Peptīdu sintēze: cietfāzes metode, metode šķīdumā un ražošanas metodes

Peptīdu sintēze ir kontrolēts process, kurā veidojas noteiktas secības aminoskābju ķēdes. Ķīmiskajā sintēzē izvēlētās aminoskābes tiek savienotas, izmantojot peptīdu saišu, vienlaikus kontrolējot citas reaktīvās grupas, kas atrodas šajās molekulās. Mērķis tātad nav vienkārši savienot aminoskābes, bet gan iegūt konkrētu molekulāro struktūru ar noteiktu secību, stereochemiju, ķēdes galu uzbūvi un – ja nepieciešams – papildu strukturālajām pazīmēm.

Pie galvenajām metodēm pieder peptīdu sintēze uz cietā fāzē (SPPS), klasiskā sintēze šķīdumā, kā arī jaunākas peptīdu sintēzes metodes šķidrā fāzē (LPPS), izmantojot šķīstošos nesējus vai molekulāros marķierus. Pētniecības laboratorijas un ražotnes var arī apvienot dažādas pieejas, atsevišķi sagatavot īsākus fragmentus un pēc tam tos savienot kopā vai izmantot bioloģisko ekspresiju, ja tā ir piemērotāka konkrētajai secībai.

Ķīmiskās sintēzes salīdzinājums ar 20–40 aminoskābju atlikumus saturošu polipeptīdu bakteriālo ekspresiju parāda svarīgu principu: praktiskā ražošanas metodes izvēle ir atkarīga no konkrētās molekulas, tās secības, tieksmes uz agregāciju, nepieciešamajām modifikācijām, ražošanas mēroga un analītiskajām prasībām. [1]

Vēlamās aminoskābju secības iegūšana ir tikai viens no peptīdu ražošanas posmiem.

Viss process var ietvert:

secvences projektēšana → celtniecības bloku sagatavošana → funkcionālo grupu aizsardzība → saistīšana → aizsarggrupu noņemšana → ķēdes montāža → fragmentu atšķelšana vai savienošana → galīgā struktūras veidošana → attīrīšana → identitātes apstiprināšana → piemaisījumu analīze → satura apzīmēšana → galvenais raksturojums.

Dažiem peptīdiem ir nepieciešami arī papildu posmi, piemēram, ciklizācija, disulfīda saišu veidošanā, locīšanā, konjugācija vai citas ķīmiskas modifikācijas.

Šī iemesla dēļ pareiza ķēdes salikšana nenozīmē automātiski, ka galaproduktam ir atbilstoša identitāte, tīrība, stereochemija, konformācija, stabilitāte vai citas prasītās īpašības.

Peptīdu sintēze ir process, kurā tiek veidoti peptīdi, ķīmiski vai bioloģiski savienojot aminoskābes kopā ar peptīdsaitēm.

Noteiktas aminoskābju secības izveide

Peptīds sastāv din aminoskābju atlikumiem, kas savienoti ar peptīdsaitēm.

Peptīdu sintēzes mērķis ir izveidot šīs saites iepriekš noteiktā secībā, bieži vien vienlaikus kontrolējot:

• aminoskābju veidu;
• aminoskābju secība virknē;
• stereohīmija;
• N-gala struktūras;
• C gala struktūras;
• sānu ķēžu modifikācijas;
• disulfīda tiltiņu izvietojums;
• ciklizācijas;
• citu prasīto strukturālo īpašību.

Secvencei ir fundamentāla nozīme, jo identisks aminoskābju sastāvs var radīt dažādas molekulas, ja aminoskābes atrodas citā secībā.

Apgalvojums, ka konkrētā molekula ir „no piecām aminoskābēm sastāvs peptīds”, tātad sniedz ļoti maz informācijas par tās reālo struktūru. Lai pareizi aprakstītu molekulu, ir jāzina aminoskābju veids, to secība, stereochemija, gala grupas, kā arī iespējamās papildu modifikācijas.

Tādējādi diviem peptīdiem var būt pilnīgi vienāds aminoskābju sastāvs, un tomēr tās var būt dažādas molekulārās struktūras.

Papildu atšķirības var rasties ķēdes galu modifikāciju, disulfīda tiltiņu klātbūtnes, cikliska karkasa, sānu ķēžu izmaiņu vai atšķirīgas stereokīmiskās konfigurācijas dēļ.

Ķīmiskā peptīdu sintēze parasti izmanto aminoskābes, kuru reaktīvās grupas ir selektīvi aizsargātas.

Pagaidu aizsarggrupas ļauj izveidot konkrētu, iecerēto ķīmisko saiti, vienlaikus ierobežojot konkurējošās reakcijas citās molekulas vietās.

Turpmākajos plānotajos sintēzes posmos šīs grupas tiek noņemtas vai mainītas.

Kontrolēta reakcija spontānas savienošanās vietā

Pamata ķīmiskajos aprakstos peptīdsaites veidošanos bieži attēlo kā kondensācijas reakciju, kurā divas aminoskābes savienojas, kopumā izdalot ūdens molekulu.

Šāds vienādojums apraksta reakcijas kopējo bilanci.

Tomēr to nevajadzētu identificēt ar veidu, kā praksē tiek veikta kontrolēta peptīdu sintēze.

Vienkārša brīvo aminoskābju sajaukšana neļautu ticami noteikt:

• kurai aminogrupai jāreaģē;
• kurai karboksilgrupai jāreaktivē;
• kurai aminoskābei jābūt pirmajai;
• kuram jāatrodas otrajam;
• vai sāks reaģēt sānķēdes;
• vai stereochemija tiks saglabāta;
• vai neradīsies daudzi nevēlami produkti.

Tāpēc praktiskajā ķīmiskajā sintēzē izmanto kontrolētas funkcionālo grupu aktivizēšanas un aizsardzības stratēģijas.

Grupa, kas izriet no karboksilgrupas, parasti tiek aktivēta tā, lai tā varētu efektīvi reaģēt ar izvēlēto aminogrupu. Aizsarggrupas, reakciju secība, nesēja ķīmija, savienošanas reaģenti, šķīdinātāja vide un izolācijas metodes kopīgi palīdz virzīt reakciju paredzētā produkta virzienā.

Tāpēc efektīva peptīdu sintēze prasa kontroli gan pār ķīmiju, kurai ir jānotiek, gan pār to, kuru nepieciešams novērst.

Labs piemērs ir aspartimīda veidošanās.

Pētnieki izstrādāja alternatīvu karboksilgrupas aizsardzības metodi, kuras mērķis bija ierobežot šo problemātisko blakusreakciju peptīdu sintēzes laikā. [2]

Pētījums atklāj plašāku peptīdu ķīmijas principu: nevēlamu molekulāro pārvērtību novēršana var būt tikpat svarīga kā pareizās peptīdu saites izveide.

Kad peptīds ir uzskatāms par gatavu?

Lineārā peptīda skeleta izveides pabeigšana ne همیشه nozīmē visas sintēzes beigas.

Atkarībā no mērķa molekulas pēc ķēdes salikšanas var būt nepieciešami papildu posmi.

Tās var ietvert:

• pilnīga aizsarggrupju noņemšana;
• peptīda atšķelšana no cietā nesēja;
• pagaidu marķieru noņemšana;
• ciklizāciju;
• oksidēšana;
• disulfīda saišu veidošana;
• locīšana;
• konjugāciju;
• ķēdes galu modifikāciju;
• attīrīšana;
• analītisko raksturojumu.

Dažiem peptīdiem pēc ķēdes izveides ir nepieciešams salīdzinoši maz papildu strukturālo izmaiņu.

Citu gadījumā vēlākiem posmiem ir izšķiroša nozīme.

Labs piemērs ir liellopu aizkuņģa dziedzera tripsīna inhibitora (BPTI) sintēze. Pētnieki salika lineāru sekvenci, attīrīja materiālu un pēc tam ieguva salocītu struktūru, kas satur disulfīda tiltiņus. Saskaņā ar pētījumā sniegtajām analīzēm un funkcionālajiem salīdzinājumiem galvenais materiāls ar dabisko sekvenci atbilda dabiskajam olbaltumumam pētīto parametru ziņā. [3]

Šis piemērs parāda atšķirību starp peptīda karkasa izveidi un pilnībā raksturotas galīgās molekulārās formas iegūšanu.

Metode, kas ļauj iegūt pareizu lineāro secību, automātiski neapstiprina:

• pareizas locīšanas;
• pareizas disulfīda saišu izvietošanas;
• bioloģiskās aktivitātes;
• stabilitātes;
• piesārņojuma profilu;
• piemērotības noteiktam lietojumam.

Katrs no šiem jautājumiem prasa atsevišķus pierādījumus.

Ķīmiskā sintēze, bioloģiskā ekspresija un kombinētās metodes

Ķīmiskajā peptīdu sintēzē iepriekš sagatavoti molekulārie bloki tiek savienoti kontrolētās laboratorijas reakcijās.

Savukārt bioloģiskā ekspresija izmanto šūnu mehānismu, lai saražotu kodēto aminoskābju secību. Pēc tam materiāls ir jāatgūst, jāattīra un, ja nepieciešams, jāpakļauj tālākai apstrādei.

Abas metodes var novest pie peptīdu vai polipeptīdu iegūšanas, taču tās ir saistītas ar citām iespējām un ierobežojumiem.

Ķīmiskā sintēze var būt īpaši noderīga, ja ir nepieciešams:

• izvēlētas nestandarta aminoskābes;
• ķīmiskās modifikācijas konkrētās vietās;
• noteiktas ķēdes gala struktūras;
• izotopu marķieri;
• peptīda mugurkaula modifikācijas;
• citas īpašības, kuras ir grūti iegūt, izmantojot standarta bioloģisko ekspresiju.

Bioloģiskā ekspresija var būt pievilcīga piemērotu garāku sekvenču vai noteiktu marķēšanas stratēģiju gadījumā, taču tā nenovērš problēmas, kas rodas ražošanas vēlākos posmos.

Joprojām ir jāņem vērā materiāla atgūšana, locīšana, apstrāde, saimnieka organisma radītais piesārņojums, attīrīšana un analītiskā raksturojums.

Tāpēc neviena no metodēm nav universāli vislabākā.

Salīdzinot polipeptīdus, kas sastāv no 20–40 aminoskābju atlikumiem, gan sekvences garums, gan tās tendence agregēties ietekmēja cietfāzes sintēzes un baktēriju ekspresijas rezultātus. [1]

Šie novērojumi apstiprina pieeju, kurā ražošanas metode tiek izvēlēta konkrētai molekulai.

Vēsturiskos datus par veiktspēju, izmaksām, aprīkojumu un ražošanas laiku nevajadzētu uzskatīt par universālām mūsdienu vērtībām, jo tehnoloģiju, reaģentu, automatizācijas, attīrīšanas metodes un ražošanas ekonomika mainās līdz ar tehnoloģiju attīstību.

Cietsfāzes peptīdu sintēze

Augošā ķēde ir piesaistīta nešķīstošam nesējam

Cietfāzes peptīdu sintēzē (SPPS) augošā peptīda ķēde secīgos sintēzes ciklos paliek piesaistīta nešķīstošam nesējam.

Parasti par nesēju kalpo funkcionalizēta polimēra sveķi.

Saistviela jeb linkeris savieno peptīdu ar nesēju un ietekmē, cita starpā, gatavās ķēdes vēlākas atbrīvošanas veidu, kā arī iegūtās gala grupas veidu.

Viens no galvenajiem SPPS praktiskajiem ieguvumiem ir materiāla vieglāka sadalīšana.

Pēc noteiktā reakcijas posma beigām šķīstošos reaģentus un daudzus šķīstošos blakusproduktus var atdalīt ar skalošanu, kamēr augošais peptīds paliek piesaistīts cietajai fāzei.

Pateicoties tam, pēc katras nākamās aminoskābes pievienošanas nav nepieciešams izolēt un attīrīt augošo peptīdu kā atsevišķu, brīvu savienojumu.

Tomēr šīs ērtības var novest to svarīga pārpratuma.

Sveķu skalošana nenozīmē, ka visi nepareizie peptīdi ir atdalīti.

Ja pie sveķiem piesaistītā ķēde nereaģē viena savienošanas posma laikā, tā var turpināt palikt uz nesēja.

Nākamajos ciklos tā var atkal reaģēt un turpināt pagarināties.

Tā rezultātā var izveidoties delecijas sekvence jeb molekula, kas no mērķa peptīda atšķiras ar vienas vai vairāku aminoskābju atlikumu trūkumu.

Līdzīgi ķīmiski modificētas vai nepilnīgi atbloķētas sveķiem piesaistītās ķēdes var piedalīties turpmākajos sintēzes posmos.

SPPS tādējādi atvieglo šķīstošo vielu atdalīšanu no pie sveķiem piesaistītā materiāla.

Tomēr es negarantēju ideālu sekvenču atbilstību.

Atkārtots atbloķēšanas un sajūgšanas cikls

Tipiska pakāpeniska SPPS sintēze ietver trīs pamatoperāciju atkārtošanu:

drošinātāja noņemšana → sakabināšana → skalošana.

Vispirms tiek atsegta reaktīvā amingrupa, kas atrodas augošā ķēdes galā.

Pēc tam ķēdei tiek pievienota nākamā aizsargātā aminoskābe.

Šķīstošie reaģenti, aminoskābes pārākums un daudzi reakcijas produkti tiek aizvākti pirms nākamā cikla sākuma.

Šī procesa atkārtošana ļauj veidot peptīdu pa vienam aminoskābes atlikumam.

Klasiskajā SPPS C-gala atlikums parasti tiek piesaistīts nesējam pirmais, un pēc tam ķēde tiek pagarināta N-gala virzienā.

Tas atšķiras no standarta ribosomālās olbaltumvielu sintēzes, kuras laikā secīgas aminoskābes tiek pievienotas augošās ķēdes C-galam.

Tomēr galīgā aminoskābju secība var būt identiska, lai gan salocīšanās procesa virziens un ķīmija ir atšķirīgi.

Terminu „cikls” nevajadzētu saprast kā vienu universālu reakcijas apstākļu kopumu, kas būtu piemērots jebkuram atlikumam un jebkurai secībai.

Reakcijas gaita var būt atkarīga no:

• aizsardzības grupu stratēģijas;
• aminoskābes veida;
• telpisko apstākļu ap reakcijas vietu;
• sveķu veida;
• saite;
• ķēdes garumi;
• agregācija;
• šķīdinātāja;
• savienošanas ķīmija;
• augošā peptīda strukturālās uzvedības.

Reakcija, kas sinēzes sākumā norit viegli, vēlākā posmā var kļūt daudz grūtāka.

Tāpēc procesa uzraudzība joprojām ir svarīga pat augsti automatizētās sistēmās.

Kpēc sveķu īpašības ir svarīgas?

Pastāvīgais datu nesējs nav tikai pasīvs turētājs.

Tā fiziskās un ķīmiskās īpašības var tieši ietekmēt reakcijas gaitu.

Viens no svarīgiem parametriem ir uzbrišana.

Ja sveķi pareizi uzbriest izvēlētajā šķīdinātāja vidē, reaģenti var vieglāk piekļūt reaktīvajām vietām, kas atrodas visā polimēra struktūrā.

Nepietiekama sveķu uzbriešana vai struktūras izmaiņas var ierobežot šo piekļuvi.

Nozīme var būt arī:

• blīvums;
• polimēru arhitektūra;
• saiteņu struktūra;
• saderība ar šķīdinātājiem;
• mehāniskā stabilitāte;
• porainība;
• difūzijas īpašības;
• mijiedarbība starp augošajiem peptīdu ķēdēm.

Palielinoties peptīda garumam, atsevišķas ķēdes var arī savstarpēji mijiedarboties.

Agregācija uz sveķiem var ierobežot piekļuvi reaģējošajām vietām un izraisīt nepilnīgu saistīšanu vai nepilnīgu atbrīvošanu.

Tas nozīmē, ka secība, kas syntēzes sākumā uzvedas pareizi, łaķa pagarinoties var kļūt arvien grūtāka.

Pētnieki ir izstrādājuši plūsmas reaktoru ar mainīgu slāni, kas ļāva uzraudzīt sveķu uzbriešanu, pamatojoties ar spiedienu saistītiem mērījumiem. [4]

Pētījumā galvenā uzmanība tika pievērsta sveķu agregācijai un nepilnīgai saišu veidošanai kā procesa problēmām, kuras citos apstākļos sintēzes laikā var būt grūti tieši novērot.

Tas parāda, ka datu nesēja fiziskās uzvedības uzraudzīšana var sniegt informāciju, kas sniedzas tālāk par vienkāršu pievienoto reaģentu reģistrēšanu.

Kam izmanto Vanga sveķus?

Vanga saistvielu ķīmija tiek plaši izmantota cietfāzes peptīdu sintēzē (SPPS), ja pēc peptīda atšķelšanas ir nepieciešams C-gals karbonskābes formā.

Peptīds ir piesaistīts, izmantojot estera saiti, kuru vēlākdos apstākļos var sašķelt.

Citstingas saistvielu sistēmas var izvēlēties tad, ja ir nepieciešama atšķirīga C-gala struktūra, piemēram, amīds.

Ir vērts nošķirt saistvielas ķīmiju no visa fiziskā nesēja.

Saistītos Vanga tipa linkerus var ievadīt dažādās polimēru arhitektūrās.

Šādiem materiāliem nav obligāti jābūt identiskiem:

• uzbriešanas īpašības;
• ietilpība;
• saderība ar šķīdinātājiem;
• mehānisko īpašību;
• uzvedība reakcijas laikā.

Pētījumi, kuros izmantoti peptidil-Wang-TentaGel nesēji, uzrādīja specializētu alternatīvu metodi peptidilhidrazīdu iegūšanai, kas ir noderīgi starpprodukti peptīdu ķīmijā. [5]

Tas nenozīmē, ka standarta atšķeltspēja no Vanga sveķiem parasti izraisa peptīdu hidrazīdu veidošanos.

Tomēr tā parāda svarīgu principu:

nesējs + saite + reakcijas apstākļi + šķelšanās ķīmija kopā nosaka iegūto produktu.

Cietā fāzes peptīžu sintēze periodiskajā un plūsmas sistēmā

SPPS var veikt klasikātos periodiskās darbības traukos vai sistēmās, kur reaģenti plūst caur reaktoru, kas satur cieto nesēju.

Plūsmas sistēmas var nodrošināt ātru reaģentu apmaiņu un precīzāku sveķus apņemošās ķīmiskās vides kontroli.

2014. gada pētījumā tika prezentēta ātrā peptīdu sintēze plūsmas sistēmā ar nepārtrauktu monitoringu un tā tika pielietota vairākiem peptīdiem un nelielam olbaltumam. [6]

Vēlākā automatizētā pētījumā tika aprakstīta ievērojami ātrāka ķēžu montāža, analizētajiem piemēriem sasniedzot neapstrādāta produkta tīrību un izolēto iznākumu, kas ir salīdzināmi ar klasisko ciklisko sintēzi. [7]

Šie pētījumi parāda konkrētu sistēmu iespējas noteiktos apstākļos.

Tomēr tās nepierāda, ka jebkuru peptīdu var ražot tikpat ātri un ar tādu pašu kvalitāti.

Laiks, kas nepieciešams peptīda saražošanai, ietver arī daudz ko vairāk nekā tikai pašas ķēdes veidošanu.

Kopējais process var ietvert:

• reaģentu sagatavošana;
• sveķu sagatavošana;
• sakabināšana;
• drošinātāja noņemšana;
• skalošana;
• atdalīšana;
• produkta apstrādi;
• attīrīšana;
• šķīdinātāju noņemšana;
• galīgā struktūras veidošana;
• analītiskie pētījumi;
• dokumentāciju.

Tāpēc ātra sasaistīšana ir tikai viens no kopējās ražošanas efektivitātes elementiem.

Sintēze šķidrajā fāzē

Ko nozīmē šis termins?

Termins „peptīdu sintēze šķidrajā fāzē” var tikt lietots vairākās nozīmēs.

Plašākā nozīmē tas var vienkārši nozīmēt šķīdumā veiktu peptīdu sintēzi.

Tomēr specializētākajā literatūrā bieži tiek nošķirts:

1. klasisko peptīžu sintēzi šķīdumā;
2. cietfāzes peptīdu sintēze;
3. jaunākas LPPS metodes, kurās augošajai ķēdei ir šķīstošs marķieris vai nesējs.

Šī atšķirība ir svarīga, jo mainās produkta sadalīšanas un atgūšanas veids.

Brīvi izšķīdināts, aizsargāts peptīda starpprodukts var būt jāizolē, izmantojot tā paša fizikālās un ķīmiskās īpašības.

Marķēta pusfabrikāta gadījumā marķieri var izstrādāt tā, lai tas atvieglotu nogulsnēšanu, ekstrakciju, aizturi uz membrānas vai citu atdalīšanas veidu.

Pārskats par LPPS skaidri nošķir klasisko sintēzi šķīdumā, SPPS un metodes, kurās izmanto šķīdināmus marķierus. [8]

Publikācija ir noderīga terminoloģijas un metodoloģijas sakārtošanai.

Tomēr to nevajadzētu interpretēt kā vienu eksperimentu, kas pierāda, ka viena metode ir vislabākā katram peptīdam.

Klasiskā peptīdu sintēze šķīdumā

Klasiskajā šķīduma sintēzē aizsargātie aminoskābes, peptīdu starpprodukti vai fragmenti paliek izšķīduši reakcijas vidē, nevis ir kovalenti piesaistīti nešķīstošai sveķu matricai.

Pēc reakcijas beigām attiecīgais starpprodukts var tikt izolēts, attīrīts un, ja nepieciešams, raksturots pirms nākamā posma uzsākšanas.

Tas var sniegt zināmas priekšrocības.

Pētnieki var:

• raksturot atsevišķus pusproduktus;
• pielāgot attīrīšanas metodi konkrētam starpproduktam;
• optimizēt atsevišķas pārvērtības;
• przygotowywać fragmenty niezależnie;
• modyfikować trasę syntezy, gdy określony półprodukt sprawia problemy.

Synteza w roztworze może jednak wiązać się również ze znacznymi trudnościami.

Wraz z wydłużaniem łańcucha peptydy mogą:

• stawać się słabo rozpuszczalne;
• agregować;
• być trudne do krystalizacji;
• tworzyć blisko spokrewnione zanieczyszczenia;
• być trudne do rozdzielenia;
• wymagać wielokrotnej izolacji;
• powodować straty materiału podczas kolejnych etapów obróbki.

Synteza w roztworze nie jest więc automatycznie prostsza ani łatwiejsza do skalowania niż SPPS.

Jej przydatność zależy od konkretnej sekwencji, stabilności półproduktów, rozpuszczalności, długości trasy syntezy, zachowania podczas oczyszczania oraz efektywności kolejnych etapów izolacji.

Rozwój znakowanych strategii LPPS częściowo wynika z prób rozwiązania właśnie tych problemów związanych z separacją i obsługą materiału. [8]

Rozpuszczalne znaczniki łączą projektowanie reakcji z projektowaniem separacji

W znakowanej LPPS rosnący peptyd posiada tymczasowe przyłączenie molekularne zaprojektowane w taki sposób, aby wpływać na jego właściwości fizyczne.

Znacznik może umożliwiać utrzymanie wystarczającej rozpuszczalności peptydu podczas reakcji, a następnie ułatwiać jego selektywne odzyskanie.

W zależności od technologii rozdzielanie może wykorzystywać:

• wytrącanie;
• ekstrakcję;
• zatrzymywanie na membranie;
• zachowanie fazowe;
• inne właściwości wynikające z obecności znacznika.

W jednej z eksperymentalnych strategii wykorzystano długołańcuchową grupę ochronną na C-końcu do przygotowania amidów peptydowych.

Powtarzane reakcje i etapy wytrącania umożliwiły badaczom przygotowanie hydrofobowego peptydu, który w zastosowanym przez nich porównaniu był trudny do uzyskania zadowalająco metodą SPPS. [9]

Pokazuje to przydatność tej konkretnej strategii dla analizowanej sekwencji.

Nie dowodzi jednak uniwersalnej przewagi syntezy znakowanej.

Znacznik staje się elementem procesu produkcyjnego i rodzi własne pytania:

• Jak skutecznie jest przyłączany?
• Czy zmienia przebieg reakcji?
• Jak niezawodnie można odzyskać znakowany półprodukt?
• Czy prowadzi do powstawania nowych zanieczyszczeń?
• W jaki sposób jest usuwany?
• Czy można potwierdzić całkowite usunięcie?
• Jakie metody analityczne potwierdzają jego brak w produkcie końcowym?

Rozpuszczalne znaczniki należy więc traktować jako funkcjonalne elementy projektu procesu, a nie wyłącznie jako proste etykiety.

Porównanie głównych metod

Porównanie przedstawia ogólne zasady działania poszczególnych metod.

Nie określa, która z nich zapewni najlepszą wydajność, czystość, koszt, zrównoważenie środowiskowe czy możliwość skalowania dla konkretnej sekwencji.

Parametry te należy oceniać na podstawie rzeczywistej cząsteczki i konkretnego procesu produkcyjnego. [4] [8] [9]

Łączenie fragmentów i produkcja hybrydowa

Peptyd nie zawsze musi być tworzony w jednym nieprzerwanym procesie polegającym na dodawaniu kolejnych reszt aminokwasowych.

Alternatywną strategią jest oddzielne przygotowanie krótszych fragmentów peptydowych, a następnie ich połączenie.

Proces hybrydowy może na przykład wykorzystywać SPPS do otrzymywania poszczególnych fragmentów oraz chemię w roztworze do ich łączenia.

Strategie fragmentowe mogą ograniczać niektóre problemy związane z bardzo długą syntezą etapową.

Wprowadzają jednak nowe wyzwania, takie jak:

• wybór odpowiedniego miejsca połączenia;
• rozpuszczalność fragmentów;
• aktywacja miejsca łączenia;
• chemoselektywność;
• zachowanie stereochemii;
• reakcje uboczne;
• oczyszczanie fragmentów;
• oczyszczanie po ich połączeniu.

Ważnym przykładem kontrolowanego łączenia fragmentów jest natywna ligacja chemiczna.

W klasycznej wersji tioester peptydowy reaguje z drugim peptydem zawierającym N-końcową cysteinę. Następujące później przegrupowanie prowadzi do utworzenia prawidłowego wiązania w szkielecie peptydowym w miejscu ligacji.

Pierwotne badania wykazały możliwość uzyskania po ligacji i fałdowaniu białka zawierającego mostki disiarczkowe. [10]

Potwierdza to znaczenie tej strategii łączenia fragmentów.

Nie oznacza jednak, że dowolne dwa niezmodyfikowane fragmenty peptydowe mogą spontanicznie się połączyć.

Sprzęganie i grupy ochronne

Sprzęganie tworzy zamierzone połączenie

Sprzęganie jest etapem reakcji, podczas którego pomiędzy wybranymi jednostkami powstaje nowe wiązanie peptydowe.

Zazwyczaj grupa pochodząca od grupy karboksylowej jest aktywowana tak, aby mogła skutecznie reagować z odpowiednią grupą aminową.

Chemia aktywacji musi być zgodna z:

• rosnącą sekwencją;
• tymczasowymi grupami ochronnymi;
• ochroną łańcuchów bocznych;
• stereochemią;
• nośnikiem lub znacznikiem;
• środowiskiem rozpuszczalnika;
• innymi grupami funkcyjnymi obecnymi w cząsteczce.

Skuteczne sprzęganie jest szczególnie ważne w syntezie etapowej, ponieważ niepełna reakcja może prowadzić do powstawania sekwencji delecyjnych.

Jeżeli jeden etap dodawania aminokwasu nie powiedzie się dla części rosnących łańcuchów, takie łańcuchy mogą pozostać w układzie i uczestniczyć w kolejnych cyklach.

W efekcie mogą powstać cząsteczki bardzo podobne do docelowego peptydu, ale pozbawione jednej reszty.

Nawet niewielkie nieefektywności mogą więc kumulować się podczas wielu etapów syntezy.

Prosty przykład matematyczny dobrze ilustruje ten problem.

Jeżeli każdy z 50 niezależnych etapów składania miałby 99% prawdopodobieństwa powodzenia, odsetek cząsteczek, dla których wszystkie etapy zakończyłyby się sukcesem, wynosiłby:

0,99^50 ≈ 0,605

czyli około 61%.

Jest to wyłącznie ilustracja matematyczna.

Nie stanowi prognozy rzeczywistej czystości ani wydajności syntezy peptydu zawierającego 50 reszt.

Rzeczywista produkcja obejmuje:

• różne wydajności sprzęgania w poszczególnych pozycjach;
• etapy odbezpieczania;
• reakcje uboczne;
• zależne od sekwencji trudności;
• strategie ponownego sprzęgania;
• straty podczas odszczepiania;
• straty podczas oczyszczania;
• inne zmienne procesowe.

Obliczenie pokazuje jedynie, dlaczego nawet pozornie niewielka nieefektywność pojedynczego etapu może nabrać dużego znaczenia w wieloetapowej syntezie.

Grupy ochronne kontrolują miejsce reakcji

Aminokwas może posiadać kilka chemicznie reaktywnych grup.

Bez selektywnej kontroli reakcje sprzęgania mogłyby zachodzić w niepożądanych miejscach.

Grupy ochronne tymczasowo blokują wybrane miejsca reaktywne.

Grupa aminowa wykorzystywana do wydłużania łańcucha zazwyczaj wymaga tymczasowej ochrony, natomiast reaktywne łańcuchy boczne mogą wymagać zabezpieczenia pozostającego na miejscu przez wiele cykli syntezy.

Połączenie z nośnikiem również musi przetrwać te etapy aż do momentu zaplanowanego odszczepienia.

Wybór grup ochronnych wpływa więc na całą strategię syntezy.

Należy uwzględnić:

• sposób ich wprowadzania;
• stabilitāte;
• sposób usuwania;
• zgodność z innymi grupami ochronnymi;
• zgodność z nośnikiem;
• reakcje uboczne;
• wpływ konkretnej sekwencji;
• końcowe warunki odbezpieczania.

Badania wykorzystujące ochronę opartą na cyjanosulfurylidzie dotyczyły powstawania aspartimidu poprzez zmianę sposobu zabezpieczenia grupy karboksylowej. [2]

Wyniki pokazują, że strategia grup ochronnych wpływa nie tylko na to, czy zamierzona reakcja może zajść, ale również na to, jakie niepożądane reakcje stają się możliwe.

Fmoc, Boc i ochrona ortogonalna

Fmoc i Boc należą do szeroko stosowanych grup chroniących grupy aminowe.

Istotnie różnią się sposobem usuwania.

Fmoc jest zazwyczaj usuwany w warunkach zasadowych, natomiast Boc jest wrażliwy na warunki kwaśne.

Właściwości te pozwalają stosować je jako elementy szerszych strategii ochrony.

W popularnej SPPS opartej na Fmoc tymczasowa ochrona N-końcowa Fmoc jest wielokrotnie usuwana, podczas gdy wybrane grupy ochronne łańcuchów bocznych oraz połączenie z żywicą pozostają nienaruszone do późniejszych etapów.

Inne strategie mogą wykorzystywać odmienne kombinacje.

Szczególnie ważnym pojęciem jest ochrona ortogonalna.

Dwie grupy ochronne są uznawane za ortogonalne, jeśli jedną można selektywnie usunąć w warunkach, w których druga pozostaje wystarczająco stabilna, aby możliwe było dalsze prowadzenie syntezy.

Ortogonalność jest więc praktyczną relacją zgodności chemicznej.

Nie oznacza, że każda zabezpieczona grupa pozostanie całkowicie niezmieniona po nieograniczonej liczbie ekspozycji na wszystkie warunki reakcji.

Reakcje uboczne nadal mogą występować.

W badaniach syntezy Fmoc opisano zarówno powstawanie aspartimidu, jak i niepożądane zmiany stereochemiczne mimo zakładanej selektywności ogólnej strategii ochronnej. [11]

Stereochemia jest częścią tożsamości cząsteczki

Wiele aminokwasów posiada centrum chiralne.

Oznacza to, że ich atomy mogą przyjmować różne układy przestrzenne odpowiadające różnym formom stereochemicznym.

Zmiana konfiguracji jednego centrum stereogenicznego może prowadzić do powstania innej struktury peptydu bez konieczności zmiany jego nominalnej masy.

Dlatego sama masa nie może potwierdzić pełnej tożsamości peptydu.

Epimeryzacja zazwyczaj oznacza zmianę konfiguracji jednego centrum stereogenicznego w cząsteczce zawierającej kilka takich centrów.

Racemizacja jest również często omawiana w chemii peptydów w kontekście utraty integralności stereochemicznej reszt aminokwasowych.

Zmiany te są istotne, ponieważ rozpoznawanie molekularne może silnie zależeć od przestrzennego ułożenia atomów.

Dwie cząsteczki o tym samym składzie pierwiastkowym i nominalnej masie mogą więc zachowywać się inaczej, jeśli różnią się stereochemią.

W badaniu syntezy Fmoc wspomaganej mikrofalami stwierdzono, że niektóre reszty były podatne na niepożądane zmiany stereochemiczne w zastosowanych warunkach. Modyfikacja metody ograniczała występowanie tych reakcji. [11]

Nie oznacza to, że ogrzewanie z definicji uszkadza wszystkie peptydy.

Prawidłowy wniosek jest taki, że przyspieszanie reakcji należy oceniać razem z zależną od sekwencji selektywnością chemiczną.

Aspartimid i inne pokrewne zanieczyszczenia

Powstawanie aspartimidu jest znaną reakcją uboczną dotyczącą określonych sekwencji zawierających asparaginian.

Może powstać niepożądany cykliczny półprodukt, z którego następnie tworzą się związki o zmienionej łączności szkieletu lub stereochemii.

Prawdopodobieństwo tej reakcji zależy od sekwencji oraz warunków procesu.

Inne zanieczyszczenia związane z syntezą mogą wynikać z:

• niepełnego sprzęgania;
• niepełnego odbezpieczania;
• powstawania sekwencji delecyjnych;
• reakcji łańcuchów bocznych;
• zmian stereochemicznych;
• reakcji podczas odszczepiania;
• utleniania;
• przegrupowań;
• warunków obróbki produktu;
• niepełnego usunięcia grup ochronnych.

Niektóre zanieczyszczenia powodują łatwo zauważalną zmianę masy cząsteczkowej.

Inne są znacznie trudniejsze do rozróżnienia.

W badaniach analitycznych syntetycznego peptydu będącego substratem reniny zidentyfikowano wiele zanieczyszczeń, w tym składniki wykazujące taką samą zmianę masy, ale zawierające modyfikacje w różnych pozycjach. [12]

Do ich rozróżnienia potrzebna była dodatkowa analiza strukturalna.

Badacze traktowali również proponowane mechanizmy powstawania tych zanieczyszczeń jako hipotezy.

Jest to ważne rozróżnienie:

ustalenie, czym jest zanieczyszczenie, oraz udowodnienie dokładnego mechanizmu jego powstania to dwa odrębne pytania naukowe.

Nie należy przedstawiać prawdopodobnego mechanizmu jako potwierdzonego wyłącznie dlatego, że odpowiada obserwowanej masie cząsteczkowej.

Oczyszczanie, skalowanie i jakość produkcji

Produkt surowy, produkt oczyszczony i wydajność

Surowy peptyd to materiał otrzymany przed zakończeniem odpowiednich etapów oczyszczania.

Może zawierać:

• docelowy peptyd;
• delecijas sekvences;
• materiał niecałkowicie odbezpieczony;
• zmodyfikowane sekwencje;
• pozostałości odczynników;
• produkty związane z odszczepianiem;
• sole;
• šķīdinātāji;
• inne składniki powstające w procesie.

Oczyszczanie ma na celu oddzielenie właściwego peptydu od tej mieszaniny.

Należy wyraźnie rozróżnić trzy pojęcia:

czystość produktu surowego — zmierzony skład materiału przed końcowym oczyszczaniem;

wydajność produktu oczyszczonego lub wyizolowanego — ilość odzyskanego materiału docelowego względem określonej wartości początkowej lub teoretycznej;

czystość końcowa — skład wyizolowanego materiału określony za pomocą konkretnej metody analitycznej.

Pojęcia te nie są wymienne.

Proces może prowadzić do powstania dużej ilości surowego materiału, ale umożliwiać odzyskanie stosunkowo niewielkiej ilości oczyszczonego produktu.

Inny proces może dawać mniej materiału surowego, ale charakteryzować się wysoką selektywnością tworzenia produktu docelowego.

Podobnie wysoka czystość analityczna nie musi oznaczać wysokiej wydajności produkcyjnej.

W badaniach przyspieszonej syntezy przepływowej prawidłowo raportowano osobno czystość materiału surowego i wydajność po izolacji. [7]

Chromatografia rozdziela składniki, ale nie odpowiada na każde pytanie

Wysokosprawna chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) jest szeroko stosowana do analizy i oczyszczania peptydów.

Różne cząsteczki w odmienny sposób oddziałują z fazą stacjonarną i ruchomą.

W odpowiednich warunkach różnice te umożliwiają rozdzielanie składników mieszaniny.

Chromatografia analityczna i preparatywna mają powiązane, ale odmienne zastosowania.

Analityczna HPLC służy przede wszystkim do badania składu próbki.

Preparatywna HPLC jest wykorzystywana do fizycznego zbierania rozdzielonych składników.

Chromatogram może dostarczać wielu wartościowych informacji.

Dużego głównego piku lub wysokiego procentowego udziału jego powierzchni nie należy jednak traktować jako pełnej charakterystyki molekularnej.

Wyniki chromatografii zależą między innymi od:

• rodzaju kolumny;
• fazy ruchomej;
• gradients;
• temperatūras;
• metody detekcji;
• długości fali;
• przygotowania próbki;
• sposobu integracji pików;
• rozdzielczości;
• właściwości zanieczyszczeń.

Dwa związki mogą potencjalnie eluować w tym samym czasie.

Niektóre składniki próbki mogą również różnie reagować na zastosowany detektor.

Dlatego wysoka czystość powierzchniowa w HPLC nie jest równoznaczna z pełnym potwierdzeniem tożsamości molekularnej.

Badania izobarycznych zanieczyszczeń peptydowych oraz analizy chiralnej pokazują, dlaczego mogą być potrzebne uzupełniające metody analityczne. [12] [13]

Metoda analityczna musi odpowiadać konkretnemu pytaniu strukturalnemu.

Tożsamość, czystość i zawartość oznaczają różne rzeczy

W charakterystyce peptydów szczególnie ważne są trzy pojęcia.

Tożsamość odpowiada na pytanie:

Czy w próbce znajduje się zamierzona cząsteczka?

Czystość odpowiada na pytanie:

Jakie inne składniki znajdują się w próbce lub jaka część mierzonego sygnału odpowiada głównemu składnikowi?

Zawartość odpowiada na pytanie:

Ile rzeczywistego peptydu znajduje się w próbce?

Na te pytania nie zawsze można odpowiedzieć za pomocą jednego pomiaru.

Materiał zawierający peptyd może również zawierać:

• wodę;
• pretjons;
• sole;
• šķīdinātāju atliekas;
• inne składniki związane z procesem;
• zanieczyszczenia.

Całkowita masa odważonego materiału nie musi więc odpowiadać masie samego peptydu.

Podobnie zgodność zmierzonej masy cząsteczkowej z wartością teoretyczną nie potwierdza:

• kompletnej sekwencji aminokwasowej;
• prawidłowej łączności poszczególnych reszt;
• integralności stereochemicznej;
• disulfīda tiltiņu izvietojums;
• fałdowania;
• braku izobarycznych zanieczyszczeń.

Spektrometria mas może dostarczać silnych dowodów dotyczących masy cząsteczkowej.

Tandemowa spektrometria mas i inne techniki strukturalne mogą dostarczać dodatkowych informacji o sekwencji.

Metody chiralne pozwalają analizować zagadnienia stereochemiczne, których nie można rozstrzygnąć zwykłym pomiarem masy.

W jednym z badań analitycznych uwzględniono nawet racemizację powstającą podczas przygotowania próbki. Pokazuje to kolejną ważną zasadę: sama procedura analityczna może powodować artefakty, jeśli nie zostanie odpowiednio zaprojektowana. [13]

Fałdowanie i aktywność mogą wymagać osobnego potwierdzenia

W przypadku strukturalnie ograniczonych peptydów i małych białek prawidłowa sekwencja oraz masa cząsteczkowa nadal mogą być niewystarczające do potwierdzenia zamierzonej struktury końcowej.

Dodatkowe pytania mogą obejmować:

• Czy powstały właściwe mostki disiarczkowe?
• Czy cząsteczka przyjęła oczekiwaną konformację?
• Czy cyklizacja jest kompletna?
• Czy obecne są izomery strukturalne?
• Czy syntetyczna cząsteczka wykazuje oczekiwaną aktywność w określonym teście eksperymentalnym?

W badaniu syntezy BPTI wykorzystano kilka metod analitycznych i biofizycznych wraz z oceną hamowania trypsyny. [3]

Łączne wyniki wspierały zgodność syntetycznego materiału o naturalnej sekwencji z naturalnym białkiem w zakresie badanych kryteriów.

Test aktywności odpowiada jednak na określone pytanie funkcjonalne.

Nie zastępuje analizy zanieczyszczeń.

Podobnie podobna aktywność w jednym teście nie potwierdza pełnej równoważności wszystkich właściwości biologicznych, strukturalnych czy produkcyjnych.

Skalowanie produkcji zmienia więcej niż tylko ilość materiału

Zwiększenie skali produkcji nie polega wyłącznie na proporcjonalnym zwiększeniu ilości wszystkich odczynników.

Procesy fizyczne mogą zachowywać się inaczej przy większej skali.

Znaczenie mogą mieć:

• mieszanie;
• wymiana ciepła;
• rozprowadzanie odczynników;
• dyfuzja;
• pęcznienie żywicy;
• ciśnienie;
• filtracja;
• gospodarka rozpuszczalnikami;
• wytrącanie;
• rozpuszczalność półproduktów;
• transport masy;
• możliwości systemu oczyszczania.

Czynniki te mogą wpływać zarówno na przebieg reakcji, jak i na powstawanie zanieczyszczeń.

Oczyszczanie na późniejszych etapach również może stać się wąskim gardłem całej produkcji.

Zwiększenie szybkości syntezy ma ograniczone znaczenie, jeśli system oczyszczania nie jest w stanie skutecznie rozdzielić powstających zanieczyszczeń lub odzyskać produktu o wymaganej jakości.

W analizie przemysłowej obejmującej 40 procesów syntezy peptydów z 14 firm farmaceutycznych oceniano zużycie materiałów podczas syntezy, oczyszczania i izolacji. [14]

Badanie pokazuje, dlaczego ocenę produkcji należy prowadzić dla całego procesu.

Nie oznacza jednak, że każda fabryka, sekwencja lub technologia produkcyjna osiąga identyczne wyniki.

Jakość produkcji jest wynikiem wielu elementów kontroli

Wiarygodna produkcja peptydów wymaga czegoś więcej niż uzyskania jednego satysfakcjonującego wyniku analitycznego.

Kontrolowany proces zazwyczaj obejmuje kilka powiązanych elementów:

zdefiniowana cząsteczka docelowa → odpowiednie materiały wyjściowe → kontrolowana synteza → kontrolowane oczyszczanie → właściwe pobieranie próbek → zwalidowana lub odpowiednia do celu analiza → dokumentacja partii.

Dokumentacja partii łączy wyniki analityczne z materiałem, który rzeczywiście został wyprodukowany.

Certyfikat analizy (COA) podsumowuje wybrane wyniki badań określonej partii.

Jego wartość informacyjna zależy od:

• rodzaju wykonanych badań;
• zastosowanych metod;
• przydatności tych metod;
• specyfikacji;
• identyfikacji próbki;
• możliwości prześledzenia partii;
• potwierdzenia, że raportowane wyniki rzeczywiście dotyczą danego materiału.

Pojedyncza wartość określana jako „czystość” nie może samodzielnie potwierdzić:

• pełnej tożsamości molekularnej;
• zawartości peptydu;
• integralności stereochemicznej;
• poziomu pozostałości rozpuszczalników;
• zawartości wody;
• składu przeciwjonów;
• właściwości mikrobiologicznych;
• fałdowania;
• bioloģiskās aktivitātes;
• przydatności do określonego celu.

Odpowiedni zestaw analiz zależy od zamierzonego zastosowania materiału.

Peptyd wykorzystywany jako analityczny materiał odniesienia, odczynnik badawczy stosowany w eksperymencie komórkowym oraz materiał znajdujący się na etapie rozwoju farmaceutycznego mogą wymagać odpowiedzi na inne pytania jakościowe.

Dowody analityczne należy więc interpretować w jasno określonym kontekście, a nie jako uniwersalne potwierdzenie jakości.

Ocena zrównoważenia środowiskowego musi obejmować cały proces

Synteza peptydów może wymagać znacznych ilości rozpuszczalników i odczynników.

Ocena wpływu środowiskowego powinna więc uwzględniać znacznie więcej niż sam etap sprzęgania.

Do istotnych elementów mogą należeć:

• przygotowanie bloków budulcowych;
• odczynniki sprzęgające;
• odczynniki do odbezpieczania;
• skalošana;
• atdalīšana;
• obróbka produktu;
• chromatografia;
• wymiana rozpuszczalników;
• izolacja;
• žāvēšana;
• gospodarowanie odpadami.

Zmniejszenie obciążenia środowiskowego może wymagać równoczesnej poprawy kilku etapów.

W opublikowanej analizie dotyczącej produkcji peptydów omówiono problemy związane zarówno z syntezą, jak i oczyszczaniem oraz wskazano potrzebę ulepszania całego projektu procesu. [15]

Jako publikacja perspektywiczna nie stanowi ona kontrolowanego bezpośredniego porównania dowodzącego, że jedna konkretna technologia zawsze jest bardziej przyjazna środowisku.

Līdzīgi:

szybsza synteza nie oznacza automatycznie bardziej ekologicznej syntezy,

a mniejsze zużycie rozpuszczalników podczas samej syntezy nie oznacza automatycznie mniejszego wpływu całego procesu produkcyjnego.

Porównania środowiskowe wymagają stosowania spójnych granic analizy i najlepiej powinny odnosić zużycie zasobów do określonej ilości wyizolowanego i scharakteryzowanego produktu końcowego.

Biežāk uzdotie jautājumi

1. Czym różni się synteza peptydów na fazie stałej od syntezy w fazie ciekłej?

W syntezie na fazie stałej rosnący peptyd pozostaje przyłączony do nierozpuszczalnego nośnika, natomiast w klasycznej syntezie w roztworze półprodukt peptydowy pozostaje rozpuszczony i zazwyczaj musi być odzyskiwany na podstawie swoich właściwości fizycznych i chemicznych. W węższym znaczeniu LPPS rozpuszczony rosnący łańcuch posiada dodatkowo rozpuszczalny znacznik lub nośnik ułatwiający późniejsze rozdzielanie. Badania syntezy znakowanej pokazują jedną ze strategii łączenia chemii roztworowej z odzyskiwaniem poprzez wytrącanie, natomiast literatura dotycząca LPPS odróżnia takie rozwiązania zarówno od klasycznej syntezy w roztworze, jak i od SPPS. Żadna metoda nie jest z definicji optymalna dla każdego peptydu. Podstawowa różnica dotyczy sposobu fizycznego prowadzenia i rozdzielania rosnącego łańcucha podczas kolejnych etapów syntezy. [8] [9]

2. Dlaczego podczas syntezy peptydów mogą powstawać zanieczyszczenia?

Zanieczyszczenia mogą powstawać dlatego, że zamierzone reakcje nie zawsze zachodzą ilościowo, a inne grupy funkcyjne mogą uczestniczyć w niepożądanych reakcjach. Niepełne sprzęganie może prowadzić do sekwencji delecyjnych, niepełne odbezpieczanie może zakłócać dalsze składanie łańcucha, a niektóre sekwencje są podatne na zmiany stereochemiczne, powstawanie aspartimidu, utlenianie, przegrupowania lub produkty uboczne związane z odszczepianiem. Badania syntezy Fmoc oraz analizy strukturalnej syntetycznych zanieczyszczeń peptydowych dokumentują kilka takich przykładów. [11] [12] Częstość i znaczenie poszczególnych zanieczyszczeń zależą od sekwencji i procesu, dlatego automatyzacji syntezy nie należy utożsamiać z całkowitym brakiem błędów chemicznych.

3. Jaką rolę pełni żywica w syntezie peptydów?

Żywica utrzymuje rosnący peptyd, podczas gdy rozpuszczalne odczynniki i wiele produktów ubocznych można usuwać pomiędzy kolejnymi etapami syntezy. Znacznie upraszcza to powtarzające się składanie łańcucha, ale żywica nie jest wyłącznie mechanicznym uchwytem. Jej pęcznienie, stopień obsadzenia, architektura polimeru, zgodność z rozpuszczalnikami i dostępność miejsc reakcji mogą wpływać na skuteczność docierania odczynników do przyłączonego peptydu. W badaniach z wykorzystaniem reaktora ze zmiennym złożem monitorowano zachowanie żywicy podczas analizy agregacji i efektywności sprzęgania. [4] Takie monitorowanie nie eliminuje błędów sekwencji, ale pokazuje, dlaczego fizyczny stan żywicy może być istotną zmienną procesową.

4. Do czego służy żywica Wanga w syntezie peptydów?

Nośniki typu Wang są powszechnie związane z przygotowywaniem peptydów uwalnianych po odpowiednim odszczepieniu z C-końcem w postaci kwasu karboksylowego. Dokładny produkt końcowy zależy jednak od linkera, architektury nośnika i zastosowanej chemii odszczepiania, a nie tylko od nazwy żywicy. Badacze przedstawili również specjalistyczną metodę przekształcania materiału peptydyl-Wang-TentaGel w hydrazydy peptydowe, które mogą służyć jako użyteczne półprodukty syntetyczne. [5] Alternatywna reakcja nie zmienia znaczenia standardowego odszczepiania z żywicy Wanga. Pokazuje natomiast, dlaczego podczas przewidywania produktu należy analizować cały system nośnika i warunki reakcji.

5. Czy SPPS buduje peptyd od N-końca czy od C-końca?

Klasyczna etapowa SPPS zazwyczaj rozpoczyna się od przyłączenia C-końcowej reszty do nośnika, po czym łańcuch jest wydłużany w kierunku N-końca. Jest to kierunek przeciwny do standardowego wydłużania łańcucha na rybosomie, gdzie białko rośnie poprzez dodawanie kolejnych aminokwasów do C-końca. Synteza BPTI jest przykładem wykorzystania zabezpieczonych bloków budulcowych i nośnika przed późniejszym uwolnieniem, oczyszczaniem i fałdowaniem produktu. [3] Istnieją jednak specjalistyczne strategie chemii peptydów wykorzystujące inne rozwiązania, dlatego budowanie od C- do N-końca należy określać jako klasyczne podejście SPPS, a nie bezwzględną zasadę wszystkich metod syntezy.

6. Dlaczego grupy ochronne są potrzebne?

Aminokwasy często zawierają kilka reaktywnych grup funkcyjnych. Grupy ochronne tymczasowo zapobiegają reakcji wybranych miejsc, pozostawiając odpowiednie miejsce dostępne w konkretnym etapie syntezy. Pomaga to kontrolować kolejność i sposób łączenia reszt. Bez właściwej ochrony konkurencyjne reakcje mogłyby prowadzić do powstawania złożonych mieszanin lub produktów o zmienionej strukturze. Badania dotyczące powstawania aspartimidu pokazały, że zmiana chemii ochrony grupy karboksylowej może ograniczać ważną reakcję uboczną w analizowanych sekwencjach. [2] Grupy ochronne nie gwarantują idealnego przebiegu syntezy, lecz zapewniają selektywną kontrolę chemiczną, która musi pozostać zgodna ze wszystkimi istotnymi etapami procesu.

7. Czym różnią się Fmoc i Boc?

Fmoc i Boc są szeroko stosowanymi tymczasowymi grupami chroniącymi grupę aminową, ale reagują na inne warunki chemiczne. Fmoc jest zazwyczaj usuwany w środowisku zasadowym, natomiast Boc jest wrażliwy na kwasy. Różnica ta wpływa na sposób łączenia ich z ochroną łańcuchów bocznych, linkerami i pozostałymi etapami syntezy. Synteza oparta na Fmoc jest szeroko wykorzystywana we współczesnej SPPS, ale badania wykazały również możliwość występowania zależnych od sekwencji reakcji ubocznych w takich warunkach. [11] W praktyce bardziej użyteczne jest więc porównywanie całych strategii ochrony i ich zgodności z daną sekwencją niż rozpatrywanie wyłącznie nazw dwóch grup ochronnych.

8. Co oznacza ochrona ortogonalna?

Ochrona ortogonalna oznacza, że jedną grupę ochronną można usunąć w warunkach, w których inna potrzebna grupa ochronna pozostaje wystarczająco stabilna, aby można było kontynuować syntezę. Pozwala to odsłaniać różne miejsca reaktywne na określonych etapach. Koncepcja ta ma podstawowe znaczenie podczas kontrolowanej syntezy złożonych peptydów. Ortogonalność jest jednak zależna od warunków, a nie absolutna: wielokrotna ekspozycja, charakter sekwencji i parametry reakcji nadal mogą prowadzić do reakcji ubocznych. Badania alternatywnych sposobów ochrony grup karboksylowych pokazują, jak strategię ochrony można modyfikować w celu kontrolowania trudnej chemii peptydowej. [2]

9. Czym jest sekwencja delecyjna?

Sekwencja delecyjna to peptyd pozbawiony jednej lub kilku reszt obecnych w zamierzonej sekwencji docelowej. Może powstać, gdy etap sprzęgania aminokwasu nie zachodzi całkowicie, ale nieprzereagowany łańcuch pozostaje przyłączony do nośnika i uczestniczy w kolejnych cyklach. Ponieważ nieprawidłowy łańcuch nadal pozostaje związany z żywicą, zwykłe przemywanie nie musi go usunąć. Badania monitorowania SPPS w czasie rzeczywistym wskazują niepełne tworzenie wiązań amidowych jako ważny problem procesowy. [4] Sekwencja delecyjna jest więc problemem związanym ze strukturą i tożsamością produktu, a nie jedynie pozostałością odczynnika.

10. Czy dwa zanieczyszczenia peptydowe mogą mieć taką samą masę cząsteczkową?

Tak. Różne struktury molekularne mogą mieć identyczną lub nierozróżnialną masę nominalną. Z tego powodu sama zgodność masy nie potwierdza pełnej tożsamości cząsteczki. W badaniach syntetycznego peptydu będącego substratem reniny zidentyfikowano izobaryczne składniki zanieczyszczeń, w których modyfikacje występowały w różnych pozycjach. Derywatyzacja i tandemowa spektrometria mas dostarczyły dodatkowych informacji strukturalnych. [12] Przykład ten pokazuje, dlaczego zgodność obserwowanej masy z oczekiwaną nie może samodzielnie potwierdzić właściwej sekwencji, łączności, stereochemii ani braku strukturalnie podobnych izomerów.

11. Czym są epimeryzacja i racemizacja w syntezie peptydów?

Epimeryzacja i racemizacja dotyczą niepożądanych zmian konfiguracji stereochemicznej. Mogą one zachodzić bez zmiany nominalnej sekwencji aminokwasowej lub masy cząsteczkowej, dlatego zwykły pomiar masy może nie wykazać różnicy strukturalnej. W badaniach syntezy Fmoc wspomaganej mikrofalami zidentyfikowano reszty podatne na zmiany stereochemiczne i wykazano, że modyfikacja warunków reakcji może ograniczać takie procesy. [11] Ryzyko zależy od bloku budulcowego, sekwencji i warunków procesu. Jakość stereochemiczna wymaga więc metod analitycznych zdolnych do oceny konfiguracji, a nie może być wnioskowana wyłącznie na podstawie masy cząsteczkowej.

12. Czym jest powstawanie aspartimidu?

Powstawanie aspartimidu jest niepożądaną reakcją związaną z określonymi sekwencjami zawierającymi asparaginian. Powstanie cyklicznego półproduktu może prowadzić do kolejnych produktów o zmienionej łączności szkieletu lub stereochemii, zmniejszając wydajność i utrudniając oczyszczanie. Badacze analizowali alternatywne strategie ochrony zaprojektowane w celu ograniczenia tej reakcji w wybranych peptydach i białkach. [2] Wyniki nie wskazują jednego uniwersalnego rozwiązania dla wszystkich sekwencji zawierających asparaginian. Pokazują natomiast, dlaczego projektowanie syntezy i strategii kontroli zanieczyszczeń musi uwzględniać specyficzne zachowanie chemiczne danej sekwencji.

13. Czy wysoka czystość HPLC potwierdza prawidłową tożsamość peptydu?

Nie. Czystość HPLC opisuje próbkę w ramach konkretnego rozdziału chromatograficznego, zastosowanego detektora i sposobu analizy danych. Wysoki udział powierzchni głównego piku może być wartościowym dowodem, że próbka jest zdominowana przez jeden chromatograficznie rozdzielony składnik, ale nie potwierdza samodzielnie pełnej tożsamości molekularnej. Współeluujące zanieczyszczenia, stereoizomery i inne warianty mogą wymagać dodatkowych technik. W badaniach analizy chiralnej peptydów wykorzystano specjalnie zaprojektowany proces, który uwzględniał również zmiany stereochemiczne powstające podczas przygotowania próbki. [13] Tożsamość i czystość należy więc traktować jako powiązane, ale odrębne pytania analityczne.

14. Czy wydajność produktu oczyszczonego oznacza to samo co czystość?

Nie. Wydajność produktu oczyszczonego lub wyizolowanego określa ilość odzyskanego materiału docelowego względem zdefiniowanej ilości początkowej lub teoretycznej. Czystość opisuje natomiast skład odzyskanego materiału według określonej metody analitycznej. Synteza może prowadzić do uzyskania stosunkowo niewielkiej ilości produktu o bardzo wysokiej czystości albo dużej ilości materiału surowego zawierającego znaczną ilość zanieczyszczeń. W badaniach automatycznej syntezy przepływowej czystość surowego produktu i wydajność po izolacji raportowano oddzielnie. [7] Rozdzielenie tych parametrów zapobiega błędnemu traktowaniu wysokiej wartości jednego z nich jako dowodu wysokiej wartości drugiego.

15. Czy długie peptydy można wytwarzać poprzez łączenie krótszych fragmentów?

Tak. W strategii fragmentowej krótsze segmenty peptydowe mogą zostać przygotowane oddzielnie, a następnie połączone za pomocą odpowiedniej chemii. Natwywna ligacja chemiczna była ważnym przykładem, w którym niezabezpieczone fragmenty peptydowe połączono w sposób prowadzący do powstania naturalnego wiązania szkieletu peptydowego, a następnie uzyskano pofałdowane białko. [10] Nie oznacza to, że dowolne fragmenty peptydowe mogą łączyć się spontanicznie. Należy uwzględnić strukturę fragmentów, chemię łączenia, wybór miejsca połączenia, rozpuszczalność, stereochemię i wymagania dotyczące oczyszczania. Składanie fragmentów jest więc alternatywną strategią projektowania syntezy, a nie automatycznym rozwiązaniem problemów związanych z długimi peptydami.

16. Czy szybsza zautomatyzowana synteza eliminuje potrzebę oczyszczania?

Nie. Szybsze zautomatyzowane lub przepływowe składanie skraca czas określonych etapów syntezy, ale nie dowodzi, że każda powstała cząsteczka ma zamierzoną strukturę. W badaniach szybkiej syntezy przepływowej nadal charakteryzowano materiał surowy i stosowano późniejsze oczyszczanie, a w kolejnych pracach dotyczących automatyzacji osobno porównywano czystość surowego materiału i wydajność po izolacji. [6] [7] Dobre wyniki systemu dla badanych sekwencji nie gwarantują również identycznych rezultatów dla każdego nowego celu. Przyspieszona synteza nadal musi być połączona z odpowiednim oczyszczaniem, potwierdzeniem tożsamości, analizą zanieczyszczeń i charakterystyką końcową.

17. Dlaczego zwiększenie skali produkcji jest bardziej skomplikowane niż przygotowanie większej partii?

Zwiększenie skali zmienia warunki fizyczne i chemiczne, a nie tylko ilość materiału. Mieszanie, wymiana ciepła, pęcznienie żywicy, dystrybucja odczynników, ciśnienie, filtracja, obsługa rozpuszczalników, rozpuszczalność półproduktów i możliwości systemu oczyszczania mogą zachowywać się inaczej przy większej objętości produkcji. W analizie przemysłowej 40 procesów peptydowych osobno oceniano syntezę, oczyszczanie i izolację podczas analizy zużycia materiałów. [14] Wyniki pokazują, dlaczego produkcję trzeba rozpatrywać jako kompletny proces. Skalowalna metoda musi powtarzalnie prowadzić do uzyskania scharakteryzowanego materiału na wszystkich etapach, a nie tylko większej ilości surowego peptydu.

18. Czy peptyd jest gotowy od razu po złożeniu prawidłowej sekwencji?

Niekoniecznie. Złożenie łańcucha tworzy szkielet sekwencji tylko w takim zakresie, w jakim potwierdzają to proces i dane analityczne. W zależności od cząsteczki mogą być nadal potrzebne odbezpieczanie, odszczepianie, cyklizacja, utlenianie, tworzenie mostków disiarczkowych, fałdowanie, koniugacja, oczyszczanie i charakterystyka. Synteza BPTI stanowi dobry przykład procesu, w którym po złożeniu liniowej sekwencji następowało oczyszczanie i tworzenie pofałdowanej struktury zawierającej mostki disiarczkowe. [3] Określenie „gotowy peptyd” powinno więc odnosić się do formy molekularnej wymaganej w danym kontekście naukowym, a nie tylko do zakończenia etapowego dodawania aminokwasów.

19. Czy prawidłowa masa cząsteczkowa potwierdza prawidłową sekwencję peptydu?

Nie. Zgodność masy cząsteczkowej jest wartościowym dowodem, ale nie może samodzielnie potwierdzić pełnej sekwencji ani struktury molekularnej. Struktury izobaryczne mogą mieć tę samą masę, a różnice stereochemiczne mogą w ogóle nie powodować zmiany masy cząsteczkowej. Badania zanieczyszczeń syntetycznych peptydów pokazały, że rozróżnienie strukturalnie odmiennych składników może wymagać tandemowej spektrometrii mas i dodatkowych analiz. [12] W przypadku pytań dotyczących integralności stereochemicznej mogą być potrzebne również metody chiralne. [13] Masę cząsteczkową należy więc traktować jako jeden z elementów oceny tożsamości, a nie jej pełne potwierdzenie.

20. Dlaczego oczyszczanie należy traktować jako część produkcji peptydu, a nie tylko końcowy dodatek?

Oczyszczanie decyduje o tym, czy docelowy peptyd można skutecznie oddzielić od sekwencji delecyjnych, produktów ubocznych, pozostałości odczynników, strukturalnie podobnych zanieczyszczeń i innych składników powstałych podczas syntezy. Metoda pozwalająca bardzo szybko wytwarzać duże ilości surowego materiału może nadal być niepraktyczna, jeśli nie da się skutecznie odzyskać docelowego produktu o wymaganej jakości. Z tego powodu analizy przemysłowe procesów peptydowych uwzględniają razem syntezę, oczyszczanie i izolację. [14] Efektywność produkcji należy ostatecznie oceniać na podstawie ilości i właściwości wyizolowanego materiału końcowego, a nie wyłącznie szybkości syntezy.

Ograniczenia przy porównywaniu metod syntezy peptydów

Podczas interpretowania badań porównujących technologie produkcji peptydów należy pamiętać o kilku istotnych ograniczeniach.

Po pierwsze, sekwencja silnie wpływa na trudność syntezy. Metoda sprawdzająca się dla jednego peptydu nie musi działać tak samo dla innego. Agregacja, hydrofobowość, skład aminokwasowy, długość, tendencja do tworzenia struktur drugorzędowych i podatność na reakcje uboczne mogą zmieniać zachowanie procesu. [1] [4]

Po drugie, czystość materiału surowego, wydajność po izolacji, czystość końcowa i zawartość peptydu są różnymi parametrami. Porównywanie metod wyłącznie na podstawie jednego z nich może dawać niepełny obraz efektywności produkcji. [7]

Po trzecie, szybkie składanie łańcucha nie oznacza szybkiej produkcji całego materiału. Odszczepianie, oczyszczanie, izolacja, końcowe kształtowanie struktury, badania analityczne i dokumentacja również wpływają na całkowity czas produkcji. [6] [7]

Po czwarte, czystość analityczna zależy od zastosowanej metody. HPLC, spektrometria mas, tandemowa spektrometria mas i analiza chiralna odpowiadają na różne pytania. Jeden wynik analityczny nie musi potwierdzać pełnej tożsamości strukturalnej. [12] [13]

Po piąte, skala wpływa na zachowanie procesu. Wyników syntezy laboratoryjnej nie można automatycznie przenosić na produkcję przemysłową bez oceny mieszania, transportu masy, możliwości oczyszczania, zużycia materiałów i innych czynników zależnych od skali. [14]

Po szóste, historyczne porównania ekonomiczne mogą z czasem tracić aktualność. Koszty odczynników, poziom automatyzacji, technologie ekspresji, wyposażenie do oczyszczania, odzyskiwanie rozpuszczalników i infrastruktura produkcyjna stale się rozwijają. Starsze analizy kosztów mogą nadal mieć znaczenie naukowe, ale nie muszą odzwierciedlać aktualnej ekonomiki rynku. [1]

Po siódme, porównania środowiskowe wymagają spójnych granic analizy. Ocena zużycia rozpuszczalników podczas samego składania łańcucha przy jednoczesnym pominięciu oczyszczania i izolacji może prowadzić do mylących wniosków dotyczących zrównoważenia procesu. [14] [15]

Wreszcie sama nazwa metody nie określa jakości produktu. SPPS, synteza w roztworze, LPPS, ligacja fragmentów oraz ekspresja biologiczna mogą prowadzić do uzyskania materiału wysokiej jakości, jeśli proces został odpowiednio zaprojektowany i kontrolowany. Żadna z tych metod nie gwarantuje jednak automatycznie właściwej tożsamości, czystości, stereochemii, fałdowania czy przydatności do konkretnego zastosowania.

Kopsavilkums

Syntezę peptydów najlepiej rozumieć jako kontrolowany proces wytwarzania cząsteczek, a nie po prostu tworzenie wiązań peptydowych.

Celem jest zbudowanie określonej sekwencji aminokwasowej przy jednoczesnym kontrolowaniu sposobu połączenia reszt, chemii grup ochronnych, stereochemii, reakcji ubocznych i wszelkich dodatkowych wymagań strukturalnych.

Synteza peptydów na fazie stałej utrzymuje rosnący łańcuch na nierozpuszczalnym nośniku, dzięki czemu powtarzane etapy sprzęgania i przemywania dobrze nadają się do automatyzacji. Zalety związane z powtarzalnym składaniem nie eliminują jednak problemów takich jak niepełne reakcje, agregacja, sekwencje delecyjne czy zależne od sekwencji reakcje uboczne. [4] [6] [7]

Klasyczna synteza w roztworze utrzymuje półprodukty peptydowe w fazie ciekłej i może zapewniać większą elastyczność w izolowaniu oraz charakteryzowaniu poszczególnych produktów pośrednich. Wielokrotne rozdzielanie oraz pogarszająca się rozpuszczalność mogą jednak stać się poważnymi ograniczeniami.

Metody syntezy w fazie ciekłej z rozpuszczalnymi znacznikami próbują połączyć chemię roztworową z zaprojektowanymi strategiami odzyskiwania materiału. Mogą więc stanowić dodatkową możliwość w przypadku sekwencji i problemów produkcyjnych, dla których klasyczna SPPS nie jest optymalna. [8] [9]

Dłuższe lub szczególnie trudne cząsteczki można również przygotowywać poprzez składanie fragmentów, w tym natywną ligację chemiczną, zamiast polegać wyłącznie na nieprzerwanym dodawaniu kolejnych reszt aminokwasowych. [10]

Niezależnie od wybranej metody składania efektywność sprzęgania i chemia grup ochronnych pozostają kluczowe, ponieważ niewielkie nieefektywności i reakcje uboczne mogą kumulować się podczas kolejnych etapów syntezy. Powstawanie aspartimidu, sekwencje delecyjne i zmiany stereochemiczne pokazują, dlaczego sama zamierzona sekwencja nie opisuje wszystkiego, co może powstać podczas procesu. [2] [11] [12]

Praca nie kończy się również wraz ze złożeniem łańcucha.

Oczyszczanie decyduje o tym, czy produkt docelowy można oddzielić od innych składników.

Następnie odpowiednio dobrane metody analityczne odpowiadają na odrębne pytania dotyczące tożsamości, czystości, zawartości, stereochemii, konformacji oraz – jeśli ma to znaczenie – aktywności funkcjonalnej. [3] [12] [13]

Zwiększenie skali produkcji wprowadza kolejne zagadnienia dotyczące transportu masy, zachowania żywicy, zużycia rozpuszczalników, filtracji, możliwości oczyszczania, powtarzalności procesu i jego wpływu środowiskowego. Z tego powodu przemysłowa ocena procesu powinna obejmować razem syntezę, oczyszczanie i izolację, a nie koncentrować się wyłącznie na szybkości sprzęgania. [14] [15]

Najważniejsza zasada jest następująca:

skuteczna produkcja peptydu wymaga kontroli całego procesu – od projektu molekularnego i tworzenia wiązań aż po oczyszczanie oraz charakterystykę strukturalną. Uzyskanie łańcucha o oczekiwanej nominalnej masie lub wysokiego głównego piku chromatograficznego stanowi wartościowy dowód, ale żaden z tych parametrów samodzielnie nie potwierdza pełnej tożsamości molekularnej ani jakości procesu produkcyjnego.

Atruna

Artykuł ma wyłącznie charakter edukacyjny i naukowo-informacyjny. Opisuje ogólne zasady chemii peptydów, syntezy na fazie stałej, syntezy w roztworze i w fazie ciekłej, strategii grup ochronnych, sprzęgania, oczyszczania, charakterystyki analitycznej, procesów produkcyjnych oraz przykłady pochodzące z opublikowanych badań. Nie jest protokołem laboratoryjnym, instrukcją produkcyjną, poradą medyczną, przewodnikiem dotyczącym dawkowania lub podawania ani certyfikatem jakości jakiegokolwiek konkretnego produktu peptydowego. Wyniki eksperymentalne należy interpretować w kontekście sekwencji, zastosowanych metod, skali procesu, technik analitycznych i ograniczeń poszczególnych badań.

Atsauces

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K., & Perczel, A. (2016). Bacterial expression and/or solid phase peptide synthesis of 20-40 amino acid long polypeptides and miniproteins, the case study of Class B GPCR ligands. Current Protein & Peptide Science, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Prevention of aspartimide formation during peptide synthesis using cyanosulfurylides as carboxylic acid-protecting groups. Nature Communications, 11(1), Article 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). Solid-phase synthesis of bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) and two analogues. A chemical approach for evaluating the role of disulfide bridges in protein folding and stability. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. PubMed record
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). Real-time monitoring of solid-phase peptide synthesis using a variable bed flow reactor. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F., & Becker, C. F. W. (2015). Efficient generation of peptide hydrazides via direct hydrazinolysis of Peptidyl-Wang-TentaGel resins. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Rapid flow-based peptide synthesis. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2017). A fully automated flow-based approach for accelerated peptide synthesis. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G., & Albericio, F. (2022). Liquid-phase peptide synthesis (LPPS): A third wave for the preparation of peptides. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T., & Fukui, T. (2012). Novel diphenylmethyl-derived amide protecting group for efficient liquid-phase peptide synthesis: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., & Kent, S. B. (1994). Synthesis of proteins by native chemical ligation. Science, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Characterization of impurities in a synthetic renin substrate peptide by fast-atom bombardment mass spectrometry and hybrid tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G., & Crowther, J. B. (1995). Peptide chiral purity determination: Hydrolysis in deuterated acid, derivatization with Marfey’s reagent and analysis using high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Process mass intensity (PMI): A holistic analysis of current peptide manufacturing processes informs sustainability in peptide synthesis. The Journal of Organic Chemistry, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Sustainability challenges in peptide synthesis and purification: From R&D to production. The Journal of Organic Chemistry, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001