Mechanizmus účinku DSIP: polčas plazmatickej eliminácie, kortizol, štruktúra a fosfo-DSIP

Neuropeptid vyvolávajúci spánok delta (DSIP), známy aj ako emideltide, sa zdá byť ovplyvňovať viaceré neuronálne a neuroendokrinné systémy namiesto toho, aby pôsobil prostredníctvom jedného potvrdeného receptora. Jeho presný mechanizmus účinku však zostáva nevysvetlený a väčšina údajov týkajúcich sa jeho biologických dráh pochádza z výskumov na zvieratách, tkanivách alebo bunkách.

DSIP je peptid zložený z deviatich aminokyselín, ktorý bol prvýkrát identifikovaný v experimentoch zahŕňajúcich mozgovú žilovú krv králikov odoberanú v súvislosti so spánkom. Jeho názov naznačuje, že pôsobí ako špecifický spánkový signál. Neskoršie výskumy však spojili DSIP s reakciami na stres, vylučovaním hypofyzárnych hormónov, cirkadiánnou aktivitou, GABA a glutamátovou signalizáciou, monoamínmi a procesmi súvisiacimi s opioidným systémom. Tieto výsledky viedli k vzniku niekoľkých možných mechanistických vysvetlení, ale žiadne z nich nepredstavuje úplný a klinicky potvrdený obraz účinku DSIP u ľudí [1–4].

Neistota presahuje chýbajúce podrobnosti o mechanizme. Výskumníci neidentifikovali jedinečný receptor DSIP s vysokou afinitou, konvenčný gén prekurzora jednoznačne zodpovedný za produkciu volného nonapeptidu ani konzistentný vzťah medzi špecifickou koncentráciou v krvi a konkrétnym účinkom u ľudí. Merania označované ako „imunoreaktivita podobná DSIP” môžu tiež detegovať peptid spojený s väčšími molekulami alebo štrukturálne podobný materiál, a nie výlučne voľný, neporušený DSIP. Z tohto dôvodu je dôležité rozlišovať medzi chemickou identitou, priamo nameranými experimentálnymi účinkami, neuroendokrinnými pozorovaniami u ľudí a širšími mechanistickými hypotézami.

Ako funguje DSIP?

Najodôvodniteľnejšia interpretácia predpokladá, že DSIP môže fungovať ako neuromodulátor závislý od kontextu. Neuromodulátor nemusí aktivovať jeden receptor a vyvolať jednu predvídateľnú odpoveď. Namiesto toho môže modifikovať spôsob, akým neuronálne okruhy reagujú na existujúce inhibičné, excitačné, hormonálne a cirkadiánne signály. Takéto vysvetlenie lepšie zodpovedá dostupnej literatúre než opisovanie DSIP ako konvenčného lieku na spanie.

V experimentálnych štúdiách sa DSIP spájal so zmenami neurónovej aktivity, prúdov aktivovaných GABA, glutamátovej a NMDA signalizácie, aktivity monoamínov, vylučovania hypofyzárnych hormónov, expresie génov súvisiacich so stresom a cirkadiánnej lokomotorickej aktivity [3–9]. Smer a intenzita týchto účinkov často závisia od druhu, dávky, spôsobu podania, dennej doby, východiskovej úrovne stresu a konkrétnej oblasti mozgu alebo skúmaného experimentálneho modelu. Staršie štúdie opísali aj nelineárne vzťahy medzi dávkou a odpoveďou alebo krivky v tvare obráteného zvona. V týchto experimentoch stredná dávka niekedy vyvolala účinok, zatiaľ čo nižšie a vyššie dávky ho nevyvolali [3,10].

Tieto pozorovania neukazujú na jeden molekulárny cieľ. Neexistujú žiadne uznané dôkazy naznačujúce, že DSIP pôsobí ako priamy agonista alebo antagonista konkrétneho „receptora DSIP”. Tvrdenia, že DSIP pôsobí výlučne prostredníctvom GABA, serotonínu, dopaminu, NMDA receptorov, znižovania kortizolu alebo opioidného systému, preto presahujú dostupné údaje. Každá z týchto dráh predstavuje experimentálne pozorovanie alebo navrhovaný nepriamy mechanizmus, nie však úplné vysvetlenie účinku DSIP u ľudí.

Aminokyselinová sekvencia a molekulárna štruktúra DSIP

DSIP je nonapeptid, čo znamená, že sa skladá z deviatich aminokyselinových zvyškov spojených peptidovými väzbami. Stanovená sekvencia voľného peptidu je:

• H–Trp–Ala–Gly–Gly–Asp–Ala–Ser–Gly–Glu–OH

Jednopísmenový zápis sekvencie je:

• WAGGDASGE

N-koniec sa začína tryptofánom, zatiaľ čo C-koniec sa končí kyselinou glutámovou. Serín sa nachádza na pozícii 7 a je obzvlášť dôležitý v prípade fosfo-DSIP, pretože jeho hydroxylový postranný reťazec môže podliehať fosforylácii. Počiatočné štúdie sekvencie taktiež ukázali, že štrukturálne detaily môžu ovplyvňovať aktivitu. Syntetický DSIP zvyšoval aktivitu delta vĺn a spánkových vretien v EEG na králičom modeli, zatiaľ čo skúmané fragmenty, analógy s modifikovanou sekvenciou a beta-aspartyl izomér vykazovali menšiu aktivitu alebo zostávali neaktívne za rovnakých experimentálnych podmienok [1]. To poukazuje na vzťah medzi štruktúrou a aktivitou v počiatočnej štúdii na zvieratách, ale nepotvrdzuje existenciu špecifického ľudského receptora pre DSIP.

Pre nemodifikovaný voľný DSIP databáza PubChem uvádza molekulový vzorec C35H48N10O15, približnú molekulovú hmotnosť 848,8 g/mol a identifikátor PubChem Compound ID 68816 [14]. Číslo CAS 62568-57-4 sa bežne priradzuje emideltidu alebo voľnému DSIP. Číslo CAS, identifikátor v chemickej databáze či medzinárodný nechránený názov však identifikujú konkrétnu chemickú látku. Potvrdzujú regulačné schválenie, klinickú účinnosť, čistotu ani ekvivalenciu medzi voľným DSIP a jeho soľnou formou.

Textový diagram štruktúry

Štruktúru peptidu DSIP možno znázorniť bez toho, aby sa naznačovalo, že má jednu pevnú, biologicky aktívnu trojrozmernú konformáciu:

Plochý diagram sekvencie je vedecky vhodnejzí než prezentovanie jedného prepracovaného „molekulárneho modelu” ako biologicky aktívneho tvaru DSIP. Krátke peptidy sa v roztoku vyskytujú ako dynamické súbory rôznych konformácií. Ich konformačné správanie sa môže meniť v závislosti od pH, iónovej sily, rozpúšťadla, membrán, vezúcich partnerov, fosforylácie a koncentrácie. Nebola stanovená definitívna štruktúra DSIP viazaného na receptor, ktorá by potvrdzovala jednu aktívnu trojrozmernú konformáciu.

Uvádzaná molekulová hmotnosť si taktiež vyžaduje zodpovedajúci kontext. Hodnota približne 848,8 g/mol sa vzťahuje na neutrálny, nemodifikovaný peptid reprezentovaný vzorom C35H48N10O15. Acetátové soli, hydratované formy, protióny, fosforylácia, izotopové značkovače a iné modifikácie môžu meniť molekulový vzor alebo nameranú molekulovú hmotnosť. Množstvo v miligramoch uvedené na komerčnej liekovke nepotvrdzuje presnú chemickú formu ani množstvo v nej prítomného neporušeného, aktívneho peptidu.

Navrhované neurálne a neuroendokrinné mechanizmy

Výskum DSIP zahŕňa niekoľko úrovní biologickej organizácie, od elektrických odpovedí izolovaných neurónov až po reakcie na stres u celých zvierat. Tieto rôzne úrovne by sa nemali spájať do jednej dráhy. Elektrofyziologický experiment môže ukázať, že DSIP modifikuje neurónovú odpoveď za kontrolovaných podmienok, ale sám o sebe nemôže potvrdiť, že rovnaký mechanizmus vyvoláva spánok, znižuje kortizol alebo zlepšuje klinický stav.

Jedna z hlavných oblastí mechanistického výskumu sa týka rovnováhy medzi inhibičnou a excitačnou signalizáciou. V neurónoch hipokampu a mozočku potkanov DSIP závisle od dávky potencioval prúdy aktivované GABA, hlavným inhibičným neurotransmiterom v mozgu. V kortikálnych a hipokampálnych preparátoch DSIP taktiež blokoval potenciáciu aktivovanú NMDA. Experimenty využívajúce synaptozómy mozgovej kôry ďalej naznačovali moduláciu presynaptického vychytávania vápnika spojeného s NMDA [6]. V samostatných pokusoch na neurónoch potkanov sa zistilo, že DSIP znižoval excitačné účinky vyvolané glutamátom [7]. Tieto výsledky spoločne podporujú možnosť posunu smerom k nižšej neurónovej excitabilite. Neukazujú však, že DSIP sa priamo viaže na GABA-A alebo NMDA receptory v koncentráciách dosiahnuteľných u ľudí.

Výskum záchvatov a stresu u zvierat vo všeobecnosti súhlasí s týmto modelom rovnováhy medzi inhibíciou a excitáciou. Počas zvýšeného tlaku kyslíka sa podávanie DSIP potkanom spájalo s vyššími koncentráciami GABA a homokarnozínu v mozgovej kôre a nižšími koncentráciami glutamátu a aspartátu [15]. Išlo o biochemický objav pochádzajúci zo špecializovaného zvieracieho modelu záchvatov. Nedá sa priamo preniesť na tvrdenia, že DSIP je GABA-ergické liečivo, antagonista NMDA alebo antikonvulzívum pre ľudí.

Skúmali sa aj monoamínergne mechanizmy. V experimente týkajúcom sa termoregulácie u potkanov bol vplyv DSIP na zmeny teploty vyvolané agonistom serotonínu modifikovaný farmakologickou blokádou. Vedci preto naznačili možnú účasť mechanizmu spojeného s receptorom 5-HT1A [8]. DSIP a fosforylovaný DSIP tiež menili hypotermiu vyvolanú apomorfínom, zatiaľ čo haloperidol antagonizoval oba účinky. To naznačovalo súvislosť s dopaminergnou signálnou trasou v tomto konkrétnom termoregulačnom modeli [9]. Tieto štúdie ukazujú závislosť určitých zvieracích odpovedí od konkrétnych dráh, ale nepotvrdzujú, že DSIP je agonistom serotonínových alebo dopamínových receptorov.

Endogénna biológia DSIP zostáva mimoriadne nejasná. Imunoreaktivitu podobnú DSIP sa podarilo zistiť v mozgu, hypofýze, periférnych tkanivách, plazme, mozgomiechovom moku, moči a mlieku. Časť tohto imunoreaktívneho materiálu sa zdá byť viazaná na väčšie molekuly. Metódy založené na protilátkach nie vždy umožňujú rozlíšiť neporušený voľný DSIP od viazaného peptidu, materiálu pripomínajúceho prekurzor alebo skrížene reagujúcich sekvencií. V prehľadoch sa preto DSIP opisoval ako nie úplne preskúmaný peptidový systém, a nie ako úplne charakterizovaný hormón so špecifickým génom, receptorom, syntetickou dráhou a mechanizmom spätnej väzby [2–4].

DSIP, ACTH a kortizol

DSIP bol skúmaný ako potenciálny regulátor osi hypothalamus-hypofýza-nadobličky, bežne označovanej ako os HPA. V klasickej dráhe stresovej odpovede hypothalamus uvoľňuje kortikoliberín (CRH). CRH stimuluje hypofýzu k vylučovaniu adrenokortikotropného hormónu (ACTH) a ACTH následne stimuluje kôru nadobličiek k produkcii kortizolu u ľudí alebo najmä kortikosterónu u potkanov. Výsledky súvisiace s DSIP sa pozorovali v niekoľkých fázach tohto systému, nepotvrdzujú však, že DSIP je látka, ktorá spoľahlivo znižuje hladinu kortizolu.

V malom klinickom experimente sa skúmali odpovede ACTH a arginín-vazopresínu u zdravých mužov. DSIP sa podával v infúzii ôsmim účastníkom počas jednej časti protokolu, zatiaľ čo ďalších sedem účastníkov bolo zahrnutých do iných časových podmienok. DSIP významne znižoval koncentráciu ACTH v krvi, ale neovplyvnil bazálnu koncentráciu vazopresínu ani jeho odpoveď na osmotické a ortostatické podnety [11]. Ide o priamy neuroendokrinný dôkaz pochádzajúci zo štúdie u ľudí. Experiment bol však malý a mal fyziologický charakter. Neukázal terapeutický vplyv na kortizol, dlhodobé prínosy, klinickú účinnosť ani bezpečnosť súčasných subkutánnych alebo nazálnych produktov DSIP.

V inej štúdii s účasťou ľudí sa použil test stimulácie CRH u 12 osôb s veľkou depresiou a 12 vhodne zodpovedajúcich kontrolných osôb. Základné koncentrácie DSIP a kortizolu boli navzájom korelované a vyššie u účastníkov s depresiou. Odpovede DSIP po podaní CRH sa taktiež líšili medzi oboma skupinami. Vedci považovali tieto výsledky za zhodné s možnou modulačnou úlohou DSIP v regulácii osi HPA [12]. Keďže išlo o štúdiu biomarkerov a odpovede na podnet, nepreukazuje to však, že podávanie DSIP znižuje hladinu kortizolu alebo lieči depresiu.

Údaje zo zvierat sú podobne závislé od experimentálnych podmienok. U potkanov vystavených dlhodobému imobilizačnému stresu sa zvyšovali hladiny ACTH, kortikosterónu a beta-endorfínu. Podávanie DSIP čiastočne znižovalo nárast kortykosterónu, ale nevedie k priamemu potlačeniu všetkých meraných hormónov [13]. Iné experimenty naznačovali, že neuronálne účinky DSIP záviseli od východiskových koncentrácií kortikosteroidov a stávali sa výraznejšími v podmienkach spojených so stresom. Takýto vzorec je viac v súlade s moduláciou závislou od stavu než s univerzálnym mechanizmom inhibície kortizolu.

Z tohto dôvodu je tvrdenie „DSIP znižuje kortizol” príliš kategorické. Presnejší záver je, že obmedzené údaje z výskumu u ľudí a zvierat naznačujú interakciu DSIP s reguláciou osi HPA, vrátane odpovedí ACTH a kortikosteroidov, neexistuje však žiadny validovaný klinický protokol preukazujúci predvídateľné zníženie kortizolu. Kortizol tiež podlieha silnému cirkadiálnemu rytmu a závisí od ochorení, spánkovej deprivácie, príjmu potravy, fyzickej aktivity, liekov a podmienok odberu vzoriek. Jednorazové meranie kortizolu si preto vyžaduje vhodný kontext.

DSIP a dráhy regulujúce spánok

DSIP dostal svoj názov na základe pozorovaného experimentálneho fenotypu, a nie objavu určitej receptorovej dráhy. V pôvodných experimentoch na králikoch sa využil materiál získaný počas elektricky navodeného spánku a ukázalo sa, že izolovaný a následne synteticky pripravený nonapeptid zvyšoval deltovú aktivitu a spánkové vretená na EEG po intracerebroventrikulárnom podaní [1]. Neskoršie experimenty priniesli zmiešané výsledky závislé od druhu, spôsobu podania, dávky a schémy liečby. Táto nekonzistentnosť je jedným z dôvodov, prečo navrhovaná úloha DSIP ako univerzálneho endogénneho spánkového faktora zostáva predmetom diskusií [2–4].

Niekoľko mechanizmov by mohlo potenciálne spájať DSIP s reguláciou spánku. Zvýšenie inhibície spojené s GABA v kombinácii so znížením excitácie spojené s glutamátom a NMDA by mohlo obmedzovať neuronálne vzrušenie v niektorých okruhoch [6,7]. Zmeny serotoninergnej a dopaminergnej aktivity by mohli ovplyvňovať prechody medzi spánkom a bdením, termoreguláciu a cirkadiánne správanie [8–10]. Modulácia osi HPA by mohla nepriamo ovplyvňovať spánok v podmienkach zvýšenej aktivity stresového systému [11–13]. Žiadna z týchto dráh však nebola stanovená ako hlavný mechanizmus zodpovedný za opakovaný vplyv DSIP na spánok u ľudí.

Pokusy na zvieratách tiež naznačujú, že čas podania a vzorec expozície môžu ovplyvniť odpoveď. Opakované podávanie menilo cirkadiánnu lokomotórnu aktivitu za podmienok nepretržitého osvetlenia, pričom natívny DSIP a P-DSIP vyvolávali rôzne vzorce [10]. V štúdiách spánku u potkanov fosforylovaný analóg zvyšoval pomalovlnový spánok aj paradoxný spánok po centrálnom podaní, hoci rozsah účinných dávok bol nelineárny [16,17]. Tieto výsledky môžu pomôcť pri vytváraní hypotéz týkajúcich sa cirkadiánnej regulácie a architektúry spánku, ale nedokazujú, že periférne podanie u ľudí vedie k dosiahnutiu rovnakých oblastí mozgu alebo vyvoláva rovnaké účinky.

Výskum nespavosti u ľudí dôsledne nepreukázal silné účinky. V niektorých menších štúdiách sa zaznamenali zmeny parametrov súvisiacich so spánkom, ale kontrolované štúdie vo všeobecnosti preukázali slabé, premenlivé alebo klinicky obmedzené prínosy. Aj keď DSIP modifikuje neuronálne dráhy spojené s útlmom, stresom alebo cirkadiánnym rytmom, mechanistické výsledky sa preto nepremenili na etablovanú liečbu nespavosti.

Čo je známe o polčase rozpadu DSIP?

U ľudí sa nestanovil dobre potvrdený polčas eliminácie DSIP, ktorý by umožnil spoľahlivo určiť trvanie klinického účinku, kumuláciu alebo frekvenciu dávkovania.

Často citovaná hodnota približne 15 minút pochádza z experimentov týkajúcich sa proteolytického rozkladu vykonaných na rezoch alebo homogenizátoch mozgu. V týchto experimentoch bol meraným koncovým bodom odstránenie N-koncového tryptofánu [3]. Ide o meranie degradácie v tkanive in vitro, a nie o moderné meranie farmakokinetického polčasu po intravenóznom podaní u ľudí.

Predchádzajúce štúdie s využitím homogenátov potkanieho mozgu poukazujú na rovnaký rozdiel. Po 7,5 minútach inkubácie s 2,5% mozgového homogenátu sa uvoľnilo približne 30% N-koncového tryptofánu DSIP. Rýchlosť degradácie sa líšila v závislosti od experimentálnych podmienok a vývojového veku [5]. Tento typ testu poukazuje na náchylnosť k enzymatickému štiepeniu. Priamo nemeria absorpciu, distribúciu, plazmatický klírens, väzbu v tkanivách, renálnu elimináciu ani dobu pôsobenia v živom ľudskom organizme.

Inkubačné štúdie s krvou podobne ukázali, že degradácia DSIP závisela od času, teploty a druhu. Natívny DSIP pomerne rýchlo mizol v preparátoch ľudskej alebo potkanej krvi, pričom vytváral produkty zodpovedajúce odstráneniu N-koncového tryptofánu. Značené analógy, ktoré boli fosforylované alebo modifikované na N-konci, sa degradovali pomalšie a vytvárali komplexy alebo agregáty, ktoré mohli potenciálne predĺžiť zdanlivú prítomnosť nespáleného materiálu [18]. Išlo o štúdie biostability, a nie o zvalidované farmakokinetické štúdie u ľudí.

Tento rozdiel vysvetľuje, prečo sa termíny „polčas rozpadu” a „trvanie účinku” nemajú používať zamieňane. Peptid môže rýchlo miznúť z voľnej cirkulujúcej frakcie v plazme a súčasne spúšťať ďalšiu signalizáciu, ktorá pretrváva oveľa dlhšie. Na druhej strane, imunoreaktívny materiál môže zostať detegovateľný, pretože je viazaný na nosič alebo preto, že meranie zahŕňa príbuzné fragmenty, napriek tomu, že nie sú biologicky rovnocenné s neporušeným voľným DSIP.

Publikované údaje neposkytujú spoľahlivé hodnoty týkajúce sa konečného polčasu, biodostupnosti, distribučného objemu, klírensu ani expozície u ľudí po intranazálnom alebo subkutánnom podaní.

Metabolizmus, degradácia a farmakokinetická neistota

N-koncový tryptofán sa zdá byť dôležitým skorým štiepiacim miestom v niekoľkých experimentoch týkajúcich sa degradácie DSIP. Peptidázy prítomné v tkanivách a v krvi môžu postupne odstraňovať zvyšky alebo štiepiť peptidové väzby, čím vznikajú fragmenty, ktoré môžu byť neaktívne, vykazovať odlišnú aktivitu alebo naďalej zostať detegovateľné pomocou špecifických analytických metód. Na nameranú rýchlosť degradácie môžu vplývať teplota, pH, koncentrácia enzýmov, živočíšny druh, biologická matrica a modifikácia peptidu [3,5,18].

Viazanie na bielkoviny a agregácia navyše komplikujú interpretáciu. Predchádzajúce štúdie naznačovali, že endogénna immunoreaktivita podobná DSIP môže byť spojená s väčšími bielkovinovými nosičmi, ktoré potenciálne chránia peptid pred rýchlym proteolytickým rozkladom [3]. Modifikované analógy taktiež vykazovali tvorbu komplexov a pomalšiu degradáciu in vitro [18]. V dôsledku toho môže test merajúci celkovú immunoreaktivitu poskytnúť iný výsledok ako analytická metóda merajúca konkrétne neporušený, voľný DSIP.

Výskum hematoencefalickej bariéry vykonaný na zvieratách a modeloch endotelových buniek in vitro naznačoval určitý stupeň prechodu DSIP. Výsledky týkajúce sa transportu však neurčujú, aká časť súčasného donosového alebo injekčne podávaného produktu sa dostane k neuronálnym cieľom u ľudí. Vstrebávanie závislé od spôsobu podania, metabolizmus v slizniciach, periférna väzba, renálna eliminácia a lokálna degradácia v tkanivách zostávajú nedostatočne charakterizované. Tvrdenia, že donosový DSIP úplne „obchádza” degradáciu alebo dodáva určitú časť látky priamo do mozgu, nie sú podložené zodpovedajúcimi farmakokinetickými štúdiami.

Tieto farmakokinetické neistoty tiež znemožňujú vedecky spoľahlivý prepočet expozície medzi intravenóznym, subkutánnym, intranazálnym a perorálnym podaním. Identické množstvá podané rôznymi cestami nemusia viesť k ekvivalentným koncentráciám v krvi alebo expozícii mozgu. Literatúra preto neumožňuje odôvodniť klinickú schému dávkovania na základe približne 15-minútovej degradácie pozorovanej in vitro.

Čo je fosfo-DSIP alebo P-DSIP?

Fosfo-DSIP, známy aj ako P-DSIP alebo DSIP-P, je fosforylovaná forma DSIP, v ktorej zvyšok serínu na pozícii 7 obsahuje fosfátovú skupinu.

Fosforylácia zavádza dodatočnú záporne nabitú chemickú skupinu a môže meniť konformáciu peptidu, jeho náchylnosť na enzýmy, väzbové vlastnosti, agregáciu a biologické správanie. P-DSIP by sa preto nemal považovať len za iný názov natívneho DSIP.

Imunochemické vyšetrenia identifikovali fosforylovanú formu podobnú DSIP na Ser7. In vitro enzýmový experiment tiež ukázal, že kazeínkináza II môže fosforylovať DSIP za použitia ATP alebo GTP ako donora fosfátu. Za týchto podmienok bola zdanlivá afinita k substrátu nízka a výskumníci opísali DSIP ako potenciálny in vitro substrát bez toho, aby označili enzým zodpovedný za fosforyláciu v živom ľudskom organisme [19]. Preukázanie, že enzým môže fosforylovať DSIP v laboratórnom systéme, nedokazuje, že tá istá reakcia predstavuje jeho prirodzenú biosyntetickú dráhu v ľudskom organisme.

Fosforylácia taktiež mení molekulovú hmotnosť. Pridanie fosfátovej skupiny zvyšuje hmotnosť peptidu približne o 80 Da. Očakávaná molekulová hmotnosť mono-fosforylovaného P-DSIP je preto približne 928,8 Da, v závislosti od ionizácie a formy soli. Ide o vypočítanú chemickú hodnotu, nie o analytický výsledok týkajúci sa konkrétnej šarže produktu.

Natívny DSIP vs. fosforylované analógy

Natívny DSIP a P-DSIP sa správali odlišne v pokusoch na zvieratách a experimentoch in vitro.

U voľne sa pohybujúcich potkanov zvýšila nepretržitá desaťhodinová nočná intraventrikulárna infúzia 0,5 nmol P-DSIP spánok s pomalými vlnami o 22% a paradoxný spánok o 81%. Toto zvýšenie bolo spôsobené väčším počtom spánkových epizód, zatiaľ čo vyššie aj nižšie skúmané dávky boli neúčinné. V tomto konkrétnom teste vedci odhadli, že P-DSIP bol približne päťkrát silnejší ako natívny DSIP [16].

V inom experimente na potkanoch bol P-DSIP podávaný do tretej komory mozgu pred nástupom tmy. Pri dávke 200 pmol/kg P-DSIP zvýšil spánok s pomalými vlnami o 17,3% a paradoxný spánok o 32,3% počas obdobia tmy nasledujúceho po podaní, bez skrátenia latencie spánku. Vplyv na spánok s pomalými vlnami pretrvával aj v nasledujúcom svetlom období, po ktorom sa hodnoty druhý deň vrátili na kontrolnú úroveň [17]. Išlo o štúdie na zvieratách s centrálnym podaním. Neboli to štúdie na ľuďoch a nestanovujú protokol intranazálneho ani subkutánneho podania.

P-DSIP sa taktiež nesprával ako konzistentne dlhšie pôsobiaca forma vo všetkých experimentálnych modeloch. V experimente s apomorfínom vyvolanou hypotermiou sa účinok P-DSIP objavil a vymizol rýchlejšie ako účinok natívneho DSIP [9]. Na druhej strane, v štúdiách inkubácie s krvou vykazovali značené fosforylované analógy pomalšiu degradáciu a tvorbu komplexov [18].

Tieto zdanlivo odlišné výsledky ukazujú, prečo trvanie účinku závisí od toho, čo presne sa meria. Chemická stabilita v biologickej matrici, fyziológia spojená s receptormi, správanie a architektúra spánku môžu prebiehať v rôznych časových rámcoch.

Ktoré tvrdenia týkajúce sa mechanizmu sú potvrdené a ktoré hypotetické?

Medzi najlepšie potvrdené chemické zistenia patria deväťaminokyselinová sekvencia DSIP, približný molekulový vzorec a hmotnosť volného peptidu a lokalizácia miesta fosforylácie Ser7 [1,14,19].

Experimentálne údaje tiež ukazujú, že DSIP môže podliehať degradácii v mozgových a krvných preparátoch, P-DSIP sa môže správať inak ako natívny DSIP a DSIP môže upravovať parametre súvisiace s GABA, glutamátom, NMDA, monoamínmi a neuroendokrinným systémom vo vybraných experimentálnych modeloch [5–13,16–19].

Rovnako dôležité sú oblasti neistoty.

Jedinečný receptor DSIP nebol stanovený. Žiadna jednotlivá vnútrobunková signálna dráha nevysvetľuje všetky uvádzané účinky DSIP. Často citovaná hodnota 15 minút nie je stanoveným polčasom eliminácie u ľudí. Nepreukázal sa predvídateľný účinok znižujúci hladinu kortizolu. Taktiež nie je známe, či pozorované účinky na GABA alebo NMDA vysvetľujú reakcie spánku u ľudí.

Podobne väčšia aktivita P-DSIP v niektorých pokusoch na zvieratách potvrdzuje jeho prevahu u ľudí. Detekcia immunoreaktivity podobnej DSIP tiež nemusí naznačovať koncentráciu neporušeného, ​​voľného DSIP.

Obmedzenia údajov o mechanizme účinku

Veľká časť literatúry týkajúca sa DSIP pochádza z obdobia od 70. do 90. rokov 20. storočia. Mnohé z týchto experimentov využívali metódy navrhnuté na zodpovedanie oveľa užších otázok než moderná receptorová farmakológia, proteomika, farmakokinetika založená na hmotnostnej spektrometrii či kontrolované klinické štúdie.

Mnohé výsledky sú založené na intraventrikulárnej aplikácii, izolovaných neurónoch, tkanivových homogenátoch, synaptozómoch, rádioimunologických testoch alebo špecializovaných zvieracích modeloch spojených so stresom a termoreguláciou.

Výsledky sa tiež líšia v závislosti od druhu, spôsobu podania, dávky, času a východiskového fyziologického stavu. Nelineárne vzťahy medzi dávkou a odpoveďou obzvlášť sťažujú širokú extrapoláciu.

Merania materiálu podobného DSIP založené na protilátkach taktiež nemusia umožniť dôsledné rozlíšenie medzi neporušeným voľným peptidom, väčšími viazanými formami a skrížene reagujúcimi molekulami.

Mechanistické výsledky tak zostávajú cenné na tvorbu a testovanie výskumných hypotéz, nemôžu však určiť účinnú dávku u ľudí, liečebnú schému, klinický prínos ani bezpečnostný profil.

Najčastejšie kladené otázky týkajúce sa mechanizmu DSIP

Aký je mechanizmus účinku DSIP?

Zdá sa, že DSIP ovplyvňuje inhibičné, excitačné, monoaminergické a cirkadiánne procesy, ako aj procesy spojené s osou HPA, avšak nepotvrdil sa jeden receptor ani jednotný mechanizmus účinku.

Najpriamejšie údaje o dráhach pochádzajú zo štúdií na neurónoch a zvieracích tkanivách a z malých neuroendokrinných štúdií, a nie z jednoznačných štúdií na ľudských receptoroch.

Ako peptid DSIP ovplyvňuje spánok?

Potenciálne mechanizmy spojené so spánkom zahŕňajú zosilnenie inhibície spojenej s GABA, obmedzenie vzruchu spojeného s glutamátom a NMDA, zmeny monoamínovej signalizácie, moduláciu cirkadiánneho rytmu a zmeny aktivity osi stresu za určitých podmienok [6–13].

Žiadny z týchto mechanizmov nebol stanovený ako hlavný mechanizmus zodpovedný za vplyv na spánok u ľudí a klinické výsledky týkajúce sa spánku boli nekonzistentné.

Viaže sa DSIP na receptory GABA?

DSIP zesiloval prúdy aktivované GABA v neurónoch hipokampu a mozočku potkanov [6].

Tento výsledok však dokazuje, že sa DSIP priamo viaže na určité miesto GABA receptora. Nepotvrdzuje to ani to, že DSIP pôsobí ako benzodiazepíny alebo iné GABA-ergické lieky.

Ovplyvňuje DSIP glutamát alebo NMDA receptory?

Pokusy na neurónoch a synaptozómoch potkanov preukázali zmeny týkajúce sa excitácie závislej od glutamátu, potenciacie súvisiacej s NMDA a vychytávania vápnika [6,7].

Tieto preklinické pozorovania podporujú možnosť modulácie exitačnej signalizácie, ale nepotvrdzujú klinicky užitočný blokujúci účinok na NMDA u ľudí.

Znižuje DSIP hladinu kortizolu?

Nie predvídateľným spôsobom na základe súčasných dôkazov.

Malé štúdie na ľuďoch a experimenty so stresom na zvieratách naznačujú, že DSIP môže ovplyvňovať reguláciu ACTH, kortizolu alebo kortikosterónu. Tieto štúdie však potvrdzujú DSIP ako spoľahlivú metódu na zníženie hladiny kortizolu [11–13].

Aký je polčas peptidu DSIP?

Zvalidovaný polčas DSIP v ľudskej plazme nebol stanovený.

Často citovaná hodnota približne 15 minút pochádza z výskumu proteolytického odstránenia tryptofánu v mozgových rezoch alebo homogenátoch, a nie z meraní farmakokinetickej eliminácie DSIP u ľudí [3].

Prečo môže účinok DSIP trvať dlhšie ako jeho čas degradácie?

Peptid môže spustiť ďalšie neuronálne alebo hormonálne procesy, ktoré pretrvávajú po degradácii alebo odstránení pôvodnej molekuly.

Viazanie na väčšie molekuly, distribúcia do tkanív, skrížená reaktivita testov a prítomnosť detegovateľných alebo biologicky aktívnych fragmentov môžu taktiež spôsobiť rozdiely medzi nameranou imunoreaktivitou podobnou DSIP a skutočnou koncentráciou neporušeného voľného DSIP.

Aké je molekulové hmotnosť DSIP?

Nemodifikovaný voľný peptid má približnú molekulovú hmotnosť 848,8 g/mol a molekulový vzorec C35H48N10O15 [14].

Formy soli, protóny, hydratácia, izotopové značenie alebo fosforylácia môžu meniť molekulový vzorec alebo nameranú hmotnosť.

Aké je číslo CAS pre DSIP?

CAS číslo 62568-57-4 sa bežne pripisuje emideltidu alebo volnému DSIP.

Katalogové informácie je však potrebné preveriť z hľadiska presnej chemickej formy, pretože voľný peptid, acetátové formy, modifikované analógy a analytické štandardy nie sú automaticky rovnocenné.

Aká je aminokyselinová sekvencia DSIP?

Sekvencia DSIP je Trp–Ala–Gly–Gly–Asp–Ala–Ser–Gly–Glu, skrátene WAGGDASGE [1].

Toto je nonapeptid obsahujúci serín na pozícii 7.

Čo je fosfo-DSIP?

Fosfo-DSIP, P-DSIP alebo DSIP-P je forma DSIP fosforylovaná na Ser7.

V vybraných *in vitro* a na zvieracích štúdiách sa zistili rozdiely medzi P-DSIP a natívnym DSIP, pokiaľ ide o degradáciu, termoreguláciu, cirkadiánnu aktivitu a účinky súvisiace so spánkom [9,10,16–19].

Je P-DSIP lepší ako natívny DSIP?

Toto nebolo potvrdené u ľudí.

P-DSIP vykazoval väčšiacu aktivitu v jednom experimente týkajúcom sa spánku u potkanov s centrálnym podaním, ale jeho účinok sa líšil v závislosti od dávky a experimentálneho modelu [16]. Chýbajú vhodné priame klinické štúdie u ľudí preukazujúce vyššiu účinnosť alebo bezpečnosť.

Je DSIP endogénny hormón?

Imunoreaktivitu podobnú DSIP identifikovali v niekoľkých tkanivách a biologických tekutinách, ale jej endogénny prekursor, syntetická dráha, receptor a biologická identita zostávajú neúplne preskúmané.

Označenie DSIP za plne charakterizovaný ľudský hormón by teda presahovalo dostupné dôkazy [2–4].

Zrieknutie sa zodpovednosti

Obsah má výlučne vzdelávací a vedecko-informačný charakter. Nepredstavuje lekársku radu, diagnózu, odporúčania týkajúce sa liečby alebo dávkovania ani odporúčanie na používanie DSIP.

Peptid indukujący spánok Delta (DSIP, emideltide) ani fosfo-DSIP nie sú schválené Americkým úradom pre kontrolu potravín a liečiv (FDA), Európskou liekovou agentúrou (EMA) ani britskou Agentúrou pre reguláciu liekov a zdravotníckych výrobkov (MHRA) na liečbu nespavosti, zníženie hladiny kortizolu, liečbu stresu ani na iné použitia diskutované v tomto článku.

Dostupné údaje sú obmedzené a pochádzajú predovšetkým zo štúdií na zvieratách, ex vivo, in vitro, mechanistických štúdií a malých historických štúdií na ľuďoch. Článok neobsahuje protokol dávkovania, rekonštitúcie, injekcie ani samostatného použitia.

Odkazy

[1] Schoenenberger, G. A., Maier, P. F., Tobler, H. J., Wilson, K., & Monnier, M. (1978). The delta EEG (sleep)-inducing peptide (DSIP). XI. Amino-acid analysis, sequence, synthesis and activity of the nonapeptide. Pflügers Archiv, 376(2), 119–129. https://doi.org/10.1007/BF00581575

[2] Kovalzon, V. M., & Strekalova, T. V. (2006). Delta sleep-inducing peptide (DSIP): A still unresolved riddle. Journal of Neurochemistry, 97(2), 303–309. https://doi.org/10.1111/j.1471-4159.2006.03693.x

[3] Schoenenberger, G. A. (1984). Characterization, properties and multivariate functions of delta-sleep-inducing peptide (DSIP). European Neurology, 23(5), 321–345. https://doi.org/10.1159/000115711

[4] Graf, M. V., & Kastin, A. J. (1986). Delta sleep-inducing peptide (DSIP): An update. Peptidy, 7(6), 1165–1187. https://doi.org/10.1016/0196-9781(86)90148-8

[5] Huang, J. T., & Lajtha, A. (1978). The degradation of a nonapeptide, sleep inducing peptide, in rat brain: Comparison with enkephalin breakdown. Research Communications in Chemical Pathology and Pharmacology, 19(2), 191–199. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25463/

[6] Grigoriev, V. V., Ivanova, T. A., Kustova, E. A., Petrova, L. N., Serkova, T. P., & Bachurin, S. O. (2006). Účinky peptidu indukujúceho delta spánok na pre- a postsynaptické glutamátové a postsynaptické GABA receptory v neurónoch kôry, hipokampu a mozočka u potkanov. Bulletin experimentálnej biológie a medicíny, 142(4), 444–446. https://doi.org/10.1007/s10517-006-0323-9

[7] Umriukhin, P. E. (2002). Delta sleep-inducing peptide blocks excitatory effects of glutamate on rat brain neurons. Bulletin experimentálnej biológie a medicíny, 134(1), 5–7. https://doi.org/10.1023/A:1020679815690

[8] Tsunashima, K., Kato, N., Masui, A., & Takahashi, K. (1994). Vplyv delta spánok indukujúceho peptidu (DSIP) na zmeny telesnej (jadrovej) teploty vyvolané serotonergnými agonistami u potkanov. Peptidy, 15(1), 61–65. https://doi.org/10.1016/0196-9781(94)90171-6

[9] Tsunashima, K., Masui, A., & Kato, N. (1990). Vplyv peptidu navodzujúceho delta spánok (DSIP) a fosforylovaného DSIP (P-DSIP) na hypotermiu vyvolanú apomorfínom u potkanov. Brain Research, 510(1), 171–174. https://doi.org/10.1016/0006-8993(90)90748-Z

[10] Graf, M., Christen, H., & Schoenenberger, G. A. (1982). DSIP/DSIP-P a cirkadiánna motorická aktivita potkanov za podmienok stáleho svetla. Peptidy, 3(6), 1053–1057. https://doi.org/10.1016/0196-9781(82)90161-9

[11] Chiodera, P., Volpi, R., Capretti, L., Giacalone, G., Caffarri, G., Davoli, C., Nigro, E., & Coiro, V. (1994). Different effects of delta-sleep-inducing peptide on arginine-vasopressin and ACTH secretion in normal men. Hormone Research, 42(6), 267–272. https://doi.org/10.1159/000184207

[12] Lesch, K. P., Widerlöv, E., Ekman, R., Laux, G., Schulte, H. M., Pfüller, H., & Beckmann, H. (1988). Odpoveď peptidu indukujúceho hlboký spánok na ľudský kortikotropín uvoľňujúci hormón (CRH) pri veľkej depresívnej poruche: Porovnanie s vylučovaním kortikotropínu a kortizolu indukovaným CRH. Biological Psychiatry, 24(2), 162–172. https://doi.org/10.1016/0006-3223(88)90271-5

[13] Iuchanov, R. Ju., Rožanec, V. V., Michaleva, I. I., & Majskij, A. I. (1990). Analiza mechanizmov stress-protective action of delta sleep-inducing peptide. Biulleten’ Eksperimental’noi Biologii i Meditsiny, 109(1), 46–47. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2159352/

[14] Národné centrum pre biotechnologické informácie. (2026). PubChem súhrn zlúčeniny pre CID 68816, peptid navodzujúci hlboký spánok. PubChem. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/68816

[15] Mendžeritskij, A. M., Lysenko, A. V., Uskova, N. I., & Michaleva, I. I. (1997). Štúdie mechanizmu antikonvulzívneho účinku peptidu navodzujúceho delta spánok v podmienkach zvýšeného tenzného tlaku kyslíka. Neuroscience and Behavioral Physiology, 27, 329–333. https://doi.org/10.1007/BF02461934

[16] Kimura, M., & Inoué, S. (1989). Fosforylovaný analóg DSIP zvyšuje pomalofázový spánok a paradoxný spánok u voľne sa pohybujúcich potkanov. Psychopharmacology, 97(1), 35–39. https://doi.org/10.1007/BF00443409

[17] Nakagaki, K., Ebihara, S., Usui, S., Honda, Y., & Takahashi, Y. (1988). Sleep-promoting effect following intracerebroventricular injection of a phosphorylated analogue of delta sleep-inducing peptide (DSIP-P) in rats. Neuroscience Letters, 91(2), 160–164. https://doi.org/10.1016/0304-3940(88)90761-6

[18] Graf, M. V., Saegesser, B., & Schoenenberger, G. A. (1987). Degradation and aggregation of delta sleep-inducing peptide (DSIP) and two analogs in plasma and serum. Peptidy, 8(4), 599–603. https://doi.org/10.1016/0196-9781(87)90031-3

[19] Nakamura, A., & Shiomi, H. (1991). Phosphorylation of delta sleep-inducing peptide (DSIP) by casein kinase II in vitro. Peptidy, 12(6), 1375–1377. https://doi.org/10.1016/0196-9781(91)90222-B