Syntéza peptidov: metóda na pevnej fáze, v roztoche a výrobné metódy

Syntéza peptidov je kontrolovaný proces tvorby aminokyselinových reťazcov so špecifickou sekvenciou. Pri chemickej syntéze sa vybrané aminokyseliny spájajú pomocou peptidových väzieb, pri súčasnom kontrolovaní iných reaktívnych skupín prítomných v týchto molekulách. Cieľom teda nie je samotné spojenie aminokyselín, ale získanie konkrétnej molekulárnej štruktúry s určitou sekvenciou, stereochémiou, štruktúrou koncov reťazca a – ak sa to vyžaduje – s dodatočnými štruktúrnymi vlastnosťami.

K hlavným metódam patria syntéza peptidov na pevnej fáze (SPPS), klasická syntéza v roztoku a novšie metódy syntézy peptidov v kvapalnej fáze (LPPS), ktoré využívajú rozpustné nosiče alebo molekulárne značkovače. Výskumné laboratóriá a výrobné závody môžu tiež kombinovať rôzne prístupy, pripravovať osobne kratšie fragmenty a následne ich spájať alebo využívať biologickú expresiu, ak je to vhodnejšie pre danú sekvenciu.

Porovnanie chemickej syntézy s bakteriálnou expresiou polypeptidov pozostávajúcich z 20 – 40 aminokyselinových zvyškov ukazuje dôležitý princíp: praktická voľba metódy výroby závisí od konkrétnej molekuly, jej sekvencie, sklonu k agregácii, požadovaných modifikácií, rozsahu výroby a analytických požiadaviek. [1]

Získanie požadovanej aminokyselinovej sekvencie je len jednou z etáp výroby peptidu.

Celý proces môže zahŕňať:

navrhovanie sekvencie → príprava stavebných blokov → ochrana funkčných skupín → spájanie → odstránenie chrániacich skupín → skladanie reťazca → štiepenie alebo spájanie fragmentov → konečné formovanie štruktúry → čistenie → potvrdenie totožnosti → analýza nečistôt → stanovenie obsahu → konečná charakteristika.

V prípade niektorých peptidov sú potrebné aj dodatočné kroky, ako je cyklizácia, tvorba disulfidových mostíkov, zvinutie, konjugácia alebo iné chemické úpravy.

Z tohto dôvodu správne zostavenie reťazca automaticky neznamená, že finálny materiál má správnu identitu, čistotu, stereochémiu, konformáciu, stabilitu alebo iné požadované vlastnosti.

Čo je to peptidová syntéza?

Tvorba špecifickej aminokyselinovej sekvencie

Peptid skladá sa z aminokyselinových zvyškov spojených peptidovými väzbami.

Cieľom syntézy peptidov je vytvorenie týchto väzieb vopred stanoveným spôsobom, často za súčasnej kontroly:

• druhu aminokyselín;
• poradia aminokyselín v sekvencii;
• stereochémii;
• N-koncové štruktúry;
• štruktúry C-konca;
• modifikácií bočných reťazcov;
• rozmistenia disulfidových mostíkov;
• cyklizácie;
• iných požadovaných štrukturálnych vlastností.

Sekvencia má zásadný význam, pretože rovnaké aminokyselinové zloženie môže viesť ku vzniku odlišných molekúl, ak sú aminokyseliny v inom poradí.

Tvrdenie, že daná molekula je „peptidom zloženým z piatich aminokyselín”, poskytuje teda len veľmi málo informácií o jej skutočnej štruktúre. Na správne opísanie molekuly treba poznať typ aminokyselín, ich poradie, stereochémiu, koncové skupiny a prípadné dodatočné úpravy.

Dva peptidy tak môžu mať úplne rovnaké aminokyselinové zloženie a napriek tomu byť odlišnými molekulárnymi štruktúrami.

Ďalšie rozdiely môžu vyplývať z modifikácií koncov reťazca, prítomnosti disulfidových mostíkov, cyklickej kostry, zmien v bočných reťazcoch alebo odlišnej stereochemickej konfigurácie.

Chemická syntéza peptidov zvyčajne využíva aminokyseliny, ktorých reaktívne skupiny boli selektívne chránené.

Dočasné chrániace skupiny umožňujú vytvorenie konkrétnej zamýšľanej chemickej väzby pri súčasnom obmedzení konkurenčných reakcií na iných miestach molekuly.

V ďalších plánovaných etapách syntézy sa tieto skupiny odstraňujú alebo menia.

Kontrolovaná reakcia namiesto spontánneho spájania

V základných chemických opisoch sa tvorba peptidovej väzby často prezentuje ako kondenzačná reakcia, pri ktorej sa dva aminokyseliny spoja za celkového uvoľnenia molekuly vody.

Takáto rovnica opisuje celkovú bilanciu reakcie.

Nemožno ho však stotožňovať so spôsobom, akým sa v praxi vykonáva kontrolovaná syntéza peptidov.

Samotné zmiešanie voľných aminokyselín by neumožnilo dôveryhodne určiť:

• ktorá aminoskupina má reagovať;
• ktorá karboxylová skupina má reagovať;
• ktorá aminokyselina má byť prvá;
• ktorý má byť druhý;
• začnú bočné reťazce reagovať;
• či sa zachová stereochémia;
• či nevzniknú mnohé nežiaduce produkty.

Preto sa v praktickej chemickej syntéze používajú kontrolované stratégie aktivácie a chránenia funkčných skupín.

Skupina pochádzajúca z karboksylovej skupiny sa zvyčajne aktivuje tak, aby mohla účinne reagovať s vybranou aminovou skupinou. Ochranné skupiny, poradie reakcií, chémia nosiča, spojovacie činidlá, prostredie rozpúšťadla a metódy izolácie spoločne pomáhajú nasmerovať reakciu smerom k požadovanému produktu.

Úspešná syntéza peptidov si preto vyžaduje kontrolu jednak chémie, ktorá má prebiehať, jednak tej, ktorej treba zabrániť.

Dobrým príkladom je vznik aspartimidu.

Vedci vyvinuli alternatívnu metódu ochrany karboxylovej skupiny, ktorej cieľom bolo obmedziť túto problematickú vedľajšiu reakciu počas syntézy peptidu. [2]

Výskum poukazuje na širší princíp chémie peptidov: zabránenie nežiadúcim molekulárnym premenám môže byť rovnako dôležité ako vytvorenie správnej peptidovej väzby.

Kedy možno považovať peptid za hotový?

Dokončenie tvorby lineárnej peptidovej kostry nemusí vždy znamenať koniec celej syntézy.

V závislosti od cieľovej molekuly môžu byť po zostavení reťazca potrebné ďalšie kroky.

Môžu zahŕňať:

• úplné odstránenie ochranných skupín;
• odštiepenie peptidu od pevného nosiča;
• odstránenie dočasných značiek;
• cyklizáciu;
• oxidácia;
• tvorba disulfidových mostíkov;
• vrásnenie;
• časovanie;
• modifikáciu koncov reťazca;
• čistenie;
• analytickú charakteristiku.

Niektoré peptydy vyžadujú relatívne málo dodatočných štrukturálnych zmien po zložení reťazca.

V prípade iných sú neskoršie etapy kľúčové.

Dobrým príkladom je syntéza bovinného pankreatického inhibítora trypsínu (BPTI). Vedci zostavili lineárnu sekvenciu, vyčistili materiál a potom získali zbalenú štruktúru obsahujúcu disulfidové mostíky. Podľa analýz a funkčných porovnaní prezentovaných v štúdii, konečný materiál s prirodzenou sekvenciou zodpovedal prírodnému proteínu v rozsahu skúmaných parametrov. [3]

Tento príklad ukazuje rozdiel medzi zostavením peptidovej kostry a získaním plne charakterizovanej konečnej molekulárnej formy.

Metóda, ktorá umožňuje získať správnu lineárnu sekvenciu, automaticky nepotvrdzuje:

• správneho skladania;
• správneho usporiadania disulfidových mostíkov;
• biologickej aktivity;
• stability;
• profilu znečistenia;
• vhodnosti na dané použitie.

Každá z týchto otázok si vyžaduje samostatné dôkazy.

Chemická syntéza, biologická expresia a kombinované metódy

Pri chemickej syntéze peptidov sa vopred pripravené molekulárne bloky spájajú v kontrolovaných laboratórnych reakciách.

Biologická expresia naproti tomu využíva bunkový aparát na vytvorenie zakódovanej aminokyselinovej sekvencie. Materiál sa potom musí získať, vyčistiť a v prípade potreby podrobiť ďalšiemu spracovaniu.

Obidve metódy môžu viesť k získaniu peptidov alebo polypeptidov, ale spájajú sa s inými možnosťami a obmedzeniami.

Chemická syntéza môže byť obzvlášť užitočná, keď sú potrebné:

• vybrané neštandardné aminokyseliny;
• chemické modifikácie na konkrétnych miestach;
• špecifické štruktúry koncov reťazca;
• izotopové ukazovatele;
• modifikácie peptidového kostry;
• iné vlastnosti, ktoré je ťažké dosiahnuť štandardnou biologickou expresiou.

Biologická expresia môže byť atraktívna v prípade vhodných dlhších sekvencií alebo určitých značkovacích stratégií, ale neodstraňuje problémy vyskytujúce sa v neskorších fázach výroby.

Stále je potrebné zohľadniť získavanie materiálu, refolding, spracovanie, nečistoty pochádzajúce z hostiteľského organizmu, čistenie a analytickú charakterizáciu.

Žiadna z metód nie je teda univerzálne najlepšia.

Pri porovnaní polypeptidov pozostávajúcich z 20–40 aminokyselinových zvyškov mali vplyv na výsledky syntézy v pevnej fáze aj na bakteriálnu expresiu nielen dĺžka sekvencie, ale aj jej náchylnosť k agregácii. [1]

Tieto pozorovania podporujú prístup, pri ktorom sa výrobná metóda volí pre konkrétnu molekulu.

Historické údaje týkajúce sa výnosnosti, nákladov, vybavenia a doby výroby by sa nemali považovať za univerzálne súčasné hodnoty, pretože technológie, reagencie, automatizácia, metódy čistenia a ekonomika výroby sa menia spolu s technologickým rozvojom.

Syntéza peptidov na pevnej fáze

Rastúci reťazec je pripojený k nerozpustnému nosiču

Pri solid-phase peptide synthesis (SPPS) zostáva rastúci peptidový reťazec počas po sebe nasledujúcich cyklov syntézy pripojený k nerozpustnému nosiču.

Nosným materiálom je väčšinou funkcionalizovaná polymérna živica.

Spojivo, čiže linker, spája peptid s nosičom a okrem iného ovplyvňuje spôsob neskoršieho uvoľnenia hotového reťazca a typ získanej koncovej skupiny.

Jednou z hlavných praktických výhod SPPS je jednoduchšie oddeľovanie materiálu.

Po ukončení určitého štádia reakcie sa rozpustné činidlá a mnohé rozpustné vedľajšie produkty dajú odstrániť premývaním, zatiaľ čo rastúci peptid zostáva naviazaný na pevnú fázu.

Vďaka tomu nie je potrebné po pridaní každého ďalšieho aminokyseliny izolovať a čistiť rastúci peptid ako samostatnú, voľnú zlúčeninu.

Toto pohodlie však môže viesť k dôležitému nedorozumeniu.

Preplachovanie živice neznamená, že boli odstránené všetky nesprávne peptidy.

Ak reťaz naviazaná na živicu nezreaguje počas jednej fázy spájania, môže naďalej zostať na nosiči.

V ďalších cykloch môže opäť reagovať a ďalej sa predlžovať.

V dôsledku toho môže vzniknúť delečná sekvencia, teda molekula líšiaca sa od cieľového peptidu absenciou jednej alebo viacerých aminokyselinových zvyškov.

Podobne chemicky modifikované alebo neúplne odblokované reťazce viazané na živicu sa môžu účastniť ďalších stupňov syntézy.

SPPS tak zjednodušuje separáciu rozpustných látok od materiálu viazaného na živicu.

Nezaručuje však dokonalú zhodu sekvencií.

Opakujúci sa cyklus odisťovania a spájania

Typická etapová syntéza SPPS zahŕňa opakovanie troch základných operácií:

odistenie → spájanie → preplachovanie.

Najprv sa odkrýva reaktívna aminoskupina nachádzajúca sa na konci rastúceho reťazca.

Potom sa do reťazca pripojí ďalšia chránená aminokyselina.

Rozpustné činidlá, prebytok aminokyseliny a mnohé reakčné produkty sa odstránia pred začiatkom nasledujúceho cyklu.

Opakovanie tohto procesu umožňuje budovať peptid po jednej aminokyselinovej zvyšku.

V klasickej SPPS sa C-koncový zvyšok zvyčajne naviaže na nosič ako prvý a potom sa reťaz predlžuje smerom k N-koncu.

Líši sa to od štandardnej ribozomálnej syntézy bielkovín, počas ktorej sa postupné aminokyseliny pripájajú na C-koniec rastúceho reťazca.

Konečné poradie aminokamin sa však môže zhodovať, napriek tomu, že smer a chémia procesu skladania sú odlišné.

Pojem „cyklus” by sa nemal chápať ako jedna univerzálna sada reakčných podmienok vhodná pre každý zvyšok a každú sekvenciu.

Priebeh reakcie môže závisieť od:

• stratégiu ochranných skupín;
• aminokyseliny;
• priestorových podmienok okolo miesta reakcie;
• druhu živice;
• linkera;
• dĺžky reťaze;
• agregácie;
• rozpúšťadla;
• spojovacej chémie;
• štruktúrne správanie sa rastúceho peptidu.

Reakcia, ktorá prebieha ľahko na začiatku syntézy, sa môže v neskoršom štádiu stať oveľa náročnejšou.

Preto monitorovanie procesu zostáva dôležité aj vo vysoko automatizovaných systémoch.

Prečo na vlastnostiach živice záleží?

Pevné médium nie je len pasívnym držiakom.

Jeho fyzikálne a chemické vlastnosti môžu priamo ovplyvniť priebeh reakcie.

Jedným z dôležitých parametrov je napučiavanie.

Ak živica správne napučiava v zvolenom prostredí rozpúšťadla, činidlá môžu ľahšie prenikať k reaktívnym miestam nachádzajúcim sa v celej štruktúre polyméru.

Nedostatočné napučanie alebo zmeny štruktúry živice môžu obmedzovať tento prístup.

Význam môžu mať aj:

• hustota obsadenia;
• architektúra polyméru;
• štruktúra linkera;
• odolnosť voči rozpúšťadlám;
• mechanická stabilita;
• pórovitosť;
• difúzne vlastnosti;
• interakcie medzi rastúcimi peptidovými reťazcami.

S predlžovaním dĺžky peptidu môžu jednotlivé reťazce taktiež vzájomne interagovať.

Agregácia na živici môže obmedziť prístup k reaktívnym miestam a viesť k neúplnému spájaniu alebo neúplnému dechráneniu.

To znamená, že sekvencia, ktorá sa správa správne na začiatku syntézy, sa môže s predlžovaním reťazca stávať čoraz náročnejšou.

Výskumníci vyvinuli prietokový reaktor s variabilným lôžkom, ktorý umožňoval monitorovanie napučiavania živice na základe meraní súvisiacich s tlakom. [4]

Výskum sa zaoberal agregáciou na živici a neúplnou tvorbou väzieb ako procesnými problémami, ktoré by za iných podmienok mohlo byť ťažké priamo pozorovať počas syntézy.

Ukazuje to, že monitorovanie fyzického správania nosiča môže poskytnúť informácie presahujúce samotnú registráciu pridávaných činidiel.

Na čo slúži Wangova živica?

Chémia Wangových linkerov sa bežne využíva v SPPS, keď sa po odštepení peptidu požaduje C-koniec vo forme karboxylovej kyseliny.

Peptid je pripojený prostredníctvom esterovej väzby, ktorú možno neskôr za vhodných podmienok štiepiť.

Iné systémy linkerov môžu byť vybrané vtedy, keď je potrebná odlišná štruktúra C-konca, napríklad amid.

Je dôležité rozlišovať medzi chémiou linkera a celým fyzickým nosičom.

Súvisiace Wangove linkery môžu byť zavádzané do rôznych polymérnych architektúr.

Takéto materiály nemusia mať identické:

• vlastnosti bobtnania;
• kapacity;
• znášanlivosť s rozpúšťadlami;
• mechanických vlastností;
• správanie počas reakcie.

Výskum s použitím nosičov peptidyl-Wang-TentaGel preukázal špecializovanú alternatívnu metódu prípravy peptidových hydrazidov, ktoré sú užitočnými medziproduktmi v peptidovej chémii. [5]

To neznamená, že štandardné odštepenie z Wangovej živice obvykle vedie ku vzniku peptidových hydrazidov.

Ukazuje však dôležitú zásadu:

nosič + linker + reakčné podmienky + chémia štiepenia spoločne určujú získaný produkt.

Syntéza SPPS v periodickom a prietokovom usporiadaní

SPPS sa môže vykonávať v klasických vsádzových nádobách alebo v systémoch, v ktorých reagencie pretekajú cez reaktor obsahujúci tuhý nosič.

Prietokové systémy môžu umožniť rýchlu výmenu činidiel a presnejšiu kontrolu chemického prostredia obklopujúceho živicu.

Štúdia z roku 2014 prezentovala rýchlu syntézu peptidov v prietokovom systéme s nepretržitým monitorovaním a aplikovala ju na niekoľko peptidov a malý proteín. [6]

V neskoršej automatizovanej štúdii sa opísalo oveľa rýchlejšie zostavovanie reťazcov, pričom sa pre analyzované príklady dosiahla čistota surového produktu a výťažok po izolácii porovnateľné s klasickou dávkovou syntézou. [7]

Tieto štúdie ukazujú možnosti konkrétnych systémov za určitých podmienok.

Nepreukazujú však, že každý peptid sa dá vyrábať rovnako rýchlo a s rovnakou kvalitou.

Čas potrebný na výrobu peptidu zahŕňa oveľa viac než len samotné zostavovanie reťazca.

Celý proces môže zahŕňať:

• príprava činidiel;
• príprava živice;
• spájanie;
• odistenie;
• premývanie;
• odštepovanie;
• spracovanie produktu;
• čistenie;
• odstraňovanie rozpúšťadiel;
• konečné formovanie štruktúry;
• analytické vyšetrenia;
• dokumentáciu.

Rýchla tvorba zväzkov je preto len jedným z prvkov celkovej efektívnosti výroby.

Syntéza v kvapalnej fáze

Čo znamená tento termín?

Termín „synteza peptydów v kvapalnej fáze” sa môže používať vo viacerých významoch.

V širšom zmysle to môže jednoducho znamenať syntézu peptidu prebiehajúcu v roztoku.

V odbornejšej literatúre sa však často rozlišuje:

1. klasickú peptidovú syntézu v roztoku;
2. syntéza peptidov na pevnej fáze;
3. novšie metódy LPPS, v ktorých rastúci reťazec obsahuje rozpustnú značku alebo nosič.

Toto rozlíšenie je dôležité, pretože sa mení spôsob separácie a získavania produktu.

Voľne rozpustený, chránený peptidový medziprodukt si môže vyžadovať izoláciu s využitím jeho vlastných fyzikálnych a chemických vlastností.

V prípade značeného polotovaru môže byť značkovač navrhnutý tak, aby uľahčoval zrážanie, extrakciu, zachytávanie na membráne alebo iný spôsob delenia.

Prehľad týkajúci sa LPPS jasne rozlišuje medzi klasickou syntézou v roztoku, SPPS a metódami využívajúcimi rozpustné značky. [8]

Publikácia je užitočná na utriedenie terminológie a metodológie.

Nemala by sa však interpretovať ako jeden experiment dokazujúci, že jedna z metód je najlepšia pre každý peptid.

Klasická peptidová syntéza v roztoku

Pri klasickej syntéze v roztvores sú chránené aminokyseliny, peptidové medziprodukty alebo fragmenty rozpustené v reakčnom prostredí namiesto toho, aby boli kovalentne pripojené k nerozpustnej živici.

Po ukončení reakcie sa príslušný medziprodukt môže izolovať, vyčistiť a v prípade potreby charakterizovať pred začatím ďalšieho stupňa.

Môže to prinášať určité výhody.

Výskumníci môžu:

• charakterizovať jednotlivé polotovary;
• dobierać metodę oczyszczania do konkretnego półproduktu;
• optymalizować poszczególne przemiany;
• przygotowywać fragmenty niezależnie;
• modyfikować trasę syntezy, gdy określony półprodukt sprawia problemy.

Synteza w roztworze może jednak wiązać się również ze znacznymi trudnościami.

Wraz z wydłużaniem łańcucha peptydy mogą:

• stawać się słabo rozpuszczalne;
• agregować;
• być trudne do krystalizacji;
• tworzyć blisko spokrewnione zanieczyszczenia;
• być trudne do rozdzielenia;
• wymagać wielokrotnej izolacji;
• powodować straty materiału podczas kolejnych etapów obróbki.

Synteza w roztworze nie jest więc automatycznie prostsza ani łatwiejsza do skalowania niż SPPS.

Jej przydatność zależy od konkretnej sekwencji, stabilności półproduktów, rozpuszczalności, długości trasy syntezy, zachowania podczas oczyszczania oraz efektywności kolejnych etapów izolacji.

Rozwój znakowanych strategii LPPS częściowo wynika z prób rozwiązania właśnie tych problemów związanych z separacją i obsługą materiału. [8]

Rozpuszczalne znaczniki łączą projektowanie reakcji z projektowaniem separacji

W znakowanej LPPS rosnący peptyd posiada tymczasowe przyłączenie molekularne zaprojektowane w taki sposób, aby wpływać na jego właściwości fizyczne.

Znacznik może umożliwiać utrzymanie wystarczającej rozpuszczalności peptydu podczas reakcji, a następnie ułatwiać jego selektywne odzyskanie.

W zależności od technologii rozdzielanie może wykorzystywać:

• wytrącanie;
• ekstrakcję;
• zatrzymywanie na membranie;
• zachowanie fazowe;
• inne właściwości wynikające z obecności znacznika.

W jednej z eksperymentalnych strategii wykorzystano długołańcuchową grupę ochronną na C-końcu do przygotowania amidów peptydowych.

Powtarzane reakcje i etapy wytrącania umożliwiły badaczom przygotowanie hydrofobowego peptydu, który w zastosowanym przez nich porównaniu był trudny do uzyskania zadowalająco metodą SPPS. [9]

Pokazuje to przydatność tej konkretnej strategii dla analizowanej sekwencji.

Nie dowodzi jednak uniwersalnej przewagi syntezy znakowanej.

Znacznik staje się elementem procesu produkcyjnego i rodzi własne pytania:

• Jak skutecznie jest przyłączany?
• Czy zmienia przebieg reakcji?
• Jak niezawodnie można odzyskać znakowany półprodukt?
• Czy prowadzi do powstawania nowych zanieczyszczeń?
• W jaki sposób jest usuwany?
• Czy można potwierdzić całkowite usunięcie?
• Jakie metody analityczne potwierdzają jego brak w produkcie końcowym?

Rozpuszczalne znaczniki należy więc traktować jako funkcjonalne elementy projektu procesu, a nie wyłącznie jako proste etykiety.

Porównanie głównych metod

Porównanie przedstawia ogólne zasady działania poszczególnych metod.

Nie określa, która z nich zapewni najlepszą wydajność, czystość, koszt, zrównoważenie środowiskowe czy możliwość skalowania dla konkretnej sekwencji.

Parametry te należy oceniać na podstawie rzeczywistej cząsteczki i konkretnego procesu produkcyjnego. [4] [8] [9]

Łączenie fragmentów i produkcja hybrydowa

Peptyd nie zawsze musi być tworzony w jednym nieprzerwanym procesie polegającym na dodawaniu kolejnych reszt aminokwasowych.

Alternatywną strategią jest oddzielne przygotowanie krótszych fragmentów peptydowych, a następnie ich połączenie.

Proces hybrydowy może na przykład wykorzystywać SPPS do otrzymywania poszczególnych fragmentów oraz chemię w roztworze do ich łączenia.

Strategie fragmentowe mogą ograniczać niektóre problemy związane z bardzo długą syntezą etapową.

Wprowadzają jednak nowe wyzwania, takie jak:

• wybór odpowiedniego miejsca połączenia;
• rozpuszczalność fragmentów;
• aktywacja miejsca łączenia;
• chemoselektywność;
• zachowanie stereochemii;
• reakcje uboczne;
• oczyszczanie fragmentów;
• oczyszczanie po ich połączeniu.

Ważnym przykładem kontrolowanego łączenia fragmentów jest natywna ligacja chemiczna.

W klasycznej wersji tioester peptydowy reaguje z drugim peptydem zawierającym N-końcową cysteinę. Następujące później przegrupowanie prowadzi do utworzenia prawidłowego wiązania w szkielecie peptydowym w miejscu ligacji.

Pierwotne badania wykazały możliwość uzyskania po ligacji i fałdowaniu białka zawierającego mostki disiarczkowe. [10]

Potwierdza to znaczenie tej strategii łączenia fragmentów.

Nie oznacza jednak, że dowolne dwa niezmodyfikowane fragmenty peptydowe mogą spontanicznie się połączyć.

Sprzęganie i grupy ochronne

Sprzęganie tworzy zamierzone połączenie

Sprzęganie jest etapem reakcji, podczas którego pomiędzy wybranymi jednostkami powstaje nowe wiązanie peptydowe.

Zazwyczaj grupa pochodząca od grupy karboksylowej jest aktywowana tak, aby mogła skutecznie reagować z odpowiednią grupą aminową.

Chemia aktywacji musi być zgodna z:

• rosnącą sekwencją;
• tymczasowymi grupami ochronnymi;
• ochroną łańcuchów bocznych;
• stereochemią;
• nośnikiem lub znacznikiem;
• środowiskiem rozpuszczalnika;
• innymi grupami funkcyjnymi obecnymi w cząsteczce.

Skuteczne sprzęganie jest szczególnie ważne w syntezie etapowej, ponieważ niepełna reakcja może prowadzić do powstawania sekwencji delecyjnych.

Jeżeli jeden etap dodawania aminokwasu nie powiedzie się dla części rosnących łańcuchów, takie łańcuchy mogą pozostać w układzie i uczestniczyć w kolejnych cyklach.

W efekcie mogą powstać cząsteczki bardzo podobne do docelowego peptydu, ale pozbawione jednej reszty.

Nawet niewielkie nieefektywności mogą więc kumulować się podczas wielu etapów syntezy.

Prosty przykład matematyczny dobrze ilustruje ten problem.

Jeżeli każdy z 50 niezależnych etapów składania miałby 99% prawdopodobieństwa powodzenia, odsetek cząsteczek, dla których wszystkie etapy zakończyłyby się sukcesem, wynosiłby:

0,99^50 ≈ 0,605

czyli około 61%.

Jest to wyłącznie ilustracja matematyczna.

Nie stanowi prognozy rzeczywistej czystości ani wydajności syntezy peptydu zawierającego 50 reszt.

Rzeczywista produkcja obejmuje:

• różne wydajności sprzęgania w poszczególnych pozycjach;
• etapy odbezpieczania;
• reakcje uboczne;
• zależne od sekwencji trudności;
• strategie ponownego sprzęgania;
• straty podczas odszczepiania;
• straty podczas oczyszczania;
• inne zmienne procesowe.

Obliczenie pokazuje jedynie, dlaczego nawet pozornie niewielka nieefektywność pojedynczego etapu może nabrać dużego znaczenia w wieloetapowej syntezie.

Grupy ochronne kontrolują miejsce reakcji

Aminokwas może posiadać kilka chemicznie reaktywnych grup.

Bez selektywnej kontroli reakcje sprzęgania mogłyby zachodzić w niepożądanych miejscach.

Grupy ochronne tymczasowo blokują wybrane miejsca reaktywne.

Grupa aminowa wykorzystywana do wydłużania łańcucha zazwyczaj wymaga tymczasowej ochrony, natomiast reaktywne łańcuchy boczne mogą wymagać zabezpieczenia pozostającego na miejscu przez wiele cykli syntezy.

Połączenie z nośnikiem również musi przetrwać te etapy aż do momentu zaplanowanego odszczepienia.

Wybór grup ochronnych wpływa więc na całą strategię syntezy.

Należy uwzględnić:

• sposób ich wprowadzania;
• stabilita;
• sposób usuwania;
• zgodność z innymi grupami ochronnymi;
• zgodność z nośnikiem;
• reakcje uboczne;
• wpływ konkretnej sekwencji;
• końcowe warunki odbezpieczania.

Badania wykorzystujące ochronę opartą na cyjanosulfurylidzie dotyczyły powstawania aspartimidu poprzez zmianę sposobu zabezpieczenia grupy karboksylowej. [2]

Wyniki pokazują, że strategia grup ochronnych wpływa nie tylko na to, czy zamierzona reakcja może zajść, ale również na to, jakie niepożądane reakcje stają się możliwe.

Fmoc, Boc i ochrona ortogonalna

Fmoc i Boc należą do szeroko stosowanych grup chroniących grupy aminowe.

Istotnie różnią się sposobem usuwania.

Fmoc jest zazwyczaj usuwany w warunkach zasadowych, natomiast Boc jest wrażliwy na warunki kwaśne.

Właściwości te pozwalają stosować je jako elementy szerszych strategii ochrony.

W popularnej SPPS opartej na Fmoc tymczasowa ochrona N-końcowa Fmoc jest wielokrotnie usuwana, podczas gdy wybrane grupy ochronne łańcuchów bocznych oraz połączenie z żywicą pozostają nienaruszone do późniejszych etapów.

Inne strategie mogą wykorzystywać odmienne kombinacje.

Szczególnie ważnym pojęciem jest ochrona ortogonalna.

Dwie grupy ochronne są uznawane za ortogonalne, jeśli jedną można selektywnie usunąć w warunkach, w których druga pozostaje wystarczająco stabilna, aby możliwe było dalsze prowadzenie syntezy.

Ortogonalność jest więc praktyczną relacją zgodności chemicznej.

Nie oznacza, że każda zabezpieczona grupa pozostanie całkowicie niezmieniona po nieograniczonej liczbie ekspozycji na wszystkie warunki reakcji.

Reakcje uboczne nadal mogą występować.

W badaniach syntezy Fmoc opisano zarówno powstawanie aspartimidu, jak i niepożądane zmiany stereochemiczne mimo zakładanej selektywności ogólnej strategii ochronnej. [11]

Stereochemia jest częścią tożsamości cząsteczki

Wiele aminokwasów posiada centrum chiralne.

Oznacza to, że ich atomy mogą przyjmować różne układy przestrzenne odpowiadające różnym formom stereochemicznym.

Zmiana konfiguracji jednego centrum stereogenicznego może prowadzić do powstania innej struktury peptydu bez konieczności zmiany jego nominalnej masy.

Dlatego sama masa nie może potwierdzić pełnej tożsamości peptydu.

Epimeryzacja zazwyczaj oznacza zmianę konfiguracji jednego centrum stereogenicznego w cząsteczce zawierającej kilka takich centrów.

Racemizacja jest również często omawiana w chemii peptydów w kontekście utraty integralności stereochemicznej reszt aminokwasowych.

Zmiany te są istotne, ponieważ rozpoznawanie molekularne może silnie zależeć od przestrzennego ułożenia atomów.

Dwie cząsteczki o tym samym składzie pierwiastkowym i nominalnej masie mogą więc zachowywać się inaczej, jeśli różnią się stereochemią.

W badaniu syntezy Fmoc wspomaganej mikrofalami stwierdzono, że niektóre reszty były podatne na niepożądane zmiany stereochemiczne w zastosowanych warunkach. Modyfikacja metody ograniczała występowanie tych reakcji. [11]

Nie oznacza to, że ogrzewanie z definicji uszkadza wszystkie peptydy.

Prawidłowy wniosek jest taki, że przyspieszanie reakcji należy oceniać razem z zależną od sekwencji selektywnością chemiczną.

Aspartimid i inne pokrewne zanieczyszczenia

Powstawanie aspartimidu jest znaną reakcją uboczną dotyczącą określonych sekwencji zawierających asparaginian.

Może powstać niepożądany cykliczny półprodukt, z którego następnie tworzą się związki o zmienionej łączności szkieletu lub stereochemii.

Prawdopodobieństwo tej reakcji zależy od sekwencji oraz warunków procesu.

Inne zanieczyszczenia związane z syntezą mogą wynikać z:

• niepełnego sprzęgania;
• niepełnego odbezpieczania;
• powstawania sekwencji delecyjnych;
• reakcji łańcuchów bocznych;
• zmian stereochemicznych;
• reakcji podczas odszczepiania;
• utleniania;
• przegrupowań;
• warunków obróbki produktu;
• niepełnego usunięcia grup ochronnych.

Niektóre zanieczyszczenia powodują łatwo zauważalną zmianę masy cząsteczkowej.

Inne są znacznie trudniejsze do rozróżnienia.

W badaniach analitycznych syntetycznego peptydu będącego substratem reniny zidentyfikowano wiele zanieczyszczeń, w tym składniki wykazujące taką samą zmianę masy, ale zawierające modyfikacje w różnych pozycjach. [12]

Do ich rozróżnienia potrzebna była dodatkowa analiza strukturalna.

Badacze traktowali również proponowane mechanizmy powstawania tych zanieczyszczeń jako hipotezy.

Jest to ważne rozróżnienie:

ustalenie, czym jest zanieczyszczenie, oraz udowodnienie dokładnego mechanizmu jego powstania to dwa odrębne pytania naukowe.

Nie należy przedstawiać prawdopodobnego mechanizmu jako potwierdzonego wyłącznie dlatego, że odpowiada obserwowanej masie cząsteczkowej.

Oczyszczanie, skalowanie i jakość produkcji

Produkt surowy, produkt oczyszczony i wydajność

Surowy peptyd to materiał otrzymany przed zakończeniem odpowiednich etapów oczyszczania.

Może zawierać:

• docelowy peptyd;
• delečné sekvencie;
• materiał niecałkowicie odbezpieczony;
• zmodyfikowane sekwencje;
• pozostałości odczynników;
• produkty związane z odszczepianiem;
• sole;
• rozpúšťadlá;
• inne składniki powstające w procesie.

Oczyszczanie ma na celu oddzielenie właściwego peptydu od tej mieszaniny.

Należy wyraźnie rozróżnić trzy pojęcia:

czystość produktu surowego — zmierzony skład materiału przed końcowym oczyszczaniem;

wydajność produktu oczyszczonego lub wyizolowanego — ilość odzyskanego materiału docelowego względem określonej wartości początkowej lub teoretycznej;

czystość końcowa — skład wyizolowanego materiału określony za pomocą konkretnej metody analitycznej.

Pojęcia te nie są wymienne.

Proces może prowadzić do powstania dużej ilości surowego materiału, ale umożliwiać odzyskanie stosunkowo niewielkiej ilości oczyszczonego produktu.

Inny proces może dawać mniej materiału surowego, ale charakteryzować się wysoką selektywnością tworzenia produktu docelowego.

Podobnie wysoka czystość analityczna nie musi oznaczać wysokiej wydajności produkcyjnej.

W badaniach przyspieszonej syntezy przepływowej prawidłowo raportowano osobno czystość materiału surowego i wydajność po izolacji. [7]

Chromatografia rozdziela składniki, ale nie odpowiada na każde pytanie

Wysokosprawna chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) jest szeroko stosowana do analizy i oczyszczania peptydów.

Różne cząsteczki w odmienny sposób oddziałują z fazą stacjonarną i ruchomą.

W odpowiednich warunkach różnice te umożliwiają rozdzielanie składników mieszaniny.

Chromatografia analityczna i preparatywna mają powiązane, ale odmienne zastosowania.

Analityczna HPLC służy przede wszystkim do badania składu próbki.

Preparatywna HPLC jest wykorzystywana do fizycznego zbierania rozdzielonych składników.

Chromatogram może dostarczać wielu wartościowych informacji.

Dużego głównego piku lub wysokiego procentowego udziału jego powierzchni nie należy jednak traktować jako pełnej charakterystyki molekularnej.

Wyniki chromatografii zależą między innymi od:

• rodzaju kolumny;
• fazy ruchomej;
• gradientu;
• teploty;
• metody detekcji;
• długości fali;
• przygotowania próbki;
• sposobu integracji pików;
• rozdzielczości;
• właściwości zanieczyszczeń.

Dwa związki mogą potencjalnie eluować w tym samym czasie.

Niektóre składniki próbki mogą również różnie reagować na zastosowany detektor.

Dlatego wysoka czystość powierzchniowa w HPLC nie jest równoznaczna z pełnym potwierdzeniem tożsamości molekularnej.

Badania izobarycznych zanieczyszczeń peptydowych oraz analizy chiralnej pokazują, dlaczego mogą być potrzebne uzupełniające metody analityczne. [12] [13]

Metoda analityczna musi odpowiadać konkretnemu pytaniu strukturalnemu.

Tożsamość, czystość i zawartość oznaczają różne rzeczy

W charakterystyce peptydów szczególnie ważne są trzy pojęcia.

Tożsamość odpowiada na pytanie:

Czy w próbce znajduje się zamierzona cząsteczka?

Czystość odpowiada na pytanie:

Jakie inne składniki znajdują się w próbce lub jaka część mierzonego sygnału odpowiada głównemu składnikowi?

Zawartość odpowiada na pytanie:

Ile rzeczywistego peptydu znajduje się w próbce?

Na te pytania nie zawsze można odpowiedzieć za pomocą jednego pomiaru.

Materiał zawierający peptyd może również zawierać:

• wodę;
• proti;
• sole;
• zvyšky rozpúšťadiel;
• inne składniki związane z procesem;
• zanieczyszczenia.

Całkowita masa odważonego materiału nie musi więc odpowiadać masie samego peptydu.

Podobnie zgodność zmierzonej masy cząsteczkowej z wartością teoretyczną nie potwierdza:

• kompletnej sekwencji aminokwasowej;
• prawidłowej łączności poszczególnych reszt;
• integralności stereochemicznej;
• rozmistenia disulfidových mostíkov;
• fałdowania;
• braku izobarycznych zanieczyszczeń.

Spektrometria mas może dostarczać silnych dowodów dotyczących masy cząsteczkowej.

Tandemowa spektrometria mas i inne techniki strukturalne mogą dostarczać dodatkowych informacji o sekwencji.

Metody chiralne pozwalają analizować zagadnienia stereochemiczne, których nie można rozstrzygnąć zwykłym pomiarem masy.

W jednym z badań analitycznych uwzględniono nawet racemizację powstającą podczas przygotowania próbki. Pokazuje to kolejną ważną zasadę: sama procedura analityczna może powodować artefakty, jeśli nie zostanie odpowiednio zaprojektowana. [13]

Fałdowanie i aktywność mogą wymagać osobnego potwierdzenia

W przypadku strukturalnie ograniczonych peptydów i małych białek prawidłowa sekwencja oraz masa cząsteczkowa nadal mogą być niewystarczające do potwierdzenia zamierzonej struktury końcowej.

Dodatkowe pytania mogą obejmować:

• Czy powstały właściwe mostki disiarczkowe?
• Czy cząsteczka przyjęła oczekiwaną konformację?
• Czy cyklizacja jest kompletna?
• Czy obecne są izomery strukturalne?
• Czy syntetyczna cząsteczka wykazuje oczekiwaną aktywność w określonym teście eksperymentalnym?

W badaniu syntezy BPTI wykorzystano kilka metod analitycznych i biofizycznych wraz z oceną hamowania trypsyny. [3]

Łączne wyniki wspierały zgodność syntetycznego materiału o naturalnej sekwencji z naturalnym białkiem w zakresie badanych kryteriów.

Test aktywności odpowiada jednak na określone pytanie funkcjonalne.

Nie zastępuje analizy zanieczyszczeń.

Podobnie podobna aktywność w jednym teście nie potwierdza pełnej równoważności wszystkich właściwości biologicznych, strukturalnych czy produkcyjnych.

Skalowanie produkcji zmienia więcej niż tylko ilość materiału

Zwiększenie skali produkcji nie polega wyłącznie na proporcjonalnym zwiększeniu ilości wszystkich odczynników.

Procesy fizyczne mogą zachowywać się inaczej przy większej skali.

Znaczenie mogą mieć:

• mieszanie;
• wymiana ciepła;
• rozprowadzanie odczynników;
• dyfuzja;
• pęcznienie żywicy;
• ciśnienie;
• filtracja;
• gospodarka rozpuszczalnikami;
• wytrącanie;
• rozpuszczalność półproduktów;
• transport masy;
• możliwości systemu oczyszczania.

Czynniki te mogą wpływać zarówno na przebieg reakcji, jak i na powstawanie zanieczyszczeń.

Oczyszczanie na późniejszych etapach również może stać się wąskim gardłem całej produkcji.

Zwiększenie szybkości syntezy ma ograniczone znaczenie, jeśli system oczyszczania nie jest w stanie skutecznie rozdzielić powstających zanieczyszczeń lub odzyskać produktu o wymaganej jakości.

W analizie przemysłowej obejmującej 40 procesów syntezy peptydów z 14 firm farmaceutycznych oceniano zużycie materiałów podczas syntezy, oczyszczania i izolacji. [14]

Badanie pokazuje, dlaczego ocenę produkcji należy prowadzić dla całego procesu.

Nie oznacza jednak, że każda fabryka, sekwencja lub technologia produkcyjna osiąga identyczne wyniki.

Jakość produkcji jest wynikiem wielu elementów kontroli

Wiarygodna produkcja peptydów wymaga czegoś więcej niż uzyskania jednego satysfakcjonującego wyniku analitycznego.

Kontrolowany proces zazwyczaj obejmuje kilka powiązanych elementów:

zdefiniowana cząsteczka docelowa → odpowiednie materiały wyjściowe → kontrolowana synteza → kontrolowane oczyszczanie → właściwe pobieranie próbek → zwalidowana lub odpowiednia do celu analiza → dokumentacja partii.

Dokumentacja partii łączy wyniki analityczne z materiałem, który rzeczywiście został wyprodukowany.

Certyfikat analizy (COA) podsumowuje wybrane wyniki badań określonej partii.

Jego wartość informacyjna zależy od:

• rodzaju wykonanych badań;
• zastosowanych metod;
• przydatności tych metod;
• specyfikacji;
• identyfikacji próbki;
• możliwości prześledzenia partii;
• potwierdzenia, że raportowane wyniki rzeczywiście dotyczą danego materiału.

Pojedyncza wartość określana jako „czystość” nie może samodzielnie potwierdzić:

• pełnej tożsamości molekularnej;
• zawartości peptydu;
• integralności stereochemicznej;
• poziomu pozostałości rozpuszczalników;
• zawartości wody;
• składu przeciwjonów;
• właściwości mikrobiologicznych;
• fałdowania;
• biologickej aktivity;
• przydatności do określonego celu.

Odpowiedni zestaw analiz zależy od zamierzonego zastosowania materiału.

Peptyd wykorzystywany jako analityczny materiał odniesienia, odczynnik badawczy stosowany w eksperymencie komórkowym oraz materiał znajdujący się na etapie rozwoju farmaceutycznego mogą wymagać odpowiedzi na inne pytania jakościowe.

Dowody analityczne należy więc interpretować w jasno określonym kontekście, a nie jako uniwersalne potwierdzenie jakości.

Ocena zrównoważenia środowiskowego musi obejmować cały proces

Synteza peptydów może wymagać znacznych ilości rozpuszczalników i odczynników.

Ocena wpływu środowiskowego powinna więc uwzględniać znacznie więcej niż sam etap sprzęgania.

Do istotnych elementów mogą należeć:

• przygotowanie bloków budulcowych;
• odczynniki sprzęgające;
• odczynniki do odbezpieczania;
• premývanie;
• odštepovanie;
• obróbka produktu;
• chromatografia;
• wymiana rozpuszczalników;
• izolacja;
• sušenie;
• gospodarowanie odpadami.

Zmniejszenie obciążenia środowiskowego może wymagać równoczesnej poprawy kilku etapów.

W opublikowanej analizie dotyczącej produkcji peptydów omówiono problemy związane zarówno z syntezą, jak i oczyszczaniem oraz wskazano potrzebę ulepszania całego projektu procesu. [15]

Jako publikacja perspektywiczna nie stanowi ona kontrolowanego bezpośredniego porównania dowodzącego, że jedna konkretna technologia zawsze jest bardziej przyjazna środowisku.

Podobne:

szybsza synteza nie oznacza automatycznie bardziej ekologicznej syntezy,

a mniejsze zużycie rozpuszczalników podczas samej syntezy nie oznacza automatycznie mniejszego wpływu całego procesu produkcyjnego.

Porównania środowiskowe wymagają stosowania spójnych granic analizy i najlepiej powinny odnosić zużycie zasobów do określonej ilości wyizolowanego i scharakteryzowanego produktu końcowego.

Často kladené otázky

1. Czym różni się synteza peptydów na fazie stałej od syntezy w fazie ciekłej?

W syntezie na fazie stałej rosnący peptyd pozostaje przyłączony do nierozpuszczalnego nośnika, natomiast w klasycznej syntezie w roztworze półprodukt peptydowy pozostaje rozpuszczony i zazwyczaj musi być odzyskiwany na podstawie swoich właściwości fizycznych i chemicznych. W węższym znaczeniu LPPS rozpuszczony rosnący łańcuch posiada dodatkowo rozpuszczalny znacznik lub nośnik ułatwiający późniejsze rozdzielanie. Badania syntezy znakowanej pokazują jedną ze strategii łączenia chemii roztworowej z odzyskiwaniem poprzez wytrącanie, natomiast literatura dotycząca LPPS odróżnia takie rozwiązania zarówno od klasycznej syntezy w roztworze, jak i od SPPS. Żadna metoda nie jest z definicji optymalna dla każdego peptydu. Podstawowa różnica dotyczy sposobu fizycznego prowadzenia i rozdzielania rosnącego łańcucha podczas kolejnych etapów syntezy. [8] [9]

2. Dlaczego podczas syntezy peptydów mogą powstawać zanieczyszczenia?

Zanieczyszczenia mogą powstawać dlatego, że zamierzone reakcje nie zawsze zachodzą ilościowo, a inne grupy funkcyjne mogą uczestniczyć w niepożądanych reakcjach. Niepełne sprzęganie może prowadzić do sekwencji delecyjnych, niepełne odbezpieczanie może zakłócać dalsze składanie łańcucha, a niektóre sekwencje są podatne na zmiany stereochemiczne, powstawanie aspartimidu, utlenianie, przegrupowania lub produkty uboczne związane z odszczepianiem. Badania syntezy Fmoc oraz analizy strukturalnej syntetycznych zanieczyszczeń peptydowych dokumentują kilka takich przykładów. [11] [12] Częstość i znaczenie poszczególnych zanieczyszczeń zależą od sekwencji i procesu, dlatego automatyzacji syntezy nie należy utożsamiać z całkowitym brakiem błędów chemicznych.

3. Jaką rolę pełni żywica w syntezie peptydów?

Żywica utrzymuje rosnący peptyd, podczas gdy rozpuszczalne odczynniki i wiele produktów ubocznych można usuwać pomiędzy kolejnymi etapami syntezy. Znacznie upraszcza to powtarzające się składanie łańcucha, ale żywica nie jest wyłącznie mechanicznym uchwytem. Jej pęcznienie, stopień obsadzenia, architektura polimeru, zgodność z rozpuszczalnikami i dostępność miejsc reakcji mogą wpływać na skuteczność docierania odczynników do przyłączonego peptydu. W badaniach z wykorzystaniem reaktora ze zmiennym złożem monitorowano zachowanie żywicy podczas analizy agregacji i efektywności sprzęgania. [4] Takie monitorowanie nie eliminuje błędów sekwencji, ale pokazuje, dlaczego fizyczny stan żywicy może być istotną zmienną procesową.

4. Do czego służy żywica Wanga w syntezie peptydów?

Nośniki typu Wang są powszechnie związane z przygotowywaniem peptydów uwalnianych po odpowiednim odszczepieniu z C-końcem w postaci kwasu karboksylowego. Dokładny produkt końcowy zależy jednak od linkera, architektury nośnika i zastosowanej chemii odszczepiania, a nie tylko od nazwy żywicy. Badacze przedstawili również specjalistyczną metodę przekształcania materiału peptydyl-Wang-TentaGel w hydrazydy peptydowe, które mogą służyć jako użyteczne półprodukty syntetyczne. [5] Alternatywna reakcja nie zmienia znaczenia standardowego odszczepiania z żywicy Wanga. Pokazuje natomiast, dlaczego podczas przewidywania produktu należy analizować cały system nośnika i warunki reakcji.

5. Czy SPPS buduje peptyd od N-końca czy od C-końca?

Klasyczna etapowa SPPS zazwyczaj rozpoczyna się od przyłączenia C-końcowej reszty do nośnika, po czym łańcuch jest wydłużany w kierunku N-końca. Jest to kierunek przeciwny do standardowego wydłużania łańcucha na rybosomie, gdzie białko rośnie poprzez dodawanie kolejnych aminokwasów do C-końca. Synteza BPTI jest przykładem wykorzystania zabezpieczonych bloków budulcowych i nośnika przed późniejszym uwolnieniem, oczyszczaniem i fałdowaniem produktu. [3] Istnieją jednak specjalistyczne strategie chemii peptydów wykorzystujące inne rozwiązania, dlatego budowanie od C- do N-końca należy określać jako klasyczne podejście SPPS, a nie bezwzględną zasadę wszystkich metod syntezy.

6. Dlaczego grupy ochronne są potrzebne?

Aminokwasy często zawierają kilka reaktywnych grup funkcyjnych. Grupy ochronne tymczasowo zapobiegają reakcji wybranych miejsc, pozostawiając odpowiednie miejsce dostępne w konkretnym etapie syntezy. Pomaga to kontrolować kolejność i sposób łączenia reszt. Bez właściwej ochrony konkurencyjne reakcje mogłyby prowadzić do powstawania złożonych mieszanin lub produktów o zmienionej strukturze. Badania dotyczące powstawania aspartimidu pokazały, że zmiana chemii ochrony grupy karboksylowej może ograniczać ważną reakcję uboczną w analizowanych sekwencjach. [2] Grupy ochronne nie gwarantują idealnego przebiegu syntezy, lecz zapewniają selektywną kontrolę chemiczną, która musi pozostać zgodna ze wszystkimi istotnymi etapami procesu.

7. Czym różnią się Fmoc i Boc?

Fmoc i Boc są szeroko stosowanymi tymczasowymi grupami chroniącymi grupę aminową, ale reagują na inne warunki chemiczne. Fmoc jest zazwyczaj usuwany w środowisku zasadowym, natomiast Boc jest wrażliwy na kwasy. Różnica ta wpływa na sposób łączenia ich z ochroną łańcuchów bocznych, linkerami i pozostałymi etapami syntezy. Synteza oparta na Fmoc jest szeroko wykorzystywana we współczesnej SPPS, ale badania wykazały również możliwość występowania zależnych od sekwencji reakcji ubocznych w takich warunkach. [11] W praktyce bardziej użyteczne jest więc porównywanie całych strategii ochrony i ich zgodności z daną sekwencją niż rozpatrywanie wyłącznie nazw dwóch grup ochronnych.

8. Co oznacza ochrona ortogonalna?

Ochrona ortogonalna oznacza, że jedną grupę ochronną można usunąć w warunkach, w których inna potrzebna grupa ochronna pozostaje wystarczająco stabilna, aby można było kontynuować syntezę. Pozwala to odsłaniać różne miejsca reaktywne na określonych etapach. Koncepcja ta ma podstawowe znaczenie podczas kontrolowanej syntezy złożonych peptydów. Ortogonalność jest jednak zależna od warunków, a nie absolutna: wielokrotna ekspozycja, charakter sekwencji i parametry reakcji nadal mogą prowadzić do reakcji ubocznych. Badania alternatywnych sposobów ochrony grup karboksylowych pokazują, jak strategię ochrony można modyfikować w celu kontrolowania trudnej chemii peptydowej. [2]

9. Czym jest sekwencja delecyjna?

Sekwencja delecyjna to peptyd pozbawiony jednej lub kilku reszt obecnych w zamierzonej sekwencji docelowej. Może powstać, gdy etap sprzęgania aminokwasu nie zachodzi całkowicie, ale nieprzereagowany łańcuch pozostaje przyłączony do nośnika i uczestniczy w kolejnych cyklach. Ponieważ nieprawidłowy łańcuch nadal pozostaje związany z żywicą, zwykłe przemywanie nie musi go usunąć. Badania monitorowania SPPS w czasie rzeczywistym wskazują niepełne tworzenie wiązań amidowych jako ważny problem procesowy. [4] Sekwencja delecyjna jest więc problemem związanym ze strukturą i tożsamością produktu, a nie jedynie pozostałością odczynnika.

10. Czy dwa zanieczyszczenia peptydowe mogą mieć taką samą masę cząsteczkową?

Tak. Różne struktury molekularne mogą mieć identyczną lub nierozróżnialną masę nominalną. Z tego powodu sama zgodność masy nie potwierdza pełnej tożsamości cząsteczki. W badaniach syntetycznego peptydu będącego substratem reniny zidentyfikowano izobaryczne składniki zanieczyszczeń, w których modyfikacje występowały w różnych pozycjach. Derywatyzacja i tandemowa spektrometria mas dostarczyły dodatkowych informacji strukturalnych. [12] Przykład ten pokazuje, dlaczego zgodność obserwowanej masy z oczekiwaną nie może samodzielnie potwierdzić właściwej sekwencji, łączności, stereochemii ani braku strukturalnie podobnych izomerów.

11. Czym są epimeryzacja i racemizacja w syntezie peptydów?

Epimeryzacja i racemizacja dotyczą niepożądanych zmian konfiguracji stereochemicznej. Mogą one zachodzić bez zmiany nominalnej sekwencji aminokwasowej lub masy cząsteczkowej, dlatego zwykły pomiar masy może nie wykazać różnicy strukturalnej. W badaniach syntezy Fmoc wspomaganej mikrofalami zidentyfikowano reszty podatne na zmiany stereochemiczne i wykazano, że modyfikacja warunków reakcji może ograniczać takie procesy. [11] Ryzyko zależy od bloku budulcowego, sekwencji i warunków procesu. Jakość stereochemiczna wymaga więc metod analitycznych zdolnych do oceny konfiguracji, a nie może być wnioskowana wyłącznie na podstawie masy cząsteczkowej.

12. Czym jest powstawanie aspartimidu?

Powstawanie aspartimidu jest niepożądaną reakcją związaną z określonymi sekwencjami zawierającymi asparaginian. Powstanie cyklicznego półproduktu może prowadzić do kolejnych produktów o zmienionej łączności szkieletu lub stereochemii, zmniejszając wydajność i utrudniając oczyszczanie. Badacze analizowali alternatywne strategie ochrony zaprojektowane w celu ograniczenia tej reakcji w wybranych peptydach i białkach. [2] Wyniki nie wskazują jednego uniwersalnego rozwiązania dla wszystkich sekwencji zawierających asparaginian. Pokazują natomiast, dlaczego projektowanie syntezy i strategii kontroli zanieczyszczeń musi uwzględniać specyficzne zachowanie chemiczne danej sekwencji.

13. Czy wysoka czystość HPLC potwierdza prawidłową tożsamość peptydu?

Nie. Czystość HPLC opisuje próbkę w ramach konkretnego rozdziału chromatograficznego, zastosowanego detektora i sposobu analizy danych. Wysoki udział powierzchni głównego piku może być wartościowym dowodem, że próbka jest zdominowana przez jeden chromatograficznie rozdzielony składnik, ale nie potwierdza samodzielnie pełnej tożsamości molekularnej. Współeluujące zanieczyszczenia, stereoizomery i inne warianty mogą wymagać dodatkowych technik. W badaniach analizy chiralnej peptydów wykorzystano specjalnie zaprojektowany proces, który uwzględniał również zmiany stereochemiczne powstające podczas przygotowania próbki. [13] Tożsamość i czystość należy więc traktować jako powiązane, ale odrębne pytania analityczne.

14. Czy wydajność produktu oczyszczonego oznacza to samo co czystość?

Nie. Wydajność produktu oczyszczonego lub wyizolowanego określa ilość odzyskanego materiału docelowego względem zdefiniowanej ilości początkowej lub teoretycznej. Czystość opisuje natomiast skład odzyskanego materiału według określonej metody analitycznej. Synteza może prowadzić do uzyskania stosunkowo niewielkiej ilości produktu o bardzo wysokiej czystości albo dużej ilości materiału surowego zawierającego znaczną ilość zanieczyszczeń. W badaniach automatycznej syntezy przepływowej czystość surowego produktu i wydajność po izolacji raportowano oddzielnie. [7] Rozdzielenie tych parametrów zapobiega błędnemu traktowaniu wysokiej wartości jednego z nich jako dowodu wysokiej wartości drugiego.

15. Czy długie peptydy można wytwarzać poprzez łączenie krótszych fragmentów?

Tak. W strategii fragmentowej krótsze segmenty peptydowe mogą zostać przygotowane oddzielnie, a następnie połączone za pomocą odpowiedniej chemii. Natwywna ligacja chemiczna była ważnym przykładem, w którym niezabezpieczone fragmenty peptydowe połączono w sposób prowadzący do powstania naturalnego wiązania szkieletu peptydowego, a następnie uzyskano pofałdowane białko. [10] Nie oznacza to, że dowolne fragmenty peptydowe mogą łączyć się spontanicznie. Należy uwzględnić strukturę fragmentów, chemię łączenia, wybór miejsca połączenia, rozpuszczalność, stereochemię i wymagania dotyczące oczyszczania. Składanie fragmentów jest więc alternatywną strategią projektowania syntezy, a nie automatycznym rozwiązaniem problemów związanych z długimi peptydami.

16. Czy szybsza zautomatyzowana synteza eliminuje potrzebę oczyszczania?

Nie. Szybsze zautomatyzowane lub przepływowe składanie skraca czas określonych etapów syntezy, ale nie dowodzi, że każda powstała cząsteczka ma zamierzoną strukturę. W badaniach szybkiej syntezy przepływowej nadal charakteryzowano materiał surowy i stosowano późniejsze oczyszczanie, a w kolejnych pracach dotyczących automatyzacji osobno porównywano czystość surowego materiału i wydajność po izolacji. [6] [7] Dobre wyniki systemu dla badanych sekwencji nie gwarantują również identycznych rezultatów dla każdego nowego celu. Przyspieszona synteza nadal musi być połączona z odpowiednim oczyszczaniem, potwierdzeniem tożsamości, analizą zanieczyszczeń i charakterystyką końcową.

17. Dlaczego zwiększenie skali produkcji jest bardziej skomplikowane niż przygotowanie większej partii?

Zwiększenie skali zmienia warunki fizyczne i chemiczne, a nie tylko ilość materiału. Mieszanie, wymiana ciepła, pęcznienie żywicy, dystrybucja odczynników, ciśnienie, filtracja, obsługa rozpuszczalników, rozpuszczalność półproduktów i możliwości systemu oczyszczania mogą zachowywać się inaczej przy większej objętości produkcji. W analizie przemysłowej 40 procesów peptydowych osobno oceniano syntezę, oczyszczanie i izolację podczas analizy zużycia materiałów. [14] Wyniki pokazują, dlaczego produkcję trzeba rozpatrywać jako kompletny proces. Skalowalna metoda musi powtarzalnie prowadzić do uzyskania scharakteryzowanego materiału na wszystkich etapach, a nie tylko większej ilości surowego peptydu.

18. Czy peptyd jest gotowy od razu po złożeniu prawidłowej sekwencji?

Niekoniecznie. Złożenie łańcucha tworzy szkielet sekwencji tylko w takim zakresie, w jakim potwierdzają to proces i dane analityczne. W zależności od cząsteczki mogą być nadal potrzebne odbezpieczanie, odszczepianie, cyklizacja, utlenianie, tworzenie mostków disiarczkowych, fałdowanie, koniugacja, oczyszczanie i charakterystyka. Synteza BPTI stanowi dobry przykład procesu, w którym po złożeniu liniowej sekwencji następowało oczyszczanie i tworzenie pofałdowanej struktury zawierającej mostki disiarczkowe. [3] Określenie „gotowy peptyd” powinno więc odnosić się do formy molekularnej wymaganej w danym kontekście naukowym, a nie tylko do zakończenia etapowego dodawania aminokwasów.

19. Czy prawidłowa masa cząsteczkowa potwierdza prawidłową sekwencję peptydu?

Nie. Zgodność masy cząsteczkowej jest wartościowym dowodem, ale nie może samodzielnie potwierdzić pełnej sekwencji ani struktury molekularnej. Struktury izobaryczne mogą mieć tę samą masę, a różnice stereochemiczne mogą w ogóle nie powodować zmiany masy cząsteczkowej. Badania zanieczyszczeń syntetycznych peptydów pokazały, że rozróżnienie strukturalnie odmiennych składników może wymagać tandemowej spektrometrii mas i dodatkowych analiz. [12] W przypadku pytań dotyczących integralności stereochemicznej mogą być potrzebne również metody chiralne. [13] Masę cząsteczkową należy więc traktować jako jeden z elementów oceny tożsamości, a nie jej pełne potwierdzenie.

20. Dlaczego oczyszczanie należy traktować jako część produkcji peptydu, a nie tylko końcowy dodatek?

Oczyszczanie decyduje o tym, czy docelowy peptyd można skutecznie oddzielić od sekwencji delecyjnych, produktów ubocznych, pozostałości odczynników, strukturalnie podobnych zanieczyszczeń i innych składników powstałych podczas syntezy. Metoda pozwalająca bardzo szybko wytwarzać duże ilości surowego materiału może nadal być niepraktyczna, jeśli nie da się skutecznie odzyskać docelowego produktu o wymaganej jakości. Z tego powodu analizy przemysłowe procesów peptydowych uwzględniają razem syntezę, oczyszczanie i izolację. [14] Efektywność produkcji należy ostatecznie oceniać na podstawie ilości i właściwości wyizolowanego materiału końcowego, a nie wyłącznie szybkości syntezy.

Ograniczenia przy porównywaniu metod syntezy peptydów

Podczas interpretowania badań porównujących technologie produkcji peptydów należy pamiętać o kilku istotnych ograniczeniach.

Po pierwsze, sekwencja silnie wpływa na trudność syntezy. Metoda sprawdzająca się dla jednego peptydu nie musi działać tak samo dla innego. Agregacja, hydrofobowość, skład aminokwasowy, długość, tendencja do tworzenia struktur drugorzędowych i podatność na reakcje uboczne mogą zmieniać zachowanie procesu. [1] [4]

Po drugie, czystość materiału surowego, wydajność po izolacji, czystość końcowa i zawartość peptydu są różnymi parametrami. Porównywanie metod wyłącznie na podstawie jednego z nich może dawać niepełny obraz efektywności produkcji. [7]

Po trzecie, szybkie składanie łańcucha nie oznacza szybkiej produkcji całego materiału. Odszczepianie, oczyszczanie, izolacja, końcowe kształtowanie struktury, badania analityczne i dokumentacja również wpływają na całkowity czas produkcji. [6] [7]

Po czwarte, czystość analityczna zależy od zastosowanej metody. HPLC, spektrometria mas, tandemowa spektrometria mas i analiza chiralna odpowiadają na różne pytania. Jeden wynik analityczny nie musi potwierdzać pełnej tożsamości strukturalnej. [12] [13]

Po piąte, skala wpływa na zachowanie procesu. Wyników syntezy laboratoryjnej nie można automatycznie przenosić na produkcję przemysłową bez oceny mieszania, transportu masy, możliwości oczyszczania, zużycia materiałów i innych czynników zależnych od skali. [14]

Po szóste, historyczne porównania ekonomiczne mogą z czasem tracić aktualność. Koszty odczynników, poziom automatyzacji, technologie ekspresji, wyposażenie do oczyszczania, odzyskiwanie rozpuszczalników i infrastruktura produkcyjna stale się rozwijają. Starsze analizy kosztów mogą nadal mieć znaczenie naukowe, ale nie muszą odzwierciedlać aktualnej ekonomiki rynku. [1]

Po siódme, porównania środowiskowe wymagają spójnych granic analizy. Ocena zużycia rozpuszczalników podczas samego składania łańcucha przy jednoczesnym pominięciu oczyszczania i izolacji może prowadzić do mylących wniosków dotyczących zrównoważenia procesu. [14] [15]

Wreszcie sama nazwa metody nie określa jakości produktu. SPPS, synteza w roztworze, LPPS, ligacja fragmentów oraz ekspresja biologiczna mogą prowadzić do uzyskania materiału wysokiej jakości, jeśli proces został odpowiednio zaprojektowany i kontrolowany. Żadna z tych metod nie gwarantuje jednak automatycznie właściwej tożsamości, czystości, stereochemii, fałdowania czy przydatności do konkretnego zastosowania.

Zhrnutie

Syntezę peptydów najlepiej rozumieć jako kontrolowany proces wytwarzania cząsteczek, a nie po prostu tworzenie wiązań peptydowych.

Celem jest zbudowanie określonej sekwencji aminokwasowej przy jednoczesnym kontrolowaniu sposobu połączenia reszt, chemii grup ochronnych, stereochemii, reakcji ubocznych i wszelkich dodatkowych wymagań strukturalnych.

Synteza peptydów na fazie stałej utrzymuje rosnący łańcuch na nierozpuszczalnym nośniku, dzięki czemu powtarzane etapy sprzęgania i przemywania dobrze nadają się do automatyzacji. Zalety związane z powtarzalnym składaniem nie eliminują jednak problemów takich jak niepełne reakcje, agregacja, sekwencje delecyjne czy zależne od sekwencji reakcje uboczne. [4] [6] [7]

Klasyczna synteza w roztworze utrzymuje półprodukty peptydowe w fazie ciekłej i może zapewniać większą elastyczność w izolowaniu oraz charakteryzowaniu poszczególnych produktów pośrednich. Wielokrotne rozdzielanie oraz pogarszająca się rozpuszczalność mogą jednak stać się poważnymi ograniczeniami.

Metody syntezy w fazie ciekłej z rozpuszczalnymi znacznikami próbują połączyć chemię roztworową z zaprojektowanymi strategiami odzyskiwania materiału. Mogą więc stanowić dodatkową możliwość w przypadku sekwencji i problemów produkcyjnych, dla których klasyczna SPPS nie jest optymalna. [8] [9]

Dłuższe lub szczególnie trudne cząsteczki można również przygotowywać poprzez składanie fragmentów, w tym natywną ligację chemiczną, zamiast polegać wyłącznie na nieprzerwanym dodawaniu kolejnych reszt aminokwasowych. [10]

Niezależnie od wybranej metody składania efektywność sprzęgania i chemia grup ochronnych pozostają kluczowe, ponieważ niewielkie nieefektywności i reakcje uboczne mogą kumulować się podczas kolejnych etapów syntezy. Powstawanie aspartimidu, sekwencje delecyjne i zmiany stereochemiczne pokazują, dlaczego sama zamierzona sekwencja nie opisuje wszystkiego, co może powstać podczas procesu. [2] [11] [12]

Praca nie kończy się również wraz ze złożeniem łańcucha.

Oczyszczanie decyduje o tym, czy produkt docelowy można oddzielić od innych składników.

Następnie odpowiednio dobrane metody analityczne odpowiadają na odrębne pytania dotyczące tożsamości, czystości, zawartości, stereochemii, konformacji oraz – jeśli ma to znaczenie – aktywności funkcjonalnej. [3] [12] [13]

Zwiększenie skali produkcji wprowadza kolejne zagadnienia dotyczące transportu masy, zachowania żywicy, zużycia rozpuszczalników, filtracji, możliwości oczyszczania, powtarzalności procesu i jego wpływu środowiskowego. Z tego powodu przemysłowa ocena procesu powinna obejmować razem syntezę, oczyszczanie i izolację, a nie koncentrować się wyłącznie na szybkości sprzęgania. [14] [15]

Najważniejsza zasada jest następująca:

skuteczna produkcja peptydu wymaga kontroli całego procesu – od projektu molekularnego i tworzenia wiązań aż po oczyszczanie oraz charakterystykę strukturalną. Uzyskanie łańcucha o oczekiwanej nominalnej masie lub wysokiego głównego piku chromatograficznego stanowi wartościowy dowód, ale żaden z tych parametrów samodzielnie nie potwierdza pełnej tożsamości molekularnej ani jakości procesu produkcyjnego.

Zrieknutie sa zodpovednosti

Artykuł ma wyłącznie charakter edukacyjny i naukowo-informacyjny. Opisuje ogólne zasady chemii peptydów, syntezy na fazie stałej, syntezy w roztworze i w fazie ciekłej, strategii grup ochronnych, sprzęgania, oczyszczania, charakterystyki analitycznej, procesów produkcyjnych oraz przykłady pochodzące z opublikowanych badań. Nie jest protokołem laboratoryjnym, instrukcją produkcyjną, poradą medyczną, przewodnikiem dotyczącym dawkowania lub podawania ani certyfikatem jakości jakiegokolwiek konkretnego produktu peptydowego. Wyniki eksperymentalne należy interpretować w kontekście sekwencji, zastosowanych metod, skali procesu, technik analitycznych i ograniczeń poszczególnych badań.

Odkazy

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K., & Perczel, A. (2016). Bacterial expression and/or solid phase peptide synthesis of 20-40 amino acid long polypeptides and miniproteins, the case study of Class B GPCR ligands. Current Protein & Peptide Science, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Prevention of aspartimide formation during peptide synthesis using cyanosulfurylides as carboxylic acid-protecting groups. Nature Communications, 11(1), Article 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). Solid-phase synthesis of bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) and two analogues. A chemical approach for evaluating the role of disulfide bridges in protein folding and stability. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. PubMed record
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). Real-time monitoring of solid-phase peptide synthesis using a variable bed flow reactor. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F., & Becker, C. F. W. (2015). Efficient generation of peptide hydrazides via direct hydrazinolysis of Peptidyl-Wang-TentaGel resins. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Rapid flow-based peptide synthesis. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2017). A fully automated flow-based approach for accelerated peptide synthesis. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G., & Albericio, F. (2022). Liquid-phase peptide synthesis (LPPS): A third wave for the preparation of peptides. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T., & Fukui, T. (2012). Novel diphenylmethyl-derived amide protecting group for efficient liquid-phase peptide synthesis: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., & Kent, S. B. (1994). Synthesis of proteins by native chemical ligation. Science, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Characterization of impurities in a synthetic renin substrate peptide by fast-atom bombardment mass spectrometry and hybrid tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G., & Crowther, J. B. (1995). Peptide chiral purity determination: Hydrolysis in deuterated acid, derivatization with Marfey’s reagent and analysis using high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Process mass intensity (PMI): A holistic analysis of current peptide manufacturing processes informs sustainability in peptide synthesis. The Journal of Organic Chemistry, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Sustainability challenges in peptide synthesis and purification: From R&D to production. The Journal of Organic Chemistry, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001