Syntéza peptidů: metoda na pevné fázi, v roztoku a metody produkce

Syntéza peptidů je kontrolovaný proces tvorby aminokyselinových řetězců o určité sekvenci. Při chemické syntéze se vybrané aminokyseliny spojují pomocí peptidových vazeb, a zároveň kontrolovat jiné reaktivní skupiny přítomné v těchto molekulách. Účelem tedy není pouze spojení aminokyselin, ale získání konkrétní molekulární struktury o určité sekvenci, stereochemii, struktuře konců řetězce a – je-li to vyžadováno – s dalšími strukturálními vlastnostmi.

Mezi hlavní metody patří solid-phase peptide synthesis (SPPS), klasická syntéza v roztoku a novější metody liquid-phase peptide synthesis (LPPS) využívající rozpustné nosiče nebo molekulární značky. Výzkumné laboratoře a výrobní závody mohou také kombinovat různé přístupy, připravovat kratší fragmenty zvlášť a ty pak vzájemně spojovat, případně využívat biologickou expresi, pokud je pro danou sekvenci vhodnější.

Porovnání chemické syntézy s bakteriovou expresí polypeptidů složených z 20 až 40 aminokyselinových zbytků ukazuje důležitý princip: praktická volba metody výroby závisí na konkrétní molekule, její sekvenci, sklonu k agregaci, požadovaných modifikacích, rozsahu výroby a analytických požadavcích. [1]

Získání požadované aminokyselinové sekvence je pouze jednou z fází výroby peptidu.

Celý proces může zahrnovat:

navrhování sekvencí → příprava stavebních bloků → ochrana funkčních skupin → spojování → odstranění chránicích skupin → skládání řetězce → odštěpení nebo spojování fragmentů → konečné tvarování struktury → čištění → potvrzení totožnosti → analýza nečistot → stanovení obsahu → konečná charakteristika.

U některých peptidů jsou nutné také další kroky, jako je cyklizace, tvorba disulfidových můstků, stáčecí proces (či konformace), konjugace nebo jiné chemické modifikace.

Z toho důvodu správné sestavení řetězce automaticky neznamená, že konečný materiál má správnou identitu, čistotu, stereochemii, konformaci, stabilitu nebo jiné požadované vlastnosti.

Co je to peptidová syntéza?

Tvorba specifické aminokyselinové sekvence

Peptid skládá se z aminokyselinových zbytku spojených peptidovými vazbami.

Cílem syntézy peptidů je vytvoření těchto vazeb v předem stanoveném pořadí, často za současné kontroly:

• druhu aminokyselin;
• poradí aminokyselin v sekvenci;
• stereochemie;
• N-koncové struktury;
• C-koncové struktury;
• modifikace postranních řetězců;
• rozložení disulfidových můstků;
• cyklizace;
• jiných požadovaných strukturálních vlastností.

Sekvence má zásadní význam, protože identické aminokyselinové složení může vést ke vzniku různých molekul, pokud jsou aminokyselinová v jiném pořadí.

Tvrzení, že daná molekula je „peptid složený z pěti aminokyselin”, tedy poskytuje velmi málo informací o její skutečné struktuře. Aby bylo možné molekulu správně popsat, je třeba znát druh aminokyselin, jejich pořadí, stereochemii, koncové skupiny a případné další modifikace.

Dva peptidy tak mohou mít úplně stejné aminokyselinové složení, a přesto být různými molekulárními strukturami.

Další rozdíly mohou vyplývat z modifikací konců řetězce, přítomnosti disulfidových můstků, cyklické kostry, změn v postranních řetězcích nebo odlišné stereochemické konfigurace.

Chemická syntéza peptidů obvykle využívá aminokyseliny, jejichž reaktivní skupiny byly selektivně chráněny.

Dočasné ochranné skupiny umožňují vytvoření konkrétní zamýšlené chemické vazby za současného omezení konkurenčních reakcí na jiných místech molekuly.

V dalších plánovaných fázích syntézy jsou tyto skupiny odstraněny nebo pozměněny.

Kontrolovaná reakce namísto spontánního spojování

V základních chemických popisech se tvorba peptidové vazby často prezentuje jako kondenzační reakce, při které se dva aminokyseliny spojují za celkového uvolnění molekuly vody.

Taková rovnice popisuje celkovou bilanci reakce.

Nelze ho však ztotožňovat se způsobem, jakým se v praxi provádí řízená syntéza peptidů.

Samotné smíchání volných aminokyselin by neumožnilo spolehlivě určit:

• která aminová skupina má reagovat;
• která karboxylová skupina má reagovat;
• která aminokyselina má být jako první;
• který má být na druhém místě;
• začnou boční řetězce reagovat;
• bude stereochemie zachována;
• nevzniknou četné nežádoucí produkty.

Při praktické chemické syntéze se proto používají kontrolované strategie aktivace a chránění funkčních skupin.

Skupina pocházející z karboxylové skupiny je obvykle aktivována takovým způsobem, aby mohla účinně reagovat s vybranou aminovou skupinou. Ochranné skupiny, pořadí reakcí, chemie nosiče, spojovací činidla, prostředí rozpouštědla a metody izolace společně pomáhají nasměrovat reakci směrem k zamýšlenému produktu.

Účinná syntéza peptidů proto vyžaduje kontrolu jak chemie, která má proběhnout, tak té, které je třeba zabránit.

Dobrým příkladem je vznik aspartimidu.

Vědci vyvinuli alternativní metodu ochrany karboxylové skupiny, jejímž cílem bylo omezení této problematické vedlejší reakce při sestavování peptidu. [2]

Studie ukazuje širší princip peptidové chemie: prevence nežádoucích molekulárních přeměn může být stejně důležitá jako vytvoření správné peptidové vazby.

Kdy lze peptid považovat za hotový?

Dokončení tvorby lineární peptidové kostry neznamená vždy konec celé syntézy.

V závislosti na cílové molekule mohou být po složení řetězce vyžadovány další kroky.

Mohou zahrnovat:

• úplné odstranění ochranných skupin;
• odštěpení peptidu od pevného nosiče;
• odstranění dočasných značek;
• cyklizaci;
• oxidace;
• tvorba disulfidických můstků;
• vrásnění;
• skloňování;
• modifikaci konců řetězce;
• čištění;
• analytickou charakteristiku.

Některé peptidy vyžadují po složení řetězce poměrně málo dodatečných strukturálních změn.

U ostatních jsou klíčové pozdější fáze.

Dobrým příkladem je syntéza bovinního pankreatického inhibitoru trypsinové aktivity (BPTI). Vědci sestavili lineární sekvenci, materiál očistili a poté získali sbalenou strukturu obsahující disulfidové můstky. Podle analýz a funkčních srovnání prezentovaných ve studii odpovídal konečný materiál s přirozenou sekvencí přírodnímu proteinu v rozsahu zkoumaných parametrů. [3]

Tento příklad ukazuje rozdíl mezi sestavením peptidové kostry a získáním plně charakterizované konečné molekulární formy.

Metoda, která umožňuje získat správnou lineární sekvenci, automaticky potvrdzuje / Metoda, která umožňuje získat správnou lineární sekvenci, automaticky potvrdit / Metoda, která umožňuje získat správnou lineární sekvenci, automaticky nepotvrzuje:

• správného skládání;
• správného uspořádání disulfidických můstků;
• biologické aktivity;
• stability;
• profilu znečištění;
• vhodnosti pro dané použití.

Každá z těchto záležitostí vyžaduje samostatné důkazy.

Chemická syntéza, biologická exprese a kombinované metody

Při chemické syntéze peptidů se dříve připravené molekulární stavební bloky spojují v kontrolovaných laboratorních reakcích.

Biologická exprese naproti tomu využívá buněčný aparát k vytvoření kódované aminokyselinové sekvence. Materiál pak musí být zotaven, očištěn a v případě potřeby podroben dalšímu zpracování.

Obě metody mohou vést k získání peptidů nebo polypeptidů, ale pojí se s jinými možnostmi a omezeními.

Chemická syntéza může být užitečná zejména tehdy, když jsou potřeba:

• vybrané nestandardní aminokyseliny;
• chemické modifikace v konkrétních místech;
• specifické struktury konců řetězce;
• izotopové značkovače;
• modifikace peptidové kostry;
• jiné vlastnosti, které lze jen obtížně získat standardní biologickou expresí.

Biologická exprese může být atraktivní v případě vhodných delších sekvencí nebo určitých strategií značení, ale neodstraňuje problémy vyskytující se v pozdějších fázích výroby.

Stále je nutné zohlednit získávání materiálu, řasení, zpracování, nečistoty pocházející z hostitelského organismu, čištění a analytickou charakteristiku.

Žádná z metod tedy není univerzálně nejlepší.

Při srovnání polypeptidů složených z 20–40 aminokyselinových zbytků ovlivňovala délka sekvence i její tendence k agregaci výsledky pevnofázové syntézy a bakteriální exprese. [1]

Tyto poznatky podporují přístup, kdy se způsob výroby volí pro konkrétní molekulu.

Historická data týkající se výtěžnosti, nákladů, vybavení a doby výroby by neměla být považována za univerzální moderní hodnoty, protože technologie, činidla, automatizace, metody čištění a ekonomika výroby se s rozvojem technologií mění.

Syntéza peptidů na pevné fázi

Rostoucí řetězec je připojen k nerozpustnému nosiči

Při peptidové syntéze na pevné fázi (SPPS) zůstává rostoucí peptidový řetězec během následujících cyklů syntézy navázán na nerozpustný nosič.

Nosičem je nejčastěji funkcionalizovaná polymerní pryskyřice.

Spojka neboli linker váže peptid s nosičem a ovlivňuje mimo jiné způsob pozdějšího uvolnění hotového řetězce a typ získané koncové skupiny.

Jednou z hlavních praktických výhod SPPS je snazší oddělování materiálu.

Po ukončení určité fáze reakce lze rozpustná činidla a mnoho rozpustných vedlejších produktů odstranit promýváním, zatímco rostoucí peptid zůstává vázán na pevnou fázi.

Díky tomu není nutné po přidání každého dalšího aminokyselinového zbytku izolovat a čistit rostoucí peptid jako samostatnou, volnou sloučeninu.

Toto pohodlí však může vést k závažnému nedorozumění.

Promývání pryskyřice neznamená, že byly odstraněny všechny nesprávné peptidy.

Pokud řetězec navázaný na pryskyřici nereaguje během jednoho stupně couplingové reakce, může na nosiči nadále zůstat.

V dalších cyklech může opět reagovat a dále se prodlužovat.

V důsledku toho může vzniknout deleční sekvence, tedy molekula lišící se od cílového peptidu absencí jedné nebo více aminokyselinových zbytků.

Podobně chemicky modifikované nebo neúplně odblokované řetězce vázané na pryskyřici se mohou účastnit dalších fází syntézy.

SPPS tak zjednodušuje oddělování rozpustných látek od materiálu vázaného na pryskyřici.

Nezaručuji však dokonalou shodu sekvencí.

Opakující se cyklus odjišťování a spínání

Typická etapová synteza SPPS zahrnuje opakování tří základních operací:

odjištění → spřahování → proplachování.

Nejprve se odhaluje reaktivní aminová skupina nacházející se na konci rostoucího řetězce.

Poté je k řetězci připojena další chráněná aminokyselina.

Rozpustná činidla, nadbytek aminokyselin a řada reakčních produktů se odstraní před zahájením následujícího cyklu.

Opakování tohoto procesu umožňuje sestavovat peptid po jedné aminokyselinové zbytcové jednotce.

V klasické SPPS se C-terminální zbytky obvykle připojují k nosiči jako první a poté se řetězec prodlužuje směrem k N-konci.

To se liší od standardní ribozomální syntézy proteinů, během níž jsou aminokyseliny postupně připojovány k C-konci rostoucího řetězce.

Konečné pořadí aminokyselin však může být totožné, přestože směr a chemie procesu skládání jsou jiné.

Pojem „cyklus” by se neměl chápat jako jeden univerzální soubor reakčních podmínek vhodný pro každý zbytkový uhlík a každou sekvenci.

Průběh reakce může záviset na:

• strategii ochranných skupin;
• druhu aminokyseliny;
• prostorových podmínek kolem místa reakce;
• druhu pryskyřice;
• odkazovač;
• del délky řetězu;
• agregace;
• rozpouštědla;
• kombinační chemii;
• strukturálního chování rostoucího peptidu.

Reakce, která na začátku syntézy probíhá snadno, se může v pozdější fázi stát výrazně obtížnější.

Proto zůstává monitorování procesu důležité i ve vysoce automatizovaných systémech.

Proč na vlastnostech pryskyřice záleží?

Pevné médium není pouhým pasivním držákem.

Jeho fyzikální a chemické vlastnosti mohou přímo ovlivnit průběh reakce.

Jedním z důležitých parametrů je bobtnání.

Pokud pryskyřice ve zvoleném prostředí rozpouštědla správně bobtná, činidla mohou snadněji pronikat k reaktivním místům nacházejícím se v celé struktuře polymeru.

Nedostatečné bobtnání nebo změny struktury pryskyřice mohou tento přístup omezovat.

Význam mohou mít také:

• hustota osídlení;
• polymerní architektura;
• struktura linkeru;
• snášenlivost s rozpouštědly;
• mechanická stabilita;
• poréznost;
• difúzní vlastnosti;
• interakcje mezi rostoucími peptidovými řetězci.

S rostoucí délkou peptidu mohou jednotlivé řetězce také vzájemně interagovat.

Agregace na pryskyřici může omezovat přístup k reaktivním místům a vést k neúplnému spřažení nebo neúplnému deprotektování.

To znamená, že sekvence, která se na začátku syntézy chová správně, může být s prodlužováním řetězce obtížnější.

Vědci vyvinuli průtokový reaktor s proměnlivým ložem, který umožňoval sledovat bobtnání pryskyřice na základě měření souvisejících s tlakem. [4]

Studie se zabývala agregací na pryskyřici a neúplnou tvorbou vazeb jako procesními problémy, které by za jiných podmínek mohly být obtížně přímo pozorovatelné během syntézy.

To ukazuje, že monitorování fyzického chování nosiče může poskytovat informace přesahující samotné zaznamenávání přidávaných činidel.

K čemu slouží Wangova pryskyřice?

Chemie Wangova linkeru je široce využívána v SPPS, když je po odštěpení peptidu požadován C-konec ve formě karboxylové kyseliny.

Peptid je připojen pomocí esterové vazby, kterou lze později za vhodných podmínek štěpit.

Alternativní systémy linkerů lze volit tehdy, je-li vyžadována odlišná struktura C-konce, například amid.

Je třeba rozlišovat mezi chemií linkeru a celým fyzickým nosičem.

Wangovy linkery lze zavádět do různých polymerních architektury.

Takové materiály nemusí mít identické:

• bobtnací vlastnosti;
• kapacity;
• snášenlivost s rozpouštědly;
• mechanických vlastností;
• chování během reakce.

Výzkum s využitím peptidyl-Wang-TentaGelových nosičů ukázal specializovanou alternativní metodu pro přípravu peptidových hydrazidů, které jsou užitečnými meziprodukty v peptidové chemii. [5]

To neznamená, že standardní odštěpení z Wangovy pryskyřice obvykle vede ke vzniku peptidových hydrazidů.

Ukazuje však důležitou zásadu:

nosič + linker + reakční podmínky + štěpná chemie společně určují výsledný produkt.

Syntéza SPPS v periodickém a průtokovém uspořádání

SPPS lze provádět v klasických vsádkových reaktorech nebo v systémech, ve kterých činidla protékají reaktorem obsahujícím pevný nosič.

Průtokové systémy mohou umožňovat rychlou výměnu činidel a přesnější kontrolu chemického prostředí obklopujícího pryskyřici.

Studie z roku 2014 představila rychou syntézu peptidů v průtokovém systému s nepřetržitým monitorováním a aplikovala ji na několik peptidů a malý protein. [6]

V pozdější automatizované studii byla popsána výrazně rychlejší montáž řetězců, přičemž u analyzovaných příkladů bylo dosaženo čistoty surového produktu a výtěžku po izolaci srovnatelných s klasickou periodickou syntézou. [7]

Tyto výzkumy ukazují možnosti konkrétních systémů za určitých podmínek.

To však nedokazuje, že každý peptid lze vyrábět stejně rychle a se stejnou kvalitou.

Doba potřebná k výrobě peptidu zahrnuje také mnohem více než jen samotné sestavování řetězce.

Celkový proces může zahrnovat:

• příprava reagencií;
• příprava pryskyřice;
• spojování;
• odjištění;
• promývání;
• odštěpování;
• zpracování produktu;
• čištění;
• odstraňování rozpouštědel;
• konečné tvarování struktury;
• analytická vyšetření;
• dokumentaci.

Rychlé vázání je tedy jen jedním z prvků celkové efektivity výroby.

Syntéza v kapalné fázi

Co tento pojem znamená?

Termín „synteza peptydů v liquidní fázi” lze použít v několika významech.

V širším slova smyslu to může jednoduše znamenat syntézu peptidu probíhající v roztoku.

V odbornější literatuře se však často rozlišuje:

1. klasickou peptidovou syntézu v roztoku;
2. syntézu peptidů na pevné fázi;
3. novější metody LPPS, ve kterých rostoucí řetězec obsahuje rozpustnou značku nebo nosič.

Toto rozlišení je důležité, protože se mění způsob separace a zpětného získávání produktu.

Volně rozpuštěný, chráněný peptidový meziprodukt může vyžadovat izolaci s využitím jeho vlastních fyzikálních a chemických vlastností.

V případě značeného polotovaru může být značka navržena tak, aby usnadňovala srážení, extrakci, zachycení na membráně nebo jiný způsob separace.

Přehled týkající se LPPS jasně rozlišuje mezi klasickou syntézou v roztoku, SPPS a metodami využívajícími rozpustné značky. [8]

Publikace je užitečná k uspořádání terminologie a metodiky.

Neměla by však být interpretována jako jediný experiment dokazující, že jedna metoda je nejlepší pro každý peptid.

Klasická peptidová syntéza v roztoku

Při klasické syntéze v roztroji zůstávají chráněné aminokyseliny, peptidové meziprodukty nebo fragmenty rozpuštěny v reakčním prostředí namísto toho, aby byly kovalentně připojeny k nerozpustné pryskyřici.

Po dokončení reakce může být příslušný meziprodukt izolován, očištěn a v případě potřeby charakterizován před zahájením dalšího kroku.

Může to přinášet určité výhody.

Výzkumní pracovníci mohou:

• charakterizovat jednotlivé polotovary;
• vybírat metodu čištění pro konkrétní polotovar;
• optimalizovat jednotlivé přeměny;
• připravovat fragmenty nezávisle;
• upravit syntetickou trasu, když určitý meziprodukt způsobí problémy.

Syntéza v roztoku však může být spojena také s významnými obtížemi.

S prodlužováním řetězce mohou peptidy:

• stávat se špatně rozpustnými;
• agregovat;
• být obtížně krystalizovatelný;
• vytvářet blízce příbuzné nečistoty;
• být těžké k oddělení;
• vyžadovat dvojitou izolaci;
• způsobovat ztráty materiálu v dalších fázích obrábění.

Syntéza v roztoku tedy není automaticky jednodušší ani snáze škálovatelná než SPPS.

Její užitečnost závisí na konkrétní sekvenci, stabilitě meziproduktů, rozpustnosti, délce syntetické trasy, chování při čištění a účinnosti následných fází izolace.

Rozvoj značených strategií LPPS částečně vyplývá ze snahy vyřešit právě tyto problémy spojené se separací a manipulací s materiálem. [8]

Rozpustné značkovače propojují navrhování reakcí s navrhováním separací

U značené LPPS má rostoucí peptid dočasné molekulární připojení navržené tak, aby ovlivňovalo jeho fyzikální vlastnosti.

Značka může umožňovat udržení dostatečné rozpustnosti peptidu během reakce a následně usnadňovat jeho selektivní získání zpět.

V závislosti na technologii může dělení využívat:

• srážení;
• extrakci;
• zadržování na membráně;
• fázové chování;
• další vlastnosti vyplývající z přítomnosti značky.

Jedna z experimentálních strategií využila dlouhořetězcovou ochrannou skupinu na C-konci k přípravě peptidových amidů.

Opakované reakce a fáze srážení umožnily výzkumníkům připravit hydrofobní peptid, který bylo v jimi použitém srovnání obtížné uspokojivě získat metodou SPPS. [9]

To dokazuje užitečnost této konkrétní strategie pro analyzovanou sekvenci.

To však nedokazuje univerzální převahu značené syntézy.

Značka se stává součástí výrobního procesu a vyvolává vlastní otázky:

• Jak efektivně je připojován?
• Mění průběh reakce?
• Jak spolehlivě lze získat označený polotovar?
• Vedete ke vzniku nových znečištění?
• Jak je odstraněn?
• Lze potvrdit úplné odstranění?
• Jaké analytické metody potvrzují jeho absenci v konečném produktu?

Rozpustné značky je tedy třeba považovat za funkční prvky návrhu procesu, a nikoli pouze za jednoduché štítky.

Porovnání hlavních metod

Porovnání představuje obecné principy fungování jednotlivých metod.

Neřídí, která z nich zajistí nejlepší výkon, čistotu, náklady, environmentální vyváženost nebo možnosti škálování pro konkrétní sekvenci.

Tyto parametry je třeba hodnotit na základě skutečné součástky a konkrétního výrobního procesu. [4] [8] [9]

Skládání částí a hybridní výroba

Peptid nemusí být vždy vytvářen v jednom nepřerušovaném procesu, který spočívá v přidávání dalších aminokyselinových resekvencí.

Alternativní strategií je samostatné připravení kratších peptidových fragmentů a jejich následné spojení.

Hybridní proces může například využívat SPPS k získávání jednotlivých fragmentů a chemikálie v roztoku k jejich spojování.

Strategie fragmentové mohou omezit některé problémy spojené s velmi dlouhou předběžnou syntézou.

Přinášejí však nové výzvy, jako například:

• výběr vhodného místa připojení;
• rozpustnost fragmentů;
• aktivace místa spojení;
• chemoselekce;
• zachování stereotypů;
• vedlejší účinky;
• čištění částí;
• čištění po jejich spojení.

Důležitým příkladem kontrolovaného spojování fragmentů je chemická nativní ligace.

V klasické verzi peptidový tioester reaguje s druhým peptidem obsahujícím N-koncovou cystein. Následné reorganizace vedou k vytvoření správného vazebného místa v peptidovém skeletu v místě ligace.

Původní studie prokázala možnost získat po ligaci a fázování proteinu obsahujícího diszaryčkové mosty. [10]

To potvrzuje význam této strategie slučování fragmentů.

Nicméně to neznamená, že jakékoli dva nelikvidované peptidové fragmenty se mohou spontánně spojit.

Připojování a ochranné skupiny

Připojování vytváří záměrné spojení

Spárování je etapou reakce, během které vzniká mezi vybranými jednotkami nový peptidový vazebný bod.

Obvykle je skupina pocházející z karboxylové skupiny aktivována tak, aby mohla účinně reagovat s příslušnou aminovou skupinou.

Chemie aktivace musí být v souladu s:

• růstající sekvencí;
• dočasnými ochrannými skupinami;
• ochranou bočních lan,;
• stereochemie;
• nosičem nebo označením;
• prostředím rozpouštědla;
• jinými funkčními skupinami přítomnými v molekule.

Účinné spájení je obzvlášť důležité v etapové syntéze, protože neúplná reakce může vést k vzniku deleční sekvence.

Pokud jeden krok přidávání aminokyselin nebude úspěšný u některých rostoucích řetězců, mohou tyto řetězce zůstat v systému a účastnit se dalších cyklů.

Výsledkem může být molekula velmi podobná cílovému peptidu, ale bez jedné zbytky.

Tedy i malé nedokonalosti se mohou během mnoha kroků syntézy kumulovat.

Jednoduchý matematický příklad dobře ilustruje tento problém.

Pokud by každý z 50 nezávislých kroků podávání měl 99% pravděpodobnost úspěchu, procento částic, u kterých by všechny kroky skončily úspěchem, by bylo:

0,99^50 ≈ 0,605

tj. zhruba 61%.

Jedná se pouze o matematickou ilustraci.

Neobsahuje prognózu skutečné čistoty ani účinnosti syntézy peptidu obsahujícího 50 restů.

Skutečná výroba zahrnuje:

• různé výkonnosti spojování v jednotlivých pozicích;
• fáze demontáže;
• vedlejší účinky;
• odpovídá sekvenci obtížnosti;
• strategie opětovného spojení;
• straty během odstraňování;
• straty během čištění;
• jiné procesní parametry.

Výpočet pouze ukazuje, proč i přesto, že se zdá být malá, neúčinnost jednotlivých kroků může mít v multikrokovém procesu velký význam.

Ochranné skupiny kontrolují místo reakce

Aminokyselina může obsahovat několik chemicky reaktivních skupin.

Bez selektivní kontroly by se reakce spojené s přilnutím mohly vyskytnout na nežádoucích místech.

Ochranné skupiny dočasně blokují vybraná místa reakce.

Aminokyselina používaná k prodloužení řetězce obvykle vyžaduje dočasnou ochranu, zatímco reaktivní vedlejší řetězce mohou vyžadovat fixaci, která zůstává na místě po mnoho cyklů syntézy.

Spojení s nosičem také musí tuto fázi přežít až do plánovaného odpojení.

Výběr ochranných skupin tedy ovlivňuje celou strategii syntézy.

Je třeba vzít v úvahu:

• způsob jejich uvádění do provozu;
• stabilita;
• způsob odstranění;
• soulad s ostatními ochrannými skupinami;
• soulad s nosičem;
• vedlejší účinky;
• vliv konkrétní sekvence;
• Konečné podmínky odstraňování záruky.

Výzkumy využívající ochranu založenou na cyjanosulfurylidinu se týkaly vzniku aspartimidu prostřednictvím změny způsobu zabezpečení karboksylové skupiny. [2]

Výsledky ukazují, že strategie ochranných skupin ovlivňuje nejen to, zda může dojít k zamýšlené reakci, ale také to, jaké nežádoucí reakce mohou nastat.

Fmoc, Boc a ortogonální ochrana

FMOC a Boc patří mezi široce používané skupiny pro ochranu aminových skupin.

Vlastně se liší způsobem odstranění.

FMOC se obvykle odstraňuje za zásadních podmínek, zatímco Boc je citlivé na kyselé podmínky.

Tyto vlastnosti umožňují jejich použití jako součásti širších strategií ochrany.

V populární SPPS založené na Fmoc je dočasná ochrana N-koncového Fmoc mnohokrát odstraněna, zatímco vybrané ochranné skupiny vedlejších řetězců a vazba na živici zůstávají nedotčeny až do pozdějších etap.

Jiné strategie mohou využívat odlišné kombinace.

Zvláště důležitým pojmem je ortogonální ochrana.

Dvě ochranné skupiny jsou považovány za ortogonalní, pokud lze jednu selektivně odstranit za podmínek, kdy druhá zůstává dostatečně stabilní, aby bylo možné pokračovat v syntéze.

Ortogonalita je tedy praktickou relací chemické shody.

To neznamená, že každá zabezpečená skupina zůstane zcela nezměněna po neomezeném počtu expozicím všem podmínkám reakce.

Nežádoucí účinky mohou nadále existovat.

V studiích syntézy Fmoc byly popsány jak tvorba aspartimidu, tak nežádoucí stereochemické změny navzdory předpokládané celkové selektivitě ochranné strategie. [11]

Stereochemie je součástí identitě molekuly

Mnoho aminokyselin má chiralní centrum.

To znamená, že jejich atomy mohou přijímat různé prostorové uspořádání odpovídající různým stereochemickým formám.

Změna konfigurace jednoho stereogenního centra může vést k vzniku jiné struktury peptidu bez nutnosti změny jeho nominální hmotnosti.

Proto samotná hmota nemůže potvrzovat úplnou identitu peptidu.

Epimerizace obvykle znamená změnu konfigurace jednoho stereogenního centra v molekule obsahující několik takových center.

Racemizace je také často diskutována v chemii peptidů v souvislosti s ztrátou stereochemické integrity aminokyselinových resekcí.

Tyto změny jsou důležité, protože molekulární rozpoznávání může záviset značně na prostorovém uspořádání atomů.

Dva molekuly s stejným atomárním složením a stejnou nominální hmotností se tedy mohou chovat jinak, pokud se liší svou stereochemí.

V studii syntézy Fmoc podporované mikrovlnnou energií bylo zjištěno, že některé zbytky byly náchylné k nežádoucím stereochemickým změnám za daných podmínek. Modifikace metody omezovala výskyt těchto reakcí. [11]

To neznamená, že topení definice podle všeho poškozuje všechny peptidy.

Správný přístup je tento: zrychlení reakce je třeba posuzovat spolu s selektivitou chemickou závislou na sekvenci.

Aspartamid a další příbuzné znečišťující látky

Vytváření aspartimidu je známou vedlejší reakcí týkající se určitých sekvencí obsahujících asparagin.

Může vzniknout nežádoucí cyklický produkt, z něhož se následně tvoří sloučeniny s modifikovanou struktuře skelných vazeb nebo stereochemie.

Pravděpodobnost této reakce závisí na sekvenci a podmínkách procesu.

Další znečištění spojené s syntézou může vyplývat z:

• neúplné sladění;
• neúplné odškodnění;
• vytváření delečních sekvencí;
• reakce bočních řetězů;
• stereotypní změny;
• reakce během odstraňování;
• oxidace;
• programeků;
• příslušných podmínek zpracování produktu;
• neúplné odstranění ochranných skupin.

Některé znečištění způsobují snadno patrnou změnu hmotnosti molekuly.

Jiná jsou mnohem těžší k rozlišení.

V analytických studiích syntetického peptidu sloužícího jako substrát reninoidů bylo identifikováno mnoho znečišťujících látek, včetně látek, které vykazují stejnou změnu hmotnosti, ale obsahují modifikace v různých pozicích. [12]

K jejich rozlišení bylo potřeba další strukturální analýza.

Badatelé také považovali navrhované mechanismy vzniku těchto znečišťujících látek za hypotézy.

Je to důležitý rozdíl:

Určení, co je znečištění, a prokázání přesného mechanismu jeho vzniku jsou dva odlišné vědecké otázky.

Nehodí se předkládat pravděpodobný mechanismus jako potvrzený pouze proto, že odpovídá pozorované hmotnosti částic.

Čištění, skalování a kvalita výroby

Surowý produkt, čištění produktu a výkonnost

Surowy peptid je materiál získaný před dokončením příslušných kroků čištění.

Může obsahovat:

• cílový peptid;
• deleční sekvence;
• část materiálů není úplně uvolněna;
• modifikované sekvence;
• ostatky činidel;
• produkty spojené s odstraňováním odpadů;
• sólu;
• rozpouštědla;
• ostatní přísady vznikající v procesu.

Čištění má za cíl oddělit správný peptid od této směsi.

Je třeba jasně rozlišit tři pojmy:

čistota surového produktu – měřený obsah materiálu před konečným čištěním;

výkon vyčištěného nebo izolovaného produktu – množství získaného cílového materiálu vzhledem k určené počáteční nebo teoretické hodnotě;

koncová čistota – složení izolovaného materiálu stanovené pomocí konkrétní analytické metody.

Tyto pojmy nejsou výměnné.

Tento proces může vést k vytvoření velké množství surového materiálu, ale umožňuje získat relativně malé množství čištěného produktu.

Jiný proces může produkovat méně surového materiálu, ale vyznačuje se vysokou selektivitou při tvorbě konečného produktu.

Stejně vysoká analytická čistota nemusí znamenat vysokou výrobní účinnost.

V studiích zrychlené průtokové syntézy bylo správně hlášeno odděleně čistota surového materiálu a výkon po izolaci. [7]

Kromatografie rozděluje látky, ale neodpovídá na každou otázku

Vysokorychlostní kapalinová chromatografie v reverzním systému fází (RP-HPLC) je široce používána k analýze a čištění peptidů.

Různé molekuly působí různým způsobem na stálou a pohyblivou fázi.

V odpovídajících podmínkách tyto rozdíly umožňují rozdělení složek směsi.

Analytická a preparativní chromatografie mají společné, ale odlišné použití.

Analytická HPLC slouží především k vyhodnocení složení vzorku.

Preparativní HPLC se používá k fyzickému sběru jednotlivých složek.

Chromatogram může poskytovat mnoho cenných informací.

Velký hlavní vrchol nebo vysoký procentní podíl jeho plochy by však nemělo být považováno za úplnou molekulární charakteristiku.

Výsledky chromatografie závisí mimo jiné od:

• typ sloupů;
• fáze pohybu;
• gradientu;
• teploty;
• metody detekce;
• vlnová délka;
• příprava vzorku;
• způsob integrace piků;
• rozlišení;
• vlastnosti znečištění.

Dva sloučeniny mohou potenciálně vyvstávat současně.

Některé komponenty vzorku mohou také různě reagovat na použitý detektor.

Proto vysoká povrchová čistota v HPLC není synonymem pro plné potvrzení molekulární identity.

Studie izobarych znečištění peptidových látek a analýzy chirality ukazují, proč mohou být potřebné doplňkové analytické metody. [12] [13]

Analytická metoda musí odpovídat konkrétnímu strukturálnímu otázce.

Identita, čistota a obsah znamenají různé věci

V charakteristice peptidů je zvláště důležité tři pojmy.

Identita odpovídá na otázku:

Je v vzorku záměrně přítomná částice?

Čistota odpovídá otázce:

Jaké další složky se nacházejí v vzorku nebo jaká část měřeného signálu odpovídá hlavnímu složku?

Obsah odpovídá na otázku:

Kolik skutečného peptidu je v vzorku?

Na tyto otázky nelze vždy odpovědět pomocí jediného měření.

Materiál obsahující peptid může také obsahovat:

• vodu;
• antionové;
• sólu;
• zbytky rozpouštědel;
• ostatní přísady spojené s procesem;
• znečištění.

Celková hmotnost odvážného materiálu tedy nemusí odpovídat hmotnosti samotného peptidu.

Stejně tak shoda naměřené hmotnosti molekuly s teoretickou hodnotou nepotvrzuje:

• kompletní aminokyselinová sekvence;
• správné propojení jednotlivých částí;
• stereochemické integrity;
• rozložení disulfidových můstků;
• falcování;
• nedostatku izobaryčných znečišťujících látek.

Masová spektrometrická analýza může poskytnout silné důkazy o hmotnosti molekuly.

Tandemní hmotnostní spektrometrie a další strukturalní metody mohou poskytnout další informace o sekvenci.

Kiralické metody umožňují analyzovat stereochemické otázky, jejichž řešení nelze provést běžným měřením hmotnosti.

V jednom z analytických výzkumů byla zohledněna i racemizace vznikající při přípravě vzorku. To poukazuje na další důležitou zásadu: samotná analytická procedura může způsobit artefakty, pokud není vhodně navržena. [13]

Ohyb a aktivita mohou vyžadovat zvláštní potvrzení

U strukturálně omezených peptidů a malých proteinů může správná sekvence a molekulová hmotnost stále nestačit k potvrzení zamýšlené konečné struktury.

Další otázky mohou zahrnovat:

• Založili se správné disiarční mosty?
• Přijal atom očekávanou konformaci?
• Je cyklizace kompletní?
• Jsou-li k dispozici strukturalní izomery?
• Projevuje syntetická molekula očekávanou aktivitu v rámci konkrétního experimentálního testu?

V rámci studie syntézy BPTI bylo použito několik analytických a biofyzikálních metod společně s hodnocením inhibice trypsinu. [3]

Souhrnná data podporovala shodu syntetického materiálu s přirozenou sekvencí v oblasti zkoumaných kritérií.

Test aktivity však odpovídá na konkrétní funkční otázku.

Nepodává náhradu za analýzu znečištění.

Stejně tak podobná aktivita v jednom testu neodhaluje plnou shodnost všech biologických, strukturálních nebo výrobních vlastností.

Skalování výroby mění více než jen množství materiálu

Zvýšení rozsahu výroby neznamená pouze proporcionální zvýšení množství všech činidel.

Fyzikální procesy se mohou chovat jinak v větší míře.

Mohou mít význam:

• míchání;
• měna tepla;
• distribuce činidel;
• difuzní proudění;
• zvětšení živice;
• tlak;
• filtrace;
• ekonomika rozpouštědel;
• srážení;
• rozpustnost polotovarů;
• přeprava hmoty;
• možnosti systému čištění.

Tyto faktory mohou mít vliv jak na průběh reakce, tak na vznik znečištění.

Oczyszczanie v pozdějších fázích může také stát se překážkou celého procesu výroby.

Zvýšení rychlosti syntézy má omezený význam, pokud systém čištění nebude schopen účinně oddělit vznikající znečištění nebo získat produkt požadované kvality.

V průmyslovém průzkumu zahrnujícím 40 procesů syntézy peptidů z 14 farmaceutických společností byla zhodnocena spotřeba materiálů během syntézy, čištění a izolace. [14]

Studie ukazuje, proč je nutné hodnotit výrobu v rámci celého procesu.

Nicméně to neznamená, že každá továrna, sekvence nebo výrobní technologie dosahuje stejných výsledků.

Kvalita výroby je výsledkem mnoha kontrolních prvků

Spolehlivá výroba peptidů vyžaduje více než jen získání jednoho uspokojivého analytického výsledku.

Kontrolovaný proces obvykle zahrnuje několik souvisejících prvků:

definovaná cílová částice → odpovídající vstupní materiály → kontrolovaná syntéza → kontrolované čištění → správné odběr vzorků → validovaná nebo cílená analýza → dokumentace o dávce.

Dokumentace strany kombinuje analytické výsledky s materiálem, který ve skutečnosti byl vytvořen.

Certifikát analýzy (COA) shrnuje vybrané výsledky analýzy určitého vzorku.

Jeho informační hodnota závisí na:

• druhu provedených testů;
• použité metody;
• účinnosti těchto metod;
• specifikace;
• identifikace vzorku;
• možnosti sledování strany;
• potvrzení, že hlášené výsledky skutečně odpovídají danému materiálu.

Jednotlivá hodnota definovaná jako „čistota” sama o sobě nemůže prokázat:

• plné molekulární identitě;
• obsah peptidu;
• stereochemické integrity;
• úrovně zbytkových látek rozpouštědel;
• obsah vody;
• skladu protilátek;
• mikrobiologické vlastnosti;
• falcování;
• biologické aktivity;
• vhodnosti pro určitý účel.

Správný soubor analýz závisí na zamýšleném použití materiálu.

Peptid, který se používá jako analytický referenční materiál, testovací činidlo používané v buněčném experimentu a materiál v farmaceutickém vývojovém stadiu mohou vyžadovat odpovědi na další kvalitativní otázky.

Analytické důkazy tedy je třeba interpretovat v jasně definovaném kontextu a nikoli jako univerzální potvrzení kvality.

Hodnocení environmentálního vyvážení musí zahrnovat celý proces.

Syntéza peptidů může vyžadovat velké množství rozpouštědel a činidel.

Hodnocení environmentálního dopadu by tedy mělo zahrnovat mnohem více než samotný proces spárování.

Mezi důležité prvky mohou patřit:

• příprava stavebních bloků;
• složení činidla;
• aktivační činidla;
• promývání;
• odštěpování;
• práce s produktem;
• kromatografie;
• výměna rozpouštědel;
• izolace;
• sušení;
• řízení odpadů.

Snižování environmentálního zatížení může vyžadovat současné zlepšení několika kroků.

V publikované analýze týkající se výroby peptidů byly projednány problémy spojené jak s syntézou, tak s čištěním a poukázáno na potřebu zlepšit celý proces. [15]

Jako publikace s perspektivou nejedná se o přímý a kontrolovaný srovnávací přehled, který by dokázal, že jedna konkrétní technologie je vždy šetrnější k životnímu prostředí.

Podobně:

rychlejší syntéza neznamená automaticky ekologičtější syntézu,

a menší spotřeba rozpouštědel během samotného syntézy neznamená automaticky menší dopad celého výrobního procesu.

Ekologické srovnání vyžaduje používání jednotných kritérií analýzy a nejlépe by se měly vztahovat na spotřebu zdrojů k určitému množství izolovaného a charakterizovaného konečného produktu.

Často kladené otázky

1. Jaký je rozdíl mezi syntézou peptidů v pevném stavu a syntézou v tekutém stavu?

V syntéze v pevném stavu rostoucí peptid zůstává vázán na nerozpustný nosič, zatímco v klasické syntéze v roztoku je rozpuštěný a obvykle musí být získán na základě svých fyzikálních a chemických vlastností. V užším významu má rozpuštěný rostoucí řetězec v LPPS navíc rozpustný marker nebo nosič usnadňující jeho pozdější oddělení. Výzkumy syntézy značeného peptidu ukazují na jeden ze strategií sloučení roztavné chemie s odstraňováním pomocí odpařování, zatímco literatura týkající se LPPS takové řešení odlišuje jak od klasické syntézy v roztoku, tak i od SPPS. Nicméně žádná metoda není z definice optimální pro každý peptid. Základní rozdíl se týká způsobu fyzického vedení a odstraňování rostoucího řetězce během následujících kroků syntézy. [8] [9]

2. Proč se při syntéze peptidů mohou vyskytnout znečištění?

Znečištění může vznikat proto, že záměrné reakce nejsou vždy prováděny v dostatečném množství a jiné funkční skupiny mohou být zapojeny do nežádoucích reakcí. Neúplné spájení může vést k selektivním sekvencím, neúplné odpojení může narušit další řetězovou syntézu a některé sekvence jsou citlivé na stereochemické změny, vznik aspartimidu, oxidaci, přeskládání nebo vedlejší produkty spojené s odštěpením. Analýza syntézy Fmoc a struktura syntetických znečišťujících látek peptidových sloučenin dokumentují několik takových příkladů.[11][12] Četnost a význam jednotlivých znečišťujících látek závisí na sekvenci a procesu, proto nelze automatizaci syntézy přehlédnout jako úplnou absence chemických chyb.

3. Jaká role hraje živice při syntéze peptidů?

Živice udržuje rostoucí peptid, zatímco rozpustné činidla a mnoho vedlejších produktů lze odstranit mezi jednotlivými fázemi syntézy. To výrazně zjednodušuje opakované fázování řetězce, ale živice nejsou pouze mechanickým uchopovacím mechanismem. Jejich zpevnění, stupeň obsazení, struktura polymeru, kompatibilita s rozpouštědly a dostupnost reakčních míst mohou ovlivňovat účinnost pronikání činidel do připojeného peptidu. V studiích s reaktorem s proměnným komplemem byl monitorován stav živice během analýzy agregace a účinnosti vazby. [4] Takové monitorování neodstraňuje chyby sekvencí, ale ukazuje, proč může být fyzikální stav živice významnou procesní proměnnou.

4. K čemu slouží wanga v syntéze peptidů?

Nosiče typu Wang jsou běžně spojeny s přípravou peptidů uvolňovaných po odpájení z C-konce v podobě karboksylového kyseliny. Přesný konečný produkt však závisí na ligáru, struktuře nosiče a použité chemické reakci na odstraňování, a nikoli pouze na názvu živice. Výzkumníci také představili specializovanou metodu přeměny materiálu peptydyl-Wang-TentaGel na peptidové hydrazidy, které mohou sloužit jako užitečné syntetické polotovarové produkty. [5] Alternativní reakce nezmění význam standardního odstraňování z Wangovy živice. Ukazuje však, proč je při předvídání produktu třeba analyzovat celý nosič a podmínky reakce.

5. Stavejí SPPS peptid od N-konce nebo od C-konce?

Klasická etapová SPPS obvykle začíná připojováním koncového C-atomu k nosiči, poté je řetěz prodloužen směrem k N-atomu. Tento směr je opačný než u standardního prodlužování řetězce na ribosomu, kde se protein vyvíjí přidáváním dalších aminokyselin do C-atomu. Syntéza BPTI je příkladem využití zabezpečených stavebních bloků a nosiče před pozdějším uvolněním, čištění a fázování produktu. [3] Existují však speciální strategie peptidové chemie využívající jiné řešení, a proto je budování od C- do N-atomu třeba považovat za klasický přístup SPPS, nikoli za absolutní pravidlo všech syntetizačních metod.

6. Proč jsou ochranné skupiny potřebné?

Aminokyseliny často obsahují několik reaktivních funkčních skupin. Ochranné skupiny dočasně zabraňují reakci vybraných míst a ponechávají příslušné místo k dispozici v konkrétním okamžiku syntézy. To pomáhá kontrolovat pořadí a způsob spájení zbytkových látek. Bez správné ochrany mohou konkurenční reakce vést k vzniku složitých směsí nebo produktů s změněnou strukturou. Výzkum vzniku aspartimidu ukázal, že změna chemické struktury ochranné skupiny karboksylové může omezit důležitou vedlejší reakci v zkoumaných sekvencích. [2] Ochranné skupiny nezaručují ideální průběh syntézy, ale zajišťují selektivní chemickou kontrolu, která musí zůstat v souladu se všemi důležitými fázemi procesu.

7. Jaký je rozdíl mezi Fmoc a Boc?

Fmoc a Boc jsou široce používanými dočasnými ochrannými skupinami aminové skupiny, ale reagují na jiné chemické podmínky. Fmoc se obvykle odstraňuje v zásadním prostředí, zatímco Boc je citlivé na kyseliny. Tato rozdílnost ovlivňuje způsob jejich sloučení s ochrannými řetězci, linkery a dalšími fázemi syntézy. Syntéza založená na Fmoc je široce používána v současné SPPS, ale studie také ukazují možnost vzniku sekvenčně závislých vedlejších reakcí za těchto podmínek. [11] V praxi je tedy spíše užitečnější porovnávat celkové strategie ochrany a jejich slučitelnost s danou sekvencí než zkoumat pouze názvy dvou ochranných skupin.

8. Co znamená ortogonální ochrana?

Ortogonalní ochrana znamená, že jednu ochrannou skupinu lze odstranit za podmínek, kdy další potřebná ochranná skupina zůstává dostatečně stabilní, aby bylo možné pokračovat v syntéze. To umožňuje odhalit různé reaktiva v jednotlivých fázích. Tato koncepce má zásadní význam při kontrolované syntéze složitých peptidů. Ortogonalita však závisí na podmínkách a není absolutní: opakované expozice, charakter sekvencí a parametry reakce mohou stále vést k vedlejším reakcím. Odborné studie alternativních způsobů ochrany karboxylových skupin ukazují, jak lze strategii ochrany upravit za účelem kontroly složité peptidové chemie. [2]

9. Co je sekvence delecyjna?

Delecyjna sekvence je peptid bez jedné nebo několika zbytkových látek přítomných v zamýšlené cílové sekvenci. Mohou vzniknout v případě, že etapa spájení aminokyselin nedochází úplně, ale neoaktívní řetězec zůstává připevněn k nosiči a účastní se dalších cyklů. Protože nesprávný řetězec stále zůstává vázán k živici, běžné odstraňování ho nemusí odstranit. Studie monitorování SPPS v reálném čase ukazují na neúplné vytváření amidových vazeb jako důležitý procesní problém. [4] Delecyjna sekvence je tedy problémem spojeným s strukturou a identitou produktu a nikoli pouze zbytky činidla.

10. Mohou dva peptidové znečištění mít stejnou molekulovou hmotnost?

Ano. Různé molekulární struktury mohou mít stejnou nebo nerozlišitelnou nominální hmotnost. Z tohoto důvodu samotná shoda hmotnosti neodhaluje úplnou identitu molekuly. V studiích syntetického peptidu působícího jako substrát reninové hormony byly identifikovány izobarytické složky znečištění, ve kterých byly modifikace umístěny v různých pozicích. Dehydrogenerace a tandemová hmotnostní spektrometrie poskytly další strukturní informace. [12] Tento příklad ukazuje, proč shoda pozorované hmotnosti s očekávanou nemusí sama o sobě potvrzovat správnou sekvenci, vazbu, stereochemii ani absenci strukturně podobných izomerů.

11. Co jsou epimeryzace a racemizace v syntéze peptidů?

Epimerizace a racemizace jsou nežádoucími změnami stereochemické konfigurace. Mohou nastat bez změny nominální aminokyselinové sekvence nebo molekulární hmotnosti, proto běžný hmotnostní rozměr může neukazovat žádný strukturální rozdíl. V studiích syntézy Fmoc podporované mikrovlnami bylo identifikováno zbytky citlivé na změny stereochemické konfigurace a prokázáno, že modifikace reakčních podmínek může tyto procesy omezit. [11] Riziko závisí na molekulární struktuře, sekvenci a podmínkách procesu. Proto kvalitativní stereochemie vyžaduje analytické metody schopné hodnocení konfigurace a nelze ji vyvodit pouze z hmotnosti molekuly.

12. Co je vznikem aspartimidu?

Vytváření aspartimidu je nežádoucí reakcí spojenou s určitými sekvencemi obsahujícími aspartin. Vytvoření cyklického produktu může vést k dalším produktům s modifikovanou struktuře nebo stereochemie, což snižuje účinnost a ztěžuje čištění. Výzkumníci analyzovali alternativní strategie ochrany navržené k omezení této reakce v vybraných peptidy a proteiny. [2] Výsledky neukazují na jedno univerzální řešení pro všechny sekvence obsahující aspartin. Naopak ukazují, proč návrh syntézy a strategie kontroly znečištění musí zohledňovat specifické chemické vlastnosti dané sekvence.

13. Dokazuje vysoká čistota HPLC správnou identitu peptidu?

Ne. Čistota HPLC popisuje vzorek v rámci konkrétního chromatografického rozdělení, použitého detektoru a způsobu analýzy dat. Vysoký podíl povrchové plochy hlavního vzorku může být cenným důkazem toho, že vzorek je dominován jedním chromatograficky odděleným složkem, ale sám o sobě nezaručuje úplnou molekulární identitu. Společné znečištění, stereoizomery a další varianty mohou vyžadovat další techniky. V badatelských pracích na analýze chirálních peptidů byl použit speciálně navržený proces, který také zohledňoval stereochemické změny vznikající při přípravě vzorku. [13] Identita a čistota by proto měly být považovány za propojené, ale odlišné analytické otázky.

14. Má výkonnost čištění produktu stejný význam jako čistota?

Ne. Výkon vyčištěného nebo izolovaného produktu určuje množství cílového materiálu získaného vzhledem k definované počáteční nebo teoretickému množství. Čistota popisuje naopak složení získaného materiálu podle stanovené analytické metody. Syntéza může vést k získání relativně malé množství produktu s velmi vysokou čistotou nebo velké množství surového materiálu obsahujícího značné množství znečištění. V studiích automatické průtokové syntézy jsou čistota surového produktu a výkon po izolaci hlášeny odděleně. [7] Oddělení těchto parametrů zabraňuje mylnému posuzování vysoké hodnoty jednoho z nich jako důkazu vysoké hodnoty druhého.

15. Mohou být dlouhé peptidy syntetizovány spojením kratších fragmentů?

Ano. V rámci fragmentové strategie mohou být kratší peptidové segmenty připraveny odděleně a poté sloučeny pomocí vhodných chemikálií. Chemická ligace nukleofilu byla důležitým příkladem, kdy byly nezabezpečené peptidové segmenty spojeny způsobem, který vedl k vzniku přirozeného vazebného mechanismu peptidového skeletu, a poté bylo získáno deformované protein. [10] To neznamená, že libovolné peptidové segmenty se mohou spontánně spojit. Je třeba zohlednit strukturu segmentů, chemikii sloučení, výběr místa sloučení, rozpustnost, stereochemii a požadavky na čištění. Skládání segmentů je tedy alternativní strategií návrhu syntézy, nikoli automatickým řešením problémů s dlouhými peptidy.

16. Eliminuje rychlejší automatizovaná syntéza potřebu čištění?

Ne. Rychlejší automatizovaný nebo průtokový postup zkracuje dobu některých etap syntézy, ale neprokazuje to, že každá vzniklá molekula má zamýšlenou strukturu. V studiích rychlého průtokového syntézy se stále charakterizoval surový materiál a následné čištění používalo se později, a v dalších pracích týkajících se automatizace bylo samostatně porovnáváno čistota surového materiálu a výkon po izolaci. [6] [7] Dobré výsledky systému pro zkoumané sekvence však nezaručují stejné výsledky pro každý nový cíl. Zrychlená syntéza stále musí být spojena s odpovídajícím čištěním, potvrzením identity, analýzou znečištění a konečnou charakteristikou.

17. Proč je zvýšení objemu výroby komplikovanější než výroba většího množství výrobků?

Zvětšení rozsahu mění fyzikální a chemické podmínky a nejen množství materiálu. Smíchání, výměna tepla, tuhnutí pryskyřice, distribuce činidel, tlak, filtrace, manipulace s rozpouštědly, rozpustnost polotovarů a možnosti čištění mohou chovat se jinak při vyšší výrobní objemnosti. V průmyslovém výzkumu bylo 40 peptidových procesů samostatně posuzováno syntéza, čištění a izolace během analýzy spotřeby materiálů. [14] Výsledky ukazují, proč je třeba výrobu považovat za kompletní proces. Skalabilní metoda musí opakovaně vést k získání charakterizovaného materiálu ve všech fázích, nikoli pouze většího množství surového peptidu.

18. Je peptid připraven okamžitě po složení správné sekvence?

Ne nutně. Skládání řetězce vytváří skelet sekvence pouze v takovém rozsahu, v jakém to potvrzují proces a analytické údaje. V závislosti na molekule mohou být nadále potřebné odstraňování vazeb, odstraňování vazeb, cyklizace, oxidace, tvorba disiarčkových mostíků, faldování, konjugace, čištění a charakterizace. Syntéza BPTI představuje dobrý příklad procesu, ve kterém po složení lineární sekvence následovalo čištění a tvorba falcované struktury obsahující disiarčkové mostíky. [3] Definice „ready peptide” by tedy měla odkazovat na molekulární formu požadovanou v daném vědeckém kontextu, a nikoli pouze na dokončení postupu přidávání aminokyselin.

19. Dokazuje správná molekulová hmotnost správnou sekvenci peptidů?

Ne. Komparace hmotnostních poměrů je cenným důkazem, ale sama o sobě nemůže potvrzovat úplnou sekvenci ani molekulární strukturu. Izobarytické struktury mohou mít stejnou hmotnost, ale různé stereochemické rozdíly nemusí vůbec vést k změně hmotnosti molekuly. Výzkumy znečištění syntetickými peptidy ukázaly, že rozlišování strukturálně odlišných látek může vyžadovat tandemovou hmotnostní spektrometrii a další analýzy. [12] V případě otázek týkajících se stereochemické integrity mohou být potřebné také chirální metody. [13] Hmotnost molekuly tedy musí být považována za jeden z prvků hodnocení identity, nikoli za její úplné potvrzení.

20. Proč by se čištění mělo považovat za součást výroby peptidu a ne pouze za konečný přísadek?

Čištění rozhoduje o tom, zda lze cílový peptid účinně oddělit od deleční sekvence, vedlejších produktů, zbytkových činidel a strukturálně podobných znečišťujících látek a dalších látek vzniklých během syntézy. Metoda umožňující velmi rychlé výrobu velkého množství surového materiálu může být i nadále nepraktická, pokud není možné účinně získat požadovanou kvalitu cílového produktu. Z tohoto důvodu průmyslové analýzy peptidových procesů zahrnují společně syntézu, čištění a izolaci. [14] Efektivnost výroby by měla být nakonec hodnocena na základě množství a vlastností izolovaného konečného materiálu, nikoli pouze rychlosti syntézy.

Omezení při porovnávání metod syntézy peptidů

Při interpretaci studií porovnávajících technologie výroby peptidů je třeba mít na paměti několik významných omezení.

Za prvé, sekvence výrazně ovlivňuje obtížnost syntézy. Metoda, která funguje u jednoho peptidu nemusí fungovat stejně u jiného. Agregace, hydrofobnost, aminokyselinový složení, délka, tendence k tvorbě sekundárních struktur a náchylnost k vedlejším reakcím mohou měnit chování procesu. [1] [4]

Za druhé, čistota surového materiálu, účinnost po izolaci, konečná čistota a obsah peptidu jsou různé parametry. Porovnávání metod pouze na základě jednoho z nich může poskytnout neúplný obraz účinnosti výroby. [7]

Za třetí, rychlé složení řetězu neznamená rychlou výrobu celého materiálu. Odstraňování, čištění, izolace, konečné tvarování struktury, analytické testy a dokumentace také ovlivňují celkovou dobu výroby. [6] [7]

Čtvrté, analytická čistota závisí na použité metodě. HPLC, hmotnostní spektrometrie, tandemová hmotnostní spektrometrie a chirální analýza odpovídají různým otázkám. Jeden analytický výsledek nemusí potvrzovat úplnou strukturalní identitu. [12] [13]

Po páté, velikost má vliv na průběh procesu. Výsledky laboratorní syntézy nelze automaticky přenést na průmyslovou výrobu bez ohledu na mísušení, transport hmoty, možnosti čištění, spotřebu materiálů a dalších veličin závislých na velikosti. [14]

Po šesté, historické ekonomické srovnání mohou časem ztrácet svou aktuálnost. Náklady na činidla, úroveň automatizace, technologie pro extrakci, vybavení pro čištění, odstraňování rozpouštědel a výrobní infrastruktura se neustále vyvíjejí. Starší analýzy nákladů mohou nadále mít vědecký význam, ale nemusí odrážet aktuální ekonomiku trhu. [1]

Po sedmé, environmentální srovnání vyžadují jednotné hranice analýzy. Hodnocení spotřeby rozpouštědel během samotného procesu vytváření řetězce, přičemž se vynechá čištění a izolace, může vést k mylným závěrům týkajícím se vyvážení procesu. [14] [15]

Konečně samotná název metody neurčuje kvalitu produktu. SPPS, syntéza v roztoku, LPPS, ligace fragmentů a biologická exprese mohou vést k získání vysoce kvalitního materiálu, pokud je proces vhodně navržen a kontrolován. Nicméně žádná z těchto metod automaticky nezaručuje správnou identitu, čistotu, stereochemii, foldování nebo vhodnost pro konkrétní použití.

Souhrn

Syntézu peptidů lze nejlépe chápat jako řízený proces tvorby molekul, nikoli pouze vytváření peptidových vazeb.

Cílem je vytvořit konkrétní aminokyselinovou sekvenci při současném kontrole způsobu spojování ostatních látek, chemie ochranných skupin, stereochemie, vedlejších reakcí a všech dalších strukturálních požadavků.

Syntéza peptidů v pevném stavu udržuje rostoucí řetězec na nerozpustném nosiči, díky čemuž jsou opakované fáze spájení a filtrace dobře vhodné pro automatizaci. Výhody spojené s opakovaným skladováním však neodstraňují problémy jako jsou neúplné reakce, agregace, sekvenční deleky nebo závislé na sekvenci vedlejší reakce. [4] [6] [7]

Klasická syntéza v roztoku udržuje peptidové poluváhy v tekutém stavu a může poskytovat větší flexibilitu při izolaci a charakterizaci jednotlivých intermediárních produktů. Větší rozdělení a snižující se rozpustnost však mohou představovat závažné omezení.

Metody syntézy v tekutém stavu s rozpustnými značkovacími látkami se snaží spojit chemickou syntézu v roztoku s navrhovanými strategiemi pro získávání materiálu. Mohou tedy představovat další možnost v případě sekvencí a výrobních problémů, pro které klasická SPPS není optimální. [8] [9]

Další nebo zvláště složité molekuly lze také připravovat formováním fragmentů, včetně nativní chemické ligace, místo aby se spoléhalo pouze na nepřetržitý přidávání dalších aminokyselinových resekcí. [10]

Bez ohledu na zvolenou metodu syntézy zůstávají účinnost spárování a chemie ochranných skupin klíčovými faktory, protože malé neúčinnosti a vedlejší reakce se mohou kumulovat během dalších kroků syntézy. Vytváření aspartimidu, deleční sekvence a změny stereochemie ukazují, proč samotná zamýšlená sekvence nepopisuje všechno, co může během procesu vzniknout.[2][11][12]

Práce se také nekončí po složení řetězu.

Čištění rozhoduje o tom, zda lze cílový produkt oddělit od ostatních složek.

Následně odpovídající analytické metody odpovídají na specifické otázky týkající se identity, čistoty, obsahu, stereochemii, konformace a – pokud je to relevantní – funkční aktivity. [3] [12] [13]

Zvýšení rozsahu výroby přináší další otázky týkající se hmotnosti, zachování pryskyřice, spotřeby rozpouštědel, filtrace, možnosti čištění, opakovatelnosti procesu a jeho environmentálního dopadu. Z tohoto důvodu by průmyslová hodnocení procesu měly zahrnovat syntézu, čištění a izolaci společně, a nikoli se soustředit pouze na rychlost slučování. [14] [15]

Nejdůležitější zásada zní takto:

Efektivní výroba peptidu vyžaduje kontrolu celého procesu – od molekulární struktury a tvorby vazeb až po čištění a strukturalní charakterizaci. Získání řetězce s očekávanou nominální hmotností nebo vysokým hlavním chromatografickým piku představuje cenný důkaz, ale žádný z těchto parametrů sám o sobě neposkytuje plnou identitu molekuly ani kvalitu výrobního procesu.

Zastrzeżenie

Článek má výhradně vzdělávací a vědecko-informativní povahu. Popisuje obecné principy chemie peptidů, syntézy v pevném stavu, syntézy v roztoku a v tekutém stavu, strategie ochranných skupin, sloučení, čištění, analytická charakterizace, výrobní postupy a příklady vycházející z publikovaných studií. Nejedná se o laboratorní protokol, výrobní návod, lékařskou radu, průvodce týkajícím se dávkování nebo podávání, ani o certifikát jakosti jakéhokoli konkrétního peptidového produktu. Výsledky experimentů je třeba interpretovat v souvislosti s sekvencí použitých metod, rozsahu procesu, analytických technik a omezení jednotlivých studií.

Odkazy

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K., & Perczel, A. (2016). Bakterieová exprese a/nebo syntéza peptidů na pevných fázích s délkou aminokyselin 20–40, případ studie ligandů GPCR třídy B. Current Protein & Peptide Science, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Prevence tvorby aspartimidu během syntézy peptidů pomocí cyanosulfurylidů jako skupin chránících kyselinu karboxylovou. Nature Communications, 11(1), článek 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C. & Barany, G. (1992). Syntéza s pevnou fázou inzulínu-podobného proteinu (insulin-like peptide) bovinního pankreatického trypsinového inhibitoru (BPTI) a dvou analogů. Kémický přístup k vyhodnocení role disulfidových mostů při skládání a stabilitě proteinů. Mezinárodní časopis pro peptidové a proteinové výzkum, 40(3–4), 194–207. Rekord v databázi PubMed
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). Monitorování pektidové syntézy v pevných fázích v reálném čase pomocí reaktoru s variabilním proudem. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F., & Becker, C. F. W. (2015). Efektivní výroba peptidových hydrazidů prostřednictvím přímé hydrazinolyze pryskyřic Peptidyl-Wang-TentaGel. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Rychlá syntéza peptidů založená na rychlém průtoku. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2017). Plně automatizovaný proudový přístup pro urychlenou syntézu peptidů. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G., & Albericio, F. (2022). Líhová syntéza peptidů (LPPS): Třetí vlna v oblasti přípravy peptidů. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T., & Fukui, T. (2012). Nová amidová ochranná skupina z difenylmetylu pro efektivní syntézu peptidů v kapalné fázi: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., & Kent, S. B. (1994). Syntéza proteinů pomocí nativní chemické ligace. Věda, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Omezování racemizace a tvorby aspartimidu při mikrovlnné syntéze pektidů na pevných bázi s Fmoc. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Charakterizace nečistot v syntetickém peptidu jako substrátu renin pomocí hmotnostní spektrometrie s rychlým bombardováním atomy a hybridní tandemové hmotnostní spektrometrie. Rapidní komunikace v hmotnostním spektrometrii, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G. & Crowther, J. B. (1995). Stanovení chirální čistoty peptidů: hydrolýza v deuterovaném kyselině, derivatizace pomocí Marfeyova činidla a analýza pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie – elektroenzymační ionizační hmotnostní spektrometrie. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Process mass intensity (PMI): Celostná analýza súčasných procesov výroby peptidov informuje o udržateľnosti syntézy peptidov. Journal of Organic Chemistry, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Výzvy udržitelnosti v syntéze a purifikaci peptidů: od výzkumu a vývoje po výrobu. Journal of Organic Chemistry, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001