Peptidų faginių ekranavimas: atranka, selekcija ir validacija

Peptidų faginių ekranavimas yra tyrimų technika, sukurianti tiesioginį ryšį tarp bakteriofago paviršiuje pateikiamo peptido ir šį peptidą koduojančios DNR sekos. Mokslininkai gali pateikti labai didelę fagų, pasižyminčių skirtingomis peptidų sekomis, populiaciją sąlyčiui su pasirinktu molekuliniu taikiniu, išskirti fago dalis, kurios liko susijusios su šiuo taikiniu, o tada nustatyti pateikiamų peptidų sekas, išanalizuodami jų genetinę medžiagą. Tokiu būdu išskirtos sekos tampa tolesnių tyrimų kandidatais. Tačiau vien jų atrinkimo faktas nereiškia, kad jos jau yra patvirtinti ligandai, pasižymi didele selektyvumu, biologiniu aktyvumu ar terapiniu potencialu.

Šis metodas yra ypač naudingas, nes sujungia eksperimentiškai stebimą molekulinę sąveiką su genetine informacija, kurią vėliau galima atgauti ir išanalizuoti. Kartu būtent šis privalumas sukuria esminį interpretacinį iššūkį. Susirišimas su numatytu taikiniu nėra vienintelis veiksnys, lemiantis, kurios sekos tampa gausesnės phage display eksperimento metu. Pradinės bibliotekos sudėtis, sąveika su paviršiais ir eksperimente naudojamomis medžiagomis, bakterijų dauginimosi skirtumai, kai kurių fagų pranašumas propagacijos metu, sekvenavimo gylis bei vėlesnės duomenų analizės būdas gali turėti įtakos tam, kurios sekos galiausiai atrodo stipriausi „laimėtojai”.

Šiame straipsnyje aiškinami svarbiausi peptidų faginio ekrano koncepciniai etapai ir įrodymų tipai, kurių reikia norint pereiti nuo praturtintos peptidinės sekos prie moksliškai pagrįstos išvados apie surišimą. Dėmesys telkiamas į atrankos, selekcijos, sekvenavimo, sisteminių klaidų šaltinių, validavimo ir įrodymų interpretavimo principus. Tekste aprašomi tyrimo metodo pagrindai, o ne išsamus laboratorinis protokolas.

Kaip fagų ekranavimas (phage display) leidžia pateikti (prezentuoti) peptidų seka

Pateiktos molekulės sąsaja su jos genetiniu įrašu

Bakteriofagas yra virusas, užkrečiantis bakterijas. Peptidų fago display (fagų atrankos) metode DNR, koduojanti tam tikrą peptidinę seką, gali būti įterpta į sistemą taip, kad peptidas būtų susijęs su fago apvalkalo baltymu. Todėl susidariusi fago dalelė neša dviejų tipų tarpusavyje susijusią informaciją: jos genetinė medžiaga turi peptidą koduojančią seką, o atitinkamas peptidas yra fiziškai pateikiamas ant dalelės paviršiaus.

Šis santykis dažnai apibūdinamas kaip genotipo ir fenotipo ryšys. Genotipas, esantis fago viduje, išlieka susijęs su molekuliniu fenotipu, rodomu jo paviršiuje.

Novatoriškas 1985 m. Smitho darbas eksperimentiškai parodė, kad svetimos sekwencijos gali būti pateiktos ant siūlinių bakteriofagų paviršiaus antikūnui prieinama forma, o fagus, kuriuose yra atpažįstama sekwencija, vėliau galima praturtinti. Šis tyrimas sukūrė svarbius koncepcinius ir eksperimentinius pagrindus šiuolaikinių faginių ekranų (phage display) bibliotekų kūrimui. Vis dėlto jo nereikėtų suprasti kaip įrodymo, kad kiekviena įvesta peptidų sekwencija bus vienodai sėkmingai ekspresuojama, pateikiama, sulankstoma ar atrenkama. [1]

Galimybė atgauti genetinę informaciją yra viena iš savybių, skiriančių faginę atranką (phage display) nuo paprasto taikinio pateikimo sąlyčiui su sudėtingu neatpažintų laisvų peptidų mišiniu. Atrankos etape atgavus fagą, jo genetinės medžiagos sekvenavimas leidžia nustatyti pateikiamo peptido kandidato tapatybę.

Vis dėlto vien tik sekos nustatymas pirmiausia parodo, koks peptidas buvo pateiktas išskirto fago. Tai automatiškai nepaaiškina, kodėl būtent ši dalelė buvo sulaikyta eksperimento metu. Siekiant įrodyti, kad už stebimą sąveiką su taikiniu tikrai atsakingas pateiktas peptidas, reikia papildomų kontrolinių tyrimų ir patvirtinimo.

Fag yra eksperimentinės pristatymo sistemos dalis

Atrankos metu pristatomas peptidas nėra visiškai nepriklausoma molekulė. Jis yra susijęs su daug didesne biologine dalele, o jo orientacija, prieinamumas, vietinė molekulinė aplinka, kopijų skaičius ir padėtis gretimų apvalkalo baltymų atžvilgiu gali turėti įtakos sąveikai su taikiniu.

Dėl šios priežasties peptidas, kuris, atrodo, stipriai jungiasi su taikiniu, kai yra pateiktas fago paviršiuje, gali elgtis kitaip po cheminės sintezės ir analizės kaip nepriklausoma molekulė.

Tai tiesiogiai susiję su skirtumu tarp afiniškumo ir avidumo. Afiniškumas apibūdiną vienos molekulinės sąveikos tarp susijungiančių partnerių stiprumą. Tuo tarpu avidumas reiškia bendrą stiprumą, atsirandantį tuomet, kai vienu metu vyksta kelios sąveikos.

Jei kelios pateikto peptido kopijos sąveikauja vienu metu su daugybe taikinio molekulių, esančių paviršiuje, fagas gali būti sulaikomas labai veiksmingai dėl daugiarūšių sąveikų, net jei vienos, izoliuotos peptido molekulės radimosi afinitetas yra žymiai silpnesnis.

Stiprus fago dalelės sulaikymas neturėtų būti automatiškai interpretuojamas kaip tokio pat stipraus laisvo peptido giminingumo įrodymas. Moksliškai vertingame aprašyme reikėtų nurodyti pateikimo sistemą ir, jei tai svarbu, molekulinę formą, naudotą vėlesnės validacijos metu. Rezultatai, gauti su izoliuotu sintetiniu peptidu, visa fago dalele ar ta pačia seka, prijungta laisvu prie kito nešiklio, atitinka į susijusius, bet vis dėlto skirtingus mokslinius klausimus.

Linijinės ir konformaciškai apribotos bibliotekos tiria kitas struktūras

Fago bibliotekos taip pat gali skirtis pristatomų sekvencijų prieinamų struktūrų požiūriu.

Linijinės bibliotekos pateikia sekas be specialiai įvedamo apribojimo, kuris priverstų suformuoti kilpos struktūrą. Konformaciškai apribotose bibliotekose galimų peptido konformacijų diapazonas tikslingai susiaurinamas, pavyzdžiui, įterpiant cisteino likučius abiejose atsitiktinio regiono pusėse. Disulfidinio tiltelio susidarymas tuomet gali lemti kilpos susidarymą.

Nė vienas iš šių variantų iš esmės nėra geresnis kiekviename eksperimente. Tinkamiausia architektūra priklauso nuo tiriamo tikslo, analizuojamos molekulinės sąveikos tipo ir galutinės formos, kurioje peptide turi būti atliekamas tyrimas.

Tokie pavadinimai kaip Ph.D.-12 ir Ph.D.-C7C, dažnai aptinkami publikacijose apie faginių atrankos (phage display) sistemą, nurodo skirtingas bibliotekų architektūras. Gamintojo dokumentacijoje Ph.D.-12 apibūdinama kaip biblioteka, kurioje yra atsitiktiniai 12 aminorūgščių liekanų ilgio pepertidiniai intarpai, o C7C konstrukcijoje yra septynios atsitiktinės aminorūgščių pozicijos, esančios tarp cisteino liekanų, kurios gali apriboti struktūrą, suformuodamos disulfidiniu tilteliu stabilizuotą kilpą.

Svarbu tai, kad septynių atsitiktinių pozicijų nereikėtų suprasti kaip visų aminorūgščių, esančių visoje pateiktoje konstrukcijoje. Šie pavadinimai apibūdina konkrečius tiriamųjų bibliotekų projektus. Jie negarantuoja, kad kuri nors iš bibliotekų leis gauti labai selektyvų kandidatą į konkretų taikinį. [2,3]

Bibliotekos konstrukcija ir jos įvairovė

Biblioteka yra populiacija, o ne tik galimų sekų sąrašas

Fagų display biblioteka koncepciškai prasideda nuo kintamų DNR sekų projekto ir jų sujungimo su faginiu pateikimo būdu. Tačiau fiziškai sukūrus biblioteką, ji tampa biologine populiacija, o ne tik matematiniu visų teoriškai įmanomų sekų sąrašu.

Atsakingi intarpai tikrai turi atsidurti bibliotekoje, būti palaikomi, ekspresuojami, tinkamai įtraukti į fago daleles ir plisti gyvoje biologinėje sistemoje.

Dėl šios priežasties kelios skirtingos sąvokos, susijusios su bibliotekos „dydžiu” ar „įvairove”, neturėtų būti vartojamos kaip ančių pakaitiniai terminai.

Jei pavyzdinėje bibliotekoje septynias pozicijas gali užimti bet kuris iš 20 standartinių aminorūgščių, matematinė sekvencijų erdvė yra 20 pakelta septintuoju laipsniu. Kintamo regiono pailginimas iki 12 pozicijų nepaprastai padidina šią teorinę erdvę.

Šie skaičiavimai tačiau apibūdina sekų, kurios teoriškai galėtų egzistuoti, skaičių. Jie neįrodo, kad kiekviena įmanoma seka buvo iš tikrųjų sukurta, išliko bibliotekos konstravimo metu arba yra aptinkama panašiu kopijų skaičiumi.

Šis skirtumas tampa vis svarbesnis didėjant teoretinei sekų erdvei. Bibliotekoje gali būti milžiniškas fizinių dalelių skaičius, tačiau ji vis tiek apima tik nedidelę dalį visų matematiškai įmanomų peptidų.

Atsitiktinumas nereiškia tolygaus atstovavimo

Bibliotekos apibūdinimas kaip „randomizuotų” apibūdina sekų įvairovės kūrimo būdą. Tai nereiškia, kad kiekvienas aminorūgšties ar kiekviena įmanoma seka pasitaiko vienodu dažniu.

Pats DNR dizainas jau gali įvesti disbalansą. Genetinis kodas yra deenervuotas, o tai reiškia, kad keli skirtingi kodonai gali koduoti tą patį aminorūgštį, o kai kurie kodonai veikia kaip STOP signalai. Priklausomai nuo nukleotidų randomizavimo būdo, tam tikros aminorūgštys gali būti per daug atstovaujamos dar prieš prasidedant biologinei atrankai.

Papildomi nuokrypimai gali rastis bibliotekos konstrukcijos, ekspresijos, sekučių įtakos fagų gyvybingumui ir jų dauginimosi bakterijose metu.

Naujos kartos sekvenavimo analizė, paskelbta 2022 metais, parodė, kad komercinėje 12 amino rūgščių bibliotekoje sekvencijos yra atstovaujamos netolygiai, yra stop kodonų ir daug lakinio tipo klonų dar prieš atliekant tikslinę atranką. [4]

Tai nereiškia, kad kiekviena komercinė biblioteka turės lygiai tokias pačias savybes. Tačiau tyrimas eksperimentiškai parodo, kad jau pradinė biblioteka gali turėti svarbią struktūrą ir tam tikrus poslinkio šaltinius, dar prieš jai susiduriant su tiriamu taikiniu.

Laukinio tipo arba be tikėtino įterpinio esančių dalelių buvimas yra ypač svarbus norint teisingai interpretuoti fago dalelių skaičių. Milžiniškas bendras fagų skaičius nebūtinai reiškia proporcingai didelį unikalių ir teisingai pateiktų peptidų variantų skaičių.

Pristatymo vieta gali turėti įtakos šališkumui

Pati pateikimo sistemos architektūra gali turėti įtakos tam, kurios sekos išliks ir bus reprezentuojamos bibliotekoje.

2018 m. tyrime buvo sekamos genetiškai koduotos peptidų bibliotekos tolimesniuose konstravimo, biologinės ekspresijos ir vėlesnių cheminių modifikacijų etapuose. Biologinės ekspresijos metu buvo pastebėtas didelis įvairovės sumažėjimas, taip pat tam tikrų aminorūgščių preferencijos skirtumai, priklausantys nuo peptidų pateikimo sistemoje vietos. [5]

Tai yra eksperimentinis įrodymas, kad sistemos architektūra nėra tik pasyvi nešančioji terpė. Ji gali aktyviai formuoti vėlesnei atrankai prieinamos populiacijos sudėtį.

Tai nereiškia, kad biblioteka, turinti poslinkį, yra bevertė. Praktiškai kiekviena biologinė atrankos sistema turi tam tikrų apribojimų. Svarbiausia yra juos įvertinti interpretuojant rezultatus.

Potencialiai vertingas peptidas gali nepasirodyti populiacijoje po atrankos dėl to, kad nuo pat pradžių buvo menkai atstovaujamas, buvo pateiktas su mažu našumu arba jo fagas silpnai dauginosi, o ne dėl to, kad peptidas nesugebėjo susieti taikinio.

Priešingai, seka, kuri jau iš pradžių yra išskirtinai gausi, po atrankos gali išlikti dominuojanti iš dalies dėl savo pranašumo pradiniame kiekyje.

Atsistos bibliotekos dalys neturi būti vienodos

Net bibliotekos, pagamintos arba parduodamos tuo pačiu pavadinimu, neturėtų būti automatiškai laikomos identiškomis sekos sudėties požiūriu.

2025 m. tyrime buvo palygintos dvi tos pačios fofų ekspozicijos (phage display) bibliotekos partijos ir stebėti jų sudėties pokyčiai tolimesnių pagausinimo etapų metu. Tyrėjai nustatė skirtumus tiek pradinėje sekų sudėtyje, tiek tame, kaip populiacijos kito propagavimo metu. Tarp stipriai praturtintų kandidatų buvo sekų, kurių pranašumas galėjo būti susijęs su geresniu pagausinimu, o ne su numatoma sąveika su taikiniu. [6]

Ši išvada yra svarbi tyrimų pakartojamumui. Vien tik bibliotekos komercinio pavadinimo nurodymas ne visuomet apibūdina visas pradinės populiacijos savybes. Partijos numeris, jos pradinė sudėtis bei padauginimo istorija gali padėti paaiškinti, kodėl du iš pirmo žvilgsnio panašūs eksperimentai duoda skirtingus kandidatus.

Rišimo atranka ir praturtinimas

Atranka atskiria sulaikytas daleles nuo pradinės populiacijos

Atliekant tipinę atranką, orientuotą į sąveiką, fagų biblioteka yra veikiama preparato, turinčio tyrėjus dominantį molekulinį taikinį. Medžiaga, kuri nesusijungia su eksperimentine sistema, pašalinama, o sulaikytos fago dalelės išgryninamos.

Atsigavusi populiacija vėliau gali būti analizuojama, dauginama arba naudojama tolesniuose atrankos etapuose. Visas šio tipo procesas dažnai vadinamas biopaningu.

Nors pagrindinė idėja gali primena tiesioginį peptido ir taikinio sąveikos testą, kiekvienas eksperimento etapas gali turėti įtakos tam, kurie fagai galiausiai išgyvens.

Fagas gali būti sulaikytas todėl, kad prezentuojamas peptidas atpažįsta numatytą taikinį. Tačiau jis taip pat gali sąveikauti su pagalbiniu paviršiumi, taikinio prezentavimo sistema, žymekliu, gaudomuoju reagentu, nešikliu ar kitu eksperimentinės sistemos elementu.

Atkūrimo ir vėlesnio padauginimo procesas gali sukelti papildomų atrankos spaudimų.

Praktikoje eksperimentas todėl atrenka faginių dalelių dalis remdamasis jų gebėjimu pereiti visą eksperimentinį procesą, o ne vien tik viena idealizuota peptido ir taikinio interakcija. Tinkamos kontrolės priemonės yra reikalingos norint nustatyti, kokia stebėto praturtėjimo dalis iš tikrųjų gali kilti dėl tiriamos molekulinės interakcijos.

Negatyvi atranka patikrina, ką dar gali atpažinti kandidatas

Kontrselekcija, arba neigiama atranka, naudojama sąveikai su medžiagomis, kurių kandidatas neturėtų atpažinti, tirti arba apriboti.

Priklausomai nuo eksperimento, tai gali būti, tarp kitko, tikslo neturintis pagrindas, nesvarbus baltymas, nešiklis, gaudantysis reagentas, gimininga ląstelių populiacija arba kitas eksperimentinės sistemos elementas.

Informatyviausios kontrolės priklauso nuo to, kaip pristatomas taikinys. Jei išgrynintas taikinys buvo imobilizuotas naudojant tam tikrą molekulinį žymeklį, reikėtų atsižvelgti į galimybę susirišti su šiuo žymekliu arba gaudymo sistema.

Jei tikslusis tyrimo klausimas yra tam tikro tipo ląstelių atpažinimas, palyginimas su panašiomis ląstelėmis gali būti informatyvesnis nei kontrolinė grupė, apimanti tik gryną (izoliuotą) baltymą.

Vis dėlto ryšio su vienu kontroliniu objektu nebuvimas nereiškia universalaus specifiškumo. Selektyvumas visada yra lyginamasis. Teiginys, kad peptidas yra „specifinis”, lieka neužbaigtas, kol nežinoma, su kokiais alternatyviais taikiniais, paviršiais, ląstelėmis, baltymais ar sistemos komponentais jis buvo tirtas ir kokiomis sąlygomis.

Neigiama atranka gali apriboti vieną nepageidaujamų sąveikų tipą, tačiau negali atmesti visų galimų poveikių už numatytojo tikslo ribų.

Praturtinimas reiškia populiacijos sudėties pasikeitimą

Fidžo eksponavimo metode praturtinimas reiškia, kad tam tikra sekcija arba panašių sekcijų grupė tampa labiau atstovaujama lyginant su ankstesne populiacija arba atitinkama kontroline grupe.

Tai yra labai naudinga atrenkant kandidatus tolimesnei analizei, nes tai rodo, kad tam tikri bibliotekos elementai eksperimentinio proceso metu yra reprezentuojami pirmenybės tvarka.

Vis dėlto praturtinimas nėra tiesioginis giminingumo, disociacijos konstantos, biologinio aktyvumo ar universaliojo selektyvumo taikinio atžvilgiu matavimas.

Šią problemą gerai iliustruoja tyrimas, susijęs su peptidine seka, daug kartų atrinkta fago display eksperimentuose. Galiausiai buvo įrodyta, kad stebėta klono sėkmė atsirado dėl mutacijos kitoje fago genomo vietoje, kuri leido efektyviau daugintis net ir be numatytos selekcinės presijos, susijusios su taikiniu. Atitinkamų genetinių pokyčių rekonstrukcija leido atskirti pateikiamo peptido seką nuo klono propagacinio pranašumo. [7]

Šis pavyzdys rodo, kodėl pakartotinis tos pačios sekos išskyrimas neturėtų būti automatiškai laikomas pakartotiniu jos sąveikos patvirtinimu.

Populiacijos po atrankos palyginimas su kontrolinėmis grupėmis, apimančiomis tik padauginimą, arba kitomis tinkamomis kontrolinėmis grupėmis gali padėti nustatyti, ar tam tikra seka tampa gausesnė būtent dėl kontakto su taikiniu, ar todėl, kad su ja susijęs klonas geriau dauginasi biologiškai.

Didesnis ratų skaičius automatiškai nereiškia stipresnių įrodymų

Atrankos etapų kartojimas gali padidinti tikrai vertingų kandidatų dalį, tačiau taip pat gali sustiprinti jau esamą pradinės populiacijos šališkumą arba paskatinti klonus, turinčius pranašumą dauginimesi.

Laipsniškas sekvencijų įvairovės siaurėjimas todėl gali rodyti naudingą, nuo tikslo priklausomą praturtėjimą, tačiau vien populiacijos susiaurėjimas neįrodo, kad didėja molekulinė kokybė ar kandidatų giminingumas.

Jei ankstyvame eksperimento etape pirmenybė teikiama jungimuisi su netinkamu paviršiumi ar reagentu, vlesni ratai gali dar veiksmingiau praturtinti būtent šią nepageidaujamą sąveiką.

Vadinasi, nėra jokios universalios taisyklės, pagal kurią didesnis atrankos ratų skaičius automatiškai lemia geresnį rezultatą. Tinkamas proceso pabaigos momentas priklauso nuo tyrimo klausimo, populiacijoje stebimų pokyčių, kontrolinių rezultatų, įvairovės ir įrodymų, rodančių, kad iš tikrųjų vyksta nuo tikslo priklausoma atranka.

Papildomi ratai nepataisys netinkamo tikslo pristatymo būdo ir nepakeis nepriklausomo patvirtinimo.

Atrinktų kandidatų sekvenavimas

Sanger sekvenavimas ir NGS rodo populiaciją iš skirtingų perspektyvų

Atskirų išskirtų klonų sekvenavimas leidžia nustatyti konkrečius peptidų kandidatus ir tebėra naudingas, kai tam tikrus klonuose esančius darinius reikia išsamiau charakterizuoti.

Naujos kartos sekvenavimas, arba NGS, leidžia išanalizuoti kur kas didesnę populiacijos dalį. Tai leidžia gauti informaciją apie sekų dažnių pasiskirstymą, panašių sekų šeimas, įvairovę bei pokyčius, vykstančius tarp skirtingų atrankos etapų.

Tačiau nė vienas iš šių metodų nesuteikia idealiai išsamaus ir visiškai be klaidos vaizdo apie visas populiacijoje esančias molekules.

Sekwencavimo gylis, amplifikacijos artefaktai, techninės klaidos, mėginių paruošimas, filtravimo slenksčiai ir bioinformatiniai sprendimai gali turėti įtakos stebimam sekų pasiskirstymui.

Resursti retą sekvencią gali būti sunku atskirti nuo techninio triukšmo, tuo tarpu labai gausus, bet biologiškai nereikšmingas variantas gali dominuoti duomenų rinkinyje, jei bus praleistas jo biologinis kontekstas.

2023 m. tyrimas, kuriame buvo lyginami skirtingi sekvenavimo gyliai, parodė, kad didesnis skaitinių nuskaitymų skaičius leidžia aptikti papildomas unikalias seka ir keičia bibliotekos heterogeniškumo vaizdą. [8]

Tai nereiškia, kad egzistuoja viena konkreti nuskaitymų skaičiaus vertė, garantuojanti išsamų charakterizavimą. Sekoskaitos gylis turi atitikti analitinį klausimą.

Duomenų tvarkymo būdas turi būti aiškiai aprašytas

Sekvencijų analizė tampa kur kas lengviau suprantama, kai taisyklės, pagal kurias neapdoroti duomenys paverčiami peptidų kandidatų sąrašu, pateikiamos aiškiai.

Tyrėjams gali prireikti nustatyti numatomas intarpo ribas, patvirtinti tinkamą skaitymo rėmelį, apibrėžti kokybės kriterijus ir nustatyti, kaip elgiamasi su neįprastomis intarpų ilgio reikšmėmis, stop kodonais, neužbaigtis skaitymais ir kitomis neįprastomis sekomis.

Leidinyje taip pat verta atskirti neapdorotus sekvenavimo nuskaitymus, nuskaitymus po kokybinio filtravimo, unikalias DNR sekas ir unikalias išverstas peptidų sekas.

Šis skirtumas yra svarbus, nes dėl genetinio kodo degeneracijos kelios skirtingos DNR sekos gali koduoti lygiai tą pačią aminorūgščių seką.

Savo ruožtu labai panašios peptidų sekos gali būti kilusios iš iš tikrųjų giminingų klonų, techninių sekvenavimo klaidų arba skirtingų genetinių variantų.

Nukleotidų sekų skaičiavimas ir išverstų peptidinių sekų skaičiavimas todėl atsako į skirtingus klausimus.

Skaidrus analitinis procesas turėtų išsaugoti pakankamai informacijos, kad kitas tyrėjas galėtų suprasti, kodėl konkrečios paraiškos buvo išsaugotos, atmestos, sujungtos ar pripažintos prioritetinėmis.

Pati galutinė peptidinių sekvencijų lista be informacijos apie pirminių duomenų apdorojimo būdą yra kur kas sunkiau įvertinama ir atgaminama.

Sekvenciniai motyvai yra hipotezės apie atpažinimą

Motyvas yra pasikartojantis sekvenavimo modelis, aptinkamas tarp panašių peptidų kandidatų.

Jei keli nepriklausomai praturtinti peptidai tam tikrose pozicijose turi panašių aminorūgščių, bendri liekanų fragmentai gali būti svarbūs tiriamo taikinio atpažinimui.

Tačiau vien pakartojimas neįrodo, kad atitinkamas motyvas yra atsakingas už jungimosi mechanizmą.

Tas pats motyvas gali atsirasti todėl, kad tam tikros aminorūgštys buvo per didelio atstumo išvestinėje bibliotekoje, tam tikros sekakos buvo sėkmingiau pateiktos ar padaugintos, arba eksperimentinė sistema teikė pirmenybę tam tikrai struktūrinei savybei, kuri nėra tiesiogiai susijusi su numatytu tikslu.

Palyginimas su pradine populiacija ir atitinkamomis neigiamomis kontrolėmis gali padėti atskirti šias galimybes.

Nepriklausomi eksperimento pakartojimai taip pat suteikia daugiau informacijos nei pakartotinis skirtingų tos pačios, iš anksto atrinktos populiacijos dalių analizavimas.

Patraukliai atrodantis sekvenavimo logotipas todėl išlieka vizualine pasitaikančių dėsningumų santrauka, o ne savarankisku eksperimentu, patvirtinančiu jungimąsi. Jo paskirtis – parodyti pasikartojančius požymius, palengvinti hipotezių kėlimą ir padėti pasirinkti aminorūgštis arba kandidatines šeimas tolesniems tyrimams.

Sąryšio validavimas ir atrankos poslinkio šaltinis

Teiginį reikia validuoti etapais

Validacija yra įtikinamiausia, kai bendras teiginys yra padalintas į kelis atskirus klausimus.

Pirmiausia galima patikrinti, ar pasirinktas fagas sąveikauja su taikiniu. Tada galima įvertinti, ar už sąveiką tikrai atsakingas pateiktas peptidas, ar sąveika yra selektyvi atitinkamų kontrolių atžvilgiu, ar jos stiprumas nuspėjamai kinta priklausomai nuo koncentracijos ir ar pats prisijungimas sukelia numatytą biologinį ar biocheminį poveikį.

Šių klausimų nereikėtų jungti į vieną „teigiamą rezultatą”.

Ši schema rodo įrodymų lygio gradaciją. Ji nėra universalus privalomų eksperimentų rinkinys. Tinkamas validavimo būdas priklauso nuo kandidato, molekulinio taikinio, pateikimo sistemos architektūros, biologinio klausimo ir potencialaus pritaikymo.

Nepriklausomas sintetinio peptido tyrimas gali sustiprinti išvadas

Ypač vertingas etapas gali būti kandidato pašalinimas iš fago konteksto ir patikrinimas, ar jo savybės išlieka po nepriklausomo molekulės paruošimo.

2009 m. tyrime buvo panaudotas fagų ekranavimas chemiškai apribotiems bicikliniams peptidų kandidatams identifikuoti, o vėliau savarankiškai susintetintas pasirinktas inhibitorius. Tolesni eksperimentai apėmė fermento slopinimo ir aktyvumo žmogaus plazmoje už organizmo ribų vertinimą. [9]

Tokis perėjimas nuo atrankos prie nepriklausomo tyrimo suteikia kur kas daugiau informacijos nei vien sekos praturtinimas, tačiau tai vis dar išlieka ikiklinikiniu įrodymu, o ne terapinio veiksmingumo pacientams patvirtinimu.

Kitame tyrime fago atrankos metu gautų sekvenavimo požymių buvo perkelta į sintetinius hibridinius peptidus, o vėliau buvo vertinamas proteazės slopinimas. [10]

Tokie eksperymentai padeda nustatyti, ar funkcinis aktyvumas iš tikrųjų lieka susijęs su atskirai paruoštu peptidu, ar priklauso nuo pradinio fago klono savybių.

Tiksli molekulinė forma išlieka svarbi. Disulfidinio tiltelio pašalinimas, peptido galų modifikavimas, fluorescencinio žymens prijungimas, aminorūgščių modifikacija arba sekos perkėlimas ant kito karkaso gali pakeisti konformaciją ir jungimosi savybes.

Todėl patvirtinimas turėtų atsižvelgti į esminius struktūrinius skirtumus, o ne daryti prielaidą, kad kiekviena molekulė, turinti tą pačią pagrindinę seką, elgiasi identiškai.

Analitinis tikrumas nėra tas pats, kas klinikinis pritaikomumas

Peptidas, kurio susirišimas su konkrečiu taikiniu buvo įtikimai patvirtintas, gali tapti vertingu tiriamuoju reagentu, analitiniu zondu, vaizdinimo kandidatu, molekulinio atpažinimo įrankiu arba tolesnio vystymo atspirties tašku.

Nė vienas iš šių rezultatų automatiškai nereiškia, kad peptidas yra vaistas.

Perėjimas prie klinikinio taikymo reikalauja atsakymų į daugelį klausimų, kurių pati fagų prezentacijos (phage display) selekcija neišsprendžia. Jie susiję, tarp kita ko, su molekuliniu stabilumu, ekspozicija, audinių pasiskirstymu, metabolizmu, toksiškumu, imunogeniškumu, gamybos galimybėmis, formulavimu, farmakokinetika, farmakodinamika ir galiausiai tuo, ar poveikis pasirinktam taikiniui duoda reikšmingą rezultatą žmonėms.

Todėl sėkmingas atradimų eksperimentas nenustato nei tinkamo vartojimo būdo, nei saugaus vartojimo būdo žmonėms. Daugiau apie tai, kodėl vartojimo būdas yra atskiras su peptidais susijusių įrodymų elementas, aprašome medžiagoje Peptidų injekcijos ir kiti vartojimo būdai.

Panašiai, peptido ryšio su su tam tikra liga susijusiu baltymu įrodymas neįrodo, kad šio baltymo aktyvumo pokytis pagerins ligos eigą.

Phage display tyrimo rezultatas todėl turėtų būti aprašomas atsižvelgiant į realų įrodymų etapatą. Vienas tyrimas gali atskleisti praturtintą seką, kitas – patvirtintą ligandą, o dar kitas – funkcionalinį inhibitorių. Kiekvienas iš šių etapų yra vertinga mokslo pažanga, kol išvada lieka proporcinga turimiems duomenims.

Dažniausiai užduodami klausimai

Ar sekvenavimo pasipildymas įrodo didelį specifiškumą?

Ne. Praturtinimas reiškia, kad tam tikra seka eksperimento eigoje tapo gausesnė. Pats savaime jis neįrodo didelio specifiškumo. Klonas gali gausėti dėl nuo taikinio nepriklausomo pranašumo dauginantis ar kitos procedūrinės savybės, kaip rodo tyrimai, kuriuose tariamas praturtinimas buvo siejamas su fago mutacija, padidinančia jo propagavimo efektyvumą. [7] Specifiškumui reikalaujama palyginimo su tinkamais alternatyviais taikiniais, paviršiais, reagentais ar kitais sistemos komponentais. Praturtinimą geriausia vertinti kaip pagrindą tolesniam kandidato tyrimui, o ne kaip galutinį jo selektyvumo patvirtinimą.

Ar fágų ekranavimas gali tiesiogiai nurodyti klinikinį gydymą?

Ne. Fagų ekranavimas gali identifikuoti molekulinius kandidatus, kuriuos verta tirti toliau, tačiau klinikiniam naudingumui reikalaujama kur kas ilgesnės įrodymų grandinės. Net jei pasirinkta seka bus nepriklausomai susintetinta ir parodys slopinamąjį poveikį ex vivo eksperimente su žmogaus plazma, tai dar reiškia nei saugumo, nei terapinės naudos pacientams. Biciklinių peptidų tyrimai rodo vertingą perėjimą nuo atrankos prie funkcinių testų, tačiau jie vis tiek lieka ikiklinikiniais tyrimais. [9]

Genotipo ir fenotipo sąryšis yra ryšys tarp organizmo genetinės sudėties (genotipo) ir jo pastebimų savybių ar požymių (fenotipo).

Tai yra ryšys tarp molekulinio požymio, rodomo fago paviršiuje, ir jį kodočios DNR sekos. Kadangi atrinktoje dalelėje yra genetinė informacija, atitinkanti rodomą peptidą, tyrėjai gali atgauti fagą ir sekoskaitos būdu nustatyti peptido seką. Šis ryšys buvo ankstyvųjų eksperimentų su fuziniais fagais pagrindas. [1] Tačiau genotipo ir fenotipo ryšys rodo, kokia seka buvo susijusi su atgauta dalele, o ne tai, kodėl ši dalelė išgyveno atranką.

Ar fagų biblioteka yra laisvų peptidų mišinys?

Ne. Peptidai fagų bibliotekoje yra pateikiami kaip su fagais susijusių konstrukcijų elementai, o ne kaip laisvi peptidai, laisvai ištirpinti tirpale. Fagonešėjas, orientacija, kopijų skaičius ir pateikimo geometrija gali turėti įtakos interakcijai su taikiniu. Jei numatomas taikymas susijęs su laisvu peptidu, jo elgsena turėtų būti ištirta būtent šia forma, o ne spėjama vien remiantis fago surišimu. [1,9]

Kuo skiriasi linijinė biblioteka nuo C7C?

Skirtumas susijęs su pateikiamo peptido architektūra. Linijinė biblioteka sąmoningai neįveda apribojimo disulfidiniu tilteliu stabilizuotos kilpos pavidalu. C7C architektūroje septynios atsitiktinės liekanos yra tarp cisteinų, kurie gali apriboti peptido konformaciją susidarydami disulfidinį tiltelį. Tuo tarpu Ph.D.-12 sistema naudoja 12 amino rūgščių atsitiktinius intarpus. [2,3] Nė vienas iš šių dizainų negarantuoja geresnio kandidato gavimo kiekvienam tikslui.

Ar didesnis dalelių skaičius reiškia didesnį unikalių peptidų skaičių?

Ne. Bendras dalelių skaičius ir unikalių peptido variantų skaičius yra du skirtingi parametrai. Didelėje populiacijoje gali būti daug to paties klono kopijų, o dalyje fagų gali nebūti tikėtino intarpo. Neatrenktos komercinės bibliotekos sekvenavimas parodė tiek netolygią sudėtį, tiek laukinio tipo klonų buvimą. [4]

Ar randomizuotos bibliotekos yra visiškai atsitiktinės?

Ne. Randomizacija apibūdina kintamumo generavimo metodą, o ne vienodos visų aminorūgščių ir sekų reprezentacijos garantiją. Šališkumas gali rastis jau kodonų projektavimo etape, o vėliau būti papildomai modifikuojamas fage konstravimo, raiškos, išgyvenimo ir propagavimo metu. [5]

Kodėl bibliotekos partija gali būti svarbi?

Skirtingos nominaliai tos pačios bibliotekos partijos gali pradėti eksperimentą su kitokiu sekvencijų pasiskirstymu ir kitaip kisti dauginimo metu. Tyrimas, kuriame lyginamos dvi partijos, parodė jų sudėties ir propogacijos eigos skirtumus, įskaitant potencialiai su dauginimo pranašumu susijusių sekvencijų praturtinimą. [6] Tai nereiškia, kad kiekviena partija bus radikaliai kitokia, tačiau parodo, kodėl informacija apie partiją gali būti svarbi pakartojamumui.

Kas yra ne tikslinis peptidas?

Tai yra pateikta seka, gauta dėl kitų priežasčių, nei numatyta peptido ir taikinio sąveika. Ji gali sąveikauti su pagrindu, žymekliu, nešikliu, gaudančiuoju reagentu ar kitu sistemos elementu. Su ja susijęs klonas taip pat gali tiesiog veiksmingiau daugintis. [7] Todėl pakartotinis sekos gavimas reikalauja tinkamų kontrolinių tyrimų, prieš nustatant ją kaip specifinį taikinio ligandą.

Ką duoda kontrselekcija?

Kontrselekcija padeda identifikuoti arba apriboti medžiagų, su kuriomis kandidatas neturėtų asocijuotis, tokių kaip tikslo neturintis pagrindas, nesvarbūs baltymas, giminingos ląstelės ar kiti eksperimento elementai, atpažinimą. Ji gali apriboti svarbų klaidingai teigiamų rezultatų šaltinį, tačiau pašalina ne visus galimus šališkumus, susijusius su pateikimu, amplifikacija ar propagacija. [10]

Ar gausiausia sekwencija visada yra geriausias ligandas?

Ne. Galutinis sekvencijų skaičius priklauso ne tik nuo jungimosi stiprumo. Jam įtakos gali turėti pradinis atstovavimas bibliotekoje, klono gebėjimas išgyventi tolesnius etapus bei amplifikacijos efektyvumas. Tyrimai, lyginantys bibliotekų partijas ir serijinę amplifikaciją, rodo, kad populiacijos sudėtis gali smarkiai keistis be jokio tiesioginio ryšio su giminingumu taikiniui. [6]

Ar sekvenavimas matuoja giminingumą?

Ne. Sekvenavimas identifikuoja genetines sekas ir leidžia įvertinti jų dažnį analizuojamoje populiacijoje. Didesnis gylis gali atskleisti didesnę įvairovę ir tiksliau apibūdinti populiacijos struktūrą, tačiau jis nepaverčia nuskaitymų dažnio disociacijos konstanta ar kitu tiesioginiu giminingumo parametru. [8]

Ar bendras sekvencijos motyvas įrodo prisijungimo mechanizmą?

Ne. Bendras motyvas rodo pasikartojantį sekos modelį, tačiau jo priežastį vis dar reikia paaiškinti. Panašios liekanos iš tikrųjų gali dalyvauti atpažįstant taikinį, bet taip pat gali atspindėti bibliotekos konstravimo poslinkį, raiškos pirmenybę, sklidimo pranašumą ar kitą eksperimentinį spaudimą. [5] Todėl motyvas yra geras atspirties taškas hipotezėms kelti, bet nėra savarankiškas mechanizmo įrodymas.

Kodėl po faginių atrankų tyrinėjamas sintetinis peptidas?

Nepriklausomai susintetinto peptido tyrimas leidžia patikrinti, ar stebima sąveika arba funkcija išlieka pašalinus seką iš pradinio fago konteksto. Tai padeda atskirti paties peptido savybę nuo fago architektūros, daugiaretės prezentacijos ar kitų klono ypatybių lemiamo poveikio. Sintetinių inhibitorių tyrimai rodo, kiek daug papildomos informacijos gali suteikti toks validavimo etapas. [10]

Ar powinowactwo i awidność oznacza to samo?

Ne. Giminystė apibūdinimai vienos molekulinės sąveikos stiprumą, tuo tarpu aviditetas apibūdinamą daugelio vienalaikių sąveikų bendrą efektą. Todėl fagą, pristatantis kelias peptido kopijas, gali sąveikauti su į tikslą turtingu paviršiumi kitaip nei viena laisvo peptido molekulė. Stiprus viso fago sulaikymas neįrodo tokio paties stipraus izoliuoto peptido giminystės. [9]

Ar didesnis atrankos ratų skaičius pašalina šališkumą?

Ne. Kiti etapai gali sustiprinti tikrąjį nuo taikinio priklausomą signalą, bet jie gali lygiai taip pat sėkmingai sustiprinti ir nepageidaujamą pranašumą. Serijinės amplifikacijos tyrimai rodo, kad sekos sudėtis gali smarkiai keistis net ir be į taikinį orientuotos atrankos. [6] Todėl etapų skaičius turėtų būti vertinamas kaip eksperimento projekto dalis, o ne kaip kokybės rodats pats savaime.

Ką turėtų būti gerai dokumentuotame fagų atrankos (phage display) eksperimente?

Aprašymas turi pateikti pakankamai informacijos, kad kitas tyrėjas galėtų suprasti, kokia populiacija buvo analizuojama, kaip buvo pristatytas tikslas, kokie alternatyvūs paaiškinimai buvo kontroliuojami, kaip buvo analizuojamos gautos sekos ir kaip buvo validuojami galutiniai kandidatai.

Praktikoje tai reiškia aiškų bibliotekos ir atitinkamos partijos, pateikimo architektūros, tikslo pateikimo būdo, kontrolinių sąlygų, pagrindinių atrankos etapų, sekoskaitos metodo, sekų apdorojimo taisyklių bei kandidatų validavimui panaudotų įrodymų apibrėžimą.

Bibliotekų šališkumo ir sekvenavimo gylio tyrimai rodo, kodėl atrinktos populiacijos interpretacija priklauso the jos sukūrimo ir analizės būdo. [4,8] Skaidrus ataskaitų teikimas leidžia atskirti atsinaujinantį molekulinį radinį nuo rezultato, kuris smarkiai priklauso nuo neaprašytų konkrečios eksperimentinės sistemos savybių.

Išvados

Peptidų faginių ekranas yra pažangus molekulių atradimo metodas, nes jis sujungia fizinę atranką su atgaunama informacija apie seką. Fago paviršiuje rodomas peptidas gali būti susietas su konkrečiu taikiniu, prijungtas fagas – atgautas, o jo genetinė seka – identifikuota. Šis genotipo ir fenotipo ryšys leidžia tyrinėti labai dideles peptidų populiacijas ir kartu išlaikyti praktinę atrinktų kandidatų identifikavimo galimybę.

Vis dėlto šis metodas reikalauja atsargaus interpretavimo, nes seka, kuri galiausiai tampa gausiausia, nebūtinai yra ta seka, kurios vidinis giminingumas numatytam tikslui yra didžiausias.

Į rezultatą gali turėti įtakos pradinės bibliotekos sudėtis, pateikimo architektūra, eksperimentiniai paviršiai, taikinio pateikimo sistema, bakterijų dauginimasis, tam tikrų klonų augimo pranašumas, sekvenavimo gylis ir bioinformatinės analizės būdas.

Dėl šios priežasties praturtinimą reikėtų vertinti kaip kandidato patvirtinimo pradžią, o ne pabaigą.

Sekvencija, kurios dalis atrankos metu daug kartų išauga, gali būti vertingas kandidatas tolimesniems tyrimams, tačiau tvirtesnėms išvadoms reikia eksperimentų, leidžiančių atskirti tikrąjį bindingą nuo tikslo nuo alternatyvių praturtėjimo priežasčių.

Įtikinamiausi fago ekrano tyrimai sujungia gerai apibūdintas pradines bibliotekas su tinkamomis taikinio ir neigiamomis kontrolėmis, skaidria sekos populiacijos pokyčių analize ir nepriklausomu perspektyviausių kandidatų tyrimu.

Jei planuojamas taikymas yra susijęs su laisvu peptidu, ypač svarbu ištirti jį už pirminio fago konteksto ribų. Tai leidžia atskirti pačios molekulės savybes nuo avidumo ir kitų efektų, kylančių dėl pateikimo fago paviršiuje.

Vėlesniuose tyrimų etapuose taip pat svarbi gali būti peptido ir jo formulės stabilumas. Tačiau tai yra atskiras tyrimo klausimas, kurio „phage display“ neišsprendžia. Šią problemą plačiau aptaria straipsnis Peptidų laikymas – temperatūra, drėgmė ir užšaldymo poveikis.

Įrodymus reikia interpretuoti etapais. Praturtintos sekos identifikavimas nėra tas pats, kas patvirtinto ligando nustatymas. Jungimosi patvirtinimas nėra tas pats, kas selektyvumo demonstravimas. Afiniteto matavimas skiriasi nuo funkcinio biologinio aktyvumo įrodymo. Netgi patvirtintas biologinis aktyvumas lieka kažkas kita nei klinikinio veiksmingumo demonstravimas.

Peptidinė fago displėja suteikia daugiausia mokslinės vertės tada, kai kiekviena išvada lieka pritaikyta prie realiai gautų įrodymų lygio.

Praturtinta sekcija yra kandidatas.

Patvirtinta sąveika reikalauja nepriklausomų įrodymų.

Funkciniam peptidui reikia tinkamo funkcinio eksperimento.

Potencjalny kliniczny użytek, jeśli w ogóle jest rozważany, wymaga zupełnie odrębnego procesu rozwoju i odpowiednich badań z udziałem ludzi.

Atsakomybės apribojimas

Šis straipsnis yra išskirtinai edukacinio ir mokslinio-informacinio pobūdžio. Jame aiškinami bendrieji su peptidų faginės atrankos (angl. phage display) metodu susiję klausimai, įskaitant bibliotekų įvairovę, molekulinę atranką, sekų praturtinimą, sekvenavimą, eksperimentinį šališkumą (bias), jungimosi validavimą bei mokslinių įrodymų interpretavimą. Jis nėra laboratorinis operacinis protokolas ar nuosekli eksperimento atlikimo instrukcija.

Fago displėjaus bibliotekų, atrankos sistemų, sekų praturtinimo, jungimosi matavimų ir nepriklausomai susintetintų peptidų aptarimo negalima suprasti kaip nurodymų, kaip gaminti, leisti ar vartoti peptidus žmonėms. Sekų identifikavimas naudojant fago displėjų nereiškia, kad konkretus peptidas yra saugus, biologiškai veiksmingas, naudingas terapeutysti ar tinkamas naudoti žmonėms.

Pats pasižymėjimas taikinio atžvilgiu taip pat reiškia klinikinės naudos. Peptidas gali selektyviai jungtis prie konkretaus molekulinio taikinio, nesukeldamas naudingo biologinio poveikio. Savo ruožtu peptidas, pasižymintis aktyvumu biocheminėje ar ląstelių sistemoje arba ex vivo eksperimente, gali nepasireikšti tokiu pačiu aktyvumu visame organizme ar žmonėms.

Klinikinis vystymas reikalauja įrodymų, gerokai viršijančių fago atrankos (phage display) patikrą. Jie apima, be kita ko, tinkamą molekulinės tapatybės ir grynumo charakterizavimą, farmakologines savybes, stabilumą, ekspoziciją, pasiskirstymą, toksiškumą, imunogeniškumą, gamybos kokybę ir – jei tai pagrįsta – tinkamai suprojektuotus tyrimus su žmonėmis.

Todėl šiame straipsnyje aprašytus eksperimentinius metodus ir pavyzdžius reikėtų interpretuoti tik atsižvelgiant į sistemas, su kuriomis jie faktiškai buvo ištirti. Rezultatų, gautų vienai bibliotekai, fago architektūrai, taikinio pateikimo būdui, peptidiniam karkasui ar eksperimentiniam modeliui, nereikėtų automatiškai perkelti į kitas sistemas.

Nuorodos

1. Smith, G. P. (1985). Siūliniai furziniai fagai: Nauji ekspresijos vektoriai, atskleidžiantys klonuotus antigenus viriono paviršiuje. Mokslas, 228(4705), 1315–1317. https://doi.org/10.1126/science.4001944
2. New England Biolabs. (n. m.). Ph.D.-12 faginių ektopetidų biblioteka. Prieiga per internetą: 2026 m. rugsėjo 25 d., gauta iš https://www.neb.com/de-de/products/e8111-phd-12-phage-display-peptide-library
3. New England Biolabs. (n. m.). Ph.D.-C7C fágų display peptidų bibliotekos rinkinys v2. Prieiga per internetą: 2026 m. rugsėjo 25 d., gauta iš https://www.neb.com/en/products/e8212-phd-c7c-phage-display-peptide-library-kit-v2
4. Sloth, A. B., Bakhshinejad, B., Jensen, M., Stavnsbjerg, C., Liisberg, M. B., Rossing, M., & Kjaer, A. (2022). Komercinės fagų ekspozicijos peptidų bibliotekos sudėties šališkumo analizė naudojant naujos kartos sekvenavimą. Virusai, 14(11), 2402 straipsnis. https://doi.org/10.3390/v14112402
5. He, B., Tjhung, K. F., Bennett, N. J., Chou, Y., Rau, A., Huang, J., & Derda, R. (2018). Compositional bias in naïve and chemically-modified phage-displayed libraries uncovered by paired-end deep sequencing. Scientific Reports, 8(1), 1214 straipsnis. https://doi.org/10.1038/s41598-018-19439-2
6. Sinkjaer, A. W., Sloth, A. B., Andersen, A. O., Jensen, M., Bakhshinejad, B., ir Kjaer, A. (2025). Skirtingų fafų display peptidų bibliotekos partijų sekos sudėties lyginamoji analizė amplifikacijos metu. Virology Journal, 22(1), 2 straipsnis. https://doi.org/10.1186/s12985-024-02600-x
7. Brammer, L. A., Bolduc, B., Kass, J. L., Felice, K. M., Noren, C. J., ir Hall, M. F. (2008). A target-unrelated peptide in an M13 phage display library traced to an advantageous mutation in the gene II ribosome-binding site. Analytical Biochemistry, 373(1), 88–98. https://doi.org/10.1016/j.ab.2007.10.015
8. Sloth, A. B., Bakhshinejad, B., Stavnsbjerg, C., Rossing, M., & Kjaer, A. (2023). Sekoskaitos gylis atlieka lemiamą vaidmenį apibūdinant fagų display peptidų bibliotekas naudojant NGS. Tarptautinis molekulinių mokslų žurnalas, 24(6), 539 straipsnis. https://doi.org/10.3390/ijms24065396
9. Heinis, C., Rutherford, T., Freund, S., & Winter, G. (2009). Phage-encoded combinatorial chemical libraries based on bicyclic peptides. Nature Chemical Biology, 5(7), 502–507. https://doi.org/10.1038/nchembio.184
10. de Marco, R., Azzolini, S. S., Lovato, D. V., Torquato, R. J., Amino, R., de Miranda, A., & Tanaka, A. S. (2010). Sintetinių hibridinių peptidų naudojimas proteazių inhibitorių atrankai taikant fago rodymo metodo validavimą. Kombinatorinė chemija ir didelės išeigos atranka, 13(9), 829–835. https://doi.org/10.2174/138620710792927394