Phage display peptida: skrining, seleksi dan validasi

Phage display peptids adalah teknik penelitian yang menciptakan hubungan langsung antara peptida yang dipamerkan di permukaan bakteriofag dengan sekven DNA yang mengkodekan peptida tersebut. Para ilmuwan dapat menempatkan populasi yang sangat besar dari fag yang memamerkan berbagai sekven peptida pada kontak dengan target molekuler yang dipilih, mengambil kembali fag yang masih terikat pada target tersebut, dan kemudian menentukan sekven peptida yang dipamerkan melalui analisis materi genetik mereka. Sekven tersebut yang diperoleh kemudian menjadi kandidat untuk penelitian lebih lanjut. Namun, hanya karena mereka telah terpilih bukan berarti mereka sudah terbukti sebagai ligandum yang spesifik, menunjukkan selektivitas yang tinggi, aktivitas biologis, atau potensi terapeutik.

Metode ini sangat berguna karena menggabungkan interaksi molekuler yang diamati secara eksperimental dengan informasi genetik yang kemudian dapat dianalisis dan dimanfaatkan. Namun, keunggulan inilah yang menimbulkan tantangan interpretasi yang signifikan. Interaksi dengan target yang diinginkan bukanlah satu-satunya faktor yang menentukan urutan mana yang menjadi lebih banyak selama eksperimen phage display. Komposisi awal dari bibliotek, interaksi dengan permukaan dan bahan yang digunakan dalam percobaan, perbedaan dalam perkembangbiakan bakteri, dominasi beberapa fag dalam propagasi, kedalaman sekvensisasi, dan cara analisis data selanjutnya dapat mempengaruhi urutan mana yang akhirnya muncul sebagai pemenang yang paling kuat.

Dalam artikel ini, kami menjelaskan tahapan konseptual utama dari phage display peptida serta jenis bukti yang diperlukan untuk beralih dari rangkaian peptida yang diperkaya ke kesimpulan ilmiah yang meyakinkan mengenai ikatan. Kami memusatkan perhatian pada prinsip-prinsip screening, seleksi, sekvenisasi, sumber kesalahan sistematis, validasi, dan interpretasi bukti. Artikel ini menjelaskan dasar-dasar metode penelitian, bukan protokol laboratorium yang terperinci.

Bagaimana phage display memungkinkan penayangan sekven asam amino

Hubungan antara molekul yang dipresentasikan dengan catatan genetiknya

Bakteriofag adalah virus yang menginfeksi bakteri. Dalam phage display, peptida DNA yang mengkodekan urutan peptida tertentu dapat dimasukkan ke dalam sistem sedemikian rupa sehingga peptida tersebut terikat pada protein mantel fag. Partikel fag yang dihasilkan kemudian membawa bersama dua jenis informasi yang terkait satu sama lain: materi genetiknya mengandung urutan kode peptida, sedangkan peptida yang sesuai dengannya dipamerkan secara fisik di permukaan partikel tersebut.

Relasi ini sering disebut sebagai hubungan genotip-fenotip. Karena genotip yang berada di dalam fag tetap terkait dengan fenotip molekular yang ditampilkan di permukaannya.

Karya Smith yang sangat penting pada tahun 1985 secara eksperimental menunjukkan bahwa urutan asing dapat ditampilkan pada permukaan bakteriofag yang mengandung nitoplasma dalam bentuk yang tersedia bagi antibodi, dan fag yang mengandung urutan yang dikenali kemudian dapat dimodifikasi. Penelitian ini menciptakan dasar-dasar konseptual dan eksperimental yang penting bagi pengembangan perpustakaan phage display modern. Namun, tidak boleh diartikan sebagai bukti bahwa setiap urutan peptida yang dimasukkan akan diekspresikan, ditampilkan, difold, atau dipilih dengan efektivitas yang sama. [1]

Kemampuan untuk memperoleh informasi genetik adalah salah satu karakteristik yang membedakan phage display dari metode menampilkan target secara langsung ke dalam campuran peptida bebas yang tidak teridentifikasi. Setelah phage tersebut berhasil didapatkan, sekvensisasi materi genetiknya memungkinkan identifikasi kandidat peptida yang ditampilkan.

Namun, hanya dengan mengetahui sekvensnya saja sudah cukup untuk menjelaskan apa peptida yang ditampilkan oleh fag yang telah ditemukan. Namun, hal itu tidak secara otomatis menjelaskan mengapa hanya bagian tersebut yang terdeteksi selama eksperimen tersebut. Untuk membuktikan bahwa peptida yang ditampilkan benar-benar bertanggung jawab atas interaksi yang diamati dengan target, diperlukan kontrol dan validasi tambahan.

Fag adalah bagian dari sistem presentasi eksperimental

Peptida yang dipresentasikan dalam seleksi tidak muncul sebagai molekul yang sepenuhnya independen. Ia terikat pada molekul biologis yang jauh lebih besar, dan orientasinya, aksesibilitasnya, lingkungan molekuler lokal, jumlah kopian, dan posisi terhadap protein lapisan sekitarnya dapat mempengaruhi interaksinya dengan target.

Karena alasan ini, peptida yang tampaknya sangat berikatan dengan target ketika dipamerkan di permukaan fagium dapat berperilaku berbeda setelah sintesis kimia dan analisis sebagai molekul independen.

Hal ini terkait langsung dengan perbedaan antara afinitas dan avidity. Afinitas menggambarkan kekuatan interaksi molekuler tunggal antara pasangan yang terikat. Sedangkan avidity mengacu pada kekuatan total yang timbul ketika beberapa interaksi terjadi secara bersamaan.

Jika beberapa replikasi peptida yang dipamerkan berinteraksi secara bersamaan dengan banyak molekul target yang berada di permukaan, fag dapat dihentikan dengan sangat efektif melalui interaksi berbobot tinggi, bahkan jika kepekaan dari satu molekul peptida yang terisolasi jauh lebih lemah.

Oleh karena itu, penahanan partikel fag yang kuat sebaiknya tidak diartikan secara otomatis sebagai bukti dari ikatan yang sama kuatnya antara peptida bebas. Dalam deskripsi ilmiah yang berharga, perlu ditentukan sistem presentasi dan, jika relevan, bentuk molekul yang digunakan selama validasi selanjutnya. Hasil yang diperoleh untuk peptida sintetis yang terisolasi, seluruh partikel fag, atau sekresi yang sama dengan urutan yang terhubung ke media lain, menjawab pertanyaan yang terkait namun berbeda.

Biblioteka linier dan konformasi terbatas meneliti struktur lain

Biblioteka peptida phage display juga dapat berbeda dalam hal struktur yang tersedia untuk urutan yang ditampilkan.

Biblioteka linear menampilkan urutan tanpa adanya pengenalan sengaja terhadap pembatasan yang memaksakan struktur gelung. Dalam biblioteka yang dikonformasikan, rentang konformasi yang mungkin untuk peptida secara sengaja dibatasi, misalnya dengan memasukkan residu cystein di kedua sisi wilayah random. Terbentuknya jembatan disiarczik dapat kemudian mengarah pada pembentukan gelung.

Tidak ada satu varian pun yang secara definisinya lebih baik dalam setiap eksperimen. Arsitektur yang paling tepat tergantung pada tujuan yang sedang dipelajari, jenis interaksi molekuler yang sedang dianalisis, dan bentuk akhir yang mana peptida tersebut akan dipelajari.

Nama-nama seperti Ph.D.-12 dan Ph.D.-C7C, yang sering ditemukan dalam publikasi mengenai phage display, merujuk pada berbagai arsitektur perpustakaan. Dokumentasi produsen menyebut Ph.D.-12 sebagai perpustakaan yang berisi insert peptida acak dengan panjang 12 rantai asam amino, sedangkan desain C7C berisi tujuh posisi asam amino acak yang ditempatkan di antara rantai cystein, yang dapat membatasi struktur dengan membentuk loop yang disempurnakan oleh disialat.

Yang penting, tujuh posisi acak tersebut tidak boleh diartikan sebagai semua asam amino yang terdapat dalam keseluruhan konstruksi yang dipresentasikan. Nama-nama tersebut menggambarkan proyek-proyek spesifik dari bibliotek penelitian. Hal ini tidak menjamin bahwa salah satu dari bibliotek tersebut akan menghasilkan kandidat yang sangat selektif untuk tujuan tertentu.[2,3]

Konstruksi perpustakaan dan keragamannya

Bibliotek adalah populasi, bukan hanya daftar kemungkinan urutan.

Bibliotekasi phage display dimulai dari gagasan tentang desain urutan DNA yang dapat diubah dan cara menghubungkannya dengan sistem presentasi fag. Namun, setelah dibuat secara fisik, bibliotek tersebut menjadi populasi biologis, bukan hanya sekadar daftar matematis dari semua urutan yang secara teoretis mungkin.

Insert individu tersebut benar-benar harus berada di dalam perpustakaan, harus dapat bertahan, harus dapat ekspresi, harus dapat dimasukkan dengan benar ke dalam partikel fag, dan harus dapat menyebar dalam sistem biologis hidup.

Karena itu, beberapa konsep yang berbeda mengenai „ukuran” atau „variasi” dari perpustakaan tidak boleh digunakan secara bergantian.

Jika dalam sebuah perpustakaan contoh terdapat tujuh nukleotida yang dapat diisi oleh salah satu dari 20 asam amino standar, ruang sekven tersebut dalam matematika adalah 20 pangkat tujuh. Memanjangkan wilayah variabel hingga 12 nukleotida sangat meningkatkan ruang teoritis tersebut.

Namun, perhitungan ini menggambarkan jumlah rangkaian yang secara teoritis mungkin ada. Mereka tidak membuktikan bahwa setiap rangkaian yang mungkin benar-benar terbentuk, bertahan dalam konstruksi perpustakaan, atau terdapat dalam jumlah salinan yang sama.

Perbedaan ini menjadi semakin penting seiring dengan meningkatnya ruang teoritis dari suatu sekensinya. Perpustakaan tersebut dapat berisi sejumlah besar partikel fisik, namun hanya mencakup sebagian kecil dari semua peptida yang matematisnya mungkin.

Keterpisahan tidak berarti representasi yang merata

Pengertian „randomized” untuk bibliotek menguraikan cara menghasilkan variasi dalam urutan. Hal ini tidak berarti bahwa setiap asam amino atau setiap urutan yang mungkin muncul dengan frekuensi yang sama.

Situs DNA itu sendiri dapat menimbulkan ketidakseimbangan. Kode genetiknya sudah terdegradasi, yang berarti bahwa beberapa kodon berbeda dapat mengkode asam amino yang sama, dan beberapa kodon berfungsi sebagai sinyal STOP. Tergantung pada cara nukleotida diacak, beberapa asam amino tertentu dapat berlebih sebelum seleksi biologis dimulai.

Perubahan selanjutnya dapat terjadi selama konstruksi perpustakaan, ekspresi, dan pengaruh urutan pada umur hidup fag serta perkembangbiakan mereka dalam bakteri.

Analisis menggunakan sekvenasi generasi baru yang diterbitkan pada tahun 2022 menunjukkan bahwa di perpustakaan komersial terdapat representasi yang tidak merata dari urutan 12 asam amino, adanya kodon STOP, dan jumlah klon tipe liar yang signifikan sebelum seleksi yang ditujukan untuk tujuan tertentu. [4]

Ini tidak berarti bahwa setiap perpustakaan komersial akan memiliki karakteristik yang sama persis. Namun, penelitian menunjukkan secara eksperimental bahwa perpustakaan awal sudah dapat memiliki struktur yang penting dan sumber bias tertentu sebelum benar-benar bertemu dengan tujuan yang sedang dipelajari.

Kehadiran partikel tipe liar atau tanpa insert yang diharapkan sangat penting untuk interpretasi jumlah fagosit. Jumlah total fag yang sangat besar tidak harus berarti jumlah varian peptida yang unik dan terpresentasikan dengan benar yang sama besarnya.

Tempat presentasi dapat mempengaruhi bias

Sistem presentasi itu sendiri dapat mempengaruhi urutan yang akan bertahan dan ditampilkan dalam perpustakaan.

Dalam penelitian tahun 2018, perpustakaan peptida yang dikodifikasi secara genetik dipelajari pada tahap-tahap konstruksi selanjutnya, ekspresi biologis, dan modifikasi kimia yang lebih lanjut. Hilangnya variasi yang signifikan diamati selama ekspresi biologis, serta perbedaan dalam preferensi terhadap asam amino tertentu yang dipengaruhi oleh tempat penempatan peptida dalam sistem. [5]

Ini merupakan bukti eksperimental bahwa struktur sistem tidak hanya merupakan media pasif. Ia dapat secara aktif membentuk susunan populasi yang tersedia untuk seleksi selanjutnya.

Ini tidak berarti bahwa bibliotek yang berisi bias tidak berguna. Praktis setiap sistem skrining biologis memiliki batasan tertentu. Yang penting adalah mempertimbangkannya saat menafsirkan hasil.

Peptida yang berpotensi berharga mungkin tidak muncul dalam populasi setelah seleksi karena pada awalnya tidak cukup banyak terdapat, dipresentasikan dengan efisiensi yang rendah, atau fagnya tidak berkembang dengan baik; bukan karena peptida tersebut tidak mampu mengikat target.

Sebaliknya, sekven tersebut yang sangat banyak terjadi pada awalnya dapat tetap dominan setelah seleksi, sebagian karena keunggulan numeriknya pada awalnya.

Partai-partai di perpustakaan tidak harus identik

Bahkan perpustakaan yang diproduksi atau dijual dengan nama yang sama seharusnya tidak otomatis dianggap identik dalam hal susunan urutan.

Dalam penelitian tahun 2025, dua kelompok dari perpustakaan phage display yang sama dibandingkan dan perubahan komposisi mereka dipantau selama tahap perkembangbiakan berikutnya. Para peneliti menemukan perbedaan baik dalam komposisi awal sekvens maupun dalam cara di mana populasi berubah selama propagasi. Di antara kandidat yang sangat diperkaya, terdapat sekvens yang kelebihannya mungkin terkait dengan perkembangbiakan yang lebih baik, bukan dengan interaksi yang direncanakan dengan target. [6]

Permintaan ini penting untuk kelangsungan studi. Penunjukan nama dagang dari perpustakaan saja tidak selalu menggambarkan semua karakteristik populasi awal. Nomor batch, komposisinya pada awalnya, dan sejarah perkembangbiakannya dapat membantu menjelaskan mengapa dua percobaan yang tampaknya serupa menghasilkan kandidat yang berbeda.

Pemilihan ikatan dan pengayaan

Seleksi memisahkan partikel yang tersisa dari populasi awal.

Dalam seleksi yang biasa dilakukan untuk mengikat molekul, bibliotek fag adalah dipasangkan dengan bahan yang mengandung target molekuler yang menarik bagi para peneliti. Bahan yang tidak terikat dengan sistem eksperimental tersebut akan dihilangkan, sedangkan partikel fag yang tetap tersisa akan diangkat kembali.

Populasi yang telah dipulihkan kemudian dapat dianalisis, dibesarkan, atau digunakan dalam putaran seleksi berikutnya. Proses umum seperti ini sering disebut sebagai biopanning.

Meskipun ide dasarnya mungkin mengingatkan pada tes langsung terkait penentuan ikatan peptida dengan target, setiap tahap eksperimen dapat memengaruhi yang mana fag yang akhirnya akan bertahan hidup.

Fag dapat terdeteksi karena peptida yang dipamerkan mengenali target yang dimaksudkan. Namun, ia juga dapat berinteraksi dengan permukaan pendukung, sistem presentasi target, label, penangkap sinyal, pembawa, atau elemen lain dari sistem eksperimental.

Proses pengembalian dan perkembangbiakan selanjutnya dapat menimbulkan tekanan selektif yang lebih besar.

Dalam praktik, eksperimen tersebut kemudian memilah partikel fag berdasarkan kemampuan mereka untuk melewati seluruh proses eksperimental, bukan hanya berdasarkan satu interaksi peptida-target yang ideal. Kontrol yang tepat diperlukan untuk menentukan bagian mana dari penguatan yang diamati benar-benar dapat berasal dari interaksi molekuler yang sedang dipelajari.

Seleksi negatif memeriksa apa lagi yang dapat dikenali oleh kandidat.

Kontraseleksi, atau seleksi negatif, digunakan untuk menguji atau membatasi interaksi dengan materi yang tidak seharusnya dikenali oleh kandidat.

Bergantung pada eksperimennya, ini dapat berupa substrat yang tidak memiliki tujuan, protein yang tidak penting, media, zat penangkap, populasi sel yang terkait, atau elemen lain dari sistem eksperimental.

Kontrol informatif yang paling efektif bergantung pada cara penyampaian tujuan. Jika target yang telah dibersihkan telah diaktifkan dengan menggunakan tanda molekuler tertentu, maka kemungkinan pengikatan dengan tanda tersebut atau sistem penangkap harus dipertimbangkan.

Jika pertanyaan penelitian yang ditargetkan adalah mengenali jenis sel tertentu, perbandingan dengan sel-sel serupa dapat lebih informatif daripada kontrol yang hanya mencakup protein yang terisolasi.

Namun, tidak adanya kaitan dengan satu objek kontrol tidak berarti bahwa hal itu bersifat universal. Selektivitas selalu bersifat komparatif. Penegasan bahwa peptida tersebut „spesifik” tetap tidak lengkap sampai diketahui terhadap target alternatif apa, permukaan apa, sel apa, protein apa, atau komponen sistem tersebut yang diuji, dan dalam kondisi apa.

Seleksi negatif dapat membatasi satu jenis interaksi yang tidak diinginkan, tetapi tidak dapat menghilangkan semua kemungkinan interaksi di luar tujuan.

Pengayaan berarti perubahan dalam komposisi populasi.

Dalam phage display, enrichment berarti bahwa suatu sekven atau kelompok sekven serupa menjadi lebih banyak diwakili dibandingkan dengan populasi sebelumnya atau kontrol yang sebanding.

Hal ini sangat berguna saat memilih kandidat untuk analisis lebih lanjut, karena menunjukkan bahwa elemen-elemen tertentu dari perpustakaan tersebut lebih disukai dalam proses eksperimental.

Namun, perkayaan bukanlah ukuran langsung dari keakraban, disosiasi konstan, aktivitas biologis, atau selektivitas universal terhadap target.

Masalah ini sangat jelas terlihat dalam penelitian mengenai urutan peptida yang sering dipilih dalam eksperimen phage display. Akhirnya, terbukti bahwa keberhasilan kloning yang diamati disebabkan oleh mutasi di tempat lain dalam genom phage, yang memungkinkan perkembangbiakan yang lebih efisien bahkan tanpa tekanan seleksi yang direncanakan terkait dengan tujuan tersebut. Rekonstruksi perubahan genetik yang tepat memungkinkan memisahkan urutan peptida yang ditunjukkan dari keunggulan reproduksi klon tersebut. [7]

Contoh ini menunjukkan mengapa pemulihan berulang dari urutan yang sama tidak boleh dianggap sebagai pengesahan berulang bahwa urutan tersebut terhubung satu sama lain secara otomatis.

Perbandingan populasi setelah seleksi dengan kontrol yang mencakup reproduksi saja atau dengan kontrol lain yang sesuai dapat membantu menentukan apakah suatu rangkaian menjadi lebih banyak karena kontak dengan sasaran atau karena klon yang terkait tersebut lebih berhasil dalam propagasi biologis.

Jumlah putaran yang lebih banyak tidak secara otomatis berarti bukti yang lebih kuat.

Pengulangan putaran seleksi dapat meningkatkan jumlah kandidat yang benar-benar berkualitas, tetapi juga dapat memperkuat bias yang sudah ada pada populasi awal atau mempromosikan kloning yang memiliki keunggulan dalam perkembangbiakan.

Penekanan secara bertahap terhadap variasi urutan dapat menunjukkan adanya pengayaan yang bermanfaat berdasarkan tujuan, tetapi penekanan secara semata-mata terhadap populasi tidak membuktikan bahwa kualitas molekuler atau kepekaan kandidat meningkat.

Jika pada tahap awal eksperimen lebih disukai ikatan dengan permukaan atau zat reagen yang tidak tepat, putaran berikutnya dapat memperkaya interaksi yang tidak diinginkan tersebut dengan lebih efektif lagi.

Oleh karena itu, tidak ada aturan universal bahwa semakin banyak putaran seleksi secara otomatis akan menghasilkan hasil yang lebih baik. Waktu yang tepat untuk mengakhiri proses tersebut tergantung pada pertanyaan penelitian, perubahan yang diamati dalam populasi, hasil kontrol, variasi, dan bukti yang menunjukkan bahwa seleksi yang terkait dengan tujuan benar-benar terjadi.

Ronde tambahan tidak akan memperbaiki cara penyampaian tujuan yang salah dan tidak akan menggantikan validasi independen.

Sekvensisasi kandidat yang dipilih

Sekvensasi Sangera dan NGS menunjukkan populasi dari berbagai perspektif

Sekvensasi kloning individu yang diperoleh memungkinkan identifikasi kandidat peptida yang spesifik dan masih berguna ketika kloning tersebut perlu dikarakterisasi lebih lanjut.

Namun, sekvenisasi generasi baru, atau NGS, memungkinkan untuk menganalisis bagian populasi yang jauh lebih besar. Dengan demikian, informasi tentang distribusi frekuensi sekven tersebut, keluarga sekven yang serupa, variabilitas, dan perubahan yang terjadi antara tahap seleksi berikutnya dapat diperoleh.

Namun, tidak ada metode apa pun yang memberikan gambar seluruh partikel yang ada dalam populasi dengan sempurna dan tanpa kesalahan.

Kedalaman sekvenasi, artefak amplifikasi, kesalahan teknis, persiapan sampel, batas filtrasi, dan keputusan bioinformatika dapat mempengaruhi distribusi sekven yang diamati.

Sebenarnya, sekumpulan data yang jarang terjadi dapat sulit dibedakan dari kebisingan teknis, sedangkan varian yang sangat banyak namun tidak penting secara biologis dapat mendominasi kumpulan data jika konteks biologisnya diabaikan.

Penelitian tahun 2023 yang membandingkan berbagai kedalaman sekvenasi menunjukkan bahwa semakin banyak pembacaan memungkinkan untuk mendeteksi sekven yang unik tambahan dan mengubah gambaran heterogenitas dari perpustakaan tersebut. [8]

Ini tidak berarti bahwa ada satu jumlah pengukuran tertentu yang menjamin karakteristik lengkap. Kedalaman sekvensisasi harus sesuai dengan pertanyaan analitik.

Cara pengolahan data harus dijelaskan dengan jelas

Analisis rangkaian menjadi jauh lebih mudah untuk diinterpretasikan ketika aturan transformasi data kasar menjadi daftar kandidat peptida dijelaskan dengan jelas.

Para peneliti mungkin perlu menentukan batas-batas yang diharapkan dari insert tersebut, mengkonfirmasi kerangka bacaan yang tepat, menentukan kriteria kualitas, dan menentukan bagaimana panjang insert yang tidak biasa, kodon STOP, bacaan yang tidak lengkap, dan sekawanan yang tidak biasa lainnya diperlakukan.

Dalam publikasi ini juga perlu dibedakan antara hasil penguraian sekvenasi yang kasar, hasil penguraian yang tersisa setelah filtrasi kualitas, urutan DNA yang unik, dan urutan peptida yang diterjemahkan secara unik.

Perbedaan ini penting karena karena degenerasi kode genetik, beberapa rangkaian DNA yang berbeda dapat mengkodekan urutan asam amino yang sama persis.

Sebaliknya, rangkaian peptida yang sangat mirip dapat berasal dari klon yang benar-benar terkait secara genetik, kesalahan teknis dalam proses sekjenrioning, atau varian genetik yang berbeda.

Mencatat urutan nukleotida dan mencatat urutan peptida yang diterjemahkan setidaknya menjawab beberapa pertanyaan.

Proses analisis yang transparan harus menyimpan informasi yang cukup agar peneliti lain dapat memahami mengapa kandidat tertentu dipertahankan, ditolak, digabungkan, atau dianggap sebagai prioritas.

Daftar lengkap sekumpulan peptida tanpa informasi tentang cara memproses data sumbernya sendiri jauh lebih sulit untuk dinilai dan direproduksi.

Motif sekensial adalah hipotesis mengenai pengenalan

Motif ini adalah pola berulang dari rangkaian yang ditemukan pada kandidat peptida yang serupa.

Jika beberapa peptida yang dimodifikasi secara independen mengandung asam amino yang serupa di posisi tertentu, residu bersama dapat menjadi penting untuk mengenali target yang sedang diuji.

Namun, keteraturan saja tidak membuktikan bahwa motif tersebut bertanggung jawab atas mekanisme pengikatan tersebut.

Model yang sama ini mungkin muncul karena asam amino tertentu lebih banyak terdapat dalam database awal, beberapa urutan lebih efektif ditampilkan atau dimultiplikasikan, atau sistem eksperimen lebih memilih sifat struktural tertentu yang tidak terkait langsung dengan tujuan yang dimaksudkan.

Perbandingan dengan populasi awal serta kontrol negatif yang sesuai dapat membantu membedakan kemungkinan tersebut.

Pengulangan eksperimen secara independen juga memberikan lebih banyak informasi daripada menganalisis berbagai bagian dari populasi yang sama yang telah dipilih sebelumnya secara berulang kali.

Logo sekvens yang terlihat menarik tetap menjadi ringkasan visual dari pola yang ada, bukan eksperimen independen yang menegaskan hubungan. Tujuannya adalah menunjukkan ciri-ciri yang berulang, memudahkan pembuatan hipotesis, dan membantu dalam memilih asam amino atau keluarga kandidat untuk penelitian lebih lanjut.

Verifikasi ikatan dan sumber bias selektif

Tanggapan tersebut harus dibuktikan secara bertahap.

Validasi paling meyakinkan ketika pernyataan umum tersebut dibagi menjadi beberapa pertanyaan yang terpisah.

Pertama-tama, kita dapat memeriksa apakah fag yang dipilih berinteraksi dengan target. Kemudian, kita dapat menilai apakah interaksi tersebut benar-benar disebabkan oleh peptida yang ditampilkan, apakah interaksi tersebut selektif terhadap kontrol yang sesuai, dan apakah kekuatannya berubah secara dapat diprediksi seiring dengan konsentrasi, serta apakah ikatan tersebut sendiri membawa kepada efek biologis atau biokimia yang diharapkan.

Pertanyaan-pertanyaan tersebut tidak boleh digabungkan menjadi satu „hasil positif”.

Skema ini menunjukkan gradasi tingkat bukti. Ini bukan seperangkat eksperimen wajib yang universal. Cara validasi yang tepat tergantung pada kandidat, tujuan molekuler, arsitektur sistem presentasi, pertanyaan biologis, dan potensi penggunaannya.

Pemeriksaan independen terhadap peptida sintetis dapat memperkuat kesimpulan tersebut.

Tahap yang sangat berharga adalah menghilangkan kandidat dari konteks fag dan memeriksa apakah sifat-sifatnya tetap bertahan setelah partikel tersebut dipersiapkan secara independen.

Dalam penelitian tahun 2009, phage display digunakan untuk mengidentifikasi kandidat peptida berantai berganda yang terlarut secara kimiawi, dan kemudian inhibitor yang dipilih disintesis secara independen. Eksperimen selanjutnya mencakup evaluasi inhibisi enzim serta aktivitasnya dalam plasma manusia di luar tubuh. [9]

Transisi dari seleksi ke penelitian independen ini memberikan informasi yang jauh lebih banyak daripada hanya memperkaya sekvenannya saja, tetapi tetap merupakan bukti praklinis dan bukan bukti kepastian efektivitas terapi pada pasien.

Dalam penelitian lain, sifat-sifat dari rangkaian yang diperoleh melalui seleksi fag telah ditransfer ke peptida hibrida sintetis dan kemudian diukur dengan penentuan inhibisi protease. [10]

Percobaan semacam itu membantu menentukan apakah aktivitas fungsionalnya benar-benar terkait dengan peptida yang disiapkan secara terpisah atau tergantung pada sifat klon fag yang asli.

Forma molekuler yang tepat tetap penting. Penghapusan pembatasan disiarczik, perubahan ujung peptida, penambahan label fluoresensi, modifikasi asam amino, atau penempatan urutan pada struktur lain dapat mengubah konformasi dan sifat ikatan.

Oleh karena itu, validasi harus mempertimbangkan perbedaan struktural yang penting, bukannya mengandaikan bahwa setiap molekul yang mengandung urutan dasar yang sama akan bereaksi secara identik.

Kepercayaan analitik tidak sama dengan kemungkinannya untuk diterapkan dalam praktik klinis

Peptida yang telah terbukti terikat dengan target tertentu dapat menjadi bahan penelitian yang berharga, alat analitik, kandidat untuk pencitraan, alat pengenalan molekuler, atau titik awal untuk pengembangan lebih lanjut.

Tidak ada dari hasil tersebut yang secara otomatis berarti bahwa peptida tersebut merupakan obat.

Transisi ke aplikasi klinis memerlukan jawaban atas banyak pertanyaan yang tidak dapat diselesaikan oleh seleksi phage display saja. Pertanyaan-pertanyaan tersebut meliputi stabilitas molekuler, eksposur, distribusi jaringan, metabolisme, toksisitas, imunogenitas, potensi produksi, formulasi, farmakokinetika, farmakodinamika, dan akhirnya apakah interaksi dengan target yang dipilih dapat memberikan hasil yang signifikan pada manusia.

Oleh karena itu, percobaan eksploratif yang sukses tidak menentukan jalur pemberian yang tepat maupun cara penggunaan yang aman pada manusia. Lebih lanjut mengenai mengapa jalur pemberian merupakan elemen bukti yang terpisah terkait peptida, kami jelaskan dalam materi tersebut. Injeksi peptida dan cara pemberian lainnya.

Demikian juga dengan menunjukkan bahwa peptida yang mengikat protein yang terkait dengan suatu penyakit tertentu tidak membuktikan bahwa perubahan aktivitas protein tersebut dapat memperbaiki perjalanan penyakit tersebut.

Oleh karena itu, hasil penelitian phage display harus dijelaskan sesuai dengan tahap bukti yang sebenarnya. Satu penelitian dapat menunjukkan sekvenasi yang diperkaya, penelitian lain menunjukkan ligand yang terkonfirmasi, dan yang lainnya menunjukkan inhibitor fungsional. Setiap tahap tersebut merupakan kemajuan ilmiah yang berharga, asalkan kesimpulannya tetap proporsional dengan data yang tersedia.

Pertanyaan yang sering diajukan

Apakah pengayaan sekven tersebut menunjukkan adanya variasi yang tinggi?

Tidak. Pengayaan berarti bahwa suatu sekawanan telah menjadi lebih banyak diwakili selama proses eksperimental. Sendiri tidak membuktikan keabsahan yang tinggi. Klon dapat meningkatkan jumlahnya karena keunggulan yang tidak terkait dengan tujuan dalam perkembangbiakan atau karakteristik prosedural lainnya, contohnya dalam penelitian di mana pengayaan yang tampak terkait dengan mutasi fag yang meningkatkan efektivitas propagasinya. [7] Keabsahan memerlukan perbandingan dengan tujuan alternatif yang sesuai, permukaan, perangsang, atau komponen lain dari sistem. Pengayaan sebaiknya dianggap sebagai alasan untuk penelitian lebih lanjut pada kandidat tersebut, bukan sebagai konfirmasi akhir terhadap selektivitasnya.

Apakah phage display dapat secara langsung mengindikasikan terapi klinis?

Tidak. Phage display dapat mengidentifikasi kandidat molekul yang layak untuk penelitian lebih lanjut, tetapi kegunaan klinis memerlukan rangkaian bukti yang jauh lebih panjang. Bahkan jika sekvens yang dipilih disintesis secara independen dan menunjukkan aktivitas penekan dalam eksperimen ex vivo dengan plasma manusia, ini belum tentu berarti keamanan atau manfaat terapeutik pada pasien. Penelitian peptida siklik menunjukkan langkah maju yang berharga dari tahap skrining ke uji fungsional, tetapi masih merupakan penelitian praklinis. [9]

Apa itu hubungan genotip-fenotip?

Ini adalah hubungan antara sifat molekuler yang ditampilkan di permukaan fag dan urutan DNA yang mengkodifikasinya. Karena molekul yang dipilih tersebut mengandung informasi genetik yang sesuai dengan peptida yang ditampilkan, para peneliti dapat mengembalikan fag tersebut dan dengan melakukan sekvensisasi, menentukan urutan peptida tersebut. Hubungan ini menjadi dasar dari eksperimen awal dengan fag fusi. [1] Namun, hubungan genotip–fenotip menunjukkan urutan mana yang terkait dengan molekul yang berhasil didapatkan, bukan mengapa molekul tersebut bertahan dalam seleksi.

Apakah biblioteka phage display merupakan campuran dari peptida bebas?

Tidak. Peptida dalam biblioteka phage display ditampilkan sebagai komponen struktur yang terkait dengan fag, bukan sebagai peptida yang terpisah yang larut bebas dalam larutan. Perantara fag, orientasi, jumlah kopian, dan geometri presentasi dapat mempengaruhi interaksi dengan target. Jika potensi penggunaannya berkaitan dengan peptida bebas, perilaku peptida tersebut harus dipelajari dalam bentuk tersebut saja, dan tidak dapat disimpulkan hanya berdasarkan ikatan dengan fag. [1,9]

Apakah perbedaan antara library liniar dan C7C?

Perbedaannya berkaitan dengan struktur peptida yang ditunjukkan. Library linear tidak sengaja memasukkan pembatasan berupa lingkaran stabilisasi disiarczate bridge. Dalam arsitektur C7C, tujuh residu acak berada di antara sitosin yang dapat membatasi konformasi peptida melalui pembentukan disiarczate bridge. Sedangkan sistem Ph.D.-12 menggunakan insert 12-aminosida secara acak. [2,3] Tidak ada satu proyek pun yang menjamin akan mendapatkan kandidat yang lebih baik untuk setiap tujuan.

Apakah semakin banyak partikel berarti semakin banyak peptida unik?

Tidak. Jumlah total partikel dan jumlah varian peptida yang unik adalah dua parameter yang berbeda. Populasi yang besar dapat mengandung banyak salinan dari klon yang sama, dan sebagian dari fag mungkin tidak mengandung insert yang diharapkan. Sekvensisasi dari bibliotek komersial yang tidak dipilih menunjukkan komposisi yang tidak merata serta adanya klon tipe liar. [4]

Apakah perpustakaan acak benar-benar acak?

Tidak. Randomisasi menggambarkan metode menghasilkan variabilitas, bukan jaminan representasi yang sama rata dari semua asam amino dan urutan. Bias dapat muncul pada tahap desain kodon, dan kemudian dapat dimodifikasi lebih lanjut selama konstruksi, ekspresi, perwujudan, dan propagasi fag. [5]

Mengapa partai perpustakaan bisa menjadi penting?

Partai-partai yang berbeda dari perpustakaan nominal yang sama dapat memulai eksperimen dengan susunan urutan yang berbeda dan berubah secara berbeda saat pembibitan. Dalam penelitian yang membandingkan dua partai, perbedaan dalam komposisi dan jalannya propagasi, termasuk pengayaan urutan yang berpotensi terkait dengan keunggulan pembibitan, telah ditemukan. [6] Hal ini tidak berarti bahwa setiap partai akan sangat berbeda, tetapi menunjukkan mengapa informasi tentang partai dapat menjadi penting untuk keberkesanan pembaruan.

Apa itu peptida yang tidak terkait dengan tujuannya?

Ini adalah serangkaian yang ditampilkan yang diperoleh karena alasan yang berbeda dari interaksi peptida-target yang dimaksudkan. Ia dapat berinteraksi dengan substrat, label, pembawa, detektor penangkapan, atau elemen lain dari sistem. Klon yang terkait dengan hal ini juga dapat berkembang biak dengan lebih efisien. [7] Oleh karena itu, pemulihan berulang dari serangkaian ini memerlukan kontrol yang tepat sebelum dapat ditetapkan sebagai ligase spesifik target.

Apa yang diberikan oleh kontrseleksi?

Kontreseleksi membantu mengidentifikasi atau membatasi pengenalan materi yang tidak seharusnya dikaitkan dengan kandidat, seperti substrat yang tidak memiliki tujuan, protein yang tidak penting, sel-sel yang terkait, atau elemen lain dari eksperimen. Hal ini dapat membatasi sumber penting dari hasil positif yang tidak wajar, tetapi tidak menghilangkan semua bias yang mungkin terkait dengan presentasi, amplifikasi, atau propagasi. [10]

Apakah urutan yang paling banyak terjadi selalu menjadi ligandum yang terbaik?

Tidak. Jumlah akhir dari suatu rangkaian tidak hanya tergantung pada kekuatan ikatan. Hal ini mungkin dipengaruhi oleh representasi awal dalam biblioteka, kemampuan klon untuk bertahan melewati tahap-tahap selanjutnya, dan efektivitas perkembangbiakan. Penelitian yang membandingkan populasi biblioteka dan amplifikasi serial menunjukkan bahwa komposisi populasi dapat berubah secara signifikan tanpa korelasi yang sederhana dengan keakraban dengan target. [6]

Apakah sekvensasi mengukur korelasi?

Tidak. Sekvensasi mengidentifikasi urutan genetik dan memungkinkan perkiraan frekuensi mereka dalam populasi yang diteliti. Ketebalan yang lebih besar dapat mengungkapkan variasi yang lebih besar dan menggambarkan struktur populasi dengan lebih akurat, tetapi tidak mengubah frekuensi bacaan menjadi disosiasi konstan atau parameter ketersambungan lainnya secara langsung. [8]

Apakah motif umum dari rangkaian tersebut merupakan bukti mekanisme pengikatan?

Tidak. Motif bersama menunjukkan suatu pola berulang dari rangkaian peristiwa, tetapi penyebabnya masih perlu dijelaskan. Sisa-sisa serupa mungkin benar-benar berperan dalam mengenali target, tetapi juga dapat mencerminkan bias dalam struktur perpustakaan, preferensi ekspresif, keunggulan propagasi, atau tekanan eksperimental lainnya.[5] Oleh karena itu, motif adalah titik awal yang baik untuk membangun hipotesis, tetapi tidak merupakan bukti mandiri dari mekanisme tersebut.

Mengapa peptida sintetis diuji setelah seleksi fagotik?

Pemeriksaan peptida yang disintesis secara independen memungkinkan untuk memeriksa apakah interaksi atau fungsi yang diamati bertahan setelah menghilangkan urutan dari konteks fagoid aslinya. Hal ini membantu membedakan sifat peptida itu sendiri dari efek yang dihasilkan oleh arsitektur fagoid, presentasi berbobot banyak, atau karakteristik klon lainnya. Penelitian mengenai inhibitor sintetis menunjukkan betapa banyak informasi tambahan yang dapat diberikan oleh tahap validasi tersebut. [10]

Apakah afinitas dan aversio sama saja?

Tidak. Affinity menggambarkan kekuatan interaksi molekul tunggal, sedangkan avidity menggambarkan efek keseluruhan dari banyak interaksi simultan. Oleh karena itu, fag yang menampilkan beberapa replikasi peptida dapat berinteraksi dengan permukaan yang kaya target secara berbeda dari pada satu molekul peptida bebas. Penahanan kuat seluruh fag tidak membuktikan bahwa avidity dari peptida yang terisolasi lebih kuat. [9]

Apakah lebih banyak putaran seleksi menghilangkan bias?

Tidak. Putaran-putaran berikutnya dapat memperkuat sinyal aktual yang tergantung pada tujuan, tetapi juga dapat dengan efektif memperkuat keunggulan yang tidak diinginkan. Penelitian amplifikasi berulang menunjukkan bahwa susunan urutan dapat berubah secara signifikan bahkan tanpa seleksi yang terfokus pada tujuan. [6] Oleh karena itu, jumlah putaran harus dianggap sebagai bagian dari proyek eksperimental, bukan sebagai indikator kualitas itu sendiri.

Apa yang seharusnya termasuk dalam eksperimen phage display yang didokumentasikan dengan baik?

Deskripsi harus memberikan informasi yang cukup agar peneliti lain dapat memahami populasi yang sedang dianalisis, bagaimana tujuan tersebut diungkapkan, apa penjelasan alternatif yang diuji, bagaimana urutan yang diperoleh dianalisis, dan bagaimana kandidat akhir divalidasi.

Dalam praktiknya, ini berarti menentukan dengan jelas perpustakaan dan partai yang sesuai, arsitektur presentasi, cara menyajikan tujuan, kondisi kontrol, tahapan utama seleksi, metode sekvenisasi, aturan pengolahan sekven, dan bukti yang digunakan untuk validasi kandidat.

Penelitian tentang bias bibliotek dan kedalaman sekvensasi menunjukkan mengapa interpretasi populasi terpilih tergantung pada cara populasi tersebut dibuat dan dianalisis. [4,8] Pelaporan yang transparan memungkinkan untuk membedakan penemuan molekuler yang berulang dengan hasil yang sangat tergantung pada sifat-sifat yang tidak dapat dijelaskan dari sistem eksperimental tertentu.

Kesimpulan

Phage display peptide adalah metode canggih untuk menemukan molekul, karena menggabungkan seleksi fisik dengan informasi sekensial yang dapat didapatkan kembali. Peptida yang dipamerkan di permukaan faga dapat diinteraksi dengan target tertentu, faga yang terkait dapat didapatkan kembali, dan sekensial genetik yang sesuai dapat diidentifikasi. Hubungan antara genotip dan fenotip ini memungkinkan untuk menguji populasi peptida yang sangat besar sambil mempertahankan kemungkinan identifikasi kandidat yang terpilih secara praktis.

Namun, metode ini memerlukan interpretasi yang hati-hati, karena urutan yang akhirnya paling banyak terjadi tidak harus merupakan urutan dengan kecocokan internal tertinggi dengan tujuan yang diinginkan.

Hasilnya dapat dipengaruhi oleh komposisi bibliotek awal, arsitektur presentasi, ruang eksperimental, sistem presentasi tujuan, perkembangbiakan bakteri, keunggulan pertumbuhan klon tertentu, kedalaman sekvensisasi, dan cara analisis bioinformatika.

Karena itu, pengayaan harus dianggap sebagai awal validasi kandidat, bukan sebagai akhirnya.

Serangkaian yang kerap meningkat selama seleksi dapat menjadi kandidat yang berharga untuk penelitian lebih lanjut, tetapi untuk menyimpulkan dengan lebih pasti diperlukan eksperimen yang membedakan hubungan yang sebenarnya dengan tujuan dari pengayaan daripada penyebab alternatif lainnya.

Penelitian phage display yang paling meyakinkan menggabungkan biblioteka awal yang dikarakterisasi dengan baik dengan kontrol target dan kontrol negatif yang sesuai, analisis perubahan yang jelas dalam populasi sekvenan, dan penelitian independen terhadap kandidat yang paling menjanjikan.

Jika rencana aplikasinya melibatkan peptida bebas, sangat penting untuk mengujinya di luar konteks fagoid aslinya. Hal ini memungkinkan untuk memisahkan sifat-sifat dari molekul itu sendiri dari keanehan dan efek-efek lainnya yang dihasilkan dari penampilannya di permukaan fagoid.

Pada tahap penelitian selanjutnya, stabilitas peptida dan formulasi peptida juga dapat menjadi faktor penting. Namun, ini adalah pertanyaan penelitian yang terpisah dan tidak dapat dijawab oleh phage display. Masalah ini dibahas lebih lanjut dalam artikel tersebut. Penyimpanan peptida – suhu, kelembaban dan pengaruh pembekuan.

Bukti harus diinterpretasikan secara bertahap. Identifikasi sekumpulan asam amino yang diperkaya bukanlah hal yang sama dengan menunjukkan adanya ligand yang telah terkonfirmasi. Konfirmasi ikatan bukanlah hal yang sama dengan menunjukkan selektivitas. Pengukuran afinitas berbeda dengan menunjukkan aktivitas biologis yang fungsional. Bahkan aktivitas biologis yang terkonfirmasi tetap merupakan hal yang berbeda dengan menunjukkan kegunaan klinis.

Penampilan peptida oleh fagos memberikan nilai ilmiah yang paling besar ketika setiap hipotesis tetap sesuai dengan tingkat bukti yang benar-benar diperoleh.

Serangkaian yang diperkaya adalah kandidatnya.

Interaksi yang telah terkonfirmasi memerlukan bukti independen.

Peptida fungsional memerlukan eksperimen fungsional yang tepat.

Kebenaran klinis potensial, jika memang dipertimbangkan, memerlukan proses pengembangan yang sepenuhnya terpisah dan penelitian yang sesuai dengan melibatkan manusia.

Penafian

Artikel ini hanya bersifat edukatif dan informatif ilmiah. Ia menjelaskan isu-isu umum terkait dengan peptida phage display, termasuk variasi bibliotek, seleksi molekuler, pengayaan sekvens, sekvensasi, bias eksperimental, validasi ikatan, dan interpretasi bukti ilmiah. Artikel ini bukan merupakan protokol operasional laboratorium maupun instruksi untuk melakukan eksperimen secara langkah demi langkah.

Pembahasan tentang bibliotek phage display, sistem screening, pengayaan sekvenan, pengukuran ikatan, dan peptida yang disintesis secara independen tidak boleh dianggap sebagai instruksi untuk produksi, pemberian, atau penggunaan peptida pada manusia. Identifikasi sekven melalui phage display tidak berarti bahwa peptida tersebut aman, secara biologis efektif, bermanfaat secara terapeutik, atau sesuai untuk penggunaan pada manusia.

Demikian juga, pengikatan pada target tidak berarti manfaat klinis. Sebuah peptida dapat secara selektif mengikat target molekul tertentu tanpa menimbulkan efek biologis yang bermanfaat. Sebaliknya, sebuah peptida yang menunjukkan aktivitas dalam sistem biokimia, seluler, atau eksperimen ex vivo mungkin tidak menunjukkan aktivitas yang sama pada seluruh organisme maupun pada manusia.

Pembangunan klinis memerlukan bukti yang jauh melampaui screening phage display. Ini mencakup antara lain karakteristik identitas dan kebersihan molekuler yang memadai, sifat farmakologis, stabilitas, eksposur, distribusi, toksisitas, imunogenitas, kualitas produksi, dan — jika relevan — uji klinis yang dirancang dengan tepat dengan melibatkan manusia.

Metode dan contoh eksperimental yang dijelaskan dalam artikel ini haruslah ditafsirkan hanya sehubungan dengan sistem di mana metode tersebut benar-benar telah diuji. Hasil yang diperoleh untuk satu biblioteka, arsitektur fag, cara menampilkan tujuan, rangka peptida, atau model eksperimental tidak boleh disimpulkan secara otomatis untuk sistem lainnya.

Referensi

1. Smith, G. P. (1985). Filamentous fusion phage: vektor ekspresi baru yang menampilkan antigen kloning pada permukaan virion. Ilmu Pengetahuan, 228(4705), 1315–1317. https://doi.org/10.1126/science.4001944
2. New England Biolabs. (n.d.). Ph.D.-12 phage display peptide library. Diakses tanggal 25 September 2026, dari https://www.neb.com/de-de/products/e8111-phd-12-phage-display-peptide-library
3. New England Biolabs. (n.d.). Ph.D.-C7C phage display peptide library kit v2. Diakses tanggal 25 September 2026, dari https://www.neb.com/en/products/e8212-phd-c7c-phage-display-peptide-library-kit-v2
4. Sloth, A. B., Bakhshinejad, B., Jensen, M., Stavnsbjerg, C., Liisberg, M. B., Rossing, M., & Kjaer, A. (2022). Analisis bias komposisi dalam perpustakaan peptida phage display komersial menggunakan sekuensing generasi berikutnya. Virus, 14(11), Pasal 2402. https://doi.org/10.3390/v14112402
5. He, B., Tjhung, K. F., Bennett, N. J., Chou, Y., Rau, A., Huang, J., & Derda, R. (2018). Pemilihan komposisi dalam perpustakaan fag yang ditampilkan secara alami dan dimodifikasi secara kimia ditemukan melalui deep sequencing dengan teknik paired-end. Scientific Reports, 8(1), Pasal 1214. https://doi.org/10.1038/s41598-018-19439-2
6. Sinkjaer, A. W., Sloth, A. B., Andersen, A. O., Jensen, M., Bakhshinejad, B., & Kjaer, A. (2025). Analisis komparatif komposisi urutan dalam berbagai lot dari perpustakaan peptida display faga selama amplifikasi. Journal of Virologi, 22(1), Pasal 24. https://doi.org/10.1186/s12985-024-02600-x
7. Brammer, L. A., Bolduc, B., Kass, J. L., Felice, K. M., Noren, C. J., & Hall, M. F. (2008). Peptida yang tidak terkait target dalam perpustakaan display fage M13 terdeteksi berasal dari mutasi yang menguntungkan pada gen II, situs pengikatan ribosom. Biokimia Analitik, 373(1), 88–98. https://doi.org/10.1016/j.ab.2007.10.015
8. Sloth, A. B., Bakhshinejad, B., Stavnsbjerg, C., Rossing, M., & Kjaer, A. (2023). Kedalaman sequencing berperan penting dalam karakterisasi perpustakaan peptida display phage melalui NGS. Jurnal Internasional Ilmu Molekuler, 24(6), Pasal 5396. https://doi.org/10.3390/ijms24065396
9. Heinis, C., Rutherford, T., Freund, S., & Winter, G. (2009). Perpustakaan kimia kombinatorial yang dikodifikasi oleh fagos pada dasarnya berdasarkan peptida biciklik. Nature Chemical Biology, 5(7), 502–507. https://doi.org/10.1038/nchembio.184
10. de Marco, R., Azzolini, S. S., Lovato, D. V., Torquato, R. J., Amino, R., de Miranda, A., & Tanaka, A. S. (2010). Validasi metode tampilan faga untuk seleksi inhibitor protease menggunakan peptida hibrida sintetis. Kimia Kombinatorial & Pengujian Berkelanjutan Tinggi, 13(9), 829–835. https://doi.org/10.2174/138620710792927394