Synteza peptydów: metoda na fazie stałej, w roztworze i metody produkcji

Synteza peptydów to kontrolowany proces tworzenia łańcuchów aminokwasowych o określonej sekwencji. W syntezie chemicznej wybrane aminokwasy są łączone za pomocą wiązań peptydowych, przy jednoczesnym kontrolowaniu innych reaktywnych grup obecnych w tych cząsteczkach. Celem nie jest więc samo połączenie aminokwasów, ale uzyskanie konkretnej struktury molekularnej o określonej sekwencji, stereochemii, budowie końców łańcucha oraz – jeśli jest to wymagane – dodatkowych cechach strukturalnych.

Do głównych metod należą synteza peptydów na fazie stałej (SPPS), klasyczna synteza w roztworze oraz nowsze metody syntezy peptydów w fazie ciekłej (LPPS), wykorzystujące rozpuszczalne nośniki lub znaczniki molekularne. Laboratoria badawcze i zakłady produkcyjne mogą również łączyć różne podejścia, przygotowywać osobno krótsze fragmenty i następnie je ze sobą łączyć albo wykorzystywać ekspresję biologiczną, jeśli jest ona bardziej odpowiednia dla danej sekwencji.

Porównanie syntezy chemicznej z ekspresją bakteryjną polipeptydów składających się z 20–40 reszt aminokwasowych pokazuje ważną zasadę: praktyczny wybór metody produkcji zależy od konkretnej cząsteczki, jej sekwencji, skłonności do agregacji, wymaganych modyfikacji, skali produkcji oraz wymagań analitycznych. [1]

Uzyskanie zamierzonej sekwencji aminokwasowej jest tylko jednym z etapów produkcji peptydu.

Cały proces może obejmować:

projektowanie sekwencji → przygotowanie bloków budulcowych → zabezpieczanie grup funkcyjnych → sprzęganie → usuwanie grup ochronnych → składanie łańcucha → odszczepianie lub łączenie fragmentów → końcowe kształtowanie struktury → oczyszczanie → potwierdzenie tożsamości → analizę zanieczyszczeń → oznaczanie zawartości → końcową charakterystykę.

W przypadku niektórych peptydów konieczne są również dodatkowe etapy, takie jak cyklizacja, tworzenie mostków disiarczkowych, fałdowanie, koniugacja lub inne modyfikacje chemiczne.

Z tego powodu prawidłowe złożenie łańcucha nie oznacza automatycznie, że materiał końcowy posiada właściwą tożsamość, czystość, stereochemię, konformację, stabilność lub inne wymagane cechy.

Czym jest synteza peptydów?

Tworzenie określonej sekwencji aminokwasowej

Peptyd składa się z reszt aminokwasowych połączonych wiązaniami peptydowymi.

Celem syntezy peptydu jest utworzenie tych połączeń w z góry określonej kolejności, często przy jednoczesnym kontrolowaniu:

• rodzaju aminokwasów;
• kolejności aminokwasów w sekwencji;
• stereochemii;
• struktury końca N;
• struktury końca C;
• modyfikacji łańcuchów bocznych;
• rozmieszczenia mostków disiarczkowych;
• cyklizacji;
• innych wymaganych cech strukturalnych.

Sekwencja ma podstawowe znaczenie, ponieważ identyczny skład aminokwasowy może prowadzić do powstania różnych cząsteczek, jeśli aminokwasy występują w innej kolejności.

Stwierdzenie, że dana cząsteczka jest „peptydem złożonym z pięciu aminokwasów”, dostarcza więc bardzo niewiele informacji o jej rzeczywistej strukturze. Aby prawidłowo opisać cząsteczkę, trzeba znać rodzaj aminokwasów, ich kolejność, stereochemię, grupy końcowe oraz ewentualne dodatkowe modyfikacje.

Dwa peptydy mogą zatem mieć dokładnie taki sam skład aminokwasowy, a mimo to być różnymi strukturami molekularnymi.

Dodatkowe różnice mogą wynikać z modyfikacji końców łańcucha, obecności mostków disiarczkowych, cyklicznego szkieletu, zmian w łańcuchach bocznych lub odmiennej konfiguracji stereochemicznej.

Chemiczna synteza peptydów zazwyczaj wykorzystuje aminokwasy, których reaktywne grupy zostały selektywnie zabezpieczone.

Tymczasowe grupy ochronne umożliwiają utworzenie konkretnego zamierzonego połączenia chemicznego przy jednoczesnym ograniczeniu konkurencyjnych reakcji w innych miejscach cząsteczki.

W kolejnych zaplanowanych etapach syntezy grupy te są usuwane lub zmieniane.

Kontrolowana reakcja zamiast spontanicznego łączenia

W podstawowych opisach chemicznych tworzenie wiązania peptydowego często przedstawia się jako reakcję kondensacji, w której dwa aminokwasy łączą się z sumarycznym wydzieleniem cząsteczki wody.

Równanie takie opisuje ogólny bilans reakcji.

Nie należy jednak utożsamiać go ze sposobem, w jaki w praktyce przeprowadza się kontrolowaną syntezę peptydów.

Samo zmieszanie wolnych aminokwasów nie pozwoliłoby wiarygodnie określić:

• która grupa aminowa ma reagować;
• która grupa karboksylowa ma reagować;
• który aminokwas ma znaleźć się pierwszy;
• który ma znaleźć się drugi;
• czy zaczną reagować łańcuchy boczne;
• czy stereochemia zostanie zachowana;
• czy nie powstaną liczne niepożądane produkty.

W praktycznej syntezie chemicznej stosuje się więc kontrolowane strategie aktywacji i zabezpieczania grup funkcyjnych.

Grupa pochodząca od grupy karboksylowej jest zazwyczaj aktywowana w taki sposób, aby mogła skutecznie reagować z wybraną grupą aminową. Grupy ochronne, kolejność reakcji, chemia nośnika, odczynniki sprzęgające, środowisko rozpuszczalnika oraz metody izolacji wspólnie pomagają skierować reakcję w stronę zamierzonego produktu.

Skuteczna synteza peptydu wymaga więc kontroli zarówno chemii, która ma zachodzić, jak i tej, której należy zapobiegać.

Dobrym przykładem jest powstawanie aspartimidu.

Badacze opracowali alternatywną metodę ochrony grupy karboksylowej, której celem było ograniczenie tej problematycznej reakcji ubocznej podczas składania peptydu. [2]

Badanie pokazuje szerszą zasadę chemii peptydów: zapobieganie niepożądanym przemianom molekularnym może być równie ważne jak tworzenie właściwego wiązania peptydowego.

Kiedy można uznać peptyd za gotowy?

Zakończenie tworzenia liniowego szkieletu peptydu nie zawsze oznacza zakończenie całej syntezy.

W zależności od docelowej cząsteczki po złożeniu łańcucha mogą być potrzebne dodatkowe etapy.

Mogą one obejmować:

• całkowite usunięcie grup ochronnych;
• odłączenie peptydu od stałego nośnika;
• usunięcie tymczasowych znaczników;
• cyklizację;
• utlenianie;
• tworzenie mostków disiarczkowych;
• fałdowanie;
• koniugację;
• modyfikację końców łańcucha;
• oczyszczanie;
• charakterystykę analityczną.

Niektóre peptydy wymagają stosunkowo niewielu dodatkowych zmian strukturalnych po złożeniu łańcucha.

W przypadku innych późniejsze etapy mają kluczowe znaczenie.

Dobrym przykładem jest synteza bydlęcego inhibitora trypsyny trzustkowej (BPTI). Badacze złożyli liniową sekwencję, oczyścili materiał, a następnie uzyskali pofałdowaną strukturę zawierającą mostki disiarczkowe. Zgodnie z analizami i porównaniami funkcjonalnymi przedstawionymi w badaniu końcowy materiał o naturalnej sekwencji odpowiadał naturalnemu białku w zakresie badanych parametrów. [3]

Przykład ten pokazuje różnicę pomiędzy złożeniem szkieletu peptydowego a uzyskaniem w pełni scharakteryzowanej końcowej formy molekularnej.

Metoda, która pozwala uzyskać prawidłową liniową sekwencję, nie potwierdza automatycznie:

• prawidłowego fałdowania;
• właściwego rozmieszczenia mostków disiarczkowych;
• aktywności biologicznej;
• stabilności;
• profilu zanieczyszczeń;
• przydatności do określonego zastosowania.

Każda z tych kwestii wymaga osobnych dowodów.

Synteza chemiczna, ekspresja biologiczna i metody łączone

W chemicznej syntezie peptydów przygotowane wcześniej bloki molekularne są łączone w kontrolowanych reakcjach laboratoryjnych.

Ekspresja biologiczna wykorzystuje natomiast maszynerię komórkową do wytworzenia zakodowanej sekwencji aminokwasowej. Następnie materiał musi zostać odzyskany, oczyszczony i, jeśli jest to konieczne, poddany dalszemu przetwarzaniu.

Obie metody mogą prowadzić do uzyskania peptydów lub polipeptydów, ale wiążą się z innymi możliwościami i ograniczeniami.

Synteza chemiczna może być szczególnie użyteczna, gdy potrzebne są:

• wybrane niestandardowe aminokwasy;
• modyfikacje chemiczne w konkretnych miejscach;
• określone struktury końców łańcucha;
• znaczniki izotopowe;
• modyfikacje szkieletu peptydowego;
• inne cechy trudne do uzyskania poprzez standardową ekspresję biologiczną.

Ekspresja biologiczna może być atrakcyjna w przypadku odpowiednich dłuższych sekwencji lub określonych strategii znakowania, ale nie eliminuje problemów występujących na późniejszych etapach produkcji.

Nadal należy uwzględnić odzyskiwanie materiału, fałdowanie, przetwarzanie, zanieczyszczenia pochodzące z organizmu gospodarza, oczyszczanie i charakterystykę analityczną.

Żadna z metod nie jest więc uniwersalnie najlepsza.

W porównaniu polipeptydów składających się z 20–40 reszt aminokwasowych zarówno długość sekwencji, jak i jej skłonność do agregacji wpływały na wyniki syntezy na fazie stałej oraz ekspresji bakteryjnej. [1]

Obserwacje te wspierają podejście, w którym metodę produkcji dobiera się do konkretnej cząsteczki.

Historycznych danych dotyczących wydajności, kosztów, wyposażenia i czasu produkcji nie należy traktować jako uniwersalnych współczesnych wartości, ponieważ technologie, odczynniki, automatyzacja, metody oczyszczania oraz ekonomia produkcji zmieniają się wraz z rozwojem technologii.

Synteza peptydów na fazie stałej

Rosnący łańcuch jest przyłączony do nierozpuszczalnego nośnika

W syntezie peptydów na fazie stałej (SPPS) rosnący łańcuch peptydowy pozostaje przyłączony do nierozpuszczalnego nośnika podczas kolejnych cykli syntezy.

Nośnikiem jest najczęściej funkcjonalizowana żywica polimerowa.

Łącznik, czyli linker, wiąże peptyd z nośnikiem i wpływa między innymi na sposób późniejszego uwolnienia gotowego łańcucha oraz na rodzaj uzyskanej grupy końcowej.

Jedną z głównych praktycznych zalet SPPS jest łatwiejsze rozdzielanie materiału.

Po zakończeniu określonego etapu reakcji rozpuszczalne odczynniki i wiele rozpuszczalnych produktów ubocznych można usunąć poprzez przemywanie, podczas gdy rosnący peptyd pozostaje związany z fazą stałą.

Dzięki temu nie trzeba po dodaniu każdego kolejnego aminokwasu izolować i oczyszczać rosnącego peptydu jako oddzielnego, wolnego związku.

Ta wygoda może jednak prowadzić do ważnego nieporozumienia.

Przemywanie żywicy nie oznacza, że wszystkie nieprawidłowe peptydy zostały usunięte.

Jeżeli przyłączony do żywicy łańcuch nie zareaguje podczas jednego etapu sprzęgania, może nadal pozostawać na nośniku.

W kolejnych cyklach może ponownie reagować i dalej się wydłużać.

W efekcie może powstać sekwencja delecyjna, czyli cząsteczka różniąca się od docelowego peptydu brakiem jednej lub większej liczby reszt aminokwasowych.

Podobnie chemicznie zmodyfikowane lub niecałkowicie odbezpieczone łańcuchy związane z żywicą mogą uczestniczyć w kolejnych etapach syntezy.

SPPS upraszcza więc rozdzielanie substancji rozpuszczalnych od materiału związanego z żywicą.

Nie gwarantuje jednak idealnej zgodności sekwencji.

Powtarzający się cykl odbezpieczania i sprzęgania

Typowa etapowa synteza SPPS obejmuje powtarzanie trzech podstawowych operacji:

odbezpieczenie → sprzęganie → przemywanie.

Najpierw odsłaniana jest reaktywna grupa aminowa znajdująca się na końcu rosnącego łańcucha.

Następnie do łańcucha przyłączany jest kolejny zabezpieczony aminokwas.

Rozpuszczalne odczynniki, nadmiar aminokwasu i wiele produktów reakcji są usuwane przed rozpoczęciem następnego cyklu.

Powtarzanie tego procesu umożliwia budowanie peptydu po jednej reszcie aminokwasowej.

W klasycznej SPPS reszta C-końcowa jest zazwyczaj przyłączana do nośnika jako pierwsza, a następnie łańcuch wydłuża się w kierunku N-końca.

Różni się to od standardowej rybosomalnej syntezy białek, podczas której kolejne aminokwasy są dołączane do C-końca rosnącego łańcucha.

Końcowa kolejność aminokwasów może jednak być identyczna, mimo że kierunek i chemia procesu składania są inne.

Określenia „cykl” nie należy rozumieć jako jednego uniwersalnego zestawu warunków reakcji odpowiedniego dla każdej reszty i każdej sekwencji.

Przebieg reakcji może zależeć od:

• strategii grup ochronnych;
• rodzaju aminokwasu;
• warunków przestrzennych wokół miejsca reakcji;
• rodzaju żywicy;
• linkera;
• długości łańcucha;
• agregacji;
• rozpuszczalnika;
• chemii sprzęgania;
• zachowania strukturalnego rosnącego peptydu.

Reakcja przebiegająca łatwo na początku syntezy może stać się znacznie trudniejsza na późniejszym etapie.

Dlatego monitorowanie procesu pozostaje istotne nawet w wysoce zautomatyzowanych systemach.

Dlaczego właściwości żywicy mają znaczenie?

Stały nośnik nie jest jedynie biernym uchwytem.

Jego właściwości fizyczne i chemiczne mogą bezpośrednio wpływać na przebieg reakcji.

Jednym z ważnych parametrów jest pęcznienie.

Jeśli żywica prawidłowo pęcznieje w wybranym środowisku rozpuszczalnika, odczynniki mogą łatwiej docierać do miejsc reaktywnych znajdujących się w całej strukturze polimeru.

Niewystarczające pęcznienie lub zmiany struktury żywicy mogą ograniczać ten dostęp.

Znaczenie mogą mieć również:

• gęstość obsadzenia;
• architektura polimeru;
• struktura linkera;
• zgodność z rozpuszczalnikami;
• stabilność mechaniczna;
• porowatość;
• właściwości dyfuzyjne;
• oddziaływania pomiędzy rosnącymi łańcuchami peptydowymi.

Wraz ze wzrostem długości peptydu poszczególne łańcuchy mogą również oddziaływać ze sobą.

Agregacja na żywicy może ograniczać dostęp do miejsc reaktywnych i prowadzić do niepełnego sprzęgania lub niepełnego odbezpieczania.

Oznacza to, że sekwencja zachowująca się prawidłowo na początku syntezy może stawać się coraz trudniejsza wraz z wydłużaniem łańcucha.

Badacze opracowali reaktor przepływowy ze zmiennym złożem, który umożliwiał monitorowanie pęcznienia żywicy na podstawie pomiarów związanych z ciśnieniem. [4]

Badanie dotyczyło agregacji na żywicy i niepełnego tworzenia wiązań jako problemów procesowych, które w innych warunkach mogą być trudne do bezpośredniego zaobserwowania podczas syntezy.

Pokazuje to, że monitorowanie fizycznego zachowania nośnika może dostarczać informacji wykraczających poza samo rejestrowanie dodawanych odczynników.

Do czego służy żywica Wanga?

Chemia linkerów typu Wang jest powszechnie wykorzystywana w SPPS, gdy po odłączeniu peptydu pożądany jest C-koniec w postaci kwasu karboksylowego.

Peptyd jest przyłączony za pomocą wiązania o charakterze estrowym, które można później rozszczepić w odpowiednich warunkach.

Inne systemy linkerów mogą być wybierane wtedy, gdy potrzebna jest odmienna struktura C-końca, na przykład amid.

Warto rozróżniać chemię linkera od całego fizycznego nośnika.

Powiązane linkery typu Wang mogą być wprowadzane do różnych architektur polimerowych.

Materiały takie nie muszą mieć identycznych:

• właściwości pęcznienia;
• pojemności;
• zgodności z rozpuszczalnikami;
• właściwości mechanicznych;
• zachowania podczas reakcji.

Badania z wykorzystaniem nośników peptydyl-Wang-TentaGel wykazały specjalistyczną alternatywną metodę otrzymywania hydrazydów peptydowych, które są użytecznymi półproduktami w chemii peptydów. [5]

Nie oznacza to, że standardowe odszczepianie z żywicy Wanga prowadzi zwykle do powstawania hydrazydów peptydowych.

Pokazuje natomiast ważną zasadę:

nośnik + linker + warunki reakcji + chemia odszczepiania wspólnie określają otrzymywany produkt.

Synteza SPPS w układzie okresowym i przepływowym

SPPS można prowadzić w klasycznych naczyniach okresowych lub w systemach, w których odczynniki przepływają przez reaktor zawierający stały nośnik.

Systemy przepływowe mogą umożliwiać szybką wymianę odczynników oraz dokładniejszą kontrolę środowiska chemicznego otaczającego żywicę.

W badaniu z 2014 roku przedstawiono szybką syntezę peptydów w układzie przepływowym z ciągłym monitorowaniem i zastosowano ją do kilku peptydów oraz małego białka. [6]

W późniejszym badaniu zautomatyzowanym opisano znacznie szybsze składanie łańcuchów, uzyskując dla analizowanych przykładów czystość surowego produktu i wydajność po izolacji porównywalne z klasyczną syntezą okresową. [7]

Badania te pokazują możliwości konkretnych systemów w określonych warunkach.

Nie dowodzą jednak, że każdy peptyd można wytwarzać równie szybko i z taką samą jakością.

Czas potrzebny do wyprodukowania peptydu obejmuje również znacznie więcej niż samo składanie łańcucha.

Całkowity proces może obejmować:

• przygotowanie odczynników;
• przygotowanie żywicy;
• sprzęganie;
• odbezpieczanie;
• przemywanie;
• odszczepianie;
• obróbkę produktu;
• oczyszczanie;
• usuwanie rozpuszczalników;
• końcowe kształtowanie struktury;
• badania analityczne;
• dokumentację.

Szybkie tworzenie wiązań jest więc tylko jednym z elementów całkowitej efektywności produkcji.

Synteza w fazie ciekłej

Co oznacza ten termin?

Określenie „synteza peptydów w fazie ciekłej” może być używane w kilku znaczeniach.

W szerokim ujęciu może po prostu oznaczać syntezę peptydu prowadzoną w roztworze.

W bardziej specjalistycznej literaturze często rozróżnia się jednak:

1. klasyczną syntezę peptydów w roztworze;
2. syntezę peptydów na fazie stałej;
3. nowsze metody LPPS, w których rosnący łańcuch posiada rozpuszczalny znacznik lub nośnik.

Rozróżnienie to jest ważne, ponieważ zmienia się sposób rozdzielania i odzyskiwania produktu.

Swobodnie rozpuszczony, zabezpieczony półprodukt peptydowy może wymagać izolacji z wykorzystaniem jego własnych właściwości fizycznych i chemicznych.

W przypadku znakowanego półproduktu znacznik może zostać zaprojektowany tak, aby ułatwiać wytrącanie, ekstrakcję, zatrzymywanie na membranie lub inny sposób rozdzielania.

Przegląd dotyczący LPPS wyraźnie rozróżnia klasyczną syntezę w roztworze, SPPS i metody wykorzystujące rozpuszczalne znaczniki. [8]

Publikacja jest przydatna do uporządkowania terminologii i metodologii.

Nie powinna jednak być interpretowana jako pojedynczy eksperyment dowodzący, że jedna z metod jest najlepsza dla każdego peptydu.

Klasyczna synteza peptydów w roztworze

W klasycznej syntezie w roztworze zabezpieczone aminokwasy, półprodukty peptydowe lub fragmenty pozostają rozpuszczone w środowisku reakcji zamiast być kowalencyjnie przyłączone do nierozpuszczalnej żywicy.

Po zakończeniu reakcji odpowiedni półprodukt może zostać wyizolowany, oczyszczony i w razie potrzeby scharakteryzowany przed rozpoczęciem kolejnego etapu.

Może to przynosić pewne korzyści.

Badacze mogą:

• charakteryzować poszczególne półprodukty;
• dobierać metodę oczyszczania do konkretnego półproduktu;
• optymalizować poszczególne przemiany;
• przygotowywać fragmenty niezależnie;
• modyfikować trasę syntezy, gdy określony półprodukt sprawia problemy.

Synteza w roztworze może jednak wiązać się również ze znacznymi trudnościami.

Wraz z wydłużaniem łańcucha peptydy mogą:

• stawać się słabo rozpuszczalne;
• agregować;
• być trudne do krystalizacji;
• tworzyć blisko spokrewnione zanieczyszczenia;
• być trudne do rozdzielenia;
• wymagać wielokrotnej izolacji;
• powodować straty materiału podczas kolejnych etapów obróbki.

Synteza w roztworze nie jest więc automatycznie prostsza ani łatwiejsza do skalowania niż SPPS.

Jej przydatność zależy od konkretnej sekwencji, stabilności półproduktów, rozpuszczalności, długości trasy syntezy, zachowania podczas oczyszczania oraz efektywności kolejnych etapów izolacji.

Rozwój znakowanych strategii LPPS częściowo wynika z prób rozwiązania właśnie tych problemów związanych z separacją i obsługą materiału. [8]

Rozpuszczalne znaczniki łączą projektowanie reakcji z projektowaniem separacji

W znakowanej LPPS rosnący peptyd posiada tymczasowe przyłączenie molekularne zaprojektowane w taki sposób, aby wpływać na jego właściwości fizyczne.

Znacznik może umożliwiać utrzymanie wystarczającej rozpuszczalności peptydu podczas reakcji, a następnie ułatwiać jego selektywne odzyskanie.

W zależności od technologii rozdzielanie może wykorzystywać:

• wytrącanie;
• ekstrakcję;
• zatrzymywanie na membranie;
• zachowanie fazowe;
• inne właściwości wynikające z obecności znacznika.

W jednej z eksperymentalnych strategii wykorzystano długołańcuchową grupę ochronną na C-końcu do przygotowania amidów peptydowych.

Powtarzane reakcje i etapy wytrącania umożliwiły badaczom przygotowanie hydrofobowego peptydu, który w zastosowanym przez nich porównaniu był trudny do uzyskania zadowalająco metodą SPPS. [9]

Pokazuje to przydatność tej konkretnej strategii dla analizowanej sekwencji.

Nie dowodzi jednak uniwersalnej przewagi syntezy znakowanej.

Znacznik staje się elementem procesu produkcyjnego i rodzi własne pytania:

• Jak skutecznie jest przyłączany?
• Czy zmienia przebieg reakcji?
• Jak niezawodnie można odzyskać znakowany półprodukt?
• Czy prowadzi do powstawania nowych zanieczyszczeń?
• W jaki sposób jest usuwany?
• Czy można potwierdzić całkowite usunięcie?
• Jakie metody analityczne potwierdzają jego brak w produkcie końcowym?

Rozpuszczalne znaczniki należy więc traktować jako funkcjonalne elementy projektu procesu, a nie wyłącznie jako proste etykiety.

Porównanie głównych metod

Porównanie przedstawia ogólne zasady działania poszczególnych metod.

Nie określa, która z nich zapewni najlepszą wydajność, czystość, koszt, zrównoważenie środowiskowe czy możliwość skalowania dla konkretnej sekwencji.

Parametry te należy oceniać na podstawie rzeczywistej cząsteczki i konkretnego procesu produkcyjnego. [4] [8] [9]

Łączenie fragmentów i produkcja hybrydowa

Peptyd nie zawsze musi być tworzony w jednym nieprzerwanym procesie polegającym na dodawaniu kolejnych reszt aminokwasowych.

Alternatywną strategią jest oddzielne przygotowanie krótszych fragmentów peptydowych, a następnie ich połączenie.

Proces hybrydowy może na przykład wykorzystywać SPPS do otrzymywania poszczególnych fragmentów oraz chemię w roztworze do ich łączenia.

Strategie fragmentowe mogą ograniczać niektóre problemy związane z bardzo długą syntezą etapową.

Wprowadzają jednak nowe wyzwania, takie jak:

• wybór odpowiedniego miejsca połączenia;
• rozpuszczalność fragmentów;
• aktywacja miejsca łączenia;
• chemoselektywność;
• zachowanie stereochemii;
• reakcje uboczne;
• oczyszczanie fragmentów;
• oczyszczanie po ich połączeniu.

Ważnym przykładem kontrolowanego łączenia fragmentów jest natywna ligacja chemiczna.

W klasycznej wersji tioester peptydowy reaguje z drugim peptydem zawierającym N-końcową cysteinę. Następujące później przegrupowanie prowadzi do utworzenia prawidłowego wiązania w szkielecie peptydowym w miejscu ligacji.

Pierwotne badania wykazały możliwość uzyskania po ligacji i fałdowaniu białka zawierającego mostki disiarczkowe. [10]

Potwierdza to znaczenie tej strategii łączenia fragmentów.

Nie oznacza jednak, że dowolne dwa niezmodyfikowane fragmenty peptydowe mogą spontanicznie się połączyć.

Sprzęganie i grupy ochronne

Sprzęganie tworzy zamierzone połączenie

Sprzęganie jest etapem reakcji, podczas którego pomiędzy wybranymi jednostkami powstaje nowe wiązanie peptydowe.

Zazwyczaj grupa pochodząca od grupy karboksylowej jest aktywowana tak, aby mogła skutecznie reagować z odpowiednią grupą aminową.

Chemia aktywacji musi być zgodna z:

• rosnącą sekwencją;
• tymczasowymi grupami ochronnymi;
• ochroną łańcuchów bocznych;
• stereochemią;
• nośnikiem lub znacznikiem;
• środowiskiem rozpuszczalnika;
• innymi grupami funkcyjnymi obecnymi w cząsteczce.

Skuteczne sprzęganie jest szczególnie ważne w syntezie etapowej, ponieważ niepełna reakcja może prowadzić do powstawania sekwencji delecyjnych.

Jeżeli jeden etap dodawania aminokwasu nie powiedzie się dla części rosnących łańcuchów, takie łańcuchy mogą pozostać w układzie i uczestniczyć w kolejnych cyklach.

W efekcie mogą powstać cząsteczki bardzo podobne do docelowego peptydu, ale pozbawione jednej reszty.

Nawet niewielkie nieefektywności mogą więc kumulować się podczas wielu etapów syntezy.

Prosty przykład matematyczny dobrze ilustruje ten problem.

Jeżeli każdy z 50 niezależnych etapów składania miałby 99% prawdopodobieństwa powodzenia, odsetek cząsteczek, dla których wszystkie etapy zakończyłyby się sukcesem, wynosiłby:

0,99^50 ≈ 0,605

czyli około 61%.

Jest to wyłącznie ilustracja matematyczna.

Nie stanowi prognozy rzeczywistej czystości ani wydajności syntezy peptydu zawierającego 50 reszt.

Rzeczywista produkcja obejmuje:

• różne wydajności sprzęgania w poszczególnych pozycjach;
• etapy odbezpieczania;
• reakcje uboczne;
• zależne od sekwencji trudności;
• strategie ponownego sprzęgania;
• straty podczas odszczepiania;
• straty podczas oczyszczania;
• inne zmienne procesowe.

Obliczenie pokazuje jedynie, dlaczego nawet pozornie niewielka nieefektywność pojedynczego etapu może nabrać dużego znaczenia w wieloetapowej syntezie.

Grupy ochronne kontrolują miejsce reakcji

Aminokwas może posiadać kilka chemicznie reaktywnych grup.

Bez selektywnej kontroli reakcje sprzęgania mogłyby zachodzić w niepożądanych miejscach.

Grupy ochronne tymczasowo blokują wybrane miejsca reaktywne.

Grupa aminowa wykorzystywana do wydłużania łańcucha zazwyczaj wymaga tymczasowej ochrony, natomiast reaktywne łańcuchy boczne mogą wymagać zabezpieczenia pozostającego na miejscu przez wiele cykli syntezy.

Połączenie z nośnikiem również musi przetrwać te etapy aż do momentu zaplanowanego odszczepienia.

Wybór grup ochronnych wpływa więc na całą strategię syntezy.

Należy uwzględnić:

• sposób ich wprowadzania;
• stabilność;
• sposób usuwania;
• zgodność z innymi grupami ochronnymi;
• zgodność z nośnikiem;
• reakcje uboczne;
• wpływ konkretnej sekwencji;
• końcowe warunki odbezpieczania.

Badania wykorzystujące ochronę opartą na cyjanosulfurylidzie dotyczyły powstawania aspartimidu poprzez zmianę sposobu zabezpieczenia grupy karboksylowej. [2]

Wyniki pokazują, że strategia grup ochronnych wpływa nie tylko na to, czy zamierzona reakcja może zajść, ale również na to, jakie niepożądane reakcje stają się możliwe.

Fmoc, Boc i ochrona ortogonalna

Fmoc i Boc należą do szeroko stosowanych grup chroniących grupy aminowe.

Istotnie różnią się sposobem usuwania.

Fmoc jest zazwyczaj usuwany w warunkach zasadowych, natomiast Boc jest wrażliwy na warunki kwaśne.

Właściwości te pozwalają stosować je jako elementy szerszych strategii ochrony.

W popularnej SPPS opartej na Fmoc tymczasowa ochrona N-końcowa Fmoc jest wielokrotnie usuwana, podczas gdy wybrane grupy ochronne łańcuchów bocznych oraz połączenie z żywicą pozostają nienaruszone do późniejszych etapów.

Inne strategie mogą wykorzystywać odmienne kombinacje.

Szczególnie ważnym pojęciem jest ochrona ortogonalna.

Dwie grupy ochronne są uznawane za ortogonalne, jeśli jedną można selektywnie usunąć w warunkach, w których druga pozostaje wystarczająco stabilna, aby możliwe było dalsze prowadzenie syntezy.

Ortogonalność jest więc praktyczną relacją zgodności chemicznej.

Nie oznacza, że każda zabezpieczona grupa pozostanie całkowicie niezmieniona po nieograniczonej liczbie ekspozycji na wszystkie warunki reakcji.

Reakcje uboczne nadal mogą występować.

W badaniach syntezy Fmoc opisano zarówno powstawanie aspartimidu, jak i niepożądane zmiany stereochemiczne mimo zakładanej selektywności ogólnej strategii ochronnej. [11]

Stereochemia jest częścią tożsamości cząsteczki

Wiele aminokwasów posiada centrum chiralne.

Oznacza to, że ich atomy mogą przyjmować różne układy przestrzenne odpowiadające różnym formom stereochemicznym.

Zmiana konfiguracji jednego centrum stereogenicznego może prowadzić do powstania innej struktury peptydu bez konieczności zmiany jego nominalnej masy.

Dlatego sama masa nie może potwierdzić pełnej tożsamości peptydu.

Epimeryzacja zazwyczaj oznacza zmianę konfiguracji jednego centrum stereogenicznego w cząsteczce zawierającej kilka takich centrów.

Racemizacja jest również często omawiana w chemii peptydów w kontekście utraty integralności stereochemicznej reszt aminokwasowych.

Zmiany te są istotne, ponieważ rozpoznawanie molekularne może silnie zależeć od przestrzennego ułożenia atomów.

Dwie cząsteczki o tym samym składzie pierwiastkowym i nominalnej masie mogą więc zachowywać się inaczej, jeśli różnią się stereochemią.

W badaniu syntezy Fmoc wspomaganej mikrofalami stwierdzono, że niektóre reszty były podatne na niepożądane zmiany stereochemiczne w zastosowanych warunkach. Modyfikacja metody ograniczała występowanie tych reakcji. [11]

Nie oznacza to, że ogrzewanie z definicji uszkadza wszystkie peptydy.

Prawidłowy wniosek jest taki, że przyspieszanie reakcji należy oceniać razem z zależną od sekwencji selektywnością chemiczną.

Aspartimid i inne pokrewne zanieczyszczenia

Powstawanie aspartimidu jest znaną reakcją uboczną dotyczącą określonych sekwencji zawierających asparaginian.

Może powstać niepożądany cykliczny półprodukt, z którego następnie tworzą się związki o zmienionej łączności szkieletu lub stereochemii.

Prawdopodobieństwo tej reakcji zależy od sekwencji oraz warunków procesu.

Inne zanieczyszczenia związane z syntezą mogą wynikać z:

• niepełnego sprzęgania;
• niepełnego odbezpieczania;
• powstawania sekwencji delecyjnych;
• reakcji łańcuchów bocznych;
• zmian stereochemicznych;
• reakcji podczas odszczepiania;
• utleniania;
• przegrupowań;
• warunków obróbki produktu;
• niepełnego usunięcia grup ochronnych.

Niektóre zanieczyszczenia powodują łatwo zauważalną zmianę masy cząsteczkowej.

Inne są znacznie trudniejsze do rozróżnienia.

W badaniach analitycznych syntetycznego peptydu będącego substratem reniny zidentyfikowano wiele zanieczyszczeń, w tym składniki wykazujące taką samą zmianę masy, ale zawierające modyfikacje w różnych pozycjach. [12]

Do ich rozróżnienia potrzebna była dodatkowa analiza strukturalna.

Badacze traktowali również proponowane mechanizmy powstawania tych zanieczyszczeń jako hipotezy.

Jest to ważne rozróżnienie:

ustalenie, czym jest zanieczyszczenie, oraz udowodnienie dokładnego mechanizmu jego powstania to dwa odrębne pytania naukowe.

Nie należy przedstawiać prawdopodobnego mechanizmu jako potwierdzonego wyłącznie dlatego, że odpowiada obserwowanej masie cząsteczkowej.

Oczyszczanie, skalowanie i jakość produkcji

Produkt surowy, produkt oczyszczony i wydajność

Surowy peptyd to materiał otrzymany przed zakończeniem odpowiednich etapów oczyszczania.

Może zawierać:

• docelowy peptyd;
• sekwencje delecyjne;
• materiał niecałkowicie odbezpieczony;
• zmodyfikowane sekwencje;
• pozostałości odczynników;
• produkty związane z odszczepianiem;
• sole;
• rozpuszczalniki;
• inne składniki powstające w procesie.

Oczyszczanie ma na celu oddzielenie właściwego peptydu od tej mieszaniny.

Należy wyraźnie rozróżnić trzy pojęcia:

czystość produktu surowego — zmierzony skład materiału przed końcowym oczyszczaniem;

wydajność produktu oczyszczonego lub wyizolowanego — ilość odzyskanego materiału docelowego względem określonej wartości początkowej lub teoretycznej;

czystość końcowa — skład wyizolowanego materiału określony za pomocą konkretnej metody analitycznej.

Pojęcia te nie są wymienne.

Proces może prowadzić do powstania dużej ilości surowego materiału, ale umożliwiać odzyskanie stosunkowo niewielkiej ilości oczyszczonego produktu.

Inny proces może dawać mniej materiału surowego, ale charakteryzować się wysoką selektywnością tworzenia produktu docelowego.

Podobnie wysoka czystość analityczna nie musi oznaczać wysokiej wydajności produkcyjnej.

W badaniach przyspieszonej syntezy przepływowej prawidłowo raportowano osobno czystość materiału surowego i wydajność po izolacji. [7]

Chromatografia rozdziela składniki, ale nie odpowiada na każde pytanie

Wysokosprawna chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) jest szeroko stosowana do analizy i oczyszczania peptydów.

Różne cząsteczki w odmienny sposób oddziałują z fazą stacjonarną i ruchomą.

W odpowiednich warunkach różnice te umożliwiają rozdzielanie składników mieszaniny.

Chromatografia analityczna i preparatywna mają powiązane, ale odmienne zastosowania.

Analityczna HPLC służy przede wszystkim do badania składu próbki.

Preparatywna HPLC jest wykorzystywana do fizycznego zbierania rozdzielonych składników.

Chromatogram może dostarczać wielu wartościowych informacji.

Dużego głównego piku lub wysokiego procentowego udziału jego powierzchni nie należy jednak traktować jako pełnej charakterystyki molekularnej.

Wyniki chromatografii zależą między innymi od:

• rodzaju kolumny;
• fazy ruchomej;
• gradientu;
• temperatury;
• metody detekcji;
• długości fali;
• przygotowania próbki;
• sposobu integracji pików;
• rozdzielczości;
• właściwości zanieczyszczeń.

Dwa związki mogą potencjalnie eluować w tym samym czasie.

Niektóre składniki próbki mogą również różnie reagować na zastosowany detektor.

Dlatego wysoka czystość powierzchniowa w HPLC nie jest równoznaczna z pełnym potwierdzeniem tożsamości molekularnej.

Badania izobarycznych zanieczyszczeń peptydowych oraz analizy chiralnej pokazują, dlaczego mogą być potrzebne uzupełniające metody analityczne. [12] [13]

Metoda analityczna musi odpowiadać konkretnemu pytaniu strukturalnemu.

Tożsamość, czystość i zawartość oznaczają różne rzeczy

W charakterystyce peptydów szczególnie ważne są trzy pojęcia.

Tożsamość odpowiada na pytanie:

Czy w próbce znajduje się zamierzona cząsteczka?

Czystość odpowiada na pytanie:

Jakie inne składniki znajdują się w próbce lub jaka część mierzonego sygnału odpowiada głównemu składnikowi?

Zawartość odpowiada na pytanie:

Ile rzeczywistego peptydu znajduje się w próbce?

Na te pytania nie zawsze można odpowiedzieć za pomocą jednego pomiaru.

Materiał zawierający peptyd może również zawierać:

• wodę;
• przeciwjony;
• sole;
• pozostałości rozpuszczalników;
• inne składniki związane z procesem;
• zanieczyszczenia.

Całkowita masa odważonego materiału nie musi więc odpowiadać masie samego peptydu.

Podobnie zgodność zmierzonej masy cząsteczkowej z wartością teoretyczną nie potwierdza:

• kompletnej sekwencji aminokwasowej;
• prawidłowej łączności poszczególnych reszt;
• integralności stereochemicznej;
• rozmieszczenia mostków disiarczkowych;
• fałdowania;
• braku izobarycznych zanieczyszczeń.

Spektrometria mas może dostarczać silnych dowodów dotyczących masy cząsteczkowej.

Tandemowa spektrometria mas i inne techniki strukturalne mogą dostarczać dodatkowych informacji o sekwencji.

Metody chiralne pozwalają analizować zagadnienia stereochemiczne, których nie można rozstrzygnąć zwykłym pomiarem masy.

W jednym z badań analitycznych uwzględniono nawet racemizację powstającą podczas przygotowania próbki. Pokazuje to kolejną ważną zasadę: sama procedura analityczna może powodować artefakty, jeśli nie zostanie odpowiednio zaprojektowana. [13]

Fałdowanie i aktywność mogą wymagać osobnego potwierdzenia

W przypadku strukturalnie ograniczonych peptydów i małych białek prawidłowa sekwencja oraz masa cząsteczkowa nadal mogą być niewystarczające do potwierdzenia zamierzonej struktury końcowej.

Dodatkowe pytania mogą obejmować:

• Czy powstały właściwe mostki disiarczkowe?
• Czy cząsteczka przyjęła oczekiwaną konformację?
• Czy cyklizacja jest kompletna?
• Czy obecne są izomery strukturalne?
• Czy syntetyczna cząsteczka wykazuje oczekiwaną aktywność w określonym teście eksperymentalnym?

W badaniu syntezy BPTI wykorzystano kilka metod analitycznych i biofizycznych wraz z oceną hamowania trypsyny. [3]

Łączne wyniki wspierały zgodność syntetycznego materiału o naturalnej sekwencji z naturalnym białkiem w zakresie badanych kryteriów.

Test aktywności odpowiada jednak na określone pytanie funkcjonalne.

Nie zastępuje analizy zanieczyszczeń.

Podobnie podobna aktywność w jednym teście nie potwierdza pełnej równoważności wszystkich właściwości biologicznych, strukturalnych czy produkcyjnych.

Skalowanie produkcji zmienia więcej niż tylko ilość materiału

Zwiększenie skali produkcji nie polega wyłącznie na proporcjonalnym zwiększeniu ilości wszystkich odczynników.

Procesy fizyczne mogą zachowywać się inaczej przy większej skali.

Znaczenie mogą mieć:

• mieszanie;
• wymiana ciepła;
• rozprowadzanie odczynników;
• dyfuzja;
• pęcznienie żywicy;
• ciśnienie;
• filtracja;
• gospodarka rozpuszczalnikami;
• wytrącanie;
• rozpuszczalność półproduktów;
• transport masy;
• możliwości systemu oczyszczania.

Czynniki te mogą wpływać zarówno na przebieg reakcji, jak i na powstawanie zanieczyszczeń.

Oczyszczanie na późniejszych etapach również może stać się wąskim gardłem całej produkcji.

Zwiększenie szybkości syntezy ma ograniczone znaczenie, jeśli system oczyszczania nie jest w stanie skutecznie rozdzielić powstających zanieczyszczeń lub odzyskać produktu o wymaganej jakości.

W analizie przemysłowej obejmującej 40 procesów syntezy peptydów z 14 firm farmaceutycznych oceniano zużycie materiałów podczas syntezy, oczyszczania i izolacji. [14]

Badanie pokazuje, dlaczego ocenę produkcji należy prowadzić dla całego procesu.

Nie oznacza jednak, że każda fabryka, sekwencja lub technologia produkcyjna osiąga identyczne wyniki.

Jakość produkcji jest wynikiem wielu elementów kontroli

Wiarygodna produkcja peptydów wymaga czegoś więcej niż uzyskania jednego satysfakcjonującego wyniku analitycznego.

Kontrolowany proces zazwyczaj obejmuje kilka powiązanych elementów:

zdefiniowana cząsteczka docelowa → odpowiednie materiały wyjściowe → kontrolowana synteza → kontrolowane oczyszczanie → właściwe pobieranie próbek → zwalidowana lub odpowiednia do celu analiza → dokumentacja partii.

Dokumentacja partii łączy wyniki analityczne z materiałem, który rzeczywiście został wyprodukowany.

Certyfikat analizy (COA) podsumowuje wybrane wyniki badań określonej partii.

Jego wartość informacyjna zależy od:

• rodzaju wykonanych badań;
• zastosowanych metod;
• przydatności tych metod;
• specyfikacji;
• identyfikacji próbki;
• możliwości prześledzenia partii;
• potwierdzenia, że raportowane wyniki rzeczywiście dotyczą danego materiału.

Pojedyncza wartość określana jako „czystość” nie może samodzielnie potwierdzić:

• pełnej tożsamości molekularnej;
• zawartości peptydu;
• integralności stereochemicznej;
• poziomu pozostałości rozpuszczalników;
• zawartości wody;
• składu przeciwjonów;
• właściwości mikrobiologicznych;
• fałdowania;
• aktywności biologicznej;
• przydatności do określonego celu.

Odpowiedni zestaw analiz zależy od zamierzonego zastosowania materiału.

Peptyd wykorzystywany jako analityczny materiał odniesienia, odczynnik badawczy stosowany w eksperymencie komórkowym oraz materiał znajdujący się na etapie rozwoju farmaceutycznego mogą wymagać odpowiedzi na inne pytania jakościowe.

Dowody analityczne należy więc interpretować w jasno określonym kontekście, a nie jako uniwersalne potwierdzenie jakości.

Ocena zrównoważenia środowiskowego musi obejmować cały proces

Synteza peptydów może wymagać znacznych ilości rozpuszczalników i odczynników.

Ocena wpływu środowiskowego powinna więc uwzględniać znacznie więcej niż sam etap sprzęgania.

Do istotnych elementów mogą należeć:

• przygotowanie bloków budulcowych;
• odczynniki sprzęgające;
• odczynniki do odbezpieczania;
• przemywanie;
• odszczepianie;
• obróbka produktu;
• chromatografia;
• wymiana rozpuszczalników;
• izolacja;
• suszenie;
• gospodarowanie odpadami.

Zmniejszenie obciążenia środowiskowego może wymagać równoczesnej poprawy kilku etapów.

W opublikowanej analizie dotyczącej produkcji peptydów omówiono problemy związane zarówno z syntezą, jak i oczyszczaniem oraz wskazano potrzebę ulepszania całego projektu procesu. [15]

Jako publikacja perspektywiczna nie stanowi ona kontrolowanego bezpośredniego porównania dowodzącego, że jedna konkretna technologia zawsze jest bardziej przyjazna środowisku.

Podobnie:

szybsza synteza nie oznacza automatycznie bardziej ekologicznej syntezy,

a mniejsze zużycie rozpuszczalników podczas samej syntezy nie oznacza automatycznie mniejszego wpływu całego procesu produkcyjnego.

Porównania środowiskowe wymagają stosowania spójnych granic analizy i najlepiej powinny odnosić zużycie zasobów do określonej ilości wyizolowanego i scharakteryzowanego produktu końcowego.

Najczęściej zadawane pytania

1. Czym różni się synteza peptydów na fazie stałej od syntezy w fazie ciekłej?

W syntezie na fazie stałej rosnący peptyd pozostaje przyłączony do nierozpuszczalnego nośnika, natomiast w klasycznej syntezie w roztworze półprodukt peptydowy pozostaje rozpuszczony i zazwyczaj musi być odzyskiwany na podstawie swoich właściwości fizycznych i chemicznych. W węższym znaczeniu LPPS rozpuszczony rosnący łańcuch posiada dodatkowo rozpuszczalny znacznik lub nośnik ułatwiający późniejsze rozdzielanie. Badania syntezy znakowanej pokazują jedną ze strategii łączenia chemii roztworowej z odzyskiwaniem poprzez wytrącanie, natomiast literatura dotycząca LPPS odróżnia takie rozwiązania zarówno od klasycznej syntezy w roztworze, jak i od SPPS. Żadna metoda nie jest z definicji optymalna dla każdego peptydu. Podstawowa różnica dotyczy sposobu fizycznego prowadzenia i rozdzielania rosnącego łańcucha podczas kolejnych etapów syntezy. [8] [9]

2. Dlaczego podczas syntezy peptydów mogą powstawać zanieczyszczenia?

Zanieczyszczenia mogą powstawać dlatego, że zamierzone reakcje nie zawsze zachodzą ilościowo, a inne grupy funkcyjne mogą uczestniczyć w niepożądanych reakcjach. Niepełne sprzęganie może prowadzić do sekwencji delecyjnych, niepełne odbezpieczanie może zakłócać dalsze składanie łańcucha, a niektóre sekwencje są podatne na zmiany stereochemiczne, powstawanie aspartimidu, utlenianie, przegrupowania lub produkty uboczne związane z odszczepianiem. Badania syntezy Fmoc oraz analizy strukturalnej syntetycznych zanieczyszczeń peptydowych dokumentują kilka takich przykładów. [11] [12] Częstość i znaczenie poszczególnych zanieczyszczeń zależą od sekwencji i procesu, dlatego automatyzacji syntezy nie należy utożsamiać z całkowitym brakiem błędów chemicznych.

3. Jaką rolę pełni żywica w syntezie peptydów?

Żywica utrzymuje rosnący peptyd, podczas gdy rozpuszczalne odczynniki i wiele produktów ubocznych można usuwać pomiędzy kolejnymi etapami syntezy. Znacznie upraszcza to powtarzające się składanie łańcucha, ale żywica nie jest wyłącznie mechanicznym uchwytem. Jej pęcznienie, stopień obsadzenia, architektura polimeru, zgodność z rozpuszczalnikami i dostępność miejsc reakcji mogą wpływać na skuteczność docierania odczynników do przyłączonego peptydu. W badaniach z wykorzystaniem reaktora ze zmiennym złożem monitorowano zachowanie żywicy podczas analizy agregacji i efektywności sprzęgania. [4] Takie monitorowanie nie eliminuje błędów sekwencji, ale pokazuje, dlaczego fizyczny stan żywicy może być istotną zmienną procesową.

4. Do czego służy żywica Wanga w syntezie peptydów?

Nośniki typu Wang są powszechnie związane z przygotowywaniem peptydów uwalnianych po odpowiednim odszczepieniu z C-końcem w postaci kwasu karboksylowego. Dokładny produkt końcowy zależy jednak od linkera, architektury nośnika i zastosowanej chemii odszczepiania, a nie tylko od nazwy żywicy. Badacze przedstawili również specjalistyczną metodę przekształcania materiału peptydyl-Wang-TentaGel w hydrazydy peptydowe, które mogą służyć jako użyteczne półprodukty syntetyczne. [5] Alternatywna reakcja nie zmienia znaczenia standardowego odszczepiania z żywicy Wanga. Pokazuje natomiast, dlaczego podczas przewidywania produktu należy analizować cały system nośnika i warunki reakcji.

5. Czy SPPS buduje peptyd od N-końca czy od C-końca?

Klasyczna etapowa SPPS zazwyczaj rozpoczyna się od przyłączenia C-końcowej reszty do nośnika, po czym łańcuch jest wydłużany w kierunku N-końca. Jest to kierunek przeciwny do standardowego wydłużania łańcucha na rybosomie, gdzie białko rośnie poprzez dodawanie kolejnych aminokwasów do C-końca. Synteza BPTI jest przykładem wykorzystania zabezpieczonych bloków budulcowych i nośnika przed późniejszym uwolnieniem, oczyszczaniem i fałdowaniem produktu. [3] Istnieją jednak specjalistyczne strategie chemii peptydów wykorzystujące inne rozwiązania, dlatego budowanie od C- do N-końca należy określać jako klasyczne podejście SPPS, a nie bezwzględną zasadę wszystkich metod syntezy.

6. Dlaczego grupy ochronne są potrzebne?

Aminokwasy często zawierają kilka reaktywnych grup funkcyjnych. Grupy ochronne tymczasowo zapobiegają reakcji wybranych miejsc, pozostawiając odpowiednie miejsce dostępne w konkretnym etapie syntezy. Pomaga to kontrolować kolejność i sposób łączenia reszt. Bez właściwej ochrony konkurencyjne reakcje mogłyby prowadzić do powstawania złożonych mieszanin lub produktów o zmienionej strukturze. Badania dotyczące powstawania aspartimidu pokazały, że zmiana chemii ochrony grupy karboksylowej może ograniczać ważną reakcję uboczną w analizowanych sekwencjach. [2] Grupy ochronne nie gwarantują idealnego przebiegu syntezy, lecz zapewniają selektywną kontrolę chemiczną, która musi pozostać zgodna ze wszystkimi istotnymi etapami procesu.

7. Czym różnią się Fmoc i Boc?

Fmoc i Boc są szeroko stosowanymi tymczasowymi grupami chroniącymi grupę aminową, ale reagują na inne warunki chemiczne. Fmoc jest zazwyczaj usuwany w środowisku zasadowym, natomiast Boc jest wrażliwy na kwasy. Różnica ta wpływa na sposób łączenia ich z ochroną łańcuchów bocznych, linkerami i pozostałymi etapami syntezy. Synteza oparta na Fmoc jest szeroko wykorzystywana we współczesnej SPPS, ale badania wykazały również możliwość występowania zależnych od sekwencji reakcji ubocznych w takich warunkach. [11] W praktyce bardziej użyteczne jest więc porównywanie całych strategii ochrony i ich zgodności z daną sekwencją niż rozpatrywanie wyłącznie nazw dwóch grup ochronnych.

8. Co oznacza ochrona ortogonalna?

Ochrona ortogonalna oznacza, że jedną grupę ochronną można usunąć w warunkach, w których inna potrzebna grupa ochronna pozostaje wystarczająco stabilna, aby można było kontynuować syntezę. Pozwala to odsłaniać różne miejsca reaktywne na określonych etapach. Koncepcja ta ma podstawowe znaczenie podczas kontrolowanej syntezy złożonych peptydów. Ortogonalność jest jednak zależna od warunków, a nie absolutna: wielokrotna ekspozycja, charakter sekwencji i parametry reakcji nadal mogą prowadzić do reakcji ubocznych. Badania alternatywnych sposobów ochrony grup karboksylowych pokazują, jak strategię ochrony można modyfikować w celu kontrolowania trudnej chemii peptydowej. [2]

9. Czym jest sekwencja delecyjna?

Sekwencja delecyjna to peptyd pozbawiony jednej lub kilku reszt obecnych w zamierzonej sekwencji docelowej. Może powstać, gdy etap sprzęgania aminokwasu nie zachodzi całkowicie, ale nieprzereagowany łańcuch pozostaje przyłączony do nośnika i uczestniczy w kolejnych cyklach. Ponieważ nieprawidłowy łańcuch nadal pozostaje związany z żywicą, zwykłe przemywanie nie musi go usunąć. Badania monitorowania SPPS w czasie rzeczywistym wskazują niepełne tworzenie wiązań amidowych jako ważny problem procesowy. [4] Sekwencja delecyjna jest więc problemem związanym ze strukturą i tożsamością produktu, a nie jedynie pozostałością odczynnika.

10. Czy dwa zanieczyszczenia peptydowe mogą mieć taką samą masę cząsteczkową?

Tak. Różne struktury molekularne mogą mieć identyczną lub nierozróżnialną masę nominalną. Z tego powodu sama zgodność masy nie potwierdza pełnej tożsamości cząsteczki. W badaniach syntetycznego peptydu będącego substratem reniny zidentyfikowano izobaryczne składniki zanieczyszczeń, w których modyfikacje występowały w różnych pozycjach. Derywatyzacja i tandemowa spektrometria mas dostarczyły dodatkowych informacji strukturalnych. [12] Przykład ten pokazuje, dlaczego zgodność obserwowanej masy z oczekiwaną nie może samodzielnie potwierdzić właściwej sekwencji, łączności, stereochemii ani braku strukturalnie podobnych izomerów.

11. Czym są epimeryzacja i racemizacja w syntezie peptydów?

Epimeryzacja i racemizacja dotyczą niepożądanych zmian konfiguracji stereochemicznej. Mogą one zachodzić bez zmiany nominalnej sekwencji aminokwasowej lub masy cząsteczkowej, dlatego zwykły pomiar masy może nie wykazać różnicy strukturalnej. W badaniach syntezy Fmoc wspomaganej mikrofalami zidentyfikowano reszty podatne na zmiany stereochemiczne i wykazano, że modyfikacja warunków reakcji może ograniczać takie procesy. [11] Ryzyko zależy od bloku budulcowego, sekwencji i warunków procesu. Jakość stereochemiczna wymaga więc metod analitycznych zdolnych do oceny konfiguracji, a nie może być wnioskowana wyłącznie na podstawie masy cząsteczkowej.

12. Czym jest powstawanie aspartimidu?

Powstawanie aspartimidu jest niepożądaną reakcją związaną z określonymi sekwencjami zawierającymi asparaginian. Powstanie cyklicznego półproduktu może prowadzić do kolejnych produktów o zmienionej łączności szkieletu lub stereochemii, zmniejszając wydajność i utrudniając oczyszczanie. Badacze analizowali alternatywne strategie ochrony zaprojektowane w celu ograniczenia tej reakcji w wybranych peptydach i białkach. [2] Wyniki nie wskazują jednego uniwersalnego rozwiązania dla wszystkich sekwencji zawierających asparaginian. Pokazują natomiast, dlaczego projektowanie syntezy i strategii kontroli zanieczyszczeń musi uwzględniać specyficzne zachowanie chemiczne danej sekwencji.

13. Czy wysoka czystość HPLC potwierdza prawidłową tożsamość peptydu?

Nie. Czystość HPLC opisuje próbkę w ramach konkretnego rozdziału chromatograficznego, zastosowanego detektora i sposobu analizy danych. Wysoki udział powierzchni głównego piku może być wartościowym dowodem, że próbka jest zdominowana przez jeden chromatograficznie rozdzielony składnik, ale nie potwierdza samodzielnie pełnej tożsamości molekularnej. Współeluujące zanieczyszczenia, stereoizomery i inne warianty mogą wymagać dodatkowych technik. W badaniach analizy chiralnej peptydów wykorzystano specjalnie zaprojektowany proces, który uwzględniał również zmiany stereochemiczne powstające podczas przygotowania próbki. [13] Tożsamość i czystość należy więc traktować jako powiązane, ale odrębne pytania analityczne.

14. Czy wydajność produktu oczyszczonego oznacza to samo co czystość?

Nie. Wydajność produktu oczyszczonego lub wyizolowanego określa ilość odzyskanego materiału docelowego względem zdefiniowanej ilości początkowej lub teoretycznej. Czystość opisuje natomiast skład odzyskanego materiału według określonej metody analitycznej. Synteza może prowadzić do uzyskania stosunkowo niewielkiej ilości produktu o bardzo wysokiej czystości albo dużej ilości materiału surowego zawierającego znaczną ilość zanieczyszczeń. W badaniach automatycznej syntezy przepływowej czystość surowego produktu i wydajność po izolacji raportowano oddzielnie. [7] Rozdzielenie tych parametrów zapobiega błędnemu traktowaniu wysokiej wartości jednego z nich jako dowodu wysokiej wartości drugiego.

15. Czy długie peptydy można wytwarzać poprzez łączenie krótszych fragmentów?

Tak. W strategii fragmentowej krótsze segmenty peptydowe mogą zostać przygotowane oddzielnie, a następnie połączone za pomocą odpowiedniej chemii. Natwywna ligacja chemiczna była ważnym przykładem, w którym niezabezpieczone fragmenty peptydowe połączono w sposób prowadzący do powstania naturalnego wiązania szkieletu peptydowego, a następnie uzyskano pofałdowane białko. [10] Nie oznacza to, że dowolne fragmenty peptydowe mogą łączyć się spontanicznie. Należy uwzględnić strukturę fragmentów, chemię łączenia, wybór miejsca połączenia, rozpuszczalność, stereochemię i wymagania dotyczące oczyszczania. Składanie fragmentów jest więc alternatywną strategią projektowania syntezy, a nie automatycznym rozwiązaniem problemów związanych z długimi peptydami.

16. Czy szybsza zautomatyzowana synteza eliminuje potrzebę oczyszczania?

Nie. Szybsze zautomatyzowane lub przepływowe składanie skraca czas określonych etapów syntezy, ale nie dowodzi, że każda powstała cząsteczka ma zamierzoną strukturę. W badaniach szybkiej syntezy przepływowej nadal charakteryzowano materiał surowy i stosowano późniejsze oczyszczanie, a w kolejnych pracach dotyczących automatyzacji osobno porównywano czystość surowego materiału i wydajność po izolacji. [6] [7] Dobre wyniki systemu dla badanych sekwencji nie gwarantują również identycznych rezultatów dla każdego nowego celu. Przyspieszona synteza nadal musi być połączona z odpowiednim oczyszczaniem, potwierdzeniem tożsamości, analizą zanieczyszczeń i charakterystyką końcową.

17. Dlaczego zwiększenie skali produkcji jest bardziej skomplikowane niż przygotowanie większej partii?

Zwiększenie skali zmienia warunki fizyczne i chemiczne, a nie tylko ilość materiału. Mieszanie, wymiana ciepła, pęcznienie żywicy, dystrybucja odczynników, ciśnienie, filtracja, obsługa rozpuszczalników, rozpuszczalność półproduktów i możliwości systemu oczyszczania mogą zachowywać się inaczej przy większej objętości produkcji. W analizie przemysłowej 40 procesów peptydowych osobno oceniano syntezę, oczyszczanie i izolację podczas analizy zużycia materiałów. [14] Wyniki pokazują, dlaczego produkcję trzeba rozpatrywać jako kompletny proces. Skalowalna metoda musi powtarzalnie prowadzić do uzyskania scharakteryzowanego materiału na wszystkich etapach, a nie tylko większej ilości surowego peptydu.

18. Czy peptyd jest gotowy od razu po złożeniu prawidłowej sekwencji?

Niekoniecznie. Złożenie łańcucha tworzy szkielet sekwencji tylko w takim zakresie, w jakim potwierdzają to proces i dane analityczne. W zależności od cząsteczki mogą być nadal potrzebne odbezpieczanie, odszczepianie, cyklizacja, utlenianie, tworzenie mostków disiarczkowych, fałdowanie, koniugacja, oczyszczanie i charakterystyka. Synteza BPTI stanowi dobry przykład procesu, w którym po złożeniu liniowej sekwencji następowało oczyszczanie i tworzenie pofałdowanej struktury zawierającej mostki disiarczkowe. [3] Określenie „gotowy peptyd” powinno więc odnosić się do formy molekularnej wymaganej w danym kontekście naukowym, a nie tylko do zakończenia etapowego dodawania aminokwasów.

19. Czy prawidłowa masa cząsteczkowa potwierdza prawidłową sekwencję peptydu?

Nie. Zgodność masy cząsteczkowej jest wartościowym dowodem, ale nie może samodzielnie potwierdzić pełnej sekwencji ani struktury molekularnej. Struktury izobaryczne mogą mieć tę samą masę, a różnice stereochemiczne mogą w ogóle nie powodować zmiany masy cząsteczkowej. Badania zanieczyszczeń syntetycznych peptydów pokazały, że rozróżnienie strukturalnie odmiennych składników może wymagać tandemowej spektrometrii mas i dodatkowych analiz. [12] W przypadku pytań dotyczących integralności stereochemicznej mogą być potrzebne również metody chiralne. [13] Masę cząsteczkową należy więc traktować jako jeden z elementów oceny tożsamości, a nie jej pełne potwierdzenie.

20. Dlaczego oczyszczanie należy traktować jako część produkcji peptydu, a nie tylko końcowy dodatek?

Oczyszczanie decyduje o tym, czy docelowy peptyd można skutecznie oddzielić od sekwencji delecyjnych, produktów ubocznych, pozostałości odczynników, strukturalnie podobnych zanieczyszczeń i innych składników powstałych podczas syntezy. Metoda pozwalająca bardzo szybko wytwarzać duże ilości surowego materiału może nadal być niepraktyczna, jeśli nie da się skutecznie odzyskać docelowego produktu o wymaganej jakości. Z tego powodu analizy przemysłowe procesów peptydowych uwzględniają razem syntezę, oczyszczanie i izolację. [14] Efektywność produkcji należy ostatecznie oceniać na podstawie ilości i właściwości wyizolowanego materiału końcowego, a nie wyłącznie szybkości syntezy.

Ograniczenia przy porównywaniu metod syntezy peptydów

Podczas interpretowania badań porównujących technologie produkcji peptydów należy pamiętać o kilku istotnych ograniczeniach.

Po pierwsze, sekwencja silnie wpływa na trudność syntezy. Metoda sprawdzająca się dla jednego peptydu nie musi działać tak samo dla innego. Agregacja, hydrofobowość, skład aminokwasowy, długość, tendencja do tworzenia struktur drugorzędowych i podatność na reakcje uboczne mogą zmieniać zachowanie procesu. [1] [4]

Po drugie, czystość materiału surowego, wydajność po izolacji, czystość końcowa i zawartość peptydu są różnymi parametrami. Porównywanie metod wyłącznie na podstawie jednego z nich może dawać niepełny obraz efektywności produkcji. [7]

Po trzecie, szybkie składanie łańcucha nie oznacza szybkiej produkcji całego materiału. Odszczepianie, oczyszczanie, izolacja, końcowe kształtowanie struktury, badania analityczne i dokumentacja również wpływają na całkowity czas produkcji. [6] [7]

Po czwarte, czystość analityczna zależy od zastosowanej metody. HPLC, spektrometria mas, tandemowa spektrometria mas i analiza chiralna odpowiadają na różne pytania. Jeden wynik analityczny nie musi potwierdzać pełnej tożsamości strukturalnej. [12] [13]

Po piąte, skala wpływa na zachowanie procesu. Wyników syntezy laboratoryjnej nie można automatycznie przenosić na produkcję przemysłową bez oceny mieszania, transportu masy, możliwości oczyszczania, zużycia materiałów i innych czynników zależnych od skali. [14]

Po szóste, historyczne porównania ekonomiczne mogą z czasem tracić aktualność. Koszty odczynników, poziom automatyzacji, technologie ekspresji, wyposażenie do oczyszczania, odzyskiwanie rozpuszczalników i infrastruktura produkcyjna stale się rozwijają. Starsze analizy kosztów mogą nadal mieć znaczenie naukowe, ale nie muszą odzwierciedlać aktualnej ekonomiki rynku. [1]

Po siódme, porównania środowiskowe wymagają spójnych granic analizy. Ocena zużycia rozpuszczalników podczas samego składania łańcucha przy jednoczesnym pominięciu oczyszczania i izolacji może prowadzić do mylących wniosków dotyczących zrównoważenia procesu. [14] [15]

Wreszcie sama nazwa metody nie określa jakości produktu. SPPS, synteza w roztworze, LPPS, ligacja fragmentów oraz ekspresja biologiczna mogą prowadzić do uzyskania materiału wysokiej jakości, jeśli proces został odpowiednio zaprojektowany i kontrolowany. Żadna z tych metod nie gwarantuje jednak automatycznie właściwej tożsamości, czystości, stereochemii, fałdowania czy przydatności do konkretnego zastosowania.

Podsumowanie

Syntezę peptydów najlepiej rozumieć jako kontrolowany proces wytwarzania cząsteczek, a nie po prostu tworzenie wiązań peptydowych.

Celem jest zbudowanie określonej sekwencji aminokwasowej przy jednoczesnym kontrolowaniu sposobu połączenia reszt, chemii grup ochronnych, stereochemii, reakcji ubocznych i wszelkich dodatkowych wymagań strukturalnych.

Synteza peptydów na fazie stałej utrzymuje rosnący łańcuch na nierozpuszczalnym nośniku, dzięki czemu powtarzane etapy sprzęgania i przemywania dobrze nadają się do automatyzacji. Zalety związane z powtarzalnym składaniem nie eliminują jednak problemów takich jak niepełne reakcje, agregacja, sekwencje delecyjne czy zależne od sekwencji reakcje uboczne. [4] [6] [7]

Klasyczna synteza w roztworze utrzymuje półprodukty peptydowe w fazie ciekłej i może zapewniać większą elastyczność w izolowaniu oraz charakteryzowaniu poszczególnych produktów pośrednich. Wielokrotne rozdzielanie oraz pogarszająca się rozpuszczalność mogą jednak stać się poważnymi ograniczeniami.

Metody syntezy w fazie ciekłej z rozpuszczalnymi znacznikami próbują połączyć chemię roztworową z zaprojektowanymi strategiami odzyskiwania materiału. Mogą więc stanowić dodatkową możliwość w przypadku sekwencji i problemów produkcyjnych, dla których klasyczna SPPS nie jest optymalna. [8] [9]

Dłuższe lub szczególnie trudne cząsteczki można również przygotowywać poprzez składanie fragmentów, w tym natywną ligację chemiczną, zamiast polegać wyłącznie na nieprzerwanym dodawaniu kolejnych reszt aminokwasowych. [10]

Niezależnie od wybranej metody składania efektywność sprzęgania i chemia grup ochronnych pozostają kluczowe, ponieważ niewielkie nieefektywności i reakcje uboczne mogą kumulować się podczas kolejnych etapów syntezy. Powstawanie aspartimidu, sekwencje delecyjne i zmiany stereochemiczne pokazują, dlaczego sama zamierzona sekwencja nie opisuje wszystkiego, co może powstać podczas procesu. [2] [11] [12]

Praca nie kończy się również wraz ze złożeniem łańcucha.

Oczyszczanie decyduje o tym, czy produkt docelowy można oddzielić od innych składników.

Następnie odpowiednio dobrane metody analityczne odpowiadają na odrębne pytania dotyczące tożsamości, czystości, zawartości, stereochemii, konformacji oraz – jeśli ma to znaczenie – aktywności funkcjonalnej. [3] [12] [13]

Zwiększenie skali produkcji wprowadza kolejne zagadnienia dotyczące transportu masy, zachowania żywicy, zużycia rozpuszczalników, filtracji, możliwości oczyszczania, powtarzalności procesu i jego wpływu środowiskowego. Z tego powodu przemysłowa ocena procesu powinna obejmować razem syntezę, oczyszczanie i izolację, a nie koncentrować się wyłącznie na szybkości sprzęgania. [14] [15]

Najważniejsza zasada jest następująca:

skuteczna produkcja peptydu wymaga kontroli całego procesu – od projektu molekularnego i tworzenia wiązań aż po oczyszczanie oraz charakterystykę strukturalną. Uzyskanie łańcucha o oczekiwanej nominalnej masie lub wysokiego głównego piku chromatograficznego stanowi wartościowy dowód, ale żaden z tych parametrów samodzielnie nie potwierdza pełnej tożsamości molekularnej ani jakości procesu produkcyjnego.

Zastrzeżenie

Artykuł ma wyłącznie charakter edukacyjny i naukowo-informacyjny. Opisuje ogólne zasady chemii peptydów, syntezy na fazie stałej, syntezy w roztworze i w fazie ciekłej, strategii grup ochronnych, sprzęgania, oczyszczania, charakterystyki analitycznej, procesów produkcyjnych oraz przykłady pochodzące z opublikowanych badań. Nie jest protokołem laboratoryjnym, instrukcją produkcyjną, poradą medyczną, przewodnikiem dotyczącym dawkowania lub podawania ani certyfikatem jakości jakiegokolwiek konkretnego produktu peptydowego. Wyniki eksperymentalne należy interpretować w kontekście sekwencji, zastosowanych metod, skali procesu, technik analitycznych i ograniczeń poszczególnych badań.

References

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K., & Perczel, A. (2016). Bacterial expression and/or solid phase peptide synthesis of 20-40 amino acid long polypeptides and miniproteins, the case study of Class B GPCR ligands. Current Protein & Peptide Science, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Prevention of aspartimide formation during peptide synthesis using cyanosulfurylides as carboxylic acid-protecting groups. Nature Communications, 11(1), Article 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). Solid-phase synthesis of bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) and two analogues. A chemical approach for evaluating the role of disulfide bridges in protein folding and stability. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. PubMed record
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). Real-time monitoring of solid-phase peptide synthesis using a variable bed flow reactor. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F., & Becker, C. F. W. (2015). Efficient generation of peptide hydrazides via direct hydrazinolysis of Peptidyl-Wang-TentaGel resins. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Rapid flow-based peptide synthesis. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2017). A fully automated flow-based approach for accelerated peptide synthesis. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G., & Albericio, F. (2022). Liquid-phase peptide synthesis (LPPS): A third wave for the preparation of peptides. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T., & Fukui, T. (2012). Novel diphenylmethyl-derived amide protecting group for efficient liquid-phase peptide synthesis: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., & Kent, S. B. (1994). Synthesis of proteins by native chemical ligation. Science, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Characterization of impurities in a synthetic renin substrate peptide by fast-atom bombardment mass spectrometry and hybrid tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G., & Crowther, J. B. (1995). Peptide chiral purity determination: Hydrolysis in deuterated acid, derivatization with Marfey’s reagent and analysis using high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Process mass intensity (PMI): A holistic analysis of current peptide manufacturing processes informs sustainability in peptide synthesis. The Journal of Organic Chemistry, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Sustainability challenges in peptide synthesis and purification: From R&D to production. The Journal of Organic Chemistry, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001