Peptidų sintezė: kietosios fazės metodas, tirpalo metodas ir gamybos metodai

Peptidų sintezė – tai kontroliuojamas procesas, kurio metu susidaro nustatytos sekos aminorūgščių grandinės. Cheminės sintezės metu pasirinktos aminorūgštys sujungiamos naudojant peptidinių junginių, tuo pačiu kontroliuojant kitas šiose molekulėse esančias reaktyvias grupes. Taigi tikslas nėra vien tik sujungti aminorūgštis, bet gauti konkrečią molekulinę struktūrą su nustatyta seka, stereochemiija, grandinės galų sandara ir – jei reikia – papildomomis struktūrinėmis savybėmis.

Pagrindiniai metodai apima peptidų sintezę kietojoje fazėje (SPPS), klasikinę sintezę tirpale ir naujesnius peptidų sintezės skystojoje fazėje (LPPS) metodus, kuriuose naudojami tirpūs nešikliai arba molekuliniai žymekliai. Mokslinių tyrimų laboratorijos ir gamybos įmonės taip pat gali derinti įvairius metodus: atskirai paruošti trumpesnius fragmentus ir vėliau juos sujungti arba taikyti biologinę ekspresiją, jei ji yra tinkamesnė konkrečiai sekai.

Palyginus cheminę sintezę su bakterine 20–40 aminorūgščių likučių turinčių polipeptidų ekspresija, paaiškėja svarbus principas: praktinis gamybos metodo pasirinkimas priklauso nuo konkrečios molekulės, jos sekos, polinkio į agregaciją, reikalingų modifikacijų, gamybos masto ir analitinių reikalavimų. [1]

Norimos aminorūgščių sekos gavimas yra tik vienas iš peptido gamybos etapų.

Visas procesas gali apimti:

sekvencijų projektavimas → statybinių blokų paruošimas → funkcinių grupių apsaugojimas → sujungimas → apsauginių grupių pašalinimas → grandinės surinkimas → fragmentų atskyrimas arba sujungimas → galutinis struktūros formavimas → valymas → tapatybės patvirtinimas → teršalų analizėteršalų → sudėties nustatymas → galutinė charakteristika.

Kai kurių peptidų atveju taip pat reikalingi papildomi etapai, tokie kaip ciklizacija, disulfidinių tiltelių susidarymas, sulankstymas, konjugacija ar kiti cheminiai modifikavimai.

Dėl šios priežasties teisingas grandinės sudėjimas savaime nereiškia, kad galutinis produktas turi tinkamą tapatybę, grynumą, stereochemines savybes, konformaciją, stabilumą ar kitas reikiamas savybes.

Kas yra peptidų sintezė?

Tam tikros aminorūgščių sekos sukūrimas

Peptidas susideda iš aminorūgščių likučių, sujungtų peptidiniais ryšiais.

Peptido sintezės tikslas – suformuoti šias jungtis iš anksto nustatyta tvarka, dažnai kartu kontroliuojant:

• aminorūgščių rūšys;
• aminorūgščių išdėstymo seka;
• stereochemijos;
• N pabaigos struktūros;
• C pabaigos struktūros;
• šoninių grandinių modifikavimas;
• disulfidinių tiltelių išdėstymo;
• ciklizacija;
• kitos būtinos struktūrinės savybės.

Sekvencija yra itin svarbi, nes identiška aminorūgščių sudėtis gali lemti skirtingų molekulių susidarymą, jei aminorūgštys išsidėsto kita tvarka.

Tvirtinimas, kad tam tikra molekulė yra „iš penkių aminorūgščių sudarytas peptidas”, suteikia labai mažai informacijos apie jos tikrąją struktūrą. Norint teisingai apibūdinti molekulę, reikia žinoti aminorūgščių rūšį, jų seką, stereochemines savybes, galines grupes ir galimas papildomas modifikacijas.

Taigi du peptidai gali turėti visiškai tą pačią aminorūgščių sudėtį, tačiau vis tiek būti skirtingų molekulių struktūrų.

Papildomi skirtumai gali atsirasti dėl grandinės galų modifikacijų, disulfidinių tiltelių buvimo, ciklinio skeleto, šoninių grandinių pokyčių arba skirtingos stereocheminės konfigūracijos.

Cheminėje peptidų sintezėje paprastai naudojami aminorūgštys, kurių reaktyviosios grupės buvo selektyviai apsaugotos.

Laikinės apsauginės grupės leidžia suformuoti konkretų pageidaujamą cheminį ryšį, tuo pačiu apribojant konkuruojančias reakcijas kitose molekulės vietose.

Tolimesniuose numatytuose sintezės etapuose šios grupės pašalinamos arba pakeičiamos.

Kontroliuojama reakcija vietoj savaiminio jungimosi

Pagrindiniuose cheminiuose aprašymuose peptidinės jungties susidarymas dažnai pateikiamas kaip kondensacijos reakcija, kurios metu dvi aminorūgštys sujungiasi, išsiskiriant vienam vandens molekuliui.

Tokia lygtis apibūdina bendrą reakcijos balansą.

Tačiau nereikėtų jo tapatinti su tuo, kaip praktikoje atliekama kontroliuojama peptidų sintezė.

Vien tik sumaišius laisvąsias amino rūgštis nebūtų galima patikimai nustatyti:

• kuri amino grupė turi reaguoti;
• kuri karboksilinė grupė turi reaguoti;
• kurią aminorūgštį reikia įrašyti pirmąją;
• kuris turi būti antras;
• ar pradės reaguoti šoninės grandinės;
• ar bus išlaikyta stereochemija;
• ar neatsiras daug nepageidaujamų produktų.

Taigi praktinėje cheminėje sintezėje taikomos kontroliuojamos funkcinių grupių aktyvavimo ir apsaugos strategijos.

Nuo karboksilinės grupės kilusi grupė paprastai aktyvuojama taip, kad galėtų veiksmingai reaguoti su pasirinkta aminine grupe. Apsauginės grupės, reakcijų eiga, nešiklio cheminė sudėtis, jungiamosios medžiagos, tirpiklio aplinka ir izoliavimo metodai kartu padeda nukreipti reakciją link norimo produkto.

Taigi, norint sėkmingai sintezuoti peptidą, reikia kontroliuoti tiek chemines reakcijas, kurios turi vykti, tiek tas, kurių reikia išvengti.

Geras pavyzdys yra aspartamido susidarymas.

Mokslininkai sukūrė alternatyvų karboksilinės grupės apsaugos metodą, kurio tikslas buvo sumažinti šią problematišką šalutinę reakciją peptido sintezės metu. [2]

Tyrimas atskleidžia platesnį peptidų chemijos principą: nepageidaujamų molekulių pokyčių prevencija gali būti ne mažiau svarbi nei tinkamo peptidinio ryšio susidarymas.

Kada peptidą galima laikyti paruoštu?

Linijinio peptido karkaso sukūrimo pabaiga ne visada reiškia visos sintezės pabaigą.

Priklausomai nuo tikslinės molekulės, po grandinės surinkimo gali prireikti papildomų etapų.

Tai gali apimti:

• visiškas apsauginių grupių pašalinimas;
• peptido atskyrimas nuo kietojo nešiklio;
• laikinų žymių pašalinimas;
• ciklizaciją;
• oksidacija;
• disulfidinių tiltelių susidarymas;
• sulankstymas;
• konjugaciją;
• grandinės galų modifikavimą;
• valymas;
• analitinę charakteristiką.

Kai kuriems peptidams, susidarius grandinei, reikia palyginti nedaug papildomų struktūrinių pokyčių.

Kitais atvejais lemiamą reikšmę turi vėlesni etapai.

Geras pavyzdys yra galvijų kasos tripsino inhibitorių (BPTI) sintezė. Mokslininkai suformavo linijinę seką, išgrynino medžiagą ir vėliau gavo banguotą struktūrą, kurioje yra disulfidinių tiltelių. Remiantis tyrime pateiktomis analizėmis ir funkciniais palyginimais, galutinė medžiaga su natūralia seka atitiko natūralų baltymą pagal tiriamus parametrus. [3]

Šis pavyzdys iliustruoja skirtumą tarp peptidinio karkaso susidarymo ir visiškai apibūdintos galutinės molekulinės formos gavimo.

Metodas, leidžiantis gauti teisingą linijinę seką, automatiškai nepatvirtina:

• teisingo sulankstymo;
• tinkamo disulfidinių tiltelių išdėstymo;
• biologinio aktyvumo;
• stabilumo;
• teršalų profilis;
• tinkamumas konkrečiam naudojimui.

Kiekvienam iš šių klausimų reikia atskirų įrodymų.

Cheminė sintezė, biologinė ekspresija ir kombinuoti metodai

Cheminėje peptidų sintezėje iš anksto paruošti molekuliniai blokai sujungiami kontroliuojamose laboratorinėse reakcijose.

Tuo tarpu biologinė ekspresija pasitelkia ląstelių mechanizmus, kad susidarytų užkoduota aminorūgščių seka. Vėliau medžiaga turi būti išgauta, išvalyta ir, jei reikia, toliau apdorota.

Abu metodai gali leisti gauti peptidus arba polipeptidus, tačiau jie susiję su skirtingomis galimybėmis ir apribojimais.

Cheminė sintezė gali būti ypač naudinga, kai reikia:

• pasirinktos nestandartinės aminorūgštys;
• cheminiai pakeitimai tam tikrose vietose;
• tam tikros grandinės galų struktūros;
• izotopiniai žymekliai;
• peptidinio karkaso modifikacijos;
• kitos požymiai, kuriuos sunku gauti naudojant įprastą biologinę ekspresiją.

Biologinė ekspresija gali būti patraukli, jei naudojamos atitinkamos ilgesnės sekos arba tam tikros žymėjimo strategijos, tačiau ji neišsprendžia problemų, kylančių vėlesniuose gamybos etapuose.

Be to, reikia atsižvelgti į medžiagos atgavimą, sulankstymą, perdirbimą, iš šeimininko organizmo kilusius teršalus, valymą ir analitines savybes.

Taigi nė vienas iš šių metodų nėra visuotinai geriausias.

Lyginant polipeptidus, sudarytus iš 20–40 aminorūgščių likučių, tiek sekvencijos ilgis, tiek jos polinkis į agregaciją turėjo įtakos sintezės kietojoje fazėje ir bakterinėje ekspresijoje rezultatams. [1]

Šios išvados patvirtina požiūrį, pagal kurį gamybos metodas parenkamas atsižvelgiant į konkrečią molekulę.

Istoriniai duomenys apie našumą, sąnaudas, įrangą ir gamybos trukmę neturėtų būti laikomi visuotinai taikomomis šiuolaikinėmis vertėmis, nes technologijos, reagentai, automatizavimas, valymo metodai ir gamybos ekonomika kinta kartu su technologijų plėtra.

Peptidų sintezė kietosios fazės metodu

Auganti grandinė yra prijungta prie netirpaus nešiklio

Atliekant peptidų sintezę kietojoje fazėje (SPPS), auganti peptidinė grandinė per vėlesnius sintezės ciklus lieka prijungta prie netirpaus nešiklio.

Dažniausiai kaip nešiklis naudojama funkcionalizuota polimerinė derva.

Jungiklis, kitaip tariant, linkeris, jungia peptidą su nešikliu ir, be kita ko, daro įtaką tam, kaip vėliau išsiskirs paruoštas grandinėlis, bei kokios rūšies galinė grupė susidarys.

Vienas iš pagrindinių praktinių SPPS privalumų – lengvesnis medžiagos atskyrimas.

Pasibaigus tam tikram reakcijos etapui, tirpūs reagentai ir daugelis tirpių šalutinių produktų gali būti pašalinti plovimo būdu, o susidarantis peptidas lieka prisijungęs prie kietosios fazės.

Dėl to nereikia po kiekvienos naujos aminorūgšties pridėjimo izoliuoti ir gryninti susidarančio peptido kaip atskiro laisvo junginio.

Tačiau šis patogumas gali sukelti rimtą nesusipratimą.

Dervos praplovimas nereiškia, kad visi netinkami peptidai buvo pašalinti.

Jei prie dervos pritvirtinta grandinė nereaguos per vieną sujungimo etapą, ji gali likti ant nešiklio.

Vėlesniuose cikluose jis gali vėl reaguoti ir toliau pailgėti.

Dėl to gali susidaryti delecijos seka, t. y. molekulė, kuri nuo tikslinio peptido skiriasi tuo, kad jai trūksta vieno ar daugiau aminorūgščių likučių.

Panašiai, chemiškai modifikuotos arba nevisiškai deaktyvuotos grandinės, susijusios su derva, gali dalyvauti tolesniuose sintezės etapuose.

Taigi SPPS palengvina tirpių medžiagų atskyrimą nuo su derva susijusios medžiagos.

Tačiau tai negarantuoja idealaus sekų atitikimo.

Pasikartojantis saugiklio atjungimo ir įjungimo ciklas

Tipinė SPPS sintezė etapais apima trijų pagrindinių operacijų kartojimą:

atidarymas → sujungimas → plovimas.

Pirmiausia atskleidžiama reaktyvi amino grupė, esanti augančios grandinės gale.

Tada prie grandinės prisijungia dar vienas apsaugotas aminorūgštis.

Prieš pradedant kitą ciklą, pašalinami tirpūs reagentai, amino rūgšties perteklius ir daugelis reakcijos produktų.

Kartojant šį procesą, peptidas sudaromas po vieną aminorūgšties likutį.

Klasikinėje SPPS technologijoje C-galo liekana paprastai pirmiausia prijungiama prie nešiklio, o po to grandinė pailginama N-galo link.

Tai skiriasi nuo įprastos ribosominės baltymų sintezės, kurios metu aminorūgštys viena po kitos jungiamos prie augančios grandinės C-galo.

Tačiau galutinė aminorūgščių seka gali būti identiška, nors sintezės kryptis ir cheminė sudėtis skiriasi.

Terminas „ciklas” neturėtų būti suprantamas kaip vienas universalus reakcijos sąlygų rinkinys, tinkamas kiekvienam likučiui ir kiekvienai sekai.

Reakcijos eiga gali priklausyti nuo:

• apsaugos grupių strategijos;
• aminorūgšties rūšis;
• erdvinių sąlygų aplink reakcijos vietą;
• dervos rūšis;
• linkerio;
• grandinės ilgis;
• agregacijos;
• tirpiklio;
• sąveikos chemija;
• augančio peptido struktūrinio išlikimo.

Reakcija, kuri sintezės pradžioje vyksta lengvai, vėlesniame etape gali tapti žymiai sudėtingesnė.

Todėl proceso stebėjimas išlieka svarbus net ir labai automatizuotose sistemose.

Kodėl svarbios dervos savybės?

Fiksuotas laikiklis nėra tik pasyvus tvirtinimo elementas.

Jo fizinės ir cheminės savybės gali tiesiogiai paveikti reakcijos eigą.

Vienas iš svarbių parametrų yra išbrinkimas.

Jei derva tinkamai išbrinksta pasirinktame tirpiklio tirpale, reagentai gali lengviau pasiekti reaktyvias vietas, esančias visoje polimero struktūroje.

Nepakankamas išbrinkimas arba dervos struktūros pokyčiai gali apriboti šį prieigą.

Taip pat gali būti svarbūs:

• augalų tankumas;
• polimero struktūra;
• linkerio struktūra;
• suderinamumas su tirpikliais;
• mechaninis stabilumas;
• poringumas;
• difuzijos savybės;
• sąveikos tarp augančių peptidinių grandinių.

Didėjant peptido ilgiui, atskiri grandynai taip pat gali sąveikauti tarpusavyje.

Agregacija ant dervos gali apriboti prieigą prie reaktyvių vietų ir sukelti neišsamų susiejimą arba neišsamų apsaugos pašalinimą.

Tai reiškia, kad seka, kuri sintezės pradžioje veikia tinkamai, gali tapti vis sudėtingesnė, ilgėjant grandinei.

Mokslininkai sukūrė srautinį reaktorių su kintamu užpildu, kuris leido stebėti dervos išbrinkimą remiantis slėgio matavimais. [4]

Tyrimas buvo skirtas agregacijai ant dervos ir neišbaigtam ryšių susidarymui kaip procesinėms problemoms, kurias kitomis sąlygomis gali būti sunku tiesiogiai pastebėti sintezės metu.

Tai rodo, kad nešiklio fizinių savybių stebėjimas gali suteikti informacijos, kuri apima ne tik pridėtų reagentų registravimą.

Kam naudojama „Wanga“ derva?

Wang tipo jungčių chemija plačiai naudojama SPPS, kai po peptido atskyrimo pageidaujama, kad C-galas būtų karboksirūgšties pavidalo.

Peptidas yra prijungtas per esterinį ryšį, kurį vėliau galima suskaidyti tinkamomis sąlygomis.

Kitos jungiklių sistemos gali būti pasirenkamos tuomet, kai reikalinga kitokia C-galo struktūra, pavyzdžiui, amidas.

Verta atskirti jungiklio cheminę sudėtį nuo viso fizinio nešiklio.

Susijusios „Wang“ tipo jungtys gali būti įterpiamos į įvairias polimerines struktūras.

Tokios medžiagos nebūtinai turi būti identiškos:

• pūtimo savybės;
• talpos;
• suderinamumas su tirpikliais;
• mechaninės savybės;
• elgesys reakcijos metu.

Tyrimai, kuriuose buvo naudojami „peptidyl-Wang-TentaGel“ nešikliai, parodė, kad tai yra specializuotas alternatyvus metodas peptidų hidrazidų, kurie yra naudingi tarpini produktai peptidų chemijoje, gavimui. [5]

Tai nereiškia, kad standartinis atskyrimas iš Wango dervos paprastai lemia peptidų hidrazidų susidarymą.

Tačiau tai iliustruoja svarbų principą:

nešiklis + jungiklis + reakcijos sąlygos + atskyrimo chemija kartu lemia gaunamą produktą.

SPPS sintezė periodinėje ir srautinėje sistemose

SPPS procesą galima vykdyti tradiciniuose periodiniuose indukuose arba sistemose, kuriose reagentai teka per reaktorių, kuriame yra nuolatinis nešiklis.

Srautinės sistemos gali užtikrinti greitą reagentų keitimą ir tikslesnę cheminės aplinkos, kurioje yra derva, kontrolę.

2014 m. tyrime buvo pristatyta greita peptidų sintezė srautinėje sistemoje su nuolatiniu stebėjimu, ir ši technologija buvo pritaikyta keliems peptidams bei vienam mažam baltymui. [6]

Vėlesniame automatizuotame tyrime buvo aprašytas žymiai spartesnis grandinių susidarymas, o tiriamų pavyzdžių atveju gauto žaliavinio produkto grynumas ir izoliavimo efektyvumas buvo palyginami su klasine periodine sinteze. [7]

Šie tyrimai rodo konkrečių sistemų galimybes tam tikromis sąlygomis.

Tačiau tai neįrodo, kad kiekvieną peptidą galima pagaminti vienodai greitai ir užtikrinant tokią pačią kokybę.

Peptido gamybai reikalingas laikas apima kur kas daugiau nei vien tik grandinės surinkimą.

Visas procesas gali apimti:

• reagentų paruošimas;
• dervos paruošimas;
• sąveika;
• atsargiklio atjungimas;
• plovimas;
• atsiskyrimas;
• produkto apdorojimą;
• valymas;
• tirpiklių pašalinimas;
• galutinis struktūros formavimas;
• analitiniai tyrimai;
• dokumentaciją.

Taigi greitas jungčių formavimas yra tik vienas iš bendro gamybos efektyvumo elementų.

Sintezė skystoje fazėje

Ką reiškia šis terminas?

Terminas „peptidų sintezė skystoje fazėje” gali būti vartojamas keliomis reikšmėmis.

Plačiąja prasme tai gali tiesiog reikšti peptido sintezę, vykdomą tirpale.

Tačiau specializuotoje literatūroje dažnai skiriamos šios sąvokos:

1. klasikinę peptidų sintezę tirpale;
2. peptidų sintezė kietojoje fazėje;
3. naujausi LPPS metodai, kuriuose auganti grandinė turi tirpų žymeklį arba nešiklį.

Šis skirtumas yra svarbus, nes dėl jo keičiasi produkto rūšiavimo ir perdirbimo būdas.

Laisvai tirpstantis, apsaugotas peptidų pusgaminys gali reikalauti izoliavimo, pasinaudojant jo pačio fizinėmis ir cheminėmis savybėmis.

Jei pusgaminys yra pažymėtas, žymeklis gali būti suprojektuotas taip, kad palengvintų nusodinimą, ekstrahavimą, sulaikymą ant membranos ar kitokį atskyrimo būdą.

LPPS apžvalgoje aiškiai išskiriamos klasikinė sintezė tirpale, SPPS ir metodai, kuriuose naudojami tirpūs žymekliai. [8]

Šis leidinys padeda susisteminti terminologiją ir metodiką.

Tačiau tai neturėtų būti vertinama kaip pavienis eksperimentas, įrodantis, kad vienas iš metodų yra geriausias kiekvienam peptidui.

Klasikinė peptidų sintezė tirpale

Klasikinėje sintezėje tirpale esančios apsaugotos aminorūgštys, peptidų tarpini produktai ar fragmentai lieka ištirpę reakcijos terpėje, o ne kovalentiškai prisijungę prie netirpios dervos.

Pasibaigus reakcijai, atitinkamas tarpinis produktas gali būti išskirtas, išgrynintas ir, jei reikia, ištirtas prieš pradedant kitą etapą.

Tai gali duoti tam tikrą naudą.

Tyrėjai gali:

• apibūdinti atskirus pusgaminius;
• pasirinkti konkrečiam tarpiniam produktui tinkamą valymo metodą;
• optimizuoti atskirus procesus;
• savarankiškai ruošti ištraukas;
• pakeisti sintezės maršrutą, kai tam tikras tarpinis produktas kelia problemų.

Tačiau sintezė tirpale taip pat gali būti susijusi su dideliais sunkumais.

Ilgėjant grandinei, peptidai gali:

• tampa sunkiai tirpios;
• apibendrinti;
• būti sunkiai kristalizuojami;
• sukurti labai panašius teršalus;
• būti sunku atskirti;
• reikalauja daugkartinės izoliacijos;
• sukelti medžiagos nuostolius tolesniuose apdirbimo etapuose.

Taigi sintezė tirpale nėra savaime paprastesnė ar lengviau pritaikoma didesniam mastui nei SPPS.

Jos tinkamumas priklauso nuo konkrečios sekos, tarpinių produktų stabilumo, tirpumo, sintezės proceso trukmės, elgsenos valymo metu ir tolesnių izoliavimo etapų efektyvumo.

LPPS žymėjimo strategijų plėtra iš dalies kyla iš pastangų išspręsti būtent šias su medžiagos atskyrimu ir tvarkymu susijusias problemas. [8]

Tirpūs žymekliai sujungia reakcijų projektavimą su atskyrimo projektavimu

Žymėtame LPPS augančiame peptide yra laikinas molekulinis ryšys, suprojektuotas taip, kad paveiktų jo fizines savybes.

Žymeklis gali užtikrinti pakankamą peptido tirpumą reakcijos metu, o vėliau palengvinti jo selektyvų išgavimą.

Priklausomai nuo technologijos, atskyrimui gali būti naudojami:

• nusėdimas;
• ekstrahavimą;
• sulaikymas ant membranos;
• fazinis elgesys;
• kitos savybės, susijusios su žymeklio buvimu.

Vienoje iš eksperimentinių strategijų buvo panaudota ilgos grandinės apsauginė grupė C-gale, siekiant pagaminti peptidinius amidus.

Pakartotiniai reakcijų ir nusodinimo etapai leido mokslininkams pagaminti hidrofobinį peptidą, kurį, kaip jie nurodė savo palyginime, buvo sunku tinkamai gauti taikant SPPS metodą. [9]

Tai rodo, kad ši konkreti strategija yra tinkama nagrinėjamai sekai.

Tačiau tai neįrodo, kad žymėta sintezė turi visuotinį pranašumą.

Žymė tampa gamybos proceso dalimi ir kelia savus klausimus:

• Kaip veiksmingai jis prijungiamas?
• Ar tai keičia reakcijos eigą?
• Kaip patikimai galima susigrąžinti pažymėtą pusgaminį?
• Ar tai sukelia naujų teršalų susidarymą?
• Kaip jis pašalinamas?
• Ar galima patvirtinti, kad viskas buvo pašalinta?
• Kokie analitiniai metodai patvirtina, kad jo nėra galutiniame produkte?

Todėl tirpūs žymekliai turėtų būti laikomi funkciniais proceso projektavimo elementais, o ne vien tik paprastomis etiketėmis.

Pagrindinių metodų palyginimas

Šiame palyginime pateikiami bendrieji atskirų metodų veikimo principai.

Nenurodoma, kuri iš jų užtikrins geriausią našumą, grynumą, kainą, aplinkos tvarumą ar mastelio keitimo galimybes konkrečiai sekai.

Šie parametrai turi būti vertinami atsižvelgiant į konkrečią molekulę ir konkretų gamybos procesą. [4] [8] [9]

Fragmentų sujungimas ir hibridinė gamyba

Peptidas ne visada turi būti sintezuojamas vienu nepertraukiamu procesu, kurio metu pridedami vienas po kito aminorūgščių likučiai.

Alternatyvi strategija – atskirai paruošti trumpesnius peptidų fragmentus, o vėliau juos sujungti.

Pavyzdžiui, hibridiniame procese gali būti naudojama SPPS technologija atskiriems fragmentams gauti, o jų sujungimui – tirpalo chemija.

Fragmentinės strategijos gali sumažinti kai kurias problemas, susijusias su labai ilga etapine sinteze.

Tačiau jos kelia naujų iššūkių, pavyzdžiui:

• tinkamos jungties vietos pasirinkimas;
• fragmentų tirpumas;
• jungties vietos aktyvinimas;
• chemoselektyvumas;
• stereocheminio struktūros išsaugojimas;
• šalutiniai poveikiai;
• fragmentų valymas;
• valymas po jų sujungimo.

Svarbus kontroliuojamo fragmentų sujungimo pavyzdys yra natūrali cheminė ligacija.

Klasikinėje versijoje peptidinis tioesteris reaguoja su kitu peptidu, kurio N-gale yra cisteinas. Vėliau vykstantis pergrupavimas lemia tinkamo ryšio susidarymą peptido grandinėje ligacijos vietoje.

Pirmieji tyrimai parodė, kad po ligacijos ir sulankstymo galima gauti baltymą, kuriame yra disulfidinių tiltelių. [10]

Tai patvirtina šios fragmentų sujungimo strategijos svarbą.

Tačiau tai nereiškia, kad bet kurie du nemodifikuoti peptidų fragmentai gali savaime susijungti.

Sujungimai ir apsauginės grupės

Sujungimas sukuria numatytą ryšį

Sujungimas – tai reakcijos etapas, kurio metu tarp pasirinktų molekulių susidaro nauja peptidinė jungtis.

Paprastai karboksilinės grupės kilusi grupė yra aktyvuojama taip, kad galėtų veiksmingai reaguoti su atitinkama aminine grupe.

Aktyvacijos cheminė sudėtis turi atitikti:

• augančia seka;
• laikinomis apsaugos grupėmis;
• šoninių grandinių apsauga;
• stereochemija;
• nešikliu arba žymekliu;
• tirpiklio terpėje;
• kitomis funkcinėmis grupėmis, esančiomis molekulėje.

Veiksmingas jungimas yra ypač svarbus etapinėje sintezėje, nes neišbaigta reakcija gali lemti delecijų sekų susidarymą.

Jei vienas aminorūgšties prijungimo etapas nepavyksta daliai augančių grandinių, tokios grandinės gali likti sistemoje ir dalyvauti tolesniuose cikluose.

Dėl to gali susidaryti molekulės, labai panašios į tikslinį peptidą, tačiau neturinčios vieno likučio.

Taigi net ir nedideli neefektyvumai gali kauptis per daugelį sintezės etapų.

Paprastas matematinis pavyzdys gerai iliustruoja šią problemą.

Jeigu kiekvienas iš 50 nepriklausomų sintezės etapų turėtų 99% sėkmės tikimybę, dalelių, kurių atveju visi etapai baigtųsi sėkmingai, procentinė dalis sudarytų:

0,99^50 ≈ 0,605

t. y. apie 61%.

Tai yra tik matematinis pavyzdys.

Tai nėra tikrojo grynumo ar 50 likučių turinčio peptido sintezės našumo prognozė.

Faktinė gamyba apima:

• skirtingi sujungimo našumai atskiruose padėtyse;
• atsarginių saugiklių išjungimo etapai;
• šalutiniai poveikiai;
• priklausantys nuo sunkumo sekos;
• pakartotinio sujungimo strategijos;
• nuostoliai atskyrimo metu;
• nuostoliai valymo metu;
• kiti proceso kintamieji.

Šis skaičiavimas tik parodo, kodėl net ir iš pažiūros nedidelis vieno etapo neefektyvumas gali tapti labai svarbus daugiaetapėje sintezėje.

Apsaugos grupės kontroliuoja įvykio vietą

Amino rūgštis gali turėti keletą chemiškai reaktyvių grupių.

Jei nebūtų atliekama selektyvi kontrolė, jungimosi reakcijos galėtų vykti nepageidaujamose vietose.

Apsauginės grupės laikinai blokuoja pasirinktas reaktyvias vietas.

Amininė grupė, naudojama grandinei pailginti, paprastai turi būti laikinai apsaugota, o reaktyviosios šoninės grandinės gali reikalauti apsaugos, kuri išliktų per daugelį sintezės ciklų.

Ryšys su nešikliu taip pat turi išlikti per visus šiuos etapus iki numatyto atsiskyrimo momento.

Taigi apsauginių grupių pasirinkimas daro įtaką visai sintezės strategijai.

Reikia atsižvelgti į:

• jų įvedimo būdas;
• stabilumas;
• pašalinimo būdas;
• suderinamumas su kitomis apsauginėmis grupėmis;
• suderinamumas su laikmena;
• šalutiniai poveikiai;
• konkrečios sekos poveikis;
• galutinės draudimo panaikinimo sąlygos.

Tyrimai, kuriuose buvo naudojama cianosulfurilidu pagrįsta apsauga, buvo susiję su aspartimido susidarymu, pakeičiant karboksilinės grupės apsaugos būdą. [2]

Rezultatai rodo, kad apsauginių grupių strategija daro įtaką ne tik tam, ar numatyta reakcija gali įvykti, bet ir tam, kokios nepageidaujamos reakcijos tampa įmanomos.

Fmoc, Boc ir ortogonali apsauga

Fmoc ir Boc yra plačiai naudojamos aminogrupių apsauginės grupės.

Jie iš tiesų skiriasi savo pašalinimo būdu.

Fmoc paprastai pašalinamas šarminėse sąlygose, o Boc yra jautrus rūgštinėms sąlygoms.

Šios savybės leidžia jas taikyti kaip platesnių apsaugos strategijų elementus.

Populiarioje Fmoc pagrįstoje SPPS technologijoje laikinoji N-galinė Fmoc apsauga yra kelis kartus pašalinama, o pasirinktos šoninių grandinių apsauginės grupės ir jungtis su derva išlieka nepaliestos iki vėlesnių etapų.

Kitos strategijos gali naudoti kitokius derinius.

Ypač svarbi sąvoka yra ortogonali apsauga.

Dvi apsauginės grupės laikomos ortogonaliomis, jei vieną iš jų galima selektyviai pašalinti tokiomis sąlygomis, kai kita išlieka pakankamai stabili, kad būtų galima tęsti sintezę.

Taigi ortogonalumas yra praktinis cheminio suderinamumo santykis.

Tai nereiškia, kad kiekviena apsaugota grupė išliks visiškai nepakitusi po neriboto skaičiaus veikimo visomis reakcijos sąlygomis.

Šalutiniai poveikiai vis dar gali pasireikšti.

Fmoc sintezės tyrimuose aprašytas tiek aspartimido susidarymas, tiek nepageidaujami stereocheminiai pokyčiai, nepaisant to, kad bendra apsaugos strategija buvo laikoma selektyvia. [11]

Stereochemija yra molekulės tapatybės dalis

Daugelis aminorūgščių turi chiralinį centrą.

Tai reiškia, kad jų atomai gali įgauti įvairias erdvinės konfigūracijas, atitinkančias skirtingas stereochemines formas.

Pakeitus vieno stereogeninio centro konfigūraciją, gali susidaryti kitokia peptido struktūra, nekeičiant jo nominalios masės.

Todėl vien tik masė negali patvirtinti visos peptido tapatybės.

Epimerizacija paprastai reiškia vieno stereogeninio centro konfigūracijos pasikeitimą molekulėje, kurioje yra keli tokie centrai.

Racemizacija taip pat dažnai aptariama peptidų chemijoje, kalbant apie aminorūgščių likučių stereocheminio vientisumo praradimą.

Šie pokyčiai yra svarbūs, nes molekulinis atpažinimas gali labai priklausyti nuo atomų erdvinės konfigūracijos.

Taigi dvi molekulės, turinčios tą pačią elementinę sudėtį ir nominalią masę, gali elgtis skirtingai, jei skiriasi jų stereocheminė struktūra.

Tyrime, kuriame buvo nagrinėjama mikrobangomis skatinama Fmoc sintezė, nustatyta, kad tam tikros liekanos esamomis sąlygomis buvo linkusios patirti nepageidaujamus stereocheminius pokyčius. Modifikavus metodą, šių reakcijų pasireiškimas buvo sumažintas. [11]

Tai nereiškia, kad šildymas iš esmės sugadina visus peptidus.

Teisinga išvada yra tokia, kad reakcijos pagreitinimą reikia vertinti kartu su nuo sekos priklausančiu cheminiu selektyvumu.

Aspartimidas ir kiti susiję teršalai

Aspartimido susidarymas yra žinoma šalutinė reakcija, susijusi su tam tikromis sekomis, kurių sudėtyje yra asparaginato.

Gali susidaryti nepageidaujamas ciklinis tarpinis produktas, iš kurio vėliau susidaro junginiai su pasikeitusiais skeleto ryšiais arba stereochemiu.

Šios reakcijos tikimybė priklauso nuo sekos ir proceso sąlygų.

Kiti su sinteze susiję teršalai gali atsirasti dėl:

• nepilno susiejimo;
• nepilno draudimo;
• delecijų sekvencijų susidarymo;
• šoninių grandinių reakcijų;
• stereocheminių pokyčių;
• reakcijos atskyrimo metu;
• oksidacijos;
• pertvarkymų;
• produkto apdorojimo sąlygos;
• ne visiškai pašalintos apsauginės grupės.

Kai kurie teršalai sukelia lengvai pastebimą molekulinės masės pokytį.

Kitus atskirti yra žymiai sunkiau.

Atliekant sintetinio peptido, kuris yra renino substratas, analitinius tyrimus, buvo nustatyta daug priemaišų, įskaitant komponentus, kurių masės pokytis yra toks pat, tačiau kurie turi modifikacijas skirtingose pozicijose. [12]

Norint juos atskirti, reikėjo atlikti papildomą struktūrinę analizę.

Tyrėjai taip pat laikė siūlomus šių teršalų susidarymo mechanizmus hipotezėmis.

Tai svarbus skirtumas:

Nustatyti, kas yra tarša, ir įrodyti tikslų jos susidarymo mechanizmą – tai du atskiri moksliniai klausimai.

Neturėtų būti teigiama, kad tikėtinas mechanizmas yra patvirtintas vien dėl to, kad jis atitinka stebėtą dalelės masę.

Valymas, kalkių pašalinimas ir gamybos kokybė

Neapdorotas produktas, išgrynintas produktas ir našumas

Neapdorotas peptidas – tai medžiaga, gauta prieš užbaigiant atitinkamus gryninimo etapus.

Gali būti sudėtyje:

• tikslinis peptidas;
• delecijų sekos;
• medžiaga nėra visiškai apsaugota;
• modifikuotos sekvencijos;
• reagentų likučiai;
• produktai, susiję su atskyrimu;
• druskos;
• tirpikliai;
• kiti proceso metu susidarantys komponentai.

Valymo tikslas – išskirti reikiamą peptidą iš šio mišinio.

Reikia aiškiai atskirti tris sąvokas:

žaliavos grynumas — medžiagos sudėtis, nustatyta prieš galutinį valymą;

išvalyto arba išskirto produkto išeiga — atgauto tikslinio medžiagos kiekis, palyginti su nustatyta pradine arba teorine verte;

galutinis grynumas — izoliuotos medžiagos sudėtis, nustatyta taikant konkretų analizės metodą.

Šios sąvokos nėra tarpusavyje keičiamos.

Šis procesas gali sukelti didelį žaliavų kiekį, tačiau leidžia gauti palyginti nedidelį kiekį išgryninto produkto.

Kitas procesas gali duoti mažiau žaliavos, tačiau pasižymėti dideliu tikslinio produkto susidarymo selektyvumu.

Be to, aukštas analitinis grynumas nebūtinai reiškia didelį gamybos našumą.

Tyrimuose, susijusiuose su pagreitinta srautinės sintezės metodu, žaliavos grynumas ir išeiga po izoliavimo buvo tinkamai nurodyti atskirai. [7]

Chromatografija atskiria sudedamąsias dalis, tačiau neatsako į visus klausimus

Aukšto efektyvumo skysčių chromatografija su apverstomis fazėmis (RP-HPLC) yra plačiai naudojama peptidų analizei ir gryninimui.

Įvairios dalelės skirtingai sąveikauja su stacionariąja ir judriąja fazėmis.

Tinkamomis sąlygomis šie skirtumai leidžia atskirti mišinio komponentus.

Analitinė ir preparatyvinė chromatografija turi susijusius, tačiau skirtingus taikymo atvejus.

Analizinis prietaisas HPLC pirmiausia skirtas mėginio sudėties tyrimui.

Preparatyvinė HPLC naudojama atskirtų komponentų fiziniam surinkimui.

Chromatogramos gali suteikti daug vertingos informacijos.

Tačiau didelio pagrindinio piko ar didelės jo ploto dalies procentinės dalies neturėtų būti laikoma išsamia molekuline charakteristika.

Chromatografijos rezultatai priklauso, be kita ko, nuo:

• stulpelio tipas;
• judamosios fazės;
• gradiento;
• temperatūros;
• aptikimo metodai;
• bangos ilgis;
• mėginio paruošimas;
• pikų integravimo būdas;
• skiriamoji geba;
• teršalų savybės.

Dvi junginiai gali potencialiai išsiskirti tuo pačiu metu.

Kai kurios mėginio sudedamosios dalys taip pat gali skirtingai reaguoti į naudojamą detektorių.

Todėl aukštas HPLC paviršiaus grynumas nereiškia, kad molekulinė tapatybė yra visiškai patvirtinta.

Izobarinių peptidinių teršalų tyrimai ir chiralinė analizė rodo, kodėl gali prireikti papildomų analitinių metodų. [12] [13]

Analitinis metodas turi atitikti konkretų struktūrinį klausimą.

Tapatybė, grynumas ir turinys reiškia skirtingus dalykus

Peptidų charakteristikoje ypač svarbios yra trys sąvokos.

Tapatybė atsako į klausimą:

Ar mėginyje yra ieškoma molekulė?

„Švarumas“ atsako į klausimą:

Kokios kitos sudedamosios dalys yra mėginyje arba kokia matuojamo signalo dalis atitinka pagrindinę sudedamąją dalį?

Ši medžiaga atsako į klausimą:

Kiek tikrojo peptido yra mėginyje?

Į šiuos klausimus ne visada galima atsakyti atlikus vieną matavimą.

Peptidą turinti medžiaga taip pat gali sudaryti:

• vandenį;
• priešingas;
• druskos;
• tirpiklių likučiai;
• kiti su procesu susiję komponentai;
• teršalai.

Taigi, pasverto medžiagos bendroji masė nebūtinai turi atitikti paties peptido masę.

Be to, išmatuotos dalelės masės atitikimas teorinei vertei nepatvirtina:

• visos aminorūgščių sekos;
• tinkamą atskirų likučių sąsają;
• stereocheminio vientisumo;
• disulfidinių tiltelių išdėstymo;
• raukšlės;
• izobarinių teršalų nebuvimas.

Masės spektrometrija gali pateikti įtikinamų įrodymų apie molekulinę masę.

Tandeminė masių spektrometrija ir kiti struktūriniai metodai gali suteikti papildomos informacijos apie seką.

Chiraliniai metodai leidžia tirti stereocheminius klausimus, kurių neįmanoma išspręsti paprastu masės matavimu.

Viename iš analitinių tyrimų buvo atsižvelgta net į racemizaciją, atsirandančią ruošiant mėginį. Tai rodo dar vieną svarbų principą: pati analitinė procedūra gali sukelti artefaktus, jei ji nėra tinkamai suplanuota. [13]

Dėl sulankstymo ir veiklos gali prireikti atskiro patvirtinimo

Struktūriškai ribotų peptidų ir mažų baltymų atveju teisinga seka ir molekulinė masė vis tiek gali būti nepakankamos, kad būtų galima patvirtinti numatytą galutinę struktūrą.

Papildomi klausimai gali apimti:

• Ar susiformavo tinkami disulfidiniai tiltai?
• Ar molekulė įgavo numatytą konformaciją?
• Ar ciklizacija yra užbaigta?
• Ar yra struktūrinių izomerų?
• Ar sintetinė molekulė rodo tikėtiną aktyvumą atliekant konkretų eksperimentinį bandymą?

Atliekant BPTI sintezės tyrimą buvo panaudoti keli analitiniai ir biofiziniai metodai, taip pat įvertintas tripsino slopinimas. [3]

Bendri rezultatai patvirtino, kad sintetinė medžiaga, turinti natūralią seką, atitinka natūralų baltymą pagal tiriamus kriterijus.

Tačiau aktyvumo testas atsako į konkretų funkcinį klausimą.

Tai nepakeičia teršalų analizės.

Be to, panašūs rezultatai viename bandyme nepatvirtina visiško visų biologinių, struktūrinių ar gamybinių savybių lygiavertiškumo.

Gamybos masto keitimas daro įtaką ne tik medžiagų kiekiui

Gamybos masto didinimas neapsiriboja vien proporcingu visų reagentų kiekio padidinimu.

Fiziniai procesai didesniu mastu gali elgtis kitaip.

Svarbūs gali būti:

• maišymas;
• šilumos mainai;
• reagentų platinimas;
• difuzija;
• dervos išsipūtimas;
• slėgis;
• filtravimas;
• tirpiklių tvarkymas;
• nusėdimas;
• pusiau gaminių tirpumas;
• masės transportavimas;
• valymo sistemos galimybės.

Šie veiksniai gali turėti įtakos tiek reakcijos eigai, tiek teršalų susidarymui.

Valymas vėlesniuose etapuose taip pat gali tapti visos gamybos kliūtimi.

Sintezės greičio padidinimas turi ribotą reikšmę, jei valymo sistema negali veiksmingai atskirti susidarančių teršalų arba atgauti reikiamos kokybės produkto.

Pramoninėje analizėje, apimančioje 40 peptidų sintezės procesų iš 14 farmacijos įmonių, buvo vertinamas medžiagų suvartojimas sintezės, gryninimo ir izoliavimo metu. [14]

Tyrimas rodo, kodėl gamybos vertinimą reikia atlikti visam procesui.

Tačiau tai nereiškia, kad kiekviena gamykla, gamybos seka ar technologija pasiekia vienodus rezultatus.

Gamybos kokybė priklauso nuo daugelio kontrolės veiksnių

Norint užtikrinti patikimą peptidų gamybą, nepakanka vieno patenkinamo analitinio rezultato.

Kontroluojamas procesas paprastai apima keletą tarpusavyje susijusių elementų:

apibrėžta tikslinė molekulė → tinkamos išeiginės medžiagos → kontroliuojama sintezė → kontroliuojamas gryninimas → tinkamas mėginių ėmimas → patvirtinta arba tikslui tinkama analizė → partijos dokumentacija.

Partijos dokumentacija susieja analitinius rezultatus su iš tikrųjų pagaminta produkcija.

Analizės sertifikatas (COA) apibendrina pasirinktus tam tikros partijos tyrimų rezultatus.

Jo informacinė vertė priklauso nuo:

• atliktų tyrimų rūšis;
• taikytų metodų;
• šių metodų tinkamumas;
• specifikacijos;
• mėginio identifikavimas;
• partijos atsekamumas;
• patvirtinimas, kad pateikti rezultatai iš tiesų susiję su konkrečia medžiaga.

Vienas rodiklis, vadinamas „grynumu”, savaime negali patvirtinti:

• visiškos molekulinės tapatybės;
• peptido kiekis;
• stereocheminio vientisumo;
• tirpiklių likučių kiekis;
• vandens kiekis;
• priešjonų sudėtis;
• mikrobiologinių savybių;
• raukšlės;
• biologinio aktyvumo;
• tinkamumas tam tikram tikslui.

Tinkamas tyrimų rinkinys priklauso nuo numatomo medžiagos naudojimo tikslo.

Peptidas, naudojamas kaip analitinis etalonas, tiriamasis reagentas, taikomas ląstelių eksperimente, ir medžiaga, esanti farmacijos plėtros etape, gali reikalauti atsakymų į kitus kokybės klausimus.

Todėl analitinius duomenis reikia vertinti aiškiai apibrėžtame kontekste, o ne kaip visuotinį kokybės patvirtinimą.

Aplinkos tvarumo vertinimas turi apimti visą procesą

Peptidų sintezei gali prireikti didelių kiekių tirpiklių ir reagentų.

Taigi, atliekant poveikio aplinkai vertinimą, reikėtų atsižvelgti į kur kas daugiau aspektų nei vien tik sujungimo etapą.

Svarbūs elementai gali būti:

• statybinių blokų paruošimas;
• sujungimo reagentai;
• reagentai, skirti apsaugos pašalinimui;
• plovimas;
• atsiskyrimas;
• produkto apdorojimas;
• chromatografija;
• tirpiklių keitimas;
• izoliacija;
• džiovinimas;
• atliekų tvarkymas.

Norint sumažinti poveikį aplinkai, gali prireikti vienu metu patobulinti kelis etapus.

Paskelbtoje analizėje apie peptidų gamybą aptariamos problemos, susijusios tiek su sinteze, tiek su gryninimu, ir pabrėžiama būtinybė tobulinti visą proceso projektą. [15]

Kadangi tai yra perspektyvinis leidinys, jame nepateikiamas kontroliuojamas tiesioginis palyginimas, įrodantis, kad viena konkreti technologija visada yra ekologiškesnė.

Taip pat:

greitesnė sintezė nebūtinai reiškia, kad ji yra ekologiškesnė,

o mažesnis tirpiklių suvartojimas pačios sintezės metu savaime nereiškia, kad viso gamybos proceso poveikis yra mažesnis.

Atliekant aplinkosauginius palyginimus būtina taikyti nuoseklias analizės ribas, o išteklių suvartojimą geriausia susieti su konkrečiu išskirto ir apibūdinto galutinio produkto kiekiu.

Dažniausiai užduodami klausimai

1. Kuo skiriasi peptidų sintezė kietojoje fazėje nuo sintezės skystojoje fazėje?

Sintezėje ant kietojo paviršiaus augantis peptidas lieka prisijungęs prie netirpaus nešiklio, tuo tarpu klasikinėje sintezėje tirpale peptido tarpinis produktas lieka ištirpęs ir paprastai turi būti išgautas remiantis jo fizinėmis ir cheminėmis savybėmis. Siauresne prasme LPPS tirpioje augančioje grandinėje yra papildomai tirpus žymeklis arba nešiklis, palengvinantis vėlesnį atskyrimą. Tyrimai apie žymėtą sintezę rodo vieną iš strategijų, kaip sujungti tirpalo chemiją su išgavimu nusodinimo būdu, o literatūroje apie LPPS tokie sprendimai atskiriami tiek nuo klasikinės sintezės tirpale, tiek nuo SPPS. Nė vienas metodas iš esmės nėra optimalus kiekvienam peptidui. Pagrindinis skirtumas susijęs su fiziniu augančios grandinės vedimo ir atskyrimo būdu per vėlesnius sintezės etapus. [8] [9]

2. Kodėl sintezuojant peptidus gali susidaryti priemaišos?

Teršalai gali susidaryti dėl to, kad numatytos reakcijos ne visada vyksta kiekybiškai, o kitos funkcinės grupės gali dalyvauti nepageidaujamose reakcijose. Nepakankamas konjugavimas gali sukelti sekvencijų delecijas, nepakankamas apsaugos grupės pašalinimas gali sutrikdyti tolesnį grandinės susidarymą, o kai kurios sekvencijos yra linkusios į stereocheminius pokyčius, aspartimido susidarymą, oksidaciją, pergrupavimui arba šalutiniams produktams, susijusiems su atskyrimu. Fmoc sintezės tyrimai ir sintetinių peptidinių priemaišų struktūrinė analizė pateikia keletą tokių pavyzdžių. [11] [12] Atskirų priemaišų dažnumas ir reikšmė priklauso nuo sekos ir proceso, todėl sintezės automatizavimą nereikėtų tapatinti su visišku cheminių klaidų nebuvimu.

3. Koks yra dervos vaidmuo peptidų sintezėje?

Sveikis išlaiko augantį peptidą, o tirpūs reagentai ir daugelis šalutinių produktų gali būti pašalinami tarp atskirų sintezės etapų. Tai žymiai supaprastina pasikartojantį grandinės suformavimą, tačiau sveikis nėra vien mechaninis laikiklis. Jos išbrinkimas, užpildymo laipsnis, polimero struktūra, suderinamumas su tirpikliais ir reakcijų vietų prieinamumas gali daryti įtaką reagentų pasiekimo prie prisijungusio peptido efektyvumui. Tyrimuose, kuriuose buvo naudojamas reaktorius su kintamuoju užpildu, buvo stebimas dervos elgesys atliekant agregacijos ir jungimosi efektyvumo analizę. [4] Toks stebėjimas nepašalina sekos klaidų, tačiau parodo, kodėl fizinė dervos būsena gali būti svarbus proceso kintamasis.

4. Kam naudojama „Wanga“ derva peptidų sintezėje?

„Wang“ tipo nešikliai dažniausiai siejami su peptidų, kurie po atitinkamo atskyrimo nuo C-galo karboksirūgšties pavidalu išsiskiria, paruošimu. Tačiau konkretus galutinis produktas priklauso nuo jungiklio, nešiklio struktūros ir taikomos atskyrimo chemijos, o ne tik nuo dervos pavadinimo. Mokslininkai taip pat pristatė specializuotą metodą, kaip „Peptidyl-Wang-TentaGel“ medžiagą paversti peptidiniais hidrazidais, kurie gali būti naudingi kaip sintetiniai tarpini produktai. [5] Alternatyvi reakcija nekeičia standartinio atskyrimo nuo Wango dervos svarbos. Tačiau ji parodo, kodėl, prognozuojant produktą, reikia analizuoti visą nešiklio sistemą ir reakcijos sąlygas.

5. Ar SPPS sintezuoja peptidą pradedant nuo N-galo ar nuo C-galo?

Klasikinis etapinis SPPS paprastai prasideda nuo C-galinio likučio prijungimo prie nešiklio, po to grandinė pailginama N-galo kryptimi. Tai yra priešinga kryptis nei įprastas grandinės pailginimas ribosomoje, kur baltymas auga pridedant naujus aminorūgštis prie C-galo. BPTI sintezė yra pavyzdys, kaip naudojami apsaugoti statybiniai blokai ir nešiklis, siekiant vėliau išlaisvinti, išgryninti ir susilankstyti produktą. [3] Tačiau egzistuoja specializuotos peptidų chemijos strategijos, kuriose naudojami kiti sprendimai, todėl sintezė nuo C-galo link N-galo turėtų būti apibrėžiama kaip klasikinis SPPS metodas, o ne kaip absoliuti visų sintezės metodų taisyklė.

6. Kodėl reikalingos apsaugos grupės?

Amino rūgštys dažnai turi keletą reaktyvių funkcinių grupių. Apsauginės grupės laikinai užkerta kelią reakcijoms tam tikrose vietose, palikdamos atitinkamą vietą prieinamą konkrečiame sintezės etape. Tai padeda kontroliuoti likučių jungimosi tvarką ir būdą. Be tinkamos apsaugos konkurencinės reakcijos galėtų sukelti sudėtingų mišinių susidarymą arba struktūros pasikeitimą turinčių produktų susidarymą. Tyrimai, susiję su aspartimido susidarymu, parodė, kad karboksilinės grupės apsaugos chemijos pakeitimas gali apriboti svarbią šalutinę reakciją tirtose sekose. [2] Apsauginės grupės negarantuoja idealaus sintezės eigos, tačiau užtikrina selektyvią cheminę kontrolę, kuri turi atitikti visus svarbius proceso etapus.

7. Kuo skiriasi Fmoc ir Boc?

Fmoc ir Boc yra plačiai naudojamos laikinosios aminogrupės apsauginės grupės, tačiau jos reaguoja skirtingomis cheminėmis sąlygomis. Fmoc paprastai pašalinamas šarminėje aplinkoje, o Boc yra jautrus rūgštims. Šis skirtumas daro įtaką tam, kaip jos jungiamos su šoninių grandinių apsaugomis, jungtimis ir kitais sintezės etapais. Fmoc pagrįsta sintezė plačiai naudojama šiuolaikinėje SPPS, tačiau tyrimai taip pat parodė, kad tokiomis sąlygomis gali vykti nuo sekos priklausančios šalutinės reakcijos. [11] Taigi praktikoje naudingiau lyginti visas apsaugos strategijas ir jų suderinamumą su konkrečia seka, nei nagrinėti tik dviejų apsauginių grupių pavadinimus.

8. Ką reiškia ortogonali apsauga?

Ortogonali apsauga reiškia, kad vieną apsauginę grupę galima pašalinti tokiomis sąlygomis, kai kita reikalinga apsauginė grupė išlieka pakankamai stabili, kad būtų galima tęsti sintezę. Tai leidžia atskleisti įvairias reaktyvias vietas tam tikruose etapuose. Ši koncepcija yra esminė atliekant sudėtingų peptidų kontroliuojamą sintezę. Tačiau ortogonalumas priklauso nuo sąlygų ir nėra absoliutus: pakartotinis eksponavimas, sekos pobūdis ir reakcijos parametrai vis dar gali sukelti šalutines reakcijas. Alternatyvių karboksilinių grupių apsaugos būdų tyrimai rodo, kaip apsaugos strategiją galima modifikuoti, siekiant kontroliuoti sudėtingą peptidų chemiją. [2]

9. Kas yra delecijos seka?

Delecijos seka – tai peptidas, kuriam trūksta vienos ar kelių liekanų, esančių numatytoje tikslinėje sekoje. Ji gali susidaryti, kai aminorūgšties jungimosi etapas nevyksta iki galo, tačiau nesureagavusi grandinė lieka prijungta prie nešiklio ir dalyvauja tolesniuose cikluose. Kadangi netinkama grandinė vis dar lieka prisijungusi prie dervos, paprastas plovimas jos nebūtinai pašalina. SPPS stebėjimo realiuoju laiku tyrimai rodo, kad neišbaigtas amidinių ryšių susidarymas yra svarbi proceso problema. [4] Taigi sekos trūkumas yra problema, susijusi su produkto struktūra ir tapatybe, o ne tik su reagento liekanomis.

10. Ar du peptidiniai teršalai gali turėti tą pačią molekulinę masę?

Taip. Įvairios molekulinės struktūros gali turėti identišką arba neatskiriamą nominalųjį svorį. Dėl šios priežasties vien tik svorio sutapimas nepatvirtina visiško molekulės tapatumo. Tiriant sintetinį peptidą, kuris yra renino substratas, buvo identifikuoti izobarinių priemaišų komponentai, kurių modifikacijos buvo skirtingose pozicijose. Derivatizacija ir tandeminė masių spektrometrija suteikė papildomos informacijos apie struktūrą. [12] Šis pavyzdys rodo, kodėl vien tik stebimos masės atitikimas tikėtinai masės vertei negali savaime patvirtinti teisingos sekos, ryšių, stereocheminės struktūros ar struktūriškai panašių izomerų nebuvimo.

11. Kas yra epimerizacija ir racemizacija peptidų sintezėje?

Epimerizacija ir racemizacija yra nepageidaujami stereocheminės konfigūracijos pokyčiais. Jie gali vykti nepakeičiant nominalios aminorūgščių sekos ar molekulinės masės, todėl paprastas masės matavimas gali neparodyti struktūrinio skirtumo. Tyrimuose, susijusiuose su mikrobangomis palaikoma Fmoc sinteze, buvo identifikuoti likučiai, linkę į stereocheminius pokyčius, ir įrodyta, kad modifikavus reakcijos sąlygas galima apriboti tokius procesus. [11] Rizika priklauso nuo statybinio bloko, sekos ir proceso sąlygų. Todėl stereocheminė kokybė reikalauja analitinių metodų, leidžiančių įvertinti konfigūraciją, ir negali būti nustatoma vien tik remiantis molekuline mase.

12. Kas yra aspartimido susidarymas?

Aspartimido susidarymas yra nepageidaujama reakcija, susijusi su tam tikromis sekomis, kurių sudėtyje yra asparaginato. Ciklinio tarpinio produkto susidarymas gali lemti tolesnių produktų, kurių skeleto jungtys ar stereochemija yra pakitusi, susidarymą, o tai sumažina išeigą ir apsunkina gryninimą. Mokslininkai analizavo alternatyvias apsaugos strategijas, sukurtas siekiant sumažinti šią reakciją pasirinktuose peptiduose ir baltymuose. [2] Rezultatai nerodo vieno visuotinio sprendimo, tinkamo visoms sekcijoms, kuriose yra asparaginato. Tačiau jie parodo, kodėl planuojant sintezę ir teršalų kontrolės strategijas būtina atsižvelgti į konkrečios sekcijos specifines chemines savybes.

13. Ar aukštas HPLC grynumas patvirtina, kad peptidas yra tikrai tas pats?

Ne. HPLC grynumas apibūdina mėginį atsižvelgiant į konkretų chromatografijos etapą, naudotą detektorių ir duomenų analizės metodą. Didelė pagrindinio piko ploto dalis gali būti vertingas įrodymas, kad mėginyje dominuoja vienas chromatografiškai atskirtas komponentas, tačiau savaime tai nepatvirtina visiškos molekulinės tapatybės. Kartu eliuojančios priemaišos, stereoizomerai ir kiti variantai gali reikalauti papildomų metodų. Atliekant peptidų chiralinės analizės tyrimus buvo naudojamas specialiai sukurtas procesas, kuris taip pat atsižvelgė į stereocheminius pokyčius, atsirandančius ruošiant mėginį. [13] Todėl tapatumą ir grynumą reikėtų laikyti susijusiais, tačiau atskirais analitiniais klausimais.

14. Ar išvalyto produkto našumas reiškia tą patį, kas ir grynumas?

Ne. Išvalyto arba izoliuoto produkto išeiga apibrėžia atgautos tikslinės medžiagos kiekį, palyginti su nustatytu pradiniu arba teoriniu kiekiu. Tuo tarpu grynumas apibūdina atgautos medžiagos sudėtį pagal nustatytą analizės metodą. Sintezės rezultatas gali būti palyginti nedidelis labai didelio grynumo produkto kiekis arba didelis žaliavos kiekis, kuriame yra nemažai priemaišų. Atliekant automatinės srautinės sintezės tyrimus, žaliavinio produkto grynumas ir išeiga po izoliavimo buvo pateikiami atskirai. [7] Šių parametrų atskyrimas užkerta kelią klaidingam vieno iš jų aukštos vertės vertinimui kaip kito parametro aukštos vertės įrodymui.

15. Ar ilgus peptidus galima gaminti sujungiant trumpesnius fragmentus?

Taip. Taikant fragmentinę strategiją, trumpesni peptidų segmentai gali būti paruošti atskirai, o vėliau sujungti naudojant atitinkamus cheminius metodus. Natūrali cheminė ligacija buvo svarbus pavyzdys, kai neapsaugoti peptidų fragmentai buvo sujungti taip, kad susidarytų natūralus peptidinio karkaso ryšys, o vėliau buvo gautas susiraukšlėjęs baltymas. [10] Tai nereiškia, kad bet kokie peptidų fragmentai gali jungtis savaime. Reikia atsižvelgti į fragmentų struktūrą, jungimo chemiją, jungimo vietos pasirinkimą, tirpumą, stereochemią ir gryninimo reikalavimus. Taigi fragmentų surinkimas yra alternatyvi sintezės projektavimo strategija, o ne automatinis ilgų peptidų problemų sprendimas.

16. Ar spartesnė automatizuota sintezė pašalina valymo būtinybę?

Ne. Greitesnis automatizuotas arba srautinis sintezavimas sutrumpina tam tikrų sintezės etapų trukmę, tačiau tai neįrodo, kad kiekviena susidariusi molekulė turi numatytą struktūrą. Tyrimuose, susijusiuose su greita srautinė sinteze, žaliava vis dar buvo charakterizuojama ir vėliau atliekamas gryninimas, o vėlesniuose darbuose, susijusiuose su automatizavimu, atskirai buvo lyginamas žaliavos grynumas ir išeiga po izoliavimo. [6] [7] Geri sistemos rezultatai tiriamų sekvencijų atveju taip pat negarantuoja identiškų rezultatų kiekvienam naujam tikslui. Pagreitinta sintezė vis dar turi būti derinama su atitinkamu gryninimu, tapatybės patvirtinimu, teršalų analize ir galutinėmis charakteristikomis.

17. Kodėl gamybos masto didinimas yra sudėtingesnis nei didesnės partijos paruošimas?

Padidinus gamybos mastą, keičiasi ne tik medžiagos kiekis, bet ir fizinės bei cheminės sąlygos. Maišymas, šilumos mainai, dervos išsipūtimas, reagentų pasiskirstymas, slėgis, filtravimas, tirpiklių tvarkymas, tarpinių produktų tirpumas ir valymo sistemos galimybės gali skirtis didesnio gamybos tūrio sąlygomis. Atliekant 40 peptidų gamybos procesų pramoninę analizę, medžiagų sąnaudų analizės metu atskirai buvo vertinama sintezė, valymas ir izoliavimas. [14] Rezultatai rodo, kodėl gamybą reikia vertinti kaip visapusišką procesą. Masto keitimui pritaikytas metodas turi nuosekliai užtikrinti apibūdintos medžiagos gavimą visuose etapuose, o ne tik didesnį žaliosios peptido medžiagos kiekį.

18. Ar peptidas yra paruoštas iškart po to, kai sudaroma teisinga seka?

Ne visada. Grandinės sudarymas sukuria sekos karkasą tik tiek, kiek tai patvirtina procesas ir analitiniai duomenys. Priklausomai nuo molekulės, vis dar gali prireikti deaktyvavimo, atskyrimo, ciklizacijos, oksidacijos, disulfidinių tiltelių formavimo, sulankstymo, konjugacijos, gryninimo ir charakterizavimo. BPTI sintezė yra geras pavyzdys proceso, kuriame po linijinės sekos surinkimo vyko gryninimas ir susidarymas susilankstytos struktūros, turinčios disulfidinius tiltelius. [3] Taigi terminas „gatavas peptidas” turėtų reikšti molekulinę formą, reikalingą konkrečiame moksliniame kontekste, o ne tik aminorūgščių pridėjimo etapų užbaigimą.

19. Ar teisinga molekulinė masė patvirtina teisingą peptido seką?

Ne. Molekulinės masės sutapimas yra vertingas įrodymas, tačiau jis pats savaime negali patvirtinti visos sekos ar molekulinės struktūros. Izobarinės struktūros gali turėti tą pačią masę, o stereocheminiai skirtumai gali visiškai nekeisti molekulinės masės. Sintetinių peptidų priemaišų tyrimai parodė, kad struktūriškai skirtingų komponentų atskyrimui gali prireikti tandeminės masių spektrometrijos ir papildomų analizės metodų. [12] Jei kyla klausimų dėl stereocheminio vientisumo, taip pat gali prireikti chirališkų metodų. [13] Taigi molekulinę masę reikėtų laikyti vienu iš tapatumo vertinimo elementų, o ne jos visišku patvirtinimu.

20. Kodėl valymą reikėtų laikyti peptido gamybos dalimi, o ne tik galutiniu etapu?

Valymas lemia, ar tikslinį peptidą galima veiksmingai atskirti nuo delecinių sekų, šalutinių produktų, reagentų likučių, struktūriškai panašių priemaišų ir kitų sintezės metu susidariusių komponentų. Metodas, leidžiantis labai greitai pagaminti didelius žaliavos kiekius, vis tiek gali būti nepraktiškas, jei neįmanoma veiksmingai išgauti tikslinio produkto, atitinkančio reikiamus kokybės reikalavimus. Dėl šios priežasties pramoninėse peptidų gamybos procesų analizėse kartu atsižvelgiama į sintezę, gryninimą ir izoliavimą. [14] Gamybos efektyvumas galiausiai turi būti vertinamas pagal išskirto galutinio produkto kiekį ir savybes, o ne vien tik pagal sintezės greitį.

Peptidų sintezės metodų palyginimo apribojimai

Aiškinant tyrimus, kuriuose lyginamos peptidų gamybos technologijos, reikia nepamiršti kelių svarbių apribojimų.

Pirma, sekvencija daro didelę įtaką sintezės sudėtingumui. Metodas, kuris pasiteisina vieno peptido atveju, nebūtinai veiks taip pat kito atveju. Agregacija, hidrofobiškumas, aminorūgščių sudėtis, ilgis, polinkis formuoti antrines struktūras ir jautrumas šalutinėms reakcijoms gali keisti proceso eigą. [1] [4]

Antra, žaliavos grynumas, išeiga po izoliavimo, galutinis grynumas ir peptido kiekis yra skirtingi parametrai. Metodų lyginimas remiantis tik vienu iš jų gali suteikti neišsamų vaizdą apie gamybos efektyvumą. [7]

Trečia, greitas grandinės surinkimas nereiškia, kad visa medžiaga pagaminama greitai. Išskyrimas, valymas, izoliavimas, galutinis struktūros formavimas, analitiniai tyrimai ir dokumentacija taip pat turi įtakos bendram gamybos laikui. [6] [7]

Ketvirta, analitinis grynumas priklauso nuo taikomo metodo. HPLC, masės spektrometrija, tandeminė masės spektrometrija ir chiralinė analizė atsako į skirtingus klausimus. Vienas analitinis rezultatas nebūtinai patvirtina visišką struktūrinį tapatumą. [12] [13]

Penkta, mastas daro įtaką proceso eigai. Laboratorinės sintezės rezultatų negalima automatiškai perkelti į pramoninę gamybą, neįvertinus maišymo, masės transportavimo, valymo galimybių, medžiagų sąnaudų ir kitų nuo masto priklausančių veiksnių. [14]

Šešta, istoriniai ekonominiai palyginimai laikui bėgant gali prarasti aktualumą. Reagentų sąnaudos, automatizacijos lygis, ekspresijos technologijos, valymo įranga, tirpiklių regeneravimas ir gamybos infrastruktūra nuolat tobulėja. Senesnės sąnaudų analizės gali ir toliau turėti mokslinę reikšmę, tačiau nebūtinai atspindi dabartinę rinkos ekonomiką. [1]

Septinta, atliekant aplinkosauginius palyginimus būtina nustatyti nuoseklias analizės ribas. Vertinant tirpiklių suvartojimą vien tik grandinės surinkimo metu, tuo pačiu neatsižvelgiant į valymą ir izoliaciją, galima padaryti klaidingas išvadas dėl proceso tvarumo. [14] [15]

Galiausiai pats metodo pavadinimas nenurodo produkto kokybės. SPPS, sintezė tirpale, LPPS, fragmentų ligacija ir biologinė ekspresija gali leisti gauti aukštos kokybės medžiagą, jei procesas buvo tinkamai suplanuotas ir kontroliuojamas. Tačiau nė vienas iš šių metodų automatiškai negarantuoja tinkamos tapatybės, grynumo, stereocheminės struktūros, konformacijos ar tinkamumo konkrečiam naudojimui.

Santrauka

Peptidų sintezę geriausia suvokti kaip kontroliuojamą molekulių gamybos procesą, o ne tiesiog kaip peptidinių ryšių susidarymą.

Tikslas – sukurti tam tikrą aminorūgščių seką, tuo pačiu kontroliuojant likučių jungimosi būdą, apsauginių grupių cheminę sudėtį, stereochemines savybes, šalutines reakcijas ir visus papildomus struktūrinius reikalavimus.

Peptidų sintezė kietojoje fazėje leidžia išlaikyti augančią grandinę ant netirpaus nešiklio, todėl pasikartojantys jungimo ir praplovimo etapai puikiai tinka automatizavimui. Tačiau privalumai, susiję su pakartotiniu sintezavimu, neišsprendžia tokių problemų kaip neišbaigtos reakcijos, agregacija, sekvencijų praradimas ar nuo sekvencijos priklausančios šalutinės reakcijos. [4] [6] [7]

Klasikinė sintezė tirpale leidžia peptidų tarpinius produktus išlaikyti skystoje fazėje ir gali suteikti daugiau lankstumo izoliuojant bei tiriant atskirus tarpinius produktus. Tačiau pakartotinis atskyrimas ir blogėjantis tirpumas gali tapti rimtais apribojimais.

Sintezės metodai skystoje fazėje su tirpiais žymekliais siekia sujungti tirpalų chemiją su specialiai sukurtais medžiagos atgavimo būdais. Taigi jie gali būti papildoma galimybė tais atvejais, kai klasikinė SPPS nėra optimalus sprendimas dėl sekos ar gamybos problemų. [8] [9]

Ilgesnes arba ypač sudėtingas molekules taip pat galima sintezuoti sujungiant fragmentus, įskaitant natūralią cheminę ligaciją, o ne vien tik nuolat pridedant naujus aminorūgščių likučius. [10]

Nepriklausomai nuo pasirinktos sintezės metodikos, jungimo efektyvumas ir apsauginių grupių chemija išlieka esminiai veiksniai, nes nedideli neefektyvumai ir šalutinės reakcijos gali kauptis vėlesniuose sintezės etapuose. Aspartimido susidarymas, delecijų sekos ir stereocheminiai pokyčiai rodo, kodėl vien tik numatyta seka neapibūdina visko, kas gali susidaryti proceso metu. [2] [11] [12]

Darbas taip pat nesibaigia, kai grandinė yra sumontuota.

Valymas lemia, ar galutinį produktą galima atskirti nuo kitų sudedamųjų dalių.

Toliau, tinkamai parinkti analizės metodai leidžia atsakyti į atskirus klausimus, susijusius su tapatybe, grynumu, sudėtimi, stereochemiu, konformacija ir – jei tai svarbu – funkciniu aktyvumu. [3] [12] [13]

Padidinus gamybos mastą, kyla naujų klausimų, susijusių su masės transportavimu, dervos išsaugojimu, tirpiklių suvartojimu, filtravimu, valymo galimybėmis, proceso pakartojamumu ir jo poveikiu aplinkai. Dėl šios priežasties pramoninis proceso vertinimas turėtų apimti sintezę, valymą ir izoliavimą, o ne sutelkti dėmesį vien tik į jungimosi greitį. [14] [15]

Svarbiausias principas yra toks:

Siekiant užtikrinti veiksmingą peptido gamybą, būtina kontroliuoti visą procesą – nuo molekulinio projektavimo ir ryšių formavimo iki gryninimo bei struktūrinių savybių nustatymo. Grandinės, turinčios numatytą nominalųjį svorį, arba aukšto pagrindinio chromatografinio piko gavimas yra vertingas įrodymas, tačiau nė vienas iš šių parametrų atskirai nepatvirtina visiškos molekulinės tapatybės ar gamybos proceso kokybės.

Atsakomybės apribojimas

Šis straipsnis yra skirtas tik švietimo ir mokslinio informavimo tikslams. Jame aprašomi bendrieji peptidų chemijos principai, sintezė kietosios fazės sąlygomis, sintezė tirpale ir skystosios fazės sąlygomis, apsauginių grupių strategijos, jungimo, gryninimo, analitinių charakteristikų, gamybos procesų bei pavyzdžiai iš paskelbtų tyrimų. Tai nėra laboratorinis protokolas, gamybos instrukcija, medicininė rekomendacija, dozavimo ar vartojimo vadovas, nei kokio nors konkretaus peptidinio produkto kokybės sertifikatas. Eksperimentinius rezultatus reikia interpretuoti atsižvelgiant į seką, taikytus metodus, proceso mastą, analitines technikas ir atskirų tyrimų apribojimus.

Nuorodos

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K. ir Perczel, A. (2016). 20–40 aminorūgščių ilgio polipeptidų ir minibaltymų ekspresija bakterijose ir (arba) kietosios fazės peptidų sintezė: B klasės GPCR ligandų atvejo tyrimas. „Current Protein & Peptide Science“, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., ir Bode, J. W. (2020). Aspartimido susidarymo prevencija peptidų sintezės metu, naudojant ciano-sulfurilidus kaip karboksirūgšties apsaugines grupes. „Nature Communications“, 11(1), 982 straipsnis. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C. ir Barany, G. (1992). Galvijų kasos tripsino inhibitorių (BPTI) ir dviejų jo analogų sintezė kietosios fazės metodu. Cheminis metodas, skirtas disulfidinių tiltelių vaidmeniui baltymų susilankstymo ir stabilumo procesuose įvertinti. „International Journal of Peptide and Protein Research“, 40(3–4), 194–207. „PubMed“ įrašas
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). Kietosios fazės peptidų sintezės stebėjimas realiuoju laiku naudojant kintamojo sluoksnio srauto reaktorių. „Chemical Communications“, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F. ir Becker, C. F. W. (2015). Efektyvus peptidų hidrazidų gaminimas tiesiogiai hidrazinoliizuojant „Peptidyl-Wang-TentaGel“ dervas. „Journal of Peptide Science“, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Greita srauto pagrindu atliekama peptidų sintezė. „ChemBioChem“, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., ir Pentelute, B. L. (2017). Visiškai automatizuotas srauto pagrįstas metodas, skirtas pagreitinti peptidų sintezę. „Nature Chemical Biology“, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G. ir Albericio, F. (2022). Peptidų sintezė skystoje fazėje (LPPS): trečioji peptidų gamybos banga. „Chemical Reviews“, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T. ir Fukui, T. (2012). Nauja difenilmetilo kilmės amido apsauginė grupė, skirta veiksmingai peptidų sintezei skystosios fazės sąlygomis: AJIPHASE. „Organic Letters“, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., ir Kent, S. B. (1994). Baltymų sintezė natūraliosios cheminės ligacijos būdu. „Science“, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J. ir Collins, J. M. (2007). Racemizacijos ir aspartimido susidarymo ribojimas mikrobangų pagreitintoje Fmoc kietosios fazės peptidų sintezėje. „Journal of Peptide Science“, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E. ir Gaskell, S. J. (1989). Sintetinio renino substrato peptido priemaišų charakterizavimas taikant greitojo atomų bombardavimo masės spektrometriją ir hibridinę tandeminę masės spektrometriją. „Rapid Communications in Mass Spectrometry“, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G., & Crowther, J. B. (1995). Peptidų chiralinio grynumo nustatymas: hidrolizė deuteruotoje rūgštyje, derivatizacija naudojant Marfey reagentą ir analizė taikant aukšto našumo skysčių chromatografiją su elektrospray jonizacija ir masių spektrometriją. „Journal of Chromatography A“, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Procesų masės intensyvumas (PMI): visapusiška dabartinių peptidų gamybos procesų analizė, padedanti užtikrinti peptidų sintezės tvarumą. „The Journal of Organic Chemistry“, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., ir Roschangar, F. (2019). Tvarumo iššūkiai peptidų sintezėje ir gryninime: nuo mokslinių tyrimų ir plėtros iki gamybos. „The Journal of Organic Chemistry“, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001