Peptyd GHK-Cu: struktura molekularna, mechanizmy działania i zastosowania w badaniach naukowych

GHK-Cu to naturalnie występujący kompleks tripeptydu z miedzią, który wzbudza zainteresowanie naukowców ze względu na udział w komunikacji komórkowej, regulacji macierzy zewnątrzkomórkowej oraz procesach biologicznych związanych z utrzymaniem i naprawą tkanek. Od czasu jego zidentyfikowania w 1973 roku przez Lorena Pickarta badacze analizują jego strukturę molekularną, zdolność wiązania miedzi, wpływ na ekspresję genów oraz oddziaływania ze szlakami komórkowymi uczestniczącymi w procesach zapalnych, stresie oksydacyjnym i przebudowie tkanek.

Związek ten po raz pierwszy zidentyfikowano podczas badań nad składnikami ludzkiej surowicy i ich wpływem na syntezę białek w komórkach. Pickart zaobserwował, że czynnik pochodzący z surowicy może wpływać na zachowanie starzejących się komórek wątroby, pobudzając wzorce syntezy białek charakterystyczne dla młodszych komórek [1]. Późniejsze badania pozwoliły zidentyfikować tripeptyd glicylo-L-histydylo-L-lizynę (GHK) oraz przeanalizować jego zdolność do tworzenia stabilnego kompleksu z dwuwartościowymi jonami miedzi (Cu²⁺).

GHK składa się z trzech aminokwasów: glicyny, histydyny i lizyny. Po związaniu z jonem miedzi(II) tworzy kompleks powszechnie określany jako GHK-Cu lub peptyd miedziowy GHK.

Peptyd ten wykryto w ludzkich płynach biologicznych, w tym w osoczu, ślinie i moczu. Według opublikowanych danych jego stężenie w osoczu zmniejsza się wraz z wiekiem — z około 200 ng/mL w wieku 20 lat do około 80 ng/mL w wieku 60 lat [2–9]. Obserwacje te przyczyniły się do rozwoju badań nad zależnościami między GHK, zmianami komórkowymi związanymi ze starzeniem a regulacją procesów tkankowych.

W badaniach eksperymentalnych wykazano, że GHK-Cu może wpływać na syntezę kolagenu, przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej, sygnalizację angiogenną oraz aktywność enzymów antyoksydacyjnych. W hodowlach fibroblastów i modelach zwierzęcych analizowano również jego oddziaływanie na mediatory zapalne, migrację komórek i wzorce ekspresji genów związanych z przebudową tkanek.

Niektóre analizy powiązały GHK ze zmianami dotyczącymi ponad 4000 genów, co sugeruje, że jego aktywność biologiczna może obejmować wiele wzajemnie powiązanych szlaków komórkowych [9].

Zmiany ekspresji genów nie oznaczają jednak automatycznie poprawy funkcjonowania tkanek ani korzystnych wyników klinicznych. Wiele obserwacji pochodzi z hodowli komórkowych, analiz komputerowych lub doświadczeń na zwierzętach.

GHK-Cu pozostaje zatem ważnym przedmiotem badań molekularnych i przedklinicznych, szczególnie w kontekście koordynacji miedzi, biologii macierzy zewnątrzkomórkowej, stresu oksydacyjnego oraz odpowiedzi komórek na uszkodzenia.

Czym jest GHK-Cu?

GHK-Cu jest kompleksem koordynacyjnym powstającym, gdy tripeptyd glicylo-L-histydylo-L-lizyna wiąże jon miedzi(II). Zdolność koordynowania miedzi stanowi jedną z właściwości molekularnych odróżniających go od wielu innych krótkich peptydów [1, 2].

Miedź jest niezbędnym pierwiastkiem śladowym uczestniczącym w licznych procesach biologicznych. Wspiera aktywność enzymów, mitochondrialne wytwarzanie energii, ochronę antyoksydacyjną oraz powstawanie i utrzymanie tkanek łącznych.

Jednocześnie gospodarka miedzią musi podlegać ścisłej regulacji, ponieważ niezwiązana lub niewłaściwie kontrolowana miedź może uczestniczyć w reakcjach prowadzących do powstawania reaktywnych form tlenu.

GHK tworzy środowisko molekularne umożliwiające wiązanie miedzi i wpływanie na jej właściwości chemiczne. Dzięki tej interakcji GHK-Cu stał się użytecznym modelem badawczym do analizowania udziału małych peptydów w koordynacji metali i sygnalizacji komórkowej.

Wczesne badania koncentrowały się na jego wpływie na fibroblasty, czyli komórki odpowiedzialne za wytwarzanie i utrzymanie wielu składników tkanki łącznej.

Fibroblasty syntetyzują kolagen, składniki związane z elastyną, glikozaminoglikany oraz inne cząsteczki macierzy zewnątrzkomórkowej. Substancje te odpowiadają za właściwości mechaniczne, organizację i stabilność strukturalną tkanek.

Badania prowadzone przez Borela, Maquarta i współpracowników wykazały, że GHK-Cu może wpływać na metabolizm macierzy zewnątrzkomórkowej w hodowlach fibroblastów nawet przy stężeniach wynoszących około 1–10 nanomoli na litr (nM) [10–13].

Obserwowane efekty obejmowały zmiany w wytwarzaniu i degradacji kolagenu, siarczanowanych glikozaminoglikanów oraz małych proteoglikanów, takich jak dekoryna.

Co ważne, utrzymanie macierzy zewnątrzkomórkowej wymaga czegoś więcej niż zwiększenia produkcji białek strukturalnych.

Prawidłowa przebudowa tkanek opiera się na skoordynowanej syntezie, modyfikacji i rozkładzie składników macierzy.

Metaloproteinazy macierzy (MMP) uczestniczą w degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej, natomiast tkankowe inhibitory metaloproteinaz (TIMP) pomagają regulować ich aktywność.

W badaniach eksperymentalnych odnotowano, że GHK-Cu wpływa na aktywność MMP oraz ekspresję inhibitorów, takich jak TIMP-1 i TIMP-2 [11, 12].

Obserwacje te sugerują związek między ekspozycją na GHK-Cu a przemianami składników macierzy. Nie dowodzą jednak, że związek ten konsekwentnie wywołuje korzystną przebudowę tkanek u ludzi.

W dodatkowych badaniach przedklinicznych analizowano GHK-Cu w modelach ran, w tym w eksperymentach dotyczących obkurczania ran, integracji przeszczepów, sygnalizacji zapalnej oraz migracji komórek [3–5].

Inne badania dotyczyły reakcji fibroblastów na uszkodzenia związane z promieniowaniem. Odnotowano w nich zmiany wzrostu i żywotności komórek oraz ekspresji czynników wzrostu [14].

W eksperymentach analizowano również interakcje obejmujące komórki odpornościowe i komórki śródbłonka, które uczestniczą w odpowiedzi tkanek na uszkodzenia [15].

Badania na zwierzętach wykazały zmiany aktywności antyoksydacyjnej i parametrów związanych z ranami po ekspozycji na GHK-Cu lub materiały zawierające pokrewne peptydy [16–21].

Wyniki te zwiększyły zainteresowanie GHK-Cu jako narzędziem badawczym do analizowania starzenia komórkowego, regulacji macierzy zewnątrzkomórkowej oraz odpowiedzi tkanek na uszkodzenia oksydacyjne i mechaniczne.

Nie należy jednak interpretować obserwacji dotyczących zamykania ran, zachowania fibroblastów czy sygnalizacji molekularnej w modelach eksperymentalnych jako dowodu skuteczności terapeutycznej u ludzi.

Mechanizm działania GHK-Cu: wyniki badań in vitro i in vivo

Mechanizmy biologiczne związane z GHK-Cu obejmują kilka wzajemnie powiązanych szlaków, a nie jeden jednoznacznie ustalony cel molekularny.

W badaniach eksperymentalnych analizowano jego wpływ na ekspresję genów, sygnalizację czynników wzrostu, metabolizm macierzy zewnątrzkomórkowej, odpowiedź na stres oksydacyjny, szlaki zapalne oraz interakcje komórek z otaczającymi je tkankami.

Mechanizmy te badano z wykorzystaniem hodowli komórkowych, modeli zwierzęcych i analiz komputerowych.

Ekspresja genów i przebudowa tkanki płucnej

Jednym z istotnych obszarów badań jest zależność między GHK a wzorcami ekspresji genów związanymi z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc (POChP).

W wieloośrodkowym badaniu z udziałem naukowców z Boston University, University of Groningen, University of British Columbia i University of Pennsylvania analizowano sygnatury ekspresji genów związane z niszczeniem tkanki płucnej w przebiegu rozedmy [22].

Zidentyfikowano grupę 127 genów związanych z rozedmą płuc i zbadano, czy GHK może wpływać na nieprawidłowe wzorce transkrypcji.

Naukowcy odnotowali, że ekspozycja na GHK wiązała się ze zmianami sygnalizacji transformującego czynnika wzrostu beta (TGF-β).

TGF-β jest ważnym regulatorem różnicowania komórek, wytwarzania macierzy zewnątrzkomórkowej, przebudowy tkanek i włóknienia.

Jego działanie zależy od kontekstu biologicznego. Chociaż TGF-β uczestniczy w prawidłowym utrzymaniu tkanek, zaburzona sygnalizacja może również przyczyniać się do patologicznego gromadzenia składników macierzy i rozwoju włóknienia.

W eksperymentach laboratoryjnych z wykorzystaniem fibroblastów płucnych pobranych od pacjentów z POChP ekspozycja na GHK wiązała się z poprawą zdolności do obkurczania i reorganizacji kolagenu.

Badacze odnotowali również zwiększoną ekspresję integryny β1, co sugeruje możliwy udział interakcji komórkowych zależnych od integryn [22, 23].

Integryny są białkami pomagającymi komórkom oddziaływać z otaczającą je macierzą zewnątrzkomórkową. Uczestniczą w adhezji i migracji komórek, przekazywaniu sygnałów mechanicznych oraz organizacji tkanek.

Obserwacje te sugerują, że GHK może wpływać na zależności między sygnalizacją TGF-β, ekspresją integryn a regulacją macierzy zewnątrzkomórkowej.

Eksperymenty nie dowodzą jednak, że GHK-Cu odwraca przebieg POChP lub przywraca czynność płuc u pacjentów.

Wyniki dotyczą wzorców ekspresji genów i zachowania komórek w warunkach eksperymentalnych.

Ekspresja genów związanych z nowotworami i proliferacja komórek

GHK analizowano również w badaniach dotyczących sieci genowych związanych z nowotworami.

Hong i współpracownicy badali wzorce ekspresji genów związane z progresją raka jelita grubego i jego potencjałem przerzutowym [7, 24].

Późniejsze interpretacje tych danych powiązały GHK z obniżeniem ekspresji około 70% wybranej grupy genów związanych z przerzutami.

W tym kontekście omawiano między innymi geny MAP3K5, LMNA, APP i NFATC2.

Geny te uczestniczą w różnych procesach biologicznych, obejmujących sygnalizację wewnątrzkomórkową, organizację jądra komórkowego, regulację komórek i odpowiedzi transkrypcyjne.

Zmian ekspresji genów związanych z przerzutami nie należy jednak utożsamiać z udowodnionym zapobieganiem przerzutom.

Sygnatury ekspresji genów mogą pomagać identyfikować szlaki związane z przebiegiem choroby, ale ich modyfikacja nie stanowi samodzielnego dowodu klinicznego działania przeciwnowotworowego.

W innych badaniach laboratoryjnych analizowano ekspozycję na GHK w ludzkich liniach komórek nowotworowych.

W części eksperymentów obejmujących modele neuroblastomy i raka piersi odnotowano zmiany apoptozy i proliferacji komórek przy stężeniach nanomolowych [25].

Apoptoza jest regulowaną formą śmierci komórkowej, która uczestniczy w rozwoju tkanek i utrzymaniu homeostazy komórkowej.

Zaburzenia apoptozy mają znaczenie w biologii nowotworów, ponieważ komórki złośliwe mogą rozwijać mechanizmy umożliwiające unikanie prawidłowych sygnałów prowadzących do śmierci komórkowej.

Zaobserwowanie apoptozy w hodowlach komórek nowotworowych nie dowodzi jednak selektywnego działania przeciwnowotworowego w organizmie człowieka.

Linie komórkowe różnią się od rzeczywistych guzów pod względem architektury, metabolizmu, mikrośrodowiska, interakcji z układem odpornościowym i warunków ekspozycji.

Dlatego wyniki te pozostają istotne dla badań nad mechanizmami nowotworzenia, a nie dla potwierdzonych zastosowań w onkologii klinicznej.

Aktywność fibroblastów i przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej

Badania fibroblastów stanowią kolejny ważny element literatury naukowej dotyczącej GHK-Cu.

Po ekspozycji na kompleksy tripeptydów miedziowych obserwowano zmiany wytwarzania kolagenu, degradacji macierzy oraz ekspresji czynników wzrostu [9, 26].

Synteza kolagenu jest tylko jednym z elementów regulacji macierzy zewnątrzkomórkowej.

Aby zachować prawidłową strukturę tkanek, macierz musi również podlegać kontrolowanej degradacji i reorganizacji.

GHK-Cu powiązano ze zmianami aktywności metaloproteinaz macierzy oraz ekspresji TIMP-1 i TIMP-2.

Wyniki te sugerują, że związek może wpływać zarówno na wytwarzanie, jak i rozkład składników macierzy.

Kierunek i znaczenie tych zmian zależą od modelu eksperymentalnego oraz otaczających warunków biologicznych.

W modelach napromieniowanych fibroblastów badacze analizowali, czy tripeptydy miedziowe wpływają na wzrost komórek i ekspresję czynników wzrostu po ekspozycji na promieniowanie [26].

W analizach ekspresji genów omawianych w literaturze odnotowano również zmiany w szlakach związanych z naprawą DNA. Obejmowały one 47 genów o zwiększonej ekspresji oraz pięć genów, których ekspresja zmniejszyła się o co najmniej 50% [9, 26].

Wyniki te wskazują na zmiany odpowiedzi transkrypcyjnej komórek.

Nie dowodzą jednak same w sobie całkowitej naprawy DNA, odwrócenia starzenia komórkowego ani przywrócenia prawidłowego funkcjonowania tkanek.

Sygnalizacja angiogenna i czynniki wzrostu

GHK-Cu badano również w kontekście angiogenezy, czyli procesu powstawania nowych naczyń krwionośnych z już istniejących struktur naczyniowych.

Angiogeneza uczestniczy w rozwoju tkanek, odpowiedzi na uszkodzenia oraz utrzymywaniu sieci naczyń krwionośnych.

W badaniach eksperymentalnych analizowano zależności między materiałami zawierającymi GHK a takimi czynnikami jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) i zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) [27].

VEGF uczestniczy w sygnalizacji komórek śródbłonka i rozwoju naczyń krwionośnych.

Zasadowy FGF bierze udział w proliferacji i różnicowaniu komórek oraz odpowiedzi tkanek obejmującej komórki naczyniowe i tkanki łącznej.

W niektórych badaniach odnotowano zwiększoną ekspresję lub wydzielanie tych czynników po ekspozycji na materiały związane z GHK.

Jako możliwy element tych efektów omawiano również sygnalizację zależną od integryn.

Zmiany ekspresji VEGF lub bFGF nie dowodzą jednak powstawania funkcjonalnych naczyń krwionośnych.

Prawidłowa angiogeneza obejmuje wiele etapów, w tym migrację komórek śródbłonka, tworzenie naczyń, ich stabilizację oraz włączenie do istniejącego układu krążenia.

Dostępne wyniki dostarczają zatem dowodów mechanistycznych istotnych dla badań naczyniowych, ale nie potwierdzają korzyści klinicznych związanych z funkcjonowaniem naczyń.

Struktura i biochemia GHK-Cu

Strukturę molekularną GHK-Cu badano z wykorzystaniem różnych technik analitycznych i spektroskopowych.

Obejmowały one krystalografię rentgenowską, elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR), spektroskopię absorpcji promieniowania rentgenowskiego, protonowy rezonans magnetyczny oraz metody miareczkowania chemicznego [28–30].

Metody te pomogły scharakteryzować środowisko koordynacyjne miedzi w kompleksie peptydowym.

Koordynacja miedzi i geometria molekularna

GHK składa się z trzech aminokwasów ułożonych w sekwencji glicyna–histydyna–lizyna.

Reszta histydynowa ma szczególne znaczenie, ponieważ jej grupa imidazolowa może uczestniczyć w koordynacji jonów metali.

Badania strukturalne wskazują, że miedź(II) może tworzyć wiązania koordynacyjne z trzema atomami azotu pełniącymi funkcję donorów elektronów w cząsteczce peptydu.

Należą do nich atom azotu grupy aminowej glicyny, zdeprotonowany atom azotu amidowego związany z wiązaniem glicyna–histydyna oraz atom azotu pierścienia imidazolowego histydyny [28–30].

Czwarta pozycja koordynacyjna może być zajmowana przez inną grupę donorową, zależnie od środowiska chemicznego.

Układ ten często opisuje się jako geometrię kwadratowo-planarną lub zbliżoną do kwadratowo-planarnej.

Dokładna geometria może zależeć od pH, warunków rozpuszczalnika, obecności dodatkowych ligandów oraz badanej postaci kompleksu.

Koordynacja miedzi wpływa na właściwości chemiczne GHK-Cu i odróżnia ten kompleks od niezwiązanego peptydu GHK.

Zależność strukturalna między peptydem a miedzią ma znaczenie, ponieważ wiązanie metalu może zmieniać reaktywność cząsteczki i jej interakcje z innymi związkami biologicznymi.

Rysunek: struktura molekularna kompleksu GHK-Cu

Struktura molekularna GHK-Cu pokazuje, w jaki sposób peptyd glicyna–histydyna–lizyna dostarcza miejsc koordynacyjnych zawierających azot, umożliwiających wiązanie miedzi(II).

W badaniach strukturalnych i spektroskopowych zidentyfikowano azot grupy aminowej, azot amidowy wiązania peptydowego oraz azot pierścienia imidazolowego histydyny jako ważne elementy uczestniczące w wiązaniu miedzi.

Środowisko koordynacyjne pomaga wyjaśnić, dlaczego GHK jest badany jako peptyd wiążący miedź oraz model oddziaływań między metalami a peptydami.

Interakcje z albuminą i innymi cząsteczkami wiążącymi miedź

Przy fizjologicznym pH GHK-Cu może uczestniczyć w różnych równowagach koordynacyjnych z udziałem dodatkowych ligandów.

Lau i Sarkar badali interakcje między miedzią(II), GHK, cząsteczkami zawierającymi histydynę oraz albuminą surowicy [28–30].

Albumina surowicy jest białkiem występującym w dużych ilościach w osoczu. Uczestniczy w transporcie i wiązaniu wielu substancji, w tym wybranych jonów metali.

W literaturze opisano wysokie powinowactwo zarówno GHK, jak i albuminy do wiązania miedzi. W badanych warunkach podawano wartości około log₁₀ 16,44 dla GHK oraz log₁₀ 16,2 dla albuminy.

Wartości te sugerują, że GHK może uczestniczyć w konkurencyjnych interakcjach związanych z wiązaniem miedzi.

Jednak dystrybucja miedzi w płynach biologicznych zależy od czegoś więcej niż tylko siły wiązania dwóch wyizolowanych cząsteczek.

Na dostępność miedzi wpływają również stężenia poszczególnych substancji, konkurujące ligandy, interakcje białkowe oraz komórkowe systemy transportowe.

Zdolność GHK do wiązania miedzi stanowi więc podstawę badań nad przenoszeniem metalu i równowagami koordynacyjnymi.

Nie dowodzi jednak, że GHK-Cu bezpiecznie dostarcza miedź do wszystkich tkanek ani że zapobiega wszystkim reakcjom oksydacyjnym związanym z miedzią.

Enzymy zależne od miedzi i regulacja procesów redoks

Miedź jest niezbędna do aktywności wielu ważnych enzymów.

Oksydaza lizylowa uczestniczy w tworzeniu wiązań poprzecznych między cząsteczkami kolagenu i elastyny.

Dysmutaza ponadtlenkowa miedziowo-cynkowa, powszechnie określana jako SOD1, wspiera ochronę antyoksydacyjną poprzez katalizowanie przemiany rodników ponadtlenkowych w mniej reaktywne produkty.

Oksydaza cytochromu c uczestniczy w mitochondrialnym transporcie elektronów i wytwarzaniu energii komórkowej.

Ponieważ GHK wiąże miedź, naukowcy analizowali, czy GHK-Cu może wpływać na dostępność tego metalu i związane z nim procesy biochemiczne.

Obecność peptydu wiążącego miedź nie oznacza jednak, że metal jest bezpośrednio przekazywany do każdego enzymu zależnego od miedzi.

Komórki posiadają wyspecjalizowane transportery, białka wiążące oraz systemy regulujące wewnątrzkomórkową dystrybucję miedzi.

Mechanizmy te mają znaczenie, ponieważ wolna lub niewłaściwie regulowana miedź może uczestniczyć w reakcjach utleniania.

W określonych warunkach reakcje redoks związane z miedzią mogą przyczyniać się do powstawania reaktywnych form chemicznych.

Dlatego GHK-Cu badano pod kątem jego potencjalnego wpływu na reaktywność miedzi i procesy oksydacyjne [31, 32].

Zależność ta jest złożona pod względem chemicznym. Wiązanie miedzi może zmieniać reaktywność metalu, ale konsekwencje biologiczne zależą od całego środowiska chemicznego.

Wiązanie aldehydów i chemia antyoksydacyjna

GHK badano również pod kątem zdolności reagowania z wybranymi aldehydami powstającymi podczas peroksydacji lipidów.

Peroksydacja lipidów obejmuje reakcje utleniania wpływające na lipidy błon komórkowych i inne struktury zawierające lipidy.

W wyniku tych reakcji mogą powstawać reaktywne aldehydy, takie jak 4-hydroksynonenal i akroleina.

Oba związki są przedmiotem badań, ponieważ mogą oddziaływać z białkami i innymi cząsteczkami komórkowymi.

W badaniach chemicznych wykazano, że GHK może tworzyć produkty reakcji z tymi aldehydami, co sugeruje potencjalną zdolność ich wiązania w warunkach eksperymentalnych [31, 32].

Wyniki te dostarczają informacji o reaktywności chemicznej GHK.

Jednak zdolność reagowania z aldehydami w układzie laboratoryjnym nie dowodzi, że peptyd zapobiega uszkodzeniom oksydacyjnym tkanek u ludzi.

Stężenia reagentów, obecność konkurujących cząsteczek biologicznych oraz szybkość reakcji mają znaczenie przy ocenie potencjalnych konsekwencji biologicznych.

Adhezja komórek i interakcje z macierzą zewnątrzkomórkową

GHK-Cu badano również w kontekście przyczepiania się komórek oraz ich interakcji z materiałami zewnątrzkomórkowymi.

Adhezja komórkowa jest niezbędna do prawidłowej organizacji tkanek, ponieważ komórki muszą rozpoznawać otaczające je środowisko i z nim oddziaływać.

W badaniach obejmujących komórki osteoblastyczne oraz modele adhezji hepatocytów analizowano wpływ materiałów związanych z GHK na rozprzestrzenianie się komórek, ich przyczepność oraz fenotyp [33, 34].

Badania te mają znaczenie dla rozwoju biomateriałów, w których peptydy mogą być wbudowywane w powierzchnie inżynieryjne lub do nich przyłączane.

Obserwowane efekty zależą od rodzaju peptydu, składu materiału, typu komórek oraz warunków eksperymentalnych.

Dostarczają informacji o interakcjach między peptydami a powierzchniami oraz między komórkami a macierzą, a nie bezpośrednich dowodów regeneracji tkanek u ludzi.

Zastosowania GHK-Cu w badaniach naukowych

GHK-Cu badano w wielu obszarach badań molekularnych i przedklinicznych.

Obejmują one biologię stresu oksydacyjnego, sygnalizację zapalną, włóknienie, uszkodzenia płuc, odpowiedzi neuronalne, regulację naczyń krwionośnych, przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej oraz analizę ekspresji genów.

Poniższe sekcje przedstawiają najważniejsze wyniki eksperymentalne i ich ograniczenia.

Badania nad działaniem antyoksydacyjnym i procesami redoks

Enzymy antyoksydacyjne zależne od miedzi stanowią ważny element komórkowej ochrony przed stresem oksydacyjnym.

Jednym z przykładów jest SOD1, która do prawidłowego działania wymaga miedzi i cynku.

Badania dotyczące niedoboru miedzi wykazały, że jej niewystarczająca dostępność może wpływać na aktywność SOD1 i zwiększać wartości parametrów związanych ze stresem oksydacyjnym [35–38].

Wyniki te potwierdzają biologiczne znaczenie prawidłowej regulacji gospodarki miedziowej.

Jednak badań nad niedoborem miedzi lub przywracaniem jej podaży w diecie nie można automatycznie traktować jako dowodów identycznego działania GHK-Cu.

Rozróżnienie jest istotne, ponieważ zachowanie biologiczne konkretnego kompleksu miedzi zależy od jego struktury molekularnej, dystrybucji oraz interakcji ze szlakami regulującymi gospodarkę tym metalem.

W badaniach eksperymentalnych obejmujących biomateriały zawierające GHK i kompleksy tripeptydów miedziowych analizowano odpowiedzi antyoksydacyjne oraz parametry związane z tkankami.

Część badań dotyczyła tego, czy GHK-Cu wpływa na peroksydację lipidów związaną z ferrytyną.

Ferrytyna jest białkiem uczestniczącym w wewnątrzkomórkowym magazynowaniu żelaza.

Żelazo może brać udział w reakcjach utleniania, gdy występuje w reaktywnych postaciach.

W badaniach wykazano, że miedź skoordynowana z GHK może wpływać na peroksydację lipidów zależną od ferrytyny w określonych warunkach eksperymentalnych [39, 40].

Obserwacje te dostarczają informacji o interakcjach między kompleksami miedzi, procesami związanymi z żelazem oraz chemią reakcji oksydacyjnych.

Dodatkowe badania chemiczne analizowały reakcje GHK z produktami peroksydacji lipidów, takimi jak 4-hydroksynonenal i akroleina [41, 42].

Wyniki uzasadniają dalsze badania nad GHK jako cząsteczką zdolną do uczestniczenia w reakcjach chemicznych z aldehydami.

Jednak aktywność antyoksydacyjna wykazana w teście chemicznym lub modelu komórkowym nie dowodzi klinicznej ochrony przed uszkodzeniami oksydacyjnymi.

Sygnalizacja zapalna i regulacja cytokin

Stan zapalny obejmuje skoordynowane interakcje między komórkami odpornościowymi, białkami sygnałowymi oraz reakcjami tkankowymi.

W kilku badaniach laboratoryjnych analizowano wpływ GHK-Cu na szlaki zapalne.

W badaniach komórkowych wykorzystujących komórki makrofagopodobne RAW 264.7 oraz komórki nabłonka jelitowego Caco-2 odnotowano zmiany parametrów oksydacyjnych i zapalnych po ekspozycji na GHK-Cu.

Obejmowały one zmniejszenie wytwarzania reaktywnych form tlenu, zwiększenie wartości parametrów antyoksydacyjnych związanych z glutationem oraz zmiany mediatorów zapalnych, takich jak TNF-α i IL-6 [43–47].

Badacze analizowali również szlaki sygnałowe obejmujące jądrowy czynnik kappa B (NF-κB) oraz kinazę białkową aktywowaną mitogenami p38 (p38 MAPK).

NF-κB uczestniczy w regulacji genów związanych ze stanem zapalnym, odpornością, przeżyciem komórek i odpowiedzią na stres.

Szlak p38 MAPK bierze udział w reakcjach komórkowych związanych z mediatorami zapalnymi i stresem środowiskowym.

W badaniach eksperymentalnych powiązano GHK-Cu ze zmianami sygnalizacji NF-κB p65 oraz p38 MAPK.

Wyniki te sugerują, że związek może wpływać na szlaki uczestniczące w odpowiedzi zapalnej w warunkach laboratoryjnych.

Nie wszystkie badania cytowane w szerszej dyskusji oceniają jednak bezpośrednio GHK-Cu. Część publikacji przedstawia informacje ogólne dotyczące szlaków zapalnych lub innych związków eksperymentalnych.

Dlatego samo istnienie badań nad NF-κB lub p38 MAPK nie dowodzi, że GHK-Cu wywołuje określony kliniczny efekt przeciwzapalny.

Wyniki te są najbardziej przydatne do poznawania możliwych interakcji molekularnych oraz identyfikowania zagadnień wymagających dalszych eksperymentów.

Modele włóknienia, uszkodzeń płuc i neuroprotekcji

Włóknienie polega na nieprawidłowym gromadzeniu lub organizacji składników macierzy zewnątrzkomórkowej w tkankach.

Może rozwijać się w odpowiedzi na utrzymujące się uszkodzenia, stan zapalny lub zmienioną sygnalizację komórkową.

GHK badano w eksperymentalnych modelach włóknienia płuc ze względu na jego opisywany wpływ na aktywność fibroblastów i szlaki związane z TGF-β.

W mysim modelu włóknienia płuc wywołanego bleomycyną naukowcy odnotowali zmiany grubości tkanek, naciekania przez komórki zapalne oraz szlaków związanych z przejściem nabłonkowo-mezenchymalnym [48].

W badaniu analizowano sygnalizację TGF-β1/Smad, która uczestniczy w odpowiedziach komórkowych związanych z wytwarzaniem macierzy i włóknieniem.

Obserwacje te sugerują, że GHK może wpływać na wybrane szlaki związane z włóknieniem w eksperymentach na zwierzętach.

Jednak efekt uzyskany w chemicznie wywołanym mysim modelu choroby nie dowodzi skuteczności w leczeniu włóknienia płuc u ludzi.

Mechanizmy biologiczne, przebieg choroby i okoliczności kliniczne mogą się znacząco różnić.

W badaniach neurobiologicznych związanych z GHK analizowano również stres oksydacyjny, sygnalizację zapalną oraz możliwe interakcje ze szlakami regulacji genów.

Niektóre opracowania łączą te mechanizmy z deacetylazą histonową 2 (HDAC2), enzymem uczestniczącym w regulacji chromatyny i ekspresji genów.

Jednak cytowana literatura dotycząca zmian poznawczych u starzejących się myszy i mechanizmów związanych z HDAC obejmuje również badania, które nie potwierdzają bezpośrednio działania swoistego dla GHK-Cu [49].

Dlatego twierdzenia dotyczące poprawy funkcji poznawczych, zmniejszenia neurozapalenia lub bezpośredniej regulacji HDAC2 przez GHK-Cu wymagają wyraźnego oddzielenia od wyników badań nad innymi interwencjami eksperymentalnymi.

Dostępne dowody uzasadniają zainteresowanie badaniami mechanistycznymi, ale nie potwierdzają ustalonego działania neuroprotekcyjnego u ludzi.

Obserwacje w modelach angiogenezy i biologii naczyń

Angiogeneza jest niezbędnym procesem w rozwoju i naprawie tkanek.

Obejmuje powstawanie nowych naczyń krwionośnych i wymaga skoordynowanych interakcji między komórkami śródbłonka, czynnikami wzrostu, składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej i otaczającymi tkankami.

GHK-Cu badano w układach eksperymentalnych związanych z sygnalizacją naczyniową i przebudową tkanek.

W niektórych badaniach odnotowano zmiany czynników związanych z angiogenezą, w tym VEGF i bFGF [50, 51].

Białka te uczestniczą w aktywności komórek śródbłonka, rozwoju naczyń krwionośnych oraz odpowiedzi komórkowej na uszkodzenia.

Naukowcy analizowali również zależności między związkami związanymi z GHK a białkami strukturalnymi, takimi jak kolagen i elastyna.

Kolagen odpowiada za wytrzymałość tkanek, natomiast elastyna wspiera ich zdolność do rozciągania i powrotu do pierwotnego kształtu.

Oba białka mają znaczenie dla struktury naczyń krwionośnych i organizacji macierzy zewnątrzkomórkowej.

Zmiany ekspresji czynników wzrostu lub syntezy białek macierzy nie muszą jednak oznaczać poprawy przepływu krwi.

Funkcjonalna odbudowa naczyń obejmuje dodatkowe procesy, w tym tworzenie naczyń, ich dojrzewanie, integrację i regulację fizjologiczną.

W niektórych szerszych opracowaniach dotyczących regeneracji naczyń wspomina się również o działaniu przeciwzakrzepowym i rozszerzaniu naczyń.

Są to odrębne procesy fizjologiczne i nie należy zakładać, że wynikają bezpośrednio z ekspozycji na GHK-Cu bez odpowiednich dowodów dotyczących tego konkretnego związku.

Obecne wyniki pozostają więc istotne przede wszystkim dla eksperymentalnych badań nad angiogenezą i biologią naczyń.

Dowody z modeli neuronalnych i neurotroficznych

Rozwój i naprawa neuronów obejmują udział czynników wzrostu, interakcje z macierzą zewnątrzkomórkową, migrację komórek oraz wydłużanie wypustek neuronalnych.

Wzrost neurytów jest jednym z parametrów eksperymentalnych wykorzystywanych do badania różnicowania i rozwoju neuronów.

We wczesnych badaniach z wykorzystaniem hodowli tkanek nerwowych analizowano wpływ peptydów i pożywek kondycjonowanych na różnicowanie neuronów [52, 53].

Badania te przyczyniły się do szerszego zainteresowania krótkimi peptydami jako potencjalnymi regulatorami zachowania komórek.

Materiały związane z GHK analizowano również w eksperymentalnych układach regeneracji nerwów.

W jednym z badań wprowadzono peptyd wspierający adhezję komórek do kolagenowych przewodów stosowanych do łączenia przerwanych odcinków nerwów [54].

Naukowcy odnotowali zmiany czynników wzrostu i mediatorów zapalnych, w tym czynnika wzrostu nerwów (NGF) oraz neurotrofin NT-3 i NT-4.

Dodatkowe obserwacje obejmowały parametry aksonów i reakcje komórek Schwanna.

Komórki Schwanna są ważnym elementem obwodowego układu nerwowego. Wspierają aksony i uczestniczą w odpowiedzi na uszkodzenia nerwów obwodowych.

Jednak wyników uzyskanych z wykorzystaniem kolagenowych przewodów zawierających peptydy nie należy automatycznie przypisywać swobodnie krążącemu GHK-Cu.

Na obserwowane efekty mogą wpływać biomateriał, lokalne środowisko, sposób prezentacji peptydu oraz zastosowany model eksperymentalny.

Podobnie zwiększenie ekspresji czynników wzrostu lub liczby aksonów w układzie eksperymentalnym nie dowodzi funkcjonalnej regeneracji neurologicznej u ludzi.

Badania te najlepiej interpretować jako analizy biomateriałów zawierających peptydy oraz sygnalizacji neurotroficznej.

Regulacja genów i przebudowa macierzy

Badania ekspresji genów stały się ważnym elementem naukowej dyskusji dotyczącej GHK i GHK-Cu.

Wczesne eksperymenty koncentrowały się na odpowiedziach komórkowych związanych z ranami, w tym zachowaniu fibroblastów, produkcji kolagenu i organizacji macierzy zewnątrzkomórkowej [55, 56].

Późniejsze badania Maquarta i współpracowników analizowały wpływ GHK-Cu na syntezę kolagenu oraz cząsteczki związane z macierzą [57–59].

W eksperymentach wykorzystujących hodowle fibroblastów odnotowano zmiany produkcji kolagenu przy niskich stężeniach.

W innych badaniach analizowano siarczanowane glikozaminoglikany i małe proteoglikany.

Cząsteczki te uczestniczą w organizacji macierzy zewnątrzkomórkowej, utrzymywaniu nawodnienia, kształtowaniu właściwości mechanicznych oraz interakcjach między komórkami a otaczającymi tkankami.

GHK-Cu powiązano również ze zmianami ekspresji metaloproteinaz macierzy, w tym MMP-2 [59].

Ma to znaczenie, ponieważ utrzymanie macierzy zewnątrzkomórkowej wymaga zarówno kontrolowanej degradacji, jak i syntezy.

Samo zwiększenie produkcji kolagenu nie dowodzi poprawy organizacji tkanek.

Podobnie zwiększona aktywność MMP może prowadzić do różnych następstw zależnie od rodzaju tkanki i kontekstu biologicznego.

Badania sugerują więc, że GHK-Cu może wpływać na przemiany macierzy poprzez kilka współdziałających szlaków.

Obserwacje te nie dowodzą jednak gojenia bez powstawania blizn ani przewidywalnej regeneracji tkanek u ludzi.

W dodatkowych eksperymentach odnotowano zmiany dotyczące takich cząsteczek jak dekoryna, siarczan dermatanu i siarczan chondroityny [60].

Dekoryna jest małym proteoglikanem związanym z organizacją kolagenu i regulacją macierzy zewnątrzkomórkowej.

Siarczan dermatanu i siarczan chondroityny należą do glikozaminoglikanów wpływających na strukturę i właściwości tkanek łącznych.

Zmiany ich ekspresji lub syntezy dostarczają informacji o metabolizmie macierzy.

Nie dowodzą jednak samodzielnie poprawy wytrzymałości tkanek, ich wyglądu ani klinicznych wyników gojenia.

Ekspresja integryn i badania komórek naskórka

Keratynocyty są dominującym typem komórek naskórka.

Uczestniczą w tworzeniu bariery skórnej, różnicowaniu komórkowym oraz odpowiedzi na uszkodzenia tkanek.

Naukowcy z Seoul National University badali wpływ peptydu miedziowego GHK na ekspresję integryn oraz obecność komórek wykazujących dodatnią ekspresję p63 w keratynocytach [61].

Integryny uczestniczą w przyczepianiu się komórek i komunikacji z macierzą zewnątrzkomórkową.

Białko p63 jest związane z rozwojem nabłonka i utrzymaniem określonych populacji komórek nabłonkowych.

W badaniu odnotowano zwiększoną ekspresję integryn i większy odsetek komórek dodatnich pod względem p63 po ekspozycji na peptyd miedziowy GHK.

Obserwacje te sugerują możliwy wpływ na cechy komórkowe związane z utrzymaniem naskórka.

Jednak zmiany tych markerów nie dowodzą samodzielnie zwiększonej regeneracji skóry u ludzi.

Wyniki pozostają ograniczone do zastosowanych modeli komórkowych i analizowanych parametrów.

Wielkoskalowe profilowanie ekspresji genów

Metody komputerowe zwiększyły możliwości analizowania wpływu różnych związków na sieci ekspresji genów.

Connectivity Map, często określany skrótem cMap, jest zasobem badawczym wykorzystywanym do porównywania wzorców ekspresji genów związanych ze stanami biologicznymi i ekspozycją na substancje chemiczne.

Powiązane podejścia komputerowe, w tym MANTRA, wykorzystywano do badania zależności między związkami a odpowiedziami transkrypcyjnymi [62, 63].

GHK omawiano w tym kontekście ze względu na jego powiązania z rozległymi zmianami wzorców ekspresji genów.

W jednej z analiz odnotowano 268 genów o zwiększonej ekspresji oraz 167 genów o zmniejszonej ekspresji.

W innych opracowaniach GHK powiązano ze zmianami obejmującymi większą liczbę genów i szlaków [9, 62–64].

Wyniki te sugerują, że odpowiedzi związane z GHK mogą obejmować wiele układów biologicznych, a nie pojedynczy cel molekularny.

Jednak zbiory danych dotyczących ekspresji genów wymagają ostrożnej interpretacji.

Zmiana ilości informacyjnego RNA (mRNA) nie musi prowadzić do odpowiadającej jej zmiany stężenia białka lub funkcji biologicznej.

Wzorce ekspresji genów zależą również od typu komórek, warunków ekspozycji, metod pomiarowych oraz progów analitycznych.

Dlatego liczby genów powiązanych z danym związkiem nie należy traktować jako bezpośredniej miary jego siły działania terapeutycznego.

Prognozy komputerowe są wartościowe przy formułowaniu hipotez, ale wymagają potwierdzenia eksperymentalnego.

Sieci genowe związane z neuroprotekcją

Analizy ekspresji genów omawiane w literaturze dotyczącej GHK zidentyfikowały zmiany obejmujące geny związane z funkcjonowaniem neuronów, przeżyciem komórek i sygnalizacją rozwojową.

Przykłady obejmują SIGMAR1, EPM2A, NAIP, FGFR2 i SLIT2 [65].

Geny te uczestniczą w różnych procesach biologicznych.

SIGMAR1 koduje receptor sigma-1, białko zaangażowane w sygnalizację komórkową i procesy związane ze stresem.

EPM2A jest związany z laforiną, białkiem istotnym dla metabolizmu glikogenu.

NAIP uczestniczy w szlakach związanych z przeżyciem komórek i odpowiedzią immunologiczną.

FGFR2 koduje receptor uczestniczący w sygnalizacji czynnika wzrostu fibroblastów.

SLIT2 bierze udział w procesach rozwojowych związanych z kierunkowaniem i migracją komórek.

Udział tych genów w biologii układu nerwowego wzbudził zainteresowanie ich możliwym związkiem z odpowiedziami transkrypcyjnymi wywoływanymi przez GHK.

Jednak obecność genu w zbiorze danych związanym z GHK nie dowodzi, że GHK bezpośrednio kontroluje ten gen w każdym środowisku biologicznym.

Nie dowodzi również, że GHK zapobiega demencji lub prowadzi do poprawy funkcji neurologicznych.

Cytowane badania dotyczące części tych genów dostarczają szerszego kontekstu biologicznego, a nie bezpośrednich dowodów działania GHK-Cu.

Dlatego wyniki te należy rozumieć jako obserwacje służące formułowaniu hipotez dotyczących regulacji genów i neurobiologii.

Wyniki badań epigenetycznych i szlaków związanych z HDAC

Regulacja epigenetyczna obejmuje zmiany aktywności genów, które nie wymagają modyfikacji podstawowej sekwencji DNA.

Jednym z ważnych mechanizmów jest modyfikacja histonów.

Histony są białkami, wokół których zorganizowane jest DNA. Ich modyfikacje chemiczne mogą wpływać na dostępność określonych regionów DNA dla aparatu transkrypcyjnego.

Deacetylazy histonowe (HDAC) usuwają grupy acetylowe z histonów i innych substratów białkowych.

Ich aktywność może wpływać na strukturę chromatyny i ekspresję genów.

GHK omawiano w kontekście szlaków związanych z HDAC ze względu na szersze obserwacje dotyczące regulacji genów i zmian transkrypcyjnych związanych z wiekiem [66, 67].

Jednak cytowane badania nad HDAC i starzeniem epigenetycznym dostarczają przede wszystkim ogólnych informacji o tych procesach biologicznych.

Nie dowodzą same w sobie, że GHK-Cu jest klinicznie potwierdzonym inhibitorem HDAC.

Podobnie zmian wzorców ekspresji genów nie należy automatycznie opisywać jako odwrócenia starzenia epigenetycznego.

Bezpośrednie twierdzenie o hamowaniu HDAC wymaga eksperymentów wykazujących wpływ na aktywność tych enzymów w określonych warunkach.

Twierdzenia dotyczące odwracania starzenia wymagają dodatkowych dowodów łączących pomiary molekularne z istotnymi wynikami biologicznymi.

Zależności między GHK, regulacją chromatyny i ekspresją genów związaną ze starzeniem pozostają więc obszarem dalszych badań mechanistycznych.

Jakość i badanie materiałów GHK-Cu przeznaczonych do badań naukowych

Charakterystyka analityczna GHK-Cu jest ważna, ponieważ wyniki badań zależą od tożsamości, składu i jakości analizowanego materiału.

Preparat określany jako GHK-Cu powinien być oceniany metodami umożliwiającymi scharakteryzowanie składnika peptydowego oraz dostarczenie dowodów dotyczących jego postaci związanej z miedzią.

Badanie jakości może obejmować chromatografię, spektrometrię mas, analizę zawartości metali oraz dodatkowe techniki dobrane do konkretnego celu analitycznego.

Żaden pojedynczy rutynowy test nie potwierdza jednak wszystkich istotnych parametrów jakościowych.

Chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas

Chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (LC-MS) łączy rozdział chromatograficzny z detekcją opartą na pomiarze masy jonów.

Część chromatograficzna umożliwia rozdzielanie związków obecnych w próbce.

Spektrometr mas dostarcza informacji o jonach na podstawie ich stosunku masy do ładunku.

LC-MS może wspierać identyfikację peptydu poprzez wykrywanie jonów molekularnych zgodnych z oczekiwanym związkiem.

W zależności od zastosowanej metody dodatkowe informacje o fragmentacji mogą pomagać w charakteryzowaniu sekwencji peptydowej.

Jednak zaobserwowanie masy molekularnej zgodnej z GHK nie potwierdza samodzielnie wszystkich aspektów struktury cząsteczki.

Podobnie wykrycie sygnałów zgodnych z obecnością formy związanej z miedzią nie musi dowodzić pełnej geometrii koordynacyjnej ani wykluczać wszystkich alternatywnych kompleksów.

Charakterystyka wiązania miedzi może wymagać dodatkowych badań z wykorzystaniem odpowiednich metod spektroskopowych lub analizy zawartości metalu.

LC-MS jest zatem wartościowym narzędziem analitycznym, ale wiarygodność uzyskanych wniosków zależy od metody, wzorców odniesienia, przygotowania próbki oraz dowodów uzupełniających.

Wysokosprawna chromatografia cieczowa i czystość

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest powszechnie stosowana do rozdzielania składników preparatów peptydowych.

Może pomagać w identyfikowaniu zanieczyszczeń związanych z syntezą, degradacją lub innymi procesami produkcyjnymi.

Wynik czystości chromatograficznej opiera się zwykle na względnych sygnałach wykrywanych w określonych warunkach analitycznych.

Jednak czystość chromatograficzna nie jest tym samym co tożsamość chemiczna, zawartość peptydu, stechiometria kompleksu miedziowego czy ogólna jakość materiału.

Na przykład deklarowana czystość na poziomie 98% nie musi oznaczać, że 98% całkowitej masy próbki stanowi prawidłowo utworzony kompleks GHK-Cu.

Interpretacja zależy od zastosowanej metody analitycznej oraz sposobu obliczenia wyniku.

Chromatogram nie potwierdza również sterylności, zawartości endotoksyn ani braku wszystkich możliwych zanieczyszczeń.

Materiał źródłowy opisuje deklarowaną specyfikację czystości wynoszącą co najmniej 98% dla określonych preparatów badawczych.

Taką specyfikację należy traktować jako deklarację dostawcy, chyba że jest poparta dostępną dokumentacją analityczną dotyczącą konkretnej partii.

Filtracja, sterylność i kontrola zanieczyszczeń cząstkami stałymi

Materiał źródłowy opisuje filtrację przez membrany o wielkości porów 0,22 mikrometra jako element procesu przygotowania materiału.

Filtracja membranowa może być wykorzystywana do ograniczania określonych zanieczyszczeń mikrobiologicznych, jeśli zastosowana metoda i warunki są odpowiednie.

Jednak przepuszczenie roztworu przez filtr o porach 0,22 mikrometra nie potwierdza samodzielnie sterylności produktu końcowego.

Zapewnienie sterylności zależy od całego procesu, w tym sprzętu, środowiska, integralności filtra, sposobu postępowania z materiałem oraz zwalidowanych procedur kontrolnych.

Filtracja nie musi również usuwać endotoksyn, rozpuszczonych zanieczyszczeń chemicznych ani wszystkich rodzajów zanieczyszczeń cząstkami stałymi.

Dlatego twierdzenia dotyczące sterylności lub przydatności do określonego zastosowania badawczego wymagają odpowiednich testów i dokumentacji, a nie opierania się wyłącznie na wielkości porów filtra.

Dobra Praktyka Laboratoryjna i dokumentacja

Dobra Praktyka Laboratoryjna (GLP) jest systemem jakości związanym z organizacją, prowadzeniem, monitorowaniem, dokumentowaniem i raportowaniem określonych badań nieklinicznych.

Stwierdzenie, że procedury są zgodne z zasadami GLP, nie musi oznaczać formalnej zgodności z wymaganiami GLP ani posiadania odpowiedniego certyfikatu.

Znaczenie takiej deklaracji zależy od konkretnych procedur, dokumentacji i zastosowanego systemu jakości.

Materiałom badawczym może również towarzyszyć certyfikat analizy (Certificate of Analysis, COA).

COA zwykle zawiera wybrane wyniki analiz dotyczących konkretnej partii.

Istotne informacje mogą obejmować badania tożsamości, pomiary czystości, oznaczenie zawartości substancji, zastosowane metody analityczne, identyfikatory partii oraz inne parametry specyfikacji.

Jednak wartość informacyjna COA zależy od metod i danych stanowiących podstawę jego wystawienia.

Sam certyfikat nie dowodzi, że materiał nadaje się do podawania ludziom, stosowania kosmetycznego lub terapeutycznego.

Podobnie czystość analityczna nie potwierdza skuteczności biologicznej ani bezpieczeństwa klinicznego.

W badaniach naukowych najbardziej przydatna dokumentacja jakościowa powinna być szczegółowa, identyfikowalna i wystarczająco kompletna, aby umożliwiać właściwą interpretację wyników analitycznych.

Więcej informacji o rozróżnianiu producentów, dostawców, deklaracji jakościowych i dokumentacji partii znajduje się w artykule Producenci i dostawcy peptydów.

Podsumowanie

GHK-Cu jest naturalnie występującym kompleksem tripeptydu z miedzią, badanym od ponad pięciu dekad.

Jego struktura molekularna, właściwości wiązania miedzi oraz interakcje z układami komórkowymi sprawiły, że stał się ważnym przedmiotem badań nad biochemią peptydów, biologią macierzy zewnątrzkomórkowej, stresem oksydacyjnym i regulacją genów.

Kompleks powstaje z glicylo-L-histydylo-L-lizyny i miedzi(II). Badania strukturalne pozwoliły zidentyfikować miejsca koordynacyjne zawierające azot, które uczestniczą w wiązaniu miedzi i wpływają na właściwości chemiczne cząsteczki.

Cechy te stanowią podstawę do analizowania oddziaływań krótkich peptydów z jonami metali oraz wpływu chemii koordynacyjnej na procesy biologiczne.

W badaniach eksperymentalnych odnotowano zmiany syntezy kolagenu, produkcji glikozaminoglikanów, ekspresji metaloproteinaz macierzy, sygnalizacji integryn, mediatorów zapalnych oraz parametrów związanych z ochroną antyoksydacyjną.

Dodatkowe badania obejmowały odpowiedzi związane z GHK w hodowlach fibroblastów, modelach ran, eksperymentach dotyczących uszkodzeń płuc, układach neuronalnych oraz biomateriałach zawierających peptydy.

Analizy komputerowe powiązały również GHK z rozległymi zmianami sieci ekspresji genów.

Znaczenie naukowe tych obserwacji zależy jednak od kontekstu eksperymentalnego.

Zmiany ekspresji genów nie muszą prowadzić do zmian aktywności białek.

Zwiększona produkcja kolagenu nie musi oznaczać poprawy struktury tkanek.

Zmiany markerów zapalnych nie stanowią samodzielnego dowodu klinicznego działania przeciwzapalnego.

Podobnie wyniki badań obejmujących linie komórek nowotworowych, modele włóknienia płuc czy hodowle neuronów nie dowodzą skuteczności wobec odpowiadających im chorób u ludzi.

W literaturze istnieją również istotne różnice między GHK a GHK-Cu oraz między eksperymentami bezpośrednio dotyczącymi danego związku a badaniami dostarczającymi jedynie ogólnego kontekstu biologicznego.

Rozróżnienia te należy zachować podczas interpretacji mechanizmów działania i proponowanych zastosowań.

Kolejną ważną kwestią jest jakość analityczna. Techniki takie jak LC-MS i HPLC mogą dostarczać wartościowych informacji o tożsamości i czystości, ale nie potwierdzają samodzielnie wszystkich właściwości strukturalnych, mikrobiologicznych i biologicznych preparatu.

Ogólnie rzecz biorąc, GHK-Cu pozostaje użytecznym narzędziem badań molekularnych nad koordynacją miedzi, sygnalizacją komórkową, metabolizmem macierzy zewnątrzkomórkowej oraz odpowiedzią na stres oksydacyjny.

Jego poznane właściwości chemiczne i rozbudowana literatura przedkliniczna stanowią podstawę dalszych badań naukowych. Natomiast twierdzenia dotyczące skuteczności klinicznej i bezpieczeństwa wymagają odrębnych, odpowiednio kontrolowanych badań z udziałem ludzi.

Zastrzeżenie

Niniejszy artykuł ma wyłącznie charakter edukacyjny i naukowo-informacyjny. Przedstawia badania dotyczące struktury molekularnej GHK-Cu, koordynacji miedzi, mechanizmów biologicznych, charakterystyki analitycznej oraz zastosowań eksperymentalnych.

Nie stanowi porady medycznej, nie rekomenduje stosowania GHK-Cu u ludzi ani zwierząt, nie określa schematów leczenia oraz nie popiera żadnego zastosowania diagnostycznego, terapeutycznego ani kosmetycznego.

Wyników uzyskanych w hodowlach komórkowych, eksperymentach na zwierzętach, analizach komputerowych i badaniach biochemicznych nie należy interpretować jako dowodu skuteczności klinicznej lub bezpieczeństwa u ludzi.

Informacje dotyczące czystości analitycznej, materiałów klasy badawczej, certyfikatów analizy lub badań laboratoryjnych nie dowodzą, że dany preparat nadaje się do podawania ludziom lub jakiegokolwiek innego zastosowania regulowanego przepisami.

Wszelkie decyzje medyczne powinny być podejmowane przez odpowiednio wykwalifikowanych pracowników ochrony zdrowia na podstawie właściwych dowodów klinicznych i obowiązujących przepisów.

References

1. Pickart L. A Tripeptide from Human Serum Which Enhances the Growth of Neoplastic Hepatocytes and the Survival of Normal Hepatocytes. San Francisco, Calif, USA: University of California; 1973.
2. Pickart L., Freedman J. H., Loker W. J., et al. Growth-modulating plasma tripeptide may function by facilitating copper uptake into cells. Nature. 1980;288(5792):715–717. doi: 10.1038/288715a0.
3. Pickart L. Use of GHL-Cu as a wound-healing and anti-inflammatory agent. 1988, http://www.freepatentsonline.com/4760051.html.
4. Downey D., Larrabee W. F., Jr., Voci V., Pickart L. Acceleration of wound healing using glycyl-histidyl-lysine copper (II) Surgical Forum. 1985;25:573–575.
5. Pickart L. Iamin: a human growth factor with multiple wound-healing properties. In: Sorenson J., editor. Biology of Copper Complexes. Clifton, NJ, USA: Humana Press; 1987. pp. 273–285.
6. Meiners S., Eickelberg O. Next-generation personalized drug discovery: the tripeptide GHK hits center stage in chronic obstructive pulmonary disease. Genome Medicine. 2012;4(8, article 70) doi: 10.1186/gm371.
7. Hong Y., Downey T., Eu K. W., Koh P. K., Cheah P. Y. A ‘metastasis-prone’ signature for early-stage mismatch-repair proficient sporadic colorectal cancer patients and its implications for possible therapeutics. Clinical and Experimental Metastasis. 2010;27(2):83–90. doi: 10.1007/s10585-010-9305-4.
8. Gruchlik A., Jurzak M., Chodurek E. W. A., Dzierzewicz Z. Effect of Gly-Gly-His, Gly-His-Lys and their copper complexes on TNF-α-dependent IL-6 secretion in normal human dermal fibroblasts. Acta Poloniae Pharmaceutica. 2012;69(6):1303–1306.
9. Pickart L., Vasquez-Soltero J. M., Margolina A. GHK and DNA: resetting the human genome to health. BioMed Research International. 2014;2014:10. doi: 10.1155/2014/151479.151479
10. Wegrowski Y., Maquart F. X., Borel J. P. Stimulation of sulfated glycosaminoglycan synthesis by the tripeptide-copper complex Glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+ . Life Sciences. 1992;51(13):1049–1056. doi: 10.1016/0024-3205(92)90504-i.
11. Siméon A., Emonard H., Hornebeck W., Maquart F.-X. The tripeptide-copper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+ stimulates matrix metalloproteinase-2 expression by fibroblast cultures. Life Sciences. 2000;67(18):2257–2265. doi: 10.1016/s0024-3205(00)00803-1.
12. Ehrlich H. Stimulation of skin healing in immunosuppressed rats. Proceedings of the Symposium on Collagen and Skin Repair; September 1991; Reims, France.
13. Siméon A., Wegrowski Y., Bontemps Y., Maquart F.-X. Expression of glycosaminoglycans and small proteoglycans in wounds: modulation by the tripeptide-copper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+ . Journal of Investigative Dermatology. 2000;115(6):962–968. doi: 10.1046/j.1523-1747.2000.00166.x.
14. McCormack M. C., Nowak K. C., Koch R. J. The effect of copper tripeptide and tretinoin on growth factor production in a serum-free fibroblast model. Archives of Facial Plastic Surgery. 2001;3(1):28–32.
15. Buffoni F., Pino R., Dal Pozzo A. Effect of tripeptide-copper complexes on the process of skin wound healing and on cultured fibroblasts. Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Therapie. 1995;330(3):345–360.
16. Gul N. Y., Topal A., Cangul I. T., Yanik K. The effects of topical tripeptide copper complex and helium-neon laser on wound healing in rabbits. Veterinary Dermatology. 2008;19(1):7–14. doi: 10.1111/j.1365-3164.2007.00647.x.
17. Cangul I. T., Gul N. Y., Topal A., Yilmaz R. Evaluation of the effects of topical tripeptide-copper complex and zinc oxide on open-wound healing in rabbits. Veterinary Dermatology. 2006;17(6):417–423. doi: 10.1111/j.1365-3164.2006.00551.x.
18. Pickart L. Method of using copper(II) containing compounds to accelerate wound healing. 1992, http://www.freepatentsonline.com/5164367.html.
19. Arul V., Kartha R., Jayakumar R. A therapeutic approach for diabetic wound healing using biotinylated GHK incorporated collagen matrices. Life Sciences. 2007;80(4):275–284. doi: 10.1016/j.lfs.2006.09.018.
20. Canapp S. O., Jr., Farese J. P., Schultz G. S., et al. The effect of topical tripeptide-copper complex on healing of ischemic open wounds. Veterinary Surgery. 2003;32(6):515–523. doi: 10.1111/j.1532-950X.2003.00515.x.
21. Swaim S. F., Vaughn D. M., Kincaid S. A., et al. Effect of locally injected medications on healing of pad wounds in dogs. American Journal of Veterinary Research. 1996;57(3):394–399.
22. Campbell J. D., McDonough J. E., Zeskind J. E., et al. A gene expression signature of emphysema-related lung destruction and its reversal by the tripeptide GHK. Genome Medicine. 2012;4, article 67 doi: 10.1186/gm367.
23. Boo S., Dagnino L. Integrins as modulators of transforming growth factor beta signaling in dermal fibroblasts during skin regeneration after injury. Advances in Wound Care. 2013;2(5):238–246. doi: 10.1089/wound.2012.0394.
24. Lubick K., Radke M., Jutila M. Securinine, a GABAA receptor antagonist, enhances macrophage clearance of phase II C. burnetii: comparison with TLR agonists. Journal of Leukocyte Biology. 2007;82(5):1062–1069. doi: 10.1189/jlb.0407255.
25. Matalka L. E., Ford A., Unlap M. T. The tripeptide, GHK, induces programmed cell death in SH-SY5Y neuroblastoma cells. Journal of Biotechnology & Biomaterials. 2012;2, article 144 doi: 10.4172/2155-952X.1000144.
26. Pollard J. D., Quan S., Kang T., Koch R. J. Effects of copper tripeptide on the growth and expression of growth factors by normal and irradiated fibroblasts. Archives of Facial Plastic Surgery. 2005;7(1):27–31. doi: 10.1001/archfaci.7.1.27.
27. Jose S., Hughbanks M. L., Binder B. Y. K., Ingavle G. C., Leach J. K. Enhanced trophic factor secretion by mesenchymal stem/stromal cells with Glycine-Histidine-Lysine (GHK)-modified alginate hydrogels. Acta Biomaterialia. 2014;10(5):1955–1964. doi: 10.1016/j.actbio.2014.01.020.
28. Lau S. J., Sarkar B. The interaction of copper(II) and glycyl-L-histidyl-L-lysine, a growth-modulating tripeptide from plasma. Biochemical Journal. 1981;199(3):649–656. doi: 10.1042/bj1990649.
29. Perkins C. M., Rose N. J., Weinstein B., Stenkamp R. E., Jensen L. H., Pickart L. The structure of a copper complex of the growth factor glycyl-L-histidyl-L-lysine at 1.1 Å resolution. Inorganica Chimica Acta. 1984;82(1):93–99. doi: 10.1016/s0020-1693(00)82544-x.
30. Freedman J. H., Pickart L., Weinstein B., Mims W. B., Peisach J. Structure of the glycyl-L-histidyl-L-lysine-copper(II) complex in solution. Biochemistry. 1982;21(19):4540–4544. doi: 10.1021/bi00262a004.
31. Pickart L., Lovejoy S. Biological activity of human plasma copper-binding growth factor glycyl-l-histidyl-l-lysine. Methods in Enzymology. 1987;147:314–328. doi: 10.1016/0076-6879(87)47121-8.
32. Beretta G., Arlandini E., Artali R., Anton J. M. G., Maffei Facino R. Acrolein sequestering ability of the endogenous tripeptide glycyl-histidyl-lysine (GHK): characterization of conjugation products by ESI-MSn and theoretical calculations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2008;47(3):596–602. doi: 10.1016/j.jpba.2008.02.012.
33. Godet D., Marie P. J. Effects of the tripeptide glycyl-L-histidyl-L-lysine copper complex on osteoblastic cell spreading, attachment and phenotype. Cellular and Molecular Biology (Noisy-le-Grand, France) 1995;41(8):1081–1091.
34. Kawase M., Miura N., Kurikawa N., et al. Immobilization of tripepride growth factor glycyl-L-histidyl-L-lysine on poly(vinylalcohol)-quarternized stilbazole (PVA-SbQ) and its use as a ligand for hepatocyte attachment. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 1999;22(9):999–1001. doi: 10.1248/bpb.22.999.
35. Lutsenko S, Bhattacharjee A, Hubbard AL. Copper handling machinery of the brain. Metallomics. 2010;2(9):596–608. doi: 10.1039/c0mt00006j.
36. Hawk SN, Lanoue L, Keen CL, Kwik-Uribe CL, Rucker RB, Uriu-Adams JY. Copper-deficient rat embryos are characterized by low superoxide dismutase activity and elevated superoxide anions. Biology of Reproduction. 2003;68(3):896–903. doi: 10.1095/biolreprod.102.009167.
37. Bayer TA, Schäfer S, Simons A, et al. Dietary Cu stabilizes brain superoxide dismutase 1 activity and reduces amyloid Aβ production in APP23 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003;100(24):14187–14192. doi: 10.1073/pnas.2332818100.
38. Arul V, Gopinath D, Gomathi K, Jayakumar R. GHK peptide incorporated collagenous matrix: a novel biomaterial for dermal wound healing in rats. Journal of Biomedical Materials Research. 2005;73(2):383–391. doi: 10.1002/jbm.b.30246.
39. Miller DM, DeSilva D, Pickart L, Aust SD. Effects of glycyl-histidyl-lysyl chelated Cu(II) on ferritin dependent lipid peroxidation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1990;264:79–84. doi: 10.1007/978-1-4684-5730-8_11.
40. Alberghina M, Lupo G, La Spina G, et al. Cytoprotective effect of copper(II) complexes against ethanol-induced damage to rat gastric mucosa. Journal of Inorganic Biochemistry. 1992;45(4):245–259. doi: 10.1016/0162-0134(92)84013-d.
41. Beretta G, Artali R, Regazzoni L, Panigati M, Facino RM. Glycyl-histidyl-lysine (GHK) is a quencher of α,β-4-hydroxy-trans-2-nonenal: a comparison with carnosine. Insights into the mechanism of reaction by electrospray ionization mass spectrometry, 1H NMR, and computational techniques. Chemical Research in Toxicology. 2007;20(9):1309–1314. doi: 10.1021/tx700185s.
42. Beretta G, Arlandini E, Artali R, Anton JM, Maffei Facino R. Acrolein sequestering ability of the endogenous tripeptide glycyl-histidyl-lysine (GHK): characterization of conjugation products by ESI-MSn and theoretical calculations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2008;47(3):596–602. doi: 10.1016/j.jpba.2008.02.012.
43. Park JR, Lee H, Kim SI, et al. The tri-peptide GHK-Cu complex ameliorates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. Oncotarget, 2016, 7(36): 58405.
44. Gao M, Chen L, Yu H, et al. Diosgenin down-regulates NF-κB p65/p50 and p38MAPK pathways and attenuates acute lung injury induced by lipopolysaccharide in mice. International immunopharmacology, 2013, 15(2): 240–245.
45. Liu T, Zhang L, Joo D, et al. NF-κB signaling in inflammation. Signal transduction and targeted therapy, 2017, 2(1): 1–9.
46. Kaminska B MAPK signalling pathways as molecular targets for anti-inflammatory therapy—from molecular mechanisms to therapeutic benefits. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 2005, 1754(1–2): 253–262.
47. Yong HY, Koh MS, Moon A. The p38 MAPK inhibitors for the treatment of inflammatory diseases and cancer. Expert opinion on investigational drugs, 2009, 18(12): 1893–1905.
48. Zhou XM, Wang GL, Wang XB, et al. GHK peptide inhibits bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice by suppressing TGFβ1/Smad-mediated epithelial-to-mesenchymal transition. Frontiers in Pharmacology, 2017, 8: 904.
49. Mukherjee K, Lee A, Zhu L, et al. Sleep-deprived cognitive impairment in aging mice is alleviated by rapamycin. Aging Pathobiology and Therapeutics, 2019, 1(1): 05–09.
50. Kalaria RN. Vascular basis for brain degeneration: Faltering controls and risk factors for dementia. Nutrition Reviews. 2010;68(supplement 2):S74–S87. doi: 10.1111/j.1753-4887.2010.00352.x.
51. Pollard JD, Quan S, Kang T, Koch RJ. Effects of copper tripeptide on the growth and expression of growth factors by normal and irradiated fibroblasts. Archives of Facial Plastic Surgery. 2005;7(1):27–31. doi: 10.1001/archfaci.7.1.27.
52. Sensenbrenner M, Jaros GG, Moonen G, Meyer BJ. Effect of conditioned media on nerve cell differentiation. Experientia. 1980;36(6):660–662. doi: 10.1007/BF01970123.
53. Lindner G, Grosse G, Halle W, Henklein P. The effect of a synthetic tripeptide nervous tissue cultured in vitro. Zeitschrift für Mikroskopisch-Anatomische Forschung. 1979;93(5):820–828. (Ger).
54. Ahmed MR, Basha SH, Gopinath D, Muthusamy R, Jayakumar R. Initial upregulation of growth factors and inflammatory mediators during nerve regeneration in the presence of cell adhesive peptide-incorporated collagen tubes. Journal of the Peripheral Nervous System. 2005;10(1):17–30. doi: 10.1111/j.1085-9489.2005.10105.x.
55. Pickart L. Use of GHL-Cu as a wound-healing and anti-inflammatory agent. United States Patent 4,760,051, July 1988.
56. Downey D, Larrabee WF, Voci V, Pickart L. Acceleration of wound healing using glycyl-histidyl-lysyl Cu(II) Surgical Forum. 1985;36:573–575.
57. Maquart FX, Pickart L, Laurent M, Gillery P, Monboisse JC, Borel JP. Stimulation of collagen synthesis in fibroblast cultures by the tripeptide-copper complex glycl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+ . FEBS Letters. 1988;238(2):343–346. doi: 10.1016/0014-5793(88)80509-x.
58. Wegrowski Y, Maquart FX, Borel JP. Stimulation of sulfated glycosaminoglycan synthesis by the tripeptide-copper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+ . Life Sciences. 1992;51(13):1049–1056. doi: 10.1016/0024-3205(92)90504-i.
59. Siméon A, Emonard H, Hornebeck W, Maquart FX. The tripeptide-copper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+ stimulates matrix metalloproteinase-2 expression by fibroblast cultures. Life Sciences. 2000;67(18):2257–2265. doi: 10.1016/s0024-3205(00)00803-1.
60. Siméon A, Wegrowski Y, Bontemps Y, Maquart FX. Expression of glycosaminoglycans and small proteoglycans in wounds: modulation by the tripeptide-copper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+ . Journal of Investigative Dermatology. 2000;115(6):962–968. doi: 10.1046/j.1523-1747.2000.00166.x.
61. Kang YA, Choi HR, Na JI, et al. Copper-GHK increases integrin expression and p63 positivity by keratinocytes. Archives of Dermatological Research. 2009;301(4):301–306. doi: 10.1007/s00403-009-0942-x.
62. Lamb J. The Connectivity Map: a new tool for biomedical research. Nature Reviews Cancer. 2007;7(1):54–60. doi: 10.1038/nrc2044.
63. Iorio F, Bosotti R, Scacheri E, et al. Discovery of drug mode of action and drug repositioning from transcriptional responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2010;107(33):14621–14626. doi: 10.1073/pnas.1000138107.
64. Hong Y, Downey T, Eu KW, Koh PK, Cheah PY. A ‘metastasis-prone’ signature for early-stage mismatch-repair proficient sporadic colorectal cancer patients and its implications for possible therapeutics. Clinical and Experimental Metastasis. 2010;27(2):83–90. doi: 10.1007/s10585-010-9305-4.
65. Huang P, Kishida S, Cao D, et al. The neuronal differentiation factor neuroD1 downregulates the neuronal repellent factor Slit2 expression and promotes cell motility and tumor formation of neuroblastoma. Cancer Research. 2011;71(8):2938–2948. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-10-3524.
66. Fischer A, Sananbenesi F, Mungenast A, Tsai LH. Targeting the correct HDAC(s) to treat cognitive disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 2010;31(12):605–617. doi: 10.1016/j.tips.2010.09.003.
67. Koch CM, Wagner W. Epigenetic-aging-signature to determine age in different tissues. Aging. 2011;3(10):1018–1027. doi: 10.18632/aging.100395.