Syntéza peptidů: metoda na pevné fázi, v roztoku a metody produkce

Syntéza peptidů je kontrolovaný proces tvorby aminokyselinových řetězců o určité sekvenci. Při chemické syntéze se vybrané aminokyseliny spojují pomocí peptidových vazeb, a zároveň kontrolovat jiné reaktivní skupiny přítomné v těchto molekulách. Účelem tedy není pouze spojení aminokyselin, ale získání konkrétní molekulární struktury o určité sekvenci, stereochemii, struktuře konců řetězce a – je-li to vyžadováno – s dalšími strukturálními vlastnostmi.

Mezi hlavní metody patří solid-phase peptide synthesis (SPPS), klasická syntéza v roztoku a novější metody liquid-phase peptide synthesis (LPPS) využívající rozpustné nosiče nebo molekulární značky. Výzkumné laboratoře a výrobní závody mohou také kombinovat různé přístupy, připravovat kratší fragmenty zvlášť a ty pak vzájemně spojovat, případně využívat biologickou expresi, pokud je pro danou sekvenci vhodnější.

Porovnání chemické syntézy s bakteriovou expresí polypeptidů složených z 20 až 40 aminokyselinových zbytků ukazuje důležitý princip: praktická volba metody výroby závisí na konkrétní molekule, její sekvenci, sklonu k agregaci, požadovaných modifikacích, rozsahu výroby a analytických požadavcích. [1]

Získání požadované aminokyselinové sekvence je pouze jednou z fází výroby peptidu.

Celý proces může zahrnovat:

navrhování sekvencí → příprava stavebních bloků → ochrana funkčních skupin → spojování → odstranění chránicích skupin → skládání řetězce → odštěpení nebo spojování fragmentů → konečné tvarování struktury → čištění → potvrzení totožnosti → analýza nečistot → stanovení obsahu → konečná charakteristika.

U některých peptidů jsou nutné také další kroky, jako je cyklizace, tvorba disulfidových můstků, stáčecí proces (či konformace), konjugace nebo jiné chemické modifikace.

Z toho důvodu správné sestavení řetězce automaticky neznamená, že konečný materiál má správnou identitu, čistotu, stereochemii, konformaci, stabilitu nebo jiné požadované vlastnosti.

Co je to peptidová syntéza?

Tvorba specifické aminokyselinové sekvence

Peptid skládá se z aminokyselinových zbytku spojených peptidovými vazbami.

Cílem syntézy peptidů je vytvoření těchto vazeb v předem stanoveném pořadí, často za současné kontroly:

• druhu aminokyselin;
• poradí aminokyselin v sekvenci;
• stereochemie;
• N-koncové struktury;
• C-koncové struktury;
• modifikace postranních řetězců;
• rozložení disulfidových můstků;
• cyklizace;
• jiných požadovaných strukturálních vlastností.

Sekvence má zásadní význam, protože identické aminokyselinové složení může vést ke vzniku různých molekul, pokud jsou aminokyselinová v jiném pořadí.

Tvrzení, že daná molekula je „peptid složený z pěti aminokyselin”, tedy poskytuje velmi málo informací o její skutečné struktuře. Aby bylo možné molekulu správně popsat, je třeba znát druh aminokyselin, jejich pořadí, stereochemii, koncové skupiny a případné další modifikace.

Dva peptidy tak mohou mít úplně stejné aminokyselinové složení, a přesto být různými molekulárními strukturami.

Další rozdíly mohou vyplývat z modifikací konců řetězce, přítomnosti disulfidových můstků, cyklické kostry, změn v postranních řetězcích nebo odlišné stereochemické konfigurace.

Chemická syntéza peptidů obvykle využívá aminokyseliny, jejichž reaktivní skupiny byly selektivně chráněny.

Dočasné ochranné skupiny umožňují vytvoření konkrétní zamýšlené chemické vazby za současného omezení konkurenčních reakcí na jiných místech molekuly.

V dalších plánovaných fázích syntézy jsou tyto skupiny odstraněny nebo pozměněny.

Kontrolovaná reakce namísto spontánního spojování

V základních chemických popisech se tvorba peptidové vazby často prezentuje jako kondenzační reakce, při které se dva aminokyseliny spojují za celkového uvolnění molekuly vody.

Taková rovnice popisuje celkovou bilanci reakce.

Nelze ho však ztotožňovat se způsobem, jakým se v praxi provádí řízená syntéza peptidů.

Samotné smíchání volných aminokyselin by neumožnilo spolehlivě určit:

• která aminová skupina má reagovat;
• která karboxylová skupina má reagovat;
• která aminokyselina má být jako první;
• který má být na druhém místě;
• začnou boční řetězce reagovat;
• bude stereochemie zachována;
• nevzniknou četné nežádoucí produkty.

Při praktické chemické syntéze se proto používají kontrolované strategie aktivace a chránění funkčních skupin.

Skupina pocházející z karboxylové skupiny je obvykle aktivována takovým způsobem, aby mohla účinně reagovat s vybranou aminovou skupinou. Ochranné skupiny, pořadí reakcí, chemie nosiče, spojovací činidla, prostředí rozpouštědla a metody izolace společně pomáhají nasměrovat reakci směrem k zamýšlenému produktu.

Účinná syntéza peptidů proto vyžaduje kontrolu jak chemie, která má proběhnout, tak té, které je třeba zabránit.

Dobrým příkladem je vznik aspartimidu.

Vědci vyvinuli alternativní metodu ochrany karboxylové skupiny, jejímž cílem bylo omezení této problematické vedlejší reakce při sestavování peptidu. [2]

Studie ukazuje širší princip peptidové chemie: prevence nežádoucích molekulárních přeměn může být stejně důležitá jako vytvoření správné peptidové vazby.

Kdy lze peptid považovat za hotový?

Dokončení tvorby lineární peptidové kostry neznamená vždy konec celé syntézy.

V závislosti na cílové molekule mohou být po složení řetězce vyžadovány další kroky.

Mohou zahrnovat:

• úplné odstranění ochranných skupin;
• odštěpení peptidu od pevného nosiče;
• odstranění dočasných značek;
• cyklizaci;
• oxidace;
• tvorba disulfidických můstků;
• vrásnění;
• skloňování;
• modifikaci konců řetězce;
• čištění;
• analytickou charakteristiku.

Některé peptidy vyžadují po složení řetězce poměrně málo dodatečných strukturálních změn.

U ostatních jsou klíčové pozdější fáze.

Dobrým příkladem je syntéza bovinního pankreatického inhibitoru trypsinové aktivity (BPTI). Vědci sestavili lineární sekvenci, materiál očistili a poté získali sbalenou strukturu obsahující disulfidové můstky. Podle analýz a funkčních srovnání prezentovaných ve studii odpovídal konečný materiál s přirozenou sekvencí přírodnímu proteinu v rozsahu zkoumaných parametrů. [3]

Tento příklad ukazuje rozdíl mezi sestavením peptidové kostry a získáním plně charakterizované konečné molekulární formy.

Metoda, která umožňuje získat správnou lineární sekvenci, automaticky potvrdzuje / Metoda, která umožňuje získat správnou lineární sekvenci, automaticky potvrdit / Metoda, která umožňuje získat správnou lineární sekvenci, automaticky nepotvrzuje:

• správného skládání;
• správného uspořádání disulfidických můstků;
• biologické aktivity;
• stability;
• profilu znečištění;
• vhodnosti pro dané použití.

Každá z těchto záležitostí vyžaduje samostatné důkazy.

Chemická syntéza, biologická exprese a kombinované metody

Při chemické syntéze peptidů se dříve připravené molekulární stavební bloky spojují v kontrolovaných laboratorních reakcích.

Biologická exprese naproti tomu využívá buněčný aparát k vytvoření kódované aminokyselinové sekvence. Materiál pak musí být zotaven, očištěn a v případě potřeby podroben dalšímu zpracování.

Obě metody mohou vést k získání peptidů nebo polypeptidů, ale pojí se s jinými možnostmi a omezeními.

Chemická syntéza může být užitečná zejména tehdy, když jsou potřeba:

• vybrané nestandardní aminokyseliny;
• chemické modifikace v konkrétních místech;
• specifické struktury konců řetězce;
• izotopové značkovače;
• modifikace peptidové kostry;
• jiné vlastnosti, které lze jen obtížně získat standardní biologickou expresí.

Biologická exprese může být atraktivní v případě vhodných delších sekvencí nebo určitých strategií značení, ale neodstraňuje problémy vyskytující se v pozdějších fázích výroby.

Stále je nutné zohlednit získávání materiálu, řasení, zpracování, nečistoty pocházející z hostitelského organismu, čištění a analytickou charakteristiku.

Žádná z metod tedy není univerzálně nejlepší.

Při srovnání polypeptidů složených z 20–40 aminokyselinových zbytků ovlivňovala délka sekvence i její tendence k agregaci výsledky pevnofázové syntézy a bakteriální exprese. [1]

Tyto poznatky podporují přístup, kdy se způsob výroby volí pro konkrétní molekulu.

Historická data týkající se výtěžnosti, nákladů, vybavení a doby výroby by neměla být považována za univerzální moderní hodnoty, protože technologie, činidla, automatizace, metody čištění a ekonomika výroby se s rozvojem technologií mění.

Syntéza peptidů na pevné fázi

Rostoucí řetězec je připojen k nerozpustnému nosiči

Při peptidové syntéze na pevné fázi (SPPS) zůstává rostoucí peptidový řetězec během následujících cyklů syntézy navázán na nerozpustný nosič.

Nosičem je nejčastěji funkcionalizovaná polymerní pryskyřice.

Spojka neboli linker váže peptid s nosičem a ovlivňuje mimo jiné způsob pozdějšího uvolnění hotového řetězce a typ získané koncové skupiny.

Jednou z hlavních praktických výhod SPPS je snazší oddělování materiálu.

Po ukončení určité fáze reakce lze rozpustná činidla a mnoho rozpustných vedlejších produktů odstranit promýváním, zatímco rostoucí peptid zůstává vázán na pevnou fázi.

Díky tomu není nutné po přidání každého dalšího aminokyselinového zbytku izolovat a čistit rostoucí peptid jako samostatnou, volnou sloučeninu.

Toto pohodlí však může vést k závažnému nedorozumění.

Promývání pryskyřice neznamená, že byly odstraněny všechny nesprávné peptidy.

Pokud řetězec navázaný na pryskyřici nereaguje během jednoho stupně couplingové reakce, může na nosiči nadále zůstat.

V dalších cyklech může opět reagovat a dále se prodlužovat.

V důsledku toho může vzniknout deleční sekvence, tedy molekula lišící se od cílového peptidu absencí jedné nebo více aminokyselinových zbytků.

Podobně chemicky modifikované nebo neúplně odblokované řetězce vázané na pryskyřici se mohou účastnit dalších fází syntézy.

SPPS tak zjednodušuje oddělování rozpustných látek od materiálu vázaného na pryskyřici.

Nezaručuji však dokonalou shodu sekvencí.

Opakující se cyklus odjišťování a spínání

Typická etapová synteza SPPS zahrnuje opakování tří základních operací:

odjištění → spřahování → proplachování.

Nejprve se odhaluje reaktivní aminová skupina nacházející se na konci rostoucího řetězce.

Poté je k řetězci připojena další chráněná aminokyselina.

Rozpustná činidla, nadbytek aminokyselin a řada reakčních produktů se odstraní před zahájením následujícího cyklu.

Opakování tohoto procesu umožňuje sestavovat peptid po jedné aminokyselinové zbytcové jednotce.

V klasické SPPS se C-terminální zbytky obvykle připojují k nosiči jako první a poté se řetězec prodlužuje směrem k N-konci.

To se liší od standardní ribozomální syntézy proteinů, během níž jsou aminokyseliny postupně připojovány k C-konci rostoucího řetězce.

Konečné pořadí aminokyselin však může být totožné, přestože směr a chemie procesu skládání jsou jiné.

Pojem „cyklus” by se neměl chápat jako jeden univerzální soubor reakčních podmínek vhodný pro každý zbytkový uhlík a každou sekvenci.

Průběh reakce může záviset na:

• strategii ochranných skupin;
• druhu aminokyseliny;
• prostorových podmínek kolem místa reakce;
• druhu pryskyřice;
• odkazovač;
• del délky řetězu;
• agregace;
• rozpouštědla;
• kombinační chemii;
• strukturálního chování rostoucího peptidu.

Reakce, která na začátku syntézy probíhá snadno, se může v pozdější fázi stát výrazně obtížnější.

Proto zůstává monitorování procesu důležité i ve vysoce automatizovaných systémech.

Proč na vlastnostech pryskyřice záleží?

Pevné médium není pouhým pasivním držákem.

Jeho fyzikální a chemické vlastnosti mohou přímo ovlivnit průběh reakce.

Jedním z důležitých parametrů je bobtnání.

Pokud pryskyřice ve zvoleném prostředí rozpouštědla správně bobtná, činidla mohou snadněji pronikat k reaktivním místům nacházejícím se v celé struktuře polymeru.

Nedostatečné bobtnání nebo změny struktury pryskyřice mohou tento přístup omezovat.

Význam mohou mít také:

• hustota osídlení;
• polymerní architektura;
• struktura linkeru;
• snášenlivost s rozpouštědly;
• mechanická stabilita;
• poréznost;
• difúzní vlastnosti;
• interakcje mezi rostoucími peptidovými řetězci.

S rostoucí délkou peptidu mohou jednotlivé řetězce také vzájemně interagovat.

Agregace na pryskyřici může omezovat přístup k reaktivním místům a vést k neúplnému spřažení nebo neúplnému deprotektování.

To znamená, že sekvence, která se na začátku syntézy chová správně, může být s prodlužováním řetězce obtížnější.

Vědci vyvinuli průtokový reaktor s proměnlivým ložem, který umožňoval sledovat bobtnání pryskyřice na základě měření souvisejících s tlakem. [4]

Studie se zabývala agregací na pryskyřici a neúplnou tvorbou vazeb jako procesními problémy, které by za jiných podmínek mohly být obtížně přímo pozorovatelné během syntézy.

To ukazuje, že monitorování fyzického chování nosiče může poskytovat informace přesahující samotné zaznamenávání přidávaných činidel.

K čemu slouží Wangova pryskyřice?

Chemie Wangova linkeru je široce využívána v SPPS, když je po odštěpení peptidu požadován C-konec ve formě karboxylové kyseliny.

Peptid je připojen pomocí esterové vazby, kterou lze později za vhodných podmínek štěpit.

Alternativní systémy linkerů lze volit tehdy, je-li vyžadována odlišná struktura C-konce, například amid.

Je třeba rozlišovat mezi chemií linkeru a celým fyzickým nosičem.

Wangovy linkery lze zavádět do různých polymerních architektury.

Takové materiály nemusí mít identické:

• bobtnací vlastnosti;
• kapacity;
• snášenlivost s rozpouštědly;
• mechanických vlastností;
• chování během reakce.

Výzkum s využitím peptidyl-Wang-TentaGelových nosičů ukázal specializovanou alternativní metodu pro přípravu peptidových hydrazidů, které jsou užitečnými meziprodukty v peptidové chemii. [5]

To neznamená, že standardní odštěpení z Wangovy pryskyřice obvykle vede ke vzniku peptidových hydrazidů.

Ukazuje však důležitou zásadu:

nosič + linker + reakční podmínky + štěpná chemie společně určují výsledný produkt.

Syntéza SPPS v periodickém a průtokovém uspořádání

SPPS lze provádět v klasických vsádkových reaktorech nebo v systémech, ve kterých činidla protékají reaktorem obsahujícím pevný nosič.

Průtokové systémy mohou umožňovat rychlou výměnu činidel a přesnější kontrolu chemického prostředí obklopujícího pryskyřici.

Studie z roku 2014 představila rychou syntézu peptidů v průtokovém systému s nepřetržitým monitorováním a aplikovala ji na několik peptidů a malý protein. [6]

V pozdější automatizované studii byla popsána výrazně rychlejší montáž řetězců, přičemž u analyzovaných příkladů bylo dosaženo čistoty surového produktu a výtěžku po izolaci srovnatelných s klasickou periodickou syntézou. [7]

Tyto výzkumy ukazují možnosti konkrétních systémů za určitých podmínek.

To však nedokazuje, že každý peptid lze vyrábět stejně rychle a se stejnou kvalitou.

Doba potřebná k výrobě peptidu zahrnuje také mnohem více než jen samotné sestavování řetězce.

Celkový proces může zahrnovat:

• příprava reagencií;
• příprava pryskyřice;
• spojování;
• odjištění;
• promývání;
• odštěpování;
• zpracování produktu;
• čištění;
• odstraňování rozpouštědel;
• konečné tvarování struktury;
• analytická vyšetření;
• dokumentaci.

Rychlé vázání je tedy jen jedním z prvků celkové efektivity výroby.

Syntéza v kapalné fázi

Co tento pojem znamená?

Termín „synteza peptydů v liquidní fázi” lze použít v několika významech.

V širším slova smyslu to může jednoduše znamenat syntézu peptidu probíhající v roztoku.

V odbornější literatuře se však často rozlišuje:

1. klasickou peptidovou syntézu v roztoku;
2. syntézu peptidů na pevné fázi;
3. novější metody LPPS, ve kterých rostoucí řetězec obsahuje rozpustnou značku nebo nosič.

Toto rozlišení je důležité, protože se mění způsob separace a zpětného získávání produktu.

Volně rozpuštěný, chráněný peptidový meziprodukt může vyžadovat izolaci s využitím jeho vlastních fyzikálních a chemických vlastností.

V případě značeného polotovaru může být značka navržena tak, aby usnadňovala srážení, extrakci, zachycení na membráně nebo jiný způsob separace.

Přehled týkající se LPPS jasně rozlišuje mezi klasickou syntézou v roztoku, SPPS a metodami využívajícími rozpustné značky. [8]

Publikace je užitečná k uspořádání terminologie a metodiky.

Neměla by však být interpretována jako jediný experiment dokazující, že jedna metoda je nejlepší pro každý peptid.

Klasická peptidová syntéza v roztoku

Při klasické syntéze v roztroji zůstávají chráněné aminokyseliny, peptidové meziprodukty nebo fragmenty rozpuštěny v reakčním prostředí namísto toho, aby byly kovalentně připojeny k nerozpustné pryskyřici.

Po dokončení reakce může být příslušný meziprodukt izolován, očištěn a v případě potřeby charakterizován před zahájením dalšího kroku.

Může to přinášet určité výhody.

Výzkumní pracovníci mohou:

• charakterizovat jednotlivé polotovary;
• vybírat metodu čištění pro konkrétní polotovar;
• optimalizovat jednotlivé přeměny;
• připravovat fragmenty nezávisle;
• upravit syntetickou trasu, když určitý meziprodukt způsobí problémy.

Syntéza v roztoku však může být spojena také s významnými obtížemi.

S prodlužováním řetězce mohou peptidy:

• stávat se špatně rozpustnými;
• agregovat;
• být obtížně krystalizovatelný;
• vytvářet blízce příbuzné nečistoty;
• být těžké k oddělení;
• vyžadovat dvojitou izolaci;
• způsobovat ztráty materiálu v dalších fázích obrábění.

Syntéza v roztoku tedy není automaticky jednodušší ani snáze škálovatelná než SPPS.

Její užitečnost závisí na konkrétní sekvenci, stabilitě meziproduktů, rozpustnosti, délce syntetické trasy, chování při čištění a účinnosti následných fází izolace.

Rozvoj značených strategií LPPS částečně vyplývá ze snahy vyřešit právě tyto problémy spojené se separací a manipulací s materiálem. [8]

Rozpustné značkovače propojují navrhování reakcí s navrhováním separací

U značené LPPS má rostoucí peptid dočasné molekulární připojení navržené tak, aby ovlivňovalo jeho fyzikální vlastnosti.

Značka může umožňovat udržení dostatečné rozpustnosti peptidu během reakce a následně usnadňovat jeho selektivní získání zpět.

V závislosti na technologii může dělení využívat:

• srážení;
• extrakci;
• zadržování na membráně;
• fázové chování;
• další vlastnosti vyplývající z přítomnosti značky.

Jedna z experimentálních strategií využila dlouhořetězcovou ochrannou skupinu na C-konci k přípravě peptidových amidů.

Opakované reakce a fáze srážení umožnily výzkumníkům připravit hydrofobní peptid, který bylo v jimi použitém srovnání obtížné uspokojivě získat metodou SPPS. [9]

To dokazuje užitečnost této konkrétní strategie pro analyzovanou sekvenci.

To však nedokazuje univerzální převahu značené syntézy.

Značka se stává součástí výrobního procesu a vyvolává vlastní otázky:

• Jak efektivně je připojován?
• Mění průběh reakce?
• Jak spolehlivě lze získat označený polotovar?
• Vedete ke vzniku nových znečištění?
• Jak je odstraněn?
• Lze potvrdit úplné odstranění?
• Jaké analytické metody potvrzují jeho absenci v konečném produktu?

Rozpustné značky je tedy třeba považovat za funkční prvky návrhu procesu, a nikoli pouze za jednoduché štítky.

Porovnání hlavních metod

Porównanie przedstawia ogólne zasady działania poszczególnych metod.

Nie określa, która z nich zapewni najlepszą wydajność, czystość, koszt, zrównoważenie środowiskowe czy możliwość skalowania dla konkretnej sekwencji.

Parametry te należy oceniać na podstawie rzeczywistej cząsteczki i konkretnego procesu produkcyjnego. [4] [8] [9]

Łączenie fragmentów i produkcja hybrydowa

Peptyd nie zawsze musi być tworzony w jednym nieprzerwanym procesie polegającym na dodawaniu kolejnych reszt aminokwasowych.

Alternatywną strategią jest oddzielne przygotowanie krótszych fragmentów peptydowych, a następnie ich połączenie.

Proces hybrydowy może na przykład wykorzystywać SPPS do otrzymywania poszczególnych fragmentów oraz chemię w roztworze do ich łączenia.

Strategie fragmentowe mogą ograniczać niektóre problemy związane z bardzo długą syntezą etapową.

Wprowadzają jednak nowe wyzwania, takie jak:

• wybór odpowiedniego miejsca połączenia;
• rozpuszczalność fragmentów;
• aktywacja miejsca łączenia;
• chemoselektywność;
• zachowanie stereochemii;
• reakcje uboczne;
• oczyszczanie fragmentów;
• oczyszczanie po ich połączeniu.

Ważnym przykładem kontrolowanego łączenia fragmentów jest natywna ligacja chemiczna.

W klasycznej wersji tioester peptydowy reaguje z drugim peptydem zawierającym N-końcową cysteinę. Następujące później przegrupowanie prowadzi do utworzenia prawidłowego wiązania w szkielecie peptydowym w miejscu ligacji.

Pierwotne badania wykazały możliwość uzyskania po ligacji i fałdowaniu białka zawierającego mostki disiarczkowe. [10]

Potwierdza to znaczenie tej strategii łączenia fragmentów.

Nie oznacza jednak, że dowolne dwa niezmodyfikowane fragmenty peptydowe mogą spontanicznie się połączyć.

Sprzęganie i grupy ochronne

Sprzęganie tworzy zamierzone połączenie

Sprzęganie jest etapem reakcji, podczas którego pomiędzy wybranymi jednostkami powstaje nowe wiązanie peptydowe.

Zazwyczaj grupa pochodząca od grupy karboksylowej jest aktywowana tak, aby mogła skutecznie reagować z odpowiednią grupą aminową.

Chemia aktywacji musi być zgodna z:

• rosnącą sekwencją;
• tymczasowymi grupami ochronnymi;
• ochroną łańcuchów bocznych;
• stereochemią;
• nośnikiem lub znacznikiem;
• środowiskiem rozpuszczalnika;
• innymi grupami funkcyjnymi obecnymi w cząsteczce.

Skuteczne sprzęganie jest szczególnie ważne w syntezie etapowej, ponieważ niepełna reakcja może prowadzić do powstawania sekwencji delecyjnych.

Jeżeli jeden etap dodawania aminokwasu nie powiedzie się dla części rosnących łańcuchów, takie łańcuchy mogą pozostać w układzie i uczestniczyć w kolejnych cyklach.

W efekcie mogą powstać cząsteczki bardzo podobne do docelowego peptydu, ale pozbawione jednej reszty.

Nawet niewielkie nieefektywności mogą więc kumulować się podczas wielu etapów syntezy.

Prosty przykład matematyczny dobrze ilustruje ten problem.

Jeżeli każdy z 50 niezależnych etapów składania miałby 99% prawdopodobieństwa powodzenia, odsetek cząsteczek, dla których wszystkie etapy zakończyłyby się sukcesem, wynosiłby:

0,99^50 ≈ 0,605

czyli około 61%.

Jest to wyłącznie ilustracja matematyczna.

Nie stanowi prognozy rzeczywistej czystości ani wydajności syntezy peptydu zawierającego 50 reszt.

Rzeczywista produkcja obejmuje:

• różne wydajności sprzęgania w poszczególnych pozycjach;
• etapy odbezpieczania;
• reakcje uboczne;
• zależne od sekwencji trudności;
• strategie ponownego sprzęgania;
• straty podczas odszczepiania;
• straty podczas oczyszczania;
• inne zmienne procesowe.

Obliczenie pokazuje jedynie, dlaczego nawet pozornie niewielka nieefektywność pojedynczego etapu może nabrać dużego znaczenia w wieloetapowej syntezie.

Grupy ochronne kontrolują miejsce reakcji

Aminokwas może posiadać kilka chemicznie reaktywnych grup.

Bez selektywnej kontroli reakcje sprzęgania mogłyby zachodzić w niepożądanych miejscach.

Grupy ochronne tymczasowo blokują wybrane miejsca reaktywne.

Grupa aminowa wykorzystywana do wydłużania łańcucha zazwyczaj wymaga tymczasowej ochrony, natomiast reaktywne łańcuchy boczne mogą wymagać zabezpieczenia pozostającego na miejscu przez wiele cykli syntezy.

Połączenie z nośnikiem również musi przetrwać te etapy aż do momentu zaplanowanego odszczepienia.

Wybór grup ochronnych wpływa więc na całą strategię syntezy.

Należy uwzględnić:

• sposób ich wprowadzania;
• stabilita;
• sposób usuwania;
• zgodność z innymi grupami ochronnymi;
• zgodność z nośnikiem;
• reakcje uboczne;
• wpływ konkretnej sekwencji;
• końcowe warunki odbezpieczania.

Badania wykorzystujące ochronę opartą na cyjanosulfurylidzie dotyczyły powstawania aspartimidu poprzez zmianę sposobu zabezpieczenia grupy karboksylowej. [2]

Wyniki pokazują, że strategia grup ochronnych wpływa nie tylko na to, czy zamierzona reakcja może zajść, ale również na to, jakie niepożądane reakcje stają się możliwe.

Fmoc, Boc i ochrona ortogonalna

Fmoc i Boc należą do szeroko stosowanych grup chroniących grupy aminowe.

Istotnie różnią się sposobem usuwania.

Fmoc jest zazwyczaj usuwany w warunkach zasadowych, natomiast Boc jest wrażliwy na warunki kwaśne.

Właściwości te pozwalają stosować je jako elementy szerszych strategii ochrony.

W popularnej SPPS opartej na Fmoc tymczasowa ochrona N-końcowa Fmoc jest wielokrotnie usuwana, podczas gdy wybrane grupy ochronne łańcuchów bocznych oraz połączenie z żywicą pozostają nienaruszone do późniejszych etapów.

Inne strategie mogą wykorzystywać odmienne kombinacje.

Szczególnie ważnym pojęciem jest ochrona ortogonalna.

Dwie grupy ochronne są uznawane za ortogonalne, jeśli jedną można selektywnie usunąć w warunkach, w których druga pozostaje wystarczająco stabilna, aby możliwe było dalsze prowadzenie syntezy.

Ortogonalność jest więc praktyczną relacją zgodności chemicznej.

Nie oznacza, że każda zabezpieczona grupa pozostanie całkowicie niezmieniona po nieograniczonej liczbie ekspozycji na wszystkie warunki reakcji.

Reakcje uboczne nadal mogą występować.

W badaniach syntezy Fmoc opisano zarówno powstawanie aspartimidu, jak i niepożądane zmiany stereochemiczne mimo zakładanej selektywności ogólnej strategii ochronnej. [11]

Stereochemia jest częścią tożsamości cząsteczki

Wiele aminokwasów posiada centrum chiralne.

Oznacza to, że ich atomy mogą przyjmować różne układy przestrzenne odpowiadające różnym formom stereochemicznym.

Zmiana konfiguracji jednego centrum stereogenicznego może prowadzić do powstania innej struktury peptydu bez konieczności zmiany jego nominalnej masy.

Dlatego sama masa nie może potwierdzić pełnej tożsamości peptydu.

Epimeryzacja zazwyczaj oznacza zmianę konfiguracji jednego centrum stereogenicznego w cząsteczce zawierającej kilka takich centrów.

Racemizacja jest również często omawiana w chemii peptydów w kontekście utraty integralności stereochemicznej reszt aminokwasowych.

Zmiany te są istotne, ponieważ rozpoznawanie molekularne może silnie zależeć od przestrzennego ułożenia atomów.

Dwie cząsteczki o tym samym składzie pierwiastkowym i nominalnej masie mogą więc zachowywać się inaczej, jeśli różnią się stereochemią.

W badaniu syntezy Fmoc wspomaganej mikrofalami stwierdzono, że niektóre reszty były podatne na niepożądane zmiany stereochemiczne w zastosowanych warunkach. Modyfikacja metody ograniczała występowanie tych reakcji. [11]

Nie oznacza to, że ogrzewanie z definicji uszkadza wszystkie peptydy.

Prawidłowy wniosek jest taki, że przyspieszanie reakcji należy oceniać razem z zależną od sekwencji selektywnością chemiczną.

Aspartimid i inne pokrewne zanieczyszczenia

Powstawanie aspartimidu jest znaną reakcją uboczną dotyczącą określonych sekwencji zawierających asparaginian.

Może powstać niepożądany cykliczny półprodukt, z którego następnie tworzą się związki o zmienionej łączności szkieletu lub stereochemii.

Prawdopodobieństwo tej reakcji zależy od sekwencji oraz warunków procesu.

Inne zanieczyszczenia związane z syntezą mogą wynikać z:

• niepełnego sprzęgania;
• niepełnego odbezpieczania;
• powstawania sekwencji delecyjnych;
• reakcji łańcuchów bocznych;
• zmian stereochemicznych;
• reakcji podczas odszczepiania;
• utleniania;
• przegrupowań;
• warunków obróbki produktu;
• niepełnego usunięcia grup ochronnych.

Niektóre zanieczyszczenia powodują łatwo zauważalną zmianę masy cząsteczkowej.

Inne są znacznie trudniejsze do rozróżnienia.

W badaniach analitycznych syntetycznego peptydu będącego substratem reniny zidentyfikowano wiele zanieczyszczeń, w tym składniki wykazujące taką samą zmianę masy, ale zawierające modyfikacje w różnych pozycjach. [12]

Do ich rozróżnienia potrzebna była dodatkowa analiza strukturalna.

Badacze traktowali również proponowane mechanizmy powstawania tych zanieczyszczeń jako hipotezy.

Jest to ważne rozróżnienie:

ustalenie, czym jest zanieczyszczenie, oraz udowodnienie dokładnego mechanizmu jego powstania to dwa odrębne pytania naukowe.

Nie należy przedstawiać prawdopodobnego mechanizmu jako potwierdzonego wyłącznie dlatego, że odpowiada obserwowanej masie cząsteczkowej.

Oczyszczanie, skalowanie i jakość produkcji

Produkt surowy, produkt oczyszczony i wydajność

Surowy peptyd to materiał otrzymany przed zakończeniem odpowiednich etapów oczyszczania.

Może zawierać:

• docelowy peptyd;
• deleční sekvence;
• materiał niecałkowicie odbezpieczony;
• zmodyfikowane sekwencje;
• pozostałości odczynników;
• produkty związane z odszczepianiem;
• sole;
• rozpouštědla;
• inne składniki powstające w procesie.

Oczyszczanie ma na celu oddzielenie właściwego peptydu od tej mieszaniny.

Należy wyraźnie rozróżnić trzy pojęcia:

czystość produktu surowego — zmierzony skład materiału przed końcowym oczyszczaniem;

wydajność produktu oczyszczonego lub wyizolowanego — ilość odzyskanego materiału docelowego względem określonej wartości początkowej lub teoretycznej;

czystość końcowa — skład wyizolowanego materiału określony za pomocą konkretnej metody analitycznej.

Pojęcia te nie są wymienne.

Proces może prowadzić do powstania dużej ilości surowego materiału, ale umożliwiać odzyskanie stosunkowo niewielkiej ilości oczyszczonego produktu.

Inny proces może dawać mniej materiału surowego, ale charakteryzować się wysoką selektywnością tworzenia produktu docelowego.

Podobnie wysoka czystość analityczna nie musi oznaczać wysokiej wydajności produkcyjnej.

W badaniach przyspieszonej syntezy przepływowej prawidłowo raportowano osobno czystość materiału surowego i wydajność po izolacji. [7]

Chromatografia rozdziela składniki, ale nie odpowiada na każde pytanie

Wysokosprawna chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) jest szeroko stosowana do analizy i oczyszczania peptydów.

Różne cząsteczki w odmienny sposób oddziałują z fazą stacjonarną i ruchomą.

W odpowiednich warunkach różnice te umożliwiają rozdzielanie składników mieszaniny.

Chromatografia analityczna i preparatywna mają powiązane, ale odmienne zastosowania.

Analityczna HPLC służy przede wszystkim do badania składu próbki.

Preparatywna HPLC jest wykorzystywana do fizycznego zbierania rozdzielonych składników.

Chromatogram może dostarczać wielu wartościowych informacji.

Dużego głównego piku lub wysokiego procentowego udziału jego powierzchni nie należy jednak traktować jako pełnej charakterystyki molekularnej.

Wyniki chromatografii zależą między innymi od:

• rodzaju kolumny;
• fazy ruchomej;
• gradientu;
• teploty;
• metody detekcji;
• długości fali;
• przygotowania próbki;
• sposobu integracji pików;
• rozdzielczości;
• właściwości zanieczyszczeń.

Dwa związki mogą potencjalnie eluować w tym samym czasie.

Niektóre składniki próbki mogą również różnie reagować na zastosowany detektor.

Dlatego wysoka czystość powierzchniowa w HPLC nie jest równoznaczna z pełnym potwierdzeniem tożsamości molekularnej.

Badania izobarycznych zanieczyszczeń peptydowych oraz analizy chiralnej pokazują, dlaczego mogą być potrzebne uzupełniające metody analityczne. [12] [13]

Metoda analityczna musi odpowiadać konkretnemu pytaniu strukturalnemu.

Tożsamość, czystość i zawartość oznaczają różne rzeczy

W charakterystyce peptydów szczególnie ważne są trzy pojęcia.

Tożsamość odpowiada na pytanie:

Czy w próbce znajduje się zamierzona cząsteczka?

Czystość odpowiada na pytanie:

Jakie inne składniki znajdują się w próbce lub jaka część mierzonego sygnału odpowiada głównemu składnikowi?

Zawartość odpowiada na pytanie:

Ile rzeczywistego peptydu znajduje się w próbce?

Na te pytania nie zawsze można odpowiedzieć za pomocą jednego pomiaru.

Materiał zawierający peptyd może również zawierać:

• wodę;
• antionové;
• sole;
• zbytky rozpouštědel;
• inne składniki związane z procesem;
• zanieczyszczenia.

Całkowita masa odważonego materiału nie musi więc odpowiadać masie samego peptydu.

Podobnie zgodność zmierzonej masy cząsteczkowej z wartością teoretyczną nie potwierdza:

• kompletnej sekwencji aminokwasowej;
• prawidłowej łączności poszczególnych reszt;
• integralności stereochemicznej;
• rozložení disulfidových můstků;
• fałdowania;
• braku izobarycznych zanieczyszczeń.

Spektrometria mas może dostarczać silnych dowodów dotyczących masy cząsteczkowej.

Tandemowa spektrometria mas i inne techniki strukturalne mogą dostarczać dodatkowych informacji o sekwencji.

Metody chiralne pozwalają analizować zagadnienia stereochemiczne, których nie można rozstrzygnąć zwykłym pomiarem masy.

W jednym z badań analitycznych uwzględniono nawet racemizację powstającą podczas przygotowania próbki. Pokazuje to kolejną ważną zasadę: sama procedura analityczna może powodować artefakty, jeśli nie zostanie odpowiednio zaprojektowana. [13]

Fałdowanie i aktywność mogą wymagać osobnego potwierdzenia

W przypadku strukturalnie ograniczonych peptydów i małych białek prawidłowa sekwencja oraz masa cząsteczkowa nadal mogą być niewystarczające do potwierdzenia zamierzonej struktury końcowej.

Dodatkowe pytania mogą obejmować:

• Czy powstały właściwe mostki disiarczkowe?
• Czy cząsteczka przyjęła oczekiwaną konformację?
• Czy cyklizacja jest kompletna?
• Czy obecne są izomery strukturalne?
• Czy syntetyczna cząsteczka wykazuje oczekiwaną aktywność w określonym teście eksperymentalnym?

W badaniu syntezy BPTI wykorzystano kilka metod analitycznych i biofizycznych wraz z oceną hamowania trypsyny. [3]

Łączne wyniki wspierały zgodność syntetycznego materiału o naturalnej sekwencji z naturalnym białkiem w zakresie badanych kryteriów.

Test aktywności odpowiada jednak na określone pytanie funkcjonalne.

Nie zastępuje analizy zanieczyszczeń.

Podobnie podobna aktywność w jednym teście nie potwierdza pełnej równoważności wszystkich właściwości biologicznych, strukturalnych czy produkcyjnych.

Skalowanie produkcji zmienia więcej niż tylko ilość materiału

Zwiększenie skali produkcji nie polega wyłącznie na proporcjonalnym zwiększeniu ilości wszystkich odczynników.

Procesy fizyczne mogą zachowywać się inaczej przy większej skali.

Znaczenie mogą mieć:

• mieszanie;
• wymiana ciepła;
• rozprowadzanie odczynników;
• dyfuzja;
• pęcznienie żywicy;
• ciśnienie;
• filtracja;
• gospodarka rozpuszczalnikami;
• srážení;
• rozpuszczalność półproduktów;
• transport masy;
• możliwości systemu oczyszczania.

Czynniki te mogą wpływać zarówno na przebieg reakcji, jak i na powstawanie zanieczyszczeń.

Oczyszczanie na późniejszych etapach również może stać się wąskim gardłem całej produkcji.

Zwiększenie szybkości syntezy ma ograniczone znaczenie, jeśli system oczyszczania nie jest w stanie skutecznie rozdzielić powstających zanieczyszczeń lub odzyskać produktu o wymaganej jakości.

W analizie przemysłowej obejmującej 40 procesów syntezy peptydów z 14 firm farmaceutycznych oceniano zużycie materiałów podczas syntezy, oczyszczania i izolacji. [14]

Badanie pokazuje, dlaczego ocenę produkcji należy prowadzić dla całego procesu.

Nie oznacza jednak, że każda fabryka, sekwencja lub technologia produkcyjna osiąga identyczne wyniki.

Jakość produkcji jest wynikiem wielu elementów kontroli

Wiarygodna produkcja peptydów wymaga czegoś więcej niż uzyskania jednego satysfakcjonującego wyniku analitycznego.

Kontrolowany proces zazwyczaj obejmuje kilka powiązanych elementów:

zdefiniowana cząsteczka docelowa → odpowiednie materiały wyjściowe → kontrolowana synteza → kontrolowane oczyszczanie → właściwe pobieranie próbek → zwalidowana lub odpowiednia do celu analiza → dokumentacja partii.

Dokumentacja partii łączy wyniki analityczne z materiałem, który rzeczywiście został wyprodukowany.

Certyfikat analizy (COA) podsumowuje wybrane wyniki badań określonej partii.

Jego wartość informacyjna zależy od:

• rodzaju wykonanych badań;
• zastosowanych metod;
• przydatności tych metod;
• specyfikacji;
• identyfikacji próbki;
• możliwości prześledzenia partii;
• potwierdzenia, że raportowane wyniki rzeczywiście dotyczą danego materiału.

Pojedyncza wartość określana jako „czystość” nie może samodzielnie potwierdzić:

• pełnej tożsamości molekularnej;
• zawartości peptydu;
• integralności stereochemicznej;
• poziomu pozostałości rozpuszczalników;
• zawartości wody;
• składu przeciwjonów;
• właściwości mikrobiologicznych;
• fałdowania;
• biologické aktivity;
• przydatności do określonego celu.

Odpowiedni zestaw analiz zależy od zamierzonego zastosowania materiału.

Peptyd wykorzystywany jako analityczny materiał odniesienia, odczynnik badawczy stosowany w eksperymencie komórkowym oraz materiał znajdujący się na etapie rozwoju farmaceutycznego mogą wymagać odpowiedzi na inne pytania jakościowe.

Dowody analityczne należy więc interpretować w jasno określonym kontekście, a nie jako uniwersalne potwierdzenie jakości.

Ocena zrównoważenia środowiskowego musi obejmować cały proces

Synteza peptydów może wymagać znacznych ilości rozpuszczalników i odczynników.

Ocena wpływu środowiskowego powinna więc uwzględniać znacznie więcej niż sam etap sprzęgania.

Do istotnych elementów mogą należeć:

• przygotowanie bloków budulcowych;
• odczynniki sprzęgające;
• odczynniki do odbezpieczania;
• promývání;
• odštěpování;
• obróbka produktu;
• chromatografia;
• wymiana rozpuszczalników;
• izolacja;
• sušení;
• gospodarowanie odpadami.

Zmniejszenie obciążenia środowiskowego może wymagać równoczesnej poprawy kilku etapów.

W opublikowanej analizie dotyczącej produkcji peptydów omówiono problemy związane zarówno z syntezą, jak i oczyszczaniem oraz wskazano potrzebę ulepszania całego projektu procesu. [15]

Jako publikacja perspektywiczna nie stanowi ona kontrolowanego bezpośredniego porównania dowodzącego, że jedna konkretna technologia zawsze jest bardziej przyjazna środowisku.

Podobně:

szybsza synteza nie oznacza automatycznie bardziej ekologicznej syntezy,

a mniejsze zużycie rozpuszczalników podczas samej syntezy nie oznacza automatycznie mniejszego wpływu całego procesu produkcyjnego.

Porównania środowiskowe wymagają stosowania spójnych granic analizy i najlepiej powinny odnosić zużycie zasobów do określonej ilości wyizolowanego i scharakteryzowanego produktu końcowego.

Často kladené otázky

1. Czym różni się synteza peptydów na fazie stałej od syntezy w fazie ciekłej?

W syntezie na fazie stałej rosnący peptyd pozostaje przyłączony do nierozpuszczalnego nośnika, natomiast w klasycznej syntezie w roztworze półprodukt peptydowy pozostaje rozpuszczony i zazwyczaj musi być odzyskiwany na podstawie swoich właściwości fizycznych i chemicznych. W węższym znaczeniu LPPS rozpuszczony rosnący łańcuch posiada dodatkowo rozpuszczalny znacznik lub nośnik ułatwiający późniejsze rozdzielanie. Badania syntezy znakowanej pokazują jedną ze strategii łączenia chemii roztworowej z odzyskiwaniem poprzez wytrącanie, natomiast literatura dotycząca LPPS odróżnia takie rozwiązania zarówno od klasycznej syntezy w roztworze, jak i od SPPS. Żadna metoda nie jest z definicji optymalna dla każdego peptydu. Podstawowa różnica dotyczy sposobu fizycznego prowadzenia i rozdzielania rosnącego łańcucha podczas kolejnych etapów syntezy. [8] [9]

2. Dlaczego podczas syntezy peptydów mogą powstawać zanieczyszczenia?

Zanieczyszczenia mogą powstawać dlatego, że zamierzone reakcje nie zawsze zachodzą ilościowo, a inne grupy funkcyjne mogą uczestniczyć w niepożądanych reakcjach. Niepełne sprzęganie może prowadzić do sekwencji delecyjnych, niepełne odbezpieczanie może zakłócać dalsze składanie łańcucha, a niektóre sekwencje są podatne na zmiany stereochemiczne, powstawanie aspartimidu, utlenianie, przegrupowania lub produkty uboczne związane z odszczepianiem. Badania syntezy Fmoc oraz analizy strukturalnej syntetycznych zanieczyszczeń peptydowych dokumentują kilka takich przykładów. [11] [12] Częstość i znaczenie poszczególnych zanieczyszczeń zależą od sekwencji i procesu, dlatego automatyzacji syntezy nie należy utożsamiać z całkowitym brakiem błędów chemicznych.

3. Jaką rolę pełni żywica w syntezie peptydów?

Żywica utrzymuje rosnący peptyd, podczas gdy rozpuszczalne odczynniki i wiele produktów ubocznych można usuwać pomiędzy kolejnymi etapami syntezy. Znacznie upraszcza to powtarzające się składanie łańcucha, ale żywica nie jest wyłącznie mechanicznym uchwytem. Jej pęcznienie, stopień obsadzenia, architektura polimeru, zgodność z rozpuszczalnikami i dostępność miejsc reakcji mogą wpływać na skuteczność docierania odczynników do przyłączonego peptydu. W badaniach z wykorzystaniem reaktora ze zmiennym złożem monitorowano zachowanie żywicy podczas analizy agregacji i efektywności sprzęgania. [4] Takie monitorowanie nie eliminuje błędów sekwencji, ale pokazuje, dlaczego fizyczny stan żywicy może być istotną zmienną procesową.

4. Do czego służy żywica Wanga w syntezie peptydów?

Nośniki typu Wang są powszechnie związane z przygotowywaniem peptydów uwalnianych po odpowiednim odszczepieniu z C-końcem w postaci kwasu karboksylowego. Dokładny produkt końcowy zależy jednak od linkera, architektury nośnika i zastosowanej chemii odszczepiania, a nie tylko od nazwy żywicy. Badacze przedstawili również specjalistyczną metodę przekształcania materiału peptydyl-Wang-TentaGel w hydrazydy peptydowe, które mogą służyć jako użyteczne półprodukty syntetyczne. [5] Alternatywna reakcja nie zmienia znaczenia standardowego odszczepiania z żywicy Wanga. Pokazuje natomiast, dlaczego podczas przewidywania produktu należy analizować cały system nośnika i warunki reakcji.

5. Czy SPPS buduje peptyd od N-końca czy od C-końca?

Klasyczna etapowa SPPS zazwyczaj rozpoczyna się od przyłączenia C-końcowej reszty do nośnika, po czym łańcuch jest wydłużany w kierunku N-końca. Jest to kierunek przeciwny do standardowego wydłużania łańcucha na rybosomie, gdzie białko rośnie poprzez dodawanie kolejnych aminokwasów do C-końca. Synteza BPTI jest przykładem wykorzystania zabezpieczonych bloków budulcowych i nośnika przed późniejszym uwolnieniem, oczyszczaniem i fałdowaniem produktu. [3] Istnieją jednak specjalistyczne strategie chemii peptydów wykorzystujące inne rozwiązania, dlatego budowanie od C- do N-końca należy określać jako klasyczne podejście SPPS, a nie bezwzględną zasadę wszystkich metod syntezy.

6. Dlaczego grupy ochronne są potrzebne?

Aminokwasy często zawierają kilka reaktywnych grup funkcyjnych. Grupy ochronne tymczasowo zapobiegają reakcji wybranych miejsc, pozostawiając odpowiednie miejsce dostępne w konkretnym etapie syntezy. Pomaga to kontrolować kolejność i sposób łączenia reszt. Bez właściwej ochrony konkurencyjne reakcje mogłyby prowadzić do powstawania złożonych mieszanin lub produktów o zmienionej strukturze. Badania dotyczące powstawania aspartimidu pokazały, że zmiana chemii ochrony grupy karboksylowej może ograniczać ważną reakcję uboczną w analizowanych sekwencjach. [2] Grupy ochronne nie gwarantują idealnego przebiegu syntezy, lecz zapewniają selektywną kontrolę chemiczną, która musi pozostać zgodna ze wszystkimi istotnymi etapami procesu.

7. Czym różnią się Fmoc i Boc?

Fmoc i Boc są szeroko stosowanymi tymczasowymi grupami chroniącymi grupę aminową, ale reagują na inne warunki chemiczne. Fmoc jest zazwyczaj usuwany w środowisku zasadowym, natomiast Boc jest wrażliwy na kwasy. Różnica ta wpływa na sposób łączenia ich z ochroną łańcuchów bocznych, linkerami i pozostałymi etapami syntezy. Synteza oparta na Fmoc jest szeroko wykorzystywana we współczesnej SPPS, ale badania wykazały również możliwość występowania zależnych od sekwencji reakcji ubocznych w takich warunkach. [11] W praktyce bardziej użyteczne jest więc porównywanie całych strategii ochrony i ich zgodności z daną sekwencją niż rozpatrywanie wyłącznie nazw dwóch grup ochronnych.

8. Co oznacza ochrona ortogonalna?

Ochrona ortogonalna oznacza, że jedną grupę ochronną można usunąć w warunkach, w których inna potrzebna grupa ochronna pozostaje wystarczająco stabilna, aby można było kontynuować syntezę. Pozwala to odsłaniać różne miejsca reaktywne na określonych etapach. Koncepcja ta ma podstawowe znaczenie podczas kontrolowanej syntezy złożonych peptydów. Ortogonalność jest jednak zależna od warunków, a nie absolutna: wielokrotna ekspozycja, charakter sekwencji i parametry reakcji nadal mogą prowadzić do reakcji ubocznych. Badania alternatywnych sposobów ochrony grup karboksylowych pokazują, jak strategię ochrony można modyfikować w celu kontrolowania trudnej chemii peptydowej. [2]

9. Czym jest sekwencja delecyjna?

Sekwencja delecyjna to peptyd pozbawiony jednej lub kilku reszt obecnych w zamierzonej sekwencji docelowej. Może powstać, gdy etap sprzęgania aminokwasu nie zachodzi całkowicie, ale nieprzereagowany łańcuch pozostaje przyłączony do nośnika i uczestniczy w kolejnych cyklach. Ponieważ nieprawidłowy łańcuch nadal pozostaje związany z żywicą, zwykłe przemywanie nie musi go usunąć. Badania monitorowania SPPS w czasie rzeczywistym wskazują niepełne tworzenie wiązań amidowych jako ważny problem procesowy. [4] Sekwencja delecyjna jest więc problemem związanym ze strukturą i tożsamością produktu, a nie jedynie pozostałością odczynnika.

10. Czy dwa zanieczyszczenia peptydowe mogą mieć taką samą masę cząsteczkową?

Tak. Różne struktury molekularne mogą mieć identyczną lub nierozróżnialną masę nominalną. Z tego powodu sama zgodność masy nie potwierdza pełnej tożsamości cząsteczki. W badaniach syntetycznego peptydu będącego substratem reniny zidentyfikowano izobaryczne składniki zanieczyszczeń, w których modyfikacje występowały w różnych pozycjach. Derywatyzacja i tandemowa spektrometria mas dostarczyły dodatkowych informacji strukturalnych. [12] Przykład ten pokazuje, dlaczego zgodność obserwowanej masy z oczekiwaną nie może samodzielnie potwierdzić właściwej sekwencji, łączności, stereochemii ani braku strukturalnie podobnych izomerów.

11. Czym są epimeryzacja i racemizacja w syntezie peptydów?

Epimeryzacja i racemizacja dotyczą niepożądanych zmian konfiguracji stereochemicznej. Mogą one zachodzić bez zmiany nominalnej sekwencji aminokwasowej lub masy cząsteczkowej, dlatego zwykły pomiar masy może nie wykazać różnicy strukturalnej. W badaniach syntezy Fmoc wspomaganej mikrofalami zidentyfikowano reszty podatne na zmiany stereochemiczne i wykazano, że modyfikacja warunków reakcji może ograniczać takie procesy. [11] Ryzyko zależy od bloku budulcowego, sekwencji i warunków procesu. Jakość stereochemiczna wymaga więc metod analitycznych zdolnych do oceny konfiguracji, a nie może być wnioskowana wyłącznie na podstawie masy cząsteczkowej.

12. Czym jest powstawanie aspartimidu?

Powstawanie aspartimidu jest niepożądaną reakcją związaną z określonymi sekwencjami zawierającymi asparaginian. Powstanie cyklicznego półproduktu może prowadzić do kolejnych produktów o zmienionej łączności szkieletu lub stereochemii, zmniejszając wydajność i utrudniając oczyszczanie. Badacze analizowali alternatywne strategie ochrony zaprojektowane w celu ograniczenia tej reakcji w wybranych peptydach i białkach. [2] Wyniki nie wskazują jednego uniwersalnego rozwiązania dla wszystkich sekwencji zawierających asparaginian. Pokazują natomiast, dlaczego projektowanie syntezy i strategii kontroli zanieczyszczeń musi uwzględniać specyficzne zachowanie chemiczne danej sekwencji.

13. Czy wysoka czystość HPLC potwierdza prawidłową tożsamość peptydu?

Nie. Czystość HPLC opisuje próbkę w ramach konkretnego rozdziału chromatograficznego, zastosowanego detektora i sposobu analizy danych. Wysoki udział powierzchni głównego piku może być wartościowym dowodem, że próbka jest zdominowana przez jeden chromatograficznie rozdzielony składnik, ale nie potwierdza samodzielnie pełnej tożsamości molekularnej. Współeluujące zanieczyszczenia, stereoizomery i inne warianty mogą wymagać dodatkowych technik. W badaniach analizy chiralnej peptydów wykorzystano specjalnie zaprojektowany proces, który uwzględniał również zmiany stereochemiczne powstające podczas przygotowania próbki. [13] Tożsamość i czystość należy więc traktować jako powiązane, ale odrębne pytania analityczne.

14. Czy wydajność produktu oczyszczonego oznacza to samo co czystość?

Nie. Wydajność produktu oczyszczonego lub wyizolowanego określa ilość odzyskanego materiału docelowego względem zdefiniowanej ilości początkowej lub teoretycznej. Czystość opisuje natomiast skład odzyskanego materiału według określonej metody analitycznej. Synteza może prowadzić do uzyskania stosunkowo niewielkiej ilości produktu o bardzo wysokiej czystości albo dużej ilości materiału surowego zawierającego znaczną ilość zanieczyszczeń. W badaniach automatycznej syntezy przepływowej czystość surowego produktu i wydajność po izolacji raportowano oddzielnie. [7] Rozdzielenie tych parametrów zapobiega błędnemu traktowaniu wysokiej wartości jednego z nich jako dowodu wysokiej wartości drugiego.

15. Czy długie peptydy można wytwarzać poprzez łączenie krótszych fragmentów?

Tak. W strategii fragmentowej krótsze segmenty peptydowe mogą zostać przygotowane oddzielnie, a następnie połączone za pomocą odpowiedniej chemii. Natwywna ligacja chemiczna była ważnym przykładem, w którym niezabezpieczone fragmenty peptydowe połączono w sposób prowadzący do powstania naturalnego wiązania szkieletu peptydowego, a następnie uzyskano pofałdowane białko. [10] Nie oznacza to, że dowolne fragmenty peptydowe mogą łączyć się spontanicznie. Należy uwzględnić strukturę fragmentów, chemię łączenia, wybór miejsca połączenia, rozpuszczalność, stereochemię i wymagania dotyczące oczyszczania. Składanie fragmentów jest więc alternatywną strategią projektowania syntezy, a nie automatycznym rozwiązaniem problemów związanych z długimi peptydami.

16. Czy szybsza zautomatyzowana synteza eliminuje potrzebę oczyszczania?

Nie. Szybsze zautomatyzowane lub przepływowe składanie skraca czas określonych etapów syntezy, ale nie dowodzi, że każda powstała cząsteczka ma zamierzoną strukturę. W badaniach szybkiej syntezy przepływowej nadal charakteryzowano materiał surowy i stosowano późniejsze oczyszczanie, a w kolejnych pracach dotyczących automatyzacji osobno porównywano czystość surowego materiału i wydajność po izolacji. [6] [7] Dobre wyniki systemu dla badanych sekwencji nie gwarantują również identycznych rezultatów dla każdego nowego celu. Przyspieszona synteza nadal musi być połączona z odpowiednim oczyszczaniem, potwierdzeniem tożsamości, analizą zanieczyszczeń i charakterystyką końcową.

17. Dlaczego zwiększenie skali produkcji jest bardziej skomplikowane niż przygotowanie większej partii?

Zwiększenie skali zmienia warunki fizyczne i chemiczne, a nie tylko ilość materiału. Mieszanie, wymiana ciepła, pęcznienie żywicy, dystrybucja odczynników, ciśnienie, filtracja, obsługa rozpuszczalników, rozpuszczalność półproduktów i możliwości systemu oczyszczania mogą zachowywać się inaczej przy większej objętości produkcji. W analizie przemysłowej 40 procesów peptydowych osobno oceniano syntezę, oczyszczanie i izolację podczas analizy zużycia materiałów. [14] Wyniki pokazują, dlaczego produkcję trzeba rozpatrywać jako kompletny proces. Skalowalna metoda musi powtarzalnie prowadzić do uzyskania scharakteryzowanego materiału na wszystkich etapach, a nie tylko większej ilości surowego peptydu.

18. Czy peptyd jest gotowy od razu po złożeniu prawidłowej sekwencji?

Niekoniecznie. Złożenie łańcucha tworzy szkielet sekwencji tylko w takim zakresie, w jakim potwierdzają to proces i dane analityczne. W zależności od cząsteczki mogą być nadal potrzebne odbezpieczanie, odszczepianie, cyklizacja, utlenianie, tworzenie mostków disiarczkowych, fałdowanie, koniugacja, oczyszczanie i charakterystyka. Synteza BPTI stanowi dobry przykład procesu, w którym po złożeniu liniowej sekwencji następowało oczyszczanie i tworzenie pofałdowanej struktury zawierającej mostki disiarczkowe. [3] Określenie „gotowy peptyd” powinno więc odnosić się do formy molekularnej wymaganej w danym kontekście naukowym, a nie tylko do zakończenia etapowego dodawania aminokwasów.

19. Czy prawidłowa masa cząsteczkowa potwierdza prawidłową sekwencję peptydu?

Nie. Zgodność masy cząsteczkowej jest wartościowym dowodem, ale nie może samodzielnie potwierdzić pełnej sekwencji ani struktury molekularnej. Struktury izobaryczne mogą mieć tę samą masę, a różnice stereochemiczne mogą w ogóle nie powodować zmiany masy cząsteczkowej. Badania zanieczyszczeń syntetycznych peptydów pokazały, że rozróżnienie strukturalnie odmiennych składników może wymagać tandemowej spektrometrii mas i dodatkowych analiz. [12] W przypadku pytań dotyczących integralności stereochemicznej mogą być potrzebne również metody chiralne. [13] Masę cząsteczkową należy więc traktować jako jeden z elementów oceny tożsamości, a nie jej pełne potwierdzenie.

20. Dlaczego oczyszczanie należy traktować jako część produkcji peptydu, a nie tylko końcowy dodatek?

Oczyszczanie decyduje o tym, czy docelowy peptyd można skutecznie oddzielić od sekwencji delecyjnych, produktów ubocznych, pozostałości odczynników, strukturalnie podobnych zanieczyszczeń i innych składników powstałych podczas syntezy. Metoda pozwalająca bardzo szybko wytwarzać duże ilości surowego materiału może nadal być niepraktyczna, jeśli nie da się skutecznie odzyskać docelowego produktu o wymaganej jakości. Z tego powodu analizy przemysłowe procesów peptydowych uwzględniają razem syntezę, oczyszczanie i izolację. [14] Efektywność produkcji należy ostatecznie oceniać na podstawie ilości i właściwości wyizolowanego materiału końcowego, a nie wyłącznie szybkości syntezy.

Ograniczenia przy porównywaniu metod syntezy peptydów

Podczas interpretowania badań porównujących technologie produkcji peptydów należy pamiętać o kilku istotnych ograniczeniach.

Po pierwsze, sekwencja silnie wpływa na trudność syntezy. Metoda sprawdzająca się dla jednego peptydu nie musi działać tak samo dla innego. Agregacja, hydrofobowość, skład aminokwasowy, długość, tendencja do tworzenia struktur drugorzędowych i podatność na reakcje uboczne mogą zmieniać zachowanie procesu. [1] [4]

Po drugie, czystość materiału surowego, wydajność po izolacji, czystość końcowa i zawartość peptydu są różnymi parametrami. Porównywanie metod wyłącznie na podstawie jednego z nich może dawać niepełny obraz efektywności produkcji. [7]

Po trzecie, szybkie składanie łańcucha nie oznacza szybkiej produkcji całego materiału. Odszczepianie, oczyszczanie, izolacja, końcowe kształtowanie struktury, badania analityczne i dokumentacja również wpływają na całkowity czas produkcji. [6] [7]

Po czwarte, czystość analityczna zależy od zastosowanej metody. HPLC, spektrometria mas, tandemowa spektrometria mas i analiza chiralna odpowiadają na różne pytania. Jeden wynik analityczny nie musi potwierdzać pełnej tożsamości strukturalnej. [12] [13]

Po piąte, skala wpływa na zachowanie procesu. Wyników syntezy laboratoryjnej nie można automatycznie przenosić na produkcję przemysłową bez oceny mieszania, transportu masy, możliwości oczyszczania, zużycia materiałów i innych czynników zależnych od skali. [14]

Po szóste, historyczne porównania ekonomiczne mogą z czasem tracić aktualność. Koszty odczynników, poziom automatyzacji, technologie ekspresji, wyposażenie do oczyszczania, odzyskiwanie rozpuszczalników i infrastruktura produkcyjna stale się rozwijają. Starsze analizy kosztów mogą nadal mieć znaczenie naukowe, ale nie muszą odzwierciedlać aktualnej ekonomiki rynku. [1]

Po siódme, porównania środowiskowe wymagają spójnych granic analizy. Ocena zużycia rozpuszczalników podczas samego składania łańcucha przy jednoczesnym pominięciu oczyszczania i izolacji może prowadzić do mylących wniosków dotyczących zrównoważenia procesu. [14] [15]

Wreszcie sama nazwa metody nie określa jakości produktu. SPPS, synteza w roztworze, LPPS, ligacja fragmentów oraz ekspresja biologiczna mogą prowadzić do uzyskania materiału wysokiej jakości, jeśli proces został odpowiednio zaprojektowany i kontrolowany. Żadna z tych metod nie gwarantuje jednak automatycznie właściwej tożsamości, czystości, stereochemii, fałdowania czy przydatności do konkretnego zastosowania.

Souhrn

Syntezę peptydów najlepiej rozumieć jako kontrolowany proces wytwarzania cząsteczek, a nie po prostu tworzenie wiązań peptydowych.

Celem jest zbudowanie określonej sekwencji aminokwasowej przy jednoczesnym kontrolowaniu sposobu połączenia reszt, chemii grup ochronnych, stereochemii, reakcji ubocznych i wszelkich dodatkowych wymagań strukturalnych.

Synteza peptydów na fazie stałej utrzymuje rosnący łańcuch na nierozpuszczalnym nośniku, dzięki czemu powtarzane etapy sprzęgania i przemywania dobrze nadają się do automatyzacji. Zalety związane z powtarzalnym składaniem nie eliminują jednak problemów takich jak niepełne reakcje, agregacja, sekwencje delecyjne czy zależne od sekwencji reakcje uboczne. [4] [6] [7]

Klasyczna synteza w roztworze utrzymuje półprodukty peptydowe w fazie ciekłej i może zapewniać większą elastyczność w izolowaniu oraz charakteryzowaniu poszczególnych produktów pośrednich. Wielokrotne rozdzielanie oraz pogarszająca się rozpuszczalność mogą jednak stać się poważnymi ograniczeniami.

Metody syntezy w fazie ciekłej z rozpuszczalnymi znacznikami próbują połączyć chemię roztworową z zaprojektowanymi strategiami odzyskiwania materiału. Mogą więc stanowić dodatkową możliwość w przypadku sekwencji i problemów produkcyjnych, dla których klasyczna SPPS nie jest optymalna. [8] [9]

Dłuższe lub szczególnie trudne cząsteczki można również przygotowywać poprzez składanie fragmentów, w tym natywną ligację chemiczną, zamiast polegać wyłącznie na nieprzerwanym dodawaniu kolejnych reszt aminokwasowych. [10]

Niezależnie od wybranej metody składania efektywność sprzęgania i chemia grup ochronnych pozostają kluczowe, ponieważ niewielkie nieefektywności i reakcje uboczne mogą kumulować się podczas kolejnych etapów syntezy. Powstawanie aspartimidu, sekwencje delecyjne i zmiany stereochemiczne pokazują, dlaczego sama zamierzona sekwencja nie opisuje wszystkiego, co może powstać podczas procesu. [2] [11] [12]

Praca nie kończy się również wraz ze złożeniem łańcucha.

Oczyszczanie decyduje o tym, czy produkt docelowy można oddzielić od innych składników.

Następnie odpowiednio dobrane metody analityczne odpowiadają na odrębne pytania dotyczące tożsamości, czystości, zawartości, stereochemii, konformacji oraz – jeśli ma to znaczenie – aktywności funkcjonalnej. [3] [12] [13]

Zwiększenie skali produkcji wprowadza kolejne zagadnienia dotyczące transportu masy, zachowania żywicy, zużycia rozpuszczalników, filtracji, możliwości oczyszczania, powtarzalności procesu i jego wpływu środowiskowego. Z tego powodu przemysłowa ocena procesu powinna obejmować razem syntezę, oczyszczanie i izolację, a nie koncentrować się wyłącznie na szybkości sprzęgania. [14] [15]

Najważniejsza zasada jest następująca:

skuteczna produkcja peptydu wymaga kontroli całego procesu – od projektu molekularnego i tworzenia wiązań aż po oczyszczanie oraz charakterystykę strukturalną. Uzyskanie łańcucha o oczekiwanej nominalnej masie lub wysokiego głównego piku chromatograficznego stanowi wartościowy dowód, ale żaden z tych parametrów samodzielnie nie potwierdza pełnej tożsamości molekularnej ani jakości procesu produkcyjnego.

Zastrzeżenie

Artykuł ma wyłącznie charakter edukacyjny i naukowo-informacyjny. Opisuje ogólne zasady chemii peptydów, syntezy na fazie stałej, syntezy w roztworze i w fazie ciekłej, strategii grup ochronnych, sprzęgania, oczyszczania, charakterystyki analitycznej, procesów produkcyjnych oraz przykłady pochodzące z opublikowanych badań. Nie jest protokołem laboratoryjnym, instrukcją produkcyjną, poradą medyczną, przewodnikiem dotyczącym dawkowania lub podawania ani certyfikatem jakości jakiegokolwiek konkretnego produktu peptydowego. Wyniki eksperymentalne należy interpretować w kontekście sekwencji, zastosowanych metod, skali procesu, technik analitycznych i ograniczeń poszczególnych badań.

Odkazy

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K., & Perczel, A. (2016). Bacterial expression and/or solid phase peptide synthesis of 20-40 amino acid long polypeptides and miniproteins, the case study of Class B GPCR ligands. Current Protein & Peptide Science, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Prevention of aspartimide formation during peptide synthesis using cyanosulfurylides as carboxylic acid-protecting groups. Nature Communications, 11(1), Article 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). Solid-phase synthesis of bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) and two analogues. A chemical approach for evaluating the role of disulfide bridges in protein folding and stability. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. PubMed record
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). Real-time monitoring of solid-phase peptide synthesis using a variable bed flow reactor. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F., & Becker, C. F. W. (2015). Efficient generation of peptide hydrazides via direct hydrazinolysis of Peptidyl-Wang-TentaGel resins. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Rapid flow-based peptide synthesis. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2017). A fully automated flow-based approach for accelerated peptide synthesis. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G., & Albericio, F. (2022). Liquid-phase peptide synthesis (LPPS): A third wave for the preparation of peptides. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T., & Fukui, T. (2012). Novel diphenylmethyl-derived amide protecting group for efficient liquid-phase peptide synthesis: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., & Kent, S. B. (1994). Synthesis of proteins by native chemical ligation. Science, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Characterization of impurities in a synthetic renin substrate peptide by fast-atom bombardment mass spectrometry and hybrid tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G., & Crowther, J. B. (1995). Peptide chiral purity determination: Hydrolysis in deuterated acid, derivatization with Marfey’s reagent and analysis using high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Process mass intensity (PMI): A holistic analysis of current peptide manufacturing processes informs sustainability in peptide synthesis. The Journal of Organic Chemistry, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Sustainability challenges in peptide synthesis and purification: From R&D to production. The Journal of Organic Chemistry, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001