne sa pripája?
• Zmení sa priebeh reakcie?
• Ako spoľahlivo obnoviť označený polotovar?
• Viedol by k vzniku nových znečisťujúcich látok?
• Ako sa ho odstraňuje?
• Je možné potvrdiť úplné odstránenie?
• Aké analytické metódy potvrdzujú jeho absenciu v konečnom produkte?

Rozpustné značky preto treba považovať za funkčné prvky projektu procesu, a nie len za jednoduché štítky.

Porovnanie hlavných metód

Porovnanie predstavuje všeobecné princípy fungovania jednotlivých metód.

Neustanovuje, ktorá z nich poskytne najlepšiu výkonnosť, čistotu, náklady, environmentálnu vyváženosť alebo možnosti škálovania pre konkrétnu sekvenciu.

Tieto parametre je potrebné posudzovať na základe skutočnej molekuly a konkrétneho výrobného procesu. [4] [8] [9]

Zlúčenie fragmentov a hybridná výroba

Peptid nemusí byť vždy vytvorený v jednom nepretržitom procese, ktorý spočíva v pridávaní ďalších aminokyselinových pozostávok.

Alternatívna stratégia spočíva v samostatnom príprave kratších peptidových fragmentov a následnom ich spojení.

Hybridný proces môže napríklad využívať SPPS na získavanie jednotlivých fragmentov a chemikálie v roztoku na ich spojenie.

Stratégie fragmentárneho spracovania môžu obmedziť niektoré problémy spojené s veľmi dlhým štádiom syntézy.

Vydržajú však nové výzvy, ako napríklad:

• výber vhodného miesta pre spojenie;
• rozpustnosť fragmentov;
• aktivácia spojovacieho miesta;
• chemoselektivita;
• zachovanie stereotypov;
• Vedľajšie účinky;
• čistenie fragmentov;
• čistenie po ich spojení.

Dôležitým príkladom kontrolovaného spájania fragmentov je chemická ligácia.

V klasickej verzii peptidový tioester reaguje s druhým peptidom obsahujúcim N-koncovú cystín. Následné reorganizácie vedú k vytvoreniu správneho väzby v peptidovom skelete v mieste ligácie.

Prvotné štúdie ukázali možnosť získania po ligácii a fázovaní proteínu obsahujúceho diszaryčné mostíky. [10]

To potvrdzuje význam tejto stratégie spájania fragmentov.

To však neznamená, že akékoľvek dva nelakované peptidové fragmenty sa môžu spontánne spojiť.

Pracovné pomôcky a ochranné skupiny

Spájkovanie vytvára zamýšľané spojenie

Spárovanie je etapou reakcie, počas ktorej vzniká medzi vybranými jednotkami nový peptidový väzob.

Zvyčajne je skupina pochádzajúca z karbokyslového radu aktivovaná tak, aby mohla účinne reagovať s príslušnou aminovou skupinou.

Chemikália na aktiváciu musí byť v súlade s:

• rastúcou sekvenciou;
• dočasnými ochrannými skupinami;
• ochranným systémom pre bočné reťaze;
• stereochemie;
• nosičom alebo označením;
• prostredím rozpúšťadla;
• inými funkčnými skupinami prítomnými v molekule.

Účinné spájanie je obzvlášť dôležité v etapovej syntéze, pretože neúplná reakcia môže viesť k vzniku delečných sekvencií.

Ak jeden krok pridávania aminokyseliny nebude fungovať pre časť rastúcich reťazcov, tieto reťazce môžu zostať v systéme a zúčastňovať sa na ďalších cykloch.

Výsledkom môže byť molekula veľmi podobná cieľovému peptidu, ale bez jednej z jej zložiek.

Aj malé neefektívnosti sa teda môžu kumulovať počas mnohých fáz syntézy.

Jednoduchý matematický príklad dobre ilustruje tento problém.

Ak by každý z 50 nezávislých krokov podávania žiadosti mal 99 percentnú pravdepodobnosť úspechu, percento častíc, pre ktoré by všetky kroky skončili úspešne, by bolo:

0,99^50 ≈ 0,605

t.j. približne 61%.

Ide len o matematickú ilustráciu.

Nepredstavuje prognózu skutočnej čistoty ani účinnosti syntézy peptidu obsahujúceho 50 pozostávajúcich zložiek.

Skutočná výroba zahŕňa:

• rôzne výkonnosti spojenia v jednotlivých pozíciách;
• fázy demontáže;
• Vedľajšie účinky;
• odlišné podľa úrovne obtiažnosti;
• strategie opätovného spájania;
• straty počas odstraňovania;
• straty počas čistenia;
• iné procesné parametre.

Výpočet len ukazuje, prečo aj takmer bezvýznamná neefektívnosť jednotlivého kroku môže mať veľký význam pri viacstupňovej syntéze.

Ochranné skupiny kontrolujú miesto reakcie

Aminokyselina môže obsahovať niekoľko chemicky reaktívnych skupín.

Bez selektívnej kontroly by sa reakcie spájania mohli vyskytovať na nežiaducich miestach.

Ochranné skupiny dočasne blokujú vybrané aktívne miesta.

Aminokyselina používaná na predĺženie reťazca zvyčajne vyžaduje dočasnú ochranu, zatiaľ čo reaktívne bočné reťazce môžu vyžadovať fixáciu na mieste počas mnohých cyklov syntézy.

Spojenie s nosičom musí tiež prežiť tieto fázy až do plánovaného odpojenia.

Výber ochranných skupín teda ovplyvňuje celú stratégiu syntézy.

Je potrebné zohľadniť:

• spôsob ich implementácie;
• stabilita;
• spôsob odstránenia;
• zodpovedajúce iným ochranným skupinám;
• zodpovedajúceho nosiču;
• Vedľajšie účinky;
• vplyv konkrétnej sekvencie;
• Konečné podmienky odosobnenia.

Výskumy využívajúce ochranu založenú na cyjanosulfurylide sa týkali vzniku aspartimidu prostredníctvom zmeny spôsobu zabezpečenia karboksylovej skupiny. [2]

Výsledky ukazujú, že stratégia ochranných skupín ovplyvňuje nielen to, či sa plánovaná reakcia môže uskutočniť, ale aj to, aké nežiaduce reakcie sú možné.

FMOC, Boc a ortogonálna ochrana

FMOC a Boc patria medzi široko používané skupiny na ochranu aminových skupín.

V skutočnosti sa líšia spôsobom odstránenia.

FMOC sa zvyčajne odstraňuje za zásadných podmienok, zatiaľ čo Boc je citlivý na kyslé podmienky.

Tieto vlastnosti umožňujú ich používanie ako prvky širších ochranných stratégií.

V populárnej SPPS založenej na Fmoc sa dočasná ochrana N-konca Fmoc niekoľkokrát odstraňuje, zatiaľ čo vybrané ochranné skupiny bočných reťazcov a spojenie s živicou zostávajú nedotknuté až do ďalších štádií.

Iné stratégie môžu využívať rôzne kombinácie.

Významnou pojmom je ortogonálna ochrana.

Dve ochranné skupiny sú považované za ortogonalné, ak jednu možno selektívne odstrániť za podmienok, v ktorých druhá zostáva dostatočne stabilná na to, aby bolo možné pokračovať v syntéze.

Ortogonalita je teda praktickou reláciou chemickej zhody.

To neznamená, že každá zabezpečená skupina zostane úplne nezmenená po neobmedzenom počte expozícií všetkým podmienkam reakcie.

Vedľajšie účinky môžu aj naďalej existovať.

V štúdiách syntézy Fmoc boli opísané nielen vznik aspartimidu, ale aj nežiaduce stereochemické zmeny napriek predpokladanej celkovej selektívnosti ochranného strategického postupu. [11]

Stereochemia je súčasťou identity molekuly

Mnohé aminokyseliny majú chiralnú časť.

To znamená, že ich atómy môžu mať rôzne priestorové usporiadania zodpovedajúce rôznym stereochemickým formám.

Zmena konfigurácie jedného stereogenného centra môže viesť k vzniku inej štruktúry peptidu bez nutnosti zmeny jeho nominálnej hmotnosti.

Preto samotná masa nemôže potvrdiť úplnú identitu peptidu.

Epimeryzácia zvyčajne znamená zmenu konfigurácie jedného stereogénneho centra v molekule obsahujúcej niekoľko takýchto centier.

Racemizácia je tiež často diskutovaná v chemii peptidov v kontexte straty stereochemickej integrity aminokyselinových reťazcov.

Tieto zmeny sú dôležité, pretože molekulárne rozpoznávanie môže závisieť výrazne od priestorového usporiadania atómov.

Dva atómy s rovnakým prvkovým zložením a nominálnou hmotnosťou môžu teda správať sa inak, ak sa líšia podľa stereochemii.

V štúdii syntézy Fmoc podporovanej mikrovlnnou energiou sa zistilo, že niektoré zložky boli náchylné na neželané stereochemické zmeny za použitých podmienok. Modifikácia metódy obmedzila výskyt týchto reakcií. [11]

To neznamená, že vykurovanie definíciou poškodzuje všetky peptidy.

Správny návrh je taký, že zrýchlenie reakcie treba posudzovať spolu s selektívnosťou chemickou závislou od sekvencie.

Aspartýmid a iné príbuzné znečisťujúce látky

Vytvorenie aspartimidu je známa vedľajšia reakcia týkajúca sa určitých sekvencií obsahujúcich asparaginian.

Môže vzniknúť nežiaduci cyklický poloproizvodok, z ktorého sa následne vytvárajú zlúčeniny s zmenenou štruktúrou štruktúry alebo stereochemie.

Pravdepodobnosť tejto reakcie závisí od sekvencie a podmienok procesu.

Ďalšie znečisťujúce látky spojené so syntézou môžu vyplývať z:

• neúplné zosúladenie;
• neúplné odškodnenie;
• vytvárania delejčných sekvencií;
• reakcie bočných reťazcov;
• stereotypné zmeny;
• reakcie počas odstraňovania;
• okysličovanie;
• prehodnotenie zloženia;
• podmienok spracovania produktu;
• neúplné odstránenie ochranných skupín.

Niektoré znečisťujúce látky spôsobujú ľahko rozpoznateľnú zmenu hmotnosti molekúl.

Iné sú oveľa ťažšie rozlíšiť.

V analytických štúdiách syntetického peptidu, ktorý je substrátom renínu, bolo identifikovaných mnoho znečisťujúcich látok vrátane látok, ktoré vykazujú rovnakú zmenu hmotnosti, ale obsahujú modifikácie v rôznych pozíciách. [12]

Na rozlíšenie medzi nimi bola potrebná dodatočná štrukturálna analýza.

Výskumníci tiež považovali navrhované mechanizmy vzniku týchto znečisťujúcich látok za hypotézy.

Je to dôležitý rozdiel:

Určenie toho, čo je znečistenie, a dokázanie presného mechanizmu jeho vzniku sú dva odlišné vedecké otázky.

Neodporúča sa prezentovať pravdepodobný mechanizmus ako potvrdený len preto, že zodpovedá pozorovanému množstvu častíc.

Čistenie, skalovanie a kvalita výroby

Surowý produkt, čistený produkt a výkonnosť

Surowý peptid je materiál získaný pred ukončením príslušných fáz čistenia.

Môže obsahovať:

• cieľový peptid;
• delečné sekvencie;
• materiál nie je úplne odpojený;
• upravené sekvencie;
• ostatky činidiel;
• produkty súvisiace s odstraňovaním štiepneho materiálu;
• huba;
• rozpúšťadlá;
• ostatné zložky vznikajúce počas procesu.

Čistenie má za cieľ oddeliť správny peptid od tejto zmesi.

Musí sa jasne rozlišovať tri pojmy:

čistota surového produktu – meraný obsah materiálu pred konečným čistením;

výkon upraveného alebo izolovaného produktu – množstvo získaného cieľového materiálu vzhľadom na určenú počiatočnú alebo teoretickú hodnotu;

koncová čistota – zloženie izolovaného materiálu určený pomocou konkrétnej analytickej metódy.

Tieto pojmy nie sú zameniteľné.

Tento proces môže viesť k vzniku veľkého množstva surového materiálu, ale umožňuje získať relatívne malé množstvo upraveného produktu.

Iný proces môže produkovať menej surového materiálu, ale vyznačuje sa vysokou selektivitou pri vytváraní cieľového produktu.

Rovnako vysoká analytická čistota nemusí znamenať vysokú výrobnú účinnosť.

V štúdiách rýchlej syntézy prietoku sa správne hlásili oddelene čistota surového materiálu a výkonnosť po izolácii. [7]

Kromatografia rozdeľuje zložky, ale neodpovedá na všetky otázky

Vysoko výkonná kvapalinová chromatografia v reverznom systéme fáz (RP-HPLC) je široko používaná na analýzu a čistenie peptidov.

Rôzne molekuly pôsobia rôznymi spôsobmi na statickú a pohyblivú fázu.

V príslušných podmienkach tieto rozdiely umožňujú rozdelenie zložiek zmesi.

Analytická a preparatívna chromatografia majú spoločné, ale odlišné použitie.

Analytická HPLC slúži predovšetkým na analýzu zloženia vzorky.

Preparatívna HPLC sa používa na fyzické zber rozdelených zložiek.

Chromatogram môže poskytovať množstvo hodnotných informácií.

Rozsiahle hlavné vrcholové body alebo vysoký percentuálny podiel ich plochy však nemožno považovať za úplnú molekulárnu charakteristiku.

Výsledky chromatografie závisia okrem iného od:

• typ stĺpika;
• pohyblivá fáza;
• gradientu;
• teploty;
• metódy detekcie;
• dĺžka vlnovej dĺžky;
• príprava vzorky;
• spôsob integrácie pikov;
• rozlíšenie;
• vlastnosti znečisťujúcich látok.

Dva zlúčeniny môžu potenciálne eluovať súčasne.

Niektoré zložky vzorky môžu tiež reagovať rôzne na použitý detektor.

Preto vysoká povrchová čistota v HPLC nie je synonymom pre úplné potvrdenie molekulárnej identity.

Výskumy izobárnych peptidových znečistení a analýzy charytnej štruktúry ukazujú, prečo môžu byť potrebné doplnkové analytické metódy. [12] [13]

Analytická metóda musí zodpovedať konkrétnemu štruktúrnemu otázke.

Identita, čistota a obsah znamenajú rôzne veci

V charakteristike peptidov sú mimoriadne dôležité tri pojmy.

Identita odpovedá na otázku:

Je v vzorke prítomná zamýšľaná molekula?

Čistota odpovedá na otázku:

Aké ďalšie zložky sa nachádzajú v vzorke alebo ktorá časť meraného signálu zodpovedá hlavnej zložke?

Obsah odpovedá na otázku:

Koľko reálneho peptidu sa nachádza v vzorke?

Na tieto otázky nie je vždy možné odpovedať jediným meraním.

Materiál obsahujúci peptid môže tiež obsahovať:

• vodu;
• proti;
• huba;
• zvyšky rozpúšťadiel;
• iné komponenty spojené s procesom;
• znečistenie.

Celková hmotnosť odváženej látky teda nemusí zodpovedať hmotnosti samotného peptidu.

Podobne, zhoda nameraného hmotnostného pomeru s teoretickou hodnotou nepotvrdzuje:

• kompletného aminokyselinového reťazca;
• správnej komunikácie jednotlivých zostatkov;
• stereochemická integrita;
• rozmistenia disulfidových mostíkov;
• krútenie;
• neexistencie izobárnych znečisťujúcich látok.

Masová spektrometría môže poskytovať silné dôkazy o hmotnosti molekuly.

Tandemná hmotnostná spektrometría a iné štruktúrne techniky môžu poskytovať ďalšie informácie o sekvencii.

Kiralické metódy umožňujú analyzovať stereochemické otázky, ktorých výsledky nemožno zistiť bežným meraním hmotnosti.

V jednom analytickom výskume sa dokonca zohľadnila aj raziu vznikajúca počas prípravy vzorky. To poukazuje na ďalšiu dôležitú zásadu: samotná analytická procedúra môže spôsobiť artefakty, ak nebude vhodne navrhnutá. [13]

Zvracanie a aktívnosť môžu vyžadovať osobitné potvrdenie

V prípade štruktúrne obmedzených peptidov a malých proteínov môže správna sekvencia a molekulová hmotnosť stále nestačiť na potvrdenie plánovanej konečnej štruktúry.

Ďalšie otázky môžu zahŕňať:

• Zostali vytvorené správne disiarčné mostíky?
• Prijala sačka očakávaná konformácia?
• Je cyklácia úplná?
• Existujú aj štrukturálne izoméry?
• Preukazuje syntetická molekula očakávanú aktivitu v rámci konkrétneho experimentálneho testu?

V štúdii syntézy BPTI sa použili niekoľko analytických a biofyzikálnych metód spolu s hodnotením inhibície tripsínu. [3]

Celkové výsledky podporovali zhodu syntetického materiálu s prírodnou sekvenciou v rámci skúmaných kritérií.

Test aktivity však odpovedá na konkrétnu funkčnú otázku.

Nepodáva analýzu znečisťujúcich látok.

Podobná aktivita v jednom teste však nepreukazuje úplnej zhodnosti všetkých biologických, štrukturálnych alebo produkčných vlastností.

Skalovanie výroby mení viac než len množstvo materiálu

Zvýšenie rozsahu výroby nezahŕňa len proporcionálne zvýšenie množstva všetkých činidiel.

Fyzikálne procesy sa môžu správať inak v prípade väčších rozmerov.

Mohli by to byť:

• miešanie;
• výmena tepla;
• distribúcia činidiel;
• difúzia;
• zrážanie živice;
• tlak;
• filtračné zariadenie;
• ekonomika rozpúšťadiel;
• vyťahovanie;
• rozpustnosť polotovarov;
• prepravu hmoty;
• možnosti systému čistenia.

Tieto faktory môžu mať vplyv na priebeh reakcie aj na vznik znečisťujúcich látok.

Čistenie v neskorších fázach môže tiež stať sa záťažou pre celú výrobu.

Zvýšenie rýchlosti syntézy má obmedzený význam, ak systém čistenia nie je schopný účinne oddeliť vznikajúce znečisťujúce látky alebo získať produkt požadovanej kvality.

V priemyselnej analýze zahŕňajúcej 40 procesov syntézy peptidov od 14 farmaceutických spoločností sa posúdilo spotreba materiálov počas syntézy, čistenia a izolácie. [14]

Výskum ukazuje, prečo je potrebné hodnotenie výroby vykonávať pre celý proces.

To však neznamená, že každá továreň, postup alebo výrobná technológia dosahuje rovnaké výsledky.

Kvalita výroby je výsledkom mnohých kontrolných mechanizmov

Vykazateľná výroba peptidov vyžaduje viac ako len získanie jedného uspokojivého analytického výsledku.

Kontrolovaný proces obvykle zahŕňa niekoľko súvisiacich prvkov:

definovaná cieľová molekula → vhodné východiskové materiály → kontrolovaná syntéza → kontrolované čistenie → správne odber vzoriek → validovaná alebo vhodná pre účel analýzy → dokumentácia o sérii.

Dokumentácia strany spája analytické výsledky s materiálom, ktorý sa skutočne vyhotovil.

Certifikát analýzy (COA) sumarizuje vybrané výsledky analýz danej dávky.

Jeho informačná hodnota závisí od:

• druhu vykonaných testov;
• použité metódy;
• užitočnosti týchto metód;
• špecifikácie;
• identifikácie vzorky;
• možnosti sledovania strany;
• potvrdenie toho, že vykázané výsledky sa týkajú konkrétneho materiálu.

Jednotlivá hodnota definovaná ako „čistota” sama o sebe nemôže potvrdiť:

• plnej molekulárnej identity;
• obsah peptidu;
• stereochemická integrita;
• úroveň rezíduí rozpúšťadiel;
• obsah vody;
• zloženie protilátok;
• mikrobiologické vlastnosti;
• krútenie;
• biologickej aktivity;
• užitočnosti pre konkrétny účel.

Vhodný súbor analýz závisí od zamýšľaného použitia materiálu.

Peptid, ktorý sa používa ako analytický referenčný materiál, testovací činidlo používané v bunkovom experimente a látka nachádzajúca sa v štádiu farmaceutického vývoja môžu vyžadovať odpovede na ďalšie kvalitatívne otázky.

Analytické dôkazy preto treba interpretovať v jasne vymedzenom kontexte a nie ako univerzálne potvrdenie kvality.

Hodnotenie environmentálneho vyváženia musí zahŕňať celý proces

Syntéza peptidov môže vyžadovať veľké množstvo rozpúšťadiel a činidiel.

Ocenenie environmentálneho vplyvu by preto malo zohľadňovať oveľa viac ako samotný proces zberu odpadu.

K významným prvkom môžu patriť:

• vypracovanie stavebných blokov;
• spojovacie činidlá;
• aktivačné činidlá;
• premývanie;
• odštepovanie;
• príprava produktu;
• kromatografia;
• výmena rozpúšťadiel;
• izolácia;
• sušenie;
• Riadenie odpadov.

Zníženie environmentálneho zaťaženia môže vyžadovať súčasné zlepšenie niekoľkých krokov.

V publikovanej analýze týkajúcej sa výroby peptidov sa hovorilo o problémoch spojených s syntézou, ako aj s čistením a poukázalo sa na potrebu zlepšiť celý procesný návrh. [15]

Ako prognostická publikácia nepredstavuje kontrolovaný priamy porovnanie, ktoré by dokázalo, že jedna konkrétna technológia je vždy ekologickejšie.

Podobne:

rýchlejšia syntéza neznamená automaticky ekologickejšiu syntézu,

a menšie spotreba rozpúšťadiel počas samotnej syntézy neznamená automaticky menší vplyv celého výrobného procesu.

Ekologické porovnania si vyžadujú používanie jednotných hraníc analýzy a najlepšie by mali odhadovať spotrebu zdrojov v súvislosti s určitým množstvom izolovaného a charakterizovaného konečného produktu.

Často kladené otázky

1. Ako sa syntéza peptidov v pevnom stave líši od syntézy v kvapalnej fáze?

V syntéze v pevnom stave rastúci peptid zostáva pripojený k nerozpustnej nosiči, zatiaľ čo v klasickej syntéze v roztoku zostáva peptidový produkt rozpustený a zvyčajne musí byť získaný na základe svojich fyzikálnych a chemických vlastností. V užšom zmysle má rozpustný rastúci reťazec v LPPS navyše rozpustný marker alebo nosič, ktorý uľahčuje neskoršie rozdelenie. Výskumy syntézy označených peptidov ukazujú jednu z možností spájania chemikálie v roztoku s získaním po následnom odstraňovaní, zatiaľ čo literatúra týkajúca sa LPPS odlišuje tieto riešenia od klasickej syntézy v roztoku aj od SPPS. Žiadna metóda definíciou nie je optimálna pre každý peptid. Základný rozdiel sa týka spôsobu fyzikálneho vedenia a odstraňovania rastúceho reťazca počas ďalších fáz syntézy. [8] [9]

2. Prečo sa počas syntézy peptidov môžu vyskytnúť znečistenia?

Znečistenia môžu vzniknúť tým, že zamýšľané reakcie nie sú vždy realizované kvantitatívne a iné funkčné skupiny môžu byť zapojené do nežiaducich reakcií. Neúplné spájanie môže viesť k deľným sekvenciám, neúplné odpojenie môže narušiť ďalšie skladanie reťazca a niektoré sekvencie sú náchylné na stereochemické zmeny, vznik aspartimidu, oxidácia, prepojenie alebo vedľajšie produkty spojené s odpojením. Analýza syntézy Fmoc a štruktúrna analýza syntetických peptidových znečistení dokumentujú niekoľko takýchto príkladov. [11] [12] Častosť a význam jednotlivých znečistení závisí od sekvencie a procesu, a preto automatizácia syntézy by sa nemala považovať za úplný nedostatok chemických chýb.

3. Akú úlohu hrá živica pri syntéze peptidov?

Peptidová živica udržiava rastúci peptid, zatiaľ čo rozpustné činidlá a mnohé vedľajšie produkty môžu byť odstránené medzi jednotlivými fázami syntézy. To výrazne zjednodušuje opakované skladanie reťazca, ale peptidová živica nie je len mechanickým uchom. Jej zmäkčenie, stupeň obsadenia, štruktúra polyméru, kompatibilita s rozpúšťadlami a dostupnosť reakčných miest môžu ovplyvniť účinnosť preniknutia činidiel do pripojeného peptidu. V štúdiách s reaktormi s variabilným zložením sa monitorovala správanie peptidu počas analýzy agregácie a účinnosti spájania. [4] Takéto monitorovanie neodstraňuje chyby sekvencií, ale poukazuje na to, prečo môže byť fyzikálny stav peptidu významnou procesnou premennou.

4. Čo slúži živica Wanga pri syntéze peptidov?

Nosiči typu Wang sú všeobecne spojené s prípravou peptidov uvoľňovaných po adekvátnom odpojení z C-konca vo forme karboksylovej kyseliny. Presný konečný produkt však závisí od ligáru, štruktúry nosiča a použitej chemickej reakcie na odpojenie, a nie len od názvu živice. Výskumníci tiež predstavili špecializovanú metódu premeny materiálu peptydyl-Wang-TentaGel na peptidové hydrazidy, ktoré môžu slúžiť ako užitočné syntetické poloprodukty. [5] Alternatívna reakcia nezmení význam štandardného odpojenia z Wanga. Naopak, poukazuje na to, prečo je pri predikcii produktu potrebné analyzovať celý systém nosiča a podmienky reakcie.

5. Stavia SPPS peptid od N-konca alebo od C-konca?

Klasická etapová SPPS sa zvyčajne začína pripojením koncového C-fragmentu k nosiču, po čom sa reťazec predĺži smerom k N-koncu. Tento smer je opačný ako pri štandardnom predĺžení reťazca na ribozóme, kde proteín rastie pridaním ďalších aminokyselín do C-konca. Syntéza BPTI je príkladom využitia zabezpečených stavebných blokov a nosiča na predchádzanie neskorému uvoľneniu, čisteniu a falšovaniu produktu. [3] Existujú však špecializované stratégie peptidovej chemie využívajúce iné riešenia, a preto je budovanie od C-po N-konca potrebné definovať ako klasický prístup SPPS a nie ako absolútnu zásadu všetkých metód syntézy.

6. Prečo sú potrebné ochranné skupiny?

Aminokyseliny často obsahujú niekoľko reaktívnych funkčných skupín. Ochranné skupiny dočasne zabraňujú reakcii vybraných miest a ponechávajú príslušné miesto dostupné v konkrétnom štádiu syntézy. To pomáha kontrolovať poradie a spôsob spájania zvyškov. Bez správnej ochrany konkurenčné reakcie by mohli viesť k vzniku zložitých zmesí alebo produktov s zmenenou štruktúrou. Výskumy týkajúce sa syntézy aspartimidu ukázali, že zmena chemickej ochrany karboksylovej skupiny môže obmedziť dôležitú vedľajšiu reakciu v sledovaných sekvenciách. [2] Ochranné skupiny nezaručujú ideálny priebeh syntézy, ale zabezpečujú selektívnu chemickú kontrolu, ktorá musí zostať v súlade so všetkými relevantnými etapami procesu.

7. Aký je rozdiel medzi Fmoc a Boc?

Fmoc a Boc sú široko používané dočasné ochranné skupiny pre aminovú skupinu, ale reagujú aj na iné chemické podmienky. Fmoc sa zvyčajne odstraňuje v zásadnom prostredí, zatiaľ čo Boc je citlivý na kyseliny. Táto rozdielnosť má vplyv na spôsob ich spájania s ochrannými reťazcami bocznými, linkermi a ostatnými fázami syntézy. Syntéza založená na Fmoc je široko používaná v súčasnej SPPS, ale štúdie tiež poukazujú na možnosť vzniku sekvenčne závislých vedľajších reakcií za takýchto podmienok. [11] V praxi je preto užitočnejšie porovnávať celé stratégie ochrany a ich zhodu s danou sekvenciou než zvažovať iba názvy dvoch ochranných skupín.

8. Čo znamená ortogonálna ochrana?

Ortogonalná ochrana znamená, že jednu ochrannú skupinu možno odstrániť za podmienok, za ktorých ostatná potrebná ochranná skupina zostáva dostatočne stabilná na to, aby bolo možné pokračovať v syntéze. To umožňuje odhaľovať rôzne reaktívne miesta v jednotlivých štádiách. Táto koncepcia má zásadný význam pri kontrolovanej syntéze zložitých peptidov. Ortogonalita však závisí od podmienok a nie je absolútna: opakované expozície, charakter sekvencie a parametre reakcie môžu stále viesť k vedľajším reakciám. Štúdie alternatívnych spôsobov ochrany karbokyslových skupín ukazujú, ako možno strategiu ochrany modifikovať s cieľom kontrolovať zložitú peptidovú chemiu. [2]

9. Čo je sekvencia delecyjna?

Delečný reťazec je peptid bez jednej alebo niekoľkých zložiek prítomných v zamýšľanom cieľovom reťazci. Môže vzniknúť vtedy, keď etapa spájania aminokyselín neprebieha úplne, ale neaktívny reťazec zostáva pripojený k nosiču a zúčastňuje sa na ďalších cykloch. Pretože nesprávny reťazec stále zostáva viazaný na živicu, bežné odstraňovanie ho nemusí odstrániť. Výskumy monitorovania SPPS v reálnom čase poukazujú na neúplné vytváranie amidových väzieb ako na významný procesný problém. [4] Delečný reťazec je teda problémom súvisiacim s štruktúrou a identitou produktu a nie len zvyškom činidla.

10. Môžu dva peptidové znečisťujúce látky mať rovnakú molekulovú hmotnosť?

Áno. Rôzne molekulárne štruktúry môžu mať identickú alebo nerozoznateľnú nominálnu hmotnosť. Z tohto dôvodu samotná zhoda hmotnosti neodhaluje úplnú identitu častice. V štúdiách syntetického peptidu, ktorý je substrátom renínu, bolo identifikovaných izobárne zložky znečisťujúcich látok, v ktorých sa modifikácie vyskytovali v rôznych pozíciách. Dehydrovanie a tandemová hmotnostná spektrometría poskytli ďalšie štrukturálne informácie. [12] Tento príklad poukazuje na to, prečo zhoda pozorovanej hmotnosti s očakávanou nezvláda sama osebe potvrdiť správnu sekvenciu, väzbu, stereochemickú stabilitu ani absenciu štrukturálne podobných izomérov.

11. Čo sú epimériza a racemizácia pri syntéze peptidov?

Epimerizácia a racemizácia sú nežiaduce zmeny stereochemickej konfigurácie. Môžu sa vyskytnúť bez zmeny nominálnej aminokyselinovej sekvencie alebo molekulovej hmotnosti, a preto bežný meranie hmotnosti nemusí odhaľovať žiadnu štrukturálnu odchýlku. V štúdiách syntézy Fmoc s mikrovlnnou podporou bolo identifikovaných zbytky citlivé na zmeny stereochemickej konfigurácie a preukázalo sa, že modifikácia reakčných podmienok môže tieto procesy obmedziť. [11] Riziko závisí od molekulárneho bloku, sekvencie a procesných podmienok. Stereochemická kvalita si preto vyžaduje analytické metódy schopné vyhodnotiť konfiguráciu a nemôže sa vyvodiť iba z hmotnosti molekuly.

12. Čo je tvorba aspartimidu?

Vytvorenie aspartimidu je nežiaduca reakcia spojená s určitými sekvenciami obsahujúcimi aspartin. Vytvorenie cyklického vedľajšieho produktu môže viesť k ďalším produktom s zmenenou štruktúrou štruktúry alebo stereochemie, čo znižuje účinnosť a komplikuje čistenie. Výskumníci analyzovali alternatívne stratégie ochrany navrhnuté na obmedzenie tejto reakcie v vybraných peptidoch a proteínach. [2] Výsledky neukazujú na jedno univerzálne riešenie pre všetky sekvencie obsahujúce aspartin. Skôr poukazujú na to, prečo návrh syntézy a stratégie kontroly znečisťovania musí zohľadňovať špecifické chemické vlastnosti danej sekvencie.

13. Dokazuje vysoká čistota HPLC správnu identitu peptidu?

Nie. Čistota HPLC opisuje vzorku v rámci konkrétneho chromatografického rozdelenia, použitého detektora a spôsobu analýzy údajov. Vysoký podiel hlavnej plochy vzorky môže byť hodnotným dôkazom toho, že vzorka je dominovaná jedným chromatograficky rozdeliteľným zložkou, ale sám o sebe neodhaluje úplnú molekulárnu identitu. Spoločné znečisťujúce látky, stereoizoméry a ďalšie varianty môžu vyžadovať ďalšie techniky. V analýze chirálnych peptidov sa použil špeciálne navrhnutý proces, ktorý zohľadňoval aj stereochemické zmeny vznikajúce počas prípravy vzorky. [13] Identita a čistota by sa preto mali považovať za súvisiace, ale samostatné analytické otázky.

14. Znamená výkonnosť čisteného produktu to isté čo čistota?

Nie. Výkon upraveného alebo izolovaného produktu určuje množstvo cieľového materiálu získaného vzhľadom na definovanú počiatočnú alebo teoretickú množinu. Čistota opisuje však zloženie získaného materiálu podľa definovanej analytickej metódy. Syntéza môže viesť k získaniu pomerne malého množstva produktu s veľmi vysokou čistotou alebo veľkého množstva surového materiálu obsahujúceho značné množstvo znečisťujúcich látok. V štúdiách automatickej cyklickej syntézy sa čistota surového produktu a výkon po izolácii hlásia oddelene. [7] Oddelenie týchto parametrov zabraňuje mylnému posudzovaniu veľkej hodnoty jedného z nich ako dôkazu o veľkej hodnote druhého.

15. Môžu sa dlhé peptidy vyrábať spojením kratších fragmentov?

Áno. V rámci fragmentovej stratégie môžu byť kratšie peptidové segmenty pripravované oddelene a následne spojené pomocou vhodnej chemikálie. Ligácia chemickou väzbou bola dôležitým príkladom, v ktorom nechránené peptidové fragmenty boli spojené takým spôsobom, že vznikol prirodzený väzobný mechanizmus peptidového skeletu, a následne sa získalo deformované proteín. [10] To neznamená, že akékoľvek peptidové fragmenty sa môžu spontánne spájať. Je potrebné zohľadniť štruktúru fragmentov, chemickú väzbu, výber miesta spojenia, rozpustnosť, stereochemickú štruktúru a požiadavky na čistenie. Ligácia fragmentov je teda alternatívnou stratégiou návrhu syntézy a nie automatickým riešením problémov s dlhými peptidmi.

16. Eliminuje rýchlejšia automatizovaná syntéza potrebu čistenia?

Nie. Rýchlejšie automatizované alebo plynné syntézy skracujú čas určitých štádií syntézy, ale nevedia, že každá vzniknutá molekula má zamýšlenú štruktúru. V štúdiách rýchlej plynnej syntézy sa stále používal surový materiál a následné čistenie, pričom v ďalších prácach týkajúcich sa automatizácie sa samostatne porovnávala čistota surového materiálu a výkonnosť po izolácii. [6] [7] Dobré výsledky systému pre sledované sekvencie však nezaručujú rovnaké výsledky pre každý nový cieľ. Rýchla syntéza stále musí byť spojená s vhodným čistením, potvrdením identity, analýzou znečisťujúcich látok a konečnou charakterizáciou.

17. Prečo je zvýšenie rozsahu výroby komplikovanejšie ako výroba väčšej série?

Zvýšenie rozsahu mení fyzikálne a chemické podmienky, a nie len množstvo materiálu. Miešanie, výmena tepla, tuhnutie živice, distribúcia činidiel, tlak, filtrácia, manipulácia rozpúšťadlami, rozpustnosť polotovarov a možnosti čistenia môžu fungovať inak pri vyššej objeme výroby. V priemyselnej analýze bolo 40 peptidových procesov samostatne hodnotených pri analýze syntézy, čistenia a izolácie počas analýzy spotreby materiálu. [14] Výsledky ukazujú, prečo je výrobu potrebné považovať za kompletný proces. Skalovateľná metóda musí opakovane viesť k získaniu charakterizovaného materiálu vo všetkých fázach, a nie len väčšieho množstva surového peptidu.

18. Je peptid pripravený hneď po zložení správnej sekvencie?

Nie nevyhnutne. Skladanie reťazca vytvára skelet sekvencie len v rozsahu, v akom to potvrdzujú proces a analytické údaje. V závislosti od molekuly môžu byť naďalej potrebné odstraňovanie väzieb, odpojenie, cyklácia, oxidácia, tvorba disiarčných mostov, faldovanie, konjugácia, čistenie a charakterizácia. Syntéza BPTI predstavuje dobrý príklad procesu, v ktorom po skladaní lineárnej sekvencie nasledovalo čistenie a vytvorenie deformovanej štruktúry obsahujúcej disiarčné mosty. [3] Výraz „ready peptide” by sa teda mal týkať molekulárnej formy požadovanej v danom vedeckom kontexte a nie len konca postupu pridávania aminokyselín.

19. Potvrdzuje správna molekulová hmotnosť správnu sekvenciu peptidu?

Nie. Zhoda hmotnosti molekuly je hodnotným dôkazom, ale sama o sebe nemôže potvrdiť úplný reťazec ani molekulárnu štruktúru. Izobárne štruktúry môžu mať rovnakú hmotnosť, pričom rôzne stereochemické rozdiely nemusia vôbec spôsobiť zmenu hmotnosti molekuly. Výskumy znečisťujúcich látok syntetických peptidov ukázali, že rozlišovanie štruktúrne odlišných zložiek môže vyžadovať tandemový hmotnostný spektrometr a ďalšie analýzy. [12] V prípade otázok týkajúcich sa stereochemickej integrity môžu byť potrebné aj chirálnické metódy. [13] Hmotnosť molekuly sa preto musí považovať za jeden z prvkov hodnotenia identity, a nie za jej úplné potvrdenie.

20. Prečo by sa čistenie malo považovať za súčasť výroby peptidu a nie len za konečný prídavok?

Čistenie rozhoduje o tom, či sa cieľový peptid môže účinne oddeliť od delecionálnych sekvencií, vedľajších produktov, zvyškov činidiel, štruktúrne podobných znečistení a ďalších zložiek vzniknutých počas syntézy. Metóda umožňujúca veľmi rýchlu výrobu veľkého množstva surového materiálu môže byť aj naďalej nepraktická, ak nie je možné účinne získať požadovaný produkt požadovanej kvality. Z tohto dôvodu priemyselné analýzy peptidových procesov zahŕňajú syntézu, čistenie a izoláciu spolu. [14] Efektívnosť výroby sa nakoniec má hodnotiť na základe množstva a vlastností izolovaného konečného materiálu, a nie iba rýchlosťou syntézy.

Obmedzenia pri porovnávaní metód syntézy peptidov

Pri interpretácii štúdií porovnávajúcich technológie výroby peptidov je potrebné mať na pamäti niekoľko dôležitých obmedzení.

Prvým dôvodom je, že sekvencia výrazne ovplyvňuje obtiažnosť syntézy. Metóda, ktorá funguje pre jeden peptid, nemusí fungovať rovnako pre iný. Agregácia, hydrofobnosť, aminokyselinový zloženie, dĺžka, tendencia vytvárať sekundárne štruktúry a náchylnosť na vedľajšie reakcie môžu meniť správanie procesu. [1] [4]

Po druhé, čistota surového materiálu, účinnosť po izolácii, konečná čistota a obsah peptidu sú rôznymi parametrami. Porovnávanie metód výhradne na základe jedného z nich môže poskytnúť neúplný obraz o účinnosti výroby. [7]

Po tretie, rýchle skladanie reťazca neznamená rýchlu výrobu celého materiálu. Odstraňovanie, čistenie, izolácia, konečné tvarovanie štruktúry, analytické testy a dokumentácia tiež ovplyvňujú celkovú dobu výroby. [6] [7]

Po štvrté, analytická čistota závisí od použitej metódy. HPLC, hmotnostná spektrometría, tandemová hmotnostná spektrometría a chiralná analýza zodpovedajú na rôzne otázky. Jeden analytický výsledok nemusí potvrdiť úplnú štrukturálnu identitu. [12] [13]

Po piate, rozsah ovplyvňuje zachovanie procesu. Výsledky laboratórnej syntézy nemožno automaticky preniesť na priemyselnú výrobu bez posúdenia miešania, transportu hmoty, možností čistenia, spotreby materiálov a ďalších faktorov závislých od rozsahu. [14]

Po šieste, historické ekonomické porovnania môžu časom stratiť svoju aktuálnosť. Náklady na činidlá, úroveň automatizácie, technológie expresie, vybavenie na čistenie, odstraňovanie rozpúšťadiel a výrobné infraštruktúry sa neustále vyvíjajú. Staršie analýzy nákladov môžu mať naďalej vedecký význam, ale nemusí to odrážať aktuálnu ekonomiku trhu. [1]

Po siedme, environmentálne porovnania si vyžadujú jednotné hranice analýzy. Hodnotenie spotreby rozpúšťadiel počas samotného procesu skladovania reťazca pri súčasnom obchádzaní čistenia a izolácie môže viesť k mylým záverom týkajúcim sa vyváženia procesu. [14] [15]

Konečne samotná názov metódy nepredurčuje kvalitu produktu. SPPS, syntéza v roztoku, LPPS, ligácia fragmentov a biologická exprese môžu viesť k získaniu materiálu vysokej kvality, ak je proces vhodne navrhnutý a kontrolovaný. Žiadna z týchto metód však automaticky nezaručuje správnu identitu, čistotu, stereochemickú stabilitu, zafalcovanie alebo vhodnosť pre konkrétne použitie.

Zhrnutie

Syntézu peptidov je najlepšie chápať ako kontrolovaný proces tvorby molekúl, a nie jednoducho ako vytváranie peptidových väzieb.

Cieľom je vytvoriť konkrétnu aminokyselinovú sekvenciu pri súčasnom kontrole spôsobu spájania reťazcov, chémie ochranných skupín, stereochémie, vedľajších reakcií a všetkých ďalších štrukturálnych požiadaviek.

Syntéza peptidov v pevnom stave udržiava rastúci reťazec na nerozpustnom nosiči, vďaka čomu sa opakované fázy spájania a preplachovania dajú dobre automatizovať. Výhody spojené s opakovaným skladaním však neodstraňujú problémy ako neúplné reakcie, agregácia, sekvenčné delecie alebo reakcie závislé od sekvencie. [4] [6] [7]

Klasická syntéza v roztoku udržiava peptidové poloprodukty v tekutej fáze a môže poskytovať väčšiu flexibilitu pri izolácii a charakterizácii jednotlivých vedľajších produktov. Viacnásobná separácia a zhoršujúca sa rozpustnosť však môžu predstavovať závažné obmedzenia.

Metódy syntézy v kvapalnej fáze s rozpustnými značkovacími látkami sa snažia spojiť chemickú syntézu v roztoku s navrhnutými stratégiami pre získavanie materiálu. Môžu teda predstavovať ďalšiu možnosť v prípade sekvencií a výrobných problémov, pre ktoré klasická SPPS nie je optimálna. [8] [9]

Dlhšie alebo mimoriadne zložité molekuly možno tiež pripravovať tak, že sa pridávajú fragmenty, vrátane natívnej chemickej ligácie, namiesto toho, aby sa spoliehalo výhradne na nepretržitú pridávanie ďalších aminokyselinových reťazcov. [10]

Bez ohľadu na zvolenú metódu syntézy zostávajú účinnosť spájania a chemická štruktúra ochranných skupín kľúčovými faktormi, pretože malé neúčinnosti a vedľajšie reakcie sa môžu kumulovať počas ďalších fáz syntézy. Vytvorenie aspartimidu, delečné sekvencie a stierové zmeny ukazujú, prečo samotná zamýšľaná sekvencia nepopisuje všetko, čo môže vzniknúť počas procesu. [2] [11] [12]

Práca tiež nekončí so zložením reťazca.

Čistenie rozhoduje o tom, či sa cieľový produkt môže oddeliť od ostatných zložiek.

Následne zodpovedajú vhodne zvolené analytické metódy osobitným otázkam týkajúcim sa identity, čistoty, obsahu, stereochemii, konformity a – ak je to relevantné – funkčnej aktivity. [3] [12] [13]

Zvýšenie rozsahu výroby prináša ďalšie problémy týkajúce sa transportu materiálu, zachovania živice, spotreby rozpúšťadiel, filtrácie, možnosti čistenia, opakovateľnosti procesu a jeho environmentálnom vplyve. Z tohto dôvodu by priemyselná validácia procesu mala zahŕňať syntézu, čistenie a izoláciu, a nie sa sústreďovať výlučne na rýchlosť reagovania. [14] [15]

Najdôležitejšou zásadou je nasledovná:

Účinná výroba peptidu si vyžaduje kontrolu celého procesu – od molekulárneho návrhu a vytvárania väzieb až po čistenie a štrukturálnu charakterizáciu. Získanie reťazca s očakávanou nominálnou hmotnosťou alebo vysokým hlavným chromatografickým bodom predstavuje cenný dôkaz, ale žiadny z týchto parametrov sám o sebe neposkytuje potvrdenie úplnej molekulárnej identity ani kvality výrobného procesu.

Zrieknutie sa zodpovednosti

Článok má výhradne edukatívny a vedecko-informačný charakter. Popisuje všeobecné princípy peptidovej chémie, syntézy v pevnom stave, syntézy v rozpúšťadle a v kvapalnej fáze, stratégie ochranných skupín, väzby, čistenie, analytická charakteristika, výrobné procesy a príklady pochádzajúce z publikovaných štúdií. Nie je to laboratórne protokoly, výrobné návody, lekárske poradenstvo, návod k dávkovaniu ani podávaniu ani certifikát kvality akéhokoľvek konkrétneho peptidového produktu. Výsledky experimentov treba interpretovať v kontexte sekvencie, použitých metód, rozsahu procesu, analytických techník a obmedzení jednotlivých štúdií.

Odkazy

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K., & Perczel, A. (2016). Bakteriálna expresia a/alebo syntéza peptidov v pevných fázach s dĺžkou 20 až 40 aminokyselín, prípadová štúdia ligandov GPCR triedy B. Current Protein & Peptide Science, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Prevencia tvorby aspartimidu počas syntézy peptidov pomocou cyanosulfurylidov ako skupín chrániacich kyselinu karboxylovú. Nature Communications, 11(1), článok 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). Syntéza pečeňového trypsinového inhibítora (BPTI) a dvoch analógov v pevných fázach. Chemický prístup na vyhodnotenie úlohy disulfidových mostov pri skladaní a stabilite proteínov. Medzinárodný časopis pre výskum peptidov a proteínov, 40(3–4), 194–207. Rekord v databáze PubMed
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). Monitorovanie syntézy peptidu v pevných fázach v reálnom čase pomocou reaktora s variabilným tokom. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F., & Becker, C. F. W. (2015). Efektívna výroba peptidových hydrazidov prostredníctvom priamej hydrazinolýzy peptidyl-Wang-TentaGel živíc. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Rýchla peptidová syntéza založená na tokovej rýchlosti. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2017). Plne automatizovaný prístup založený na toku pre urýchlenú syntézu peptidov. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G., & Albericio, F. (2022). Lítiová fázová syntéza peptidov (LPPS): Tretia vlna pri príprave peptidov. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T. & Fukui, T. (2012). Nová amínová ochranná skupina odvodená z difenylmetylu pre účinnú syntézu peptidov v kvapalinovej fáze: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., & Kent, S. B. (1994). Syntéza proteínov pomocou natívnej chemickej ligácie. Veda, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Limitácia racemizácie a tvorby aspartimidu pri mikrovlnnej syntéze peletových peptidov s Fmoc. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Charakterizácia nečistôt v syntetickom peptide ako substrátu renínu pomocou hmotnostnej spektrometrógie s rýchlym bombardovaním atómov a hybridnej tandemovej hmotnostnej spektrometrógie. Rapidné komunikácie v hmotnostnom spektrometrii, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G. & Crowther, J. B. (1995). Určenie chirálnej čistoty peptidov: hydrolýza v deuterovanom kyslíku, derivatizácia reagentom Marfeyho a analýza pomocou vysoko výkonnej kvapalinovej chromatografie s elektropráškovým ionizáciou a hmotnostovou spektrometriou. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Intenzita procesu (PMI): komplexná analýza súčasných výrobných procesov peptidov informuje o udržateľnosti syntézy peptidov. Journal of Organic Chemistry, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Výzvy udržateľnosti v syntéze a čistení peptidov: od výskumu a vývoja po výrobu. Journal of Organic Chemistry, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001