Peptidbindningar: definition, förekomst och biologisk betydelse

Peptidbindning är en kovalent amidbindning som sammankopplar aminosyrarester i peptider och proteiner. Dessa bindningar bildar en kontinuerlig molekylär ryggrad i peptidkedjorna, vilket upprätthåller en specifik ordning på aminosyrorna samtidigt som det gör det möjligt för hela kedjan att anta olika tredimensionella strukturer.

Peptidbindningar är en av de grundläggande byggstenarna peptider. Att förstå deras kemi bidrar till att förklara hur enskilda aminosyror kan bilda större molekyler med en noggrant bestämd sekvens och struktur.

Även om den grundläggande definitionen är relativt enkel, har peptidbindningens kemi flera viktiga egenskaper. Elektronerna i amidgegruppen är fördelade på ett sådant sätt att kol–kväve-bindningen delvis liknar en dubbelbindning. Detta begränsar möjligheten till fri rotation kring peptidbindningen, men gör inte att hela peptiden eller proteinet blir en stiv molekyl. Andra bindningar i ryggraden behåller en större rotationsfrihet, vilket gör att peptidkedjorna kan böjas och veckas.

Peptidbindningar kan analyseras ur flera olika vetenskapliga perspektiv. Kemister studerar deras elektronstruktur och geometri. Molekylärbiologer analyserar hur de bildas av ribosomer och andra biologiska system. Strukturterbiologer undersöker hur dessa bindningars geometri påverkar proteinerats arkitektur. Biokemister studerar däremot hur enzymer selektivt bryter ner peptidbindningar under bearbetning och nedbrytning av proteiner.

Dessa åtskillnader hjälper till att förstå hur proteiner samtidigt kan behålla en specifik aminosyrarespons, anta komplexa strukturer, bildas i kontrollerade biologiska processer och sedan genomgå bearbetning eller nedbrytning. Studier av elektronstruktur, peptidgeometri, ribosomal katalys, proteinsyntes och enzymatisk hydrolys ger kompletterande information om dessa processer. [1] [2] [3]

Vad är en peptidbindning?

Den kemiska definitionen av en peptidbindning

Peptidbindningen är amidbindning mellan gruppen som härstammar från karboxylgruppen hos en aminosyra och gruppen som härstammar från aminogruppen hos en annan aminosyra. I ett typiskt proteinskelett binds kolatom i karbonylgruppen och kväveatom i nästa aminosyrarest samman.

Det vanligaste framställda fragmentet har formen av:

–C(=O)–NH–

C=O-fragmentet är karbonylgrupp, medan C–N-bindningen är den bindning vi vanligtvis menar när vi talar specifikt om en peptidbindning. Tillsammans bildar dessa atomer och deras direkta omgivning den så kallade peptidgeten eller amidgrupp.

Denna åtskillnad är viktig eftersom peptidgruppens fullständiga strukturformel innehåller flera olika bindningar. Kol–syre-bindningen är inte den koppling som sammanbinder två aminosyrarester. Denna funktion utförs av kol–kväve-amidbindningen.

När en aminosyra kopplas till en annan, binds karbonylgruppens kolatom bunden till en rest kovalent till kväveatom bunden till nästa rest. Upprepning av detta mönster leder till bildandet av stommen i en typisk peptidkedja.

Undersökningar av elektronstrukturen analyserar bland annat växelverkan mellan kvävets fria elektronpar och det närliggande karbonylsystemet, vilket gör det möjligt att förklara varför denna bindning skiljer sig från en vanlig, fritt roterande enkelbindning mellan kol och kväve. [1]

Varför är en peptidbindning en kovalent bindning?

Peptidbindningen är kovalent, eftersom de bundna atomerna delar elektronpar.

Det är varken en jonisk interaktion mellan två separata, laddade aminosyror eller en vätebindning som håller olika delar av den veckade kedjan nära varandra.

Det är just denna kovalenta bindning som säkerställer den kemiska kontinuiteten hos aminosyrasekvensen. Resterna förblir en del av samma kedja tills en kemisk reaktion förändrar hur de är sammankopplade.

Denna skillnad blir särskilt viktig när man diskuterar veckning och utveckning av proteiner. En peptidkedja kan böjas, ändra konformation, förlora en del av de interaktioner som stabiliserar dess struktur och till och med vecklas ut avsevärt utan att de peptidbindningar som upprätthåller dess primärsekvens behöver brytas.

Kovalent betyder dock inte oförstörbart.

Enzymer och lämpliga kemiska förhållanden kan orsaka klyvning av peptidbindningar. En sådan klyvning är dock kemisk reaktion som förändrar sättet atomerna är bundna på, och inte bara en förändring av molekylens form.

Strukturstudier av ett av aspartylproteaserna visar hur en enzym på ett lämpligt sätt kan organisera ett substrat som innehåller en peptidbindning och en vattenmolekyl på ett sätt som är av betydelse för hydrolysen. [4]

Den dubbelbindandeaturens partiella karaktär och resonans

C–N-peptidbindningen framställs ofta i formler som en enkel linje, men den faktiska elektronfördelningen är mer komplex.

Det fria elektronparet hos kväveatom kan delta i den närliggande karbonylgruppens elektronssystem. Elektrondelokaliseringen gör att C–N-bindningen får delvis dubbelbindningskaraktär.

Detta fenomen förklaras ofta med hjälp av resonansstrukturer.

Resonansstrukturer är alternativa sätt att representera elektronspridningen i samma molekyl. De ska inte tolkas som skilda former av molekylen som snabbt övergår i varandra.

På samma sätt innebär inte dubbelbindningens partiella karaktär att peptidbindningen under en viss procent av tiden är en vanlig enkelbindning och under resten av tiden en vanlig dubbelbindning.

Den faktiska elektronstrukturen är ett resultat av elektronernas delokalisering inom hela amidgruppen.

I en beräkningsstudie analyserade Fedorov resonansens bidrag till att bestämma peptidbindningens ordning. De detaljerade numeriska värdena beror på vilken metod för elektronstrukturanalys som används. För en generell förståelse är dock den viktigaste slutsatsen att interaktionen mellan kväveatomens och karboxylgruppens elektroniska system står för några av de ovanliga egenskaperna hos C–N-bindningen. [1]

Varför är rotationen kring en peptidbindning begränsad?

Den partiella karaktären hos dubbelbindningen har en viktig strukturmässig konsekvens: rotationen kring den amidiska C–N-bindningen är mer begränsad än rotationen kring en typisk enkel bindning mellan kol och kväve.

Detta betyder dock inte att proteiner inte kan böjas eller veckas.

Peptidskelettet innehåller även andra bindningar kring vilka rotation är möjlig. Proteinkedjan består således av repeterande, relativt styva peptidgrupper sammankopplade via andra skelettbindningar som karaktäriseras av större konformationsflexibilitet.

Kombinationen av dessa begränsningar och rotationsmöjligheter bidrar till den enorma mångfalden av tredimensionella strukturer som peptider och proteiner kan anta.

Ungefärlig planhet innebär inte en perfekt plan struktur

Elektrondelokalisering gynnar av den ungefär planära geometrin hos peptidgruppen och begränsar rotationen kring den amida C–N-bindningen.

Verkliga molekylära strukturer kan dock avvika något från det idealiska matematiska planet.

Improta och medarbetare kombinerade kvantmekaniska beräkningar med analys av kristallstrukturer för peptider och proteiner. Resultaten visade små, systematiska avvikelser beroende på skelettets lokala geometri. [2]

Därför är det korrekt att påstå att peptidgrupper är nästan platta, medan det vore en alltför stor förenkling att påstå att varje peptidbindning i varje peptid eller protein är helt plan.

Detta är ett bra exempel på skillnaden mellan en användbar pedagogisk modell och det mer detaljerade beteendet hos verkliga molekylära strukturer.

Var förekommer peptidbindningar?

I ryggraden hos peptider och proteiner

Peptidbindningar förekommer mellan intilliggande aminosyrarester i typiska peptid- och proteinkedjor.

Tillsammans med de omgivande atomerna bildar de en upprepande molekylskelett. Aminosyrorna har sidokedjor som sticker ut från detta skelett och ger de enskilda resterna ytterligare kemiska egenskaper.

Ett protein kan bestå av en enda peptidkedja eller av flera kedjor som är sammankopplade till ett större molekylkomplex. Var och en av dem har sina egna ryggradskopplingar.

Olika kedjor kan bindas samman genom icke-kovalenta interaktioner eller ytterligare kovalenta bindningar. Sådana kopplingar bör inte automatiskt räknas till peptidbindningar.

Den kemiska syntesen av bovint pankreatiskt trypsinhämmare, det vill säga BPTI, visar tydligt skillnaden mellan bildandet av pepsidryggen och uppkomsten av extra disulfidbryggor. Forskarna erhöll först det linjära materialet och utförde sedan dess oxidation och karakterisering. Studien skiljer därmed kedjans uppbyggnad från den senare strukturella organisationen. [5]

Peptidbindningar bestämmer kontinuiteten i primärsekvensen

aminosyraföljd primärstruktur.

Peptidbindningar tillhandahåller den grundläggande kovalenta kontinuitet som upprätthåller denna sekvens.

Till exempel sekvensen:

Ala–Gly–Ser

innehåller samma tre typer av aminosyror som:

Ser–Gly–Ala

Det är dock inte samma peptidsekvenser.

De enskilda resternas position i förhållande till de peptidbindningarna är en annan.

Därför räcker inte enbart listan över aminosyror i provet för att identifiera peptiden. Det krävs också att man känner till deras ordningsföljd och bindningssätt.

I linjära och cykliska peptider

En typisk öppen peptidkedja har två ändar, benämnda N-slut i C-slut.

N-änden motsvarar ena änden av peptidstommen, medan C-änden motsvarar den andra. Peptidsekvenser skrivs standardmässigt från N-änden i riktning mot C-änden.

Huvud-till-svans-cyklisk peptid, det vill säga sluten genom en sammankoppling av kedjans ändar, innehåller en extra ryggradsbindning som bildar en ring.

Inte alla cykliska peptider sluts dock på samma sätt. Ringstrukturen kan också bildas med hjälp av en sidokedja, och vissa molekyler innehåller mer än en typ av tvärbindning.

Term cyklisk beskriver således en egenskap hos molekylens arkitektur snarare än ett enda universellt sätt att binda samman den.

Kalata B1 är ett konkret exempel på en peptid vars cykliska ryggrad har bekräftats bland annat genom enzymatiska klyvningsstudier, sekvensanalys och molekylstruktur. Molekylen innehåller också disulfidbryggor. Dessa extra svavel–svavel-bindningar skiljer sig kemiskt från amidbindningarna som binder samman resterna i peptidryggraden. [6]

Peptidbindningar vs isopeptidbindningar

I ett typiskt proteinskelett binds de huvudsakliga aminogrupperna och grupperna härrörande från karboxylgrupper samman av peptidbindningar.

Amidbindning, i vars bildning deltar aminosyrasidokedjans funktionella grupp, brukar ofta beskrivas som isopeptidbindning.

Den viktigaste principen är därför att fastställa vilka atomer som faktiskt har bundits till varandra.

Enbart förekomsten av en amidbindning innebär inte automatiskt att den finns i ett typiskt peptidskelett. Samtidigt är inte varje tvärbindning i en peptid eller ett protein en amidbindning – disulfidbryggor och andra kovalenta modifieringar har en annan kemi.

För nybörjare är vanliga peptidbindningar i ryggraden den mest användbara utgångspunkten. Mer specialiserade kopplingar kan därefter betraktas som olika varianter av molekylär organisation.

Hur många peptidbindningar finns i kedjan?

Enkel öppen, ogrenad kedja som innehåller n aminosyrarester har n − 1 peptidbindningar i ryggraden.

Detta innebär att:

• dipeptid har 2 restsyror och 1 peptidbindning;
• En tripeptid har 3 restgrupper och 2 peptidbindningar;
• tetrapeptiden har 4 restpartiklar och 3 peptidbindningar;
• en pentapeptid har 5 rester och 4 peptidbindningar;
• en öppen kedja som innehåller 10 restgrupper har 9 peptidbindningar.

Detta beroende beror direkt på molekylens bindningssätt: varje efterföljande rest förlänger den befintliga kedjan med en extra skelettbindning.

Motsvarande cyklisk head-to-tail-kedja innehåller n peptidbindningar i ryggraden, eftersom en extra bindning sluter ringen.

Dessa antaganden är dock väsentliga. Förgreningar, atypiska sidokedjekopplingar, närvaron av flera kedjor, isopeptidbindningar eller andra skelettelement än amidbindningar kräver en mer detaljerad analys.

Enbart antalet restur är därför inte alltid tillräckligt för att bestämma alla kovalenta bindningar som finns i en komplex peptid eller ett protein.

Hur binder peptidbindningar samman aminosyror?

Från fria aminosyror till aminosyrarester

Den fria aminosyran och motsvarande rest i en peptid är relaterade till varandra, men de beskriver inte exakt samma kemiska tillstånd.

När en aminosyra införlivas i en peptid deltar dess funktionella grupper i de bindningar som bildar kedjan.

Till exempel leder enkoppling av glycin och alanin i en viss ordning till bildandet av glycylalanin. Omkastning av ordningen leder till uppkomsten av alanyloglicyny.

Typerna av aminosyror är desamma, men deras position och kemiska miljö skiljer sig åt.

Detta visar varför en peptidsekvens innehåller mer information än en enkel lista över dess beståndsdelar.

Bindningsbildning kan studeras direkt. Stachelhaus och medarbetare analyserade komponenter i det icke-ribosomala peptidsyntassystemet och visade att en förändring av aminosyraresten i det föreslagna katalytiska sätet omöjliggjorde den studerade kondensationsreaktionen. Experimentet kopplar därmed bildandet av en specifik peptidprodukt till funktionen hos ett specifikt molekylärt maskineri. [7]

Kondensationsekvationen är en reaktionsbalansmodell

I grundläggande kemi framställs bildningen av en peptid ofta med ekvationen:

aminosyra + aminosyra → dipeptid + vatten

Ekvationen visar skillnaden i sammansättning mellan de fria utgångsmolekylerna och den sammansatta produkten.

Det är användbart för att förstå det kemiska förhållandet mellan reaktanterna och produkten.

Den bör dock inte tolkas som en komplett mekanism för proteinsyntes inuti en levande cell.

Fria aminosyror ställer sig inte bara bredvid varandra i vatten, frigör inte spontant vattenmolekyler och bildar inte automatiskt en specifik proteinkedja.

Biologisk syntes kräver aktiverade substrat, ordnade molekylära maskinerier, sekvensbestämmande information och energikrävande förberedelseprocesser.

Det är därför viktigt att skilja mellan sumarisk kemisk formel a reaktionsmekanism.

Ekvationen beskriver den ursprungliga och slutliga sammansättningen. Mekanismen förklarar de faktiska molekylära stegen och intermediärerna som leder till reaktionen.

Experiment med ribosomer studerar just sådana mekanistiska detaljer och återskapar inte bara den kända kondenseringsekvationen. [3]

Hur bildar ribosomen peptidbindningar?

Under translacji överför transfer-RNA, det vill säga tRNA, transporterar aminosyror och den växande peptidkedjan inne i ribosomen.

Aminogruppen hos den nyligen levererade aminosyran reagerar med den aktiverade änden av den befintliga kedjan som är bunden till tRNA, vilket leder till att den växande peptiden överförs till resten som är bunden till det nya tRNA:t.

Peptidkedjan förlängs vanligtvis från änden C-terminalen.

Aktiveringen av aminosyror och deras bindning till tRNA är energiberoende processer. Därför skulle en beskrivning av varje ribosomalt peptidbindningsbildande som antingen sker direkt mellan två fria aminosyror eller som en enkel „vattenborttagning” av ribosomen vara en alltför stor förenkling.

Weinger och medarbetare modifierade en kemisk grupp i tRNA-substratet och observerade en avsevärd minskning av bildningen av peptidbindningar utan en motsvarande minskning av substratbindningen. Detta resultat gav bevis för substratassisterad katalys, där substratens egna kemiska egenskaper deltar i reaktionsförloppet. [3]

Eksperimentet pekar därför på tRNA-kemins mekanistiska roll, snarare än enbart dess funktion som en passiv bärare.

Bildningen av peptidbindningar har en specifik riktning

Proteinsyntesen är en riktad process.

Eftersom den växande kedjan förlängs från C-änden utvecklas sekvensen i en specifik orientering.

Detta är kopplat till den gängliga konventionen att skriva peptid- och proteinsekvenser från N-terminal till C-terminal.

Riktningen är dock inte enbart en skrivkonvention. Att vända på sekvensen leder vanligtvis till bildandet av en annan molekyl, eftersom varje rest då intar en annan position i förhållande till kedjans övriga element.

Andra sätt att skapa liknande typer av bindningar

Peptidbindningar kan även bildas utanför ribosomen.

Specialiserade icke-ribosomala enzymsystem syntetiserar vissa peptider, medan laboratoriesyntes av peptider utnyttjar aktiverade beståndsdelar och kontrollerade kopplingsreaktioner.

Dessa vägar skiljer sig åt i fråga om organisation, substrat, reaktionsvillkor och katalytiska mekanismer.

De bör inte betraktas som identiska processer bara för att slutprodukterna innehåller amidbindningar.

Undersökningar av icke-ribosomal bindningsbildning och kemisk syntes av BPTI utgör exempel på sådana skilda produktionsmetoder. [7] [5]

Själva tillverkningsmetoden avgör inte heller om en viss molekyl är en peptid eller ett protein. Kemisk syntes kan leda till erhållande av ett material som motsvarar en naturligt förekommande peptid eller ett protein, förutsatt att dess sekvens och andra väsentliga strukturella egenskaper fastställs korrekt.

Peptidbindningar vs andra bindningar i proteiner

Ryggradsbindningar kontra bindningar ansvariga för veckning

Peptidbindningarna håller ihop den sammanlänkade aminosyrasekvensen.

De interna interaktionerna hjälper däremot till att bestämma hur denna sekvens veckas i den tredimensionella rymden eller hur enskilda peptidkedjor interagerar med varandra.

Vätebindningar bildas mellan lämpliga vätedonatorer och väteacceptorer. Inom proteinstommen kan syreatomerna i karbonylgrupperna fungera som acceptorer, och många N–H-amidgrupper kan fungera som donor.

Amidkväve brukar inte betraktas som en vätebindningsacceptor eftersom dess elektronpar deltar i amidgruppens elektronssystem.

Särskild uppmärksamhet krävs också för peptidgrupper som innehåller prolin, eftersom skelettets kväve då saknar den typiska N–H-väteatomen.

Gruppen som innehåller en peptidbindning kan därför delta i bildandet av vätebindningar, men peptidbindning och vätebindning är olika typer av bindningar.

Den ena binder aminosyrarester kovalent. Den andra deltar i interaktioner inom molekylen eller mellan molekyler.

Studier av den korta, veckade peptiden CLN025 analysera strukturen som stabiliseras av bland annat vätebindningar och andra intramolekylära interaktioner. Detta visar att veckning kan ske utan bildandet av en ny ryggradssekvens. [8]

Disulfidbryggor sammankopplar svavelhaltiga sidokedjor

Disulfidbryggor är kovalenta svavel-svavel-bindningar som oftast bildas mellan cysteinets sidokedjor.

De kan sammankoppla avlägsna delar av samma peptidkedja eller olika kedjor.

De är inte peptidbindningar och förekommer inte i alla proteiner.

Bildandet eller brytandet av en disulfidbrygga kan avsevärt förändra molekylens rymdorganisation utan att dess peptidryggrad behöver kapas.

I en studie om syntesen av BPTI förbereddes en naturlig sekvens och analoger utformade för att förändra möjligheten att bilda disulfidbryggor. Materialet med den naturliga sekvensen jämfördes med naturligt BPTI med hjälp av analytiska och funktionella metoder. Publikationens abstrakt bekräftade inte alla strukturella konsekvenser för analogerna, varför de föreslagna skillnaderna inte bör presenteras som fullt fastställda resultat. [5]

Joniska och hydrofoba interaktioner

Laddade grupper kan attrahera eller repellera varandra, vilket påverkar molekylens rumsliga organisation.

Icke-polära regioner interagerar å sin sida med vattenmiljön på ett sätt som kan gynna att de döljs inuti strukturen, association elleraggregation. Detta fenomen diskuteras ofta i samband med den hydrofoba effekten.

Dessa interaktioner kan ha enorm betydelse för proteinveckningen, men den hydrofoba interaktionen är inte en ny kovalent bindning mellan aminosyrorna.

Därför är det felaktigt att benämna alla krafter som stabiliserar proteinet som peptidbindningar.

De olika typerna av interaktioner kan också reagera olika på temperatur, lösningsmedel, surhetsgrad, jonförhållanden och andra miljöförändringar. Att fastställa vilken typ av bindning eller interaktion som förändras gör det möjligt att mer exakt förstå experimentets resultat.

Denaturering är inte samma sak som hydrolys

Denaturering Det ändrar den typiska strukturella organisationen hos proteinet.

Det kan störa flöjningen eller associeringen av molekylerna, samtidigt som majoriteten eller alla peptidhållningsbanden förblir intakta.

Hydrolys Det ändrar däremot de kemiska bindningarna genom att bryta ned den känsliga bindningen i en reaktion med vatten.

Under vissa förhållanden kan båda processerna äga rum i samma prov, men de är inte synonyma.

En proteins tillväxt innebär alltså inte automatiskt att den omvandlas till kortare peptider eller fria aminosyror.

Denna skillnad syns även i strukturella studier. I experiment med termiskt utvecklat kollagen identifierades olika konfigurationer av cis- och trans-peptidbindningar kopplade till prolin. Ändringen av skelettkonfigurationen är en annan händelse än dess kemiska sönderdelning [9].

Uppkomst, egenskaper och hydrolys av peptidbindningar

Stabiliteten beror på typen av den analyserade reaktionen

Peptidbindningar är tillräckligt starka för att hålla samman biologiska kedjor, samtidigt som organismerna kan selektivt skapa och bryta ned dem.

Det finns ingen motsägelse i det.

Reaktionstiden beror bland annat på Barriärer för aktivering och närvaro av katalysatorer, Men om en viss reaktion är termodynamiskt fördelaktig är en annan fråga.

Processen kan kemiskt sett vara möjlig, men utan lämplig katalys går den mycket långsamt.

Å andra sidan kan ett enzym kraftigt påskynda en viss reaktion genom att tillhandahålla en bättre reaktionsväg.

Enzymet ändrar inte peptidsammanhållningen till någon helt annan typ av bindning. Det ändrar vägen som den kemiska reaktionen går.

Det skulle också vara felaktigt att tilldela en universell hållbarhetstid till alla peptidhålliga bindningar, peptider eller proteiner som finns i vatten.

Sekvensen, den lokala strukturen, bindningsmöjligheten, angränsande kemiska grupper, temperatur, pH, lösningens sammansättning och närvaron av katalysatorer kan påverka den observerade effekten.

Vad förändras genom hydrolys?

Hydrolysen använder vatten i en kemisk reaktion för att bryta ner amidbindningen, vilket leder till bildandet av nya ändar som härrör från karboxyl- och amingrupperna.

Deras exakta joniska form är beroende av förhållandena i den omgivande lösningen.

Separeringen av en bindning i skelettet leder inte automatiskt till bildandet av fria aminosyror.

Om den interna peptidhållningen i den längre öppna kedjan bryts sönder, kommer de direkta produkterna vanligtvis att vara två kortare peptidhål.

Fler reaktioner av splittring behövs för att gradvis minska dessa fragment och slutligen frigöra de enskilda aminosyrorna.

Strukturella studier av penicillopepsin analyserade hur aspartatproteas kan organisera vatten och substratgrupper under hydrolysprocessen. Den föreslagna reaktionsmodellen bygger på kristallografiska observationer och modellering. Den ger information om en enzymmekanism, men bevisar inte att varje proteas använder samma katalysmetod. [4]

Hydrolysen kan vara selektiv

Proteaser och peptidaser skiljer sig åt vad gäller de bindningar och molekylära miljöer som de identifierar.

Vissa enzymer bryter ner bindningarna inuti kedjan, medan andra tar bort rester från dess ändar.

Sekvensen, den lokala strukturen, tillgängligheten och de omgivande kemiska grupperna kan påverka om den potentiellt känsliga platsen verkligen splittras.

Davidson och Hutton undersökte ett enzym kopplat till insulinproducerande celler. Den rensade preparaten avlägsnade de alkaliska resterna från substrat som härrörde från proinsulinsubstansen och i den testade metoden medförde det inte ytterligare nedbrytning av den mogna insulinet. [10]

Det visar det selektiv biologisk behandling, och inte en slumpmässig brytning av alla peptidhållningar.

Selektiv spaltning är av betydelse för biologin eftersom större prekursormolekyler kan bearbetas på specifika platser, vilket leder till att specifika mogna produkter bildas i stället för en slumpmässig nedbrytning.

Villkor spelar roll: två experimentella exempel

Kenley och Warne studerade rekombinant humant interleukin 11 under syftet stressiga förhållanden, inklusive högre temperatur och olika pH-värden.

I surt miljö identifierade de en splittring i Asp–Pro på en specifik plats. Resultaten visar sekvensberoende och förhållandebestämda nedbrytning, men de bör inte tolkas som en universell princip som beskriver beteendet hos alla proteiner under typiska biologiska förhållanden.[11]

I en annan studie observerades fragmentering av radioaktivt joderat intestinalt vasoaktivt peptid i en utspätt lösning med neutral pH. Relaterade, kortare fragment visade ingen mätbar nedbrytning under samma experimentella förhållanden, och tillsatser till lösningen påverkade resultatet [12].

Begge studierna visar varför stabiliteten hos peptidhållningar bör diskuteras i relation till en specifik molekyl, sekvens, miljö och experimentella förhållanden, Istället för att anta att en viss pH-nivå eller temperatur skulle ge samma resultat för varje peptid.

Varför är peptidbindningar biologiskt viktiga?

Peptidbindningar bevarar ordningen av aminosyrer som definierar peptidhållningen eller proteinet.

Deras geometri begränsar de möjliga rumsliga arrangemangen av kedjan, medan karboxylgrupperna och de kvävehaltiga grupperna som finns i peptidhjälpen deltar i molekylära interaktioner.

Reglerad syntes av peptidbindningar möjliggör syntesen av peptider och proteiner.

Den kontrollerade nedbrytningen av dessa bindningar är emellertid involverad i bearbetningen av prekursorerna, upptagningen, metabolismen av proteiner, reglerande banor och den slutliga nedbrytningen av molekylerna.

Denna samma grundläggande typ av kemiskt samband deltar alltså i flera nivåer av biologisk organisation.

Dess uppkomst fastställer kontinuiteten i sekvensen.

Dess elektroniska struktur påverkar skelettets geometri.

De kemiska grupper som finns i det deltar i molekylära interaktioner.

Dess selektiva nedbrytning gör att biologiska system kan bearbeta och eliminera proteiner och peptider.

Disse funktionerna kombinerar molekylär kemi med biologi. Bevisen kommer bland annat från beräkningar av elektronstruktur, strukturella mätningar, enzymatiska studier, kemisk syntes och experiment med kompletta biologiska system. Varje metod visar en annan del av mekanismen och bör inte användas för att dra slutsatser som går utöver den faktiskt undersökta processen. [2] [3] [10]

Vanliga frågor och svar

1. Är peptidbindningen kovalkynerisk?

Ja. Peptidbindning är en amidkovalent bindning mellan grupper som härrör från aminosyror. Kol- och azoflöden delar elektroner, vilket ger en kemisk kontinuitet i peptidskedjan. Fysikaliska studier av elektronstruktur undersöker hur detta elektrondelning påverkar den angränsande karboxylgruppens elektroner och hur den bidrar till de karakteristiska egenskaperna hos amidbindning. Begreppet „kovalent” betyder dock inte att bindningen inte kan brytas. Under lämpliga kemiska förhållanden eller med hjälp av enzymer kan den vara utsatt för hydrolys. Det viktigaste är att skilja på att peptidbindning kemiskt binder samman resterna till en enda molekyl och inte bara orsakar attraktion mellan separata molekyler eller fragment av samma molekyl. [1]

2. Varför har peptidbindning en partiell dubbelbindningskaraktär?

Den partiella karaktären hos dubbelbindningen beror på att den fria elektronparn från azoflödet interagerar med den angränsande elektroniska systemet i karboxylgruppen. På så sätt avlägsnas elektronens koncentration inom amidgruppen. Beräkningar har undersökt andelen av detta fenomen i peptidbindningskedjan. De resonansstrukturer som används för att förklara detta är alternativa sätt att presentera samma elektronisk struktur, och inte separata molekyler som byter plats med varandra. Värdena för de resonansfrekvenser som används för att förklara detta kan också variera beroende på den analysmetod som används. Den viktigaste strukturella konsekvensen är en minskning av omkretsen kring C–N-kopplingen jämfört med den typiska, fritt roterande enskilda bindningen. [1]

3. Vilka atomer bildar peptidhållning?

I en typisk peptidisk kedja binder peptidsammanhållningen kolatomet i karboxylgruppen på den ena resten till azotoatomet i den andra resten. Kolatomet förblir en del av karboxylgruppen och utgör inte en direkt koppling mellan de två aminosyraresterna. Elektroniska och strukturella studier analyserar dessa atomer som en del av den sammanhängande amidgruppen samtidigt som de skiljer dem åt genom sina separata bindningar. Vid identifieringen av typisk peptidisk sammanhållning i den strukturella formeln är det därför användbart att hitta en C–N-bindning som ligger direkt intill karboxylgruppen.[2]

4. Var finns peptidhållningen i proteinet?

Peptidbindningar finns i kedjan av varje protein och binder samman angränsande aminosyror. De skiljer sig från sidobindningar mellan sidokedjor och från interaktioner mellan separata kedjor. Kemisk syntes av BPTI visar denna skillnad genom att skilja strukturen från senare bildning av disärchonska broar. En fullständig tredimensionell struktur för ett protein kan innehålla många typer av konjugativa och icke-konjugativa bindningar, därför kräver identifiering av peptidbindningar spårning av aminosyrekedjan och inte räkning av alla linjer eller kopplingar som presenteras i en molekylmodell. [5]

5. Är varje amidbindning en peptidbindning?

Nej. Amidbindningar förekommer i många olika organiska föreningar, medan termen „peptidbindning” hänför sig till specifika bindningar som härrör från aminosyrorna i peptider och proteiner. Den typiska amidbindningen i skelettet är en av typerna av amidbindning. Bindningar med amid som använder en aminosyras sidorande kedja bör därför inte automatiskt räknas som vanliga skelettbindningar. Studien av peptidskemometri fokuserar på den definierade amidbindningsgruppen i skelettet och inte på att alla möjliga amider är kemiskt och strukturellt identiska. Den rätta beteckningen beror på de deltagande grupperna och deras position i molekylen. [2]

6. Hur många peptidbindningar finns det i tripeptidet?

En typisk öppen, icke-grenad tripeptid består av två peptidbindningar, eftersom tre resterna kräver två bindningar för att skapa en kontinuerlig, öppen kedja. Detta beror på den allmänna n-1-relationen för en typisk öppen kedja med n resterna. Detta beror på strukturen hos molekylen och inte på experimentella resultat eller information om dess biologiska funktion. Svaret kommer att vara annorlunda om ytterligare skelettbindningar stänger av molekylen i en ring. Bindningarna mellan sidokedjorna och andra konjugativa bindningar måste dock räknas separat. Innan man använder den allmänna regeln bör därför molekylets struktur fastställas.

7. Har cykliska peptider ytterligare peptidsammanhållning?

En head-to-tail-cyklisk peptid har ett extra skjelettbindningstorn jämfört med en liknande öppen kedja, eftersom ytterligare amidbindningar binder båda ändarna och stänger ringen. Andra cykliska peptider kan dock bilda en ring med hjälp av sidorande kedjor, därför gäller inte denna regel automatiskt för varje molekyl som betraktas som cyklisk. Studien av B1-kalat bekräftade ett specifikt fall av en cyklisk kedja som dessutom innehöll disyarsktåg. Att ringa kedjan och skapa bindningar mellan sidorande kedjor bör därför beskrivas separat vid beräkning av bindningar och presentation av molekylstrukturen. [6]

8. Är peptidbindningar alltid perfekt plana?

Nej. Peptidgrupperna är i stort sett plana, men mätbara avvikelser från den perfekta geometrin är möjliga. En studie som kombinerar kvantmekaniska beräkningar med analys av strukturella data för peptider och proteiner visade små deformationer relaterade till den lokala strukturen av skelettet. Dessa observationer kompletterar den förenklade handböckermodellen, men gör den inte oanvändbar. Planärhet förblir en viktig strukturell preferens som härrör från den elektroniska strukturen hos amidgruppen, men en noggrann strukturell analys bör ta hänsyn till lokala skillnader som är karakteristiska för den specifika molekylen. [2]

9. Kan proteinet krympa när rotationen kring peptidsammanhållningen är begränsad?

Ja. Beljmassan innehåller andra bindningar, runt vilka torsionsvinklar kan uppstå. Den begränsade rotationen kring amidbindningen C–N gör därför inte hela kedjan instabil. Strukturella analyser skiljer vinklarna för rotationen kring angränsande skelettbindningar från vinkeln kopplad till själva peptidsammanhållningen. Styrkaeffekter, lokala kemiska effekter och typen av angränsande resterna påverkar dessutom vilka arrangemang som är energimässigt och fysiskt tillgängliga. Därför är proteiner inte bara styva strängar eller kedjor av helt fritt roterande delar. Deras struktur härrör från en kombination av begränsade och relativt flexibla grader av frihet i skelettet. [2]

10. Vad är cis- och trans-peptidbindningar?

Begreppen cis och trans beskriver olika rumsliga arrangemang av grupper som finns på båda sidor av peptidsammanhållningen. I typiska proteinstrukturer dominerar trans-konfigurationen. Speciell uppmärksamhet kräver peptidsammanhållningsbindningar som är relaterade till prolin, eftersom cis-konfigurationen förekommer oftare i dessa fall än för många andra restkombinationer. I termiska NMR-studier av utvecklat kollagen har båda konfigurationerna upptäckts. Dessa resultat gäller dock en specifik proteinkomplex genom specifika experimentella förhållanden och bör inte tolkas som universella procentvärden för alla peptider och proteiner. Begreppen cis och trans beskriver peptidsammanhållningsgeometri, inte olika typer av kemiska bindningar. [9]

11. Under bildandet av ett peptidbindningsförhållande frigörs alltid vatten direkt?

Nej. Den välkända ekvationen som beskriver vattenutsläpp beskriver endast den sammanlagda kondensationsprocessen mellan fria funktionella grupper, men inte varje verklig mekanism för bildandet av peptidhållningar. Ribosomalt syntes använder aktiverade substrat som är kopplade till tRNA, och experimentella studier visar att substratets kemi deltar i katalysen. Den direkta reaktionens förlopp är alltså mer komplicerat än att helt enkelt avlägsna vatten från två fritt lösta aminosyror. Att skilja mellan den sammanlagda reaktionsbilagan och den verkliga biologiska mekanismen förhindrar att den användbara utbildningsekvationen förvandlas till en felaktig beskrivning av proteinsyntes. [3]

12. Skapar blandning av aminosyror med vatten uppkomsten av protein?

Nej. En blandning av fria aminosyror skapar inte automatiskt en bestämd proteinstruktur. Kontrollerad peptidbildning kräver lämplig kemi och även en organiserad syntesmaskinering i celler som kan styra ordningen av aminosyrorna och skapa bindningar. Experimenter kring nirobosomal peptidbildning har visat att en störning av en specifik katalytisk komponent kan förhindra bildningen av den undersökta peptidhartsformen. Resultaten gäller en specifik biosyntesmekanism, men de visar en bredare princip: endast när molekylära byggstenar finns tillgängliga räcker det inte. En definierad sekvens kräver kontrollerad bildning av molekylära bindningar. [7]

13. Är peptidbindning detsamma som vätebindning?

Nej. Peptidbindning är en kovalent bindning i peptidets skikt, medan vätebindning är en interaktion mellan den relevanta donorn och acceptorn av vatten. Kemiska grupper som finns i peptidets skikt kan delta i bildandet av vätebindningar utan att skapa ytterligare peptidbindningar. Forskningen med den formade dekapeptiden CLN025 analyserade vätebindningar och andra interaktioner som bidrar till att stabilisera dess struktur. Denna åtskillnad skiljer de bindningar åt som definierar den grundläggande kovalenta kedjans sekvens från interaktioner som hjälper den redan sammanbundna kedjan att organisera sig i tredimensionell rymd. [8]

14. Är disiarcyntjockt en typ av peptidbindning?

Nej. En disärskapsjon är en kovalent bindning mellan svavel och svavel, som vanligtvis uppstår mellan sidorande kedjor av cystein. En peptidbindning däremot är en amidbindning som binder grupper som härrör från aminosyrorna i peptidets skalle. Studien av BPTI-syntes behandlade skelettbyggandet och bildningen av disärskapsjoner som separata processer. Båda typerna av bindningar kan vara av betydelse för molekylstrukturen, men de binder andra atomer och deltar i andra kemiska reaktioner. Brutenheten i en disärskapsjon behöver inte bryta sönder peptidskeletten, medan avbrottet i en peptidbindning direkt ändrar kedjans sekvens. [5]

15. Skapar denaturering av proteinet peptidhållningsbanden?

Detta är inte nödvändigt. Denaturering innebär en störning av den typiska formade eller gruppbundna strukturen hos ett protein och enligt definitionen kräver den inte sönderdelning av peptidhållningsbanden. Enligt de tillämpliga förhållandena kan den kemiska nedbrytningen inträffa samtidigt med denatureringen, men de båda processerna bör inte automatiskt betraktas som samma sak. I studier av termiskt utvecklat kollagen har olika konfigurationer av dess peptidhållningsband fortfarande analyserats. Den termiskt utvecklade kedjan och den hydrolyserade kedjan är alltså olika molekylära tillstånd: den första gäller främst den tredimensionella organisationen, medan den andra handlar om förändringar i konformationer av kovalensbindningar. [9]

16. Börder det direkt till att fria aminosyror bildas vid hydrolys?

Inte alltid. Hydrolysen av en intern peptidbindning i en längre öppnad kedja leder vanligtvis till att två kortare peptidhjälpande strukturer bildas. Vidare reaktioner för att bryta ned strukturen krävs för att gradvis minska längden på dessa fragment och slutligen frigöra enskilda aminosyror. I experimentella studier har specifika fragmenter identifierats som bildas vid hydrolysen av peptidhjälpande bindningar, bland annat under studier av nedbrytning av interleukin 11 och av intestinalt vasoaktivt peptid. Typen av produkter beror på vilka delar som har hydrolyserats samt graden av avancerad hydrolytisk nedbrytning. Uttrycket „hydrolyserad” betyder alltså inte automatiskt att peptidet eller proteinet har fullständigt omvandlats till fria aminosyror. [11] [12]

17. Försvinner alla peptidbindningar med samma hastighet?

Nej. Den observerade hastigheten av avspaltning beror på peptidssekvensen, den lokala molekylära strukturen, bindningsmöjligheterna, angränsande kemiska grupper, lösningens sammansättning, temperatur, pH och närvaron av katalysatorer såsom proteolytiska enzymer. Studien av interleukin 11 och den vasoaktiva peptiden från tarmväggen visade en selektiv, beroende av omständigheterna uppkomna nedbrytning, men inte samma beteende för alla bindningar. Dessa experiment fastställer inte en universell halveringstid för andra peptider. Vetenskapligt motiverat är att peptids bindningsstabilitet ska bedömas med avseende på den specifika molekylen, miljön och reaktionen, och inte bara genom bindningsnamnet. [11] [12]

18. Vad skiljer peptidhållning från isopeptidhållning?

Typiskt peptidhållning i skelettet binder vanligtvis den huvudsakliga gruppen från karboxylgruppen till den andra restens huvudsakliga aminosubstansgrupp. Isopeptidhållning är också en amidbindning, men i denna deltar minst en funktionell grupp som ligger utanför det typiska skelettet, till exempel en lämplig grupp i aminosyras sidorande kedja. Båda typerna av bindningar bygger alltså på besläktad amidkemikalie, men de utgör andra platser i molekylstrukturen. En sådan skillnad är viktig eftersom enbart upptäckt av amidbindning inte är tillräckligt för att fastslå att det rör sig om en vanlig peptidhållning.

19. Varför är peptidbindningar viktiga för proteins struktur?

Peptidbindningar upprätthåller en ordnad kovalent sekvens av aminosyrekedjor samtidigt som de ålägger geometriska begränsningar på molekylets skelett. Deras partiella dubbelbindningskaraktär begränsar rotationen kring amidbindningen C–N och gynnar en ungefär platt geometri för peptidhärnan. Samtidigt kan karboxylgrupperna och N–H-grupperna i skelettet delta i bindningsmönster för vätebindningar som är viktiga för strukturer på högre nivåer. Peptidbindningar sammanbinder därför inte bara aminosyror — deras elektroniska och geometriska egenskaper hjälper till att fastslå de strukturella möjligheterna för hela kedjan. [1] [2]

20. Kan enzymer bryta ned peptidhållningar?

Ja. Proteaser och peptidaser kan katalysera hydrolys av peptidsammanhang, men de behöver inte kunna bryta ner alla bindningar utan att göra en särskild åtskillnad. Enkelte enzymer känner igen specifika sekvenser, strukturella miljöer eller positioner i peptidsammanhang. Strukturella studier av penicillopepsin analyserade hur asparaginsyra-proteasen organiserar substratet och vattnet under hydrolysen, medan Davidson och Hutton visade på selektiv bearbetning av proinsulinrelaterade substrat. Dessa exempel visar hur biologiska system på kontrollerad väg kan bryta ned specifika peptidsammanhang under bearbetning och nedbrytning av molekyler. [4] [10]

Begränsningar i tolkningen av studier om peptidhållning

När man går från grundläggande kemi kring peptidhållningar till slutsatser om verkliga peptider och proteiner är det viktigt att komma ihåg några begränsningar.

Först och främst är den idealiserade peptidhopen som presenteras i handböckerna en modell av ett typiskt strukturellt system. Reala molekylära strukturer kan visa mätbara avvikelser från den perfekta planheten och geometrin.[2]

För det andra, stabiliteten hos peptidsammanhållningen Det beror på sammanhanget. Resultaten från experiment som utförts vid högre temperaturer, med ovanligt pH-värde, lågt koncentrat eller i närvaro av särskilda katalysatorer får inte automatiskt användas för att förutsäga molekylens beteende under helt andra förhållanden. [11] [12]

För det tredje använder olika enzymer olika katalityka mekanismer. Bevis som beskriver hydrolys genom en asparaginsyra-proteas som inte betyder att alla proteaser bryter ned peptidhållningar på exakt samma sätt. [4]

Fjärde, peptidhållningar kan uppstå genom olika mekanismer. Translasjon i ribosomerna, biosyntes utanför ribosomerna och kemisk syntes i laboratoriet kan leda till bildandet av amidbindningar, även om de använder olika substrat och molekylär maskinvara. [3] [7]

Femte, strukturella förändringar i proteinet bör inte automatiskt tolkas som en uppdelning av peptidhållningsbanden. Denaturering, konformationsförändringar, cis–trans-övergångar, störningar i vätebindningar, minskning av disarsktioner och hydrolys av peptidhållningsband beskriver olika molekylära händelser.

Dessa skillnader är viktiga eftersom termen peptidbindning Den beskriver en specifik typ av koagulationsbundet samband. För att förstå vad som verkligen händer med ett peptid eller ett protein måste man fastslå vilka kemiska bindningar eller molekylära interaktioner som har förändrats.

Sammanfattning

Peptidbindningar är kovensiva amidbindningar som binder aminosyror till peptidhjärter och proteiner. Även om de ofta presenteras som C–N-bindningar i en återkommande del av skelettstrukturen –C(=O)–NH–, deras kemi är mer komplex än kemin hos en vanlig, fritt rörlig enskild bindning.

Elektronlokaliseringen inom amidgruppen ger kopplingen C–N en partiell dubbelbindningskaraktär, vilket begränsar dess rotation och främjar en ungefär platt geometri för peptidsammansättningen. Samtidigt möjliggör möjligheten att rotera kring angränsande skelettbindningar att peptidhållarna kan anta mycket varierande tredimensionella strukturer.[1][2]

Peptidbindningar förekommer i skelettet hos typiska peptider och proteiner, men de ska särskiljas från vätebindningar, disärtska länkar, joniska effekter, hydrofobisk effekt och specialiserade bindningar av sidorande kedjor, såsom isopeptidbindningar.

De kan uppstå som en följd av olika processer. Ribosomer bildar peptidbindningar under translering genom användning av aktiverade substrat som är kopplade till tRNA, och nonribosomal system använder specialiserad enzymatisk maskinvara. Laboratorieproduktion baseras däremot på kontrollerade kemiska bindningsreaktioner. [3] [7]

Det är lika viktigt att de bryts ned. Hydrolysen kan dela upp en peptidkedja i kortare fragment, och proteaser och peptidaser gör det möjligt för organismer att selektivt genomföra denna process. Forskning kring proteaser, proinsulins behandling, nedbrytning av interleukin 11 och den vasoaktiva tarmproteinet visar att nedbrytningen beror på molekylär kontext och experimentella förhållanden.[4][10][11][12]

Den viktigaste principen är alltså enkel:

Peptidbindningar ger en koherens av aminosyrakedjorna genom konjugation, medan deras elektroniska struktur, kontrollerad bildning och selektiv avspänning kombinerar grundläggande kemi med biologi av peptider och proteiner.

Varning

Artikelns syfte är endast utbildningsrelaterat och vetenskapligt informativt. Den förklarar kemin bakom peptidbindningar, deras molekylära struktur, bildning, hydrolys samt exempel som härrör från publicerade studier. Den utgör inte medicinsk rådgivning, rekommendationer om behandling, laboratorieinstruktioner, produktrekommendationer eller rådgivning om användning av någon peptid eller protein. Resultaten av beräknings-, strukturella, biokemiska och andra djurstudier samt andra experiment bör tolkas inom ramen för de särskilda förhållanden och begränsningar som gäller för respektive studie.

Referenser

1. Fedorov, D. G. (2024). Peptidbindningen: Resonans ökar bindningsordningen och komplicerar fragmentering. ChemPhysChem, 25(14), Artikel e202400170. https://doi.org/10.1002/cphc.202400170
2. Improta, R., Vitagliano, L., & Esposito, L. (2011). Peptidbindningsförvrängningar på grund av planäritet: Nya insikter från kvantmekaniska beräkningar och peptids/proteinkristallstrukturer. PLOS ONE, 6(9), Artikel e24533. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0024533
3. Weinger, J. S., Parnell, K. M., Dorner, S., Green, R., & Strobel, S. A. (2004). Substratstött katalys av peptidbindning genom ribosomen. Nature Structural & Molecular Biology, 11(11), 1101–1106. https://doi.org/10.1038/nsmb841
4. James, M. N., & Sielecki, A. R. (1985). Stereokemisk analys av peptidbindningshydrolys som katalyseras av aspartproteasen penicillopepsin. Biokemi, 24(14), 3701–3713. https://doi.org/10.1021/bi00335a045
5. Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). Solid-phase syntes av bovin pankreatisk trypsininhibitor (BPTI) och två analoger. En kemisk metod för att utvärdera rollen av disulfidbroar i proteinspackning och stabilitet. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. PubMed-post
6. Saether, O., Craik, D. J., Campbell, I. D., Sletten, K., Juul, J., & Norman, D. G. (1995). Utlärning av den primära och tredimensionella strukturen hos det uterotontiska polypeptidet kalata B1. Biokemi, 34(13), 4147–4158. https://doi.org/10.1021/bi00013a002
7. Stachelhaus, T., Mootz, H. D., Bergendahl, V., & Marahiel, M. A. (1998). Peptidbindningstillväxt vid nonribosomal peptidbiosyntes. Katalytisk roll för kondensationsdomänen. Journal of Biological Chemistry, 273(35), 22773–22781. https://doi.org/10.1074/jbc.273.35.22773
8. Hatfield, M. P. D., Murphy, R. F., & Lovas, S. (2010). Spektralegenskaper för VCD:et hos beta-hårknutande miniproteinet CLN025 i olika lösningsmedel. Biopolymerer, 93(5), 442–450. https://doi.org/10.1002/bip.21356
9. Sarkar, S. K., Young, P. E., Sullivan, C. E., & Torchia, D. A. (1984). Detektering av cis- och trans-X-Pro-peptidbindningar i proteiner med 13C-NMR: tillämpning på kollagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 81(15), 4800–4803. https://doi.org/10.1073/pnas.81.15.4800
10. Davidson, H. W., & Hutton, J. C. (1987). Insulinförening-granulära carboxypeptidase H. Reningsprocessen och bevisning för dess delaktighet i proinsulinförädlingen. Biokemisk tidskrift, 245(2), 575–582. https://doi.org/10.1042/bj2450575
11. Kenley, R. A., & Warne, N. W. (1994). Syra-katalyserad hydrolys av peptidsammanhang i rekombinant humant interleukin 11. Farmaceutisk forskning, 11(1), 72–76. https://doi.org/10.1023/a:1018945727640
12. Mody, R., Tramontano, A., & Paul, S. (1994). Spontan hydrolys av vasoaktivt tarmpeptid i neutralt vatten. International Journal of Peptide and Protein Research, 44(5), 441–447. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1994.tb00180.x