Propeptīdi: prekursoru olbaltumvielas, apstrāde un bioloģiskās nozīmes

Propeptīds ir proteīna priekšteča nobriešanai saistīts segments, kurš parasti tiek noņemts noteiktā enzīmu procesa laikā. Tomēr pirms tā noņemšanas tas var pildīt svarīgas bioloģiskās funkcijas. Atkarībā no olbaltumvielas tas var palīdzēt pareizā locīšanā, novērst priekšlaicīgu bioloģisko aktivitāti, ietekmēt molekulāro struktūru veidošanos vai regulēt laiku un vietu, kurā gatavais produkts kļūst pieejams.

Tas nozīmē, ka propeptīds nav jāsaprot vienkārši kā cita maza peptīda nosaukums. Tas nav arī automātiski aktīvs hormons, signālu peptīds vai kosmētikas sastāvdaļa. Šis termins raksturo attiecības starp konkrētu sekvenci un lielākas prekursoru molekulas nobriešanas procesu.

Šī atšķirība ir īpaši svarīga, jo propeptīds, probolbaltums, prohormons, preprobaltums, signālpeptīds un prodomēns apzīmē saistītus, bet dažādus bioloģiskos jēdzienus. Tajā pašā laikā kosmētikā un tirdzniecības produktos dažreiz tiek lietoti tādi apzīmējumi kā „pro-peptides” (propeptīds), kam nebūt nav jāattiecas uz bioloģisko prekursoru.

Izpratne par prekursorveidu olbaltumvielu veidošanās un apstrādes procesu tāpēc atvieglo gan zinātniskās terminoloģijas, gan komercproduktos lietoto nosaukumu interpretāciju.

Šajā rakstā prekursoru apstrādes process ir parādīts, izmantojot piemērus, kas saistīti ar hormonu ražošanu, enzīmu nobriešanu, augšanas faktoru regulēšanu un kolagēna bioloģiju. Šie piemēri parāda specifiskus bioloģiskos mehānismus konkrētos eksperimentālos apstākļos. Tie nepierāda, ka kosmētikas līdzeklis vai cits produkts rada tādu pašu efektu tikai tāpēc, ka tā nosaukumā parādās apzīmējums „pro-peptīds”.

Kas ir propeptīds?

Proteīna nobriešanā iesaistītais segments

Daudzi olbaltumvielu savienojumi sākotnēji netiek sintetizēti tieši tādā molekulārā formā, kādā tie galu galā pilda savu funkciju.

Šūnas var vispirms saražot prekursoru molekulu, kas satur papildu aminoskābju secības. Nobriešanas laikā dažas no šīm secībām var tikt izdalītas, ķīmiski modificētas, pārkārtotas vai pakļautas citiem procesiem, pirms izveidojas galīgais funkcionālais produkts.

Propeptīds parasti apzīmē šāda prekursoru segmentu, kas saistīts ar tā nobriešanu, savukārt probolbaltums plašāk attiecas uz lielāku prekursora molekulu, kas satur šo reģionu.

Šis nošķirums ir noderīgs, lai gan bioloģiskā terminoloģija nav pilnīgi vienota visās olbaltumvielu saimēs.

Dažās publikācijās terminu „prodomēns” lieto attiecībā uz salīdzinoši lielu strukturālo reģionu, bet „propeptīds” – attiecībā uz atbilstošo segmentu. Citi autori lieto apzīmējumu propeptīds nedaudz plašākā nozīmē, apspriežot prekursoru molekulas.

Tāpēc visuzticamākā pieeja nav paša priedēkļa interpretēšana. Tā vietā ir jāanalizē secības robežas, molekulas struktūra, apstrādes posmi un terminoloģija, ko lieto pētnieki, kuri nodarbojas ar konkrēto olbaltumvielu.

Šajā bioloģiskajā kontekstā prefikss „pro-” norāda uz saistību ar prekursoru vai nobriešanas procesu.

Tas nenozīmē, ka molekula ir profesionāli izstrādāta, spēcīgāka, modernāka, efektīvāka vai pievienošanas gadījumā kosmētikas līdzeklim obligāti labvēlīga.

Propeptīdi nav tikai lieks „iepakojums”

Ir viegli iedomāties propeptīdu kā nevajadzīgu molekulāro iepakojumu, kas nobriedušā baltuma veidošanās laikā tiek vienkārši noņemts un atmests.

Bioloģija tomēr bieži vien ir sarežģītāka.

Noņemamais segments var pildīt būtiskas funkcijas, pirms tas pazūd no nobriedušās molekulas.

Pētījumi par baktēriju enzīmu subtilizīnu E sniedz īpaši skaidru piemēru. Zinātnieki ir pierādījuši, ka sintētisks propeptīds var palīdzēt denaturētam enzīmam atgūt tā aktīvo trīsdimensiju struktūru. Tas pats propeptīds varēja arī saistīties ar nobriedušu enzīmu un kavēt tā aktivitāti. [1]

Šie novērojumi parāda divas dažādas bioloģiskās funkcijas.

Pirmkārt, propeptīds var piedalīties olbaltumvielas locīšanā.

Otrkārt, tas var palīdzēt ierobežot fermentatīvo aktivitāti līdz attiecīgajam nogatavināšanas posmam.

Šāda veida palīdzību locīšanā dēvē par intracelulārā molekulārā šaperīna funkciju. Tā ir prekursora molekulas daļa, kas palīdz citam tās pašas molekulas fragmentam iegūt pareizo struktūru.

Subtilizīna piemērs tāpēc parāda, kāpēc konkrētā segmenta trūkums enzīma galīgajā aktīvajā formā nenozīmē, ka tas būtu bioloģiski mazsvarīgs.

Vienlaikus šos rezultātus nevajadzētu pārlieku vispārināt.

Subtilizīns ir baktēriju enzīms. Noteiktas funkcijas, kas saistīta ar locīšanos un inhibīciju, demonstrēšana šajā sistēmā nenozīmē, ka katrs cilvēka propeptīds pilda tādas pašas funkcijas.

Vēlāki pētījumi par pro-subtilizīnu saistīja vairākus nobriešanas posmus, tostarp locīšanos, pašpārveidošanos, propeptīda atbrīvošanos un enzīma aktivāciju. [2]

Šie eksperimenti parāda vēl vienu svarīgu principu: prekursoru nobriešana var būt saskaņota molekulāro notikumu secība, nevis viens vienīgs griezums, kas uzreiz nodrošina pilnīgu bioloģisko aktivitāti.

Propeptīda atbrīvošanas brīdis tāpēc var būt tikpat svarīgs kā pati sākotnējā šķelšana.

Kā atšķirt saistītos jēdzienus?

Diskusijās par prekursoru olbaltumvielām regulāri parādās vairāki saistīti termini, taču tos nevajadzētu uztvert kā vienu un to pašu jēdzienu.

Šīs kategorijas daļēji pārklājas, jo tās apraksta dažādus prekursoru bioloģijas aspektus, taču tās nav sinonīmi.

Piemēram, prohormons ir noteikta veida prekursors, kas saistīts ar hormona vai saistītu peptīdu veidošanos.

Savukārt propeptīds var nozīmēt tikai vienu daudz lielākas prekursormolekulas segmentu.

Šī atšķirība ir svarīga pētījumu interpretēšanā, jo bioloģiskā funkcija ir atkarīga no faktiskās molekulas un tās apstrādes pētītā ceļa.

Pirmapstrāde un prekursoru apstrāde

„pre” sekvence ir atbildīga par proteīna virzīšanu

Daudzu sekretorisko proteīnu gadījumā agrīnākā prekursora forma satur sākotnējo aminoskābju sekvenci, kas palīdz novirzīt jaunsintetizēto molekulu uz atbilstošo intracelulāro ceļu.

Šo sekvenci parasti sauc par signālpeptīdu vai — preproteīnu terminoloģijā — par „pre” daļu.

Tās loma atšķiras no propeptīda funkcijas, kas vēlāk piedalās proteīna salocīšanā, inhibīcijā, salikšanā vai aktivācijā.

Zīdītāju signālaptveršanas kompleksa strukturālie pētījumi analizēja veidu, kā šūnas iekšējais olbaltumvielu virzīšanas mehānisms atpazīst topošo signālsecību jau olbaltumvielu sintēzes laikā uz ribosomas un palīdz koordinēt tā transportēšanu membrānas virzienā. [3]

Šis ir intracelulārs mehānisms olbaltumvielu novirzīšanai.

To nevajadzētu interpretēt kā pierādījumu tam, ka kosmētikā ārīgi lietots peptīds automātiski iekļūst ādas šūnās vai seko tam pašam ceļam.

Signālsēkvences noņemšana un tam sekojošā prekursora apstrāde tāpēc ir atsevišķi bioloģiski notikumi.

Tās var norisināties dažādās šūnas vietās, iesaistīt dažādus enzīmus un pildīt dažādas funkcijas.

Vienkāršoti šo maršrutu var attēlot šādi:

iepriekšējais olbaltums → olbaltums → gatavs produkts

Tomēr tas ir tikai mācību modelis. Atsevišķi olbaltumvielas var tikt pakļautas papildu modifikācijām, starpposmu šķelšanai, locīšanai, transportēšanai un salikšanai.

Ne katrs prekisors nobriest pēc identiska laika grafika.

Insulīna piemērs

Insulīns ir viens no vislabāk zināmajiem piemēriem par hormonu, kas rodas, pārstrādājot tā prekursoru.

Agrākais priekštecis, preproinsulīns, satur signālsekvenci.

Pēc šīs signāla sekvences noņemšanas paliek proinsulīns.

Pēc tam proinsulīns tiek pakļauts turpmākai pārstrādei, kuras laikā savienojošais reģions tiek atdalīts no fragmentiem, kas veido galīgi nobriedušās insulīna ķēdes.

Šis piemērs parāda, kāpēc preproteīns, proteīns un nobriedis proteīns nav savstarpēji aizvietojami jēdzieni. Tie apraksta dažādus molekulāros posmus tajā pašā biosintēzes ceļā.

Vienā pētījumā par proinsulīna apstrādi zinātnieki kultivētajās šūnās ekspresēja proinsulīnu kopā ar potenciāliem apstrādes enzīmiem. Tika novērotas dažādas PC2 un PC3 šķelšanas preferences, kas apstiprināja to iesaisti insulīna nobriešanā. [4]

Vēlākajā terminoloģijā PC3 parasti tiek dēvēts par PC1/3.

Vissvarīgākais noteikums ir tāds, ka prekursoru apstrāde ir selektīva.

Apstrādes fermenti nešķeļ prekursoru olbaltumvielas nejauši mazākos peptīdos.

Savukārt noteiktas secības apkārtnes un šķelšanas vietu atpazīšana palīdz noteikt, kādi gatavie molekulārie produkti tiks izveidoti.

Eksperiments ar proinsulīnu arī parāda, kāpēc zinātniskajos aprakstos ir jāsaglabā tādas detaļas kā enzīma identitāte, substrāta veids un eksperimentālais modelis.

Šie faktori var būtiski ietekmēt rezultātu interpretāciju.

Viens prekistors var izraisīt vairāku produktu veidošanos

Prekursora molekula ne vienmēr rada tikai vienu aktīvo produktu.

Daži prekursorbaltmouri satur vairākus reģionus, no kuriem galu galā var veidoties dažādi bioloģiski aktīvi peptīdi.

Svarīgs piemērs ir proopiomelanokortīns jeb POMC.

POMC satur daudzus reģionus, kurus var pārstrādāt dažādos peptīdu produktos. Tas, kādi produkti galu galā uzkrājas, daļēji ir atkarīgs no attiecīgajās šūnās esošā enzīmu aparāta.

1991. gada pētījumā zinātnieki kopīgi ekspresēja POMC ar PC1 vai PC2 vairākos šūnu modeļos. Attiecībā uz atsevišķiem enzīmiem tika novēroti dažādi šķelšanas virzieni. [5]

Eksperiments tādējādi sniedza tiešus pierādījumus tam, ka dažādi apstrādes enzīmi no viena un tā paša prekursora var radīt dažādus nobriešanas produktus.

Tas izskaidro, kāpēc prekursora sekvences pārzināšana pētniekiem ne vienmēr precīzi pasaka, kādi nobrieduši peptīdi radīsies katrā audī.

Aminoskābju secība nosaka molekulāro materiālu, ko potenciāli var apstrādāt.

Savukārt fermentu vide un intracelulārie apstākļi palīdz noteikt, kas patiesībā tiks pārstrādāts un sintezēts pētītajos bioloģiskajos apstākļos.

Līdz ar to divas šūnas, kas ražo to pašu prekursoru, var saražot dažādus nobriedušu peptīdu maisījumus, ja atšķiras to apstrādes aparāts.

Pārstrāde ir kas vairāk nekā vienkārši ķēdes pārgriešana

Proteolītiskā šķelšana ir tikai viens no olbaltumvielu nobriešanas elementiem.

Atkarībā no molekulas, nobriešana var ietvert arī proteīna konformācijas izmaiņas, disulfīda tiltu veidošanos, transportu šūnas iekšienē, savienošanos ar citām molekulām, kā arī ķīmiskas modifikācijas.

Šie procesi var savstarpēji ietekmēties.

Griešanas vieta var būt klātesoša aminoskābju secībā, bet palikt nepieejama apstrādes fermentam olbaltumvielas trīsdimensiju struktūras dēļ.

Tāpat pareiza locīšanās var būt atkarīga no agrākiem apstrādes posmiem.

Tāpēc, izvērtējot pētījumus par prekursoriem, ir jānošķir trīs jautājumi:

Vai prekursors tika izgatavots?

Vai tas ir pareizi apstrādāts līdz identificētajam gatavajam produktam?

Vai iegūtais produkts uzrādīja atbilstošu bioloģisko aktivitāti?

Šie jautājumi ir savstarpēji saistīti, bet nav savstarpēji aizvietojami.

Prekursora daudzuma mērījums var atbildēt uz pirmo jautājumu, vienlaikus nesniedzot atbildes uz otro un trešo.

Piemēram, tests, kas vienlaikus nosaka prekursoru un vairākus tā fragmentus, var uzrādīt ievērojamu kopējo olbaltumvielu daudzumu, sniedzot maz informācijas par faktisko nobrieduša, aktīvā produkta daudzumu.

Ja bioloģiskā interpretācija ir atkarīga no nobriešanas procesa, tad ir nepieciešamas analītiskās metodes, kas ļauj atšķirt prekursoru, starpproduktus un molekulas nobriedušās formas.

Apstrāde var notikt ārpus šūnām

Ne katrs nozīmīgs prekursora pārstrādes posms notiek sekrēcijas granulās vai citās šūnu daļās.

Svarīgs ārpusšūnu procesa piemērs ir kolagēna bioloģija.

Prokolagēna molekulas satur gala propeptīdus. Šo reģionu atdalīšana piedalās kolagēna šķiedru nobriešanā un veidošanā.

1996. gada pētījumā kaulu morfoģenētiskais olbaltums 1 jeb BMP-1 tika identificēts kā I tipa prokolagēna C-proteināze. [6]

Pētījumā konkrēts enzīms tika saistīts ar C-gala propeptīdu atdalīšanu no I tipa prokolagēna.

Šis piemērs ir noderīgs vairāku iemeslu dēļ.

Pirmkārt, tas liecina, ka prekursoru pārstrāde var būt svarīgs ārpusšūnu matricas nobriešanas elements, nevis tikai hormonālā signālu pārraide.

Otrkārt, tas parāda, kāpēc proteīnu nosaukumus nevajadzētu interpretēt, balstoties vienīgi uz zināmo terminoloģiju. Neskatoties uz savu nosaukumu, BMP-1 nevajadzētu automātiski uzskatīt par proteīnu, kas darbojas tāpat kā visi pārējie proteīni, kurus dēvē par kaulu morfogenētiskajiem proteīniem.

Treškārt, šis piemērs parāda, kāpēc propeptīds automātiski nav hormons.

Prokolagēna gadījumā bioloģiskais konteksts attiecas uz ekstracelulārās matricas veidošanos un nobriešanu, nevis uz hormonālo signālu pārraidi uz attālu orgānu.

Aktivizācija un griešana

Griešana maina molekulāro identitāti

Proteolītiskā sadalīšanās ir atsevišķu peptīdu saišu pārraušana prekursora ietvaros.

Atkarībā no konkrētās molekulas un griešanas vietas šis process var atbrīvot nobriedušu peptīdu, noņemt inhibējošo reģionu, atklāt receptora saistīšanās vietu, ļaut molekulārajai struktūrai salocīties, radīt starpproduktu vai citādi mainīt molekulas bioloģiskās īpašības.

Tomēr „griešana” un „aktivizēšana” nav sinonīmi.

Griešana apraksta ķīmisku notikumu.

Aktivizācija raksturo tās funkcionālo seku.

Griešana var aktivizēt molekulu, bet tā var to arī inaktivēt, radīt starpformu vai novest pie fragmentu rašanās, kuru bioloģiskās funkcijas joprojām nav skaidras.

Šis nošķirums novērš pārlieku vienkāršotu prekursoru apstrādes eksperimentu interpretāciju.

Fakts, ka prekursors ir sadalīts, pats par sevi vēl neliecina, ka ir palielinājusies sagaidāmā gatavā produkta aktivitāte.

Lai pierādītu aktivāciju, parasti ir jānovērtē arī iegūtā produkta bioloģiskā funkcija.

Griezums ne vienmēr nozīmē tūlītēju atbrīvošanu

Pat pēc kovalentās saites pārtraukšanas noņemtais segments joprojām var palikt fiziski saistīts ar savu partneri, izmantojot nekovalentas mijiedarbības.

Tas nozīmē, ka sadalīšanās ne vienmēr izraisa pilnībā pieejamas aktīvās molekulas tūlītēju atbrīvošanos.

Labs piemērs ir neaktīvā transformējošā augšanas faktora beta jeb TGF-β strukturālie pētījumi.

Pētījumi ir parādījuši, kā prodomēns var pasargāt augšanas faktoru no atpazīšanas ar receptoru, un ir saistījuši aktivāciju ar strukturālām izmaiņām slēptajā kompleksā, tostarp ar spēka atkarīgiem procesiem pētītajā sistēmā. [7]

Šis piemērs parāda, ka regulēšana var sniegties tālāk par pašu griešanu.

Prekursors jau var būt proteolītiski pārveidots, savukārt bioloģiski aktīvā sastāvdaļa joprojām ir ierobežota mijiedarbības ar prodomēnu vai citiem molekulārajiem partneriem dēļ.

Tas nenozīmē, ka katrs propeptīds uzvedas tāpat kā TGF-β prodomēns.

Vispārējais likums ir tāds, ka aktivācija ir jāpierāda konkrētai bioloģiskai sistēmai, nevis jāizdara secinājums, pamatojoties uz pieņēmumu, ka „pārgriezts nozīmē aktīvs”.

Griešanas vietām un enzīmiem ir jāsader kopā

Daudzi hormonu prekursori satur sārmainas aminoskābes netālu no svarīgām pārveidošanās vietām.

Tomēr noteikta aminoskābju pāra vai secības klātbūtne nenozīmē, ka katra šāda vieta tiks šķelta vienādi.

Apstrāde ir atkarīga cita starpā no enzīma specifikas, vietējā sekvenču konteksta, olbaltumvielu konformācijas, šūnas lokalizācijas un atbilstoša enzīmu aparāta pieejamības.

Eksperimenti ar proinsulīnu un POMC ilustrē šo principu, izmantojot dažādus prekursorus un konvertāzes kā piemērus. [4][5]

To rezultāti apstiprina selektīvu fermentatīvo pārstrādi, nevis vispārēju likumsakarību, saskaņā ar kuru jau pati īsā sekvences motīva daļa nosaka turpmāko procesa gaitu.

Tāpēc paredzamo iegriezuma vietu vislabāk ir uztvert kā hipotēzi, ko iespējams pārbaudīt.

Pierādījums kļūst pārliecinošāks, ja pētnieki identificē faktisko pārstrādes produktu un saista tā veidošanos ar ierosināto enzīmu un atbilstošajiem bioloģiskajiem apstākļiem.

Kādi eksperimenti apstiprina prekursoru apstrādi?

Uzticams secinājums par apstrādi parasti balstās uz vairākiem savstarpēji papildinošiem pierādījumu veidiem, nevis uz vienu atsevišķu novērojumu.

Pētnieki var identificēt izveidojušos fragmentus, izmantojot masu spektrometriju vai sekvencēšanu. Viņi var salīdzināt prekursora un galaprodukta daudzumu laika gaitā, mainīt ierosināto sadalīšanās vietu vai ierobežot potenciālā pārveidojošā enzīma aktivitāti vai ekspresiju.

Funkcionālie eksperimenti pēc tam var noteikt, vai iegūtais produkts uzrāda bioloģisko aktivitāti, kas piemīt tā nobriedušajai formai.

Katrai no šīm pieejām ir ierobežojumi.

Šķietamās molekulmasas izmaiņas gelā var liecināt desprestrādi, bet tās nenorāda precīzu šķelšanas vietu.

Fermenta inhibitors var ietekmēt vairāk nekā vienu bioloģisko ceļu.

Piedāvātās griezuma vietas maiņa var izjaukt gan olbaltumvielas locīšanos, gan enzīma atpazīšanu.

Masu spektrometrija var identificēt molekulāros produktus, taču viena pati tā neapstiprina to bioloģisko aktivitāti.

Tāpēc rezultātu atbilstība, kas iegūta, izmantojot neatkarīgas analītiskās un funkcionālās metodes, parasti ir pārliecinošāka nekā viens mērījums.

Šie noteikumi ir paredzēti pētījumu interpretācijai. Tos nevajadzētu uzskatīt par laboratorijas protokolu vai apgalvojumu, ka katrs šeit citētais pētījums ir veicis visus iespējamos eksperimentus.

Nepieciešamo pierādījumu veids ir atkarīgs no tā, vai pētnieciskais jautājums attiecas uz molekulāro identitāti, apstrādes mehānismu, enzīma specifiku vai bioloģisko funkciju.

Atbrīvotie fragmenti var uzrādīt savu aktivitāti

Fragments, kas atbrīvots no propetīda reģiona vai identificēts tajā, dažreiz pats var kļūt par pētījuma objektu.

Atbilstošs piemērs nāk no kolagēna pētījumiem.

Zinātnieki identificēja pentapeptīdu KTTKS I tipa prokolagēna propeptīda reģionā un pētīja tā bioloģisko aktivitāti kultivētās mezenhimālajās šūnās. Tika novērota ietekme uz kolagēna un fibronektīna ražošanu. [8]

Šis rezultāts ir jāapraksta līmenī, kāds patiesībā tika uzrādīts.

Konkrēts peptīda fragments izmainīja mērītos ar ārpusšūnu matriksu saistītos parametrus šūnu kultūras eksperimentā.

Tas nenozīmē, ka pilns prokolagēna propeptīds, izolētā KTTKS secība, ķīmiski modificētie KTTKS atvasinājumi un katrs kosmētikas līdzeklis, kas satur līdzīgu sastāvdaļu, ir līdzvērtīgi.

Katrs no šiem gadījumiem pārstāv citu eksperimentālo vai formulēšanas kontekstu.

Rezultāts arī nepierāda, ka kosmētikas līdzekļa lietošana uz cilvēka ādas atjauno pareizu prokolagēna šūnu iekšējo vai ārpusšūnu pārstrādes procesu.

Bioloģiskā izcelsme var būt interesants zinātnisks pamatojums konkrētās peptīdu secības izpētei.

Tas tomēr nenovērš jautājumus par formulējumu, koncentrāciju, stabilitāti, iekļūšanu, iedarbību, gatavā produkta darbību un pētījumu rezultātiem ar cilvēku līdzdalību.

Kosmētiskajā kontekstā ir vērts arī nodalīt šo mehānismu no plašākā jautājuma signālpeltīdu izmantošanā ādas kopšanā, tā kā secības izcelsme no prekursora automātiski nenozīmē gatavā kosmētikas līdzekļa noteiktu iedarbību.

Propeptīdi un kosmētiskais termins „pro-peptide”

Apzīmējums uz etiķetes neidentificē secību

Apzīmējums „pro-peptīds” uz lūpu līdzekļa, seruma, krēma vai cita kosmētikas līdzekļa pats par sevi neidentificē konkrētu molekulu.

Tas var attiekties uz zīmola sastāvdaļu kompleksu, ražotāja paša terminoloģiju, mārketinga koncepciju vai vispārēju paziņojumu par produktu.

Noskaidrot, kas patiesībā atrodas produktā, prasa sastāvdaļu saraksta un — ja tādi ir pieejami — attiecīgo tehnisko dokumentu analīzi.

Zinātniski lietderīgai molekulārajai identifikācijai ir jānosaka sastāvdaļa un, attiecīgā gadījumā, arī tās aminoskābju secība, modifikācija vai ķīmiskā forma.

Pat viennozīmīga identitātes noteikšana atbild tikai uz daļu jautājuma.

Tas nenorāda, cik daudz attiecīgā komponenta ir gatavajā formulā, vai tas saglabā stabilitāti uzglabāšanas laikā, vai tas nonāk attiecīgajā bioloģiskajā vietā, un vai visa formulācija sniedz izmērāmu efektu cilvēkiem.

Savienotājfakts vai tā trūkums nosaukumā neveido zinātnisku garantiju.

Termini „pro peptide”, „pro-peptide” un „propeptide” var radīt daļēji pārklājošos meklēšanas rezultātus, taču jebkura no tiem parādīšanās produkta nosaukumā nebūtu automātiski jāinterpretē saskaņā ar propeptīda definīciju, ko izmanto molekulārajā bioloģijā.

Priekšteču bioloģija neapstiprina kosmētiskos paziņojumus

Pētījums, kas parāda, ka propeptīds palīdz enzīma locīšanā, sniedz informāciju par šo enzīmu un konkrēto eksperimentālo sistēmu.

Tas nepierāda, ka lūpu kosmētika uzlabo mitrināšanu.

Līdzīgi arī pētījums par prokolagēna apstrādi pats par to neliecina, ka gatavais krēms samazina grumbu redzamību.

Tie ir dažādi zinātniski jautājumi, kuriem nepieciešami dažāda veida pierādījumi.

Noderīgam kosmētiskajam pētījumam vajadzētu noteikt gatavo formulējumu, tā lietošanas veidu, pētāmo populāciju, salīdzināšanas līdzekli, ilgumu un vērtējamo rezultātu.

Ja deklarācija attiecas uz mitrināšanu, jāizmanto atbilstoša mitrināšanas novērtēšanas metode.

Ja runa ir par grumbu izskatu, pētījumā ir jāizmanto atbilstoši ar izskatu saistīti galvenie rādītāji un jāņem vērā produkta mitrinošās bāzes ietekme.

Ja produkts konkrēti deklarē ietekmi uz prekursoru apstrādi, pierādījumiem būtu jāuzrāda attiecīgs bioloģiskais notikums, nevis tikai jāatsaucas uz vispārēju publikāciju par prekursoru bioloģiju.

Ja paziņojumu pamatojošie pētījumi ietver tikai attīrītas olbaltumvielas, skaitļošanas modeļus vai kultivētas šūnas, formulējumā šie ierobežojumi ir jāsaglabā.

„Pētīts šūnu modelī” nav pielīdzināms apgalvojumam „ir pierādīts cilvēkiem, kuri lieto šo gatavo formulāciju”.

Trīs jautājumi atvieglo deklarāciju novērtēšanu

Trīs vienkārši jautājumi var atvieglot gan bioloģisko, gan komerciālo apgalvojumu izvērtēšanu.

Pirmais skan:

Kas tieši ir klāt?

Tas ļauj noteikt, vai diskusija attiecas uz bioloģisku propeptīdu, definētu sintētisku secību, modificētu peptīdu, maisījumu vai tikai tirdzniecības terminoloģiju.

Otrais jautājums ir:

Kādu eksperimentu patiesībā veica?

Tas ļauj noteikt, vai pierādījumi ir iegūti no attīrītu olbaltumvielu, šūnu, dzīvnieku pētījumiem, sastāvdaļas testiem vai gatavā produkta pētījuma ar cilvēkiem.

Trešais jautājums ir:

Vai izmērītais rezultāts tiešām atbilst deklarētajam efektam?

Molekulārā iedarbība nav automātiski pierādījums grumbu samazināšanai. Paaugstināta laboratorijas marķiera ekspresija nav automātiski pierādījums redzamam ādas izskata uzlabojumam.

Šie jautājumi palīdz novērst situāciju, kurā zinātniskā terminoloģija aizstāj trūkstošos pierādījumus.

Kosmētika var ļoti labi mitrināt ādu, nesaturam bioloģisku peptīdu.

Savukārt ar bioloģisko prekursoru saistītā komponenta klātbūtne negarantē redzamu efektu.

Gatavo produktu var novērtēt, pamatojoties uz tā pašu pierādījumiem, bez nepieciešamības radīt nepamatotu skaidrojumu, kura pamatā ir prekursoru aktivācija.

Šāds nošķīrums ļauj precīzi apspriest gan pamata bioloģiju, gan kosmētiskos pierādījumus, nepieņemot kļūdaini, ka piedēklis „pro” ir efektivitātes skala.

Biežāk uzdotie jautājumi

1. Vai propeptīdi ir aktīvi hormoni?

Ne obligāti. Daudzi propeptīdi ir ar prekursoriem saistīti segmenti, kas piedalās olbaltumvielu locīšanā, aktivitātes inhibīcijā, struktūru veidošanā vai nobriešanā, nevis ir aktīvi hormoni. Dažas prekursoru olbaltumvielas galu galā rada hormonus, bet citas nobriest par enzīmiem, strukturālajiem proteīniem, augšanas faktoriem vai citām bioloģiskām molekulām. Prokolagēna apstrāde un subtilizīna locīšanās parāda ļoti atšķirīgas propeptīdu funkcijas. [6][1] Tāpēc tas, vai konkrētam propeptīdam piemīt hormonālā aktivitāte, ir jānosaka katrai konkrētajai molekulai, nevis jāsecina tikai no paša termina.

2. Vai apzīmējums „pro-peptide” produkta etiķetē identificē konkrētu molekulu?

Nē. Pats termins „pro-peptīds” nenodrošina viennozīmīgu molekulāro identifikāciju. Tas var apzīmēt komerciālu koncepciju, zīmola kompleksu, mārketinga terminu vai ražotāja izmantotu sastāvdaļas pašnosaukumu, nevis bioloģiski definētu prekursoru segmentu. Lai noteiktu, kāda viela patiesībā ir klāt, ir nepieciešams sastāvdaļu saraksts un atbilstoša tehniskā dokumentācija. Pat pēc identitātes noskaidrošanas ir nepieciešami pierādījumi par gatavo produktu, lai noteiktu, vai tas nodrošina deklarēto efektu. Produkta nosaukums nevar aizstāt ne molekulāro identifikāciju, ne efektivitātes pierādījumus.

3. Ar ko propeptīds atšķiras no proteīna priekšteča (probalstvielas / probaltuma)?

Probaltkums parasti ir lielāka prekursoru molekula, turpretim propeptīds parasti apzīmē ar nobriešanu saistītu segmentu, kas atrodas šajā prekursorā vai tiek atbrīvots tā apstrādes laikā. Terminoloģija dažādās olbaltumvielu saimēs var atšķirties, tāpēc ir svarīgas secības robežas un definīcijas, ko izmanto konkrētajā pētījumā. Propeptīds var pildīt arī svarīgu funkciju pirms tā noņemšanas, lai gan tas nav atrodams galīgajā nobriedušajā olbaltumvielā. Tāpēc probaltkuma un propeptīda uzskatīšana par precīziem sinonīmiem var apgrūtināt aprakstītā apstrādes mehānisma izpratni.

4. Vai signālpeptīds ir tas pats, kas propeptīds?

Nē. Signālpeptīds parasti palīdz novirzīt no jauna sintezētu olbaltumvielu uz atbilstošo šūnas iekšējo ceļu, turpretim propeptīds biežāk piedalās vēlākā nobriešanā, locīšanā, inhibīcijā, salikšanā vai aktivācijā. Abi var būt sastopami vienā un tajā pašā preproproteīnā, taču tiem ir atšķirīgas funkcijas. Strukturālie pētījumi par signāla atpazīšanu apraksta olbaltumvielu intracelulārās novirzīšanas mehānismu, nevis katra propeptīda nobriešanas funkciju. [3] Tāpēc ir jānosaka konkrētā secība un apstrādes posms, nevis jāpieņem, ka katrs noņemtais apgabals pilda vienu un to pašu funkciju.

5. Kāpēc šūnas ražo prekursorus, nevis tikai gatavus olbaltumvielu produktus?

Prekursoru molekulu veidošana ļauj šūnām koordinēt vairākus proteīnu bioloģijas elementus, tostarp to virzīšanu, locīšanu, transportēšanu, salikšanu un bioloģiskās aktivitātes iegūšanas brīdi. Dažiem proteīniem var būt nepieciešams palikt neaktīvā stāvoklī vai ierobežotiem, līdz tie sasniedz pareizo vietu vai iegūst pareizu trīsdimensiju struktūru. Pētījumi par subtilizīnu parāda, ka propeptīds var veicināt locīšanu, vienlaikus kavējot enzīmu pirms nobriešanas procesa beigām. [1] Tas ir skaidrs bioloģisks ieguvums no prekursoru organizācijas, lai gan dažādi proteīni izmanto dažādas nobriešanas stratēģijas.

6. Vai griešana vienmēr aktivizē olbaltumvielu?

Nē. Griešana var aktivizēt molekulu, inaktivēt to, izraisīt starpposma formas veidošanos vai radīt fragmentus ar atšķirīgām vai nenoteiktām funkcijām. Pat pēc sagriešanas noņemtais segments dažkārt var palikt nekovalenti saistīts ar nobriedušo daļu un turpināt ierobežot tās aktivitāti. Pētījumi par neaktīvo TGF-β parāda, kāpēc funkcionālai aktivācijai var būt nepieciešams kas vairāk nekā tikai peptīdu saites pārtraukšana prekursorā. [7] Tāpēc aktivācija ir jāapstiprina ar atbilstošiem funkcionāliem pierādījumiem, nevis par to jāsecina tikai, pamatojoties uz griešanu.

7. Vai no viena prekursorja var rasties vairāki peptīdi?

Tā. Viens prekensors var saturēt vairākus reģionus, no kuriem galu galā veidojas dažādi peptīdu produkti. Svarīgs piemērs ir POMC. Eksperimenti ir parādījuši, ka dažādas konvertāzes noved pie atšķirīgiem tā paša prekursora apstrādes modeļiem. [5] Tādējādi konkrētajā šūnā pieejamie apstrādes enzīmi ietekmē to, kādi gatavie produkti radīsies un kādās proporcijās. Prekursora secība nosaka iespējamos produktus, bet pati par sevi neparedz, kuri no tiem dominēs katrā audī vai bioloģiskajā situācijā.

8. Vai propeptīdi vienmēr atrodas olbaltumvielas sākumā?

Nē. Ar prekursoru saistītie segmenti var atrasties dažādās vietās atkarībā no konkrētā olbaltumvielas uzbūves. Prokolagēns satur gala propeptīdus, tostarp C-gala reģionu, kas tiek izvadīts nobriešanas laikā, savukārt proinsulīns satur iekšējo savienojošo reģionu, kas tiek izvadīts nobriedušā insulīna veidošanās laikā. [6][4] Tādējādi atrašanās vieta ir konkrētā prekursora īpašība, un par to nevajadzētu secināt, pamatojoties tikai uz priedēkli pro.

9. Vai propeptīdi ir vienkārši atkritumu produkti?

Nē. Daži propeptīdi pirms to atdalīšanas pilda svarīgas funkcijas, un daži atbrīvotie fragmenti ir pētīti arī to pašu bioloģiskās aktivitātes dēļ. Subtilizīna pētījumi sniedz eksperimentālus piemērus gan locīšanās veicināšanai, gan enzīma inhibīcijai, ko veic propeptīds. Tomēr dažu propeptīdu svarīgo funkciju pierādīšana nenozīmē, ka katram atdalītajam prekursora segmentam ir sava labvēlīgā iedarbība. Bioloģiskā nozīme ir jāpēta individuāli, nevis automātiski jāpieņem tās klātbūtne vai neesība.

10. Kas ir intracelulārais molekulārais šaperons?

Intramolekulārais šaperons ir proteīna prekuzora reģions, kas palīdz citai tās pašas molekulas daļai iegūt pareizu trīsdimensiju struktūru. Propeptīds var pildīt šādu funkciju, kas ir pierādīts pētījumos par subtilizīna nobriešanu. [2] Šis termins apraksta molekulas locīšanās mehānismu, nevis kosmētikas sastāvdaļu kategoriju. Pierādījums tam, ka viens enzīms izmanto propeptīdu kā intramolekulāro šaperonu, nenozīmē, ka saistīts peptīds vai kosmētikas sastāvdaļa pilda to pašu funkciju.

11. Vai katrs prekursors izmanto to pašu apstrādes enzīmu?

Nē. Dažādi apstrādes enzīmi atpazīst dažādus substrātus un tiem var būt atšķirīgas preferences attiecībā uz šķelšanas vietām. Eksperimenti ar proinsulīnu un POMC ir parādījuši dažādus apstrādes modeļus, kas saistīti ar dažādām konvertāzēm. [4][5] Rezultātu var ietekmēt enzīma pieejamība, vietējā aminoskābju secība, olbaltumvielu konformācija, intracelulārā lokalizācija un šķelšanas vietas pieejamība. Tāpēc vispārīgais termins „aktivējošie enzīmi” sniedz mazāk zinātniskas informācijas nekā konkrētā enzīma un prekursoru norādīšana, kas faktiski tika pētīti.

12. Vai apstrāde var notikt ārpus šūnas?

Labi. Daži prekursoru apstrādes posmi norisinās ārpusšūnu vidē. Ar ārpusšūnu matricas nobriešanu saistīts piemērs ir prokolagēna C-propeptīda noņemšana, ko veic BMP-1. [6] Tas atšķiras no daudzu hormonu prekursoru apstrādes sekrēcijas ceļā. Tāpēc nobriešanas vieta ir atkarīga no konkrētā olbaltumvairuma, un tā ir jānosaka eksperimentāli, nevis jāvispārina, pamatojoties uz vienu zināmu prekursora sistēmu.

13. Vai propeptīdiem ir jābūt ļoti īsiem?

Nē. Termins propeptīds apraksta saistību ar prekursoru nobriešanu, nevis stingri noteiktu aminoskābju skaitu. Eksperimentāli pētītais subtilizīna propeptīds satur 77 aminoskābju atlikumus, kas parāda, ka propeptīds nebūt nenozīmē ļoti mazu peptīdu, kāds bieži parādās kosmētikas mārketingā. [1] Citi ar prekursoriem saistītie segmenti un produmēni var būtiski atšķirties pēc garuma un struktūras sarežģītības. Tāpēc pati secības garuma noteikšana neļauj noteikt, vai konkrētā struktūra ir bioloģisks propeptīds.

14. Vai prekursoru noteikšana pierāda to nobriedušā produkta klātbūtni?

Nē. Prekursora noteikšana apstiprina noteiktās prekursorās formas klātbūtni. Tas nebūt nenozīmē, ka apstrāde ir noritējusi pareizi vai ka ir uzkrājies nobriedis, bioloģiski aktīvs produkts. Apstrāde var būt nepilnīga vai izmainīta, un nobriedušais produkts pēc tam var tikt pakļauts noārdīšanai. Ja šī atšķirība ir svarīga, ir nepieciešami testi, kas ļauj atšķirt prekursoru, starpproduktu un nobriedušo formu. Kopējo olbaltumvielu daudzumu nevajag automātiski pielīdzināt aktīvā produkta daudzumam.

15. Vai KTTKS ir tas pats, kas viss kolagēna propeptīds?

Nē. KTTKS ir īsa secība, kas identificēta I tipa prokolagēna propeptīda reģionā, nevis viss propeptīds. Zinātnieki pētīja KTTKS kultivētās šūnās un aprakstīja ietekmi uz ārpusšūnu matricas komponentu veidošanos. [8] Šiem rezultātiem vajadzētu palikt saistītiem ar precīzo pētīto secību un eksperimentālo modeli. Pilns prekursoru segments, izolēts KTTKS, ķīmiski modificēti atvasinājumi un gatavie kosmētikas līdzekļi, kas satur līdzīgas sastāvdaļas, ir dažādi materiāli, un tiem nevajadzētu automātiski pārņemt vienam otra pierādījumus.

16. Vai paredzētā griezuma vieta ir pietiekama bioloģiskā mehānisma apstiprināšanai?

Nē. Paredzētā griezuma vieta norāda uz iespējamo apstrādes lokalizāciju, taču tā nepierāda, ka bioloģiskajos apstākļos griezums patiešām notiek tieši šajā vietā. Ir nepieciešami eksperimenti, kas identificē radītos produktus un saista to veidošanos ar attiecīgo enzīmu un apstākļiem. Olbaltumvielu locīšanās un griezuma vietas pieejamība var arī noteikt, vai teorētiski atpazīstamā vieta tiešām tiks apstrādāta. Tāpēc prognozes ir noderīgas hipotēzu izveidei un testēšanai, bet tās nevajadzētu pasniegt kā pabeigtu mehānisma validāciju.

Kādi pierādījumi var pamatojumu kosmētiskajam apgalvojumam par „pro-peptīdu”?

Skaidri identificēta sastāvdaļa kopā ar atbilstoši izstrādātu gatavās formulas pētījumu sniedz daudz noderīgākus pierādījumus nekā pati terminoloģija. Pētījumā ir jānovērtē deklarētais efekts, izmantojot piemērotu salīdzināšanas līdzekli, atbilstošu populāciju, piemērotu ilgumu un pareizu mērījumu metodi. Ja deklarācijā ir konkrēti teikts, ka kosmētikas līdzeklis maina prekursora aktivāciju vai apstrādi, arī šim mehānismam ir nepieciešami tieši pierādījumi. Vispārīga molekulārās bioloģijas publikācija par olbaltumvielu apstrādi, to locīšanu vai kolagēna prekursoru aktivitāti pati par sevi nevar apstiprināt mazumtirdzniecības kosmētikas līdzekļa darbību.

Kopsavilkums

Propeptīdi ir svarīga bioloģisko mehānismu daļa, ar kuras palīdzību daudzi olbaltumvielas tiek sagatavotas, regulētas, transportētas, locītas un pakļautas nobriešanas procesam.

Tos nedefinē vienkārši īsa aminoskābju secība.

Savukārt šis termins apraksta to saistību ar prekursoru un tā nobriešanas procesu.

Atsevišķi propeptīdi var pildīt ļoti dažādas funkcijas.

Dažas palīdz pareizi locīt olbaltumvielas.

Inas ierobežo bioloģisko aktivitāti līdz attiecīgajam nobriešanas posmam.

Dažas piedalās molekulāro struktūru veidošanā, turpretī noteikti atbrīvotie fragmenti var uzrādīt savu bioloģisko aktivitāti un kļūt par neatkarīgu pētījumu objektu.

Hormonu prekursoruri, enzīmu prekursoru formas, augšanas faktoru sistēmas un prokolagēns parāda, cik dažādi var būt šie mehānismi.

Īpaši svarīga ir atšķirība starp šķelšanu un aktivāciju. Peptīda saites pārraušana var mainīt molekulāro identitāti, uzreiz neizraisot bioloģisko aktivitāti. Atbrīvotais segments var joprojām būt saistīts ar nobriedušo molekulu, šķelšana var novest pie starpposma formas, nevis galaprodukta, un pareiza apstrāde automātiski nepierāda funkcionālo aktivitāti.

Tāpat prekursoru noteikšana neapstiprina nobrieduša produkta klātbūtni.

Šīs atšķirības izskaidro, kāpēc prekursoru bioloģiju parasti nosaka, pamatojoties uz papildinošiem pierādījumiem par molekulāro identitāti, apstrādi, enzīmu specifiku un bioloģisko funkciju.

Kosmētika izmantotā terminoloģija prasa atsevišķu interpretāciju.

Produkts ar apzīmējumu „pro-peptide” nav obligāti jāsatur bioloģisks propeptīds, jāatveido dabīgais prekursoru apstrādes process vai jānodrošina redzami kosmētiskie ieguvumi.

Vispiru jānoskaidro sastāvdaļas patiesā identitāte.

Pēc tam gatavais sastāvs ir jānovērtē, pamatojoties uz pierādījumiem par efektu, ko tas patiesi deklarē.

Eksperiments par olbaltumvielu locīšanos nepierāda ādas mitrināšanu.

Prokolagēna apstrādes pētījums pats par sevi nav pierādījums grumbu samazināšanai.

Šūnu kultūras eksperiments ar sekvenci, kas atvasināta no prekursoru vielas, nepierāda gatavā kosmētikas līdzekļa iedarbību uz cilvēkiem.

Tāpēc visnoderīgākais princips ir molekulārās identitātes, bioloģiskā mehānisma, eksperimentālo pierādījumu un gatavā produkta deklarāciju nošķiršana.

Šāds nošķīrums ļauj saglabāt propeptīdu zināšanu zinātnisko vērtību, nepaplašinot laboratorijas rezultātus ārpus tā, kas faktiski ir pierādīts eksperimentos.

Atruna

Šis raksts ir paredzēts tikai izglītojošiem un zināniski informatīviem mērķiem. Tajā ir paskaidroti jautājumi, kas saistīti ar prekursoru olbaltumvielām, propeptīdiem, olbaltumvielu apstrādi, šķelšanu, nobriešanu un saistītās kosmētikas terminoloģijas interpretāciju.

Tas nav ieteikums par kosmētikas līdzekli, peptīda sastāvdaļu, uztura bagātinātāju, ārstēšanu, formulējumu, devu vai lietošanas veidu.

Laboratorijas pētījumu rezultātus, kas ietver attīrītus olbaltumumvielas, prekursoru sistēmas, kultivētas šūnas, enzīmus vai atsevišķus peptīdu fragmentus, nedrīkst automātiski interpretēt kā pierādījumus tam, ka līdzīgi nosauktām komerciālām sastāvdaļām piemīt klīniska vai kosmētiska iedarbība.

Produktam, kura nosaukumā ir termins „pro-peptide”, vajadzētu tikt novērtētam, pamatojoties uz faktisko sastāvu un pierādījumiem par gatavo formulējumu, nevis uz pieņēmumu, ka tas atveido bioloģisko mehānismu, kas saistīts ar prekursoru.

Jautājumi par ārstēšanu, slimībām vai individuālo veselības stāvokli vajadzības gadījumā ir jāapspriež ar atbilstoši kvalificētu veselības aprūpes speciālistu.

Atsauces

1. Ohta, Y., Hojo, H., Aimoto, S., Kobayashi, T., Zhu, X., Jordan, F., & Inouye, M. (1991). Propeptīds kā intracelulārais šaperons: Denaturētas subtilizīna E renaturācija ar sintētisku propeptīdu [labots]. Molekulārā mikrobioloģija, 5(6), 1507–1510. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.1991.tb00797.x
2. Jabuta, J., Takagi, H., Inouje, M., & Šinde, U. (2001). Intramolekulāra šaperīna mediēts locīšanās ceļš: Propeptīda atbrīvošana modulē prosubtilizīna aktivācijas precizitāti. Journal of Biological Chemistry, 276(48), 44427–44434. https://doi.org/10.1074/jbc.M107573200
3. Jomaa, A., Eitzinger, S., Zhu, Z., Chandrasekar, S., Kobayashi, K., Shan, S. O., & Ban, N. (2021). Mammāļu signālu atpazīšanas daļiņas kravas atpazīšanas un nodošanas molekulārais mehānisms. Cell Reports, 36(2), 109350. pants. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109350
4. Smeekens, S. P., Montag, A. G., Thomas, G., Albiges-Rizo, C., Carroll, R., Benig, M., Phillips, L. A., Martin, S., Ohagi, S., & Gardner, P. (1992). Proinsulīna apstrāde ar subtilizīnam radniecīgajām proproteīna konvertāzēm furīnu, PC2 un PC3. Amerikas Savienoto Valstu Nacionālās zinātņu akadēmijas ziņojumi, 89(18), 8822–8826. https://doi.org/10.1073/pnas.89.18.8822
5. Benjannet, S., Rondeau, N., Day, R., Chrétien, M., & Seidah, N. G. (1991). PC1 un PC2 ir proproteīnu konvertāzes, kas spēj šķelt proopiomelanokortīnu pie dažādiem bāziskiem aminoskābju pāriem. Amerikas Savienoto Valstu Nacionālās zinātņu akadēmijas ziņojumi, 88(9), 3564–3568. https://doi.org/10.1073/pnas.88.9.3564
6. Kessler, E., Takahara, K., Biniaminov, L., Brusel, M., & Greenspan, D. S. (1996). Kaulu morfooģenētiskais proteīns-1: I tipa prokolagēna C-proteināze. Science, 271(5247), 360–362. https://doi.org/10.1126/science.271.5247.360
7. Shi, M., Zhu, J., Wang, R., Chen, X., Mi, L., Walz, T., & Springer, T. A. (2011). Latentās TGF-β struktūra un aktivācija. Nature, 474(7351), 343–349. https://doi.org/10.1038/nature10152
8. Katayama, K., Armendariz-Borunda, J., Raghow, R., Kang, A. H., & Seyer, J. M. (1993). A pentapeptide from type I procollagen promotes extracellular matrix production. Journal of Biological Chemistry, 268(14), 9941–9944. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8486721/