Peptīdu sintēze: cietfāzes metode, metode šķīdumā un ražošanas metodes

Peptīdu sintēze ir kontrolēts process, kurā veidojas noteiktas secības aminoskābju ķēdes. Ķīmiskajā sintēzē izvēlētās aminoskābes tiek savienotas, izmantojot peptīdu saišu, vienlaikus kontrolējot citas reaktīvās grupas, kas atrodas šajās molekulās. Mērķis tātad nav vienkārši savienot aminoskābes, bet gan iegūt konkrētu molekulāro struktūru ar noteiktu secību, stereochemiju, ķēdes galu uzbūvi un – ja nepieciešams – papildu strukturālajām pazīmēm.

Pie galvenajām metodēm pieder peptīdu sintēze uz cietā fāzē (SPPS), klasiskā sintēze šķīdumā, kā arī jaunākas peptīdu sintēzes metodes šķidrā fāzē (LPPS), izmantojot šķīstošos nesējus vai molekulāros marķierus. Pētniecības laboratorijas un ražotnes var arī apvienot dažādas pieejas, atsevišķi sagatavot īsākus fragmentus un pēc tam tos savienot kopā vai izmantot bioloģisko ekspresiju, ja tā ir piemērotāka konkrētajai secībai.

Ķīmiskās sintēzes salīdzinājums ar 20–40 aminoskābju atlikumus saturošu polipeptīdu bakteriālo ekspresiju parāda svarīgu principu: praktiskā ražošanas metodes izvēle ir atkarīga no konkrētās molekulas, tās secības, tieksmes uz agregāciju, nepieciešamajām modifikācijām, ražošanas mēroga un analītiskajām prasībām. [1]

Vēlamās aminoskābju secības iegūšana ir tikai viens no peptīdu ražošanas posmiem.

Viss process var ietvert:

secvences projektēšana → celtniecības bloku sagatavošana → funkcionālo grupu aizsardzība → saistīšana → aizsarggrupu noņemšana → ķēdes montāža → fragmentu atšķelšana vai savienošana → galīgā struktūras veidošana → attīrīšana → identitātes apstiprināšana → piemaisījumu analīze → satura apzīmēšana → galvenais raksturojums.

Dažiem peptīdiem ir nepieciešami arī papildu posmi, piemēram, ciklizācija, disulfīda saišu veidošanā, locīšanā, konjugācija vai citas ķīmiskas modifikācijas.

Šī iemesla dēļ pareiza ķēdes salikšana nenozīmē automātiski, ka galaproduktam ir atbilstoša identitāte, tīrība, stereochemija, konformācija, stabilitāte vai citas prasītās īpašības.

Peptīdu sintēze ir process, kurā tiek veidoti peptīdi, ķīmiski vai bioloģiski savienojot aminoskābes kopā ar peptīdsaitēm.

Noteiktas aminoskābju secības izveide

Peptīds sastāv din aminoskābju atlikumiem, kas savienoti ar peptīdsaitēm.

Peptīdu sintēzes mērķis ir izveidot šīs saites iepriekš noteiktā secībā, bieži vien vienlaikus kontrolējot:

• aminoskābju veidu;
• aminoskābju secība virknē;
• stereohīmija;
• N-gala struktūras;
• C gala struktūras;
• sānu ķēžu modifikācijas;
• disulfīda tiltiņu izvietojums;
• ciklizācijas;
• citu prasīto strukturālo īpašību.

Secvencei ir fundamentāla nozīme, jo identisks aminoskābju sastāvs var radīt dažādas molekulas, ja aminoskābes atrodas citā secībā.

Apgalvojums, ka konkrētā molekula ir „no piecām aminoskābēm sastāvs peptīds”, tātad sniedz ļoti maz informācijas par tās reālo struktūru. Lai pareizi aprakstītu molekulu, ir jāzina aminoskābju veids, to secība, stereochemija, gala grupas, kā arī iespējamās papildu modifikācijas.

Tādējādi diviem peptīdiem var būt pilnīgi vienāds aminoskābju sastāvs, un tomēr tās var būt dažādas molekulārās struktūras.

Papildu atšķirības var rasties ķēdes galu modifikāciju, disulfīda tiltiņu klātbūtnes, cikliska karkasa, sānu ķēžu izmaiņu vai atšķirīgas stereokīmiskās konfigurācijas dēļ.

Ķīmiskā peptīdu sintēze parasti izmanto aminoskābes, kuru reaktīvās grupas ir selektīvi aizsargātas.

Pagaidu aizsarggrupas ļauj izveidot konkrētu, iecerēto ķīmisko saiti, vienlaikus ierobežojot konkurējošās reakcijas citās molekulas vietās.

Turpmākajos plānotajos sintēzes posmos šīs grupas tiek noņemtas vai mainītas.

Kontrolēta reakcija spontānas savienošanās vietā

Pamata ķīmiskajos aprakstos peptīdsaites veidošanos bieži attēlo kā kondensācijas reakciju, kurā divas aminoskābes savienojas, kopumā izdalot ūdens molekulu.

Šāds vienādojums apraksta reakcijas kopējo bilanci.

Tomēr to nevajadzētu identificēt ar veidu, kā praksē tiek veikta kontrolēta peptīdu sintēze.

Vienkārša brīvo aminoskābju sajaukšana neļautu ticami noteikt:

• kurai aminogrupai jāreaģē;
• kurai karboksilgrupai jāreaktivē;
• kurai aminoskābei jābūt pirmajai;
• kuram jāatrodas otrajam;
• vai sāks reaģēt sānķēdes;
• vai stereochemija tiks saglabāta;
• vai neradīsies daudzi nevēlami produkti.

Tāpēc praktiskajā ķīmiskajā sintēzē izmanto kontrolētas funkcionālo grupu aktivizēšanas un aizsardzības stratēģijas.

Grupa, kas izriet no karboksilgrupas, parasti tiek aktivēta tā, lai tā varētu efektīvi reaģēt ar izvēlēto aminogrupu. Aizsarggrupas, reakciju secība, nesēja ķīmija, savienošanas reaģenti, šķīdinātāja vide un izolācijas metodes kopīgi palīdz virzīt reakciju paredzētā produkta virzienā.

Tāpēc efektīva peptīdu sintēze prasa kontroli gan pār ķīmiju, kurai ir jānotiek, gan pār to, kuru nepieciešams novērst.

Labs piemērs ir aspartimīda veidošanās.

Pētnieki izstrādāja alternatīvu karboksilgrupas aizsardzības metodi, kuras mērķis bija ierobežot šo problemātisko blakusreakciju peptīdu sintēzes laikā. [2]

Pētījums atklāj plašāku peptīdu ķīmijas principu: nevēlamu molekulāro pārvērtību novēršana var būt tikpat svarīga kā pareizās peptīdu saites izveide.

Kad peptīds ir uzskatāms par gatavu?

Lineārā peptīda skeleta izveides pabeigšana ne همیشه nozīmē visas sintēzes beigas.

Atkarībā no mērķa molekulas pēc ķēdes salikšanas var būt nepieciešami papildu posmi.

Tās var ietvert:

• pilnīga aizsarggrupju noņemšana;
• peptīda atšķelšana no cietā nesēja;
• pagaidu marķieru noņemšana;
• ciklizāciju;
• oksidēšana;
• disulfīda saišu veidošana;
• locīšana;
• konjugāciju;
• ķēdes galu modifikāciju;
• attīrīšana;
• analītisko raksturojumu.

Dažiem peptīdiem pēc ķēdes izveides ir nepieciešams salīdzinoši maz papildu strukturālo izmaiņu.

Citu gadījumā vēlākiem posmiem ir izšķiroša nozīme.

Labs piemērs ir liellopu aizkuņģa dziedzera tripsīna inhibitora (BPTI) sintēze. Pētnieki salika lineāru sekvenci, attīrīja materiālu un pēc tam ieguva salocītu struktūru, kas satur disulfīda tiltiņus. Saskaņā ar pētījumā sniegtajām analīzēm un funkcionālajiem salīdzinājumiem galvenais materiāls ar dabisko sekvenci atbilda dabiskajam olbaltumumam pētīto parametru ziņā. [3]

Šis piemērs parāda atšķirību starp peptīda karkasa izveidi un pilnībā raksturotas galīgās molekulārās formas iegūšanu.

Metode, kas ļauj iegūt pareizu lineāro secību, automātiski neapstiprina:

• pareizas locīšanas;
• pareizas disulfīda saišu izvietošanas;
• bioloģiskās aktivitātes;
• stabilitātes;
• piesārņojuma profilu;
• piemērotības noteiktam lietojumam.

Katrs no šiem jautājumiem prasa atsevišķus pierādījumus.

Ķīmiskā sintēze, bioloģiskā ekspresija un kombinētās metodes

Ķīmiskajā peptīdu sintēzē iepriekš sagatavoti molekulārie bloki tiek savienoti kontrolētās laboratorijas reakcijās.

Savukārt bioloģiskā ekspresija izmanto šūnu mehānismu, lai saražotu kodēto aminoskābju secību. Pēc tam materiāls ir jāatgūst, jāattīra un, ja nepieciešams, jāpakļauj tālākai apstrādei.

Abas metodes var novest pie peptīdu vai polipeptīdu iegūšanas, taču tās ir saistītas ar citām iespējām un ierobežojumiem.

Ķīmiskā sintēze var būt īpaši noderīga, ja ir nepieciešams:

• izvēlētas nestandarta aminoskābes;
• ķīmiskās modifikācijas konkrētās vietās;
• noteiktas ķēdes gala struktūras;
• izotopu marķieri;
• peptīda mugurkaula modifikācijas;
• citas īpašības, kuras ir grūti iegūt, izmantojot standarta bioloģisko ekspresiju.

Bioloģiskā ekspresija var būt pievilcīga piemērotu garāku sekvenču vai noteiktu marķēšanas stratēģiju gadījumā, taču tā nenovērš problēmas, kas rodas ražošanas vēlākos posmos.

Joprojām ir jāņem vērā materiāla atgūšana, locīšana, apstrāde, saimnieka organisma radītais piesārņojums, attīrīšana un analītiskā raksturojums.

Tāpēc neviena no metodēm nav universāli vislabākā.

Salīdzinot polipeptīdus, kas sastāv no 20–40 aminoskābju atlikumiem, gan sekvences garums, gan tās tendence agregēties ietekmēja cietfāzes sintēzes un baktēriju ekspresijas rezultātus. [1]

Šie novērojumi apstiprina pieeju, kurā ražošanas metode tiek izvēlēta konkrētai molekulai.

Vēsturiskos datus par veiktspēju, izmaksām, aprīkojumu un ražošanas laiku nevajadzētu uzskatīt par universālām mūsdienu vērtībām, jo tehnoloģiju, reaģentu, automatizācijas, attīrīšanas metodes un ražošanas ekonomika mainās līdz ar tehnoloģiju attīstību.

Cietsfāzes peptīdu sintēze

Augošā ķēde ir piesaistīta nešķīstošam nesējam

Cietfāzes peptīdu sintēzē (SPPS) augošā peptīda ķēde secīgos sintēzes ciklos paliek piesaistīta nešķīstošam nesējam.

Parasti par nesēju kalpo funkcionalizēta polimēra sveķi.

Saistviela jeb linkeris savieno peptīdu ar nesēju un ietekmē, cita starpā, gatavās ķēdes vēlākas atbrīvošanas veidu, kā arī iegūtās gala grupas veidu.

Viens no galvenajiem SPPS praktiskajiem ieguvumiem ir materiāla vieglāka sadalīšana.

Pēc noteiktā reakcijas posma beigām šķīstošos reaģentus un daudzus šķīstošos blakusproduktus var atdalīt ar skalošanu, kamēr augošais peptīds paliek piesaistīts cietajai fāzei.

Pateicoties tam, pēc katras nākamās aminoskābes pievienošanas nav nepieciešams izolēt un attīrīt augošo peptīdu kā atsevišķu, brīvu savienojumu.

Tomēr šīs ērtības var novest to svarīga pārpratuma.

Sveķu skalošana nenozīmē, ka visi nepareizie peptīdi ir atdalīti.

Ja pie sveķiem piesaistītā ķēde nereaģē viena savienošanas posma laikā, tā var turpināt palikt uz nesēja.

Nākamajos ciklos tā var atkal reaģēt un turpināt pagarināties.

Tā rezultātā var izveidoties delecijas sekvence jeb molekula, kas no mērķa peptīda atšķiras ar vienas vai vairāku aminoskābju atlikumu trūkumu.

Līdzīgi ķīmiski modificētas vai nepilnīgi atbloķētas sveķiem piesaistītās ķēdes var piedalīties turpmākajos sintēzes posmos.

SPPS tādējādi atvieglo šķīstošo vielu atdalīšanu no pie sveķiem piesaistītā materiāla.

Tomēr es negarantēju ideālu sekvenču atbilstību.

Atkārtots atbloķēšanas un sajūgšanas cikls

Tipiska pakāpeniska SPPS sintēze ietver trīs pamatoperāciju atkārtošanu:

drošinātāja noņemšana → sakabināšana → skalošana.

Vispirms tiek atsegta reaktīvā amingrupa, kas atrodas augošā ķēdes galā.

Pēc tam ķēdei tiek pievienota nākamā aizsargātā aminoskābe.

Šķīstošie reaģenti, aminoskābes pārākums un daudzi reakcijas produkti tiek aizvākti pirms nākamā cikla sākuma.

Šī procesa atkārtošana ļauj veidot peptīdu pa vienam aminoskābes atlikumam.

Klasiskajā SPPS C-gala atlikums parasti tiek piesaistīts nesējam pirmais, un pēc tam ķēde tiek pagarināta N-gala virzienā.

Tas atšķiras no standarta ribosomālās olbaltumvielu sintēzes, kuras laikā secīgas aminoskābes tiek pievienotas augošās ķēdes C-galam.

Tomēr galīgā aminoskābju secība var būt identiska, lai gan salocīšanās procesa virziens un ķīmija ir atšķirīgi.

Terminu „cikls” nevajadzētu saprast kā vienu universālu reakcijas apstākļu kopumu, kas būtu piemērots jebkuram atlikumam un jebkurai secībai.

Reakcijas gaita var būt atkarīga no:

• aizsardzības grupu stratēģijas;
• aminoskābes veida;
• telpisko apstākļu ap reakcijas vietu;
• sveķu veida;
• saite;
• ķēdes garumi;
• agregācija;
• šķīdinātāja;
• savienošanas ķīmija;
• augošā peptīda strukturālās uzvedības.

Reakcija, kas sinēzes sākumā norit viegli, vēlākā posmā var kļūt daudz grūtāka.

Tāpēc procesa uzraudzība joprojām ir svarīga pat augsti automatizētās sistēmās.

Kpēc sveķu īpašības ir svarīgas?

Pastāvīgais datu nesējs nav tikai pasīvs turētājs.

Tā fiziskās un ķīmiskās īpašības var tieši ietekmēt reakcijas gaitu.

Viens no svarīgiem parametriem ir uzbrišana.

Ja sveķi pareizi uzbriest izvēlētajā šķīdinātāja vidē, reaģenti var vieglāk piekļūt reaktīvajām vietām, kas atrodas visā polimēra struktūrā.

Nepietiekama sveķu uzbriešana vai struktūras izmaiņas var ierobežot šo piekļuvi.

Nozīme var būt arī:

• blīvums;
• polimēru arhitektūra;
• saiteņu struktūra;
• saderība ar šķīdinātājiem;
• mehāniskā stabilitāte;
• porainība;
• difūzijas īpašības;
• mijiedarbība starp augošajiem peptīdu ķēdēm.

Palielinoties peptīda garumam, atsevišķas ķēdes var arī savstarpēji mijiedarboties.

Agregācija uz sveķiem var ierobežot piekļuvi reaģējošajām vietām un izraisīt nepilnīgu saistīšanu vai nepilnīgu atbrīvošanu.

Tas nozīmē, ka secība, kas syntēzes sākumā uzvedas pareizi, łaķa pagarinoties var kļūt arvien grūtāka.

Pētnieki ir izstrādājuši plūsmas reaktoru ar mainīgu slāni, kas ļāva uzraudzīt sveķu uzbriešanu, pamatojoties ar spiedienu saistītiem mērījumiem. [4]

Pētījumā galvenā uzmanība tika pievērsta sveķu agregācijai un nepilnīgai saišu veidošanai kā procesa problēmām, kuras citos apstākļos sintēzes laikā var būt grūti tieši novērot.

Tas parāda, ka datu nesēja fiziskās uzvedības uzraudzīšana var sniegt informāciju, kas sniedzas tālāk par vienkāršu pievienoto reaģentu reģistrēšanu.

Kam izmanto Vanga sveķus?

Vanga saistvielu ķīmija tiek plaši izmantota cietfāzes peptīdu sintēzē (SPPS), ja pēc peptīda atšķelšanas ir nepieciešams C-gals karbonskābes formā.

Peptīds ir piesaistīts, izmantojot estera saiti, kuru vēlākdos apstākļos var sašķelt.

Citstingas saistvielu sistēmas var izvēlēties tad, ja ir nepieciešama atšķirīga C-gala struktūra, piemēram, amīds.

Ir vērts nošķirt saistvielas ķīmiju no visa fiziskā nesēja.

Saistītos Vanga tipa linkerus var ievadīt dažādās polimēru arhitektūrās.

Šādiem materiāliem nav obligāti jābūt identiskiem:

• uzbriešanas īpašības;
• ietilpība;
• saderība ar šķīdinātājiem;
• mehānisko īpašību;
• uzvedība reakcijas laikā.

Pētījumi, kuros izmantoti peptidil-Wang-TentaGel nesēji, uzrādīja specializētu alternatīvu metodi peptidilhidrazīdu iegūšanai, kas ir noderīgi starpprodukti peptīdu ķīmijā. [5]

Tas nenozīmē, ka standarta atšķeltspēja no Vanga sveķiem parasti izraisa peptīdu hidrazīdu veidošanos.

Tomēr tā parāda svarīgu principu:

nesējs + saite + reakcijas apstākļi + šķelšanās ķīmija kopā nosaka iegūto produktu.

Cietā fāzes peptīžu sintēze periodiskajā un plūsmas sistēmā

SPPS var veikt klasikātos periodiskās darbības traukos vai sistēmās, kur reaģenti plūst caur reaktoru, kas satur cieto nesēju.

Plūsmas sistēmas var nodrošināt ātru reaģentu apmaiņu un precīzāku sveķus apņemošās ķīmiskās vides kontroli.

2014. gada pētījumā tika prezentēta ātrā peptīdu sintēze plūsmas sistēmā ar nepārtrauktu monitoringu un tā tika pielietota vairākiem peptīdiem un nelielam olbaltumam. [6]

Vēlākā automatizētā pētījumā tika aprakstīta ievērojami ātrāka ķēžu montāža, analizētajiem piemēriem sasniedzot neapstrādāta produkta tīrību un izolēto iznākumu, kas ir salīdzināmi ar klasisko ciklisko sintēzi. [7]

Šie pētījumi parāda konkrētu sistēmu iespējas noteiktos apstākļos.

Tomēr tās nepierāda, ka jebkuru peptīdu var ražot tikpat ātri un ar tādu pašu kvalitāti.

Laiks, kas nepieciešams peptīda saražošanai, ietver arī daudz ko vairāk nekā tikai pašas ķēdes veidošanu.

Kopējais process var ietvert:

• reaģentu sagatavošana;
• sveķu sagatavošana;
• sakabināšana;
• drošinātāja noņemšana;
• skalošana;
• atdalīšana;
• produkta apstrādi;
• attīrīšana;
• šķīdinātāju noņemšana;
• galīgā struktūras veidošana;
• analītiskie pētījumi;
• dokumentāciju.

Tāpēc ātra sasaistīšana ir tikai viens no kopējās ražošanas efektivitātes elementiem.

Sintēze šķidrajā fāzē

Ko nozīmē šis termins?

Termins „peptīdu sintēze šķidrajā fāzē” var tikt lietots vairākās nozīmēs.

Plašākā nozīmē tas var vienkārši nozīmēt šķīdumā veiktu peptīdu sintēzi.

Tomēr specializētākajā literatūrā bieži tiek nošķirts:

1. klasisko peptīžu sintēzi šķīdumā;
2. cietfāzes peptīdu sintēze;
3. jaunākas LPPS metodes, kurās augošajai ķēdei ir šķīstošs marķieris vai nesējs.

Šī atšķirība ir svarīga, jo mainās produkta sadalīšanas un atgūšanas veids.

Brīvi izšķīdināts, aizsargāts peptīda starpprodukts var būt jāizolē, izmantojot tā paša fizikālās un ķīmiskās īpašības.

Marķēta pusfabrikāta gadījumā marķieri var izstrādāt tā, lai tas atvieglotu nogulsnēšanu, ekstrakciju, aizturi uz membrānas vai citu atdalīšanas veidu.

Pārskats par LPPS skaidri nošķir klasisko sintēzi šķīdumā, SPPS un metodes, kurās izmanto šķīdināmus marķierus. [8]

Publikācija ir noderīga terminoloģijas un metodoloģijas sakārtošanai.

Tomēr to nevajadzētu interpretēt kā vienu eksperimentu, kas pierāda, ka viena metode ir vislabākā katram peptīdam.

Klasiskā peptīdu sintēze šķīdumā

Klasiskajā šķīduma sintēzē aizsargātie aminoskābes, peptīdu starpprodukti vai fragmenti paliek izšķīduši reakcijas vidē, nevis ir kovalenti piesaistīti nešķīstošai sveķu matricai.

Pēc reakcijas beigām attiecīgais starpprodukts var tikt izolēts, attīrīts un, ja nepieciešams, raksturots pirms nākamā posma uzsākšanas.

Tas var sniegt zināmas priekšrocības.

Pētnieki var:

• raksturot atsevišķus pusproduktus;
• pielāgot attīrīšanas metodi konkrētam starpproduktam;
• optimizēt atsevišķas pārvērtības;
• gatavot fragmentus neatkarīgi;
• modificēt sintēzes maršrutu, ja noteikts starpprodukts rada problēmas.

Tomēr sintēze šķīdumā var būt saistīta arī ar ievērojamām grūtībām.

Līdz ar peptīda ķēdes pagarināšanos tie var:

• kļūt mazšķīstošam;
• apkopot;
• būt grūti kristalizējamam;
• radīt cieši radniecīgus piemaisījumus;
• būt grūti atdalāmiem;
• pieprasīt dubultu izolāciju;
• radīt materiāla zudumus nākamo apstrādes posmu laikā.

Tāpēc sintēze šķīdumā nav automātiski vienkāršāka vai vieglāk mērogojama nekā SPPS.

Tās noderība ir atkarīga no konkrētās secības, starpproduktu stabilitātes, šķīdības, sintēzes maršruta garuma, uzvedības attīrīšanas laikā un nākamo izolācijas posmu efektivitātes.

LPPS marķēto stratēģiju attīstība daļēji izriet no mēģinājumiem atrisināt tieši šīs problēmas, kas saistītas ar separāciju un materiāla apstrādi. [8]

Šķīstošie marķieri apvieno reakciju projektēšanu ar separācijas projektēšanu

Marķētā LPPS augošajam peptīdam ir pagaidu molekulārais piesaistījums, kas izstrādāts tā, lai ietekmētu tā fizikālās īpašības.

Marķieris var nodrošināt peptīda pietiekamu šķīdību reakcijas laikā un pēc tam atvieglot tā selektīvu atgūšanu.

Atkarībā no tehnoloģijas atdalīšana var izmantot:

• izgulsnēšana;
• ekstrakciju;
• aizture uz membrānas;
• fāžu uzvedība;
• citas īpašības, kas izriet no taga klātbūtnes.

Vienā no eksperimentālajām stratēģijām C-galā tika izmantota garas ķēdes aizsarggrupa peptīdu amīdu sagatavošanai.

Atkārtotās reakcijas un nogulsnēšanas posmi ļāva pētniekiem sagatavot hidrofobu peptīdu, ko viņu izmantotajā salīdzinājumā bija grūti apmierinoši iegūt ar SPPS metodi. [9]

Tas parāda šīs konkrētās stratēģijas lietderību analizētajai secībai.

Tomēr tas nepierāda iezīmētās sintēzes universālu pārsvaru.

Marķieris kļūst par ražošanas procesa sastāvdaļu un rada jaunus jautājumus:

• Cik efektīvi tas tiek pievienots?
• Vai tas maina reakcijas gaitu?
• Kā var droši atgūt marķētu pusfabrikātu?
• Vai tas rada jaunu piesārņojumu?
• Kā tas tiek izņemts?
• Vai var apstiprināt pilnīgu dzēšanu?
• Kādas analītiskās metodes apstiprina tā neesamību galaproduktā?

Tāpēc šķīstošie marķieri būtu jāuztver kā funkcionāli procesa dizaina elementi, nevis vienkārši kā vienkāršas etiķetes.

Galveno metožu salīdzinājums

Salīdzinājumā ir parādīti atsevišķu metožu vispārējie darbības principi.

Tas nenorāda, kura no tām nodrošinās vislabāko veiktspēju, tīrību, izmaksas, vides ilgtspēju vai mērogojamību konkrētai sekvencei.

Šie parametri ir jānovērtē, pamatojoties uz reālu molekulu un konkrētu ražošanas procesu. [4] [8] [9]

Fragmentu savienošana un hibrīdra ražošana

Peptīds ne vienmēr ir jāveido vienā nepārtrauktā procesā, kas sastāv no secīgas aminoskābju atlikumu pievienošanas.

Alternatīva stratēģija ir atsevišķa īsāku peptīdu fragmentu sagatavošana un to savienošana.

Hibrīda process var piemēram izmantot SPPS atsevišķu fragmentu iegūšanai un ķīmiju šķīdumā to savienošanai.

Fragmentārās stratēģijas var mazināt dažas problēmas, kas saistītas ar ļoti garu pakāpenisku sintēzi.

Tomēr tās rada jaunas problēmas, piemēram:

• atbilstošas savienojuma vietas izvēle;
• fragmentu šķīdība;
• savienojuma vietas aktivizēšana;
• ķīmiskā selektivitāte;
• stereochemijas saglabāšana;
• blakusparādības;
• fragmentu attīrīšana;
• tīrīšana pēc to savienošanas.

Svarīgs kontrolētas fragmentu savienošanas piemērs ir natīvā ķīmiskā ligācija.

Klasiskajā versijā tioestera peptīds reaģē ar citu peptīdu, kas satur N-gala cisteīnu. Tam sekojoša pārgrupēšanās noved pie pareizas saites veidošanās peptīda karkasā ligācijas vietā.

Sākotnējie pētījumi uzrādīja iespēju pēc ligācijas un locīšanas iegūt olbaltumvielu, kas satur disulfīda saites. [10]

Tas apstiprina šīs fragmentu apvienošanas stratēģijas nozīmi.

Tomēr tas nenozīmē, ka jebkuri divi nemodificēti peptīdu fragmenti var spontāni savienoties.

Savienošana un aizsarggrupas

Savienošana rada apzinātu savienojumu

Sasaistīšana ir reakcijas posms, kura laikā starp izvēlētajām vienībām izveidojas jauna peptīdsaite.

Parasti karboksilgrupa tiek aktivēta tā, lai tā varētu efektīvi reaģēt ar atbilstošo aminogrupu.

Aktivācijas ķīmijai jāatbilst:

• augošā secībā;
• pagaidu aizsardzības grupām;
• sānu ķēžu aizsardzību;
• stereochemiju;
• nesējs vai atzīme;
• šķīdinātāja videi;
• ar citām molekulā esošajām funkcionālajām grupām.

Efektīva savienošana ir īpaši svarīga pakāpeniskajā sintēzē, jo nepilnīga reakcija var novest pie delecijas secību veidošanās.

Ja viens aminoskābes pievienošanas posms neizdodas daļai augošo ķēžu, šādas ķēdes var palikt sistēmā un piedalīties nākamajos ciklos.

Rezultātā var rasties molekulas, kas ir ļoti līdzīgas mērķa peptīdam, bet kurām trūkst viena atlikuma.

Tāpēc pat nelielas neefektivitātes var uzkrāties daudzajos sintēzes posmos.

Vienkāršs matemātiskais piemērs labi ilustrē šo problēmu.

Ja katrā no 50 neatkarīgajiem montāžas posmiem būtu 99% varbūtība gūt panākumus, to daļiņu īpatsvars, kurām visi posmi beigtos veiksmīgi, būtu:

0,99^50 ≈ 0,605

proti apmēram 61%.

Šī ir tikai matemātiska ilustrācija.

Tas nav reālas tīrības vai 50 atlikumu peptīda sintēzes efektivitātes prognoze.

Faktiskā ražošana ietver:

• dažāda sajūguma efektivitāte dažādās pozīcijās;
• drošinātāja noņemšanas posmi;
• blakusparādības;
• no sekvences atkarīgas grūtības;
• atjaunotās saistīšanas stratēģija;
• zudumi atdalīšanas laikā;
• zaudējumi tīrīšanas laikā;
• citi procesa mainīgie.

Aprēķins tikai parāda, kāpēc pat šķietami neliela viena posma neefektivitāte var iegūt lielu nozīmi daudzposmu sintēzē.

Aizsarggrupas kontrolē reakcijas vietu

Aminoskābei var būt vairākas ķīmiski reaģējošas grupas.

Bez selektīvas kontroles sajūguma reakcijas varētu norisināties nevēlamās vietās.

Aizsarggrupas īslaicīgi bloķē atlasītās reaktīvās vietas.

Amīngrupa, ko izmanto ķēdes pagarināšanai, parasti prasa pagaidu aizsardzību, savukārt reaktīvajām sānķēdēm var būt nepieciešama aizsardzība, kas paliek savā vietā vairākus sintēzes ciklus.

Savienojumam ar nesēju arī ir jāiztur šie posmi līdz pat plānotajai atdalīšanai.

Aizsarggrupu izvēle tāpēc ietekmē visu sintēzes stratēģiju.

Ir jāņem vērā:

• to ieviešanas veids;
• stabilitāte;
• noņemšanas veids;
• saderība ar citām aizsardzības grupām;
• saderība ar datu nesēju;
• blakusparādības;
• konkrētās sekvences ietekme;
• galīgie atbloķēšanas nosacījumi.

Pētījumos, kuros izmantota uz cianosulfurilīda balstīta aizsardzība, tika pētīta aspartimīda veidošanās, mainot karboksilgrupas aizsardzības veidu. [2]

Rezultāti rāda, ka aizsarggrupu stratēģija ietekmē ne tikai to, vai var norisināties paredzētā reakcija, bet arī to, kādas nevēlamas reakcijas kļūst iespējamas.

Fmoc, Boc un ortogonālā aizsardzība

Fmoc un Boc ir plaši lietotas aminosgrupu aizsarggrupas.

Tie būtiski atšķiras ar savu likvidēšanas veidu.

Fmoc parasti tiek noņemts bāziskos apstākļos, turpretī Boc ir jutīgs pret skābiem apstākļiem.

Šīs īpašības ļauj tos izmantot kā plašāku aizsardzības stratēģiju elementus.

Populārajā SPPS, kas balstīta uz Fmoc, pagaidu N-gala Fmoc aizsarggrupa tiek vairākārt noņemta, savukārt izvēlētas sānķēžu aizsarggrupas un saistījums ar sveķiem paliek neskarti līdz vēlākiem posmiem.

Citas stratēģijas var izmantot atšķirīgas kombinācijas.

Īpaši svarīgs jēdziens ir ortogonālā aizsardzība.

Divas aizsarggrupas tiek uzskatītas par ortogonālām, ja vienu var selektīvi noņemt apstākļos, kuros otra paliek pietiekami stabila, lai varētu turpināt sintēzi.

Ortogonalitāte tātad ir praktiska ķīmiskās saderības attiecība.

Tas nenozīmē, ka katra aizsargātā grupa paliks pilnīgi nemainīga pēc neierobežota skaita pakļaušanas visiem reakcijas apstākļiem.

Blakusparādības joprojām var rasties.

Fmoc sintēzes pētījumos ir aprakstīta gan aspartimīda veidošanās, gan nevēlamas stereoķīmiskās izmaiņas, neraugoties uz kopējās aizsardzības stratēģijas paredzēto selektivitāti. [11]

Stereochemija ir molekulas identitātes daļa

Daudzām aminoskābēm ir hirāls centrs.

Tas nozīmē, ka to atomi var ieņemt dažādus telpiskos izkārtojumus, kas atbilst dažādām stereochemiskām formām.

Viena stereogēnā centra konfigurācijas maiņa var izraisīt citas peptīda struktūras rašanos, nemainot tā nominālo masu.

Tāpēc pati masa vien nevar apstiprināt pilnīgu peptīda identitāti.

Epimerizācija parasti nozīmē viena stereogēnā centra konfigurācijas maiņu molekulā, kurā ir vairāki šādi centri.

Racemizācija tiek arī bieži apspriesta peptīdu ķīmijā saistībā ar aminoskābju atlikumu stereochemiskās integritātes zudumu.

Šīs izmaiņas ir būtiskas, jo molekulārā atpazīšana var būt spēcīgi atkarīga no atomu telpiskā izvietojuma.

Tādējādi divas molekulas ar vienādu elementāro sastāvu un nominālo masu var uzvesties atšķirīgi, ja tām ir atšķirīga stereochemija.

Pētījumā par mikroviļņu palīdzību veikto Fmoc sintēzi tika konstatēts, ka noteikti atlikumi bija jutīgi pret nevēlamām stereokīmiskām izmaiņām izmantotajos apstākļos. Metodes modifikācija ierobežoja šo reakciju rašanos. [11]

Tas nenozīmē, ka sildīšana pēc definīcijas sabojā visus peptīdus.

Pareizais secinājums ir tāds, ka reakcijas paātrināšana ir jāvērtē kopā ar no sekvences atkarīgo ķīmisko selektivitāti.

Aspartāms un citi saistīti piemaisījumi

Aspartimīda veidošanās ir zināma blakusreakcija, kas skar noteiktas sekvenču grupas, kuras satur asparagīnskābi.

Var veidoties nevēlams ciklisks starpprodukts, no kura pēc tam veidojas savienojumi ar mainītu karkasa savienojumu vai stereoķīmiju.

Šīs reakcijas varbūtība ir atkarīga no secības un procesa apstākļiem.

Citi ar sintēzi saistīti netīrumi var rasties no:

• nepilnas saistīšanās;
• nepilnas atbloķēšanas;
• delecijas sekvenču veidošanās;
• sānu ķēžu reakcijas;
• stereochemisko izmaiņu;
• reakcijas atšķelšanas laikā;
• oksidēšanās;
• pārgrupēju;
• produkta apstrādes apstākļu;
• nepilnīgas aizsarggrupu noņemšanas.

Daži piesārņojumi izraisa viegli pamanāmas molekulmasas izmaiņas.

Citas ir daudz grūtāk atšķiramas.

Sintētiskā renīna substrāta peptīda analītiskajos pētījumos tika identificēti vairāki piemaisījumi, tostarp komponenti, kuriem ir vienādas masas izmaiņas, bet kuri satur modifikācijas dažādās pozīcijās. [12]

Lai tos atšķirtu, bija nepieciešama papildu strukturālā analīze.

Pētnieki arī izvirzītos šo piesārņotāju rašanās mehānismus uzskatīja par hipotēzēm.

Šī ir svarīga atšķirība:

piesārņojuma definēšana un tā rašanās precīzā mehānisma pierādīšana ir divi dažādi zinātniski jautājumi.

Varbūtējo mehānismu nevajag uzskatīt už apstiprinātu tikai tāpēc, ka tas atbilst novērotajai molekulmasai.

Attīrīšana, mērogošana un ražošanas kvalitāte

Neapstrādāts produkts, attīrīts produkts un iznākums

Neapstrādāts peptīds ir materiāls, kas iegūts pirms atbilstošu attīrīšanas posmu pabeigšanas.

Var saturēt:

• mērķa peptīds;
• delecijas sekvences;
• materiāls nav pilnībā atdrošināts;
• modificētās secības;
• reaģentu atliekas;
• atdalīšanas produkti;
• zole;
• šķīdinātāji;
• citas sastāvdaļas, kas rodas procesā.

Attīrīšanas mērķis ir atdalīt mērķa peptīdu no šī maisījuma.

Skaidri jānošķir trīs jēdzieni:

neattīrītā produkta tīrība — materiāla sastāvs, kas izmērīts pirms galīgās attīrīšanas;

attīrīta vai izolēta produkta iznākums — iegūtā mērķa materiāla daudzums attiecībā pret noteiktu sākotnējo vai teorētisko vērtību;

gala tīrība — izolētā materiāla sastāvs, kas noteikts, izmantojot konkrētu analītisko metodi.

Šie jēdzieni nav savstarpēji aizvietojami.

Process var radīt lielu daudzumu izejmateriāla, bet ļauj atgūt salīdzinoši nelielu attīrītā produkta daudzumu.

Cits process vardot dot mazāk izejmateriāla, bet izcelties ar augstu mērķa produkta veidošanās selektivitāti.

Līdzīgi augsta analītiskā tīrība nenozīmē augstu ražošanas efektivitāti.

Paātrinātās plūsmas sintēzes pētījumos pareizi tika ziņots atsevišķi par izejmateriāla tīrību un iznākumu pēc izolēšanas. [7]

Hromatogrāfija atdala komponentus, bet neatbild uz katru jautājumu

Augstas izšķirtspējas apgrieztās fāzes šķidruma hromatogrāfija (RP-HPLC) tiek plaši izmantota peptīdu analīzei un attīrīšanai.

Dažādas molekulas dažādi mijiedarbojas ar stacionāro un mobilo fāzi.

Atbilstošos apstākļos šīs atšķirības ļauj atdalīt maisījuma sastāvdaļas.

Analītiskajai un preparatīvajai hromatogrāfijai ir saistīti, bet atšķirīgi pielietojumi.

Analītiskā HPLC galvenokārt tiek izmantota paraugu sastāva izpētei.

Preparat HPLC tiek izmantots atdalīto komponentu fiziskai savākšanai.

Hromatogramš var sniegt daudz vērtīgas informācijas.

Tomēr lielu galveno piku vai tā laukuma augstu procentuālo īpatsvaru nevajadzētu uzskatīt par pilnīgu molekulāro raksturojumu.

Hromatogrāfijas rezultāti cita starpā ir atkarīgi no:

• kolonnas veids;
• kustīgās fāzes;
• gradients;
• temperatūras;
• noteikšanas metodes;
• viļņa garumi;
• parauga sagatavošana;
• integrācijas metožu;
• izšķirtspējas;
• piesārņojuma īpašības.

Divi savienojumi var potenciāli eluēt vienā un tajā pašā laikā.

Dažas parauga sastāvdaļas var arī dažādi reaģēt uz izmantoto detektoru.

Tāpēc augsta virsmas tīrība HPLC neesot pilnīgs molekulārās identitātes apstiprinājums.

Izobārisku peptīdu piemaisījumu pētījumi un hirālā analīze parāda, kāpēc var būt nepieciešamas papildu analītiskās metodes. [12] [13]

Analītiskajai metodei jāatbilst konkrētam strukturālajam jautājumam.

Identitāte, tīrība un saturs nozīmē dažādas lietas

Peptīdu raksturojumā īpaši svarīgi ir trīs jēdzieni.

Identitāte atbild uz jautājumu:

Vai paraugā atrodas paredzētā molekula?

Tīrība atbild uz jautājumu:

Kādi citi komponenti atrodas paraugā vai kura mērītā signāla daļa atbilst galvenajam komponentam?

Saturs atbild uz jautājumu:

Cik daudz reālā peptīda ir paraugā?

Uz šiem jautājumiem ne siempre var atbildēt ar vienu mērījumu.

Materiāls, kas satur peptīdu, var saturēt arī:

• ūdeni;
• pretjons;
• zole;
• šķīdinātāju atliekas;
• citas ar procesu saistītas sastāvdaļas;
• piesārņojums.

Tādējādi nosvērtā materiāla kopējā masa var neatbilst paša peptīda masai.

Līdzīgi izmērītās molekulmasas sakritība ar teorētisko vērtību neapstiprina:

• pilnas aminoskābju secības;
• pareizas atsevišķu atlikumu savienošanās;
• stereochemiskās integritātes;
• disulfīda tiltiņu izvietojums;
• kocēšana; ielocīšana;
• izobāro piemaisījumu trūkuma.

Masu spektrometrija var sniegt spēcīgus pierādījumus par molekulmasu.

Tandemā masu spektrometrija un citas strukturālās tehnikas var sniegt papildu informāciju par secību.

Hiralgrie metodes ļauj analizēt stereokīmiskus jautājumus, kurus nav iespējams atrisināt ar parastu masas mērījumu.

Viņā no analītiskajiem pētījumiem pat tikaņemta vērā racemizācija, kas rodas parauga sagatavošanas laikā. Tas parāda vēl vienu svarīgu principu: pati analītiskā procedūra var radīt artefaktus, ja tā nav pareizi izstrādāta. [13]

Locīšana un aktivitāte var pieprasīt atsevišķu apstiprinājumu

Strukturāli ierobežotiem peptīdiem un maziem olbaltumvielu savienojumiem pareiza secība un molekulmasa joprojām var nebūt pietiekama, lai apstiprinātu paredzēto gala struktūru.

Papildu jautājumi var ietvert:

• Vai ir izveidojušies pareizie disulfīda tiltiņi?
• Vai molekula ieņēma paredzēto konformāciju?
• Vai ciklizācija ir pabeigta?
• Vai ir klāt strukturālie izomēri?
• Vai sintētiskā molekula uzrāda paredzēto aktivitāti noteiktajā eksperimentālajā testā?

BPTI sintēzes pētījumā tika izmantotas vairākas analītiskās un biofizikālās metodes kopā ar tripsīna inhibīcijas novērtējumu. [3]

Kopējie rezultāti apstiprināja dabiskās secības sintētiskā materiāla atbilstību dabiskajam olbaltumam pētītajos kritērijos.

Tomēr aktivitātes tests atbild uz noteiktu funkcionālu jautājumu.

Neaizstāj piesārņojuma analīzi.

Līdzīga aktivitāte vienā testā neapstiprina visu bioloģisko, strukturālo vai ražošanas īpašību pilnīgu ekvivalenci.

Ražošanas mērogmaiņa maina vairāk nekā tikai materiāla daudzumu

Ražošanas mēroga palielināšana nenozīmē tikai visu reaģentu daudzuma proporcionālu palielināšanu.

Fiziskie procesi lielākā mērogā var uzvesties citādi.

Nozīme var būt:

• maisīšana;
• siltummaiņa;
• reaģentu izplatīšana;
• difūzija;
• sveķu uzbriešana;
• spiediens;
• filtrēšana;
• šķīdinātāju saimniecība;
• izgulsnēšana;
• pusfabrikātu šķīdība;
• masveida transports;
• attīrīšanas sistēmas iespējas.

Šie faktori var ietekmēt gan reakcijas gaitu, gan piemaisījumu veidošanos.

Attīrīšana vēlākajos posumos arī var kļūt par visas ražošanas vieso vietu.

Sintēzes ātruma palielināšanai ir ierobežota nozīme, ja attīrīšanas sistēma nespēj efektīvi atdalīt radušos piemaisījumus vai atgūt prasītās kvalitātes produktu.

Rūpīgā analīzē, kas ietvēra 40 peptīdu sintēzes procesus no 14 farmācijas uzņēmumiem, tika novērtēts materiālu patēriņš sintēzes, attīrīšanas un izolēšanas laikā. [14]

Pētījums parāda, kāpēc ražošanas novērtēšana ir jāveic visam procesam.

Tas siiski nenozīmē, ka katra rūpnīca, secība vai ražošanas tehnoloģija sasniedz identiskus rezultātus.

Ražošanas kvalitāte ir daudzu kontroles elementu rezultāts

Uzticama peptīdu ražošana prasa vairāk nekā tikai viena apmierinoša analītiskā rezultāta iegūšanu.

Kontrolēts process parasti ietver vairākus saistītus elementus:

definēta mērķa molekula → piemēroti izejmateriāli → kontrolēta sintēze → kontrolēta attīrīšana → atbilstoša paraugu ņemšana → validēta vai mērķim atbilstoša analīze → sērijas dokumentācija.

Partijas dokumentācija saista analītiskos rezultātus ar materiālu, kas faktiski ir ticis ražots.

Analīzes sertifikāts (COA) apkopo konkrētas partijas atlasītos testa rezultātus.

Tā informatīvā vērtība ir atkarīga no:

• veikto izmeklējumu veida;
• izmantotajām metodēm;
• šo metožu lietderību;
• specifikācija;
• parauga identifikācija;
• partiju izsekojamības iespējas;
• apstiprinājumu tam, ka ziņotie rezultāti patiešām attiecas uz attiecīgo materiālu.

Viena pati vērtība, kas definēta kā „tīrība”, nevar pati par sevi apstiprināt:

• pilnas molekulārās identitātes;
• peptīda saturu;
• stereochemiskās integritātes;
• atlikušo šķīdinātāju līmeni;
• ūdens satura;
• pretjonu sastāva;
• mikrobioloģiskās īpašības;
• kocēšana; ielocīšana;
• bioloģiskās aktivitātes;
• atbilstību noteiktam mērķim.

Atbilstošais analīžu komplekts ir atkarīgs no materiāla paredzētā lietojuma.

Peptīds, ko izmanto kā analītisko references materiālu, pētniecisko reaģentu, ko izmanto šūnu eksperimentā, un materiāls, kas atrodas farmaceitiskās izstrādes stadijā, var pieprasīt atbildes uz citiem kvalitatīvajiem jautājumiem.

Analītiskie pierādījumi tāpēc ir jāinterpretē skaidri definētā kontekstā, nevis kā universāls kvalitātes apstiprinājums.

Vides ilgtspējas novērtējumam ir jāaptver viss process

Peptīdu sintēze var prasīt ievērojamu šķidinātāju un reaģentu daudzumu.

Tāpēc ietekmes uz vidi novērtējumam būtu jāņem vērā daudz kas vairāk nekā tikai pati savienošanas fāze.

Pie svarīgiem elementiem var piederēt:

• celtniecības bloku sagatavošana;
• savienotājiesto reaktīvi;
• reaģenti atdrošināšanai;
• skalošana;
• atdalīšana;
• produktu apstrāde;
• hromatogrāfija;
• šķīdinātāju maiņa;
• izolācija;
• žāvēšana;
• atkritumu apsaimniekošana.

Vides ietekces samazināšana var prasīt vairāku posmu vienlaicīgu uzlabošanu.

Publicētajā analīzē par peptīdu ražošanu tika apspriestas problēmas, kas saistītas gan ar sintēzi, gan attīrīšanu, un norādīts uz nepieciešamību uzlabot visu procesa dizainu. [15]

Tā kā tā ir perspektīva publikācija, tā nav kontrolēta tieša salīdzinoša analīze, kas pierādītu, ka viena konkrētā tehnoloģija vienmēr ir videi draudzīgāka.

Līdzīgi:

ātrāka sintēze automātiski nenozīmē videi draudzīgāku sintēzi,

savukārt mazāks šķīdinātāju patēriņš pašā sintēzē automātiski nenozīmē mazāku visu ražošanas procesa ietekmi.

Vides salīdzinājumi prasa izmantot konsekventas analīzes robežas un vislabāk būtu, ja resursu patēriņš tiktu saistīts ar noteiktu izolēta un raksturota galaprodukta daudzumu.

Biežāk uzdotie jautājumi

1. Ar ko peptīdu sintēze cietajā fāzē atšķiras no sintēzes šķidrajā fāzē?

Cietas fāzes sintēzē augošais peptīds paliek piesaistīts nešķīstošam nesējam, savukārt klasiskajā šķīduma sintēzē peptīda starpprodukts paliek izšķīdušā veidā un parasti ir jāatgūst, pamatojoties uz tā fizikālajām un ķīmiskajām īpašībām. Šaurākā nozīmē LPPS gadījumā izšķīdinātajai augošajai ķēdei papildus ir šķīstošs marķieris vai nesējs, kas atvieglo vēlāku atdalīšanu. Marķētas sintēzes pētījumi parāda vienu no stratēģijām, kā apvienot šķīduma ķīmiju ar atgūšanu, izmantojot nokrišņu veidošanos, savukārt literatūra par LPPS šādus risinājumus nošķir gan no klasiskās sintēzes šķīdumā, gan no SPPS. Neviena metode pēc definīcijas nav optimāla katram peptīdam. Būtiskā atšķirība attiecas uz augošās ķēdes fiziskās vadīšanas un atdalīšanas veidu sintēzes secīgo posmu laikā. [8] [9]

2. Kāpēc peptīdu sintēzes laikā var rasties piemaisījumi?

Piesārņojums var rasties tāpēc, ka paredzētās reakcijas ne همیشه norisinās kvantitatīvi un citas funkcionālās grupas var iesaistīties nevēlamās reakcijās. Nepilnīga savienošana var novest pie delēcijas sekvencēm, nepilnīga deblokēšana var traucēt turpmāku ķēdes veidošanos, un dažas sekvences ir uzņēmīgas pret stereoķīmiskām izmaiņām, aspartimīda veidošanos, oksidēšanos, pārgrupējumiem vai blakusproduktiem, kas saistīti ar atšķelšanu. Fmoc sintēzes pētījumi un sintētisko peptīdu piemaisījumu strukturālā analīze dokumentē vairākus šādus piemērus. [11] [12] Atsevišķu piemaisījumu biežums un nozīme ir atkarīga no sekvences un procesa, tāpēc sintēzes automatizāciju nevajadzētu pielīdzināt pilnīgam ķīmisko kļūdu trūkumam.

3. Kādu lomu spēlē sveķi peptīdu sintēzē?

Sveķi notur augošo peptīdu, kamēr šķīstošos reaģentus un daudzus blakusproduktus var noņemt starp secīgiem sintēzes posmiem. Tas būtiski vienkāršo atkārtotu ķēdes veidošanu, taču sveķi nav tikai mehānisks turētājs. To uzbriešana, aizvietošanas pakāpe, polimēra arhitektūra, saderība ar šķīdinātājiem un reakcijas vietu pieejamība var ietekmēt reaģentu piekļuves efektivitāti piesaistītajam peptīdam. Pētījumos, kuros izmantots mainīgas gultnes reaktors, tika uzraudzīta sveķu uzvedība agregācijas analīzes un sajūgšanas efektivitātes laikā. [4] Šāda uzraudzība nenovērš secības kļūdas, bet parāda, kāpēc sveķu fiziskais stāvoklis var būt svarīgs procesa mainīgais lielums.

4. Kam paredzēts Vanga sveķis peptīdu sintēzē?

Wang tipa nesēji ir plaši saistīti ar peptīdu sagatavošanu, kurus atbrīvo pēc atbilstošas atšķelšanas ar C-galu karbonskābes veidā. Tomēr precīzais galaprodukts ir atkarīgs no linkera, nesēja arhitektūras un izmantotās atšķelšanas ķīmijas, nevis tikai no sveķu nosaukuma. Pētnieki demonstrēja arī specializētu metodi peptidel-Wang-TentaGel materiāla pārvēršanai peptīdu hidrazīdos, kuri var kalpot par noderīgiem sintētiskiem starpproduktiem. [5] Alternatīvā reakcija nemaina standarta Wang sveķu atšķelšanas nozīmi. Tā vietā tā parāda, kāpēc, prognozējot produktu, ir jāanalizē visa nesēja sistēma un reakcijas apstākļi.

5. Vai SPPS būvē peptīdu no N-gala vai C-gala?

Klasiskā pakāpeniskā SPPS parasti sākas ar C-gala atlikuma pievienošanu pie nesēja, pēc kura ķēde tiek pagarināta N-gala virzienā. Tas ir pretējs virziens standarta ķēdes pagarināšanai uz ribosomas, kur olbaltumviela aug, pievienojot secīgas aminoskābes pie C-gala. BPTI sintēze ir piemērs aizsargātu celtniecības bloku un nesēja izmantošanai pirms produkta vāku atbrīvošanas, attīrīšanas un locīšanas. [3] Tomēr pastāv specializētas peptīdu ķīmijas stratēģijas, kurās izmanto citus risinājumus, tāpēc būvēšanu no C- līdz N-galam vajadzētu definēt kā klasisko SPPS pieeju, nevis kā visu sintēzes metožu absolūtu likumu.

6. Kāpēc ir vajadzīgas aizsardzības grupas?

Aminoskābes bieži satur vairākas reaktīvas funkcionālās grupas. Aizsarggrupas īslaicīgi novērš atlasīto vietu reakciju, atstājot atbilstošo vietu pieejamu konkrētā sintēzes posmā. Tas palīdz kontrolēt atlikumu savienošanas secību un veidu. Bez atbilstošas aizsardzības konkurējošas reakcijas varētu izraisīt sarežģītu maisījumu vai produktu ar mainītu struktūru veidošanos. Pētījumi par aspartimīda veidošanos ir parādījuši, ka karboksilgrupas aizsardzības ķīmijas maiņa var ierobežot svarīgu blakusreakciju analizētajās secībās. [2] Aizsarggrupas negarantē ideālu sintēzes gaitu, bet nodrošina selektīvu ķīmisko kontroli, kurai ir jāsaglabā saderība ar visiem būtiskajiem procesa posmiem.

7. Ar ko Fmoc un Boc atšķiras?

Fmoc un Boc ir plaši lietotas pagaidu amīngrupas aizsarggrupas, taču tās reaģē uz atšķirīgiem ķīmiskajiem apstākļiem. Fmoc parasti tiek noņemts bāziskā vidē, savukārt Boc ir jutīgs pret skābēm. Šī atšķirība ietekmē to savienošanas veidu ar sānķēžu aizsardzību, saistvielām (linkeriem) un pārējiem sintēzes posmiem. Uz Fmoc balstīta sintēze tiek plaši izmantota mūsdienu cietfāzes peptīdu sintēzē (SPPS), taču pētījumi ir parādījuši arī no sekvences atkarīgu blakusreakciju iespējamību šādos apstākļos. Praksē tāpēc ir lietderīgāk salīdzināt veselas aizsardzības stratēģijas un to saderību ar konkrēto sekvenci, nevis aplūkot tikai abu aizsarggrupu nosaukumus.

8. Ko nozīmē ortogonālā aizsardzība?

Ortogonālā aizsardzība nozīmē, ka vienu aizsarggrupu var noņemt apstākļos, kuros cita nepieciešamā aizsarggrupa paliek pietiekami stabila, lai varētu turpināt sintēzi. Tas ļauj atsegt dažādas reaģējošās vietas noteiktos posmos. Šī koncepcija ir būtiska sarežģītu peptīdu kontrolētai sintēzei. Tomēr ortogonalitāte ir atkarīga no apstākļiem, nevis absolūta: atkārtota iedarbība, sekvences raksturs un reakcijas parametri joprojām var izraisīt blakusreakcijas. Pētījumi par alternatīviem karboksilgrupu aizsardzības veidiem parāda, kā aizsardzības stratēģiju var modificēt, lai kontrolētu sarežģītu peptīdu ķīmiju. [2]

9. Kas ir dzēšanas secība?

Delecijas sekwence ir peptīds, kuram trūkst viena vai vairāki atlikumi, kas ir paredzēti mērķa sekvencē. Tā var rasties, ja aminoskābes saistīšanas posms nenotiek pilnībā, bet nereaģējusī ķēde paliek piesaistīta nesējam un piedalās nākamajos ciklos. Tā kā nepareizā ķēde joprojām ir saistīta ar sveķiem, parastā skalošana to var neizskalot. Reāllaika SPPS uzraudzības pētījumi norāda uz nepilnīgu amīdsaišu veidošanos kā nozīmīgu procesa problēmu. [4] Līdz ar to delecijas sekwence ir problēma, kas saistīta ar produkta struktūru un identitāti, nevis tikai reaģenta atlieku.

10. Vai diviem peptīdu piemaisījumiem var būt vienāda molekulmasa?

Tā. Dažādām molekulārajām struktūrām var būt identiska vai neatšķirama nominālā masa. Šī iemesla dēļ masas atbilstība vien neapstiprina pilnīgu molekulas identitāti. Pētot sintētisku peptīdu, kas ir renīna substrāts, tika identificēti izobāri piemaisījumu komponenti, kuros modifikācijas pastāvēja dažādās pozīcijās. Derivatizācija un tandēma masas spektrometrija sniedza papildu strukturālo informāciju. [12] Šis piemērs parāda, kāpēc novērotās masas atbilstība gaidītajai nevar viena pati apstiprināt pareizo secību, savienojamību, stereochemiju vai strukturāli līdzīgu izomēru neesību.

11. Kas ir epimerizācija un racemizācija peptīdu sintēzē?

Epimērizācija un racemizācija attiecas uz nevēlamām stereoisomērās konfigurācijas izmaiņām. Tās var notikt bez nominālās aminoskābju secības vai molekulmasas izmaiņām, tāpēc parasts masas mērījums var neuzrādīt strukturālu atšķirību. Pētījumos par mikroviļņu atbalstītu Fmoc sintēzi tika identificētas pret stereoisomērām izmaiņām jutīgas atliekas un parādīts, ka reakcijas apstākļu modifikācija var ierobežot šādus procesus. [11] Risks ir atkarīgs no celtniecības bloka, secības un procesa apstākļiem. Tāpēc stereoisomērā kvalitāte prasa analītiskās metodes, kas spēj novērtēt konfigurāciju, un to nevar secināt, pamatojoties tikai uz molekulmasu.

12. Kas ir aspartimīda veidošanās?

Aspartimīda veidošanās ir nevēlama reakcija, kas saistīta ar noteiktām secībām, kuras satur aspartātu. Cikliska starpprodukta veidošanās var novest pie turpmākiem produktiem ar izmainītu mugurkaula savienojamību vai stereochemiju, samazinot iznākumu un apgrūtinot attīrīšanu. Pētnieki analizēja alternatīvas aizsardzības stratēģijas, kas izstrādātas, lai ierobežotu šo reakciju atlasītos peptīdos un olbaltumvielās. [2] Rezultāti nenorāda uz vienu universālu risinājumu visām secībām, kas satur aspartātu. Tā vietā tie parāda, kāpēc sintēzes projektēšanā un piesārņojuma kontroles stratēģijās ir jāņem vērā konkrētās secības specifiskā ķīmiskā uzvedība.

13. Vai augsta HPLC tīrība apstiprina pareizu peptīda identitāti?

Nē. HPLC tīrība raksturo paraugu konkrētā hromatogrāfiskā sadalījuma, izmantotā detektora un datu analīzes metodes ietvaros. Liels galvenā pīķa laukuma īpatsvars var būt vērtīgs pierādījums tam, ka paraugā dominē viens hromatogrāfiski atdalīts komponents, taču tas viens pats neapstiprina pilnīgu molekulāro identitāti. Līdzīgi eluējoši piemaisījumi, stereoizomēri un citi varianti var prasīt papildu tehnikas. Peptīdu hirālās analīzes pētījumos tika izmantots īpaši izstrādāts process, kurā tika ņemtas vērā arī stereochemiska rakstura izmaiņas, kas rodas parauga sagatavošanas laikā. [13] Tāpēc identitāte un tīrība ir jāuzskata par saistītiem, bet atsevišķiem analītiskiem jautājumiem.

14. Vai attīrītā produkta efektivitāte nozīmē to pašu, kas tīrība?

Nē. Attīrītā vai izolētā produkta iznākums nosaka atgūtā mērķa materiāla daudzumu attiecībā pret noteiktu sākotnējo vai teorētisko daudzumu. Turpretī tīrība raksturo atgūtā materiāla sastāvu saskaņā ar noteiktu analītisko metodi. Sintēzes rezultātā var iegūt salīdzinoši nelielu produkta daudzumu ar ļoti augstu tīrību vai lielu daudzumu jēlproduktu, kas satur ievērojamu daudzumu piemaisījumu. Automātiskās plūsmas sintēzes pētījumos jēlprodukta tīrība un iznākums pēc izolēšanas tika ziņoti atsevišķi. [7] Šo parametru nodalīšana novērš kļūdainu vienas vērtības augstā līmeņa uztveršanu par pierādījumu otras vērtības augstajam līmenim.

15. Vai garus peptīdus var iegūt, savienojot īsākus fragmentus?

Jā. Fragmentārās stratēģijas ietvaros īsākus peptīdu segmentus var sagatavot atsevišķi un pēc tam savienot, izmantojot piemērotu ķīmiju. Dabiskā ķīmiskā ligācija bija nozīmīgs piemērs, kurā neaizsargātus peptīdu fragmentus savienoja veidā, kas nodrošināja dabiskas peptīdu mugurkaula saites veidošanos, un pēc tam ieguva salocītu olbaltumvielu. [10] Tas nenozīmē, ka jebkuri peptīdu fragmenti var savienoties spontāni. Ir jāņem vērā fragmentu struktūra, savienošanas ķīmija, savienošanas vietas izvēle, šķīstība, stereochemija un attīrīšanas prasības. Tādējādi fragmentu montāža ir alternatīva sintēzes projektēšanas stratēģija, nevis automātisks risinājums ar gariem peptīdiem saistītajām problēmām.

16. Vai ātrāka automatizētā sintēze novērš attīrīšanas nepieciešamību?

Nē. Ātrāka automatizēta vai plūsmas sintēze saīsina laiku konkrētiem sintēzes posmiem, taču tas nepierāda, ka katrai iegūtajai molekulai ir paredzētā struktūra. Ātrās plūsmas sintēzes pētījumos joprojām tika raksturots jēlprodukts un piemērota turpmāka attīrīšana, savukārt vārdkopas darbos par automatizāciju atsevišķi tika salīdzināta jēlmateriāla tīrība un iznākums pēc izolēšanas. [6] [7] Sistēmas labie rezultāti pētītajām sekvencēm arī negarantē identiskus rezultātus katram jaunam mērķim. Paātrinātā sintēze joprojām ir jāsavieno ar atbilstošu attīrīšanu, identitātes apstiprināšanu, piemaisījumu analīzi un gala raksturojumu.

17. Kāpēc ražošanas mēroga palielināšana ir sarežģītāka nekā lielākas partijas sagatavošana?

Mēroga palielināšana izmaina fizikālos un ķīmiskos apstākļus, nevis tikai materiāla daudzumu. Maisīšana, siltuma apmaiņa, sveķu uzbrišana, reaģentu sadalījums, spiediens, filtrēšana, šķidinātāju apstrāde, starpproduktu šķīdināmība un attīrīšanas sistēmas iespējas lielākā ražošanas apjomā var uzvesties citādi. 40 peptīdu procesu rūpnieciskajā analīzē, analizējot materiālu patēriņu, atsevišķi tika vērtēta sintēze, attīrīšana un izolēšana [14]. Rezultāti parāda, kāpēc ražošana ir jāuzskata par vienotu procesu. Mērogojamai metodei ir jānodrošina atkārtojama raksturota materiāla iegūšana visos posmos, nevis vienkārši lielāks neapstrādāta peptīda daudzums.

18. Vai peptīds ir gatavs uzreiz pēc pareizas secības izveides?

Neobligāti. Ķēdes salikšana veido sekvences karkasu tikai tādā mērā, kādā to apstiprina process un analītiskie dati. Atkarībā no molekulas var būt joprojām nepieciešama aizsarggrupu noņemšana, atšķelšana, ciklizācija, oksidēšana, disulfīda tiltiņu veidošana, locīšanās (foldings), konjugācija, attīrīšana un raksturošana. BPTI sintēze ir labs piemērs procesam, kurā pēc lineārās sekvences salikšanas sekoja attīrīšana un salocītas struktūras veidošana, kas satur disulfīda tiltiņus. [3] Apzīmējumam „gatavs peptīds” tāpēc jāattiecas uz molekulāro formu, kas nepieciešama konkrētajā zinātniskajā kontekstā, nevis tikai uz pakāpeniskās aminoskābju pievienošanas pabeigšanu.

19. Vai pareizā molekulmasa apstiprina pareizu peptīda secību?

Nē. Molekulmasa ir vērtīgs pierādījums, taču tā viena pati nevar apstiprināt pilnu secību vai molekulāro struktūru. Izobārām struktūrām var būt vienāda masa, un stereochemiskās atšķirības var vispār neizraisīt molekulmasas izmaiņas. Sintētisko peptīdu piemaisījumu pētījumi on parādījuši, ka strukturāli atšķirīgu komponentu atšķiršanai var būt nepieciešama tandēma masu spektrometrija un papildu analīzes. [12] Jautājumos par stereochemisko integritāti var būt nepieciešamas arī hirālās metodes. [13] Tāpēc molekulmasa ir jāuztver kā viens no identitātes novērtēšanas elementiem, nevis kā tās pilnīgs apstiprinājums.

20. Kāpēc attīrīšana ir jāuzskata par peptīda ražošanas sastāvdaļu, nevis tikai par galīgo piedevu?

Attīrīšana nosaka, vai mērķa peptīdu var efektīvi atdalīt no delēcijas sekvencēm, blakusproduktiem, reaģentu atliekām, strukturāli līdzīgiem piemaisījumiem un citiem sintēzes laikā radušajiem komponentiem. Metode, kas ļauj ļoti ātri saražot lielu daudzumu neapstrādāta materiāla, var joprojām būt nepraktiska, ja mērķa produktu ar nepieciešamo kvalitāti nav iespējams efektīvi atgūt. Šī iemesla dēļ rūpnieciskajās peptīdu procesu analīzēs sintēze, attīrīšana un izolēšana tiek ņemtas vērā kopā. [14] Ražošanas efektivitāte galu galā ir jāvērtē, pamatojoties uz izolētā galaprodukta daudzumu un īpašībām, nevis tikai uz sintēzes ātrumu.

Ierobežojumi, salīdzinot peptīdu sintēzes metodes

Interpretējot pētījumus, kuros salīdzina peptīdu ražošanas tehnoloģijas, ir jāņem vērā vairāki būtiski ierobežojumi.

Pirmkārt, secība spēcīgi ietekmē sintēzes grūtību. Metode, kas darbojas vienam peptīdam, var nedarboties tāpat citam. Agregācija, hidrofobitāte, aminoskābju sastāvs, garums, tendence veidot sekundārās struktūras un jutība pret blakusreakcijām var mainīt procesa gaitu. [1] [4]

Otrsno, izejvateriāla tīrība, iznākums pēc izolācijas, galīgā tīrība un peptīdu saturs ir dažādi parametri. Metožu salīdzināšana, balstoties tikai uz vienu no tiem, var sniegt nepilnīgu priekšstatu par ražošanas efektivitāti. [7]

Treškārt, ātra ķēdes montāža nenozīmē ātru visa materiāla ražošanu. Atšķelšana, attīrīšana, izolācija, galīgā struktūras veidošana, analītiskie pētījumi un dokumentācija arī ietekmē kopējo ražošanas laiku. [6] [7]

Ceturtkārt, analītiskā tīrība ir atkarīga no izmantotās metodes. HPLC, masas spektrometrija, tandēma masas spektrometrija un hirālā analīze atbild uz dažādiem jautājumiem. Viens analītiskais rezultāts ne vienmēr apstiprina pilnīgu strukturālo identitāti. [12] [13]

Piektkārt, mērogs ietekmē procesa gaitu. Laboratorijas sintēzes rezultātus nevar automātiski pārnest uz rūpniecisko ražošanu, neveicot maisīšanas, masas pārneses, attīrīšanas iespēju, materiālu patēriņa un citu no mēroga atkarīgu faktoru novērtējumu. [14]

Sestkārt, vēsturiskie ekonomiskie salīdzinājumi laika gaitā var zaudēt aktualitāti. Reaģentu izmaksas, automatizācijas līmenis, ekspresijas tehnoloģijas, attīrīšanas aprīkojums, šķīdinātāju atgūšana un ražošanas infrastruktūra nepārtraukti attīstās. Vecākām izmaksu analīzēm joprojām var būt zinātniska nozīme, taču tās var neatspoguļot pašreizējo tirgus ekonomiku. [1]

Septītajam, vides salīdzinājumiem ir nepieciešamas konsekventas analīzes robežas. Šķīdinātāju patēriņa novērtēšana tikai pašas ķēdes montāžas laikā, vienlaikus izlaižot attīrīšanu un izolāciju, var novest pie maldinošiem secinājumiem par procesa ilgtspējību. [14] [15]

Visbeidzot, pati metodes nosaukums nenosaka produkta kvalitāti. SPPS, sintēze šķīdumā, LPPS, fragmentu ligācija un bioloģiskā ekspresija var nodrošināt augstas kvalitātes materiālu, ja process ir atbilstoši projektēts un kontrolēts. Tomēr neviena no šīm metodēm automātiski negarantē pareizu identitāti, tīrību, stereoķīmiju, salocīšanos vai piemērotību konkrētam lietojumam.

Kopsavilkums

Peptīdu sintēzi vislabāk ir saprast kā kontrolētu molekulu veidošanas procesu, nevis vienkārši peptīdsaišu veidošanu.

Mērķis ir izveidot noteiktu aminoskābju secību, vienlaikus kontrolējot atlikumu savienošanas veidu, aizsarggrupu ķīmiju, stereochemiju, blakusreakcijas un jebkādas papildu strukturālās prasības.

Cietfāzes peptīžu sintēze uztur augošo ķēdi uz nešķīstoša nesēja, padarot atkārtotos sajaukšanas un skalošanas posmus labi piemērotus automatizācijai. Tomēr ar atkārtotu montāžu saistītās priekšrocības nenovērš tādas problēmas kā nepilnīgas reakcijas, agregācija, delecijas sekvences vai no sekvences atkarīgas blakusreakcijas. [4] [6] [7]

Klasiskā sintēze šķīdumā uztur peptīdu starpproduktus šķidrajā fāzē un var nodrošināt lielāku elastību atsevišķu starpproduktu izolēšanā un raksturošanā. Tomēr vairākkārtēja atdalīšana un pasliktinās šķīmība var kļūt par nopietniem ierobežojumiem.

Šķidrās fāzes sintēzes metodes ar šķīdināmiem marķieriem mēģina apvienot šķīdumu ķīmiju ar izstrādātām materiāla atgūšanas stratēģijām. Tādējādi tās var piedāvāt papildu iespēju tādām secībām un ražošanas problēmām, kurām klasiskā SPPS nav optimāla. [8] [9]

Garākus vai īpaši sarežģītus peptīdus un olbaltumvielas var sagatavot arī, savienojot fragmentus, tostarp izmantojot dabisko ķīmisko ligāciju, nevis paļaujoties tikai uz nepārtrauktu secīgu aminoskābju atlikumu pievienošanu. [10]

Neatkarīgi no izētās montāžas metodes savienošanas efektivitāte un aizsarggrupu ķīmija saglabājas izšķirošas, jo nelielas neefektivitātes un blakusreakcijas var kumulēties sintēzes secīgo posmu laikā. Aspartimīda veidošanās, delekcijas sekvences un stereochemiskās izmaiņas parāda, kāpēc pati paredzētā sekvence neapraksta visu, kas procesa laikā var rasties. [2] [11] [12]

Darbs nebeidzas arī līdz ar ķēdes salikšanu.

Attīrīšana nosaka, vai mērķa produktu var atdalīt no citām sastāvdaļām.

Tālāk atbilstoši izvēlētas analītiskās metodes atbild uz atsevišķiem jautājumiem par identitāti, tīrību, saturu, stereochemiju, konformāciju un – ja tam ir nozīme – funkcionālo aktivitāti. [3] [12] [13]

Ražošanas mēroga palielināšana rada papildu jautājumus par masas pārnesi, sveķu uzvedību, šķīdinātāju patēriņu, filtrēšanu, attīrīšanas iespējām, procesa atkārtojamību un tā ietekmi uz vidi. Šī iemesla dēļ rūpiskai procesa novērtēšanai rūpnieciskā mērogā vajadzētu ietvert gan sintēzi, gan attīrīšanu un izolēšanu kopā, nevis koncentrēties tikai uz saistīšanas ātrumu. [14] [15]

Svarīgākais noteikums ir šāds:

Efektīva peptīdu ražošana prasa visa procesa kontroli – no molekulārā dizaina un saišu veidošanas līdz pat attīrīšanai un strukturālajai raksturošanai. Ķēdes iegūšana ar sagaidāmo nominālo masu vai augstu galveno hromatogrāfisko piku ir vērtīgs pierādījums, taču neviens no šiem parametriem atsevišķi neapstiprina pilnīgu molekulāro identitāti vai ražošanas procesa kvalitāti.

Atruna

Rakstam ir tikai izglītojošs un zinātniski informatīvs raksturs. Tas apraksta vispārīgos peptīdu ķīmijas principus, cietfāzes sintēzi, sintēzi šķīdumā un šķidrajā fāzē, aizsarggrupu stratēģijas, sajūgšanu, attīrīšanu, analītisko raksturojumu, ražošanas procesus, kā arī piemērus no publicētiem pētījumiem. Tas nav laboratorijas protokols, ražošanas instrukcija, medicīnisks padoms, devu vai ievadīšanas ceļu ceļvedis vai jebkura konkrēta peptīdu produkta kvalitātes sertifikāts. Eksperimentālie rezultāti ir jāinterpretē secības, izmantoto metožu, procesa mēroga, analītisko tehniku un atsevišķu pētījumu ierobežojumu kontekstā.

Atsauces

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K., & Perczel, A. (2016). Bacterial expression and/or solid phase peptide synthesis of 20-40 amino acid long polypeptides and miniproteins, the case study of Class B GPCR ligands. Current Protein & Peptide Science, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Prevention of aspartimide formation during peptide synthesis using cyanosulfurylides as carboxylic acid-protecting groups. Nature Communications, 11(1), 982. pants. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrers, M., Vudvards, K., un Baranī, G. (1992). Liellopu aizkuņģa dziedzera tripsīna inhibitora (BPTI) un divu analogu cietfāzes sintēze. Ķīmiska pieeja disulfīda tiltiņu nozīmes izvērtēšanai olbaltumvielu locīšanā un stabilitātē. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. PubMed ieraksts
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). Real-time monitoring of solid-phase peptide synthesis using a variable bed flow reactor. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F., & Becker, C. F. W. (2015). Efficient generation of peptide hydrazides via direct hydrazinolysis of Peptidyl-Wang-TentaGel resins. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Strauja plūsmas peptīdu sintēze. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2017). Pilnībā automatizēta plūsmas metode paātrinātai peptīdu sintēzei. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G., & Albericio, F. (2022). Šķidrās fāzes peptīdu sintēze (LPPS): trešais vilnis peptīdu iegūšanai. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Jano, T., un Fukui, T. (2012). Jauna difenilmetilskatā atvasināta amīdu aizsarggrupa efektīvai šķidrās fāzes peptīdu sintēzei: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Klārks-Luiss, I., un Kents, S. B. (1994). Olbaltumvielu sintēze, izmantojot dabisko ķīmisko ligēšanu. Zinātne, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Kokss, Z. Dž., un Kolinss, Dž. M. (2007). Racemizācijas un aspartimīda veidošanās ierobežošana mikroviļņu pastiprinātā Fmoc cietfāzes peptīdu sintēzē. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Sintētiskā renīna substrāta peptīda piemaisījumu raksturojums ar ātro atomu bombardēšanas masu spektrometriju un hibrīdo tandēma masu spektrometriju. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G., & Crowther, J. B. (1995). Peptīdu hirālās tīrības noteikšana: hidrolīze eirotā skābē, derivatizācija ar Mārfija reaģentu un analīze, izmantojot augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju-elektrosmidzināšanas jonizācijas masu spektrometriju. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Process mass intensity (PMI): A holistic analysis of current peptide manufacturing processes informs sustainability in peptide synthesis. The Journal of Organic Chemistry, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Ilgtspējas izaicinājumi peptīdu sintēzē un attīrīšanā: No pētniecības un attīstības līdz ražošanai. The Journal of Organic Chemistry, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001