Peptidsyntese: fastfase-metode, i opløsning og produktionsmetoder

Peptidsyntese er en kontrolleret proces til dannelse af aminosyrekæder med en specifik sekvens. Ved kemisk syntese forbindes udvalgte aminosyrer ved hjælp af peptidbindinger, samtidig med at andre reaktive grupper til stede i disse molekyler kontrolleres. Målet er derfor ikke blot at forbinde aminosyrer, men at opnå en specifik molekylstruktur med en bestemt sekvens, stereokemi, kædeendestruktur og – hvis det kræves – yderligere strukturelle egenskaber.

De vigtigste metoder omfatter fastfase-peptidsyntese (SPPS), klassisk syntese i opløsning samt nyere metoder til peptidsyntese i flydende fase (LPPS), der anvender opløselige bærere eller molekylære markører. Forskningslaboratorier og produktionsfaciliteter kan også kombinere forskellige tilgange, fremstille kortere fragmenter separat og derefter koble dem sammen, eller anvende biologisk ekspresjon, hvis det er mere egnet til den pågældende sekvens.

Sammenligning af kemisk syntese med bakteriel ekspresjon af polypeptider bestående af 20-40 aminosyrerester viser et vigtigt princip: det praktiske valg af produktionsmetode afhænger af det konkrete molekyle, dets sekvens, tendens til aggregation, krævede modifikationer, produktionsskala og analytiske krav. [1]

Opnåelse af den tilsigtede aminosyresekvens er kun ét af stadierne i peptidproduktionen.

Hele processen kan omfatte:

sekvensdesign → klargøring af byggesten → beskyttelse af funktionelle grupper → kobling → afbeskyttelse → kædesamling → spaltning eller samling af fragmenter → endelig strukturformning → oprensning → identitetsbekræftelse → urenhedsanalyse → indholdsbestemmelse → endelig karakterisering.

For visse peptider er det også nødvendigt med yderligere trin, såsom cyklisering, dannelse af disulfidbindinger, foldning, konjugering eller andre kemiske modifikationer.

Af denne grund betyder en korrekt samling af kæden ikke automatisk, at det endelige materiale har den rette identitet, renhed, stereokemi, konformation, stabilitet eller andre krævede egenskaber.

Hvad er peptidesyntese?

Dannelse af en specifik aminosyresekvens

Peptid består af aminosyrerester forbundet med peptidbindinger.

Formålet med peptidesyntese er at danne disse bindinger i en forudbestemt rækkefølge, ofte samtidig med at man kontrollerer:

• aminosyretyper;
• aminosyresekvens i rækkefølge;
• stereokemi;
• N-terminale strukturer;
• C-terminale strukturer;
• modifikation af sidekæder;
• placering af disulfidbindinger;
• cyklisering;
• andre krævede strukturelle egenskaber.

Sekvensen er af fundamental betydning, fordi den identiske aminosyresammensætning kan føre til dannelsen af forskellige molekyler, hvis aminosyrerne optræder i en anden rækkefølge.

At sige, at et givet molekyle er „et peptid sammensat af fem aminosyrer”, giver derfor meget lidt information om dets faktiske struktur. For at beskrive molekylet korrekt skal man kende typen af aminosyrer, deres rækkefølge, stereokemi, endegrupper og eventuelle yderligere modifikationer.

To peptider kan således have nøjagtigt den samme aminosyresammensætning og alligevel være forskellige molekylære strukturer.

Yderligere forskelle kan skyldes modifikationer af kædeenderne, tilstedeværelsen af disulfidbindinger, et cyklisk skelet, ændringer i sidekæderne eller en anden stereokemisk konfiguration.

Kemisk peptidsyntese anvender typisk aminosyrer, hvis reaktive grupper er blevet selektivt beskyttet.

Midlertidige beskyttelsesgrupper muliggør dannelsen af en specifik tilsigtet kemisk binding, samtidig med at konkurrerende reaktioner andre steder på molekylet begrænses.

I efterfølgende planlagte syntesetrin fjernes eller ændres disse grupper.

Kontrolleret reaktion i stedet for spontan sammenkobling

I grundlæggende kemiske beskrivelser fremstilles dannelsen af en peptidbinding ofte som en kondensationsreaktion, hvor to aminosyrer forenes med den samlede frigivelse af et vandmolekyle.

En sådan ligning beskriver det generelle reaktionsregnskab.

Det bør dog ikke forveksles med den måde, hvorpå kontrolleret peptidesyntese udføres i praksis.

Blot en blanding af frie aminosyrer ville ikke gøre det muligt pålideligt at bestemme:

• hvilken aminogruppe skal reagere;
• hvilken carboxylgruppe skal reagere;
• hvilken aminosyre skal være den første;
• som skal være nummer to;
• vil sidekæderne begynde at reagere;
• vil stereokemien blive bevaret;
• vil der ikke opstå adskillige uønskede produkter.

I praktisk kemisk syntese anvendes derfor kontrollerede aktiverings- og beskyttelsesstrategier for funktionelle grupper.

Gruppen, der stammer fra en carboxylsyre, aktiveres normalt på en sådan måde, at den effektivt kan reagere med en udvalgt aminogruppe. Beskyttelsesgrupper, reaktionsrækkefølge, bærerkemi, koblingsreagenser, opløsningsmiddelmiljø og isoleringsmetoder hjælper tilsammen med at styre reaktionen i retning af det tilsigtede produkt.

Effektiv peptidsyntese kræver derfor kontrol med både den kemi, der skal finde sted, og den, der skal forhindres.

Et godt eksempel er dannelsen af aspartimid.

Forskere har udviklet en alternativ metode til beskyttelse af carboxylgruppen med det formål at begrænse denne problematiske Bivirkning under peptidsyntesen.

Undersøgelsen viser et bredere princip inden for peptidkemi: at forhindre uønskede molekylære omdannelser kan være lige så vigtigt som at danne den rette peptidbinding.

Hvornår kan et peptid betragtes som færdigt?

Afslutningen af dannelsen af det liniære peptidskeleton betyder ikke altid afslutningen på hele syntesen.

Afhængigt af målmolekylet kan yderligere trin være nødvendige efter kædesamlingen.

De kan omfatte:

• fuldstændig fjernelse af beskyttelsesgrupper;
• af spaltning af peptid fra det faste bæremedie;
• fjernelse af midlertidige markører;
• cyklisering;
• iltning;
• dannelse af disulfidbindinger;
• foldning;
• bøjning;
• modifikation af kædeender;
• Rensning;
• analytisk karakteristik.

Nogle peptider kræver relativt få yderligere strukturelle ændringer efter kædens dannelse.

For andre er de senere faser af afgørende betydning.

Et godt eksempel er syntesen af bovin pankreatisk trypsin-inhibitor (BPTI). Forskerne samlede en lineær sekvens, oprensede materialet og opnåede derefter en foldet struktur indeholdende disulfidbindinger. Ifølge de analyser og funktionelle sammenligninger, der præsenteres i studiet, svarede det endelige materiale med den naturlige sekvens til det naturlige protein med hensyn til de undersøgte parametre. [3]

Dette eksempel viser forskellen mellem sammensætningen af et peptid-skelet og opnåelsen af en fuldt karakteriseret endelig molekylær form.

Metoden, som gør det muligt at opnå en korrekt lineær sekvens, bekræfter ikke automatisk:

• korrekt foldning;
• korrekt placering af disulfidbindinger;
• biologisk aktivitet;
• stabilitet;
• forureningsprofilen;
• egnethed til et bestemt formål.

Hvert af disse spørgsmål kræver særskilt bevisførelse.

Kemisk syntese, biologisk ekspression og kombinerede metoder

Ved kemisk peptidsyntese samles tidligere forberedte molekylære blokke i kontrollerede laboratoriereaktioner.

Biologisk ekspresjon anvender derimod cellens maskineri til at fremstille den kodede aminosyresekvens. Derefter skal materialet indvindes, oprenses og, hvis det er nødvendigt, undergå yderligere bearbejdning.

Begge metoder kan føre til dannelse af peptider eller polypeptider, men er forbundet med forskellige muligheder og begrænsninger.

Kemisk syntese kan være særligt nyttig, når der er brug for:

• udvalgte ustandardiserede aminosyrer;
• specifikke kemiske modifikationer;
• specifikke kædeendetstrukturer;
• isotopmærkning;
• modifikationer af peptidrygraden;
• andre egenskaber, der er vanskelige at opnå gennem standard biologisk ekspresion.

Biologisk ekspression kan være attraktiv i tilfælde af passende længere sekvenser eller specifikke mærkningsstrategier, men det eliminerer ikke problemer, der opstår i de senere produktionsstadier.

Materialegenvinding, foldning, bearbejdning, urenheder hidrørende fra værtsorganismen, oprensning og analytisk karakterisering skal fortsat tages i betragtning.

Ingen af metoden er derfor universelt den bedste.

Ved sammenligning af polypeptider bestående af 20-40 aminosyrerester påvirkede både sekvenslængden og dens tendens tilaggregation resultaterne af fastfasesyntese og bakteriell ekspresjon. [1]

Disse observationer understøtter en tilgang, hvor fremstillingsmetoden vælges til det specifikke molekyle.

Historiske data om ydeevne, omkostninger, udstyr og produktionstid bør ikke betragtes som universelle moderne værdier, da teknologier, reagenser, automatisering, oprensningsmetoder og produktionsøkonomi ændrer sig i takt med den teknologiske udvikling.

Fastfases-peptidsyntese

Den voksende kæde er bundet til en uopløselig bærer

Ved fastfasespeptidsyntese (SPPS) forbliver den voksende peptidkæde bundet til en uopløselig bærer under de efterfølgende syntesecyklusser.

Bæreren er typisk en funktionaliseret polymerharpiks.

Linkeren, eller forbindelsesleddet, binder peptidet til bæreren og påvirker blandt andet måden, hvorpå den færdige kæde senere frigives, samt typen af den opnåede endegruppe.

En af de væsentligste praktiske fordele ved SPPS er nemmere adskillelse af materiale.

Efter afslutningen af et bestemt reaktionstrin kan opløselige reagenser og mange opløselige biprodukter fjernes ved vask, mens det voksende peptid forbliver bundet til den faste fase.

Derved behøver man ikke efter tilføjelsen af hver enkelt aminosyre at isolere og rense det voksende peptid som en separat, fri forbindelse.

Denne bekvemmelighed kan imidlertid føre til en vigtig misforståelse.

Vask af harpiksen betyder ikke, at alle forkerte peptider er blevet fjernet.

Hvis kæden, der er bundet til harpiksen, ikke reagerer under et koblingstrin, kan den stadig forblive på bæreren.

I de følgende cyklusser kan det reagere igen og forlænge sig yderligere.

Som resultat kan der dannes en deletionssekvens, dvs. et molekyle, der adskiller sig fra målpeptidet ved manglen på en eller flere aminosyrerester.

Ligeledes kemisk modificerede eller ufuldstændigt afblokerede kæder bundet til harpiks kan deltage i de efterfølgende syntesetrin.

SPPS forenkler således adskillelsen af opløselige stoffer fra det harpiksbundne materiale.

Jeg garanterer dog ikke for en fuldkommen sekvensmæssig overensstemmelse.

Den gentagne cyklus af afsikring og tilobling

En typisk trinvis SPPS-syntese omfatter gentagelse af tre grundlæggende operationer:

sikring af -> tilkobling -> skylning.

Først blotlægges den reaktive aminogruppe for enden af den voksende kæde.

Derefter bindes endnu en beskyttet aminosyre til kæden.

Opløselige reagenser, overskud af aminosyre og mange reaktionsprodukter fjernes, før den næste cyklus starter.

Gentagelse af denne proces gør det muligt at opbygge peptidet en aminosyrerester ad gangen.

I klassisk SPPS kobles C-terminal-resten typisk til bæreren først, hvorefter łańcuch forlænges mod N-terminalen.

Dette adskiller sig fra standard ribosomal proteinsyntese, hvor successive aminosyrer tilføjes til C-enden af den voksende kæde.

Den endelige aminosyrensekvens kan imidlertid være identisk, selvom retningen og kemien i foldningsprocessen er en anden.

Udtrykket „cyklus” bør ikke forstås som et enkelt universelt sæt af reaktionsbetingelser, der egner sig til enhver rest og enhver sekvens.

Reaktionens forløb kan afhænge af:

• strategier for beskyttelsesgrupper;
• aminosyretype;
• rumlige forhold omkring reaktionsstedet;
• harpiksype;
• linkera;
• kædelængder;
• aggregering;
• opløsningsmidlets;
• koblingskemi;
• strukturelle adfærd af den voksende peptid.

En reaktion, der forløber let i begyndelsen af syntesen, kan blive meget vanskeligere på et senere stadium.

Derfor forbliver procesovervågning vigtig selv i højt automatiserede systemer.

Hvorfor er harpiksens egenskaber vigtige?

Et varigt medium er ikke blot en passiv holder.

Dets fysiske og kemiske egenskaber kan direkte påvirke reaktionens forløb.

En af de vigtige parametre er svulning.

Hvis theisen svulmer korrekt op i det valgte opløsningsmiddelmiljø, kan reagenserne lettere nå de reaktive steder, der findes i hele polymerstrukturen.

Utilstrækkelig svulning eller ændringer i harpiksens struktur kan begrænse denne adgang.

Betydning kan også have:

• belægningstæthed;
• polymerarkitektur;
• linker-struktur;
• opløsningsmiddelbestandighed;
• mekanisk stabilitet;
• porøsitet;
• diffusive egenskaber;
• interaktioner mellem voksende peptidkæder.

Med en øget peptidlængde kan de enkelte kæder også interagere med hinanden.

Aggregering på harts kan begrænse adgangen til reaktive steder og føre til ufuldstændig kobling eller ufuldstændig afbeskyttelse.

Dette betyder, at en sekvens, der opfører sig korrekt i begyndelsen af syntesen, kan blive sværere og sværere, jo længere kæden bliver.

Forskere har udviklet en gennemstrømningsreaktor med variabelt leje, som gjorde det muligt at overvåge harpiksens svulmning baseret på trykrelaterede målinger. [4]

Undersøgelsen omhandlede harpiksaggregation og ufuldstændig binding som procesmæssige problemer, som under andre omstændigheder kan være vanskelige at observere direkte under syntesen.

Dette viser, at overvågning af mediets fysiske adfærd kan tilvejebringe information, der rækker ud over blot registrering af de tilsatte reagenser.

Hvad bruges Wang-harpiks til?

Wang-linker-kemi anvendes i vid udstrækning i fastfasepeptidsyntese (SPPS), når en C-terminal carboxylsyre er ønsket efter fraspaltning af peptidet.

Peptidet er fastgjort via en esterbinding, som senere kan spaltes under de rette betingelser.

Alternative linkersystemer kan vælges, når en anden C-terminalstruktur er nødvendig, for eksempel et amid.

Det er værd at skelne mellem linkerkemi og hele den fysiske bærer.

Relaterede Wang-lignende linkere kan indføres i forskellige polymerarkitekturer.

Sådanne materialer behøver ikke at have identiske:

• svellingsegenskaber;
• kapaciteter;
• opløsningsmiddelkompatibilitet;
• mekaniske egenskaber;
• adfærd under reaktioner.

Undersøgelser ved brug af peptidyl-Wang-TentaGel-harpikser har påvist en specialiseret alternativ metode til fremstilling af peptidhydrazider, som er nyttige mellemprodukter i peptidkemi. [5]

Dette betyder ikke, at standard Wang-harpikskløvning normalt fører til dannelse af peptidhydrazider.

Den viser imidlertid en vigtig princip:

bærer + linker + reaktionsbetingelser + fralysningskemi bestemmer tilsammen det opnåede produkt.

SPPS-syntese i batch- og flowsystem

SPPS kan udføres i klassiske batch-reaktorer eller i systemer, hvor reagenserne strømmer gennem en reaktor indeholdende det faste bæremateriale.

Flow-systemer kan muliggøre hurtig udskiftning af reagenser og mere præcis kontrol af det kemiske miljø omkring resinen.

Et studie fra 2014 præsenterede hurtig flow-baseret peptidsyntese med kontinuerlig overvågning og anvendte den på flere peptider og et lille protein. [6]

I en senere automatiseret undersøgelse blev der beskrevet en betydeligt hurtigere kædesammenføjning, hvor man for de analyserede eksempler opnåede en råproduktrenhed og isoleret udbytte, der var sammenlignelige med klassisk fastfasesyntese. [7]

Disse undersøgelser viser specifikke systemers muligheder under bestemte forhold.

De beviser dog ikke, at ethvert peptid kan fremstilles lige så hurtigt og med samme kvalitet.

Tiden det tager at producere et peptid, omfatter også meget mere end blot selve kædesammenføjningen.

Den samlede proces kan omfatte:

• klargøring af reagenser;
• klargøring af harpiks;
• kobling;
• sikring af; afsikring;
• vaskning;
• udskillelse;
• forarbejdning af produktet;
• Rensning;
• fjernelse af opløsningsmidler;
• endelig formning af strukturen;
• analytiske undersøgelser;
• dokumentation.

Hurtig binding er derfor kun ét af elementerne i den samlede produktionseffektivitet.

Syntese i væskefase

Hvad betyder denne term?

Udtrykket „syntese af peptider i væskefase” kan bruges i flere betydninger.

I bred forstand kan det ganske enkelt betyde peptidsyntese udført i opløsning.

I mere specialiseret litteratur skelnes der dog ofte mellem:

1. klassisk peptidsyntese i opløsning;
2. peptidsyntese på fast fase;
3. nyere LPPS-metoder, hvor den voksende kæde bærer et opløseligt mærke eller en bærer.

Denne skelnen er vigtig, fordi måden, hvorpå produktet adskilles og genvindes, ændrer sig.

Et frit opløst, beskyttet peptidmellemprodukt kan kræve isolering ved hjælp af dets egne fysiske og kemiske egenskaber.

I tilfælde af et mærket intermediat kan mærket designes til at lette udfældning, ekstraktion, tilbageholdelse på en membran eller en anden form for separation.

Gennemgangskilden om LPPS skelner tydeligt mellem klassisk opløsningsmiddelsyntese, SPPS og metoder, der anvender opløselige markører. [8]

Publikationen er nyttig til at strukturere terminologi og metoder.

Den bør dog ikke tolkes som et enkelt eksperiment, der viser, at en metode er den bedste for hvert enkelt peptid.

Klassisk syntese af peptider i en opløsning

I den klassiske syntese i en opløsning af beskyttede aminosyrer forbliver de proteolyserede biprodukter eller fragmenter opløselige i reaktionsmiljøet i stedet for at blive koblingsfyldt til den uopløselige harpiks.

Efter afslutningen af reaktionen kan det relevante halvprodukt isoleres, renses og om nødvendigt karakteriseres, før det næste trin påbegyndes.

Det kan måske give nogle fordele.

Forskere kan:

• karakterisere de enkelte halvfabrikata;
• At vælge en rensningsmetode til det specifikke halvprodukt;
• optimere de enkelte processer;
• at kunne udarbejde afsnitene uafhængigt;
• at ændre syntesestrækningen, når et bestemt biprodukt giver problemer.

Syntese i en opløsning kan dog også være forbundet med betydelige problemer.

Med en forlængelse af peptidskæret kan de:

• at blive svagt opløselige;
• at samle;
• at være vanskeligt at krystallisere;
• skabe nært beslægtede forureninger;
• at være svær at adskille;
• kræver gentagen isolering;
• forårsage materialettab i de efterfølgende trin i bearbejdningsprocessen.

Syntese i en opløsning er således ikke automatisk nemmere eller lettere at skalere end SPPS.

Dens anvendelighed afhænger af den specifikke sekvens, halvprodukternes stabilitet, opløseligheden, synteseforløbets længde, holdbarheden under rensningen og effektiviteten af de efterfølgende isoleringsfaser.

Udviklingen af markerede LPPS-strategier skyldes delvist forsøg på at løse netop disse problemer i forbindelse med separering og materialhåndtering. [8]

Fordampbare mærker forbinder reaktionens design med separationsdesignet

I det markerede LPPS-systemet har den voksende peptid en midlertidig molekylær binding, der er designet til at påvirke dens fysiske egenskaber.

En markør kan muliggøre opretholdelse af peptids tilstrækkelige opløselighed under reaktionen og derefter lette selektiv genfinding af det.

Afhængigt af teknologien kan opsplitningen anvende:

• udskilning;
• udtrækning;
• hæmning på membranen;
• faseadfærd;
• Andre egenskaber, der skyldes tilstedeværelsen af et mærke.

I en af de eksperimentelle strategier blev en langkædede beskyttelsesgruppe på C-enden anvendt til at fremstille peptidamidene.

Gentagne reaktioner og udfældningsfaser gjorde det muligt for forskerne at fremstille et hydrofobt peptid, som i den sammenligning, de anvendte, var vanskeligt at opnå tilfredsstillende med SPPS-metoden. [9]

Dette viser den konkrete strategis anvendelighed for den analyserede sekvens.

Det beviser dog ikke en universel fordel ved markeret syntese.

Markeringssystemet bliver en del af produktionsprocessen og giver anledning til sine egne spørgsmål:

• Hvor effektivt er det at tilslutte det?
• Skifter reaktionen retning?
• Hvordan kan markeret halvfabrikat genoprettes pålideligt?
• Skaber det nye forureninger?
• Hvordan bliver det fjernet?
• Kan man bekræfte fuldstændig fjernelse?
• Hvilke analytiske metoder bekræfter hans fravær i det endelige produkt?

Fordampbare mærker bør derfor betragtes som funktionelle elementer i procesdesignet, og ikke kun som simple etiketter.

Sammenligning af de vigtigste metoder

Sammenligningen præsenterer de generelle principper for, hvordan de enkelte metoder fungerer.

Det angiver ikke, hvilken af dem der vil give den bedste ydeevne, renhed, omkostninger, miljømæssig balance eller mulighed for skalering for en bestemt sekvens.

Disse parametre bør vurderes ud fra den faktiske partikelstørrelse og den specifikke produktionsproces. [4] [8] [9]

Sammenføjning af fragmenter og hybridproduktion

Peptidet behøver ikke altid dannes i én uafbrudt proces, hvor der tilføjes nye aminosyrerester.

En alternativ strategi er at separate de kortere peptidhjørner og derefter kombinere dem.

En hybridproces kan f.eks. bruge SPPS til at modtage de enkelte fragmenter og en kemi i en opløsning til at sammenkoble dem.

Fragmenterede strategier kan begrænse nogle af problemerne ved den meget lange syntetiske fase.

Men de medfører nye udfordringer, såsom:

• valg af det rette forbindelsessted;
• opløseligheden af fragmenterne;
• aktivering af sammenkoblingsstedet;
• kemisk selektivitet;
• opretholdelse af stereotyper;
• bivirkninger;
• rensning af fragmenter;
• rensning efter deres sammenføjning.

Et vigtigt eksempel på kontrolleret sammenføjning af fragmenter er den naturlige kemiske ligering.

I den klassiske version reagerer peptidsaltet med et andet peptid, der indeholder N-terminal cystein. Den efterfølgende reorganisering fører til dannelsen af en korrekt binding i peptidskallen ved ligationsstedet.

Original undersøgelser viste mulighed for at opnå efter ligering og folding af et protein, der indeholder disaccharidmolekyler. [10]

Det bekræfter betydningen af denne strategi med at samle fragmenter.

Det betyder dog ikke, at enhver to uændrede peptidsubstanser kan blive samlet spontant.

Masker og sikkerhedsgrupper

Sammenstillingen skaber den tilsigtede forbindelse

Bindingsprocessen er et trin i reaktionen, hvor der dannes nye peptidbindinger mellem de valgte enheder.

Normalt aktiveres en gruppe fra carboxylgruppen, så den kan reagere effektivt med den relevante amingruppe.

Aktiveringskemien skal være i overensstemmelse med:

• en stigende sekvens;
• midlertidige beskyttelsesgrupper;
• beskyttelse af sidekæder;
• stereokemien;
• en bærer eller et symbol;
• opløsningsmiddelmiljø;
• andre funktionelle grupper, der er til stede i molekylet.

Effektiv binding er særligt vigtig i fasebestående syntese, da en ufuldstændig reaktion kan føre til dannelse af delektionssekvenser.

Hvis et trin i aminoforbindelsens tilførsel ikke lykkes for nogle af de voksende kæder, kan disse kæder forbli i systemet og deltage i de efterfølgende cyklusser.

Som følge heraf kan der dannes molekyler, der er meget ens i struktur med det målte peptid, men som mangler én rest.

Selv små uøkonomier kan derfor kunne akkumuleres under mange stadier af syntesen.

Et simpelt matematisk eksempel illustrerer dette problem godt.

Hvis hver af de 50 uafhængige trin i processen havde en sandsynlighed for succes på 99%, ville andelen af molekyler, hvor alle trinne endte med succes, være:

0,99^50 ≈ 0,605

Det vil sige omkring 61%.

Det er udelukkende en matematisk illustration.

Det repræsenterer ikke en prognose for den faktiske renhed eller produktiviteten af syntesen af et peptid med 50 rester.

Den faktiske produktion omfatter:

• Forskellige samplingshastigheder i forskellige positioner;
• fase af afmontering;
• bivirkninger;
• afhængigt af sværhedsgraden;
• strategier for genforening;
• Tab i forbindelse med afskilning;
• Tab i forbindelse med rensningen;
• Andre procesmæssige variabler.

Beregningsmetoden viser blot, hvorfor selv tilsyneladende lille ineffektivitet i et enkelt trin kan blive meget vigtigt i en flerfase-syntese.

Beskyttelsesgrupper kontrollerer stedet for reaktionen

En aminosyre kan have flere kemisk reaktive grupper.

Uden selektiv kontrol kan sammenkoblingsreaktionerne forekomme på uønskede steder.

Beskyttelsesgrupper blokerer midlertidigt udvalgte reaktionsområder.

En aminosyre, der bruges til at forlænge kæden, kræver normalt midlertidig beskyttelse, mens reaktive sidekæder kan kræve vedhæftning af det resterende materiale i mange syntesecyklusser.

Sammenkoblingen til bæredonoren skal også overleve disse faser indtil den planlagte afkobling.

Valget af beskyttelsesgrupper påvirker således hele syntese-strategien.

Det er vigtigt at tage højde for:

• hvordan de implementeres;
• stabilitet;
• metode til fjernelse;
• overensstemmelse med andre beskyttelsesgrupper;
• overensstemmelse med bæregodet;
• bivirkninger;
• effekten af en bestemt sekvens;
• De endelige betingelser for afmontering.

Forskning, der anvendte beskyttelse baseret på cyjanosulfurylid, beskrev dannelsen af aspartimid ved at ændre metoden til beskyttelse af carboxylgruppen.[2]

Resultaterne viser, at strategien for beskyttelsesgrupper ikke kun påvirker, om den planlagte reaktion kan finde sted, men også hvilke uønskede reaktioner der bliver mulige.

Fmoc, Boc og ortogonal beskyttelse

Fmoc og Boc er blandt de mest anvendte grupper til at beskytte aminosyrer.

De adskiller sig faktisk i deres måde at fjerne det på.

Fmoc fjernes normalt under basiske betingelser, mens Boc er følsomt over for sure betingelser.

Disse egenskaber gør det muligt at bruge dem som en del af bredere beskyttelsesstrategier.

I den populære SPPS-baserede Fmoc-metode fjernes den midlertidige N-terminale Fmoc-beskyttelse flere gange, mens de valgte beskyttelsesgrupper i de sidekedler og forbindelsen med harpiksen forbliver intakte indtil senere stadier.

Andre strategier kan bruge forskellige kombinationer.

En særligt vigtig begreb er ortogonal beskyttelse.

To grupper af proteiner anses for at være ortogonale, hvis den ene kan selektivt fjernes under betingelser hvor den anden forbliver tilstrækkelig stabil til at fortsat syntese kan fortsætte.

Ortogonalitet er således en praktisk relation til kemisk overensstemmelse.

Det betyder ikke, at enhver beskyttet gruppe forbliver fuldstændig uændret efter uendeligt mange eksponeringer for alle reaktionsbetingelser.

Bivirkninger kan fortsat forekomme.

I undersøgelserne af Fmoc-syntese blev både aspartimidets dannelse og uønskede stereokemiske ændringer beskrevet, selvom den overordnede beskyttelsesstrategis generelle selektivitet var forudset. [11]

Stereokemi er en del af en molekyls identitet

Mange aminosyrer har et chiralt centrum.

Det betyder, at deres atomer kan indtage forskellige rumlige arrangementer, der svarer til forskellige stereokemiske former.

En ændring af konfigurationen af et stereogent center kan føre til dannelse af en anden peptidstruktur uden behov for at ændre dets nominelle masse.

Derfor kan selve massen ikke bekræfte peptids fulde identitet.

Epimerisering betyder normalt en ændring i konfigurationen af et stereogent centrum i en molekyle, der indeholder flere sådanne centre.

Racemization er også ofte omtalt i peptidkemi i forbindelse med tab af den stereokemiske integritet af aminosyreresterne.

Disse ændringer er vigtige, fordi molekylær genkendelse kan afhænge kraftigt af atomernes rumlige arrangement.

Toer er to partikler med det samme grundstofindhold og nominelle masse, kan således opføre sig forskelligt, hvis de adskiller sig ved stereokemi.

I et studie af mikrovibreret Fmoc-syntese blev det konstateret, at nogle restkoncentrationer var modtagelige for uønskede stereokemiske ændringer under de anvendte betingelser. Modifikationen af metoden begrænsede forekomsten af disse reaktioner. [11]

Det betyder ikke, at opvarmning som defineret i denne artikel beskadiger alle peptider.

Den rigtige konklusion er, at fremskyndelsen af reaktionen bør vurderes sammen med selektiviteten, der er afhængig af sekvensen.

Aspartamid og andre beslægtede forureninger

Dannelsen af aspartimid er en kendt bivirkning ved visse sekvenser, der indeholder aspartin.

Det kan opstå et uønsket cyklisk biprodukt, som derefter dannes forbindelser med ændret skjelett- eller stereokemisk binding.

Muligheden for denne reaktion afhænger af sekvensen og betingelserne for processen.

Andre forureninger forbundet med syntesen kan skyldes:

• ikke fuldstændig sammenfald;
• ufuldstændig demontering;
• optræden af delegerende sekvenser;
• reaktioner fra sidevægge;
• stereotypiske ændringer;
• reaktioner under afskæring;
• forurening;
• omplaceringer;
• betingelserne for produktets bearbejdning;
• Ufuldstændig fjernelse af beskyttelsesgrupper.

Nogle forureninger medfører en let mærkbar ændring i partikelmassen.

Andre er langt sværere at adskille.

I analytiske undersøgelser af et syntetisk peptid, der er en renin-substrat, er der identificeret mange forureninger, herunder stoffer, der viser den samme masseændring, men indeholder modifikationer i forskellige positioner. [12]

For at kunne skelne dem mellem, var der brug for en yderligere strukturel analyse.

Forskere behandlede også de foreslåede mekanismer for dannelsen af disse forureninger som hypoteser.

Det er en vigtig sondring:

At fastslå, hvad forurening er, og at bevise den nøjagtige mekanisme for dens opståen er to separate videnskabelige spørgsmål.

En mulig mekanisme bør ikke betragtes som bekræftet kun fordi den svarer til den observerede partikelmasse.

Rensning, skalering og produktkvalitet

Råprodukt, renset produkt og produktivitet

En rå peptid er et materiale, der er fremstillet før afslutningen af de relevante rensningsfaser.

Kan indeholde:

• målrettet peptid;
• sletningssekvenser;
• materialet ikke helt afmonteret;
• ændrede sekvenser;
• rester af reagenser;
• produkter relateret til afskæring;
• salt;
• opløsningsmidler;
• Andre ingredienser, der dannes i processen.

Rensningen har til formål at adskille det rette peptid fra denne blanding.

Det er vigtigt at skelne mellem tre begreber:

renheden af det rå produkt — den målte sammensætning af materialet før den endelige rensning;

Effektiviteten af det rensede eller isolerede produkt — mængden af genvundet formålsmateriale i forhold til en bestemt startværdi eller teoretisk værdi;

Endelig renhed — sammensætningen af det isolerede materiale bestemmes ved hjælp af en specifik analytisk metode.

Disse begreber er ikke udskiftelige.

Processen kan føre til oprettelsen af en stor mængde råmateriale, men gør det muligt at genvinde en relativt lille mængde af det rensede produkt.

En anden proces kan give mindre råmateriale, men er kendetegnet ved høj selektivitet i fremstillingen af det endelige produkt.

En lignende høj analytisk renhed behøver ikke at betyde høj produktivitet.

I undersøgelser af accelereret strømsyntese blev renheden af råmaterialet og produktionskapaciteten efter isolering rapporteret separat korrekt. [7]

Kromatografi adskiller bestanddelene, men den kan ikke besvare ethvert spørgsmål.

Højtydende væskekromatografi i reversert fasekonfiguration (RP-HPLC) er meget udbredt til analyse og rensning af peptider.

Forskellige molekyler påvirker stationær og flydende fase på forskellige måder.

Under de rette betingelser muliggør disse forskelle adskillelsen af bestanddelene i blandingen.

Analytisk og preparativ kromatografi har sammenhængende, men forskellige anvendelser.

Den analytiske HPLC bruges primært til at undersøge prøveens sammensætning.

Preparative HPLC bruges til fysisk at opsamle de adskilte bestanddele.

En chromatogram kan give mange værdifulde oplysninger.

En stor hovedmængde eller en høj andel af dens overflade bør dog ikke betragtes som en fuldstændig molekylær karakterisering.

Resultaterne af kromatografien afhænger bl.a. af:

• typen af kolonne;
• den bevægelige fase;
• gradient;
• temperaturer;
• detekteringsmetoder;
• bølgelængde;
• Prøveudtagning;
• metoden til integration af pikker;
• opløsning;
• egenskaber ved forurening.

Dva sloučeniny mohou potenciálně vyvstávat současně.

Nogle bestanddele i prøven kan også reagere forskelligt på det anvendte detektor.

Derfor er høj overfladerenhed i HPLC ikke ensbetydende med fuldstændig bekræftelse af molekylær identitet.

Studier af isobariske peptidsubstanser og kiral analyse viser, hvorfor der kan være brug for supplerende analytiske metoder. [12] [13]

Den analytiske metode skal svare på et konkret strukturel spørgsmål.

Identitet, renhed og indhold betyder forskellige ting

Tre begreber er særligt vigtige i peptidspecifikationen.

Identitet svarer på spørgsmålet:

Findes der den tilsigtede molekyle i prøven?

Renlighed svarer på spørgsmålet:

Hvilke andre komponenter findes i prøven, eller hvilken del af det måltesignalet svarer til hovedkomponenten?

Indholdet svarer til spørgsmålet:

Hvor meget reelt peptid er der i prøven?

Disse spørgsmål kan ikke altid besvares med et enkelt måltal.

Materialet, der indeholder peptidet, kan også indeholde:

• vand;
• modsat;
• salt;
• opløsningsmiddelrester;
• Andre komponenter relateret til processen;
• forurening.

Den samlede masse af det modige materiale behøver således ikke svare til massen af peptidet selv.

På samme måde bekræfter ikke overensstemmelsen mellem den målte molekylmasse og den teoretiske værdi:

• en komplet struktur af aminosyrer;
• den korrekte kommunikation mellem de enkelte dele;
• stereokemisk integritet;
• placering af disulfidbindinger;
• foldning;
• Fravær af isobariske forureninger.

Massespektrometri kan give stærke beviser vedrørende molekylmassen.

Tandemmasspektrometri og andre strukturelle teknikker kan give yderligere information om sekvensen.

Kiralmetoder gør det muligt at analysere stereokemiske problemer, som ikke kan løses ved hjælp af almindelige målinger af masse.

I en af de analytiske undersøgelser blev selv racematisering, der opstår under prøvepræpareringen, taget i betragtning. Dette viser en anden vigtig regel: Selve analyseteknikken kan give artefakter, hvis den ikke designes korrekt. [13]

Foldning og aktivitet kan kræve separat bekræftelse

For strukturelt begrænsede peptider og små proteiner kan den korrekte sekvens og molekylmasse stadig være utilstrækkelige til at bekræfte den tilsigtede endelige struktur.

Yderligere spørgsmål kan omfatte:

• Er der opstået passende disiarcziske broer?
• Har molekylet opnået den forventede konformitet?
• Er cykleringen komplet?
• Er der strukturelle isomerer til stede?
• Viser det syntetiske stof den forventede aktivitet i en bestemt eksperimentel test?

I undersøgelsen af BPTI-syntesen blev flere analytiske og biokemiske metoder anvendt sammen med en vurdering af trypsinhæmmingen. [3]

De samlede resultater støttede sammenhængen mellem det syntetiske materiale med en naturlig sekvens og det naturlige protein inden for de undersøgte kriterier.

En aktivitetstest svarer dog på et bestemt funktionelt spørgsmål.

Det erstatter ikke analysen af forureningen.

På samme måde bekræfter en lignende aktivitet i et enkelt test ikke fuldstændig overensstemmelse mellem alle biologiske, strukturelle eller produktionsmæssige egenskaber.

Produktionsskalering ændrer mere end blot mængden af materiale

En stigning i produktionsomfanget handler ikke kun om en proportional forøgelse af mængden af alle reagenser.

Fysiske processer kan opføre sig anderledes i større skalaer.

Det kan have betydning:

• blanding;
• varmeveksling;
• distribuerer reagenser;
• difusjon;
• vævning af harpiks;
• tryk;
• filtrering;
• ekonomi med opløsningsmidler;
• udskilning;
• opløseligheden af halvfabrikata;
• transport af masse;
• mulighederne for rensningssystemet.

Disse faktorer kan både påvirke reaktionsforløbet og forureningens opståen.

Rensning i senere faser kan også blive en svær opgave for hele produktionsprocessen.

En forøgelse af syntesehastigheden har kun begrænset betydning, hvis rensningssystemet ikke er i stand til at adskille de opståede forureninger effektivt eller genvinde produktet af den krævede kvalitet.

I en industriel analyse, der omfattede 40 processer til syntese af peptider fra 14 farmaceutiske virksomheder, blev forbruget af materialer under syntesen, rensningen og isoleringen vurderet. [14]

Studiet viser, hvorfor produktionsvurderingen skal udføres for hele processen.

Det betyder dog ikke, at enhver fabrik, sekvens eller produktionsproces opnår identiske resultater.

Produktionskvaliteten er resultatet af mange kontrolmekanismer

Gennemsigtig produktion af peptider kræver mere end blot at opnå et tilfredsstillende analytisk resultat.

Den kontrollerede proces omfatter normalt flere sammenhængende elementer:

definerede målmolekyl → passende udgangsmaterialer → kontrolleret syntese → kontrolleret rensning → passende prøveudtagning → valideret eller relevant analyse → partierapportering.

Partiets dokumentation kombinerer analytiske resultater med materiale, der faktisk er produceret.

En analysecertifikat (COA) opsummerer de udvalgte resultater af undersøgelser af en bestemt partikelmængde.

Dens informationsværdi afhænger af:

• arten af undersøgelser, der er udført;
• de anvendte metoder;
• denne metodernes anvendelighed;
• specifikationer;
• identifikation af prøven;
• mulighederne for at spore partiet;
• Bekræftelse af, at de rapporterede resultater faktisk vedrører det pågældende materiale.

En enkelt værdi, der defineres som „renhed”, kan ikke alene bekræfte:

• fuld molekylær identitet;
• indholdet af peptidet;
• stereokemisk integritet;
• niveauet for restkoncentrationen af opløsningsmidler;
• vandindholdet;
• antistofbestandet;
• Mikrobiologiske egenskaber;
• foldning;
• biologisk aktivitet;
• nytteevne til et bestemt formål.

Det rette analyseværktøj afhænger af det formål, materialet skal anvendes til.

Peptidet, der anvendes som analytisk referencemateriale, det undersøgelsesmiddel, der anvendes i en celleeksperimentel undersøgelse, og det materiale, der er under udvikling til farmaceutisk brug, kan kræve svar på andre kvalitetsspørgsmål.

Analytiske beviser bør derfor fortolkes i en tydeligt defineret sammenhæng og ikke som et universelt bevis på kvalitet.

Evalueringen af miljømæssig balance skal omfatte hele processen

Syntese af peptider kan kræve betydelige mængder opløsningsmidler og reagenser.

En vurdering af miljøpåvirkningen bør derfor tage højde for langt mere end blot sammensætningen af materialerne.

Vigtige elementer kan omfatte:

• Opbygning af bygningsblokke;
• bindemidler;
• afslibningsmidler;
• vaskning;
• udskillelse;
• bearbejdning af produktet;
• kromatografi;
• udskiftning af opløsningsmidler;
• isolering;
• tørring;
• affaldshåndtering.

En reduktion af miljøbelastningen kan kræve en samtidig forbedring af flere faser.

I den offentliggjorte analyse af peptidsyntese blev der behandlet problemerne forbundet med både syntesen og rensningen, og der blev påpeget behovet for at forbedre hele procesdesignet. [15]

Som en perspektivisk publikation er den ikke et kontrolleret direkte sammenlignende argument, der påviser, at en bestemt teknologi altid er mere miljøvenlig.

Ligeledes:

En hurtigere syntese betyder ikke automatisk en mere miljøvenlig syntese,

Og mindre forbrug af opløsningsmidler under selve syntesen betyder ikke automatisk, at hele produktionsprocessen har en mindre indvirkning.

Miljømæssige sammenligninger kræver anvendelse af sammenhængende analysegrænser og bør helst afspejle ressourceforbruget i forhold til en bestemt mængde af det isolerede og karakteriserede endelige produkt.

Ofte stillede spørgsmål

1. Hvordan adskiller peptidsyntese på fast fase sig fra syntese i flydende fase?

I syntesen i fast fase forbliver det voksende peptid forbundet med en uopløselig bærer, mens i den klassiske syntese forbliver det opløselige peptid i en opløsning og skal normalt genvindes på grundlag af sine fysiske og kemiske egenskaber. I et mere begrænset omfang har den opløselige voksende kæde desuden en opløselig markør eller bærer, der letter senere opsamling. Studier af markør-syntese viser en af strategierne for at kombinere opløselig syntesefase med opsamling ved at udtrække, mens litteraturen vedrørende LPPS adskiller sådanne løsninger fra både den klassiske syntese i opløsning og SPPS. Ingen metode er defineret som optimal for hvert peptid. Den grundlæggende forskel vedrører den fysiske fremgangsmåde og opsamlingen af det voksende kæde under de efterfølgende trin i syntesen. [8] [9]

2. Hvorfor kan der opstå forureninger under syntesen af peptider?

Forureninger kan opstå, fordi målrettede reaktioner ikke altid finder sted i mængder, og andre funktionelle grupper kan deltage i uønskede reaktioner. Ufuldstændig binding kan føre til delektioner, ufuldstændig afbinding kan forstyrre yderligere kædebinding, og nogle sekvenser er modtagelige for stereokemiske ændringer, aspartimidoproduktion, oxidation, omgruppering eller biprodukter forbundet med afbinding. Undersøgelser af syntese med Fmoc og strukturel analyse af syntetiske peptidsubstanser dokumenterer flere eksempler på dette. [11] [12] Hyppigheden og betydningen af de enkelte forureninger afhænger af sekvensen og processen, og automatisering af syntesen bør derfor ikke sammenlignes med fuldstændig fravær af kemiske fejl.

3. Hvilken rolle spiller harpiks i syntesen af peptider?

Gummi fastholder det voksende peptid, mens opløselige reagenser og mange biprodukter kan fjernes mellem de forskellige syntese-trin. Dette gør det betydeligt mere enkelt at gentage reaktionen, men gummi er ikke kun en mekanisk fastgørelse. Dens strukturen, graden af binding, polymerens struktur, kompatibiliteten med opløsningsmidler og tilgængeligheden af reaktionssteder kan påvirke effektiviteten af reagensernes indtræden i det tilsluttede peptid. I undersøgelser med en reaktor med variabel sammensætning blev gummiets opførsel monitoreret under analysen af aggregering og bindingseffektivitet. [4] Denne overvågning eliminerer ikke sekvensfejl, men den viser, hvorfor gummiets fysiske tilstand kan være en vigtig procesvariabel.

4. Hvad bruges Wanga-harpiks til i peptidsyntesen?

Wang-medier er almindeligt forbundet med fremstillingen af peptider, der frigives efter passende affejning fra C-enden i form af karboksylsyre. Den nøjagtige slutprodukt afhænger dog af linkeren, medierstrukturen og den anvendte affejningskemikalie, og ikke kun af navnet på harpiksen. Forskere har også præsenteret en specialmetode til omdannelse af peptydyl-Wang-TentaGel-materialet til peptidhydrider, som kan bruges som nyttige syntetiske biprodukter. [5] En alternativ reaktion ændrer ikke betydningen af den standardvise affejning fra Wang-harpiks. Den viser dog, hvorfor man under forudsigelsen af produktet bør analysere hele medierystemet og reaktionsbetingelserne.

5. Bygger SPPS peptidet fra N-enden eller fra C-enden?

Den klassiske fase-spesifikke peptid syntese starter normalt med tilslutningen af den C-terminale rest til bærergenet, hvorefter kæden forlænges i retning af N-enden. Dette er den modsatte retning som den standard lange kaskade på ribosomerne, hvor proteinet vokser ved at tilføje flere aminosyrer til C-enden. Syntese af BPTI er et eksempel på brugen af beskyttede byggestenblokke og bærergenet for at forhindre senere frigivelse, rensning og affaldsproduktion af produktet. [3] Der findes dog specialiserede peptidsyntese strategier, der anvender andre løsninger, og derfor bør opbygningen fra C-enden til N-enden defineres som den klassiske fase-spesifikke peptid syntese, og ikke som en absolut regel for alle syntese metoder.

6. Hvorfor er sikkerhedsgrupper nødvendige?

Aminosyrer indeholder ofte flere reaktive funktionelle grupper. Beskyttelsesgrupper forhindrer midlertidigt reaktionen i bestemte områder og efterlader det relevante sted tilgængeligt på et bestemt trin i syntesen. Dette hjælper med at styre rekkefølgen og sammensætningen af restene. Uden den rette beskyttelse kunne konkurrerende reaktioner føre til opståen af komplekse blandinger eller produkter med ændret struktur. Forskning om aspartimideproduktion viste, at ændring af beskyttelsesgruppen for karboksylgruppen kan begrænse en vigtig bivirkning i de undersøgte sekvenser [2]. Beskyttelsesgrupper garanterer ikke en perfekt syntese, men de giver en selektiv kemisk kontrol, som skal være i overensstemmelse med alle væsentlige trin i processen.

7. Hvad er forskellen mellem Fmoc og Boc?

Fmoc og Boc er almindeligt anvendte midlertidige grupper til beskyttelse af aminosyren, men de reagerer på andre kemiske betingelser. Fmoc fjernes normalt i basiske omgivelser, mens Boc er følsomt over for syrer. Denne forskel påvirker måden, hvorpå de forbinder med sidekædebeskyttelse, linkere og andre trin i syntesen. Syntese baseret på Fmoc er almindeligt anvendt i moderne SPPS, men undersøgelser har også vist mulighed for forekomst af sekvensafhængige sidekæde-reaktioner under sådanne betingelser. [11] I praksis er det derfor mere nyttigt at sammenligne hele beskyttelsesstrategier og deres overensstemmelse med den givne sekvens end at kun se på navne på de to beskyttelsesgrupper.

8. Hvad betyder ortogonal beskyttelse?

Ortogonal beskyttelse betyder, at en beskyttelsesgruppe kan fjernes under betingelser, hvor en anden beskyttelsesgruppe er tilstrækkelig stabil til at kunne fortsætte syntesen. Dette gør det muligt at identificere forskellige reaktive steder på bestemte stadier. Denne koncepte har stor betydning under kontrolleret syntese af komplekse peptider. Ortogonalitet er dog afhængig af betingelserne og ikke absolut: gentagen eksponering, sekvensens karakter og reaktionsparametre kan fortsat føre til bivirkninger. Eksperimenter med alternative metoder til beskyttelse af carboxylgrupper viser, hvordan beskyttelsesstrategien kan modificeres for at styre vanskelig peptidkemisk virkning. [2]

9. Hvad er en delecyndeløsning?

En delecyndelægning er et peptid, der er uden én eller flere rester, der er til stede i den tilsigtede målsekvens. Det kan opstå, når aminosyrebindingen ikke finder sted fuldstændigt, men en ikke-reagert kæde forbliver forbundet med bæreren og deltager i de efterfølgende cyklusser. Da den ufuldstændige kæde fortsat er forbundet med bæreren, behøver den normale rensning ikke fjerne den. Studier af realtidsmonitorering af SPPS viser, at ufuldstændig dannelse af amidbindinger er et vigtigt procesmæssigt problem. [4] Delecyndelægning er derfor et problem relateret til produktets struktur og identitet, og ikke kun resterne af reagenset.

10. Kan to to eller to peptidsubstanser have samme molekylvægt?

Ja. Forskellige molekylære strukturer kan have identisk eller uadskillelig nominell masse. Af denne grund bekræfter selve massekonvergens ikke en fuldstændig identitet af molekylet. I undersøgelser af et syntetisk peptid, der er en renin-substrat, er isobariske bestanddele af forureningen identificeret, hvor modifikationerne fandt sted på forskellige positioner. Derevatisering og tandemmassespektrometri gav yderligere strukturelle oplysninger. [12] Dette eksempel viser, hvorfor en overensstemmelse mellem den observerede masse og den forventede masse ikke alene kan bekræfte en korrekt sekvens, sammenhæng, stereokemi eller fravær af strukturelt lignende isomerer.

11. Hvad er epimerektion og racemisation i peptidsyntesen?

Epimerisering og racemisation er uønskede ændringer i stereokemisk konfiguration. Disse kan forekomme uden ændring af den nominelle aminosyresekvens eller molekylmasse, og derfor kan almindelig massebestemmelse ikke vise nogen strukturel forskel. I undersøgelser af mikrofot-støttet Fmoc-syntese er restkoncentrationer, der er modtagelige for stereokemiske ændringer, identificeret, og det er blevet påvist, at ændring af reaktionsbetingelserne kan begrænse sådanne processer. [11] Risikoen afhænger af molekylets blokkstruktur, sekvens og procesbetingelser. Stereokemisk kvalitet kræver derfor analytiske metoder, der kan vurdere konfigurationen, og kan ikke kun udledes af molekylmassebestemmelse.

12. Hvad er dannelsen af aspartimid?

Dannelsen af aspartimid er en uønsket reaktion forbundet med bestemte sekvenser, der indeholder aspartin. Dannelsen af det cykliske biprodukt kan føre til yderligere produkter med ændret skel eller stereokemi, hvilket nedsætter effektiviteten og gør rensning vanskelig. Forskere har analyseret alternative beskyttelsesstrategier, der er designet til at reducere denne reaktion i udvalgte peptider og proteiner. [2] Resultaterne viser ikke et universelt løsning for alle sekvenser, der indeholder aspartin. De viser dog, hvorfor designet af syntese- og forureningstilsynestrategier skal tage højde for den specifikke kemiske adfærd hos den pågældende sekvens.

13. Bekræfter den høje HPLC-renhed den korrekte identitet af peptidet?

Nej. HPLC-renheden beskriver prøven inden for rammerne af en bestemt kromatografidel, detektoren anvendt og analysen af dataene. En høj andel af hovedpartiklens overflade kan være et værdifuldt bevis på, at prøven domineres af én kromatografisk adskilt bestanddel, men den kan ikke alene bekræfte den fuldstændige molekylære identitet. Samarbejdende forureninger, stereoisomerer og andre varianter kan kræve yderligere teknikker. I studier af chiral analyse af peptider blev en specielt udviklet proces anvendt, som også tog højde for stereokemiske ændringer, der opstår under prøvepræpareringen. [13] Identitet og renhed bør derfor betragtes som relaterede, men separate analytiske spørgsmål.

14. Betegner produktets effektivitet det samme som renhed?

Nej. Produktets effektivitet ved rensning eller isolering bestemmer mængden af det genvundne målmateriale i forhold til den definerede oprindelige eller teoretiske mængde. Renhed beskriver imidlertid sammensætningen af det genvundne materiale efter en bestemt analytisk metode. Syntese kan føre til opnåelse af en relativt lille mængde af produkt af meget høj renhed eller en stor mængde råmateriale indeholdende en betydelig mængde forureninger. I undersøgelser af automatisk strømningssyntese rapporteres renheden af det råprodukt separat og effektiviteten efter isolering. [7] Afgrænsningen af disse parametre forhindrer fejlagtig behandling af den høje værdi af det ene parameter som bevis for den anden parameter.

15. Kan lange peptider fremstilles ved at kombinere kortere fragmenter?

Ja. I en fragmentær strategi kan kortere peptidsegmenter fremstilles separat og derefter kombineres med passende kemikalier. Ligering ved kemisk binding var et vigtigt eksempel, hvor ubeskyttede peptidsegmenter blev forbundet på en måde, der fører til dannelse af et naturligt peptidskal-bindingsforhold, og derefter opnåedes et formet protein. [10] Det betyder ikke, at ethvert peptidsegment kan forbinde sig spontant. Strukturen af segmenterne, bindingsteknologien, valg af forbindelsessted, opløselighed, stereokemi og rensningskrav skal derfor tages i betragtning. Ligering af segmenter er således en alternativ strategi for synteseudvikling, og ikke en automatisk løsning på problemerne vedrørende lange peptider.

16. Eliminerer hurtigere automatiseret syntese behovet for rensning?

Nej. Hurtigere automatiseret eller flow-baseret syntese forkorter tiden for de specifikke stadier af syntesen, men det beviser ikke, at hver opstået molekyle har den tilsigtede struktur. I undersøgelser af hurtig flow-syntese blev råmaterialet stadig karakteriseret og senere rensning anvendt, og i senere arbejder vedrørende automatisering blev renheden af råmaterialet og produktionshastigheden efter isolering fortsat sammenlignet separat. [6] [7] De gode resultater for systemet for de undersøgte sekvenser garanterer ikke også identiske resultater for ethvert nyt mål. Hastig syntese skal fortsat kombineres med passende rensning, identifikation, analyse af forureninger og slutkarakterisering.

17. Hvorfor er det sværere at øge produktionsmængden, end det er at fremstille en større part?

Størrelsesstørrelsen ændrer de fysiske og kemiske forhold, og ikke kun mængden af materiale. Blandning, varmeoverførsel, harpiksens udvidelse, fordeling af reagenser, tryk, filtrering, opløsningsmidlers anvendelse, halvprodukters opløselighed og mulighederne for rensningssystemet kan opføre sig anderledes ved større produktionsmængder. I en industriel analyse blev 40 peptidsynteseprocesser individuelt vurderet ved analyse af materialeforbrug under syntese, rensning og isolering. [14] Resultaterne viser, hvorfor produktionen skal betragtes som en komplet proces. En skalerbar metode skal gentagne gange føre til opnåelse af et karakteriseret materiale på alle trin, og ikke kun en større mængde råpeptider.

18. Er peptidet klar straks efter at den rigtige sekvens er blevet dannet?

Ikke nødvendigvis. Påføringen af en kæde skaber sekvensstrukturen kun i det omfang, at den bekræftes af processen og analytiske data. Afhængigt af molekylet kan der fortsat være behov for afsporing, afskilning, cyklisering, oxidering, dannelsen af disiarcykliske broer, folding, konjugation, rensning og karakterisering. Syntese af BPTI udgør et godt eksempel på en proces, hvor efter påføringen af en lineær sekvens fulgt af rensning og dannelse af en formet struktur indeholdende disiarcykliske broer fandt sted. [3] Begrebet „ferdigt peptid” bør derfor henvise til den molekylære form, der er nødvendig i det givne videnskabelige kontekst, og ikke kun til afslutningen af det trinvise tilførsel af aminosyrer.

19. Bekræfter den korrekte molekylmasse den korrekte peptidsekvens?

Nej. Massenligevægten er et værdifuldt bevis, men den kan ikke alene bekræfte den fulde sekvens eller molekylstrukturen. Isobariske strukturer kan have samme masse, og stereokemiske forskelle kan slet ikke medføre en ændring i massen af molekylet. Undersøgelser af forurening med syntetiske peptider har vist, at en differensiering af strukturelt forskellige bestanddele kan kræve tandemmassespektrometri og yderligere analyser. [12] For spørgsmål om stereokemisk integritet kan også kiral metoder være nødvendige. [13] Massen af molekylet bør derfor betragtes som et af elementerne i vurderingen af identiteten, og ikke som en fuldstændig bekræftelse af den.

20. Hvorfor bør rensning betragtes som en del af peptids produktion, og ikke kun som en endelig tilføjelse?

Rensningen afgør, om det målte peptid kan adskilles effektivt fra sekvenser af deleterende stoffer, biprodukter, reststoffer fra reagenser og andre bestanddele dannet under syntesen. En metode, der gør det muligt at producere store mængder råmateriale meget hurtigt, kan fortsat være upraktisk, hvis det ikke er muligt at genvinde det målte produkt af den ønskede kvalitet effektivt. Af denne grund tager analyse af peptidsynteseprocesser sammen syntese, rensning og isolering i betragtning. [14] Produktets effektivitet bør i sidste ende vurderes ud fra mængden og kvaliteten af det isolerede slutprodukt og ikke kun ud fra syntesehastigheden.

Begrænsninger ved sammenligning af metoder til syntese af peptider

Når man tolker undersøgelser, der sammenligner peptidsyntese-teknologier, er det vigtigt at huske på nogle vigtige begrænsninger.

For det første påvirker sekvensen kraftigt syntesevanskeligheden. En metode, der fungerer godt med et enkelt peptid, behøver ikke at fungere ens med et andet. Aggregation, hydrofobicitet, aminosyreindhold, længde, tendens til at danne sekundære strukturer og følsomhed over for bivirkninger kan ændre processens virkemåde.[1] [4]

For det andet er renheden af råmaterialet, produktiviteten efter isolering, den endelige renhed og indholdet af peptidet forskellige parametre. En sammenligning af metoderne udelukkende på grundlag af et af disse kan give et ufuldstændigt billede af produktionseffektiviteten. [7]

For det tredje betyder hurtig kædeopbygning ikke en hurtig produktion af hele materialet. Fjernelse af overfladeaflejringer, rensning, isolering, slutbehandling af strukturen, analytiske undersøgelser og dokumentation påvirker også den samlede produktionsperiode. [6] [7]

For det fjerde afhænger analytisk renhed af den anvendte metode. HPLC, massespektrometri, tandemmassespektrometri og chiralanalyse besvarer forskellige spørgsmål. Et analytisk resultat behøver ikke at bekræfte den fulde strukturelle identitet. [12] [13]

Femte, skalaen påvirker processen. Resultaterne af laboratorie-syntese kan ikke automatisk overføres til industriel produktion uden at tage højde for blandingen, masseoverførslen, mulighederne for rensning, materialeforbruget og andre skalaafhængige faktorer. [14]

Seks, historiske økonomiske sammenligninger kan med tiden miste deres aktualitet. Prisen på reagenser, niveauet af automatisering, teknologi til ekspression, udstyr til rensning, genvinding af opløsningsmidler og produktionsinfrastruktur udvikler sig konstant. Ældre omkostningsanalyser kan fortsat have videnskabelig relevans, men de behøver ikke at afspejle det aktuelle markedsekonomi. [1]

Sette, miljømæssige sammenligninger kræver sammenhængende analysegrænser. En vurdering af opløsningsmiddelforbruget under selve produktionsprocessen, mens rensning og isolering udelades, kan føre til forvirrende konklusioner om procesbalance. [14] [15]

Endelig angiver selve navnet på metoden ikke produktets kvalitet. SPPS, syntese i opløsning, LPPS, fragmentbinding og biologisk ekspression kan føre til at opnå materiale af høj kvalitet, hvis processen er designet og kontrolleret korrekt. Ingen af disse metoder garanterer dog automatisk den korrekte identitet, renhed, stereokemisk balance, folding eller anvendelighed til et bestemt formål.

Sammenfatning

Syntese af peptider kan bedst forstås som en kontrolleret proces for at fremstille molekyler, og ikke blot som dannelsen af peptidsammenhænge.

Formålet er at opbygge en bestemt aminosyresekvens samtidig med at man kontrollerer måden hvorpå restene forbinder sig, beskyttelsesgruppernes kemi, stereokemi, bivirkninger og alle andre strukturelle krav.

Syntese af peptider på fast fase opretholder den voksende kæde på et uopløseligt medium, hvilket gør de gentagne faser forbinding og vaskning velegnede til automatisering. Fordelene ved gentagne opbyggninger eliminerer dog ikke problemer som ufuldstændige reaktioner, aggregering, sekvensielle delektioner eller sekvensafhængige bivirkninger. [4] [6] [7]

Den klassiske syntese i en opløsning bevarer peptidprodukterne i flydende fase og kan give større fleksibilitet i isoleringen og karakteriseringen af de enkelte mellemprodukter. Men gentagne opløsninger og forringet opløselighed kan dog blive alvorlige begrænsninger.

Metoder til syntese i flydende fase med opløselige markører forsøger at kombinere opløsningskemien med designet strategier til materialgenvinding. De kan derfor være en ekstra mulighed i tilfælde af sekvenser og produktionsproblemer, hvor den klassiske SPPS ikke er optimal. [8] [9]

Længere eller særligt komplekse molekyler kan også fremstilles ved at sammenstille dele, herunder nativ kemisk ligering, i stedet for kun at basere sig på kontinuerlig tilføjelse af nye aminosyrerester. [10]

Uanset hvilken metode der vælges til at formulere det, forbliver effektiviteten af bindingen og kemien i beskyttelsesgrupper afgørende, da små ueffektiviteter og bivirkninger kan akkumuleres i de efterfølgende trin i syntesen. Dannelsen af aspartimid, delecykliske sekvenser og stereokemiske ændringer viser, hvorfor selve den tilsigtede sekvens ikke beskriver alt, hvad der kan opstå under processen.[2][11][12]

Arbejdet slutter heller ikke med at man lægger kæden sammen.

Rensningen afgør, om det endelige produkt kan adskilles fra de andre bestanddele.

Herefter svarer de passende valgte analytiske metoder på specifikke spørgsmål vedrørende identitet, renhed, indhold, stereokemi, konformitet og – hvis det er relevant – funktionel aktivitet. [3] [12] [13]

En stigning i produktionsomfanget indfører nye aspekter ved masseoverførsel, holdbarhed af harpiks, forbrug af opløsningsmidler, filtrering, muligheder for rensning, procesgennemskuelighed og dens miljømæssige indvirkning. Af denne grund bør en industriel vurdering af processen omfatte syntese, rensning og isolering sammen, i stedet for kun at fokusere på sammenkoblingshastigheden. [14] [15]

Den vigtigste regel er følgende:

Effektiv peptidproduktion kræver kontrol af hele processen – fra molekylær design og bindinger til rensning og strukturel karakterisering. At opnå en kæde med den forventede nominelle masse eller en høj hovedchromatografisk peak er værdifuld dokumentation, men ingen af disse parametre kan alene bekræfte den fulde molekylære identitet eller kvaliteten af produktionsprocessen.

Ansvarsfraskrivelse

Artikelet har udelukkende en uddannelsesmæssig og videnskabelig-informativ karakter. Det beskriver de generelle principper for peptidkemien, syntese i fast fase, syntese i opløsning og i flydende fase, beskyttelsesgruppes strategier, bindinger, rensning, analytisk karakterisering, produktionsprocesser samt eksempler fra offentliggjorte undersøgelser. Det er ikke et laboratoriumprotokol, produktionsvejledning, medicinsk rådgivning, vejledning vedrørende dosering eller administration, eller en certifikat for kvaliteten af et bestemt peptidprodukt. Resultaterne af eksperimenterne bør fortolkes i forhold til sekvensen, de anvendte metoder, processkalaen, analytiske teknikker og begrænsninger ved de enkelte undersøgelser.

Referencer

1. Stráner, P., Taricska, N., Szabó, M., Tóth, G. K., & Perczel, A. (2016). Bakteriel ekspression og/eller fastfase-peptidsyntese af polypeptider og miniproteiner med en længde på 20-40 aminosyrer, casestudiet for Class B GPCR-ligander. Current Protein & Peptide Science, 17(2), 147–155. https://doi.org/10.2174/1389203716666151102105215
2. Neumann, K., Farnung, J., Baldauf, S., & Bode, J. W. (2020). Forebyggelse af aspartimidedannelse under peptidsyntese ved brug af cyanosulfuryler som carboxylsyregrupper. Nature Communications, 11(1), Artikel 982. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14755-6
3. Ferrer, M., Woodward, C., & Barany, G. (1992). Fusionssyntese i fast fase af bovin pankreatisk trypsininhibitor (BPTI) og to analoger. En kemisk tilgang til at evaluere disulfidbroernes rolle i proteinfoldning og stabilitet. International Journal of Peptide and Protein Research, 40(3–4), 194–207. PubMed-optegnelse
4. Sletten, E. T., Nuño, M., Guthrie, D., & Seeberger, P. H. (2019). Real-time overvågning af fastfase-peptidsyntese ved brug af en variabel bed-flow-reaktor. Chemical Communications, 55(97), 14598–14601. https://doi.org/10.1039/c9cc08421e
5. Bello, C., Kikul, F., & Becker, C. F. W. (2015). Effektiv fremstilling af peptidhydrazider via direkte hydrazinolysering af Peptidyl-Wang-TentaGel-harpiks. Journal of Peptide Science, 21(3), 201–207. https://doi.org/10.1002/psc.2747
6. Simon, M. D., Heider, P. L., Adamo, A., Vinogradov, A. A., Mong, S. K., Li, X., Berger, T., Policarpo, R. L., Zhang, C., Zou, Y., Liao, X., Spokoyny, A. M., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2014). Rapid flow-based peptide synthesis. ChemBioChem, 15(5), 713–720. https://doi.org/10.1002/cbic.201300796
7. Mijalis, A. J., Thomas, D. A., III, Simon, M. D., Adamo, A., Beaumont, R., Jensen, K. F., & Pentelute, B. L. (2017). En fuldautomatiseret flowbaseret metode til accelereret peptidsyntese. Nature Chemical Biology, 13(5), 464–466. https://doi.org/10.1038/nchembio.2318
8. Sharma, A., Kumar, A., de la Torre, B. G., & Albericio, F. (2022). Flydende-fase-peptidsyntese (LPPS): En tredje bølge inden for peptidfremstilling. Chemical Reviews, 122(16), 13516–13546. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132
9. Takahashi, D., Yano, T. & Fukui, T. (2012). Ny amidetypen med diphenylmethyl som beskyttende gruppe til effektiv syntese af peptider i flydende fase: AJIPHASE. Organic Letters, 14(17), 4514–4517. https://doi.org/10.1021/ol302002g
10. Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., & Kent, S. B. (1994). Syntese af proteiner ved naturlig kemisk ligering. Videnskab, 266(5186), 776–779. https://doi.org/10.1126/science.7973629
11. Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Begrænsning af racemisering og aspartimidedannelse ved mikrobølgeteknologi til syntese af fmk-holdige peptider i fast fase. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
12. Mathews, W. R., Runge, T. A., Haroldsen, P. E., & Gaskell, S. J. (1989). Karakterisering af urenheder i et syntetisk renin-substratpeptid ved hurtigatom-bombardement-massespektrometri og hybrid tandem-massespektrometri. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 3(9), 314–319. https://doi.org/10.1002/rcm.1290030912
13. Goodlett, D. R., Abuaf, P. A., Savage, P. A., Kowalski, K. A., Mukherjee, T. K., Tolan, J. W., Corkum, N., Goldstein, G. & Crowther, J. B. (1995). Peptid-kiralitetsbestemmelse: Hydrolyse i deuterat syre, derivatisering med Marfey’s reagens og analyse ved brug af højtydende flydende kromatografi-elektrospray-ionisations-massespektrometri. Journal of Chromatography A, 707(2), 233–244. https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)00352-n
14. Kekessie, I., Wegner, K., Martinez, I., Kopach, M. E., White, T. D., Tom, J. K., Kenworthy, M. N., Gallou, F., Lopez, J., Koenig, S. G., Payne, P. R., Eissler, S., Arumugam, B., Li, C., Mukherjee, S., Isidro-Llobet, A., Ludemann-Hombourger, O., Richardson, P., Kittelmann, J., … van den Bos, L. J. (2024). Process mass intensity (PMI): En holistisk analyse af aktuelle peptidfremstillingsprocesser informerer om bæredygtighed i peptidsyntese. Journal of Organic Chemistry, 89(7), 4261–4282. https://doi.org/10.1021/acs.joc.3c01494
15. Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019). Bæredygtighedsudfordringer i peptidsyntese og -rensning: Fra forskning og udvikling til produktion. Journal of Organic Chemistry, 84(8), 4615–4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001