Sinteza peptidelor: metoda în fază solidă, în soluție și metode de producție

Sinteza peptidelor este un proces controlat de formare a lanțurilor de aminoacizi cu o secvență specifică. În sinteza chimică, aminoacizii selectați sunt uniți prin intermediul legături peptidice, controlând în același timp și alte grupări reactive prezente în aceste molecule. Scopul nu este, așadar, simpla legare a aminoacizilor, ci obținerea unei structuri moleculare specifice, cu o secvență, o stereochimie și o configurație a capetelor lanțului bine definite, precum și – dacă este necesar – cu caracteristici structurale suplimentare.

Printre principalele metode se numără sinteza peptidelor în fază solidă (SPPS), sinteza clasică în soluție și metodele mai recente de sinteză a peptidelor în fază lichidă (LPPS), care utilizează suporturi solubile sau marcatori moleculari. Laboratoarele de cercetare și unitățile de producție pot, de asemenea, să combine diferite abordări, să prepare separat fragmente mai scurte și apoi să le unească sau să utilizeze expresia biologică, dacă aceasta este mai adecvată pentru o anumită secvență.

Compararea sintezei chimice cu expresia bacteriană a polipeptidelor compuse din 20–40 de resturi de aminoacizi evidențiază un principiu important: alegerea practică a metodei de producție depinde de molecula respectivă, de secvența acesteia, de tendința de agregare, de modificările necesare, de scara de producție și de cerințele analitice. [1]

Obținerea secvenței de aminoacizi dorite este doar una dintre etapele de producție a peptidului.

Întregul proces poate include:

proiectarea secvențelor → pregătirea elementelor constitutive → protejarea grupărilor funcționale → cuplarea → îndepărtarea grupărilor protectoare → asamblarea lanțului → separarea sau unirea fragmentelor → modelarea finală a structurii → purificarea → confirmarea identității → analizaimpurităților → determinarea conținutului → caracterizarea finală.

În cazul anumitor peptide, sunt necesare și etape suplimentare, precum ciclizarea, formarea punților disulfidice, plierea, conjugarea sau alte modificări chimice.

Din acest motiv, asamblarea corectă a lanțului nu înseamnă în mod automat că materialul final are identitatea, puritatea, stereochimia, conformația, stabilitatea sau alte caracteristici necesare.

Ce este sinteza peptidelor?

Crearea unei secvențe specifice de aminoacizi

Peptidă este alcătuit din resturi de aminoacizi legați prin legături peptidice.

Scopul sintezei peptidice este formarea acestor legături într-o ordine prestabilită, adesea însoțită de controlul:

• tipuri de aminoacizi;
• ordinea aminoacizilor în secvență;
• stereochimiei;
• structurile capătului N;
• structurile de sfârșit C;
• modificarea lanțurilor laterale;
• distribuția punților disulfurice;
• ciclizare;
• alte caracteristici structurale necesare.

Secvența are o importanță fundamentală, deoarece o compoziție identică de aminoacizi poate duce la formarea unor molecule diferite, dacă aminoacizii sunt dispuși într-o ordine diferită.

Afirmația că o anumită moleculă este „un peptid format din cinci aminoacizi” oferă, așadar, foarte puține informații despre structura sa reală. Pentru a descrie corect o moleculă, este necesar să se cunoască tipul de aminoacizi, ordinea acestora, stereochimia, grupările terminale și eventualele modificări suplimentare.

Prin urmare, două peptide pot avea exact aceeași compoziție de aminoacizi, dar pot avea totuși structuri moleculare diferite.

Alte diferențe pot rezulta din modificarea capetelor lanțului, prezența punților disulfurice, a scheletului ciclic, a modificărilor la nivelul lanțurilor laterale sau a unei configurații stereochimice diferite.

Sinteza chimică a peptidelor utilizează, de obicei, aminoacizi ale căror grupări reactive au fost protejate în mod selectiv.

Grupurile protectoare temporare permit formarea unei legături chimice specifice dorite, limitând în același timp reacțiile concurente în alte zone ale moleculei.

În etapele următoare ale sintezei, aceste grupe sunt eliminate sau modificate.

O reacție controlată în locul unei reacții spontane

În descrierile chimice de bază, formarea legăturii peptidice este adesea prezentată ca o reacție de condensare, în care două aminoacizi se unesc cu eliberarea unei molecule de apă.

O astfel de ecuație descrie bilanțul general al reacției.

Totuși, nu trebuie să-l confundăm cu modul în care se realizează, în practică, sinteza controlată a peptidelor.

Simpla amestecare a aminoacizilor liberi nu ar permite determinarea cu certitudine a:

• care grupă amino trebuie să reacționeze;
• care grupă carboxilică trebuie să reacționeze;
• care aminoacid trebuie să fie primul;
• care urmează să ocupe locul al doilea;
• dacă vor începe să reacționeze lanțurile laterale;
• dacă stereochimia va fi păstrată;
• dacă nu vor apărea numeroase produse nedorite.

În sinteza chimică practică se utilizează, așadar, strategii controlate de activare și protejare a grupărilor funcționale.

Grupul derivat din grupul carboxil este de obicei activat astfel încât să poată reacționa eficient cu grupul aminic ales. Grupurile protectoare, ordinea reacțiilor, chimia suportului, reactanții de cuplare, mediul solventului și metodele de izolare contribuie împreună la orientarea reacției către produsul dorit.

Prin urmare, pentru o sinteză eficientă a peptidului este necesar să se controleze atât reacțiile chimice care trebuie să aibă loc, cât și cele care trebuie împiedicate.

Un bun exemplu este formarea aspartimidei.

Cercetătorii au elaborat o metodă alternativă de protejare a grupării carboxilice, cu scopul de a limita această reacție secundară problematică în timpul sintezei peptidului. [2]

Studiul evidențiază un principiu mai general al chimiei peptidelor: prevenirea transformărilor moleculare nedorite poate fi la fel de importantă ca și formarea unei legături peptidice corespunzătoare.

Când se poate considera că un peptid este gata?

Finalizarea formării scheletului liniar al peptidului nu înseamnă întotdeauna finalizarea întregii sinteze.

În funcție de molecula țintă, după asamblarea lanțului pot fi necesare etape suplimentare.

Acestea pot include:

• eliminarea completă a grupurilor de protecție;
• desprinderea peptidului de pe suportul solid;
• eliminarea marcajelor temporare;
• ciclizare;
• oxidarea;
• formarea punților disulfurice;
• plisare;
• conjugarea;
• modificarea capetelor lanțului;
• epurare;
• caracteristicile analitice.

Unele peptide necesită relativ puține modificări structurale suplimentare după asamblarea lanțului.

În cazul altora, etapele ulterioare sunt de o importanță crucială.

Un bun exemplu îl reprezintă sinteza inhibitorului de tripsină pancreatică de origine bovină (BPTI). Cercetătorii au asamblat o secvență liniară, au purificat materialul și au obținut apoi o structură ondulată care conține punți disulfidice. Conform analizelor și comparațiilor funcționale prezentate în studiu, materialul final cu secvență naturală a corespuns proteinei naturale în ceea ce privește parametrii analizați. [3]

Acest exemplu ilustrează diferența dintre asamblarea scheletului peptidic și obținerea formei moleculare finale complet caracterizate.

Metoda care permite obținerea unei secvențe liniare corecte nu confirmă automat:

• plierii corecte;
• distribuirea corespunzătoare a punților disulfurici;
• activității biologice;
• stabilitate;
• profilul poluanților;
• adecvarea pentru o anumită utilizare.

Fiecare dintre aceste aspecte necesită dovezi separate.

Sinteza chimică, expresia biologică și metode combinate

În sinteza chimică a peptidelor, blocurile moleculare preparate anterior sunt combinate în cadrul unor reacții controlate de laborator.

Expresia biologică, pe de altă parte, utilizează aparatul celular pentru a produce secvența de aminoacizi codificată. Ulterior, materialul trebuie recuperat, purificat și, dacă este necesar, supus unei prelucrări ulterioare.

Ambele metode pot duce la obținerea de peptide sau polipeptide, dar prezintă avantaje și limitări diferite.

Sinteza chimică poate fi deosebit de utilă atunci când sunt necesare:

• anumite aminoacizi neobișnuiți;
• modificări chimice în anumite locuri;
• anumite structuri ale capetelor lanțului;
• indicatori izotopici;
• modificări ale scheletului peptidic;
• alte caracteristici greu de obținut prin expresia biologică standard.

Expresia biologică poate fi o opțiune atractivă în cazul unor secvențe mai lungi adecvate sau al unor strategii specifice de marcare, dar nu elimină problemele care apar în etapele ulterioare ale producției.

În continuare, trebuie să se țină seama de recuperarea materialului, plierea, prelucrarea, contaminările provenite de la organismul gazdă, purificarea și caracteristicile analitice.

Prin urmare, niciuna dintre aceste metode nu este cea mai bună în toate situațiile.

În cazul polipeptidelor alcătuite din 20–40 de resturi de aminoacizi, atât lungimea secvenței, cât și tendința acesteia de agregare au influențat rezultatele sintezei în fază solidă și ale expresiei bacteriene. [1]

Aceste observații susțin abordarea conform căreia metoda de producție se alege în funcție de molecula respectivă.

Datele istorice privind randamentul, costurile, echipamentele și durata de producție nu trebuie considerate valori universale actuale, deoarece tehnologiile, reactivii, automatizarea, metodele de purificare și economia producției se modifică odată cu evoluția tehnologică.

Sinteza peptidelor în fază solidă

Lanțul în formare este atașat la un suport insolubil

În sinteza peptidelor în fază solidă (SPPS), lanțul peptidic în curs de formare rămâne atașat de un suport insolubil pe parcursul ciclurilor succesive de sinteză.

Suportul este, de cele mai multe ori, o rășină polimerică funcționalizată.

Conectorul, sau linkerul, leagă peptida de suport și influențează, printre altele, modul în care se va produce ulterior eliberarea lanțului final, precum și tipul grupării terminale obținute.

Unul dintre principalele avantaje practice ale SPPS este separarea mai ușoară a materialului.

După finalizarea unei anumite etape a reacției, reactanții solubili și numeroși produși secundari solubili pot fi îndepărtați prin spălare, în timp ce peptida în curs de formare rămâne legată de faza solidă.

Astfel, nu este necesar ca, după adăugarea fiecărui aminoacid, peptidul în curs de formare să fie izolat și purificat ca un compus liber separat.

Totuși, această comoditate poate duce la o neînțelegere importantă.

Spălarea rășinii nu înseamnă că toate peptidele defectuoase au fost eliminate.

Dacă lanțul atașat la rășină nu reacționează în timpul unei etape de cuplare, acesta poate rămâne în continuare pe suport.

În ciclurile următoare, acesta poate reacționa din nou și poate continua să se prelungească.

Ca urmare, poate apărea o secvență de deleție, adică o moleculă care diferă de peptida țintă prin lipsa uneia sau a mai multor resturi de aminoacizi.

În mod similar, lanțurile legate de rășină, modificate chimic sau care nu au fost complet dezactivate, pot participa la etapele următoare ale sintezei.

SPPS simplifică astfel separarea substanțelor solubile de materialul legat de rășină.

Totuși, aceasta nu garantează o concordanță perfectă a secvențelor.

Ciclul repetitiv de deblocare și cuplare

O sinteză SPPS tipică, realizată în etape, implică repetarea a trei operații de bază:

dezlipire → cuplare → spălare.

Mai întâi este expusă gruparea amino reactivă situată la capătul lanțului în creștere.

Apoi, la lanț se adaugă un alt aminoacid protejat.

Reactivii solubili, excesul de aminoacizi și numeroase produse de reacție sunt îndepărtate înainte de începerea ciclului următor.

Repetarea acestui proces permite sinteza peptidului, câte o restă de aminoacid pe rând.

În SPPS-ul clasic, restul de la capătul C este de obicei atașat la suport ca primul element, iar apoi lanțul se extinde spre capătul N.

Acest proces diferă de sinteza standard a proteinelor la nivel ribozomal, în cadrul căreia aminoacizii sunt adăugați succesiv la capătul C al lanțului în curs de formare.

Cu toate acestea, ordinea finală a aminoacizilor poate fi identică, chiar dacă direcția și procesul chimic de asamblare sunt diferite.

Termenul „ciclu” nu trebuie înțeles ca un set unic și universal de condiții de reacție valabil pentru fiecare rest și fiecare secvență.

Desfășurarea reacției poate depinde de:

• strategiile grupurilor de protecție;
• un tip de aminoacid;
• condițiile spațiale din jurul locului reacției;
• tipul de rășină;
• linker;
• lungimea lanțului;
• agregare;
• solvent;
• chimia cuplării;
• comportamentul structural al peptidului în creștere.

O reacție care decurge ușor la începutul sintezei poate deveni mult mai dificilă într-o etapă ulterioară.

De aceea, monitorizarea procesului rămâne esențială chiar și în cazul sistemelor extrem de automatizate.

De ce sunt importante proprietățile rășinii?

Un suport fix nu este doar un element de fixare pasiv.

Proprietățile sale fizice și chimice pot influența în mod direct desfășurarea reacției.

Unul dintre parametrii importanți este umflarea.

Dacă rășina se umflă corespunzător în mediul de dizolvant ales, reactanții pot ajunge mai ușor la zonele reactive situate în întreaga structură a polimerului.

Umflarea insuficientă sau modificările structurii rășinii pot limita acest acces.

Ar putea avea importanță și:

• densitatea de plantare;
• arhitectura polimerului;
• structura linkerului;
• compatibilitatea cu solvenții;
• stabilitatea mecanică;
• porozitate;
• proprietățile de difuzie;
• interacțiunile dintre lanțurile peptidice în curs de sinteză.

Pe măsură ce lungimea peptidului crește, lanțurile individuale pot interacționa între ele.

Agregarea pe rășină poate limita accesul la zonele reactive și poate duce la o cuplare incompletă sau la o dezactivare incompletă.

Aceasta înseamnă că o secvență care se comportă corect la începutul sintezei poate deveni din ce în ce mai dificilă pe măsură ce lanțul se prelungește.

Cercetătorii au dezvoltat un reactor cu flux continuu și pat variabil, care a permis monitorizarea umflării rășinii pe baza măsurătorilor legate de presiune. [4]

Studiul a abordat agregarea pe rășină și formarea incompletă a legăturilor ca probleme de proces care, în alte condiții, pot fi greu de observat direct în timpul sintezei.

Acest lucru arată că monitorizarea comportamentului fizic al suportului poate furniza informații care depășesc simpla înregistrare a reactivilor adăugați.

La ce servește rășina Wanga?

Chimia linkerilor de tip Wang este utilizată pe scară largă în SPPS atunci când, după detașarea peptidului, se dorește ca capătul C să aibă forma unui acid carboxilic.

Peptida este legată printr-o legătură de tip ester, care poate fi ulterior scindată în condiții adecvate.

Se pot alege alte sisteme de legături atunci când este necesară o structură diferită la capătul C, de exemplu o amida.

Este important să se facă distincția între compoziția chimică a linkerului și cea a întregului suport fizic.

Linkerii de tip Wang asociați pot fi introduși în diverse arhitecturi polimerice.

Aceste materiale nu trebuie să aibă următoarele caracteristici identice:

• proprietățile de umflare;
• capacități;
• compatibilitatea cu solvenții;
• proprietățile mecanice;
• comportamentul în timpul reacției.

Cercetările care au utilizat suporturile peptidil-Wang-TentaGel au evidențiat o metodă alternativă specializată de obținere a hidrazidelor peptidice, care sunt intermediari utili în chimia peptidelor. [5]

Aceasta nu înseamnă că separarea standard din rășina Wang duce, de obicei, la formarea de hidrazide peptidice.

În schimb, ilustrează un principiu important:

suportul + agentul de legare + condițiile de reacție + chimia de clivaj determină împreună produsul obținut.

Sinteza SPPS în sistem periodic și în sistem cu flux continuu

SPPS poate fi realizat în recipiente periodice clasice sau în sisteme în care reactanții trec prin reactorul care conține un suport solid.

Sistemele cu flux continuu pot permite înlocuirea rapidă a reactivilor și un control mai precis al mediului chimic din jurul rășinii.

Într-un studiu din 2014 a fost prezentată sinteza rapidă a peptidelor într-un sistem cu flux continuu, cu monitorizare continuă, aceasta fiind aplicată în cazul mai multor peptide și al unei proteine de dimensiuni reduse. [6]

Într-un studiu automatizat ulterior s-a descris o asamblare a lanțurilor semnificativ mai rapidă, obținându-se, pentru exemplele analizate, o puritate a produsului brut și un randament după izolare comparabile cu cele ale sintezei periodice clasice. [7]

Aceste studii evidențiază capacitățile unor sisteme concrete în anumite condiții.

Totuși, acestea nu demonstrează că fiecare peptidă poate fi produsă la fel de repede și cu aceeași calitate.

Timpul necesar pentru producerea unui peptid implică mult mai mult decât simpla asamblare a lanțului.

Întregul proces poate include:

• pregătirea reactivilor;
• prepararea rășinii;
• cuplare;
• dezarmare;
• spălarea;
• separare;
• prelucrarea produsului;
• epurare;
• eliminarea solvenților;
• modelarea finală a structurii;
• analize;
• documentația.

Crearea rapidă a legăturilor este, așadar, doar unul dintre elementele eficienței globale a producției.

Sinteza în fază lichidă

Ce înseamnă acest termen?

Termenul „sinteza peptidelor în fază lichidă” poate fi utilizat în mai multe sensuri.

În sens larg, poate însemna pur și simplu sinteza unui peptid realizată în soluție.

În literatura de specialitate, se face însă adesea distincția între:

1. sinteza clasică a peptidelor în soluție;
2. sinteza peptidelor în fază solidă;
3. metodele LPPS mai recente, în care lanțul în curs de sinteză conține un marker sau un suport solubil.

Această distincție este importantă, deoarece schimbă modul în care produsul este sortat și valorificat.

Un produs intermediar peptidic în stare liberă, stabilizat, poate necesita izolarea prin utilizarea propriilor sale proprietăți fizice și chimice.

În cazul unui produs intermediar marcat, marcatorul poate fi conceput astfel încât să faciliteze precipitarea, extracția, reținerea pe membrană sau orice altă metodă de separare.

Analiza privind LPPS face o distincție clară între sinteza clasică în soluție, SPPS și metodele care utilizează marcatori solubili. [8]

Publicația este utilă pentru clarificarea terminologiei și a metodologiei.

Totuși, aceasta nu ar trebui interpretată ca un experiment izolat care să demonstreze că una dintre metode este cea mai bună pentru fiecare peptid.

Sinteza clasică a peptidelor în soluție

În sinteza clasică în soluție, aminoacizii protejați, intermediarii peptidici sau fragmentele rămân dizolvați în mediul de reacție, în loc să fie legați covalent de o rășină insolubilă.

După finalizarea reacției, produsul intermediar respectiv poate fi izolat, purificat și, dacă este necesar, caracterizat înainte de începerea etapei următoare.

Este posibil ca acest lucru să aducă anumite beneficii.

Cercetătorii pot:

• să descrie fiecare semiprodus în parte;
• să aleagă metoda de purificare adaptată fiecărui produs intermediar;
• să optimizeze fiecare reacție în parte;
• să pregătească fragmentele în mod independent;
• a modifica traseul de sinteză atunci când un anumit produs intermediar prezintă probleme.

Sinteza în soluție poate însă prezenta și dificultăți considerabile.

Pe măsură ce lanțul se prelungește, peptidele pot:

• să devină slab solubile;
• a agrega;
• să fie dificil de cristalizat;
• să genereze poluanți foarte asemănători;
• să fie greu de separat;
• să necesite izolare repetată;
• să provoace pierderi de material în etapele ulterioare de prelucrare.

Prin urmare, sinteza în soluție nu este în mod automat mai simplă sau mai ușor de scalat decât SPPS.

Utilitatea acesteia depinde de secvența specifică, de stabilitatea intermediarilor, de solubilitate, de lungimea traseului de sinteză, de comportamentul în timpul purificării și de eficiența etapelor ulterioare de izolare.

Dezvoltarea strategiilor LPPS marcate se datorează, în parte, încercărilor de a rezolva tocmai aceste probleme legate de separarea și manipularea materialului. [8]

Marcatorii solubili combină proiectarea reacțiilor cu proiectarea separării

În LPPS marcat, peptidul în creștere prezintă o legătură moleculară temporară concepută astfel încât să îi influențeze proprietățile fizice.

Marcatorul poate permite menținerea unei solubilități suficiente a peptidului în timpul reacției și, ulterior, poate facilita recuperarea selectivă a acestuia.

În funcție de tehnologie, separarea poate utiliza:

• precipitare;
• extragerea;
• retenția pe membrană;
• comportamentul de fază;
• alte proprietăți care decurg din prezența marcatorului.

Într-una dintre strategiile experimentale s-a utilizat un grup protector cu lanț lung la capătul C pentru prepararea amidelor peptidice.

Reacțiile repetate și etapele de precipitare le-au permis cercetătorilor să sintetizeze un peptid hidrofob care, în comparația pe care au făcut-o, era dificil de obținut în mod satisfăcător prin metoda SPPS. [9]

Acest lucru demonstrează utilitatea acestei strategii specifice pentru secvența analizată.

Totuși, acest lucru nu dovedește superioritatea universală a sintezei marcate.

Eticheta devine parte integrantă a procesului de producție și ridică o serie de întrebări:

• Cât de eficient se realizează racordarea?
• Modifică cursul reacției?
• Cum se poate recupera în mod sigur un produs semi-finis marcat?
• Duce la apariția unor noi poluanți?
• Cum se elimină?
• Se poate confirma ștergerea definitivă?
• Ce metode analitice confirmă absența acestuia din produsul final?

Prin urmare, marcajele solubile trebuie considerate elemente funcționale ale proiectului procesului, și nu doar simple etichete.

Compararea principalelor metode

Comparația prezintă principiile generale de funcționare ale fiecărei metode.

Nu precizează care dintre acestea va oferi cea mai bună performanță, puritate, cost, sustenabilitate ecologică sau scalabilitate pentru o secvență anume.

Aceste parametri trebuie evaluați pe baza moleculei reale și a procesului de producție concret. [4] [8] [9]

Combinarea fragmentelor și producția hibridă

Peptida nu trebuie neapărat să fie formată printr-un singur proces continuu care constă în adăugarea succesivă a unor resturi de aminoacizi.

O strategie alternativă constă în prepararea separată a unor fragmente peptidice mai scurte și, ulterior, combinarea acestora.

Procesul hibrid poate, de exemplu, să utilizeze SPPS pentru obținerea unor fragmente individuale și chimia în soluție pentru combinarea acestora.

Strategiile fragmentare pot reduce unele dintre problemele asociate sintezei etapizate de lungă durată.

Cu toate acestea, ele aduc cu sine noi provocări, precum:

• alegerea locului adecvat pentru îmbinare;
• solubilitatea fragmentelor;
• activarea punctului de îmbinare;
• chemoselectivitate;
• păstrarea stereochimiei;
• efecte secundare;
• curățarea fragmentelor;
• curățarea după îmbinarea acestora.

Un exemplu important de îmbinare controlată a fragmentelor este ligarea chimică nativă.

În varianta clasică, tioesterul peptidic reacționează cu un al doilea peptid care conține cisteină la capătul N-terminal. Rearanjarea care urmează duce la formarea unei legături corecte în scheletul peptidic la locul ligării.

Studiile inițiale au demonstrat că, în urma ligării și plierii, se poate obține o proteină care conține punți disulfidice. [10]

Acest lucru confirmă importanța acestei strategii de îmbinare a fragmentelor.

Acest lucru nu înseamnă însă că orice două fragmente peptidice nemodificate s-ar putea uni spontan.

Cuplarea și grupurile de protecție

Cuplarea creează o legătură intenționată

Cuplarea este etapa reacției în care se formează o nouă legătură peptidică între unitățile selectate.

De obicei, grupa derivată din grupul carboxilic este activată astfel încât să poată reacționa eficient cu grupul aminic corespunzător.

Compoziția chimică de activare trebuie să fie conformă cu:

• o secvență crescătoare;
• grupuri de protecție temporare;
• protecția lanțurilor laterale;
• stereochimie;
• un suport sau un marcator;
• mediul de dizolvare;
• cu alte grupe funcționale prezente în moleculă.

Cuplarea eficientă este deosebit de importantă în sinteza etapizată, deoarece o reacție incompletă poate duce la apariția unor secvențe cu deleții.

Dacă o etapă a procesului de adăugare a unui aminoacid eșuează pentru o parte dintre lanțurile în creștere, aceste lanțuri pot rămâne în sistem și pot participa la ciclurile următoare.

Ca urmare, pot apărea molecule foarte asemănătoare cu peptidul țintă, dar cărora le lipsește o singură unitate.

Prin urmare, chiar și ineficiențele minore se pot acumula pe parcursul numeroaselor etape ale sintezei.

Un exemplu matematic simplu ilustrează bine această problemă.

Dacă fiecare dintre cele 50 de etape independente ale procesului de asamblare ar avea o probabilitate de succes de 99%, procentul de molecule pentru care toate etapele s-ar încheia cu succes ar fi:

0,99^50 ≈ 0,605

adică aproximativ 61%.

Aceasta este doar o ilustrare matematică.

Nu constituie o estimare a purității reale sau a randamentului sintezei unui peptid care conține 50 de resturi.

Producția efectivă cuprinde:

• randamente de cuplare diferite în fiecare poziție;
• etapele de dezarmare;
• efecte secundare;
• în funcție de nivelul de dificultate;
• strategii de reacopplare;
• pierderi în timpul separării;
• pierderile survenite în timpul procesului de epurare;
• alte variabile de proces.

Calculul arată doar de ce chiar și o ineficiență aparent minoră a unei singure etape poate căpăta o importanță semnificativă într-o sinteză în mai multe etape.

Grupurile de protecție controlează locul reacției

Un aminoacid poate avea mai multe grupări chimic reactive.

Fără un control selectiv, reacțiile de cuplare ar putea avea loc în locuri nedorite.

Grupurile de protecție blochează temporar anumite locuri reactive.

Grupul amino utilizat pentru prelungirea lanțului necesită, de obicei, o protecție temporară, în timp ce lanțurile laterale reactive pot necesita o protecție care să rămână în vigoare pe parcursul mai multor cicluri de sinteză.

Legătura cu suportul trebuie, de asemenea, să reziste acestor etape până în momentul separării planificate.

Alegerea grupărilor de protecție influențează, așadar, întreaga strategie de sinteză.

Trebuie să se țină seama de:

• modul de introducere a acestora;
• stabilitate;
• metoda de eliminare;
• compatibilitatea cu alte grupuri de protecție;
• compatibilitatea cu suportul;
• efecte secundare;
• efectul unei secvențe anume;
• condițiile finale de deblocare.

Cercetările care au utilizat protecția bazată pe cianosulfurilidă s-au axat pe formarea aspartimidului prin modificarea modului de protecție a grupării carboxilice. [2]

Rezultatele arată că strategia grupurilor de protecție influențează nu numai posibilitatea ca reacția dorită să aibă loc, ci și tipul de reacții nedorite care devin posibile.

Fmoc, Boc și protecția ortogonală

Fmoc și Boc fac parte dintre grupările de protecție a grupărilor aminice utilizate pe scară largă.

Se deosebesc în mod semnificativ prin modul de eliminare.

Fmoc este de obicei eliminat în mediu alcalin, în timp ce Boc este sensibil la mediul acid.

Aceste caracteristici permit utilizarea lor ca elemente ale unor strategii mai ample de protecție.

În procesul SPPS popular bazat pe Fmoc, grupul protector temporar Fmoc de la capătul N este îndepărtat de mai multe ori, în timp ce grupurile protectoare selectate ale lanțurilor laterale și legătura cu rășina rămân intacte până în etapele ulterioare.

Alte strategii pot folosi combinații diferite.

Un concept deosebit de important este protecția ortogonală.

Două grupe protectoare sunt considerate ortogonale dacă una dintre ele poate fi eliminată selectiv în condiții în care cealaltă rămâne suficient de stabilă pentru a permite continuarea sintezei.

Ortogonalitatea este, așadar, o relație practică de compatibilitate chimică.

Aceasta nu înseamnă că fiecare grup protejat va rămâne complet neschimbat după un număr nelimitat de expuneri la toate condițiile de reacție.

Pot apărea în continuare reacții adverse.

În studiile privind sinteza Fmoc s-au descris atât formarea aspartimidului, cât și modificări stereochimice nedorite, în ciuda selectivității presupuse a strategiei generale de protecție. [11]

Stereochimia face parte din identitatea moleculei

Multe aminoacizi au un centru chiral.

Aceasta înseamnă că atomii lor pot adopta diverse configurații spațiale corespunzătoare diferitelor forme stereochimice.

Modificarea configurației unui singur centru stereogenic poate duce la formarea unei alte structuri a peptidului, fără a fi necesară modificarea masei sale nominale.

Prin urmare, masa în sine nu poate confirma identitatea completă a peptidului.

Epimerizarea înseamnă, de obicei, modificarea configurației unui singur centru stereogenic într-o moleculă care conține mai multe astfel de centre.

Racemizarea este, de asemenea, adesea abordată în chimia peptidelor în contextul pierderii integrității stereochimice a resturilor de aminoacizi.

Aceste modificări sunt importante, deoarece recunoașterea moleculară poate depinde în mare măsură de dispunerea spațială a atomilor.

Două molecule cu aceeași compoziție elementară și aceeași masă nominală pot, așadar, să se comporte diferit dacă au o stereochimie diferită.

În cadrul studiului privind sinteza Fmoc asistată de microunde, s-a constatat că anumite grupări erau susceptibile la modificări stereochimice nedorite în condițiile utilizate. Modificarea metodei a limitat apariția acestor reacții. [11]

Aceasta nu înseamnă că încălzirea, prin definiție, dăunează tuturor peptidelor.

Concluzia corectă este că accelerarea reacției trebuie evaluată împreună cu selectivitatea chimică determinată de secvență.

Aspartimida și alte impurități înrudite

Formarea aspartimidei este o reacție secundară cunoscută care implică anumite secvențe ce conțin asparaginat.

Se poate forma un produs intermediar ciclic nedorit, din care se formează ulterior compuși cu o structură sau o stereochimie modificată.

Probabilitatea acestei reacții depinde de secvență și de condițiile procesului.

Alte contaminări legate de sinteză pot proveni din:

• cu cuplaj incomplet;
• dezarmării incomplete;
• formarea secvențelor de deleție;
• reacțiile lanțurilor laterale;
• modificări stereochimice;
• reacțiile care au loc în timpul separării;
• oxidare;
• reorganizări;
• condițiile de prelucrare a produsului;
• eliminarea incompletă a grupurilor de protecție.

Anumite impurități determină o modificare ușor de observat a masei moleculare.

Alte cazuri sunt mult mai greu de distins.

În cadrul analizelor efectuate asupra unui peptid sintetic care servește drept substrat pentru renină, au fost identificate numeroase impurități, printre care și componente care prezintă aceeași variație de masă, dar care conțin modificări în poziții diferite. [12]

Pentru a le distinge, a fost necesară o analiză structurală suplimentară.

Cercetătorii au considerat, de asemenea, mecanismele propuse pentru formarea acestor poluanți ca fiind simple ipoteze.

Aceasta este o distincție importantă:

A stabili ce este poluarea și a demonstra mecanismul exact al apariției acesteia sunt două întrebări științifice distincte.

Nu trebuie să se prezinte un mecanism probabil ca fiind confirmat doar pentru că corespunde masei moleculare observate.

Curățarea, detartrarea și calitatea producției

Produsul brut, produsul purificat și randamentul

Peptidul brut este un material obținut înainte de finalizarea etapelor corespunzătoare de purificare.

Poate conține:

• peptida țintă;
• secvențe de deleție;
• materialul nu este complet deblocat;
• secvențe modificate;
• reziduuri de reactivi;
• produse legate de separare;
• săruri;
• solvenți;
• alte componente rezultate în urma procesului.

Purificarea are ca scop separarea peptidului dorit din acest amestec.

Trebuie să se facă o distincție clară între trei noțiuni:

puritatea materiei prime — compoziția măsurată a materialului înainte de purificarea finală;

randamentul produsului purificat sau izolat — cantitatea de material țintă recuperată raportată la o valoare inițială sau teoretică specificată;

puritatea finală — compoziția materialului izolat, determinată printr-o metodă analitică specifică.

Aceste noțiuni nu sunt interschimbabile.

Procesul poate genera o cantitate mare de materie primă, dar permite obținerea unei cantități relativ mici de produs purificat.

Un alt proces poate produce o cantitate mai mică de materie primă, dar se caracterizează printr-o selectivitate ridicată în obținerea produsului țintă.

În mod similar, o puritate analitică ridicată nu înseamnă neapărat și un randament ridicat de producție.

În studiile privind sinteza accelerată în flux continuu, puritatea materiei prime și randamentul după izolare au fost raportate corect separat. [7]

Cromatografia separă componentele, dar nu oferă răspuns la toate întrebările

Cromatografia lichidă de înaltă performanță cu faze inversate (RP-HPLC) este utilizată pe scară largă pentru analiza și purificarea peptidelor.

Diferitele molecule interacționează în moduri diferite cu faza staționară și cu cea mobilă.

În condiții adecvate, aceste diferențe permit separarea componentelor amestecului.

Cromatografia analitică și cea preparativă au aplicații conexe, dar diferite.

Aparatul analitic HPLC este utilizat în principal pentru analiza compoziției probei.

Unitatea de preparare HPLC este utilizată pentru colectarea fizică a componentelor separate.

Cromatograma poate oferi numeroase informații valoroase.

Cu toate acestea, un vârf principal mare sau un procent ridicat al suprafeței sale nu trebuie considerat ca o caracteristică moleculară completă.

Rezultatele cromatografiei depind, printre altele, de:

• tipul coloanei;
• faza mobilă;
• gradientului;
• temperaturile;
• metode de detectare;
• lungimea de undă;
• pregătirea probei;
• modul de integrare a vârfurilor;
• rezoluție;
• proprietățile poluanților.

Este posibil ca două compuși să se elueze în același timp.

Anumite componente ale probei pot reacționa, de asemenea, în mod diferit la detectorul utilizat.

Prin urmare, gradul ridicat de puritate superficială al HPLC nu echivalează cu o confirmare completă a identității moleculare.

Studiile privind impuritățile peptidice izobarice și analizele chirale arată de ce ar putea fi necesare metode analitice complementare. [12] [13]

Metoda analitică trebuie să răspundă la o întrebare structurală concretă.

Identitatea, puritatea și conținutul au semnificații diferite

În caracterizarea peptidelor, trei noțiuni sunt deosebit de importante.

Identitatea răspunde la întrebarea:

Molecula dorită se află în probă?

„Puritatea” răspunde la întrebarea:

Ce alte componente se regăsesc în probă sau ce proporție din semnalul măsurat corespunde componentei principale?

Conținutul răspunde la întrebarea:

Cât peptid real se află în probă?

La aceste întrebări nu se poate răspunde întotdeauna pe baza unei singure măsurători.

Materialul care conține peptida poate conține, de asemenea:

• apă;
• opuse;
• săruri;
• reziduuri de solvenți;
• alte componente legate de proces;
• poluanți.

Prin urmare, masa totală a materialului cântărit nu trebuie neapărat să corespundă cu masa peptidului în sine.

În mod similar, concordanța dintre masa moleculară măsurată și valoarea teoretică nu confirmă:

• secvența completă de aminoacizi;
• legăturile corecte dintre diferitele resturi;
• integritatea stereochimică;
• distribuția punților disulfurice;
• pliuri;
• absența poluării izobarice.

Spectrometria de masă poate furniza dovezi solide privind masa moleculară.

Spectrometria de masă în tandem și alte tehnici structurale pot oferi informații suplimentare despre secvență.

Metodele chirale permit analizarea aspectelor stereochimice care nu pot fi determinate prin simpla măsurare a masei.

Într-unul dintre studiile analitice s-a luat în considerare chiar și racemizarea care are loc în timpul pregătirii probei. Acest lucru ilustrează un alt principiu important: procedura analitică în sine poate genera artefacte dacă nu este concepută corespunzător. [13]

Plierea și activitatea pot necesita o confirmare separată

În cazul peptidelor cu structură limitată și al proteinelor mici, secvența corectă și masa moleculară pot fi totuși insuficiente pentru a confirma structura finală dorită.

Întrebările suplimentare pot include:

• S-au format punți disulfurice corespunzătoare?
• A adoptat molecula conformația așteptată?
• Ciclizarea este completă?
• Există izomeri structurali?
• Molecula sintetică prezintă activitatea așteptată în cadrul unui anumit test experimental?

În studiul privind sinteza BPTI s-au utilizat mai multe metode analitice și birofizice, împreună cu evaluarea inhibării tripsinei. [3]

Rezultatele globale au confirmat compatibilitatea materialului sintetic cu secvență naturală cu proteina naturală în ceea ce privește criteriile analizate.

Testul de activitate oferă însă un răspuns la o anumită întrebare funcțională.

Nu înlocuiește analiza poluanților.

În mod similar, o activitate comparabilă în cadrul unui singur test nu confirmă echivalența completă a tuturor proprietăților biologice, structurale sau de producție.

Scalarea producției nu afectează doar cantitatea de material

Creșterea volumului de producție nu constă doar în creșterea proporțională a cantității tuturor reactivilor.

Procesele fizice pot avea un comportament diferit la o scară mai mare.

Ar putea fi relevante:

• amestecarea;
• schimbul de căldură;
• distribuirea reactivilor;
• difuzie;
• umflarea rășinii;
• presiune;
• filtrare;
• gestionarea solvenților;
• precipitare;
• solubilitatea produselor intermediare;
• transportul masei;
• capacitățile sistemului de epurare.

Acești factori pot influența atât desfășurarea reacției, cât și formarea contaminanților.

Purgarea în etapele ulterioare poate deveni, de asemenea, un punct de blocaj al întregului proces de producție.

Creșterea vitezei de sinteză are o importanță limitată dacă sistemul de epurare nu este capabil să separe în mod eficient impuritățile rezultate sau să recupereze produsul la calitatea necesară.

Într-o analiză industrială care a cuprins 40 de procese de sinteză a peptidelor din 14 companii farmaceutice, s-a evaluat consumul de materii prime în timpul sintezei, purificării și izolării. [14]

Studiul arată de ce evaluarea producției trebuie efectuată pe întreaga durată a procesului.

Totuși, acest lucru nu înseamnă că fiecare fabrică, secvență sau tehnologie de producție obține rezultate identice.

Calitatea producției este rezultatul mai multor elemente de control

Producția fiabilă de peptide necesită mai mult decât obținerea unui singur rezultat analitic satisfăcător.

Un proces controlat cuprinde, de obicei, câteva elemente interconectate:

molecula țintă definită → materii prime adecvate → sinteză controlată → purificare controlată → prelevare corespunzătoare a probelor → analiză validată sau adecvată scopului → documentația lotului.

Documentația lotului corelează rezultatele analitice cu materialul care a fost efectiv produs.

Certificatul de analiză (COA) prezintă un rezumat al unor rezultate selectate ale analizelor efectuate asupra unui lot specific.

Valoarea sa informativă depinde de:

• tipul cercetărilor efectuate;
• metodele utilizate;
• utilitatea acestor metode;
• specificații;
• identificarea probei;
• posibilitatea de a urmări loturile;
• confirmarea faptului că rezultatele raportate se referă într-adevăr la materialul respectiv.

O singură valoare denumită „puritate” nu poate dovedi, în sine:

• identitate moleculară completă;
• conținutul de peptidă;
• integritatea stereochimică;
• nivelul reziduurilor de solvenți;
• conținutul de apă;
• compoziția contraionilor;
• proprietățile microbiologice;
• pliuri;
• activității biologice;
• adecvarea pentru un anumit scop.

Setul adecvat de analize depinde de utilizarea prevăzută a materialului.

Un peptid utilizat ca material de referință analitic, ca reactiv de testare în cadrul unui experiment celular sau ca material aflat în stadiul de dezvoltare farmaceutică poate necesita răspunsuri la alte întrebări legate de calitate.

Prin urmare, dovezile analitice trebuie interpretate într-un context clar definit, și nu ca o confirmare universală a calității.

Evaluarea sustenabilității de mediu trebuie să acopere întregul proces

Sinteza peptidelor poate necesita cantități considerabile de solvenți și reactivi.

Evaluarea impactului asupra mediului ar trebui, așadar, să ia în considerare mult mai mult decât doar etapa de cuplare.

Printre elementele importante se pot număra:

• prepararea blocurilor de construcție;
• reactivi de cuplare;
• reactivi pentru dezactivarea dispozitivelor de siguranță;
• spălarea;
• separare;
• prelucrarea produsului;
• cromatografie;
• schimbarea solvenților;
• izolație;
• uscare;
• gestionarea deșeurilor.

Reducerea impactului asupra mediului poate necesita îmbunătățirea simultană a mai multor etape.

În analiza publicată privind producția de peptide s-au discutat problemele legate atât de sinteză, cât și de purificare și s-a subliniat necesitatea îmbunătățirii întregului proiect al procesului. [15]

Fiind o publicație prospectivă, aceasta nu constituie o comparație directă și controlată care să demonstreze că o anumită tehnologie este întotdeauna mai ecologică.

În mod similar:

o sinteză mai rapidă nu înseamnă automat o sinteză mai ecologică,

iar un consum mai redus de solvenți în timpul sintezei în sine nu înseamnă automat un impact mai redus al întregului proces de producție.

Comparațiile de mediu necesită utilizarea unor limite de analiză coerente și, în mod ideal, ar trebui să raporteze consumul de resurse la o cantitate specifică de produs final izolat și caracterizat.

Întrebări frecvente

1. În ce constă diferența dintre sinteza peptidelor în fază solidă și cea în fază lichidă?

În sinteza în fază solidă, peptidul în curs de sinteză rămâne atașat de un suport insolubil, în timp ce în sinteza clasică în soluție, produsul intermediar peptidic rămâne dizolvat și, de obicei, trebuie recuperat pe baza proprietăților sale fizice și chimice. În sensul mai restrâns al LPPS, lanțul în curs de sinteză dizolvat conține, în plus, un marcator sau un suport solubil care facilitează separarea ulterioară. Cercetările privind sinteza marcată prezintă una dintre strategiile de combinare a chimiei în soluție cu recuperarea prin precipitare, în timp ce literatura de specialitate referitoare la LPPS distinge astfel de soluții atât de sinteza clasică în soluție, cât și de SPPS. Nicio metodă nu este, prin definiție, optimă pentru fiecare peptid. Diferența fundamentală ține de modul fizic de conducere și separare a lanțului în creștere în timpul etapelor succesive ale sintezei. [8] [9]

2. De ce pot apărea impurități în timpul sintezei peptidelor?

Contaminările pot apărea deoarece reacțiile dorite nu au loc întotdeauna în mod cantitativ, iar alte grupări funcționale pot participa la reacții nedorite. Cuplarea incompletă poate duce la secvențe de deleție, dezactivarea incompletă poate perturba asamblarea ulterioară a lanțului, iar anumite secvențe sunt susceptibile la modificări stereochimice, formarea de aspartimid, oxidare, regrupări sau produse secundare asociate cu clivajul. Studiile privind sinteza Fmoc și analiza structurală a impurităților peptidice sintetice documentează câteva astfel de exemple. [11] [12] Frecvența și importanța fiecărei impurități depind de secvență și de proces; prin urmare, automatizarea sintezei nu trebuie echivalată cu absența totală a erorilor chimice.

3. Ce rol joacă rășina în sinteza peptidelor?

Rășina reține peptidul în curs de sinteză, în timp ce reactanții solubili și numeroși produși secundari pot fi îndepărtați între etapele succesive ale sintezei. Acest lucru simplifică considerabil asamblarea repetată a lanțului, dar rășina nu este doar un suport mecanic. Umflarea acesteia, gradul de încărcare, arhitectura polimerului, compatibilitatea cu solvenții și disponibilitatea siturilor de reacție pot influența eficiența cu care reactanții ajung la peptida fixată. În studiile care au utilizat un reactor cu pat variabil, s-a monitorizat comportamentul rășinii în timpul analizei agregării și a eficienței cuplării. [4] O astfel de monitorizare nu elimină erorile de secvență, dar arată de ce starea fizică a rășinii poate fi o variabilă importantă a procesului.

4. La ce servește rășina Wanga în sinteza peptidelor?

Suporturile de tip Wang sunt asociate în mod obișnuit cu prepararea peptidelor care se eliberează după clivarea corespunzătoare la capătul C sub formă de acid carboxilic. Produsul final exact depinde însă de linker, de arhitectura suportului și de chimia de clivaj utilizată, și nu doar de denumirea rășinii. Cercetătorii au prezentat, de asemenea, o metodă specializată de transformare a materialului peptidil-Wang-TentaGel în hidrazide peptidice, care pot servi drept intermediari sintetici utili. [5] Reacția alternativă nu schimbă importanța decepării standard din rășina Wang. Ea arată însă de ce, atunci când se prevede produsul, trebuie analizat întregul sistem al suportului și condițiile de reacție.

5. SPPS sintetizează peptida pornind de la capătul N sau de la capătul C?

SPPS-ul clasic în etape începe, de obicei, prin atașarea restului de la capătul C la suport, după care lanțul este prelungit în direcția capătului N. Aceasta este direcția opusă alungirii standard a lanțului la ribozom, unde proteina crește prin adăugarea de aminoacizi succesivi la capătul C. Sinteza BPTI este un exemplu de utilizare a blocurilor de construcție și a suportului protejați înainte de eliberarea ulterioară, purificarea și plierea produsului. [3] Există însă strategii specializate de chimie a peptidelor care utilizează alte soluții; de aceea, sinteza de la capătul C- la capătul N- trebuie considerată ca fiind abordarea clasică a SPPS, și nu o regulă absolută valabilă pentru toate metodele de sinteză.

6. De ce sunt necesare grupurile de protecție?

Aminoacizii conțin adesea mai multe grupe funcționale reactive. Grupele protectoare împiedică temporar reacția anumitor segmente, lăsând locul respectiv disponibil într-o etapă specifică a sintezei. Acest lucru ajută la controlarea ordinii și a modului de legare a resturilor. Fără o protecție adecvată, reacțiile concurente ar putea duce la formarea unor amestecuri complexe sau a unor produse cu structură modificată. Studiile privind formarea aspartimidei au arătat că modificarea chimiei de protecție a grupării carboxilice poate limita o reacție secundară importantă în secvențele analizate. [2] Grupurile protectoare nu garantează un decurs ideal al sintezei, dar asigură un control chimic selectiv, care trebuie să rămână compatibil cu toate etapele relevante ale procesului.

7. Care sunt diferențele dintre Fmoc și Boc?

Fmoc și Boc sunt grupe protectoare temporare ale grupului amino utilizate pe scară largă, dar reacționează la condiții chimice diferite. Fmoc este de obicei eliminat în mediu alcalin, în timp ce Boc este sensibil la acizi. Această diferență influențează modul în care acestea se leagă de protecția lanțurilor laterale, de linkeri și de celelalte etape ale sintezei. Sinteza bazată pe Fmoc este utilizată pe scară largă în SPPS-ul modern, dar studiile au arătat, de asemenea, posibilitatea apariției unor reacții secundare dependente de secvență în astfel de condiții. [11] În practică, este deci mai util să se compare strategiile de protecție în ansamblu și compatibilitatea acestora cu o anumită secvență decât să se ia în considerare doar denumirile celor două grupe de protecție.

8. Ce înseamnă protecția ortogonală?

Protecția ortogonală înseamnă că o grupă protectoare poate fi îndepărtată în condiții în care o altă grupă protectoare necesară rămâne suficient de stabilă pentru a permite continuarea sintezei. Acest lucru permite expunerea diferitelor situsuri reactive în anumite etape. Acest concept are o importanță fundamentală în sinteza controlată a peptidelor complexe. Ortogonalitatea este însă condiționată de condițiile de reacție și nu este absolută: expunerea repetată, natura secvenței și parametrii reacției pot duce în continuare la reacții secundare. Cercetările privind metodele alternative de protejare a grupărilor carboxil arată cum poate fi modificată strategia de protejare pentru a controla chimia peptidică dificilă. [2]

9. Ce este o secvență de deleție?

O secvență de deleție este un peptid din care lipsesc una sau mai multe unități prezente în secvența țintă dorită. Aceasta poate apărea atunci când etapa de cuplare a aminoacidului nu se desfășoară complet, dar lanțul nereacționat rămâne atașat de suport și participă la ciclurile următoare. Deoarece lanțul defect rămâne în continuare legat de rășină, o simplă spălare nu îl poate elimina. Studiile de monitorizare SPPS în timp real indică formarea incompletă a legăturilor amide ca fiind o problemă importantă a procesului. [4] Secvența de deleție reprezintă, așadar, o problemă legată de structura și identitatea produsului, și nu doar un reziduu al reactivului.

10. Este posibil ca două impurități peptidice să aibă aceeași masă moleculară?

Da. Diferite structuri moleculare pot avea o masă nominală identică sau nediferențiabilă. Din acest motiv, simpla concordanță a masei nu confirmă identitatea completă a moleculei. În studiile privind un peptid sintetic care servește drept substrat al reninei, au fost identificate componente izobarice ale impurităților, în care modificările apăreau în poziții diferite. Derivatizarea și spectrometria de masă în tandem au furnizat informații structurale suplimentare. [12] Acest exemplu ilustrează motivul pentru care concordanța dintre masa observată și cea așteptată nu poate confirma, de una singură, secvența corectă, legăturile, stereochimia sau absența izomerilor structural similari.

11. Ce sunt epimerizarea și racemizarea în sinteza peptidelor?

Epimerizarea și racemizarea se referă la modificări nedorite ale configurației stereochimice. Acestea pot avea loc fără a modifica secvența nominală a aminoacizilor sau masa moleculară, motiv pentru care o simplă măsurare a masei poate să nu evidențieze diferențele structurale. În studiile privind sinteza Fmoc asistată de microunde, au fost identificate resturi susceptibile la modificări stereochimice și s-a demonstrat că modificarea condițiilor de reacție poate limita astfel de procese. [11] Riscul depinde de blocul constitutiv, de secvență și de condițiile procesului. Calitatea stereochimică necesită, așadar, metode analitice capabile să evalueze configurația și nu poate fi dedusă exclusiv pe baza masei moleculare.

12. Ce este formarea aspartimidei?

Formarea aspartimidului este o reacție nedorită asociată cu anumite secvențe care conțin asparaginat. Formarea unui intermediar ciclic poate duce la apariția unor produse ulterioare cu legături ale scheletului sau stereochimie modificate, reducând randamentul și îngreunând purificarea. Cercetătorii au analizat strategii alternative de protecție concepute pentru a limita această reacție în anumite peptide și proteine. [2] Rezultatele nu indică o soluție universală pentru toate secvențele care conțin asparaginat. Ele arată însă de ce proiectarea sintezei și a strategiilor de control al impurităților trebuie să țină seama de comportamentul chimic specific al unei anumite secvențe.

13. Puritatea ridicată a HPLC confirmă identitatea corectă a peptidului?

Nu. Puritatea HPLC descrie proba în cadrul unei anumite separări cromatografice, al detectorului utilizat și al metodei de analiză a datelor. Suprafața mare a picului principal poate constitui o dovadă valoroasă că proba este dominată de un singur component separat cromatografic, dar nu confirmă, în sine, identitatea moleculară completă. Impuritățile co-eluvante, stereoizomerii și alte variante pot necesita tehnici suplimentare. În studiile de analiză chirală a peptidelor s-a utilizat un proces special conceput, care a luat în considerare și modificările stereochimice apărute în timpul pregătirii probei. [13] Identitatea și puritatea trebuie, așadar, considerate ca fiind chestiuni analitice corelate, dar distincte.

14. Eficiența produsului epurat înseamnă același lucru cu puritatea?

Nu. Randamentul produsului purificat sau izolat se referă la cantitatea de material țintă recuperată în raport cu o cantitate inițială sau teoretică definită. Puritatea, pe de altă parte, descrie compoziția materialului recuperat conform unei metode analitice specifice. Sinteza poate duce la obținerea unei cantități relativ mici de produs cu o puritate foarte ridicată sau a unei cantități mari de materie primă care conține o cantitate semnificativă de impurități. În studiile privind sinteza automată în flux continuu, puritatea produsului brut și randamentul după izolare au fost raportate separat. [7] Separarea acestor parametri împiedică interpretarea eronată a valorii ridicate a unuia dintre ei ca dovadă a valorii ridicate a celuilalt.

15. Se pot produce peptide lungi prin combinarea unor fragmente mai scurte?

Da. În strategia fragmentară, segmentele peptidice mai scurte pot fi preparate separat și apoi unite prin intermediul unor reacții chimice adecvate. Ligarea chimică naturală a reprezentat un exemplu important în care fragmente peptidice neprotejate au fost unite într-un mod care a condus la formarea unei legături naturale a scheletului peptidic, obținându-se astfel o proteină pliată. [10] Acest lucru nu înseamnă însă că orice fragmente peptidice se pot uni spontan. Trebuie luate în considerare structura fragmentelor, chimia legării, alegerea locului de legătură, solubilitatea, stereochimia și cerințele privind purificarea. Asamblarea fragmentelor este, așadar, o strategie alternativă de proiectare a sintezei, și nu o soluție automată la problemele legate de peptidele lungi.

16. Sinteza automatizată mai rapidă elimină necesitatea purificării?

Nu. Sinteza automatizată sau în flux continuu, mai rapidă, reduce durata anumitor etape ale sintezei, dar nu demonstrează că fiecare moleculă rezultată are structura dorită. În studiile privind sinteza rapidă în flux continuu, materia-primă a fost în continuare caracterizată și s-a recurs la purificare ulterioară, iar în lucrările ulterioare privind automatizarea s-au comparat separat puritatea materiei-primă și randamentul după izolare. [6] [7] Rezultatele bune ale sistemului pentru secvențele studiate nu garantează, de asemenea, rezultate identice pentru fiecare țintă nouă. Sinteza accelerată trebuie să fie în continuare combinată cu o purificare adecvată, confirmarea identității, analiza impurităților și caracterizarea finală.

17. De ce extinderea producției este mai complicată decât pregătirea unui lot mai mare?

Creșterea scării de producție modifică condițiile fizice și chimice, nu doar cantitatea de material. Amestecarea, schimbul de căldură, umflarea rășinii, distribuția reactivilor, presiunea, filtrarea, manipularea solvenților, solubilitatea produselor intermediare și capacitățile sistemului de epurare pot prezenta un comportament diferit la un volum de producție mai mare. Într-o analiză industrială a 40 de procese de sinteză a peptidelor, s-au evaluat separat sinteza, purificarea și izolarea în cadrul analizei consumului de materiale. [14] Rezultatele arată de ce producția trebuie privită ca un proces complet. O metodă scalabilă trebuie să conducă în mod repetabil la obținerea unui material caracterizat în toate etapele, și nu doar la o cantitate mai mare de peptidă brută.

18. Peptida este gata imediat după asamblarea secvenței corecte?

Nu neapărat. Asamblarea lanțului constituie scheletul secvenței doar în măsura în care acest lucru este confirmat de proces și de datele analitice. În funcție de moleculă, pot fi încă necesare dezactivarea grupărilor protectoare, clivajul, ciclizarea, oxidarea, formarea punților disulfurice, plierea, conjugarea, purificarea și caracterizarea. Sinteza BPTI constituie un bun exemplu de proces în care, după asamblarea secvenței liniare, au urmat purificarea și formarea unei structuri pliate care conține punți disulfurice. [3] Termenul „peptidă finală” ar trebui, așadar, să se refere la forma moleculară necesară în contextul științific respectiv, și nu doar la finalizarea adăugării etapizate a aminoacizilor.

19. Masa moleculară corectă confirmă secvența corectă a peptidului?

Nu. Coincidența masei moleculare este o dovadă valoroasă, dar nu poate confirma, prin ea însăși, secvența completă sau structura moleculară. Structurile izobarice pot avea aceeași masă, iar diferențele stereochimice pot să nu determine deloc o modificare a masei moleculare. Studiile privind impuritățile din peptidele sintetice au arătat că diferențierea componentelor cu structuri diferite poate necesita spectrometrie de masă în tandem și analize suplimentare. [12] În cazul întrebărilor privind integritatea stereochimică, pot fi necesare și metode chirale. [13] Masa moleculară trebuie, așadar, considerată ca unul dintre elementele evaluării identității, și nu ca o confirmare completă a acesteia.

20. De ce purificarea trebuie considerată parte integrantă a procesului de producție a peptidului și nu doar o etapă finală?

Purificarea determină dacă peptida țintă poate fi separată în mod eficient de secvențele de deleție, produsele secundare, reziduurile de reactivi, impuritățile cu structură similară și alte componente rezultate în timpul sintezei. O metodă care permite producerea foarte rapidă a unor cantități mari de material brut poate fi totuși nepractică dacă nu se poate recupera în mod eficient produsul țintă la calitatea cerută. Din acest motiv, analizele industriale ale proceselor peptidice iau în considerare împreună sinteza, purificarea și izolarea. [14] Eficiența producției trebuie evaluată în cele din urmă pe baza cantității și a proprietăților materialului final izolat, și nu exclusiv pe baza vitezei de sinteză.

Limitări în compararea metodelor de sinteză a peptidelor

Atunci când se interpretează studiile care compară tehnologiile de producție a peptidelor, trebuie să se țină seama de câteva limitări importante.

În primul rând, secvența influențează puternic gradul de dificultate al sintezei. O metodă care dă rezultate pentru un peptid nu trebuie neapărat să funcționeze la fel și pentru altul. Agregarea, hidrofobicitatea, compoziția aminoacidică, lungimea, tendința de a forma structuri secundare și susceptibilitatea la reacții secundare pot modifica comportamentul procesului. [1] [4]

În al doilea rând, puritatea materiei prime, randamentul după izolare, puritatea finală și conținutul de peptidă sunt parametri diferiți. Compararea metodelor exclusiv pe baza unuia dintre aceștia poate oferi o imagine incompletă a eficienței producției. [7]

În al treilea rând, asamblarea rapidă a lanțului nu înseamnă o producție rapidă a întregului material. Separarea, purificarea, izolarea, modelarea finală a structurii, analizele și documentația influențează, de asemenea, durata totală a producției. [6] [7]

În al patrulea rând, puritatea analitică depinde de metoda utilizată. HPLC, spectrometria de masă, spectrometria de masă în tandem și analiza chirală oferă răspunsuri la întrebări diferite. Un singur rezultat analitic nu confirmă neapărat identitatea structurală completă. [12] [13]

În al cincilea rând, scara influențează comportamentul procesului. Rezultatele sintezei de laborator nu pot fi transpus automat la producția industrială fără o evaluare a procesului de amestecare, a transportului masei, a capacității de epurare, a consumului de materiale și a altor factori care depind de scară. [14]

În al șaselea rând, comparațiile economice istorice își pot pierde, în timp, relevanța. Costurile reactivilor, nivelul de automatizare, tehnologiile de sinteză, echipamentele de epurare, recuperarea solvenților și infrastructura de producție sunt în continuă evoluție. Analizele de costuri mai vechi pot avea în continuare o importanță științifică, dar nu reflectă neapărat realitățile economice actuale ale pieței. [1]

În al șaptelea rând, comparațiile de mediu necesită limite coerente ale analizei. Evaluarea consumului de solvenți doar în etapa de asamblare a lanțului, fără a lua în considerare procesele de purificare și izolare, poate conduce la concluzii eronate privind sustenabilitatea procesului. [14] [15]

În cele din urmă, denumirea metodei în sine nu determină calitatea produsului. SPPS, sinteza în soluție, LPPS, ligarea fragmentelor și expresia biologică pot conduce la obținerea unui material de înaltă calitate, dacă procesul a fost proiectat și controlat corespunzător. Cu toate acestea, niciuna dintre aceste metode nu garantează automat identitatea corectă, puritatea, stereochimia, plierea sau adecvarea pentru o anumită aplicație.

Rezumat

Sinteza peptidelor poate fi înțeleasă cel mai bine ca un proces controlat de producere a moleculelor, și nu doar ca formarea legăturilor peptidice.

Scopul este de a construi o anumită secvență de aminoacizi, controlând în același timp modul de legare a resturilor, chimia grupărilor protectoare, stereochimia, reacțiile secundare și orice alte cerințe structurale suplimentare.

Sinteza peptidelor în fază solidă menține lanțul în curs de formare pe un suport insolubil, ceea ce face ca etapele repetate de cuplare și spălare să se preteze bine la automatizare. Avantajele asociate sintezei iterative nu elimină însă probleme precum reacțiile incomplete, agregarea, secvențele cu deleții sau reacțiile secundare dependente de secvență. [4] [6] [7]

Sinteza clasică în soluție menține intermediarii peptidici în faza lichidă și poate oferi o mai mare flexibilitate în izolarea și caracterizarea fiecărui produs intermediar. Cu toate acestea, separările repetate și solubilitatea din ce în ce mai redusă pot constitui limite serioase.

Metodele de sinteză în fază lichidă cu marcatori solubili încearcă să combine chimia în soluție cu strategii de recuperare a materialului special concepute. Prin urmare, acestea pot reprezenta o opțiune suplimentară în cazul secvențelor și al problemelor de producție pentru care SPPS-ul clasic nu este optim. [8] [9]

Moleculele mai lungi sau deosebit de complexe pot fi, de asemenea, sintetizate prin asamblarea fragmentelor, inclusiv prin ligare chimică nativă, în loc să se bazeze exclusiv pe adăugarea continuă de resturi de aminoacizi. [10]

Indiferent de metoda de sinteză aleasă, eficiența cuplării și chimia grupărilor protectoare rămân esențiale, deoarece ineficiențele minore și reacțiile secundare se pot acumula pe parcursul etapelor ulterioare ale sintezei. Formarea aspartimidului, secvențele de deleție și modificările stereochimice demonstrează de ce secvența dorită în sine nu descrie tot ceea ce se poate forma în timpul procesului. [2] [11] [12]

Munca nu se încheie nici odată cu asamblarea lanțului.

Procesul de purificare determină dacă produsul final poate fi separat de celelalte componente.

Ulterior, metodele analitice selectate în mod corespunzător oferă răspunsuri la întrebări distincte privind identitatea, puritatea, conținutul, stereochimia, conformația și – dacă este cazul – activitatea funcțională. [3] [12] [13]

Creșterea scalei de producție ridică noi probleme legate de transportul masei, conservarea rășinii, consumul de solvenți, filtrarea, capacitatea de epurare, repetabilitatea procesului și impactul acestuia asupra mediului. Din acest motiv, evaluarea industrială a procesului ar trebui să includă atât sinteza, cât și purificarea și izolarea, fără a se concentra exclusiv pe viteza de cuplare. [14] [15]

Principiul cel mai important este următorul:

Producția eficientă a unui peptid necesită controlul întregului proces – de la proiectarea moleculară și formarea legăturilor până la purificare și caracterizarea structurală. Obținerea unui lanț cu masa nominală așteptată sau a unui pic cromatografic principal ridicat constituie o dovadă valoroasă, dar niciunul dintre acești parametri nu confirmă, în sine, identitatea moleculară completă sau calitatea procesului de producție.

Mențiune

Articolul are un caracter exclusiv educativ și științifico-informativ. Acesta descrie principiile generale ale chimiei peptidelor, sinteza în fază solidă, sinteza în soluție și în fază lichidă, strategiile privind grupările protectoare, cuplarea, purificarea, caracterizarea analitică, procesele de producție, precum și exemple extrase din studii publicate. Acesta nu constituie un protocol de laborator, un manual de producție, un sfat medical, un ghid privind dozarea sau administrarea, nici un certificat de calitate pentru vreun produs peptidic specific. Rezultatele experimentale trebuie interpretate în contextul secvențelor, al metodelor utilizate, al scării procesului, al tehnicilor analitice și al limitărilor fiecărui studiu în parte.

Referințe

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K. și Perczel, A. (2016). Expresia bacteriană și/sau sinteza peptidică în fază solidă a polipeptidelor și miniproteinelor cu lungimea de 20-40 de aminoacizi: studiu de caz privind liganzii GPCR de clasa B. Current Protein & Peptide Science, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S. și Bode, J. W. (2020). Prevenirea formării aspartimidei în timpul sintezei peptidice prin utilizarea ciano-sulfurilidelor ca grupe protectoare ale acidului carboxilic. Nature Communications, 11(1), articolul 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C. și Barany, G. (1992). Sinteza în fază solidă a inhibitorului de tripsină pancreatică bovină (BPTI) și a două analogi. O abordare chimică pentru evaluarea rolului punților disulfidice în plierea și stabilitatea proteinelor. Revista internațională de cercetare în domeniul peptidelor și proteinelor, 40(3–4), 194–207. Înregistrare PubMed
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D. și Seeberger, P. H. (2019). Monitorizarea în timp real a sintezei peptidelor în fază solidă cu ajutorul unui reactor cu flux cu pat variabil. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F. și Becker, C. F. W. (2015). Generarea eficientă a hidrazidelor peptidice prin hidrazinoliza directă a rășinilor Peptidyl-Wang-TentaGel. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Sinteza rapidă a peptidelor bazată pe flux. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F. și Pentelute, B. L. (2017). O abordare complet automatizată, bazată pe flux, pentru sinteza accelerată a peptidelor. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G. și Albericio, F. (2022). Sinteza peptidelor în fază lichidă (LPPS): un nou val în prepararea peptidelor. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T. și Fukui, T. (2012). Un nou grup protector de amidă derivat din difenilmetil pentru sinteza eficientă a peptidelor în fază lichidă: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I. și Kent, S. B. (1994). Sinteza proteinelor prin ligare chimică nativă. Science, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J. și Collins, J. M. (2007). Limitarea racemizării și a formării aspartimidei în sinteza peptidică în fază solidă Fmoc asistată de microunde. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E. și Gaskell, S. J. (1989). Caracterizarea impurităților dintr-o peptidă substrat sintetică a reninei prin spectrometrie de masă cu bombardament rapid cu atomi și spectrometrie de masă hibridă în tandem. Comunicări rapide în spectrometria de masă, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G., & Crowther, J. B. (1995). Determinarea purității chirale a peptidelor: hidroliza în acid deuterat, derivatizarea cu reactivul Marfey și analiza prin cromatografie lichidă de înaltă performanță-ionizare prin electrospray-spectrometrie de masă. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Intensitatea masei procesului (PMI): O analiză holistică a proceselor actuale de fabricație a peptidelor oferă informații privind sustenabilitatea în sinteza peptidelor. The Journal of Organic Chemistry, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Provocări legate de sustenabilitate în sinteza și purificarea peptidelor: de la cercetare și dezvoltare la producție. The Journal of Organic Chemistry, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001