Peptidsyntes: fastfasmetod, i lösning samt produktionsmetoder

Peptidsyntes är en kontrollerad process för att bilda aminosyrakedjor med en specifik sekvens. Vid kemisk syntes kopplas utvalda aminosyror samman med hjälp av peptidbindningars, samtidigt som man kontrollerar andra reaktiva grupper som finns i dessa molekyler. Målet är därför inte enbart att koppla samman aminosyror, utan att erhålla en specifik molekylstruktur med en viss sekvens, stereokemi, struktur på kedjans ändar och – om så krävs – ytterligare strukturella egenskaper.

Till de huvudsakliga metoderna hör fastfaspeptidsyntes (SPPS), klassisk syntes i lösning och nyare metoder för peptidsyntes i flytande fas (LPPS), som utnyttjar lösliga bärare eller molekylära taggar. Forskningslaboratorier och produktionsanläggningar kan också kombinera olika tillvägagångssätt, förbereda kortare fragment separat och sedan foga samman dem, eller använda biologisk uttryck om det är lämpligare för den givna sekvensen.

Jämförelse av kemisk syntes med bakteriell uttryck av polypeptider bestående av 20–40 aminosyrarester visar på en viktig princip: det praktiska valet av produktionsmetod beror på den specifika molekylen, dess sekvens, benägenhet för aggregation, nödvändiga modifieringar, produktionsskala och analytiska krav. [1]

Att erhålla den avsedda aminosyrasekvensen är bara ett av stegen i peptidproduktionen.

Hela processen kan omfatta:

sekvensdesign → förberedelse av byggstenar → skydd av funktionella grupper → koppling → avskyddning → kedjesammansättning → klyvning eller sammanslagning av fragment → slutlig formning av strukturen → rening → identitetsverifiering → föroreningsanalys → bestämning av halt → slutlig karakterisering.

För vissa peptider krävs det också ytterligare steg, såsom cyklisering, bildning av disulfidbryggor, veckning, konjugering eller andra kemiska modifieringar.

Av denna anledning innebär en korrekt sammansättning av kedjan inte automatiskt att det slutliga materialet har rätt identitet, renhet, stereokemi, konformation, stabilitet eller andra erforderliga egenskaper.

Vad är peptidsyntes?

Skapande av en specifik aminosyrasekvens

Peptid består av aminosyrarester som är sammankopplade med peptidbindningar.

Målet med peptidsyntesen är att bilda dessa bindningar i en förutbestämd ordning, ofta samtidigt som man kontrollerar:

• aminosyratyp;
• aminosyrenas ordningsföljd i sekvensen;
• stereokemi;
• N-terminala strukturer;
• C-terminala strukturer;
• modifiering av sidokedjor;
• disulfidbryggors placering;
• cyklisering;
• andra erforderliga strukturella egenskaper.

Sekvensen är av grundläggande betydelse eftersom en identisk aminosyrasammansättning kan leda till bildandet av olika molekyler om aminosyrorna förekommer i en annan ordning.

Uttalandet att en given molekyl är „en peptid bestående av fem aminosyror” ger därför väldigt lite information om dess faktiska struktur. För att korrekt beskriva molekylen måste man känna till vilka typer av aminosyror det rör sig om, deras ordning, stereokemi, endgrouper samt eventuella ytterligare modifieringar.

Två peptider kan således ha exakt samma aminosyrasammansättning och ändå vara olika molekylstrukturer.

Ytterligare skillnader kan bero på modifiering av kedjans ändar, närvaron av disulfidbryggor, ett cykliskt skelett, förändringar i sidokedjor eller en annan stereokemisk konfiguration.

Kemisk peptidsyntes använder vanligtvis aminosyror vars reaktiva grupper har skyddats selektivt.

Temporära skyddsgrupper gör det möjligt att bilda en specifik avsedd kemisk bindning samtidigt som konkurrerande reaktioner begränsas på andra ställen i molekylen.

I nästkommande planerade syntessteg tas dessa grupper bort eller modifieras.

Kontrollerad reaktion i stället för spontan sammankoppling

I grundläggande kemiska beskrivningar framställs bildningen av en peptidbindning ofta som en kondensationsreaktion, där två aminosyror binds samman med nettoutsläpp av en vattenmolekyl.

En sådan ekvation beskriver reaktionens allmänna balans.

Det bör dock inte förväxlas med det sätt på vilket kontrollerad peptidsyntes utförs i praktiken.

Enbart en blandning av fria aminosyror skulle inte på ett tillförlitligt sätt tillåta att man fastställer:

• vilken aminosyra som ska reagera;
• vilken karboxylgrupp som ska reagera;
• vilken aminosyra som ska komma först;
• som ska finnas som nummer två;
• kommer sidokedjorna att börja reagera;
• kommer stereokemman att bevaras;
• kommer det inte att bildas många oönskade produkter.

Vid praktisk kemisk syntes tillämpas därför kontrollerade strategier för aktivering och skydd av funktionella grupper.

En grupp som härstammar från en karboxylgrupp aktiveras vanligtvis så att den effektivt kan reagera med en utvald aminogrupp. Skyddsgrupper, reaktionsordning, bärarkemi, kopplingsreagenser, lösningsmedelsmiljö och isoleringsmetoder bidrar gemensamt till att styra reaktionen mot den avsedda produkten.

Effektiv peptidsyntes kräver därför kontroll av både den kemi som ska äga rum och den som måste förhindras.

Ett bra exempel är bildningen av aspartimid.

Forskare har utvecklat en alternativ metod för skydd av karboxylgruppen i syfte att begränsa denna problematiska bivreaktion vid peptidsyntesen. [2]

Studien visar en bredare princip inom peptidkemin: att förhindra oönskade molekylära omvandlingar kan vara lika viktigt som att bilda den rätta peptidbindningen.

När kan en peptid anses vara färdig?

Slutförandet av skapandet av det linjära peptidskelettet innebär inte alltid att hela syntesen är klar.

Beroende på målmolekylen kan ytterligare steg behövas efter att kedjan har satts ihop.

De kan inkludera:

• fullständig avskyddning;
• avspjälkning av peptid från det fasta bärarmaterialet;
• borttagning av tillfälliga markörer;
• cyklisering;
• oxidation;
• bildande av disulfidbryggor;
• veckning;
• böjning;
• modifiering av kedjans ändar;
• renovering;
• analytisk karaktäristik.

Vissa peptider kräver relativt få ytterligare strukturförändringar efter kedjans hopsättning.

För andra är de senare etapperna avgörande.

Ett bra exempel är syntesen av bovint pankreatiskt trypsininhibitor (BPTI). Forskarna satte ihop en linjär sekvens, renade materialet och erhöll sedan en veckad struktur som innehöll disulfidbryggor. Enligt de analyser och funktionella jämförelser som presenteras i studien överensstämde det slutliga materialet med den naturliga sekvensen med det naturliga proteinet vad gäller de undersökta parametrarna. [3]

Detta exempel visar skillnaden mellan att sätta ihop en peptidskelett och att erhålla en fullständigt karakteriserad slutlig molekylform.

Metoden som gör det möjligt att erhålla en korrekt linjär sekvens bekräftar inte automatiskt:

• korrekt veckning;
• korrekta placering av disulfidbryggor;
• biologisk aktivitet;
• stabilitet;
• föroreningsprofilens;
• lämplighet för ett visst ändamål.

Var och en av dessa frågor kräver separata bevis.

Kemisk syntes, biologiskt uttryck och kombinerade metoder

Vid kemisk peptidsyntes sammankopplas tidigare framställda molekylära byggstenar i kontrollerade laboratoriereaktioner.

Biologisk expression utnyttjar däremot cellmaskineriet för att producera den kodade aminosyrasekvensen. Därefter måste materialet återvinnas, renas och, om det är nödvändigt, genomgå ytterligare bearbetning.

Båda metoderna kan leda till att man erhåller peptider eller polypeptider, men de är förknippade med olika möjligheter och begränsningar.

Kemisk syntes kan vara särskilt användbar när det behövs:

• utvalda icke-standardiserade aminosyror;
• specifika kemiska modifieringar;
• specifika kedjeändstrukturer;
• isotopmarkörer;
• modifieringar av peptidstommen;
• andra egenskaper som är svåra att uppnå genom standardmässigt biologiskt uttryck.

Biologisk expression kan vara attraktiv vid lämpliga längre sekvenser eller specifika märkningsstrategier, men den eliminerar inte problem som uppstår i senare produktionsstadier.

Materialåtervinning, vikning, bearbetning, föroreningar från värdorganismen, rening och analytisk karakterisering måste fortfarande beaktas.

Ingen av metoderna är därför universellt bäst.

Vid jämförelse av polypeptider bestående av 20–40 aminosyras残ਰester (aminosyrarester) påverkade både sekvensens längd och dess benägenhet att aggregera resultaten av fastfas-syntes och bakteriell expression. [1]

Dessa observationer stöder ett tillvägagångssätt där produktionsmetoden väljs utifrån den specifika molekylen.

Historiska data om prestanda, kostnader, utrustning och produktionstid bör inte betraktas som universella moderna värden, eftersom teknologier, reagenser, automatisering, reningsmetoder och produktionssekonomi förändras i takt med att teknologin utvecklas.

Fasbunden peptidsyntes

Den växande kedjan är bunden till ett olösligt bärarmaterial

Vid fastfaspeptidsyntes (SPPS) förblir den växande peptidkedjan fäst vid en o löslig bärare under de efterföljande syntescyklerna.

Bäraren är oftast ett funktionaliserat polymerharts.

Linker, det vill säga en länkmolekyl, binder peptiden till bäraren och påverkar bland annat hur den färdiga kedjan senare friges samt vilken typ av slutgrupp som erhålls.

En av de största praktiska fördelarna med SPPS är lättare uppdelning av materialet.

Efter avslutandet av ett visst reaktionssteg kan lösliga reagenser och många lösliga biprodukter avlägsnas genom tvättning, medan den växande peptiden förblir bunden till den fasta fasen.

Detta innebär att man efter tillsats av varje ny aminosyra inte behöver isolera och rena den växande peptiden som en separat, fri förening.

Denna bekvämlighet kan dock leda till ett viktigt missförstånd.

Tvättning av hartset innebär inte att alla felaktiga peptider har avlägsnats.

Om kedjan som sitter fast på hartsdelen inte reagerar under ett kopplingssteg kan den fortfarande finnas kvar på bäraren.

I följande cykler kan den reagera igen och förlängas ytterligare.

Som ett resultat kan en deletionssekvens bildas, det vill säga en molekyl som skiljer sig från målpeptiden genom att sakna en eller flera aminosyrarester.

På liknande sätt kan kemiskt modifierade eller ofullständigt avblockerade kedjor bundna till hartset delta i efterföljande syntessteg.

SPPS förenklar därför separationen av lösliga substanser från det hartsbundna materialet.

Det garanterar dock inte en perfekt sekvensöverensstämmelse.

Den upprepade cykeln av frånkoppling och inkoppling

En typisk stegvis SPPS-syntes omfattar upprepning av tre grundläggande operationer:

avsäkring → koppling → ursköljning.

Först blottas den reaktiva aminogruppen i slutet av den växande kedjan.

Därefter kopplas nästa skyddade aminosyra till kedjan.

Lösliga reagenser, ett överskott av aminosyran och många reaktionsprodukter avlägsnas innan nästa cykel påbörjas.

Genom att upprepa denna process kan en peptid byggas upp en aminosyrarest i taget.

I klassisk SPPS kopplas den C-terminala resterelementet vanligtvis till bäraren först, och sedan förlängs kedjan i riktning mot N-terminalen.

Detta skiljer sig från den vanliga ribosomala proteinsyntesen, under vilken nya aminosyror fogas till C-änden av den växande kedjan.

Den slutliga aminosyraordningen kan dock vara identisk, trots att riktningen och kemin i hopvikningsprocessen är en annan.

Terminen „cykel” ska inte förstås som en enda universell uppsättning reaktionsvillkor som lämpar sig för varje rest och varje sekvens.

Reaktionsförloppet kan bero på:

• strategier för skyddsgrupper;
• aminosyrutyp;
• rumsliga förhållanden kring reaktionsplatsen;
• hartsart;
• länka;
• kedjelängder;
• aggregering;
• lösningsmedels;
• kopplingskemi;
• det växande peptidens strukturella beteende.

En reaktion som förlöper lätt i början av syntesen kan bli betydligt svårare i ett senare skede.

Därför förblir processövervakning viktig även i högt automatiserade system.

Varför har hartsens egenskaper betydelse?

Ett fast medium är inte enbart en passiv hållare.

Dess fysikaliska och kemiska egenskaper kan direkt påverka reaktionens förlopp.

En viktig parameter är svällning.

Om harts sväller korrekt i det valda lösningsmedelsmiljön kan reagensen lättare nå de reaktiva platserna som finns i hela polymerstrukturen.

Otillräcklig svällning eller förändringar i hartsets struktur kan begränsa denna åtkomst.

Betydelse kan också ha:

• beläggningstäthet;
• polymerarkitektur;
• länkstruktur;
• lösningsmedelskompatibilitet;
• mekanisk stabilitet;
• porositet;
• diffusionsegenskaper;
• interaktioner mellan växande peptidkedjor.

Allteftersom peptidkedjans längd ökar kan de enskilda kedjorna också interagera med varandra.

Aggregation på harts kan begränsa tillgången till reaktiva platser och leda till ofullständig koppling eller ofullständig avskyddning.

Detta innebär att en sekvens som fungerar korrekt i början av synthesen kan bli allt svårare allteftersom kedjan förlängs.

Forskare har utvecklat en flödesreaktor med en variabel bädd som gjorde det möjligt att övervaka hartssvällning baserat på tryckrelaterade mätningar. [4]

Studien gällde aggregering på harts och ofullständig bindningsbildning som processproblem som under andra förhållanden kan vara svåra att observera direkt under syntesen.

Detta visar att övervakning av mediets fysiska beteende kan ge information som sträcker sig längre än enbart registrering av tillstötande reagenser.

Vad används Wang-harts till?

Wang-linkerkemi används allmänt inom fastfaspeptidsyntes (SPPS) när en C-terminal karboxylsyra önskas efter att peptiden har klyvts av.

Peptiden är bunden med en esterliknande bindning som senare kan klyvas under lämpliga förhållanden.

Alternativa linkersystem kan väljas när en annan C-terminal struktur behövs, till exempel en amid.

Det är värt att skilja linkerkemin från hela den fysiska bäraren.

Relaterade linkers av Wang-typ kan införlivas i olika polymerarkitekturer.

Sådana material behöver inte ha identiska:

• svällningsegenskaper;
• kapaciteter;
• lösningsmedelskompatibilitet;
• mekaniska egenskaper;
• beteenden vid reaktion.

Studier med peptidyl-Wang-TentaGel-hartser har påvisat en specialiserad alternativ metod för att erhålla peptidhydrazider, som är användbara intermediat inom peptidkemin. [5]

Detta betyder inte att standardklyvning från Wang-harts vanligtvis leder till bildning av pepthydrazider.

Den visar däremot på en viktig princip:

bärare + linker + reaktionsvillkor + klyvningskemi bestämmer gemensamt den erhållna produkten.

SPPS-syntes i batch- och flödessystem

SPPS kan utföras i klassiska omrörningsreaktorer eller i system där reagenser strömmar genom en reaktor som innehåller ett fast bärarmaterial.

Flödessystem kan möjliggöra snabbt utbyte av reagenser och mer noggrann kontroll av den kemiska miljön som omger hartset.

En studie från 2014 presenterade snabb flödesbaserad peptidesyntes med kontinuerlig övervakning och tillämpade den på flera peptider och ett litet protein. [6]

I en senare automatiserad studie beskrevs en betydligt snabbare kedjehopsättning, varvid man för de analyserade exemplen erhöll råproduktsrenhet och isolerat utbyte som var jämförbara med klassisk intermittent syntes. [7]

Dessa studier visar potentialen hos specifika system under givna förhållanden.

De bevisar dock inte att vilken peptid som helst kan produceras lika snabbt och med samma kvalitet.

Tiden det tar att producera en peptid innefattar dessutom mycket mer än bara själva kedjeuppbyggnaden.

Hela processen kan omfatta:

• beredning av reagens;
• beredning av harts;
• koppling;
• avsäkring;
• sköljning;
• avspjälkning;
• produktbearbetning;
• renovering;
• borttagning av lösningsmedel;
• slutlig formning av strukturen;
• analytiska undersökningar;
• dokumentationen.

Snabb bindning är därför bara ett av flera element för den totala produktionseffektiviteten.

Syntes i vätskefas

Vad betyder den här termen?

Terminet „peptidsyntes i vätskefas” kan användas i flera betydelser.

I ett vidare perspektiv kan det helt enkelt betyda peptidsyntes i lösning.

I mer specialistliteratur skiljer man dock ofta mellan:

1. klassisk peptidsyntes i lösning;
2. peptidsyntes på fast fas;
3. nyare LPPS-metoder, där den växande kedjan har en löslig markör eller bärare.

Denna åtskillnad är viktig eftersom sättet på vilket produkten separeras och återvinns förändras.

En fritt löst, skyddad peptidmellanprodukt kan kräva isolering med hjälp av dess egna fysikaliska och kemiska egenskaper.

För en märkt intermediär produkt kan märket utformas så det underlättar utfällning, extraktion, membranhållning eller annat sätt för separering.

Översikten om LPPS gör en tydlig åtskillnad mellan klassisk lösningssyntes, SPPS och metoder som använder lösliga taggar. [8]

Publikationen är till nytta för att strukturera upp terminologi och metodologi.

Den bör dock inte tolkas som ett enskilt experiment som bevisar att en metod är bäst för alla peptider.

Klassisk peptidsyntes i lösning

Vid klassisk lösningsmedelssyntes förblir skyddade aminosyror, peptidmellanprodukter eller fragment upplösta i reaktionsmediet istället för att vara kovalent bundna till ett olösligt harts.

Efter reaktionens slut kan den motsvarande mellanprodukten isoleras, renas och vid behov karakteriseras innan nästa steg påbörjas.

Detta kan medföra vissa fördelar.

Forskare kan:

• karaktärisera de enskilda halvfabrikaten;
• välja renodlingsmetod för en specifik halvprodukt;
• optimera enskilda omvandlingar;
• förbereda fragment oberoende;
• modifiera syntesvägen när en viss mellanprodukt skapar problem.

Syntes i lösning kan dock även vara förknippad med betydande svårigheter.

När kedjan förlängs kan peptider:

• bli svårlösliga;
• aggregera;
• vara svår att kristallisera;
• generera närbesläktade föroreningar;
• vara svåra att skilja åt;
• kräva multipel isolering;
• orsaka materialförluster under de följande bearbetningsstegen.

Syntes i lösning är därför inte automatiskt enklare eller lättare att skala upp än SPPS.

Dess användbarhet beror på den specifika sekvensen, intermediatens stabilitet, löslighet, syntesvägens längd, reningsbeteendet samt effektiviteten av efterföljande isoleringssteg.

Utvecklingen av märkta LPPS-strategier beror delvis på försök att lösa just dessa problem relaterade till separation och materialhantering. [8]

Lösliga markörer förenar reaktionsdesign med separationsdesign

I den märkta LPPS-strukturen har den växande peptiden en tillfällig molekylär anslutning som är utformad för att påverka dess fysiska egenskaper.

Markören kan underlätta att vidmakthålla tillräcklig löslighet hos peptiden under reaktionen och därefter underlätta dess selektiva återvinning.

Beroende på teknik kan separationen använda:

• utfällning;
• extraktion;
• retention på membran;
• fasbeteende;
• andra egenskaper som beror på närvaron av taggen.

En av de experimentella strategierna använde en långkedjig skyddsgrupp i C-terminalen för att framställa peptidamider.

Upprepade reaktioner och utfällningssteg gjorde det möjligt för forskarna att framställa en hydrofob peptid, som i den jämförelse de gjorde var svår att få fram på ett tillfredsställande sätt med SPPS-metoden. [9]

Detta visar användbarheten av denna specifika strategi för den analyserade sekvensen.

Det bevisar dock inte den universella överlägsenheten hos den märkta syntesen.

Märkningen blir en del av produktionsprocessen och väcker egna frågor:

• Hur effektivt ansluts den?
• Ändrar den reaktionsförloppet?
• Hur kan man på ett tillförlitligt sätt återvinna den märkta halvfabrikatet?
• Leder det till bildandet av nya föroreningar?
• Hur tas det bort?
• Går det att bekräfta att den har tagits bort helt?
• Vilka analytiska metoder bekräftar dess frånvaro i slutprodukten?

Lösliga markörer bör därför betraktas som funktionella delar av procesdesignen snarare än enbart som enkla etiketter.

Jämförelse av de huvudsakliga metoderna

Jämförelsen presenterar de allmänna principerna för hur de olika metoderna fungerar.

Det anger inte vilken av dem som ger den bästa prestandan, renheten, kostnaden, miljömässiga balans eller möjligheten att skalas upp för en viss serie.

Dessa parametrar bör bedömas utifrån den faktiska partikeln och den specifika produktionsprocessen. [4] [8] [9]

Fragmentering och hybridproduktion

Peptidet behöver inte alltid bildas i en enda, kontinuerlig process där nya aminosyror tillsätts i följd.

En alternativ strategi är att separera de kortare peptidhålen och sedan kombinera dem.

En hybridprocess kan till exempel använda SPPS för att erhålla separata fragment samt kemikalier i en lösning för att sammanföra dem.

Fragmentstrategier kan begränsa vissa problem som är förknippade med den mycket långa fasen av syntes.

De innebär dock nya utmaningar, såsom:

• val av lämpligt anslutningsställe;
• delarnas löslighet;
• aktivering av sammankopplingsplatsen;
• kemisk selektivitet;
• upprätthållandet av stereotyper;
• biverkningar;
• rengöring av fragmenten;
• rengöring efter att de har kombinerats.

En viktig exempel på kontrollerad sammanfogning av fragment är den naturliga kemiska ligering.

I den klassiska versionen reagerar peptidsaltet med ett annat peptid som innehåller N-terminala cystein. Den efterföljande omgrupperingen leder till att en korrekt bindning uppstår i peptidskärmen vid ligationsstället.

Ursprungliga studier visade möjligheten att erhålla protein med disyarska länkar efter ligering och folding. [10]

Det bekräftar betydelsen av denna strategi att sammanföra fragmenten.

Det betyder dock inte att vilka två icke modifierade peptidhuvuden som helst kan spontant sammanfalla.

Masker och skyddsgrupper

Sammanfogning skapar en avsiktlig koppling

Bindning är en reaktion där ett peptidbindningsförhållande uppstår mellan de valda enheterna.

Vanligtvis aktiveras en grupp som härrör från en karboxylgrupp så att den kan reagera effektivt med den lämpliga amingruppen.

Aktiveringskemikalien måste vara i överensstämmelse med:

• en stigande sekvens;
• tillfälliga skyddsgrupper;
• skydd av sidoväggar;
• stereokemiska;
• en bärare eller en markör;
• en lösningsmedelsmiljö;
• andra funktionella grupper som finns i molekylen.

Effektiv kondensation är särskilt viktig i den stegvisa syntesen, eftersom en ofullständig reaktion kan leda till bildning av deleterande sekvenser.

Om en fas av aminosyraförsörjning inte fungerar för vissa av de växande kedjorna kan dessa kedjor kvarstå i systemet och delta i följande cykler.

Som resultat kan det bildas partiklar som mycket liknar det målmedvetna peptidet, men som saknar den ena resten.

Så även små effektnedsättningar kan ackumuleras under många av syntesfaserna.

En enkel matematisk illustration illustrerar detta problem väl.

Om varje av de 50 oberoende skedena för inlämning hade en sannolikhet på 99% att lyckas, skulle andelen av de partiklar där alla skeden skulle sluta framgångsrikt vara:

0,99^50 ≈ 0,605

Det vill säga ungefär 61%.

Detta är enbart en matematisk illustration.

Det utgör inte en prognos för den faktiska renheten eller prestationsförmågan vid syntesen av ett peptid som innehåller 50 restsubstanser.

Den faktiska produktionen omfattar:

• Olika prestationsnivåer vid olika positioner;
• faser av avmontering;
• biverkningar;
• beroende på svårighetsgraden;
• strategier för återkoppling;
• Förluster vid avskiljande;
• Förluster vid reningen;
• andra processrelaterade variabler.

Beräkningen visar bara varför även en till synes liten ineffektivitet i en enskild etapp kan få stor betydelse i en multipel synteseprocess.

Skyddsgrupper kontrollerar platsen för reaktionen

En aminosyra kan ha flera kemiskt reaktiva grupper.

Utan selektiv kontroll skulle bindningsreaktionerna kunna inträffa på oönskade platser.

Skyddsgrupper blockerar tillfälligt utvalda reaktionsområden.

Den aminosyra som används för att förlänga kedjan kräver vanligtvis temporär skyddning, medan reaktiva sidokedjor kan kräva att den kvarvarande strukturen bevaras under många syntescykler.

Sammanlänkningen med bärare måste också klara dessa faser fram till den planerade avkopplingen.

Valet av skyddsgrupper påverkar alltså hela syntesstrategin.

Det bör beaktas:

• hur de införs;
• stabilitet;
• metoden för borttagning;
• samstämmighet med andra skyddsgrupper;
• överensstämmelse med bärare;
• biverkningar;
• effekten av en specifik sekvens;
• Slutliga villkor för avlastning.

Studier som använde skydd baserat på cyjanosulfurylid behandlade bildningen av aspartimid genom att ändra sättet att säkra karboxylgruppen.[2]

Resultaten visar att skyddsgruppernas strategi inte bara påverkar om den avsedda reaktionen kan äga rum, utan också vilka oönskade reaktioner som blir möjliga.

Fmoc, Boc och ortogonal skydd

Fmoc och Boc är bland de mest använda grupperna för att skydda aminosyrorna.

De skiljer sig verkligen i hur de tas bort.

Fmoc avlägsnas vanligtvis under sura förhållanden, medan Boc är känsligt för sura förhållanden.

Disse egenskaper gör det möjligt att använda dem som delar av bredare skyddsåtgärder.

I den populära SPPS-baserade Fmoc-metoden avlägsnas den tillfälliga N-terminala Fmoc-gruppen flera gånger, medan de valda skyddsgrupperna på sidorande kedjor och kombinationen med ett bindemedel förblir intakta till senare faser.

Andra strategier kan använda andra kombinationer.

En särskilt viktig term är ortogonal skydd.

Två skyddsgrupper anses vara ortogonala om den ena kan selektivt elimineras under förutsättning att den andra förblir tillräckligt stabil för att fortsatta syntesprocesser ska kunna pågå.

Ortogonalitet är alltså en praktisk relation till kemisk överensstämmelse.

Det betyder inte att varje säkrad grupp kommer att förbli helt oförändrad efter obegränsad exponering för alla reaktionsförhållanden.

Biverkningar kan fortfarande uppstå.

I studierna av Fmoc-syntesen beskrevs både bildningen av aspartimid och oönskade stereokemiska förändringar trots den antagna selektiviteten hos den övergripande skyddsstyrkan. [11]

Stereokemi är en del av en molekyls identitet

Många aminosyror har en chiral center.

Detta innebär att deras atomer kan ha olika rumsliga arrangemang som motsvarar olika stereokemiska former.

En ändring av konfigurationen av ett stereogent centrum kan leda till att en annan peptidstruktur uppstår utan att dess nominella massa behöver ändras.

Därför kan själva massan inte bekräfta peptidets fulla identitet.

Epimerisering innebär vanligtvis en förändring av konfigurationen av ett stereogent centrum i en molekyl som innehåller flera sådana centra.

Rasemering diskuteras också ofta inom peptidkemi i samband med förlusten av den stereokemiska integriteten hos aminosyrorna.

Dessa förändringar är viktiga, eftersom molekylär identifiering kan vara starkt beroende av den rumsliga ordningen av atomerna.

Två partiklar med samma grundämnesammansättning och nominell massa kan därför uppföra sig annorlunda om de skiljer sig i stereokemi.

I en studie av mikrovågsstödd Fmoc-syntes konstaterades att vissa restsubstanser var känsliga för oönskade stereokemiska förändringar under de använda förhållandena. Modifikationen av metoden begränsade förekomsten av dessa reaktioner.[11]

Detta betyder inte att uppvärmning enligt definitionen skadar alla peptider.

Det rätta argumentet är att man bör bedöma snabbheten i reaktionen tillsammans med den sekvensberoende selektiviteten.

Aspartamid och andra närbesläktade föroreningar

Aspartimidbildning är en känd biverkning av vissa sekvenser som innehåller aspartin.

Det kan uppstå en oönskad cyklisk biprodukt, från vilket sedan föreningar med förändrad skallebundet eller stereokemi bildas.

Risken för denna reaktion beror på sekvensen och processförhållandena.

Andra föroreningar relaterade till syntesen kan bero på:

• ofullständig sammansmältning;
• ofullständig demontering;
• uppkomsten av delegerade sekvenser;
• reaktioner från sidoväggarna;
• stereotypiska förändringar;
• reaktioner vid avlägsnandet av implantatet;
• reaktion med syrgas;
• omstruktureringar;
• förhållandena för produktbearbetning;
• Ofullständig borttagning av skyddsgrupperna.

Vissa föroreningar orsakar en lätt märkbar förändring av den molekylära massan.

Andra är mycket svårare att skilja åt.

I analytiska studier av ett syntetiskt peptid som är ett renin-substrat har många föroreningar identifierats, inklusive komponenter som visar samma massaökning, men som innehåller modifieringar på olika positioner. [12]

För att kunna skilja dem åt behövdes ytterligare strukturell analys.

Forskarna behandlade även de föreslagna mekanismerna för bildandet av dessa föroreningar som hypoteser.

Det är en viktig skillnad:

Att fastslå vad förorening är och att bevisa den exakta mekanismen för dess uppkomst är två separata vetenskapliga frågor.

En sannolik mekanism får inte betraktas som bekräftad endast på grund av att den stämmer överens med den observerade partikelmängden.

Rensning, skalering och produktionskvalitet

Råprodukt, rensad produkt och produktivitet

En rå peptid är materialet som erhålls innan de relevanta rensningsstegen är slutförda.

Kan innehålla:

• målmedicin;
• deletionssekvenser;
• materialet inte är helt avmonterat;
• modifierade sekvenser;
• rester av reagenser;
• Produkter relaterade till avskiljande;
• sol;
• lösningsmedel;
• Andra komponenter som uppstår under processen.

Reningsprocessen syftar till att separera det korrekta peptidet från denna blandning.

Det är nödvändigt att tydligt skilja mellan tre begrepp:

renheten hos råprodukten – den mätta sammansättningen av materialet före den slutliga reningen;

produktens produktivitet efter rening eller isolering – mängden återvunnet slutmaterial jämfört med en viss initial eller teoretisk värdering;

Slutlig renhet — sammansättningen av den isolerade substansen definieras med hjälp av en specifik analytisk metod.

De här begreppen är inte utbytbara.

Processen kan leda till att en stor mängd råmaterial bildas, men den möjliggör återvinning av en relativt liten mängd renat produkt.

En annan process kan ge mindre råmaterial, men kännetecknas av hög selektivitet vid tillverkningen av det slutliga produkten.

En liknande hög analytisk renhet behöver inte betyda hög produktivitet.

I studier av accelererad flödessyntes rapporterades separat renheten av råmaterialet och produktionsförmågan efter isolering korrekt. [7]

Kromatografi delar upp komponenterna, men den besvarar inte alla frågor.

Höghastighets vätskekromatografi i invers flödessystem (RP-HPLC) används ofta för analys och rening av peptider.

Olika molekyler påverkar stationära och rörliga faser på olika sätt.

Under lämpliga förhållanden möjliggör dessa skillnader att separera komponenterna i blandningen.

Analytisk och preparativ kromatografi har relaterade, men olika användningsområden.

Analytisk HPLC används främst för att analysera provens sammansättning.

Preparative HPLC används för fysisk upptagning av separerade komponenter.

En chromatogram kan ge många värdefulla uppgifter.

En stor huvudvolym eller en hög andel av dess yta bör dock inte betraktas som en fullständig molekylär karaktäristik.

Resultaten av kromatografin beror bland annat på:

• typ av kolumnen;
• flytande fasen;
• gradient;
• temperaturer;
• detekteringsmetoder;
• våglängd;
• provsmältning;
• hur prickarna integreras;
• upplösning;
• egenskaper hos föroreningar.

Två föreningar kan potentiellt eluera samtidigt.

Vissa komponenter i provet kan också reagera olika på den använda detektorn.

Av den anledningen är hög ytkärnarenhet i HPLC inte synonymt med fullständig bekräftelse av molekylär identitet.

Studier av isobariska peptidskador samt kiralanalyser visar varför kompletterande analytiska metoder kan behövas. [12] [13]

Analytisk metod måste motsvara en specifik strukturell fråga.

Identitet, renhet och innehåll betyder olika saker

Tre begrepp är särskilt viktiga i beskrivningen av peptider.

Identitet svarar på frågan:

Finns det en avsedd molekyl i provet?

Renhet besvarar frågan:

Vilka andra komponenter finns i provet eller vilken del av det mätade signalen motsvarar huvudkomponenten?

Innehållet svarar på frågan:

Hur mycket verkligt peptid finns i provet?

Det är inte alltid möjligt att svara på dessa frågor med en enda mätning.

Material som innehåller peptidet kan också innehålla:

• vatten;
• motjonar;
• sol;
• lösningsmedelsrester;
• andra komponenter relaterade till processen;
• föroreningar.

Den totala massan av det modiga materialet behöver alltså inte motsvara massan av peptidet själv.

På samma sätt bekräftar inte överensstämmelsen mellan den uppmätta molekylmängden och den teoretiska värden:

• en komplett aminosyresekvens;
• korrekt kommunikation mellan de olika delarna;
• stereokemisk integritet;
• disulfidbryggors placering;
• fållning;
• Bristen på isobariska föroreningar.

Massspektrometri kan ge starka bevis om molekylmassa.

Tandemmassspektrometri och andra strukturella tekniker kan ge ytterligare information om sekvensen.

Kiralmetoder gör det möjligt att analysera stereokemiska ämnen som inte kan bestämmas med hjälp av en vanlig massaanalys.

I en av de analytiska studierna beaktades även reaktionsmekanismen som uppstår vid provtagningsprocessen. Detta visar ytterligare en viktig princip: själva analysprocessen kan orsaka artefakter om den inte utformas korrekt. [13]

Faldning och aktivitet kan kräva särskilt bekräftelse

För strukturellt begränsade peptider och små proteiner kan den korrekta sekvensen och molekylmassa fortfarande vara otillräckliga för att bekräfta den avsedda slutliga strukturen.

Ytterligare frågor kan omfatta:

• Har de rätta disiarckiska bryggorna uppstått?
• Har partikeln fått den förväntade konformen?
• Är cykleringen komplett?
• Finns det strukturella isomerer?
• Visar den syntetiska föreningen den förväntade aktiviteten i en specifik experimentell testning?

I studien av BPTI-syntesen användes flera analytiska och biofysiska metoder tillsammans med en bedömning av trypsinhämning. [3]

De sammanlagda resultaten stödde sambandet mellan det syntetiska materialet med en naturlig sekvens och det naturliga proteinet inom de granskade kriterierna.

Testen av aktivitet svarar dock på en viss funktionell fråga.

Det ersätter inte analysen av föroreningar.

På samma sätt bekräftar liknande aktivitet i ett test inte fullständig överensstämmelse mellan alla biologiska, strukturella eller produktionsrelaterade egenskaper.

Produktionsökningen förändrar mer än bara mängden material

En ökning av produktionsvolymen beror inte enbart på en proportionell ökning av mängden av alla reagenser.

Fysiska processer kan bete sig annorlunda i större skala.

Det kan vara av betydelse:

• blandning;
• värmeutbyte;
• distribution av reagenser;
• diffusion;
• vätskedannelse av gel;
• tryck;
• filtrering;
• ekonomin för lösningsmedel;
• utfällning;
• löslighet hos halvprodukterna;
• masstransport;
• möjligheterna med reningssystemet.

Disse faktorer kan påverka både reaktionsförloppet och föroreningarnas uppkomst.

Rensning i senare steg kan också bli en svår överraskning för hela produktionen.

En ökning av synteshastigheten är av begränsad betydelse om reningen inte kan separera de uppkomna föroreningarna effektivt eller återställa produkten av den önskade kvaliteten.

I en industriell analys som omfattade 40 processer för syntes av peptider från 14 läkemedelsföretag bedömdes materialförbrukningen under syntesen, reningen och isoleringen. [14]

Studien visar varför produktionsbedömningen bör utföras för hela processen.

Det betyder dock inte att varje fabrik, sekvens eller produktionsprocess ger identiska resultat.

Produktionens kvalitet är resultatet av många kontroller

Pålitlig produktion av peptider kräver mer än att få ett enda tillfredsställande analysresultat.

En kontrollerad process omfattar vanligtvis flera relaterade delar:

definierad målmolekyl → lämpliga utgångsmaterial → kontrollerad syntes → kontrollerad rening → lämplig provtagningsmetod → validerad eller ändamålsenlig analys → dokumentation av partiet.

Partiledighetens dokumentation kombinerar analytiska resultat med material som faktiskt har producerats.

Analyscertifikat (COA) sammanfattar de valda resultaten av analysen av en viss parti.

Dess informationsvärde beror på:

• typ av utförda undersökningar;
• de använda metoderna;
• denna metoders användbarhet;
• specifikationer;
• identifiering av provet;
• möjligheten att spåra partiet;
• Bekräftelse på att de rapporterade resultaten verkligen gäller det aktuella materialet.

Enskild värdering som „renhet” kan inte i sig bekräfta något:

• fullständig molekylär identitet;
• innehållet av peptidet;
• stereokemisk integritet;
• nivån av restsubstanser från lösningsmedel;
• vattenhalten;
• antijonstjälk;
• mikrobiologiska egenskaper;
• fållning;
• biologisk aktivitet;
• användbarhet för ett visst syfte.

Den rätta analysenheten beror på det avsedda användningsområdet för materialet.

Peptidet som används som analytisk referensmaterial, den undersökningsmedlet som används i en cellexperiment samt materialet som befinner sig i utvecklingsstadiet för läkemedel kan kräva svar på andra kvalitetsfrågor.

Analytiska beviser bör därför tolkas i en tydligt definierad kontext, och inte som universella bevis på kvalitet.

Miljöanalysen måste omfatta hela processen

Syntesen av peptider kan kräva stora mängder lösningsmedel och reagenser.

En miljöbedömning bör därför ta hänsyn till mycket mer än bara sammansättningsstadiet.

Viktiga delar kan vara:

• Anläggning av byggblock;
• bindningsmedel;
• avlägsnande medel;
• sköljning;
• avspjälkning;
• bearbetning av produkten;
• kromatografi;
• utbyte av lösningsmedel;
• isolering;
• torkning;
• avfallshantering.

Att minska miljöpåverkan kan kräva samtidigt förbättringar av flera steg.

I den publicerade analysen av peptidproduktionen behandlades problem som rör såväl syntesen som reningen och det framkom att det var nödvändigt att förbättra hela processen. [15]

Som en perspektivstudie utgör den inte någon kontrollerad direkt jämförelse som visar att en specifik teknik alltid är mer miljövänlig.

På samma sätt:

Snabbare syntes innebär inte automatiskt en mer miljövänlig syntes,

och lägre konsumtion av lösningsmedel under själva syntesen innebär inte automatiskt att hela produktionsprocessen påverkas mindre.

Miljöjämförelser kräver en konsekvent analysmetod och bör helst kopplas till en viss mängd isolerad och karakteriserad slutprodukt.

Vanliga frågor och svar

1. Hur skiljer sig syntesen av peptider på fast fas från syntesen i flytande fas?

I syntesen i fast fas förblir den ökande peptiden kopplad till en icke-löslig bärare, medan i den klassiska syntesen förblir peptidsaltet lösligt i en lösning och måste vanligtvis återvinnas baserat på sina fysiska och kemiska egenskaper. I en mer begränsad bemärkelse har en löslig ökande kedja i LPPS dessutom en löslig markör eller bärare som underlättar senare separering. Studien av markerad synteseprocesser visar en strategi för att kombinera den lösliga lösningen med återvinningen genom utspädning, medan litteraturen om LPPS skiljer sådana lösningar från både den klassiska syntesen i lösning och SPPS. Ingen metod är i sig optimal för varje peptid. Den grundläggande skillnaden gäller den fysiska hanteringen och separeringen av den ökande kedjan under de följande stadierna av syntesen. [8] [9]

2. Varför kan föroreningar uppstå under peptidsyntesen?

Förfyllda reaktioner kan inte alltid utföras i kvantitativt antal, och andra funktionella grupper kan delta i oönskade reaktioner. Ofullständig kondensation kan leda till selektiva sekvenser, och ofullständig avblockering kan störa den fortsatta kedjebildningen, och vissa sekvenser är känsliga för stereokemiska förändringar, bildning av aspartimid, oxidering, omgruppering eller biprodukter relaterade till avblockering. Synteseframgångar med Fmoc och strukturell analys av syntetiska peptidsubstanser dokumenterar flera sådana exempel. [11] [12] Frecvensen och betydelsen av de olika föroreningarna beror på sekvensen och processen, därför bör automatisering av syntesen inte jämföras med fullständig avsaknad av kemiska fel.

3. Vilken roll spelar gummi i syntesen av peptider?

Harts håller fast en växande peptidkedja, medan lösliga reagenser och många biprodukter kan avlägsnas mellan de olika syntesstegen. Detta underlättar betydligt den upprepade sammanfogningen av kedjan, men hartset är inte enbart en mekanisk hållare. Dess förträngning, fyllningsgraden, polymerens struktur, överensstämmelsen med lösningsmedlen och tillgängligheten av reaktionsplatser kan påverka effektiviteten i hur reagenserna når den sammanfogade peptiden. I studier med en reaktor med variabel sammansättning övervakades hartsets beteende under analysen av aggregering och bindningseffektivitet. [4] Denna övervakning eliminerar inte sekvensfel, men den visar varför hartsets fysiska tillstånd kan vara en viktig processvariabel.

4. Vad används vanga-harpiks för i peptidsyntesen?

Wang-substrat är allmänt förknippade med framställningen av peptider som frigörs efter en lämplig avblockering av C-koncentratet i form av karboxylsyra. Den exakta slutprodukten beror dock på länkeformen, bärarens struktur och den använda avblockningskemikalien, och inte bara på värmelacketets namn. Forskarna presenterade också en specialmetod för att omvandla peptidyl-Wang-TentaGel-materialet till peptidhydrater som kan användas som användbara syntetiska biprodukter. [5] En alternativ reaktion ändrar inte betydelsen av den standarda avblockeringen av Wang-värmelacket. Den visar dock varför man vid förutsägelse av produkten bör analysera hela bärare-systemet och reaktionsförhållandena.

5. Bygger SPPS peptidet från N-änden eller från C-änden?

Den klassiska spårbaserade SPPS-processen börjar vanligtvis med att den C-terminala delen kopplas till bärare, varefter kedjan förlängs i riktning mot N-änden. Detta är motsatt riktning till den standardiserade förlängningen av kedjan på ribosomen, där proteinet växer genom att ytterligare aminosyror läggs till C-änden. Syntesen av BPTI är ett exempel på användning av säkrade byggstenar och bärare för att förhindra senare frigörande, rening och avfall av produkten. [3] Det finns dock specialiserade peptidkemistrategier som använder andra lösningar, så därför bör uppbyggnaden från C-änden till N-änden betraktas som den klassiska SPPS-processen och inte som en absolut regel för alla syntesmetoder.

6. Varför behövs skyddsgrupper?

Aminosyror innehåller ofta flera reaktiva funktionella grupper. Säkerhetsgrupperna förhindrar tillfälligt reaktionen vid vissa platser och lämnar platsen fri för vidare reaktioner vid en specifik fas i syntesen. Detta hjälper till att styra ordningen och sättet att sammanföra resterna. Utan lämplig säkerhet kan konkurrerande reaktioner leda till att komplexa blandningar eller produkter med förändrad struktur bildas. Forskning om bildningen av aspartimid visade att en förändring av karboksygenerationens kemiska struktur kan begränsa en viktig bieffekt i de analyserade sekvenserna. [2] Säkerhetsgrupperna garanterar inte en perfekt syntesprocess, men de ger en selektiv kemisk kontroll som måste hållas i linje med alla viktiga faser i processen.

7. Vad skiljer Fmoc och Boc åt?

Fmoc och Boc är allmänt använda temporära grupper som skyddar amingruppen, men de reagerar på andra kemiska förhållanden. Fmoc avlägsnas vanligtvis i en sur miljö, medan Boc är känsligt för syror. Denna skillnad påverkar hur de kombineras med sidoringsgrupper, ligander och andra steg i syntesen. Syntes baserad på Fmoc används ofta i dagens SPPS, men studier har också visat möjligheten för sekvensberoende bieffekter i sådana förhållanden. [11] I praktiken är det därför mer användbart att jämföra hela skyddsstrategier och deras överensstämmelse med den givna sekvensen än att bara granska namnen på de två skyddsgrupperna.

8. Vad innebär ortogonal skydd?

Ortogonal skydd innebär att en skyddsgrupp kan avlägsnas under förutsättning att en annan skyddsgrupp är tillräckligt stabil för att syntesen kan fortsätta. Detta möjliggör exponering av olika reaktiva platser vid olika stadier. Denna konception är av grundläggande betydelse vid kontrollerad syntes av komplexa peptider. Ortogonalitet är dock beroende av förhållanden och inte av absolut värde: upprepad exponering, sekvensens karaktär och reaktionsparametrar kan fortfarande leda till biverkningar. Forskning kring alternativa metoder för att skydda karboxylgrupper visar hur skyddsåtgärden kan modifieras för att kontrollera svårkemisk peptidsyntes. [2]

9. Vad är en delecyndel?

En delecyndel är en peptid som saknar en eller flera aminosyror som finns i den avsedda målsekvensen. Den kan bildas när aminosyresammansättningsstadiet inte genomförs fullständigt, men den orenade kedjan förblir kopplad till bärare och deltar i följande cykler. Eftersom den felaktiga kedjan fortfarande är bundet till substratet behöver vanlig rening inte ta bort den. Studier av realtidsövervakning av SPPS visar att ofullständig amidbindning är ett viktigt processproblem. [4] Den delecyndella sekvensen är alltså ett problem relaterat till strukturen och identiteten hos produkten, inte bara resterna av reagenset.

10. Kan två peptidsorter ha samma molekylvikt?

Ja. Olika molekylära strukturer kan ha en identisk eller olik nominell massanivå. Därför bekräftar själva massöverensstämmelsen inte en fullständig identitet hos en molekyl. I studier av syntetiskt reninsubstratpeptider har isoarbetaresammansättningar av föroreningar identifierats där modifieringar förekom i olika positioner. Derivatisering och tandemmassspektroskopi gav ytterligare strukturell information. [12] Detta exempel visar varför en observerad massöverensstämmelse med förväntad massa inte i sig kan bekräfta en korrekt sekvens, sammanlänkning, stereokemi eller frånvaro av strukturellt liknande isomerer.

11. Vad är epimerisering och racemisering i peptidsyntesen?

Epimerisering och racemisering handlar om oönskade förändringar av den stereokemiska konfigurationen. Dessa kan inträffa utan att den nominella aminosyresekvensen eller molekylmassen ändras, vilket är anledningen till att en vanlig massmätning inte kan visa någon strukturell skillnad. I studier av mikrofotstimulerad Fmoc-syntes har rester som är känsliga för stereokemiska förändringar identifierats och det har visats att modifiering av reaktionsförhållandena kan minska sådana processer.[11] Risken beror på byggstenen, sekvensen och processförhållandena. Stereokemisk kvalitet kräver därför analytiska metoder som kan bedöma konfigurationen och kan inte bara dras slutsatsen utifrån molekylmassa.

12. Vad är bildningen av aspartimid?

Aspartimidbildning är en oönskad reaktion som är kopplad till vissa sekvenser som innehåller aspartin. Bildningen av den cirkulära biprodukten kan leda till ytterligare produkter med modifierad skallebundetlighet eller stereokemi, vilket minskar effektiviteten och gör reningen svårare. Forskare har analyserat alternativa skyddsåtgärder som är utformade för att minska denna reaktion i utvalda peptider och proteiner. [2] Resultaten visar inte på en enhetlig lösning för alla sekvenser som innehåller aspartin. De visar dock varför konstruktion av syntesstrategier och strategier för kontroll av föroreningar måste ta hänsyn till den specifika kemiska beteendet hos den givna sekvensen.

13. Stämmer hög renhet av HPLC med peptids identitet?

Nej. HPLC-renheten beskriver provet inom ramen för en specifik kromatografisk sektion, den använda detektorn och analysmetoden för data. En hög andel av huvudpartikeln kan vara ett värdefullt bevis på att provet domineras av en kromatografiskt separerad beståndsdel, men den självständiga bekräftelsen av fullständig molekylär identitet är inte möjlig. Samverkan av föroreningar, stereoisomerer och andra varianter kan kräva ytterligare tekniker. I studier av chiral analys av peptider användes en speciellt konstruerad process som även tog hänsyn till de stereokemiska förändringar som uppstår under provberedningen. [13] Identitet och renhet bör därför ses som relaterade, men separata analytiska frågor.

14. Betecknar produktens effektivitet samma sak som renhet?

Nej. Produktens kapacitet efter rening eller isolering anger mängden återvunnet slutmaterial jämfört med den definierade initiala eller teoretiska mängden. Renhet beskriver däremot sammansättningen av återvunnet material enligt en specifik analytisk metod. Syntesen kan leda till att en relativt liten mängd av produkt med mycket hög renhet eller en stor mängd råmaterial som innehåller en betydande mängd föroreningar erhålls. I studier av automatisk flödessyntes rapporterades renheten av råmaterial separat och produktens kapacitet efter isolering separat [7]. Att separera dessa parametrar förhindrar att en hög värde på den ena faktorn missförstås som bevis för en hög värde på den andra.

15. Kan långa peptider tillverkas genom att sammanföra kortare fragment?

Ja. I en fragmentstrategi kan kortare peptidsatser prepareras separat och sedan kombineras med hjälp av lämplig kemi. Ligering med hjälp av kemikalier var ett viktigt exempel där osäkra peptidsatser kombinerades på ett sätt som leder till bildandet av en naturlig bindning mellan peptidskelettet, och sedan erhålls ett formad protein. [10] Detta betyder inte att alla peptidsatser kan binda spontant. Strukturen hos peptidsatserna, bindningskemien, platsen för bindningen, löslighet, stereokemi och rensningskrav måste beaktas. Därför är sammanfogning av peptidsatser en alternativ strategi för synteseprojektion och inte en automatisk lösning på problemen med långa peptider.

16. Eliminerar snabbare automatiserad syntes behovet av rening?

Nej. Snabbare automatiserad eller flödesbaserad syntes minskar tiden för de specifika stadierna i syntesen, men det bevisar inte att varje bildad molekyl har den avsedda strukturen. I studier av snabb flödessyntes karakteriserades fortfarande råmaterialet och senare rening användes, och i senare arbeten om automatisering jämfördes separat råmaterialets renhet och produktivitet efter isolering. [6] [7] Bra resultat för systemet för de studerade sekvenserna garanterar dock inte identiska resultat för varje ny mål. Snabb syntes måste fortfarande kombineras med lämplig rening, identitetsbekräftelse, analys av föroreningar och slutlig karakterisering.

17. Varför är en ökning av produktionsvolymen mer komplicerad än att tillverka en större partikel?

Större skala förändrar fysiska och kemiska förhållanden, inte bara mängden material. Blandning, värmeutbyte, vidhäftning av bindemedlet, fördelningen av reagenser, tryck, filtrering, hantering av lösningsmedel, lösligheten hos halvprodukterna och systemets reningsegenskaper kan bete sig annorlunda vid större produktionsvolym. I en industriell analys bedömdes 40 peptidsyntesprocesser separat: syntes, rening och isolering under analysen av materialförbrukningen. [14] Resultaten visar varför produktionen måste ses som en komplett process. En skalbar metod måste kunna upprepas för att ge en karakteriserad produkt vid alla faser, inte bara vid en större mängd råpeptider.

18. Är peptidet färdigt direkt efter att den korrekta sekvensen har lagts in?

Inte nödvändigtvis. Konstruktionen av kedjan skapar sekvensen endast i den utsträckning som processen och analytiska data bekräftar detta. Avseende molekylen kan avblockering, avblockning, cyklisering, oxidering, bildning av disiarcykliska broar, folding, konjugering, rening och karakterisering fortfarande vara nödvändiga. Syntesen av BPTI utgör ett bra exempel på en process där rening och bildning av en formad struktur med disiarcykliska broar ägde rum efter konstruktionen av den linjära sekvensen. [3] Begreppet „färdigt peptid” bör alltså avse den molekylära form som krävs i det givna vetenskapliga sammanhanget, och inte bara den slutliga fasen med tillsats av aminosyror.

19. Stämmer den korrekta molekylmassen med den korrekta peptidssekvensen?

Nej. Masskonvergens är ett värdefullt bevis, men den kan inte självständigt bekräfta hela sekvensen eller molekylstrukturen. Isobariska strukturer kan ha samma massa, och stereokemiska skillnader kan i allmänhet inte orsaka någon förändring i masskonvergens. Forskningar om föroreningar av syntetiska peptider har visat att skillnader i strukturellt sett olika komponenter kan kräva tandemmassspektroskopi och ytterligare analyser. [12] Vid frågor om stereokemisk integritet kan även kiraliska metoder behövas. [13] Masskonvergens bör därför betraktas som en del av bedömningen av identitet, och inte som en fullständig bekräftelse av den.

20. Varför ska rening ses som en del av peptidproduktionen och inte bara som en slutlig tillsats?

Rensningen avgör om den avsedda peptiden kan separeras effektivt från sekvenserna av deleterande substanser, biprodukter, restsubstanser från reagenser, strukturellt liknande föroreningar och andra komponenter som uppstår under syntesen. En metod som möjliggör att man snabbt kan producera stora mängder råmaterial kan fortfarande vara praktiskt obefintlig om man inte kan återvinna det avsedda produkts kvalitet effektivt. Därför omfattar industriell analys av peptidsyntesprocesser sammanfattningen av syntesprocessen, reningen och isoleringen. [14] Effektiviteten av produktionen bör slutligen bedömas utifrån mängden och kvaliteten på det isolerade slutmaterialet, inte bara på synteshastigheten.

Begränsningar vid jämförelse av metoder för syntes av peptider

När man tolkar studier som jämför olika tekniker för produktion av peptider är det viktigt att komma ihåg några viktiga begränsningar.

Först och främst påverkar sekvensen starkt svårigheten att syntetisera. En metod som fungerar för ett peptid behöver inte fungera på samma sätt för ett annat. Aggregering, hydrofobitet, aminosyrebildning, längd, tendens att bilda sekundära strukturer och känslighet för sidorörliga reaktioner kan ändra processens beteende. [1] [4]

För det andra är renheten hos råmaterialet, prestandan efter isolering, den slutliga renheten och innehållet av peptid olika parametrar. Att jämföra metoderna enbart utifrån en av dem kan ge en ofullständig bild av produktionseffektiviteten. [7]

För det tredje innebär snabb sammanfogning av kedjan inte snabb produktion av hela materialet. Avskärning, rening, isolering, slutlig strukturformning, analytiska undersökningar och dokumentation påverkar också den totala produktionstiden. [6] [7]

För det fjärde, den analytiska renheten beror på den använda metoden. HPLC, massspektroskopi, tandemmassspektroskopi och chiral analys svarar på olika frågor. En analytisk utvärdering behöver inte bekräfta den fullständiga strukturella identiteten. [12] [13]

Femte, skalaen påverkar processens beteende. Resultaten från laboratorieutbildningen kan inte automatiskt överföras till industriell produktion utan beaktande av blandning, masstransport, möjligheter till rening, materialförbrukning och andra skalförändrande faktorer. [14]

Sjätte, historiska ekonomiska jämförelser kan med tiden tappa sin aktualitet. Kostnaderna för reagenser, nivån på automatisering, teknik för expressionsprocesser, utrustning för rensning, återvinning av lösningsmedel och produktionsinfrastruktur utvecklas ständigt. Äldre kostnadsanalyser kan fortfarande vara av vetenskaplig betydelse, men de behöver inte längre spegla den aktuella marknadsekonomin. [1]

Sju: Miljöjämförelser kräver konsekventa gränser för analysen. En bedömning av användningen av lösningsmedel under själva tillverkningen av kedjan, samtidigt som rening och isolering undviks, kan leda till missvisande slutsatser om processens balans. [14] [15]

Slutligen definierar själva namnet på metoden inte produktens kvalitet. SPPS, syntes i en lösning, LPPS, ligering av fragment samt biologisk expression kan leda till att man får material av hög kvalitet, om processen är korrekt utformad och kontrollerad. Ingen av dessa metoder garanterar dock automatiskt korrekt identitet, renhet, stereokemisk struktur, folding eller användbarhet för ett visst tillämpningsområde.

Sammanfattning

Syntesen av peptider kan bäst förstås som en kontrollerad process för att skapa molekyler, och inte bara som bildandet av peptidhållna bindningar.

Syftet är att konstruera en viss aminosyresekvens samtidigt som man kontrollerar hur resterna binds samman, skyddsgruppernas kemiska struktur, stereokemi, sidoreaktioner och eventuella ytterligare strukturella krav.

Peptidsyntes på fast fas håller den växande kedjan på en icke-löslig bärare, vilket gör att upprepade faser för bindning och rensning är lämpliga för automatiserad process. Fördelarna med upprepade upplagningar eliminerar dock inte problem som bristfälliga reaktioner, aggregering, sekvenser av delektioner eller sekvensberoende bieffekter. [4] [6] [7]

Den klassiska syntesen i en lösning håller peptidsubstanserna i flytande fas och kan ge större flexibilitet vid isolering och karakterisering av de olika mellanprodukterna. Vidare kan flera separeringar och försämrad löslighet dock bli allvarliga begränsningar.

Metoder för syntes i flytande fas med lösliga markörer försöker kombinera lösningsmedelskemien med utformade återvinningsstrategier för materialet. De kan därför vara en ytterligare möjlighet vid sekvenser och produktionsproblem där klassisk SPPS inte är optimalt. [8] [9]

Längre eller särskilt svåra molekyler kan också framställas genom att dela dem upp, inklusive naturlig kemisk ligering, i stället för att bara använda sig av en kontinuerlig tillsats av nya aminosyrerester.[10]

Oavsett vilken metod som väljs för att framställa produkten, förblir effektiviteten av bindningen och kemiska bindningsstrukturer av avgörande betydelse, eftersom små effektnedsättningar och biverkningar kan ackumuleras under följande steg i syntesen. Syntesen av aspartimid, delecyngångar och stereokemiska förändringar visar varför själva den avsedda sekvensen inte beskriver allt som kan uppstå under processen.[2] [11] [12]

Arbetet slutar inte heller med att kedjan läggs.

Rensningen avgör om det slutliga produkten kan separeras från andra ingredienser.

Därefter motsvarande analysmetoder svarar på särskilda frågor om identitet, renhet, innehåll, stereokemi, konformitet och – om det är relevant – funktionell aktivitet. [3] [12] [13]

En ökning av produktionsvolymen innebär ytterligare frågor om masstransport, vidhäftning av limmet, konsumtion av lösningsmedel, filtrering, möjligheter till rening, processens återbeskrivbarhet och dess miljöeffekter. Av denna anledning bör den industriella utvärderingen av processen omfatta syntes, rening och isolering, och inte bara koncentrera sig på bindningshastigheten. [14] [15]

Den viktigaste principen är följande:

Effektiv peptidproduktion kräver kontroll av hela processen – från molekylär design och bindingen till rening och strukturell karakterisering. Att erhålla en kedja med den förväntade nominella massan eller en hög huvudkromatografisk peak är ett värdefullt bevis, men ingen av dessa parametrar i sig kan bekräfta den fullständiga molekylära identiteten eller kvaliteten på produktionsprocessen.

Varning

Artikelns syfte är endast utbildningsrelaterat och vetenskapligt informativt. Den beskriver allmänna principer för peptidkemi, fastfas-syntes, lösning- och flytandefas-syntes, strategier för skyddsgrupper, bindning, rening, analytisk karakterisering, produktionsprocesser samt exempel som härrör från publicerade studier. Den är inte en laboratorieprotokoll, produktionsanvisning, medicinsk rådgivning, vägledning om dosering eller administrering, eller certifikat om kvalitet för någon särskild peptidprodukt. Experimentella resultat bör tolkas i relation till sekvensen, de använda metoderna, processens omfattning, analytiska tekniker och begränsningar för de enskilda studierna.

Referenser

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K., & Perczel, A. (2016). Bakteriell expresion och/eller peptidsyntes i fast fas av polypeptider med 20–40 aminosyror samt miniproteiner, fallstudien med klass B-GPCR-ligander. Current Protein & Peptide Science, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Förhindrande av aspartimidbildning under peptidsyntes med cyanosulfuryler som karboxylsyra-skyddande grupper. Nature Communications, 11(1), Artikel 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). Solid-phase syntes av bovin pankreatisk trypsininhibitor (BPTI) och två analoger. En kemisk metod för att utvärdera rollen av disulfidbroar i proteinspackning och stabilitet. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. PubMed-post
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). Realtidsuppföljning av peptidsyntes i fast fas med hjälp av en flödesreaktor med variabel bädd. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F., & Becker, C. F. W. (2015). Effektiv framställning av peptidhydrazider via direkt hydrazinolys av Peptidyl-Wang-TentaGel-harts. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Rapid flow-based peptide synthesis. ChembioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2017). En helt automatiserad flödesbaserad metod för accelererad peptidsyntes. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G., & Albericio, F. (2022). Viskosfasipetidsyntes (LPPS): En tredje våg för framställning av peptider. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T., & Fukui, T. (2012). Ny amid-skyddsgrupp av derivat av difenylmetyl för effektiv syntes av peptider i flytande fas: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., & Kent, S. B. (1994). Syntes av proteiner genom nativ kemisk ligering. Science, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Begränsning av racemisering och aspartimidbildning vid mikrovågsbehandlad Fmoc-fasta fas-peptidsyntes. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Karakterisering av föroreningar i ett syntetiskt renin-substratpeptid genom masspektrometri med snabbatombombardering och hybrid tandemmasspektrometri. Rapid kommunikation inom massspectrometri, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G. & Crowther, J. B. (1995). Peptidkiralisk renhetsbestämning: Hydrolyse i deutererad syra, derivatisering med Marfey’s reagens och analys med högpresterande vätskekromatografi-elektrosprayspray-ionisationsmassspektrometri. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Process mass intensity (PMI): En helhetsanalys av nuvarande peptidtillverkningsprocesser informerar om hållbarhet i peptidsyntesen. Journal of Organic Chemistry, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Hållbarhetsutmaningar inom peptidsyntes och rening: Från forskning och utveckling till produktion. Journal of Organic Chemistry, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001