Peptidoszintézis: szilárd fázisú módszer, oldatfázisú módszer és előállítási módszerek

A peptidoszintézis aminosav-láncok meghatározott szekvenciájú, ellenőrzött előállítási folyamata. A kémiai szintézis során a kiválasztott aminosavakat peptidkötés, valamint ezzel párhuzamosan az ezen molekulákban jelen lévő egyéb reaktív csoportok ellenőrzése mellett. A cél tehát nem maguknak az aminosavaknak az összekapcsolása, hanem egy adott molekuláris szerkezet létrehozása meghatározott szekvenciával, sztereokémiával, láncvégi felépítéssel, valamint – amennyiben ez szükséges – további szerkezeti jellemzőkkel.

A fő módszerek közé tartozik a szilárd fázisú peptidszintézis (SPPS), a klasszikus oldatfázisú szintézis, valamint az újabb, oldható hordozókat vagy molekuláris címkéket alkalmazó folyékony fázisú peptidszintézis (LPPS) módszerek. A kutatólaboratóriumok és a gyártóüzemek a különböző megközelítéseket is ötvözhetik, külön-külön előállíthatnak rövidebb fragmentumokat, majd ezeket egymáshoz kapcsolhatják, vagy biológiai expressziót is alkalmazhatnak, ha az adott szekvencia számára az a célszerűbb.

A 20–40 aminosavmaradékból álló polipeptidek kémiai szintézisének és bakteriális expressziójának összehasonlítása egy fontos elvet mutat: a gyártási módszer gyakorlati megválasztása az adott molekulától, annak szekvenciájától, aggregációs hajlamától, a szükséges módosításoktól, a gyártási skálától és az analitikai követelményektől függ. [1]

A kívánt aminosavsorrend elérése csak az egyik lépés a peptid előállításában.

A teljes folyamat magában foglalhatja:

szekvenciatervezés → építőkövek előkészítése → funkciós csoportok védelme → kapcsolás → védőcsoportok eltávolítása → láncépítés → fragmensek hasítása vagy kapcsolása → végső szerkezetalakítás → tisztítás → azonosság igazolása → szennyezésvizsgálat → tartalommeghatározás → végső jellemzés.

Bizonyos peptidek esetében további lépésekre is szükség van, mint például a ciklikus szerkezet kialakítása, diszulfidhidak képzése, hajtogatás, konjugáció vagy egyéb kémiai módosítások.

Emiatt a lánc helyes összerakása nem jelenti automatikusan azt, hogy a végtermék rendelkezik a megfelelő azonossággal, tisztasággal, sztereokémiával, konformációval, stabilitással vagy egyéb elvárt tulajdonsággal.

Mi az a peptidszintéza?

Egy bizonyos aminosavszekvencia létrehozása

Peptid aminosavmaradékokból áll, amelyeket peptidkötések kötnek össze.

A peptid-szintézis célja ezen kötések létrehozása egy előre meghatározott sorrendben, gyakran a következők egyidejű ellenőrzése mellett:

• aminosavak fajtái;
• az aminosavak sorrendje a szekvenciában;
• sztereokémiája;
• N-terminális struktúrák;
• C-terminális struktúrák;
• oldallánc-módosítások;
• a diszulfidhidak eloszlása;
• ciklizálás;
• egyéb szükséges szerkezeti jellemzők.

A szekvencia alapvető fontosságú, mivel azonos aminosav-összetétel is különböző molekulák kialakulásához vezethet, ha az aminosavak más sorrendben vannak.

Annak a kijelentése, hogy egy adott molekula „öt aminosavból álló peptid”, így nagyon kevés információt nyújt a tényleges szerkezetéről. Ahhoz, hogy helyesen lehessen írni a molekulát, ismerni kell az aminosavak típusát, sorrendjét, sztereémiáját, a végcsoportokat, valamint az esetleges további módosításokat.

Két peptidnek lehet tehát pontosan ugyanaz az aminosavösszetétele, és mégis különböző molekuláris szerkezetűek lehetnek.

További eltérések adódhatnak a láncvégmódosulásokból, diszulfidhidak jelenlétéből, a ciklikus vázból, az oldalláncok változásaiból vagy az eltérő sztereokémiai konfigurációból.

A kémiai peptidszintézis általában olyan aminosavakat használ fel, amelyek reaktív csoportjai szelektíven védve vannak.

Az átmeneti védőcsoportok lehetővé teszik egy adott szándékos kémiai kötés létrehozását, miközben korlátozzák a versengő reakciókat a molekula más részein.

A szintézis következő tervezett lépéseiben ezeket a csoportokat eltávolítják vagy megváltoztatják.

Ellenőrzött reakció a spontán egyesülés helyett

Az alapvető kémiai leírásokban a peptidkötés kialakulását gyakran kondenzációs reakcióként ábrázolják, amelynek során két aminosav egyesül, és eközben egy vízmolekula szabadul fel.

Egy ilyen egyenlet leírja a reakció általános mérlegét.

Ezt azonban nem szabad azonosítani azzal a módszerrel, ahogyan a gyakorlatban a szintetikus peptidek ellenőrzött szintézisét végzik.

A szabad aminosavak egyszerű összekeverése önmagában nem tenné lehetővé a következő tényezők megbízható meghatározását:

• melyik aminopcsoportnak kell reagálnia;
• melyik karboxilcsoportnak kell reagálnia;
• melyik aminosavnak kell az elsőnek lennie;
• amelynek a második helyen kell szerepelnie;
• reagálni fognak az oldalláncok;
• megmarad-e a sztereokémia;
• nem keletkeznek-e számos nem kívánt termékek.

A gyakorlati kémiai szintézisben tehát szabályozott stratégiákat alkalmaznak a funkcionális csoportok aktiválására és védelmére.

A karboxilcsoportból származó csoportot általában úgy aktiválják, hogy hatékonyan reagálhasson a kiválasztott aminocsoporttal. A védőcsoportok, a reakció sorrendje, a hordozó kémiai tulajdonságai, a kapcsoló reagensek, az oldószer-környezet és az izolálási módszerek együttesen segítik a reakciót a kívánt termék irányába terelni.

A hatékony peptidszintézis tehát megköveteli mind a végbemenő, mind a megakadályozandó kémiai folyamatok ellenőrzését.

Jó példa erre az aszpartimid képződése.

A kutatók egy alternatív módszert dolgoztak ki a karboxilcsoport védelmére, amelynek célja ezen problematikus mellékreakció korlátozása volt a peptid szintézise során. [2]

A kutatás a peptidkémia egy általánosabb elvét mutatja be: a nemkívánatos molekuláris átalakulások megelőzése ugyanolyan fontos lehet, mint a megfelelő peptidkötés kialakítása.

Mikor tekinthető egy peptid késznek?

A lineáris peptidváz létremanak befejezése nem mindig jelenti az egész szintézis végét.

A célt molékulától függően a lánc összeállítása után további lépésekre lehet szükség.

Ezek maguk in foglalhatják:

• a védőcsoportok teljes eltávolítása;
• peptid leválasztása a szilárd hordozóról;
• ideiglenes jelölők eltávolítása;
• ciklizációt;
• oxidáció;
• diszulfidhidak képződése;
• gyűrődés;
• ragozást;
• láncvég-módosítást;
• tisztítás;
• analitikus jellemzést.

Bizonyos peptidek a lánc felépülése után viszonylag kevés további szerkezeti módosítást igényelnek.

Más esetekben a későbbi szakaszok kulcsfontosságúak.

Jó példa erre a szarvasmarha hasnyálmirigy tripszin-inhibitor (BPTI) szintézise. A kutatók összeállították a lineáris szekvenciát, megtisztították az anyagot, majd diszulfid-hídakat tartalmazó, feltekeredett szerkezetet hoztak létre. A tanulmányban bemutatott elemzések és funkcionális összehasonlítások szerint a természetes szekvenciájú végső anyag a vizsgált paraméterek tekintetében megfelelt a természetes fehérjének. [3]

Ez a példa bemutatja a különbséget a peptidváz összeállítása és a teljesen jellemzett végső molekuláris forma elérése között.

Az a módszer, amely lehetővé teszi a helyes lineáris szekvencia elérését, nem igazolja automatikusan:

• megfelelő feltekeredés;
• a megfelelő diszulfidhidak kialakításának;
• biológiai aktivitás;
• stabilitás;
• szennyezési profil;
• adott alkalmazásra való alkalmasságát.

Mindezek a kérdések külön-külön bizonyítást igényelnek.

Kémiai szintézis, biológiai expresszió és kombinált módszerek

A kémiai peptidszintézis során a előre elkészített molekuláris blokkokat kapcsolják össze ellenőrzött laboratóriumi reakciókban.

A biológiai expresszió ezzel szemben a sejt gépezetét használja fel a kódolt aminosavszekvencia előállítására. Ezt követően az anyagot ki kell nyerni, meg kell tisztítani, és szükség esetén további feldolgozásnak kell alávetni.

Mindkét módszer vezethet peptidek vagy polipeptidek előállításához, de eltérő lehetőségekkel és korlátokkal járnak.

A kémiai szintézis különösen hasznos lehet, ha szükség van a következőkre:

• kiválasztott nem-szabványos aminosavak;
• kémiai módosítások adott helyeken;
• meghatározott láncvég-struktúrák;
• izotópjelölések;
• peptidgerinc-módosítások;
• egyéb, a standard biológiai expresszió útján nehezen elérhető tulajdonságok.

A biológiai expresszió vonzó lehet megfelelő hosszabb szekvenciák vagy meghatározott jelölési stratégiák esetén, de nem küszöböli ki a gyártás későbbi szakaszain jelentkező problémákat.

Még mindig figyelembe kell venni az anyag visszanyerését, a hajtogatást, a feldolgozást, a gazdaszervezettől származó szennyeződéseket, a tisztítást és az analitikai jellemzést.

Ezért egyik módszer sem a legkedvezőbb minden helyzetben.

A 20–40 aminosavmaradékból álló polipeptidek összehasonlításakor mind a szekvencia hossza, mind az aggregációs hajlamuk befolyásolta a szilárd fázisú szintézis és a bakteriális expresszió eredményeit. [1]

Ezek a megfigyelések alátámasztják azt a megközelítést, amelyben a gyártási módszert az adott molekulához igazítják.

A teljesítményre, a költségekre, a felszerelésre és a gyártási időre vonatkozó történelmi adatokat nem szabad univerzális modern értékként kezelni, mivel a technológiák, a reagensek, az automatizálás, a tisztítási módszerek és a gyártás gazdaságossága a technológia fejlődésével együtt változnak.

Szilárd fázisú peptidoszintézis

A növekvő lánc egy oldhatatlan hordozóhoz van kapcsolva

A szilárd fázisú peptidszintézisben (SPPS) a növekvő peptidlánc az egymást követő szintézis-ciklusok során oldhatatlan hordozóhoz kötve marad.

Hordozóként leggyakrabban funkcionalizált polimergyantát használnak.

A linker, azaz összekötő elem, a peptidet a hordozóhoz kapcsolja, és többek között befolyásolja a kész lánc későbbi felszabadulásának módját, valamint a kapott végcsoport típusát.

Az SPPS egyik fő gyakorlati előnye az anyag könnyebb szétválasztása.

Egy adott reakciólépés végén az oldható reagensek és a számos oldható melléktermék mosással eltávolítható, míg a növekedő peptid a szilárd fázishoz kötve marad.

Ennek köszönhetően minden egyes újabb aminosav hozzáadása után nem kell a növekvő peptidet külön, szabad vegyületként izolálni és tisztítani.

Ez a kényelem azonban fontos félreértéshez vezethet.

A gyanta átmosása nem jelenti azt, hogy az összes hibás peptid eltávolításra került.

Ha a gyantához kötött lánc nem reagál az egyik kapcsolási lépés során, még rajta maradhat a hordozón.

A következő ciklusokban ismét reagálhat és tovább nyúlhat.

Ennek eredményeként deléciós szekvencia jöhet létre, azaz egy olyan molekula, amely egy vagy több aminosavmaradék hiányában eltér a célpeptidtől.

A gyantához kötött, hasonló módon kémiailag módosított vagy nem teljesen deblokkolt láncok részt vehetnek a szintézis további lépéseiben.

Az SPPS ezért megkönnyíti az oldható anyagok elválasztását a gyantához kötött anyagtól.

Ez azonban nem garantálja a szekvenciák tökéletes egyezését.

A kioldási és összekapcsolási ciklus ismétlődése

A tipikus lépéses SPPS-szintézis három alapvető művelet ismétléséből áll:

biztosítás kitörlése → összekapcsolás → átöblítés.

Először a növekvő lánc végén található reaktív aminoport tárják fel.

Ezután egy újabb védett aminosav kapcsolódik a lánchoz.

Az oldható reagensek, az aminosav-felesleg és a számos reakciótermék eltávolításra kerül a következő ciklus megkezdése előtt.

Ennek a folyamatnak az ismétlése lehetővé tőle egy peptid felépítését aminosav-maradékonként.

A klasszikus SPPS-ben a C-terminális aminosav általában először kapcsolódik a hordozóhoz, majd a lánc az N-terminális felé hosszabbodik.

Ez eltér a standard riboszómális fehérjeszintézistől, amelynek során az egymást követő aminosavak a növekvő lánc C-terminálisához kapcsolódnak.

A végső aminosavsorrend azonban azonos lehet annak ellenére, hogy a hajtogatási folyamat iránya és kémiája eltérő.

A „ciklus” kifejezést nem úgy kell értelmezni, mint minden egyes maradékra és minden egyes szekvenciára alkalmas egyetlen univerzális reakciókörülmény-készletet.

A reakció lefolyása függhet a következőktől:

• védelmi csoportok stratégiái;
• aminosav típusú;
• a reakció helye körüli térbeli viszonyoknak;
• gyanta típusú;
• linkera;
• lánchosszak;
• aggregáció;
• oldószeré;
• kapcsolási kémia;
• a növekvő peptid szerkezeti viselkedésének.

A szintézis kezdetén könnyen végbemenő reakció a későbbi szakaszban lényegesen nehezebbé válhat.

Ezért a folyamat monitoringa a erősen automatizált rendszerekben is fontos marad.

Miért számítanak a gyanta tulajdonságai?

A tartós adathordozó nem csupán egy passzív tároló.

Fizikai és kémiai tulajdonságai közvetlenül befolyásolhatják a reakció lefolyását.

Az egyik fontos paraméter a duzzadás.

Ha a gyanta megfelelően duzzad a kiválasztott oldószeres közegben, a reagensek könnyebben eljuthatnak a polimer szerkezetében mindenhol megtalálható reaktív helyekre.

A gyanta elégtelen duzzadása vagy szerkezeti változásai korlátozhatják ezt a hozzáférést.

Jelentőséggel bírhatnak még:

• állománysűrűség;
• polimer-architektúra;
• linkerszerkezet;
• oldószerállóság;
• mechanikai stabilitás;
• porozitás;
• diffúziós tulajdonságok;
• a növekvő peptidláncok közötti kölcsönhatások.

A peptid hosszának növekedésével az egyes láncok is kölcsönhatásba léphetnek egymással.

A gyantán történő aggregáció korlátozhatja a reaktív helyekhez való hozzáférést, és nem teljes kapcsolódáshoz vagy nem teljes deblokkoláshoz vezethet.

Ez azt jelenti, hogy a szintézis elején még megfelelően viselkedő szekvencia a lánc növekedésével egyre nehezebbé válhat.

A kutatók egy változtatható ágyas átfolyásos reaktort fejlesztettek ki, amely lehetővé tette a gyanta duzzadásának monitoringját nyomással kapcsolatos mérések alapján. [4]

A vizsgálat a gyantán történő aggregációt és a hiányos kötésképződést vizsgálta olyan folyamatbeli problémákként, amelyek más körülmények között a szintézis során közvetlenül nehezen figyelhetők meg.

Ez azt mutatja, hogy a hordozó fizikai viselkedésének felügyelete olyan információkkal szolgálhat, amelyek túllépnek magának a hozzáadott reagensnek a rögzítésén.

Mire használják a Wang-gyantát?

A Wang-linker-kémia széles körben alkalmazható a szilárd fázisú peptidszintézisben (SPPS), ha a peptid hasítása után karbonsav oldalláncú C-terminális kívánatos.

A peptid egy észter típusú kötés útján kapcsolódik, amely megfelelő körülmények között később hasítható.

Más linkerrendszerek is választhatók, amikor eltérő C-terminális szerkezetre, például amidra van szükség.

Érdemes különbséget tenni a linker kémiája és a teljes fizikai hordozó között.

A kapcsolódó Wang-típusú linkerek különböző polimer architektúrákba építhetők be.

Az ilyen anyagoknak nem kell azonosakkal rendelkezniük:

• duzzadási tulajdonságok;
• kapacitások;
• oldószer-állóság;
• mechanikai tulajdonságok;
• viselkedés reakció alatt.

A peptitil-Wang-TentaGel hordozókkal végzett vizsgálatok egy speciális alternatív módszert mutattak ki a peptidhidrazidok előállítására, amelyek hasznos közbenső termékek a peptmkémiában.

Ez nem jelenti azt, hogy a Wang-gyantáról történő szokásos hasítás általában peptidhrazidok képződéséhez vezet.

Ugyanakkor egy fontos elvet mutat:

A hordozó + linker + reakciókörülmények + hasítási kémia együttesen határozzák meg a kapott terméket.

Az SPPS szintézis batch és áramlásos rendszerben

Az SPPS végezhető klasszikus szakaszos edényekben vagy olyan rendszerekben, amelyekben a reagensek átfolynak a szilárd hordozót tartalmazó reaktoron.

A áramlásos rendszerek lehetővé teszik a reagensek gyorscseréjét és a gyantát körülvevő kémiai környezet pontosabb szabályozását.

Egy 2014-es tanulmány bemutatta a gyors áramlási rendszerű peptidszintézist folyamatos monitoringgal, és ezt számos peptidre, valamint egy kis fehérjére alkalmazta. [6]

Egy későbbi automatizált vizsgálatban szignifikánsabb gyorsabb láncösszeállítást írtak le, amellyel az elemzett példák esetében a klasszikus szakaszos szintézissel összehasonlítható nyers terméktisztaságot és izolálás utáni hozamot értek el. [7]

Ezek a vizsgálatok bemutatják a konkrét rendszerek lehetőségeit meghatározott körülmények között.

Ez azonban nem bizonyítja, hogy minden peptid előállítható ugyanolyan gyorsan és ugyanolyan minőségben.

A peptid előállításához szükséges idő ráadásul magában foglal sokkal többet is, mint csupán magát a láncépítést.

A teljes folyamat magában foglalhatja:

• reagensek előkészítése;
• gyanta előkészítése;
• kapcsolás;
• biztosítástalanítás;
• öblítés;
• szakadás;
• a termék feldolgozását;
• tisztítás;
• oldószerek eltávolítása;
• végső alakítás;
• laboratóriumi vizsgálatok;
• dokumentációt.

A gyors kötésimplettálás ezért csak az egyik eleme a teljes gyártási hatékonyságnak.

Folyadékfázisú szintézis

Mit jelent ez a kifejezés?

A „folyadékfázisú peptidszintézis” kifejezés több értelemben is használható.

Tágan értelmezve egyszerűen jelentheti oldatfázisú peptidszintézist is.

A szakszerűbb irodalomban azonban gyakran különbséget tesznek:

1. a klasszikus, oldatfázisú peptidszintézist;
2. szilárd fázisú peptidszintézist;
3. az LPPS újabb módszerei, amelyekben a növekvő lánc oldható jelölőt vagy hordozót tartalmaz.

Ez a megkülönböztetés azért fontos, mert megváltozik a termék szétválasztásának és visszanyerésének módja.

A szabadon oldott, védett peptid közbenső termék igényelheti az izolálást a saját fizikai és kémiai tulajdonságainak felhasználásával.

Jelölt félkész termék esetén a jelölő úgy tervezhető meg, hogy megkönnyítse a kicsapást, az extrakciót, a membránon történő visszatartást vagy más elválasztási módszert.

Az LPPS-ről szóló áttekintés világosan különbséget tesz a klasszikus szintézis oldatban, az SPPS és az oldható jelölőket használó módszerek között. [8]

A kiadvány hasznos a terminológia és a módszertan rendszerezéséhez.

Ez azonban nem értelmezhető úgy, mint egyetlen olyan kísérlet, amely bizonyítja, hogy az egyik módszer a legjobb minden peptid számára.

Klasszikus oldatfázisú peptidszintézis

A klasszikus oldatfázisú szintézisben a védett aminosavak, peptidféltermékek vagy fragmentumok a reakcióközegben oldva maradnak ahelyett, hogy kovalensen egy oldhatatlan gyantához lennének kapcsolva.

A reakció befejezése után a megfelelő köztes termék izolálható, tisztítható, és szükség esetén jellemezhető a következő lépés megkezdése előtt.

Ennek lehetnek bizonyos előnyei.

A kutatók:

• jellemezni az egyes félkész termékeket;
• a tisztítási módszert az adott félkész termékhez igazítani;
• optimalizálni az egyes átalakításokat;
• függetlenül elkészíteni a részleteket;
• módosítani a szintézisútvonalat, amikor egy bizonyos köztermék problémát okoz.

Az oldatban történő szintézis azonban jelentős nehézségekkel is járhat.

A lánc növekedésével a peptidek:

• rosszul oldódóvá válni;
• összesít;
• nehéz kristályosítani;
• szorosan rokon szennyeződéseket hozni létre;
• nehéz szétválasztani;
• többszörös szigetelést igényel;
• anyagveszteséget okozni a megmunkálás későbbi szakaszaiban.

A szintézis oldatban tehát nem automatikusan egyszerűbb vagy könnyebben skálázható, mint az SPPS.

Hasznossága az adott szekvenciától, a köztermékek stabilitásától, oldhatóságától, a szintézisút hosszától, a tisztítás során tanúsított viselkedéstől, valamint a további izolálási lépések hatékonyságától függ.

A jelölt LPPS-stratégiák fejlesztése részben ezen, az anyagleválasztással és -kezeléssel kapcsolatos problémák megoldására tett kísérletekből ered. [8]

Az oldódó markerek összekötik a reakciótervezést a szétválasztási tervezéssel

A jelzett LPPS-ben a növekvő peptid olyan ideiglenes molekuláris kapcsolattal rendelkezik, amelyet úgy terveztek, hogy befolyásolja a fizikai tulajdonságait.

A címke elősegítheti a peptid megfelelő oldhatóságának fenntartását a reakció során, majd megkönnyítheti annak szelektív visszanyerését.

A technológiától függően a szétválasztás alkalmazhat:

• kicsapás;
• kihúzás;
• membránvisszatartás;
• fázisviselkedés;
• más tulajdonságok, amelyek a címke jelenlétéből fakadnak.

Az egyik kísérleti stratégia egy hosszú láncú C-terminális védőcsoportot használt peptidamidok előállítására.

Az ismételt reakciók és kicsapási lépések lehetővé tették a kutatók számára egy olyan hidrofób peptid előállítását, amelyet az általuk alkalmazott összehasonlításban az SPPS módszerrel kielégítően nehéz volt előállítani. [9]

Ez mutatja ennek a konkrét stratégiának a hasznosságát az elemzett szekvencia szempontjából.

Ez azonban nem bizonyítja a jelzett szintézis univerzális előnyét.

A jelölő a gyártási folyamat részévé válik, és saját kérdéseket vet fel:

• Mennyire hatékonyan csatlakozik?
• Megváltoztatja a reakció menetét?
• Hogyan lehet megbízhatóan visszanyerni a megjelölt félkész terméket?
• Vezet új szennyeződések keletkezéséhez?
• Hogyan távolítják el?
• Megerősíthető a teljes törlés?
• Milyen analitikai módszerek igazolják a hiányát a végtermékben?

Az oldódó jelölőket ezért a folyamattervezés funkcionális elemeiként kell kezelni, nem pedig kizárólag egyszerű címkékként.

A fő módszerek összehasonlítása

Porównanie przedstawia ogólne zasady działania poszczególnych metod.

Nie określa, która z nich zapewni najlepszą wydajność, czystość, koszt, zrównoważenie środowiskowe czy możliwość skalowania dla konkretnej sekwencji.

Parametry te należy oceniać na podstawie rzeczywistej cząsteczki i konkretnego procesu produkcyjnego. [4] [8] [9]

Łączenie fragmentów i produkcja hybrydowa

Peptyd nie zawsze musi być tworzony w jednym nieprzerwanym procesie polegającym na dodawaniu kolejnych reszt aminokwasowych.

Alternatywną strategią jest oddzielne przygotowanie krótszych fragmentów peptydowych, a następnie ich połączenie.

Proces hybrydowy może na przykład wykorzystywać SPPS do otrzymywania poszczególnych fragmentów oraz chemię w roztworze do ich łączenia.

Strategie fragmentowe mogą ograniczać niektóre problemy związane z bardzo długą syntezą etapową.

Wprowadzają jednak nowe wyzwania, takie jak:

• wybór odpowiedniego miejsca połączenia;
• rozpuszczalność fragmentów;
• aktywacja miejsca łączenia;
• chemoselektywność;
• zachowanie stereochemii;
• reakcje uboczne;
• oczyszczanie fragmentów;
• oczyszczanie po ich połączeniu.

Ważnym przykładem kontrolowanego łączenia fragmentów jest natywna ligacja chemiczna.

W klasycznej wersji tioester peptydowy reaguje z drugim peptydem zawierającym N-końcową cysteinę. Następujące później przegrupowanie prowadzi do utworzenia prawidłowego wiązania w szkielecie peptydowym w miejscu ligacji.

Pierwotne badania wykazały możliwość uzyskania po ligacji i fałdowaniu białka zawierającego mostki disiarczkowe. [10]

Potwierdza to znaczenie tej strategii łączenia fragmentów.

Nie oznacza jednak, że dowolne dwa niezmodyfikowane fragmenty peptydowe mogą spontanicznie się połączyć.

Sprzęganie i grupy ochronne

Sprzęganie tworzy zamierzone połączenie

Sprzęganie jest etapem reakcji, podczas którego pomiędzy wybranymi jednostkami powstaje nowe wiązanie peptydowe.

Zazwyczaj grupa pochodząca od grupy karboksylowej jest aktywowana tak, aby mogła skutecznie reagować z odpowiednią grupą aminową.

Chemia aktywacji musi być zgodna z:

• rosnącą sekwencją;
• tymczasowymi grupami ochronnymi;
• ochroną łańcuchów bocznych;
• stereochemią;
• nośnikiem lub znacznikiem;
• środowiskiem rozpuszczalnika;
• innymi grupami funkcyjnymi obecnymi w cząsteczce.

Skuteczne sprzęganie jest szczególnie ważne w syntezie etapowej, ponieważ niepełna reakcja może prowadzić do powstawania sekwencji delecyjnych.

Jeżeli jeden etap dodawania aminokwasu nie powiedzie się dla części rosnących łańcuchów, takie łańcuchy mogą pozostać w układzie i uczestniczyć w kolejnych cyklach.

W efekcie mogą powstać cząsteczki bardzo podobne do docelowego peptydu, ale pozbawione jednej reszty.

Nawet niewielkie nieefektywności mogą więc kumulować się podczas wielu etapów syntezy.

Prosty przykład matematyczny dobrze ilustruje ten problem.

Jeżeli każdy z 50 niezależnych etapów składania miałby 99% prawdopodobieństwa powodzenia, odsetek cząsteczek, dla których wszystkie etapy zakończyłyby się sukcesem, wynosiłby:

0,99^50 ≈ 0,605

czyli około 61%.

Jest to wyłącznie ilustracja matematyczna.

Nie stanowi prognozy rzeczywistej czystości ani wydajności syntezy peptydu zawierającego 50 reszt.

Rzeczywista produkcja obejmuje:

• różne wydajności sprzęgania w poszczególnych pozycjach;
• etapy odbezpieczania;
• reakcje uboczne;
• zależne od sekwencji trudności;
• strategie ponownego sprzęgania;
• straty podczas odszczepiania;
• straty podczas oczyszczania;
• inne zmienne procesowe.

Obliczenie pokazuje jedynie, dlaczego nawet pozornie niewielka nieefektywność pojedynczego etapu może nabrać dużego znaczenia w wieloetapowej syntezie.

Grupy ochronne kontrolują miejsce reakcji

Aminokwas może posiadać kilka chemicznie reaktywnych grup.

Bez selektywnej kontroli reakcje sprzęgania mogłyby zachodzić w niepożądanych miejscach.

Grupy ochronne tymczasowo blokują wybrane miejsca reaktywne.

Grupa aminowa wykorzystywana do wydłużania łańcucha zazwyczaj wymaga tymczasowej ochrony, natomiast reaktywne łańcuchy boczne mogą wymagać zabezpieczenia pozostającego na miejscu przez wiele cykli syntezy.

Połączenie z nośnikiem również musi przetrwać te etapy aż do momentu zaplanowanego odszczepienia.

Wybór grup ochronnych wpływa więc na całą strategię syntezy.

Należy uwzględnić:

• sposób ich wprowadzania;
• stabilitás;
• sposób usuwania;
• zgodność z innymi grupami ochronnymi;
• zgodność z nośnikiem;
• reakcje uboczne;
• wpływ konkretnej sekwencji;
• końcowe warunki odbezpieczania.

Badania wykorzystujące ochronę opartą na cyjanosulfurylidzie dotyczyły powstawania aspartimidu poprzez zmianę sposobu zabezpieczenia grupy karboksylowej. [2]

Wyniki pokazują, że strategia grup ochronnych wpływa nie tylko na to, czy zamierzona reakcja może zajść, ale również na to, jakie niepożądane reakcje stają się możliwe.

Fmoc, Boc i ochrona ortogonalna

Fmoc i Boc należą do szeroko stosowanych grup chroniących grupy aminowe.

Istotnie różnią się sposobem usuwania.

Fmoc jest zazwyczaj usuwany w warunkach zasadowych, natomiast Boc jest wrażliwy na warunki kwaśne.

Właściwości te pozwalają stosować je jako elementy szerszych strategii ochrony.

W popularnej SPPS opartej na Fmoc tymczasowa ochrona N-końcowa Fmoc jest wielokrotnie usuwana, podczas gdy wybrane grupy ochronne łańcuchów bocznych oraz połączenie z żywicą pozostają nienaruszone do późniejszych etapów.

Inne strategie mogą wykorzystywać odmienne kombinacje.

Szczególnie ważnym pojęciem jest ochrona ortogonalna.

Dwie grupy ochronne są uznawane za ortogonalne, jeśli jedną można selektywnie usunąć w warunkach, w których druga pozostaje wystarczająco stabilna, aby możliwe było dalsze prowadzenie syntezy.

Ortogonalność jest więc praktyczną relacją zgodności chemicznej.

Nie oznacza, że każda zabezpieczona grupa pozostanie całkowicie niezmieniona po nieograniczonej liczbie ekspozycji na wszystkie warunki reakcji.

Reakcje uboczne nadal mogą występować.

W badaniach syntezy Fmoc opisano zarówno powstawanie aspartimidu, jak i niepożądane zmiany stereochemiczne mimo zakładanej selektywności ogólnej strategii ochronnej. [11]

Stereochemia jest częścią tożsamości cząsteczki

Wiele aminokwasów posiada centrum chiralne.

Oznacza to, że ich atomy mogą przyjmować różne układy przestrzenne odpowiadające różnym formom stereochemicznym.

Zmiana konfiguracji jednego centrum stereogenicznego może prowadzić do powstania innej struktury peptydu bez konieczności zmiany jego nominalnej masy.

Dlatego sama masa nie może potwierdzić pełnej tożsamości peptydu.

Epimeryzacja zazwyczaj oznacza zmianę konfiguracji jednego centrum stereogenicznego w cząsteczce zawierającej kilka takich centrów.

Racemizacja jest również często omawiana w chemii peptydów w kontekście utraty integralności stereochemicznej reszt aminokwasowych.

Zmiany te są istotne, ponieważ rozpoznawanie molekularne może silnie zależeć od przestrzennego ułożenia atomów.

Dwie cząsteczki o tym samym składzie pierwiastkowym i nominalnej masie mogą więc zachowywać się inaczej, jeśli różnią się stereochemią.

W badaniu syntezy Fmoc wspomaganej mikrofalami stwierdzono, że niektóre reszty były podatne na niepożądane zmiany stereochemiczne w zastosowanych warunkach. Modyfikacja metody ograniczała występowanie tych reakcji. [11]

Nie oznacza to, że ogrzewanie z definicji uszkadza wszystkie peptydy.

Prawidłowy wniosek jest taki, że przyspieszanie reakcji należy oceniać razem z zależną od sekwencji selektywnością chemiczną.

Aspartimid i inne pokrewne zanieczyszczenia

Powstawanie aspartimidu jest znaną reakcją uboczną dotyczącą określonych sekwencji zawierających asparaginian.

Może powstać niepożądany cykliczny półprodukt, z którego następnie tworzą się związki o zmienionej łączności szkieletu lub stereochemii.

Prawdopodobieństwo tej reakcji zależy od sekwencji oraz warunków procesu.

Inne zanieczyszczenia związane z syntezą mogą wynikać z:

• niepełnego sprzęgania;
• niepełnego odbezpieczania;
• powstawania sekwencji delecyjnych;
• reakcji łańcuchów bocznych;
• zmian stereochemicznych;
• reakcji podczas odszczepiania;
• utleniania;
• przegrupowań;
• warunków obróbki produktu;
• niepełnego usunięcia grup ochronnych.

Niektóre zanieczyszczenia powodują łatwo zauważalną zmianę masy cząsteczkowej.

Inne są znacznie trudniejsze do rozróżnienia.

W badaniach analitycznych syntetycznego peptydu będącego substratem reniny zidentyfikowano wiele zanieczyszczeń, w tym składniki wykazujące taką samą zmianę masy, ale zawierające modyfikacje w różnych pozycjach. [12]

Do ich rozróżnienia potrzebna była dodatkowa analiza strukturalna.

Badacze traktowali również proponowane mechanizmy powstawania tych zanieczyszczeń jako hipotezy.

Jest to ważne rozróżnienie:

ustalenie, czym jest zanieczyszczenie, oraz udowodnienie dokładnego mechanizmu jego powstania to dwa odrębne pytania naukowe.

Nie należy przedstawiać prawdopodobnego mechanizmu jako potwierdzonego wyłącznie dlatego, że odpowiada obserwowanej masie cząsteczkowej.

Oczyszczanie, skalowanie i jakość produkcji

Produkt surowy, produkt oczyszczony i wydajność

Surowy peptyd to materiał otrzymany przed zakończeniem odpowiednich etapów oczyszczania.

Może zawierać:

• docelowy peptyd;
• deletációs szekvenciák;
• materiał niecałkowicie odbezpieczony;
• zmodyfikowane sekwencje;
• pozostałości odczynników;
• produkty związane z odszczepianiem;
• sole;
• oldószerek;
• inne składniki powstające w procesie.

Oczyszczanie ma na celu oddzielenie właściwego peptydu od tej mieszaniny.

Należy wyraźnie rozróżnić trzy pojęcia:

czystość produktu surowego — zmierzony skład materiału przed końcowym oczyszczaniem;

wydajność produktu oczyszczonego lub wyizolowanego — ilość odzyskanego materiału docelowego względem określonej wartości początkowej lub teoretycznej;

czystość końcowa — skład wyizolowanego materiału określony za pomocą konkretnej metody analitycznej.

Pojęcia te nie są wymienne.

Proces może prowadzić do powstania dużej ilości surowego materiału, ale umożliwiać odzyskanie stosunkowo niewielkiej ilości oczyszczonego produktu.

Inny proces może dawać mniej materiału surowego, ale charakteryzować się wysoką selektywnością tworzenia produktu docelowego.

Podobnie wysoka czystość analityczna nie musi oznaczać wysokiej wydajności produkcyjnej.

W badaniach przyspieszonej syntezy przepływowej prawidłowo raportowano osobno czystość materiału surowego i wydajność po izolacji. [7]

Chromatografia rozdziela składniki, ale nie odpowiada na każde pytanie

Wysokosprawna chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) jest szeroko stosowana do analizy i oczyszczania peptydów.

Różne cząsteczki w odmienny sposób oddziałują z fazą stacjonarną i ruchomą.

W odpowiednich warunkach różnice te umożliwiają rozdzielanie składników mieszaniny.

Chromatografia analityczna i preparatywna mają powiązane, ale odmienne zastosowania.

Analityczna HPLC służy przede wszystkim do badania składu próbki.

Preparatywna HPLC jest wykorzystywana do fizycznego zbierania rozdzielonych składników.

Chromatogram może dostarczać wielu wartościowych informacji.

Dużego głównego piku lub wysokiego procentowego udziału jego powierzchni nie należy jednak traktować jako pełnej charakterystyki molekularnej.

Wyniki chromatografii zależą między innymi od:

• rodzaju kolumny;
• fazy ruchomej;
• gradiens;
• hőmérsékletek;
• metody detekcji;
• długości fali;
• przygotowania próbki;
• sposobu integracji pików;
• rozdzielczości;
• właściwości zanieczyszczeń.

Dwa związki mogą potencjalnie eluować w tym samym czasie.

Niektóre składniki próbki mogą również różnie reagować na zastosowany detektor.

Dlatego wysoka czystość powierzchniowa w HPLC nie jest równoznaczna z pełnym potwierdzeniem tożsamości molekularnej.

Badania izobarycznych zanieczyszczeń peptydowych oraz analizy chiralnej pokazują, dlaczego mogą być potrzebne uzupełniające metody analityczne. [12] [13]

Metoda analityczna musi odpowiadać konkretnemu pytaniu strukturalnemu.

Tożsamość, czystość i zawartość oznaczają różne rzeczy

W charakterystyce peptydów szczególnie ważne są trzy pojęcia.

Az identitás arra a kérdésre válaszol, hogy:

Czy w próbce znajduje się zamierzona cząsteczka?

A tisztaság arra a kérdésre válaszol, hogy:

Jakie inne składniki znajdują się w próbce lub jaka część mierzonego sygnału odpowiada głównemu składnikowi?

Zawartość odpowiada na pytanie:

Ile rzeczywistego peptydu znajduje się w próbce?

Na te pytania nie zawsze można odpowiedzieć za pomocą jednego pomiaru.

Materiał zawierający peptyd może również zawierać:

• wodę;
• ellenionok;
• sole;
• oldószer-maradványok;
• inne składniki związane z procesem;
• zanieczyszczenia.

Całkowita masa odważonego materiału nie musi więc odpowiadać masie samego peptydu.

Podobnie zgodność zmierzonej masy cząsteczkowej z wartością teoretyczną nie potwierdza:

• kompletnej sekwencji aminokwasowej;
• prawidłowej łączności poszczególnych reszt;
• integralności stereochemicznej;
• a diszulfidhidak eloszlása;
• fałdowania;
• braku izobarycznych zanieczyszczeń.

Spektrometria mas może dostarczać silnych dowodów dotyczących masy cząsteczkowej.

Tandemowa spektrometria mas i inne techniki strukturalne mogą dostarczać dodatkowych informacji o sekwencji.

Metody chiralne pozwalają analizować zagadnienia stereochemiczne, których nie można rozstrzygnąć zwykłym pomiarem masy.

W jednym z badań analitycznych uwzględniono nawet racemizację powstającą podczas przygotowania próbki. Pokazuje to kolejną ważną zasadę: sama procedura analityczna może powodować artefakty, jeśli nie zostanie odpowiednio zaprojektowana. [13]

Fałdowanie i aktywność mogą wymagać osobnego potwierdzenia

W przypadku strukturalnie ograniczonych peptydów i małych białek prawidłowa sekwencja oraz masa cząsteczkowa nadal mogą być niewystarczające do potwierdzenia zamierzonej struktury końcowej.

Dodatkowe pytania mogą obejmować:

• Czy powstały właściwe mostki disiarczkowe?
• Czy cząsteczka przyjęła oczekiwaną konformację?
• Czy cyklizacja jest kompletna?
• Czy obecne są izomery strukturalne?
• Czy syntetyczna cząsteczka wykazuje oczekiwaną aktywność w określonym teście eksperymentalnym?

W badaniu syntezy BPTI wykorzystano kilka metod analitycznych i biofizycznych wraz z oceną hamowania trypsyny. [3]

Łączne wyniki wspierały zgodność syntetycznego materiału o naturalnej sekwencji z naturalnym białkiem w zakresie badanych kryteriów.

Test aktywności odpowiada jednak na określone pytanie funkcjonalne.

Nie zastępuje analizy zanieczyszczeń.

Podobnie podobna aktywność w jednym teście nie potwierdza pełnej równoważności wszystkich właściwości biologicznych, strukturalnych czy produkcyjnych.

Skalowanie produkcji zmienia więcej niż tylko ilość materiału

Zwiększenie skali produkcji nie polega wyłącznie na proporcjonalnym zwiększeniu ilości wszystkich odczynników.

Procesy fizyczne mogą zachowywać się inaczej przy większej skali.

Znaczenie mogą mieć:

• mieszanie;
• wymiana ciepła;
• rozprowadzanie odczynników;
• dyfuzja;
• pęcznienie żywicy;
• ciśnienie;
• filtracja;
• gospodarka rozpuszczalnikami;
• kicsapás;
• rozpuszczalność półproduktów;
• transport masy;
• możliwości systemu oczyszczania.

Czynniki te mogą wpływać zarówno na przebieg reakcji, jak i na powstawanie zanieczyszczeń.

Oczyszczanie na późniejszych etapach również może stać się wąskim gardłem całej produkcji.

Zwiększenie szybkości syntezy ma ograniczone znaczenie, jeśli system oczyszczania nie jest w stanie skutecznie rozdzielić powstających zanieczyszczeń lub odzyskać produktu o wymaganej jakości.

W analizie przemysłowej obejmującej 40 procesów syntezy peptydów z 14 firm farmaceutycznych oceniano zużycie materiałów podczas syntezy, oczyszczania i izolacji. [14]

Badanie pokazuje, dlaczego ocenę produkcji należy prowadzić dla całego procesu.

Nie oznacza jednak, że każda fabryka, sekwencja lub technologia produkcyjna osiąga identyczne wyniki.

Jakość produkcji jest wynikiem wielu elementów kontroli

Wiarygodna produkcja peptydów wymaga czegoś więcej niż uzyskania jednego satysfakcjonującego wyniku analitycznego.

Kontrolowany proces zazwyczaj obejmuje kilka powiązanych elementów:

zdefiniowana cząsteczka docelowa → odpowiednie materiały wyjściowe → kontrolowana synteza → kontrolowane oczyszczanie → właściwe pobieranie próbek → zwalidowana lub odpowiednia do celu analiza → dokumentacja partii.

Dokumentacja partii łączy wyniki analityczne z materiałem, który rzeczywiście został wyprodukowany.

Certyfikat analizy (COA) podsumowuje wybrane wyniki badań określonej partii.

Jego wartość informacyjna zależy od:

• rodzaju wykonanych badań;
• zastosowanych metod;
• przydatności tych metod;
• specyfikacji;
• identyfikacji próbki;
• możliwości prześledzenia partii;
• potwierdzenia, że raportowane wyniki rzeczywiście dotyczą danego materiału.

Pojedyncza wartość określana jako „czystość” nie może samodzielnie potwierdzić:

• pełnej tożsamości molekularnej;
• zawartości peptydu;
• integralności stereochemicznej;
• poziomu pozostałości rozpuszczalników;
• zawartości wody;
• składu przeciwjonów;
• właściwości mikrobiologicznych;
• fałdowania;
• biológiai aktivitás;
• przydatności do określonego celu.

Odpowiedni zestaw analiz zależy od zamierzonego zastosowania materiału.

Peptyd wykorzystywany jako analityczny materiał odniesienia, odczynnik badawczy stosowany w eksperymencie komórkowym oraz materiał znajdujący się na etapie rozwoju farmaceutycznego mogą wymagać odpowiedzi na inne pytania jakościowe.

Dowody analityczne należy więc interpretować w jasno określonym kontekście, a nie jako uniwersalne potwierdzenie jakości.

Ocena zrównoważenia środowiskowego musi obejmować cały proces

Synteza peptydów może wymagać znacznych ilości rozpuszczalników i odczynników.

Ocena wpływu środowiskowego powinna więc uwzględniać znacznie więcej niż sam etap sprzęgania.

Do istotnych elementów mogą należeć:

• przygotowanie bloków budulcowych;
• odczynniki sprzęgające;
• odczynniki do odbezpieczania;
• öblítés;
• szakadás;
• obróbka produktu;
• chromatografia;
• wymiana rozpuszczalników;
• izolacja;
• szárítás;
• gospodarowanie odpadami.

Zmniejszenie obciążenia środowiskowego może wymagać równoczesnej poprawy kilku etapów.

W opublikowanej analizie dotyczącej produkcji peptydów omówiono problemy związane zarówno z syntezą, jak i oczyszczaniem oraz wskazano potrzebę ulepszania całego projektu procesu. [15]

Jako publikacja perspektywiczna nie stanowi ona kontrolowanego bezpośredniego porównania dowodzącego, że jedna konkretna technologia zawsze jest bardziej przyjazna środowisku.

Hasonlóan:

szybsza synteza nie oznacza automatycznie bardziej ekologicznej syntezy,

a mniejsze zużycie rozpuszczalników podczas samej syntezy nie oznacza automatycznie mniejszego wpływu całego procesu produkcyjnego.

Porównania środowiskowe wymagają stosowania spójnych granic analizy i najlepiej powinny odnosić zużycie zasobów do określonej ilości wyizolowanego i scharakteryzowanego produktu końcowego.

Gyakran ismételt kérdések

1. Czym różni się synteza peptydów na fazie stałej od syntezy w fazie ciekłej?

W syntezie na fazie stałej rosnący peptyd pozostaje przyłączony do nierozpuszczalnego nośnika, natomiast w klasycznej syntezie w roztworze półprodukt peptydowy pozostaje rozpuszczony i zazwyczaj musi być odzyskiwany na podstawie swoich właściwości fizycznych i chemicznych. W węższym znaczeniu LPPS rozpuszczony rosnący łańcuch posiada dodatkowo rozpuszczalny znacznik lub nośnik ułatwiający późniejsze rozdzielanie. Badania syntezy znakowanej pokazują jedną ze strategii łączenia chemii roztworowej z odzyskiwaniem poprzez wytrącanie, natomiast literatura dotycząca LPPS odróżnia takie rozwiązania zarówno od klasycznej syntezy w roztworze, jak i od SPPS. Żadna metoda nie jest z definicji optymalna dla każdego peptydu. Podstawowa różnica dotyczy sposobu fizycznego prowadzenia i rozdzielania rosnącego łańcucha podczas kolejnych etapów syntezy. [8] [9]

2. Dlaczego podczas syntezy peptydów mogą powstawać zanieczyszczenia?

Zanieczyszczenia mogą powstawać dlatego, że zamierzone reakcje nie zawsze zachodzą ilościowo, a inne grupy funkcyjne mogą uczestniczyć w niepożądanych reakcjach. Niepełne sprzęganie może prowadzić do sekwencji delecyjnych, niepełne odbezpieczanie może zakłócać dalsze składanie łańcucha, a niektóre sekwencje są podatne na zmiany stereochemiczne, powstawanie aspartimidu, utlenianie, przegrupowania lub produkty uboczne związane z odszczepianiem. Badania syntezy Fmoc oraz analizy strukturalnej syntetycznych zanieczyszczeń peptydowych dokumentują kilka takich przykładów. [11] [12] Częstość i znaczenie poszczególnych zanieczyszczeń zależą od sekwencji i procesu, dlatego automatyzacji syntezy nie należy utożsamiać z całkowitym brakiem błędów chemicznych.

3. Jaką rolę pełni żywica w syntezie peptydów?

Żywica utrzymuje rosnący peptyd, podczas gdy rozpuszczalne odczynniki i wiele produktów ubocznych można usuwać pomiędzy kolejnymi etapami syntezy. Znacznie upraszcza to powtarzające się składanie łańcucha, ale żywica nie jest wyłącznie mechanicznym uchwytem. Jej pęcznienie, stopień obsadzenia, architektura polimeru, zgodność z rozpuszczalnikami i dostępność miejsc reakcji mogą wpływać na skuteczność docierania odczynników do przyłączonego peptydu. W badaniach z wykorzystaniem reaktora ze zmiennym złożem monitorowano zachowanie żywicy podczas analizy agregacji i efektywności sprzęgania. [4] Takie monitorowanie nie eliminuje błędów sekwencji, ale pokazuje, dlaczego fizyczny stan żywicy może być istotną zmienną procesową.

4. Do czego służy żywica Wanga w syntezie peptydów?

Nośniki typu Wang są powszechnie związane z przygotowywaniem peptydów uwalnianych po odpowiednim odszczepieniu z C-końcem w postaci kwasu karboksylowego. Dokładny produkt końcowy zależy jednak od linkera, architektury nośnika i zastosowanej chemii odszczepiania, a nie tylko od nazwy żywicy. Badacze przedstawili również specjalistyczną metodę przekształcania materiału peptydyl-Wang-TentaGel w hydrazydy peptydowe, które mogą służyć jako użyteczne półprodukty syntetyczne. [5] Alternatywna reakcja nie zmienia znaczenia standardowego odszczepiania z żywicy Wanga. Pokazuje natomiast, dlaczego podczas przewidywania produktu należy analizować cały system nośnika i warunki reakcji.

5. Czy SPPS buduje peptyd od N-końca czy od C-końca?

Klasyczna etapowa SPPS zazwyczaj rozpoczyna się od przyłączenia C-końcowej reszty do nośnika, po czym łańcuch jest wydłużany w kierunku N-końca. Jest to kierunek przeciwny do standardowego wydłużania łańcucha na rybosomie, gdzie białko rośnie poprzez dodawanie kolejnych aminokwasów do C-końca. Synteza BPTI jest przykładem wykorzystania zabezpieczonych bloków budulcowych i nośnika przed późniejszym uwolnieniem, oczyszczaniem i fałdowaniem produktu. [3] Istnieją jednak specjalistyczne strategie chemii peptydów wykorzystujące inne rozwiązania, dlatego budowanie od C- do N-końca należy określać jako klasyczne podejście SPPS, a nie bezwzględną zasadę wszystkich metod syntezy.

6. Dlaczego grupy ochronne są potrzebne?

Aminokwasy często zawierają kilka reaktywnych grup funkcyjnych. Grupy ochronne tymczasowo zapobiegają reakcji wybranych miejsc, pozostawiając odpowiednie miejsce dostępne w konkretnym etapie syntezy. Pomaga to kontrolować kolejność i sposób łączenia reszt. Bez właściwej ochrony konkurencyjne reakcje mogłyby prowadzić do powstawania złożonych mieszanin lub produktów o zmienionej strukturze. Badania dotyczące powstawania aspartimidu pokazały, że zmiana chemii ochrony grupy karboksylowej może ograniczać ważną reakcję uboczną w analizowanych sekwencjach. [2] Grupy ochronne nie gwarantują idealnego przebiegu syntezy, lecz zapewniają selektywną kontrolę chemiczną, która musi pozostać zgodna ze wszystkimi istotnymi etapami procesu.

7. Czym różnią się Fmoc i Boc?

Fmoc i Boc są szeroko stosowanymi tymczasowymi grupami chroniącymi grupę aminową, ale reagują na inne warunki chemiczne. Fmoc jest zazwyczaj usuwany w środowisku zasadowym, natomiast Boc jest wrażliwy na kwasy. Różnica ta wpływa na sposób łączenia ich z ochroną łańcuchów bocznych, linkerami i pozostałymi etapami syntezy. Synteza oparta na Fmoc jest szeroko wykorzystywana we współczesnej SPPS, ale badania wykazały również możliwość występowania zależnych od sekwencji reakcji ubocznych w takich warunkach. [11] W praktyce bardziej użyteczne jest więc porównywanie całych strategii ochrony i ich zgodności z daną sekwencją niż rozpatrywanie wyłącznie nazw dwóch grup ochronnych.

8. Co oznacza ochrona ortogonalna?

Ochrona ortogonalna oznacza, że jedną grupę ochronną można usunąć w warunkach, w których inna potrzebna grupa ochronna pozostaje wystarczająco stabilna, aby można było kontynuować syntezę. Pozwala to odsłaniać różne miejsca reaktywne na określonych etapach. Koncepcja ta ma podstawowe znaczenie podczas kontrolowanej syntezy złożonych peptydów. Ortogonalność jest jednak zależna od warunków, a nie absolutna: wielokrotna ekspozycja, charakter sekwencji i parametry reakcji nadal mogą prowadzić do reakcji ubocznych. Badania alternatywnych sposobów ochrony grup karboksylowych pokazują, jak strategię ochrony można modyfikować w celu kontrolowania trudnej chemii peptydowej. [2]

9. Czym jest sekwencja delecyjna?

Sekwencja delecyjna to peptyd pozbawiony jednej lub kilku reszt obecnych w zamierzonej sekwencji docelowej. Może powstać, gdy etap sprzęgania aminokwasu nie zachodzi całkowicie, ale nieprzereagowany łańcuch pozostaje przyłączony do nośnika i uczestniczy w kolejnych cyklach. Ponieważ nieprawidłowy łańcuch nadal pozostaje związany z żywicą, zwykłe przemywanie nie musi go usunąć. Badania monitorowania SPPS w czasie rzeczywistym wskazują niepełne tworzenie wiązań amidowych jako ważny problem procesowy. [4] Sekwencja delecyjna jest więc problemem związanym ze strukturą i tożsamością produktu, a nie jedynie pozostałością odczynnika.

10. Czy dwa zanieczyszczenia peptydowe mogą mieć taką samą masę cząsteczkową?

Tak. Różne struktury molekularne mogą mieć identyczną lub nierozróżnialną masę nominalną. Z tego powodu sama zgodność masy nie potwierdza pełnej tożsamości cząsteczki. W badaniach syntetycznego peptydu będącego substratem reniny zidentyfikowano izobaryczne składniki zanieczyszczeń, w których modyfikacje występowały w różnych pozycjach. Derywatyzacja i tandemowa spektrometria mas dostarczyły dodatkowych informacji strukturalnych. [12] Przykład ten pokazuje, dlaczego zgodność obserwowanej masy z oczekiwaną nie może samodzielnie potwierdzić właściwej sekwencji, łączności, stereochemii ani braku strukturalnie podobnych izomerów.

11. Czym są epimeryzacja i racemizacja w syntezie peptydów?

Epimeryzacja i racemizacja dotyczą niepożądanych zmian konfiguracji stereochemicznej. Mogą one zachodzić bez zmiany nominalnej sekwencji aminokwasowej lub masy cząsteczkowej, dlatego zwykły pomiar masy może nie wykazać różnicy strukturalnej. W badaniach syntezy Fmoc wspomaganej mikrofalami zidentyfikowano reszty podatne na zmiany stereochemiczne i wykazano, że modyfikacja warunków reakcji może ograniczać takie procesy. [11] Ryzyko zależy od bloku budulcowego, sekwencji i warunków procesu. Jakość stereochemiczna wymaga więc metod analitycznych zdolnych do oceny konfiguracji, a nie może być wnioskowana wyłącznie na podstawie masy cząsteczkowej.

12. Czym jest powstawanie aspartimidu?

Powstawanie aspartimidu jest niepożądaną reakcją związaną z określonymi sekwencjami zawierającymi asparaginian. Powstanie cyklicznego półproduktu może prowadzić do kolejnych produktów o zmienionej łączności szkieletu lub stereochemii, zmniejszając wydajność i utrudniając oczyszczanie. Badacze analizowali alternatywne strategie ochrony zaprojektowane w celu ograniczenia tej reakcji w wybranych peptydach i białkach. [2] Wyniki nie wskazują jednego uniwersalnego rozwiązania dla wszystkich sekwencji zawierających asparaginian. Pokazują natomiast, dlaczego projektowanie syntezy i strategii kontroli zanieczyszczeń musi uwzględniać specyficzne zachowanie chemiczne danej sekwencji.

13. Czy wysoka czystość HPLC potwierdza prawidłową tożsamość peptydu?

Nie. Czystość HPLC opisuje próbkę w ramach konkretnego rozdziału chromatograficznego, zastosowanego detektora i sposobu analizy danych. Wysoki udział powierzchni głównego piku może być wartościowym dowodem, że próbka jest zdominowana przez jeden chromatograficznie rozdzielony składnik, ale nie potwierdza samodzielnie pełnej tożsamości molekularnej. Współeluujące zanieczyszczenia, stereoizomery i inne warianty mogą wymagać dodatkowych technik. W badaniach analizy chiralnej peptydów wykorzystano specjalnie zaprojektowany proces, który uwzględniał również zmiany stereochemiczne powstające podczas przygotowania próbki. [13] Tożsamość i czystość należy więc traktować jako powiązane, ale odrębne pytania analityczne.

14. Czy wydajność produktu oczyszczonego oznacza to samo co czystość?

Nie. Wydajność produktu oczyszczonego lub wyizolowanego określa ilość odzyskanego materiału docelowego względem zdefiniowanej ilości początkowej lub teoretycznej. Czystość opisuje natomiast skład odzyskanego materiału według określonej metody analitycznej. Synteza może prowadzić do uzyskania stosunkowo niewielkiej ilości produktu o bardzo wysokiej czystości albo dużej ilości materiału surowego zawierającego znaczną ilość zanieczyszczeń. W badaniach automatycznej syntezy przepływowej czystość surowego produktu i wydajność po izolacji raportowano oddzielnie. [7] Rozdzielenie tych parametrów zapobiega błędnemu traktowaniu wysokiej wartości jednego z nich jako dowodu wysokiej wartości drugiego.

15. Czy długie peptydy można wytwarzać poprzez łączenie krótszych fragmentów?

Tak. W strategii fragmentowej krótsze segmenty peptydowe mogą zostać przygotowane oddzielnie, a następnie połączone za pomocą odpowiedniej chemii. Natwywna ligacja chemiczna była ważnym przykładem, w którym niezabezpieczone fragmenty peptydowe połączono w sposób prowadzący do powstania naturalnego wiązania szkieletu peptydowego, a następnie uzyskano pofałdowane białko. [10] Nie oznacza to, że dowolne fragmenty peptydowe mogą łączyć się spontanicznie. Należy uwzględnić strukturę fragmentów, chemię łączenia, wybór miejsca połączenia, rozpuszczalność, stereochemię i wymagania dotyczące oczyszczania. Składanie fragmentów jest więc alternatywną strategią projektowania syntezy, a nie automatycznym rozwiązaniem problemów związanych z długimi peptydami.

16. Czy szybsza zautomatyzowana synteza eliminuje potrzebę oczyszczania?

Nie. Szybsze zautomatyzowane lub przepływowe składanie skraca czas określonych etapów syntezy, ale nie dowodzi, że każda powstała cząsteczka ma zamierzoną strukturę. W badaniach szybkiej syntezy przepływowej nadal charakteryzowano materiał surowy i stosowano późniejsze oczyszczanie, a w kolejnych pracach dotyczących automatyzacji osobno porównywano czystość surowego materiału i wydajność po izolacji. [6] [7] Dobre wyniki systemu dla badanych sekwencji nie gwarantują również identycznych rezultatów dla każdego nowego celu. Przyspieszona synteza nadal musi być połączona z odpowiednim oczyszczaniem, potwierdzeniem tożsamości, analizą zanieczyszczeń i charakterystyką końcową.

17. Dlaczego zwiększenie skali produkcji jest bardziej skomplikowane niż przygotowanie większej partii?

Zwiększenie skali zmienia warunki fizyczne i chemiczne, a nie tylko ilość materiału. Mieszanie, wymiana ciepła, pęcznienie żywicy, dystrybucja odczynników, ciśnienie, filtracja, obsługa rozpuszczalników, rozpuszczalność półproduktów i możliwości systemu oczyszczania mogą zachowywać się inaczej przy większej objętości produkcji. W analizie przemysłowej 40 procesów peptydowych osobno oceniano syntezę, oczyszczanie i izolację podczas analizy zużycia materiałów. [14] Wyniki pokazują, dlaczego produkcję trzeba rozpatrywać jako kompletny proces. Skalowalna metoda musi powtarzalnie prowadzić do uzyskania scharakteryzowanego materiału na wszystkich etapach, a nie tylko większej ilości surowego peptydu.

18. Czy peptyd jest gotowy od razu po złożeniu prawidłowej sekwencji?

Niekoniecznie. Złożenie łańcucha tworzy szkielet sekwencji tylko w takim zakresie, w jakim potwierdzają to proces i dane analityczne. W zależności od cząsteczki mogą być nadal potrzebne odbezpieczanie, odszczepianie, cyklizacja, utlenianie, tworzenie mostków disiarczkowych, fałdowanie, koniugacja, oczyszczanie i charakterystyka. Synteza BPTI stanowi dobry przykład procesu, w którym po złożeniu liniowej sekwencji następowało oczyszczanie i tworzenie pofałdowanej struktury zawierającej mostki disiarczkowe. [3] Określenie „gotowy peptyd” powinno więc odnosić się do formy molekularnej wymaganej w danym kontekście naukowym, a nie tylko do zakończenia etapowego dodawania aminokwasów.

19. Czy prawidłowa masa cząsteczkowa potwierdza prawidłową sekwencję peptydu?

Nie. Zgodność masy cząsteczkowej jest wartościowym dowodem, ale nie może samodzielnie potwierdzić pełnej sekwencji ani struktury molekularnej. Struktury izobaryczne mogą mieć tę samą masę, a różnice stereochemiczne mogą w ogóle nie powodować zmiany masy cząsteczkowej. Badania zanieczyszczeń syntetycznych peptydów pokazały, że rozróżnienie strukturalnie odmiennych składników może wymagać tandemowej spektrometrii mas i dodatkowych analiz. [12] W przypadku pytań dotyczących integralności stereochemicznej mogą być potrzebne również metody chiralne. [13] Masę cząsteczkową należy więc traktować jako jeden z elementów oceny tożsamości, a nie jej pełne potwierdzenie.

20. Dlaczego oczyszczanie należy traktować jako część produkcji peptydu, a nie tylko końcowy dodatek?

Oczyszczanie decyduje o tym, czy docelowy peptyd można skutecznie oddzielić od sekwencji delecyjnych, produktów ubocznych, pozostałości odczynników, strukturalnie podobnych zanieczyszczeń i innych składników powstałych podczas syntezy. Metoda pozwalająca bardzo szybko wytwarzać duże ilości surowego materiału może nadal być niepraktyczna, jeśli nie da się skutecznie odzyskać docelowego produktu o wymaganej jakości. Z tego powodu analizy przemysłowe procesów peptydowych uwzględniają razem syntezę, oczyszczanie i izolację. [14] Efektywność produkcji należy ostatecznie oceniać na podstawie ilości i właściwości wyizolowanego materiału końcowego, a nie wyłącznie szybkości syntezy.

Ograniczenia przy porównywaniu metod syntezy peptydów

Podczas interpretowania badań porównujących technologie produkcji peptydów należy pamiętać o kilku istotnych ograniczeniach.

Po pierwsze, sekwencja silnie wpływa na trudność syntezy. Metoda sprawdzająca się dla jednego peptydu nie musi działać tak samo dla innego. Agregacja, hydrofobowość, skład aminokwasowy, długość, tendencja do tworzenia struktur drugorzędowych i podatność na reakcje uboczne mogą zmieniać zachowanie procesu. [1] [4]

Po drugie, czystość materiału surowego, wydajność po izolacji, czystość końcowa i zawartość peptydu są różnymi parametrami. Porównywanie metod wyłącznie na podstawie jednego z nich może dawać niepełny obraz efektywności produkcji. [7]

Po trzecie, szybkie składanie łańcucha nie oznacza szybkiej produkcji całego materiału. Odszczepianie, oczyszczanie, izolacja, końcowe kształtowanie struktury, badania analityczne i dokumentacja również wpływają na całkowity czas produkcji. [6] [7]

Po czwarte, czystość analityczna zależy od zastosowanej metody. HPLC, spektrometria mas, tandemowa spektrometria mas i analiza chiralna odpowiadają na różne pytania. Jeden wynik analityczny nie musi potwierdzać pełnej tożsamości strukturalnej. [12] [13]

Po piąte, skala wpływa na zachowanie procesu. Wyników syntezy laboratoryjnej nie można automatycznie przenosić na produkcję przemysłową bez oceny mieszania, transportu masy, możliwości oczyszczania, zużycia materiałów i innych czynników zależnych od skali. [14]

Po szóste, historyczne porównania ekonomiczne mogą z czasem tracić aktualność. Koszty odczynników, poziom automatyzacji, technologie ekspresji, wyposażenie do oczyszczania, odzyskiwanie rozpuszczalników i infrastruktura produkcyjna stale się rozwijają. Starsze analizy kosztów mogą nadal mieć znaczenie naukowe, ale nie muszą odzwierciedlać aktualnej ekonomiki rynku. [1]

Po siódme, porównania środowiskowe wymagają spójnych granic analizy. Ocena zużycia rozpuszczalników podczas samego składania łańcucha przy jednoczesnym pominięciu oczyszczania i izolacji może prowadzić do mylących wniosków dotyczących zrównoważenia procesu. [14] [15]

Wreszcie sama nazwa metody nie określa jakości produktu. SPPS, synteza w roztworze, LPPS, ligacja fragmentów oraz ekspresja biologiczna mogą prowadzić do uzyskania materiału wysokiej jakości, jeśli proces został odpowiednio zaprojektowany i kontrolowany. Żadna z tych metod nie gwarantuje jednak automatycznie właściwej tożsamości, czystości, stereochemii, fałdowania czy przydatności do konkretnego zastosowania.

Összefoglaló

Syntezę peptydów najlepiej rozumieć jako kontrolowany proces wytwarzania cząsteczek, a nie po prostu tworzenie wiązań peptydowych.

Celem jest zbudowanie określonej sekwencji aminokwasowej przy jednoczesnym kontrolowaniu sposobu połączenia reszt, chemii grup ochronnych, stereochemii, reakcji ubocznych i wszelkich dodatkowych wymagań strukturalnych.

Synteza peptydów na fazie stałej utrzymuje rosnący łańcuch na nierozpuszczalnym nośniku, dzięki czemu powtarzane etapy sprzęgania i przemywania dobrze nadają się do automatyzacji. Zalety związane z powtarzalnym składaniem nie eliminują jednak problemów takich jak niepełne reakcje, agregacja, sekwencje delecyjne czy zależne od sekwencji reakcje uboczne. [4] [6] [7]

Klasyczna synteza w roztworze utrzymuje półprodukty peptydowe w fazie ciekłej i może zapewniać większą elastyczność w izolowaniu oraz charakteryzowaniu poszczególnych produktów pośrednich. Wielokrotne rozdzielanie oraz pogarszająca się rozpuszczalność mogą jednak stać się poważnymi ograniczeniami.

Metody syntezy w fazie ciekłej z rozpuszczalnymi znacznikami próbują połączyć chemię roztworową z zaprojektowanymi strategiami odzyskiwania materiału. Mogą więc stanowić dodatkową możliwość w przypadku sekwencji i problemów produkcyjnych, dla których klasyczna SPPS nie jest optymalna. [8] [9]

Dłuższe lub szczególnie trudne cząsteczki można również przygotowywać poprzez składanie fragmentów, w tym natywną ligację chemiczną, zamiast polegać wyłącznie na nieprzerwanym dodawaniu kolejnych reszt aminokwasowych. [10]

Niezależnie od wybranej metody składania efektywność sprzęgania i chemia grup ochronnych pozostają kluczowe, ponieważ niewielkie nieefektywności i reakcje uboczne mogą kumulować się podczas kolejnych etapów syntezy. Powstawanie aspartimidu, sekwencje delecyjne i zmiany stereochemiczne pokazują, dlaczego sama zamierzona sekwencja nie opisuje wszystkiego, co może powstać podczas procesu. [2] [11] [12]

Praca nie kończy się również wraz ze złożeniem łańcucha.

Oczyszczanie decyduje o tym, czy produkt docelowy można oddzielić od innych składników.

Następnie odpowiednio dobrane metody analityczne odpowiadają na odrębne pytania dotyczące tożsamości, czystości, zawartości, stereochemii, konformacji oraz – jeśli ma to znaczenie – aktywności funkcjonalnej. [3] [12] [13]

Zwiększenie skali produkcji wprowadza kolejne zagadnienia dotyczące transportu masy, zachowania żywicy, zużycia rozpuszczalników, filtracji, możliwości oczyszczania, powtarzalności procesu i jego wpływu środowiskowego. Z tego powodu przemysłowa ocena procesu powinna obejmować razem syntezę, oczyszczanie i izolację, a nie koncentrować się wyłącznie na szybkości sprzęgania. [14] [15]

Najważniejsza zasada jest następująca:

skuteczna produkcja peptydu wymaga kontroli całego procesu – od projektu molekularnego i tworzenia wiązań aż po oczyszczanie oraz charakterystykę strukturalną. Uzyskanie łańcucha o oczekiwanej nominalnej masie lub wysokiego głównego piku chromatograficznego stanowi wartościowy dowód, ale żaden z tych parametrów samodzielnie nie potwierdza pełnej tożsamości molekularnej ani jakości procesu produkcyjnego.

Jogi nyilatkozat

Artykuł ma wyłącznie charakter edukacyjny i naukowo-informacyjny. Opisuje ogólne zasady chemii peptydów, syntezy na fazie stałej, syntezy w roztworze i w fazie ciekłej, strategii grup ochronnych, sprzęgania, oczyszczania, charakterystyki analitycznej, procesów produkcyjnych oraz przykłady pochodzące z opublikowanych badań. Nie jest protokołem laboratoryjnym, instrukcją produkcyjną, poradą medyczną, przewodnikiem dotyczącym dawkowania lub podawania ani certyfikatem jakości jakiegokolwiek konkretnego produktu peptydowego. Wyniki eksperymentalne należy interpretować w kontekście sekwencji, zastosowanych metod, skali procesu, technik analitycznych i ograniczeń poszczególnych badań.

Hivatkozások

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K., & Perczel, A. (2016). Bacterial expression and/or solid phase peptide synthesis of 20-40 amino acid long polypeptides and miniproteins, the case study of Class B GPCR ligands. Current Protein & Peptide Science, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Prevention of aspartimide formation during peptide synthesis using cyanosulfurylides as carboxylic acid-protecting groups. Nature Communications, 11(1), Article 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). Solid-phase synthesis of bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) and two analogues. A chemical approach for evaluating the role of disulfide bridges in protein folding and stability. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. PubMed record
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). Real-time monitoring of solid-phase peptide synthesis using a variable bed flow reactor. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F., & Becker, C. F. W. (2015). Efficient generation of peptide hydrazides via direct hydrazinolysis of Peptidyl-Wang-TentaGel resins. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Rapid flow-based peptide synthesis. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2017). A fully automated flow-based approach for accelerated peptide synthesis. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G., & Albericio, F. (2022). Liquid-phase peptide synthesis (LPPS): A third wave for the preparation of peptides. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T., & Fukui, T. (2012). Novel diphenylmethyl-derived amide protecting group for efficient liquid-phase peptide synthesis: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., & Kent, S. B. (1994). Synthesis of proteins by native chemical ligation. Science, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Characterization of impurities in a synthetic renin substrate peptide by fast-atom bombardment mass spectrometry and hybrid tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G., & Crowther, J. B. (1995). Peptide chiral purity determination: Hydrolysis in deuterated acid, derivatization with Marfey’s reagent and analysis using high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Process mass intensity (PMI): A holistic analysis of current peptide manufacturing processes informs sustainability in peptide synthesis. The Journal of Organic Chemistry, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Sustainability challenges in peptide synthesis and purification: From R&D to production. The Journal of Organic Chemistry, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001