Peptidbinding er en kemisk proces, der fører til dannelsen af en binding mellem en komponent, der indeholder en karboksylgruppe, og en komponent, der indeholder en aminogruppe. Som følge af denne reaktion dannes en amidbinding. Når sådan en binding binder de rester af aminosyrerne under peptidets syntese, bliver den en del af det, der betegnes som peptidskelettet.
Reaktive bestanddele behøver ikke at være individuelle aminosyrer. Reageringen kan sammenkoble én aminosyre med en anden, forbinde en anden aminosyre til den voksende peptidkæde eller forbinde større fragmenter af peptider, der tidligere er syntetiseret separat.
På første øjekast kan sammenkoblingen af peptider virke som et simpelt opgave: man skal blot sammenkoble én aminosyre med den næste.
Fra et kemisk synspunkt er imidlertid dannelsen af en amidbinding kun en del af det samlede mål.
Kombinationen skal finde sted på det rette sted og med overholdelse af en passende stereokemisk konfiguration, mens andre reaktive funktionelle grupper skal holdes under passende kontrol. Reaktionen kan tilsyneladende gå vel og bruge det meste eller endda hele udgangsmaterialet, men alligevel føre til dannelse af en uønsket blanding af det endelige peptid og andre strukturer.
Derfor betyder afsluttningen af reaktionen og produktets korrekte dannelse ikke det samme.
Studier, der sammenligner forskellige bindingssystemer, strategier til at sikre funktionelle grupper og stereokemiske resultater, viser, hvorfor der ikke findes én universelt bedste bindingstype uafhængigt af den type peptid, der syntetiseres.
Fra et videnskabeligt synspunkt lyder det så ikke mere nyttigt at spørge:
„Hvilken forbindelse er den bedste?”
Et bedre spørgsmål lyder:
„Hvilken metode gør det muligt at opnå det ønskede peptid med passende konvertering, ved at bevare stereokemisk integritet og med passende kontrol af forureninger under forhold, der er egnede til den specifikke molekyle?”
Denne sondring er af afgørende betydning for forståelsen af peptidbindingens kemi.
Hvad betyder sammenkoblingen af peptider?
Koblering forbinder to bestanddele ved at skabe et nyt bind
I den typiske reaktion, der fører til dannelsen af et peptidskal, bliver den carboxylgruppe, der er forbundet med den ene aminosyrerest, forbundet med den aminosyregruppe på den anden rest.
Den opståede forbindelse er et kemisk amidbinding.
Hvis dette binding er forbundet med andre aminosyrer i en peptidkæde, kaldes det almindeligt set peptydbinding.
Den nøjagtige fysiske placering af de reagerende bestanddele afhænger af den anvendte syntesestrategi.
Under peptidsyntesen på den faste fase er den afdækkede aminogruppe normalt en del af den voksende peptidhovedgruppe, der er forbundet med harpiksen, mens den bestanddel, der indeholder en karboksylgruppe, stammer fra den indførte beskyttede aminosyre.
I syntesen, der udføres i en opløsning, kan begge bestanddele imidlertid befinde sig i flydende fase.
Ved sammenføjning af fragmenter forbinder man større, beskyttede peptidssegmenter i stedet for at tilføje enkelte aminosyrerester efter hinanden.
Forskellige strategier ændrer måden, hvorpå reaktionen udføres, materialernes opsplitning og rensning, men de eliminerer ikke det grundlæggende kemiske problem: de rette funktionelle grupper skal reagere sammen, mens uønskede reaktioner i andre dele af molekylet skal begrænses til et rimeligt niveau.
Binding, konvertering og effektivitet er forskellige begreber
Flere udtryk, der ofte bruges ved beskrivelse af peptidsammenføjning, kan lyde ens, selvom de henvender sig til forskellige emner.
Konverteringen angiver, hvilken del af det givne udgangsmateriale der har modtaget en reaktion.
Men den fortæller ikke automatisk, hvad det pågældende materiale er blevet til.
Hvis 99% procent af det udgangsmateriale forsvinder, men en del af det danner uønskede biprodukter, betyder 99-procentlig konvertering ikke, at der er dannet 99% procent af det tilsigtede peptid.
Opbygningen af det endelige produkt besvarer et andet spørgsmål: Hvor stor en mængde af den tilsigtede molekylære struktur er faktisk blevet dannet? Svaret kræver en analytisk metode, der gør det muligt at adskille det rette produkt fra relevante alternative strukturer.
Effektivitet beskriver den mængde af det specifikke produkt, som i sidste ende blev genvundet i forhold til den definerede mængde af oprindelig materiale. Endelig effektivitet kan derfor også påvirkes af trin som bearbejdning, opsplitning og rensning, selvom selve sammenpressningen foregik effektivt.
Kromatografisk renhed beskriver fordelingen af bestanddele, der påvises under betingelserne for en bestemt kromatografimetode. Den kan give meget værdifulde oplysninger om prøvens sammensætning, men dens fortolkning kan begrænses af sammenudløb, forskelle i detektorens respons eller tilstedeværelsen af bestanddele, der let kan undervurderes af den pågældende metode.
Stereokemisk renhed svarer imidlertid på spørgsmålet om den tilsigtede rumlige konfiguration af partiklen er blevet bevaret. Dette er et separat analytisk spørgsmål, da nogle stereokemiske varianter kan have nøjagtigt samme molekylmasse som det endelige produkt.
Disse forskelle hjælper med at forstå resultaterne, som på første øjekast kan virke uforenelige.
Reaktionen kan give en høj omvandling af udgangsmaterialet, men samtidig medføre oprettelsen af flere produkter. Det rå produkt kan have en høj genvundet masse, men indeholde en betydelig mængde forureninger. Intensiv rensning kan imidlertid føre til at opnå materiale med høj renhed på bekostning af en lavere isoleringsydelse.
Ingen af disse observationer er i sig selv uforenelige med de andre.
De beskriver simpelthen forskellige egenskaber ved produktet eller forskellige faser i processen.
Derfor har påstanden „det var komplet sammenlignelighed” en langt større værdi, hvis man også ved, hvilken analytisk metode der blev brugt og hvad der præcist blev målt.
Svære substrater afslører forskellige begrænsninger i processen
Ikke alle peptidsammenføjningsreaktioner er forbundet med samme grad af kemisk kompleksitet.
Et sterisk stærkt overbelastet reaktivt sted kan hæmme bindingen, fordi de reagerende grupper har begrænset adgang til hinanden.
Lav opløselighed kan begrænse den effektive kontakt mellem reaktionskomponenterne.
I syntese i fast fase kan en stigende peptidkæde påvirke nabokæder eller påtage sig strukturer, der begrænser adgangen til reaktionssteder, selv når bindende reagenser er til stede i overskud.
Disse problemer har forskellige kemiske årsager.
Man kan derfor ikke forudsige, at én løsning automatisk vil være effektiv i alle tilfælde.
Studier, der sammenlignede metoder til gentagen binding for svære peptidsætningssekvenser, undersøgte det faktiske sammensætning af de modtagne råprodukter i stedet for udelukkende at basere vurderingen på den teoretiske reaktivitet eller ryet af de enkelte reagenser. En af de undersøgte strategier viste sig at være fordelagtig i de analyserede modeller, men det betyder ikke, at der findes en universel løsning, der er passende for enhver peptidsætningssekvens.
Det vigtigste budskab er, at metodenens effektivitet bør vurderes ud fra det produkt, der opnås fra det specifikke substrat, og ikke kun ud fra rygraden af det anvendte reagens.
Aktivering af carboxylgruppen
Hvorfor er aktivering normalt nødvendig?
Selvom uforarbejdet karboksylsyre blandes med en aminosyre under normale betingelser, fører det normalt ikke til en effektiv dannelse af et rent peptidbinding.
I stedet kan der opstå syre-base-interaktioner, og effektiv dannelse af amidbindingen kræver en passende kemisk proces.
Derfor omfatter bindingen af peptider normalt aktivering af det stof, der indeholder en karboksylgruppe.
Aktivering øger dets modtagelighed for reaktion med den relevante aminogruppe. Det rette reaktionsmiljø og den rette afgangsgruppe letter dannelsen af et nyt amidbinding.
En aktiveret intermediær produkt kan kun eksistere i en kort periode og behøver ikke at blive isoleret.
Men målet er ikke at opnå den maksimale mulige kemiske reaktivitet.
Formålet er en kontrolleret reaktivitet.
En aktiveret intermediær, der reagerer meget hurtigt med vand, med andre uønskede nukleofiler eller deltager i en konkurrerende reaktion, kan hurtigt forsvinde, samtidig med at det fører til dannelse af en relativt lille mængde af det tilsigtede peptid.
En høj reaktivitet er derfor kun gunstig, når den kan indstilles korrekt til at fremkalde det tilsigtede binding.
Bindemidler og tilføjelsesstoffer har forskellige funktioner
Nogle peptider kan interagere med flere typer kemiske stoffer, der udfører forskellige funktioner.
Karbodiimider er en af familier af reagenser, der anvendes til at aktivere carboxylgrupper.
Andre koblingssystemer bruger forskellige aktiveringsmekanismer, herunder ofte anvendte ioniske reagenser som systemer baseret på HATU.
Yderligere forbindelser kan fungere som tilsætningsstoffer.
Begrebet „additiv” betyder dog ikke, at det pågældende stof er kemisk uvæsentligt. Et additiv kan påvirke mellemprodukter, sammenkoblingsydelse, konkurrerende reaktionsveje og stereokemiske resultater.
Forskning af Oxyma i syntesen af peptider med deltagelse af karbodiimider undersøgte både bindingseffektiviteten og begrænsningen af racemisation i udvalgte modeller.
Sådanne data er værdifulde for de undersøgte systemer og konkrete modeller.
Det betyder dog ikke, at anvendelsen af det samme stof i ethvert muligt peptidbindingsforhold vil give det samme resultat.
Efterfølgende undersøgelser med Oxyma-B sammenlignede resultaterne vedrørende optisk renhed i flere modelpeptider.
Studiet af mange substrater er særligt vigtigt, da meget gode resultater ved let kemisk binding ikke nødvendigvis forudsiger reaktionen af reagenset i et stærkt stærkt sted, der er modtageligt for aggregering eller stereokemisk følsomt.
Hvad betyder HATU i peptidsyntesen?
HATU er et koblingsmiddel, der anvendes til at lette dannelsen af amidbindinger, herunder under syntesen af peptider.
HATU er ikke et peptid.
Det er heller ikke en beskyttende gruppe.
Selv sin egen tilstedeværelse er ikke et bevis på, at bindingen er afsluttet, eller at den modtagne peptid er ren.
Effektiviteten afhænger af substrattypen, de andre reagenser, opløsningsmiddelsystemet og det bredere kontekst af reaktionsbetingelserne.
Studierne af sekvenser, der var modtagelige for aggregering, sammenlignede blandt andet tilgange baseret på HATU og Oxyma-/karbodiimid-systemer under betingelser med gentagen binding.
Det viser, hvorfor søgninger som „HATU peptide” bør forstås som spørgsmål om bindingens kemi og valg af metode, og ikke som bevis for, at en bestemt reagens er en universel metode til syntese af peptider.
Selv navnet på reagenset er ikke nok til at gengive eller korrekt fortolke det offentliggjorte resultat.
Også reaktionsbetingelserne, peptidsekvensen og den analytiske måde at definere processucces har betydning.
Aktivering og stereokontrol kræver opretholdelse af balance
At opretholde den aktiverede aminosyre-derivat i reaktionssystemet i længere tid er ikke altid en fordel.
Den ønskede koblingsreaktion finder sted sammen med andre mulige kemiske processer.
Nogle konkurrerende ruter kan ændre stereotyperne.
Eksperimentelle undersøgelser af beskyttede epimere produkter analyserede effekten af kombinationer af aminosyrer, opløsningsmiddel og andre reaktionsbestanddele på de stereokemiske ændringer, der opstår under kobling med deltagelse af carbodiimider.
Det viser en vigtig regel: hele reaktionsmiljøet kan være lige så vigtigt som den generelle familie af anvendte bindende reagenser.
Strategien for sammenkobling skal derfor sikre tilstrækkelig reaktivitet til at opnå det ønskede bindeværd, samtidig med at muligheden for uønskede reaktioner begrænses.
Disse regler kan drøftes i uddannelsesmæssige sammenhænge uden at blive omdannet til en færdig laboratorieprotokol. De nøjagtige mængder af reagenser, reagensernes tilføjelsesrækkefølge og reaktionsbetingelserne afhænger af den specifikke synteseproces, der udvikles.
Rollen for beskyttelsesgrupper
Beskyttelse begrænser konkurrencepladserne for reaktioner
En aminosyre kan indeholde flere reaktive grupper end blot den aminosyre- og karboksylgruppe, der er nødvendig for at danne det peptidiske skab.
Dens sidekæde kan indeholde yderligere reaktive kemiske grupper.
Hvis alle potentielt reaktive grupper var synlige under hvert fasen af bindingen, kunne den tilsigtede dannelse af peptidsammenkoblinger konkurrere med spaltning eller andre uønskede reaktioner.
En strategi, der bruger beskyttelsesgrupper, gør det midlertidigt muligt at maskere udvalgte reaktive områder.
På denne måde kan de relevante aminosyre- og karboksylgrupper reagere med hinanden, mens andre områder forbliver utilgængelige eller tilstrækkelig svage til at reagere under de givne betingelser.
Beskyttelse sikrer således kemisk selektivitet.
En effektiv strategi består dog ikke kun af at tilslutte en kemisk stabil gruppe.
Beskyttelsesgruppen skal også fjernes senere.
Et beskyttelseslag, der effektivt forhindrer uønskede reaktioner under bindingen, men som ikke senere kan fjernes uden at beskadige det målte molekyle, skaber et yderligere syntetisk problem.
En fuldstændig strategi skal derfor tage højde for både stabiliteten i en periode, hvor beskyttelse er nødvendig, samt muligheden for selektiv fjernelse af beskyttelsen, når den ikke længere er nødvendig.
Midlertidige og langvarige sikkerhedsforanstaltninger har forskellige funktioner
Forskellige beskyttelsesgrupper kan forbli på en del af kroppen i forskellige længder af tid.
I en typisk syntese på den faste fase, hvor en Fmoc-beskyttelse af den endelige aminosyregruppe i den voksende kæde anvendes, fjernes den flere gange i takt med at sekvensen forlænges.
Mange grupper af sidekæder forbliver imidlertid til stede gennem mange gentagne faser af sammenkobling og fjernes først på et senere tidspunkt.
Standardmetoder baseret på Fmoc viser, hvordan gentagne cyklusser af selektiv fjernelse af beskyttelsesgrupper og binding sammenkædes.
Den type beskyttelse, der er nødvendig for en bestemt sidekæde, afhænger af resten af aminosyren, hele peptidet og den valgte syntese-strategi.
Det ville således ikke være rigtigt at påstå, at hver aminosyre kræver identisk beskyttelse, eller at alle synteser anvender de samme beskyttelsesgrupper.
Midlertidige beskyttelsesgrupper bør også adskilles fra kemiske grupper, som bevarer sig i den færdige peptidform.
Den planlagte modifikation af den N-ende eller amid på C-enden kan f.eks. udgøre en del af den endelige struktur.
Imidlertid ville en midlertidig beskyttelsesgruppe, der tilfældigvis blev tilbage i den endelige del, betyde en uønsket strukturel forskel.
Ortogonalitet er et krav til kemisk overensstemmelse
Ortogonal beskyttelse er en strategi, hvor udvalgte beskyttelsesgrupper kan fjernes, mens andre sikkerhedsforanstaltninger forbliver tilstrækkelig ubeskadigede.
Dette gør det muligt at afsløre forskellige reaktive steder på målrettede stadier i syntesen.
Ortogonalitet bør ikke kun forstås som egenskaber ved det enkelte reagens, som er angivet på etiketten.
Den beskriver overensstemmelsen mellem hele den planlagte sekvens af kemiske operationer.
Den tilsigtede fjernelse af beskyttelsen bør foregå uden at forårsage uacceptable ændringer i andre dele af det voksende peptid.
I syntesen i fast fase kan denne overensstemmelse også omfatte bærer-bindingssystemet samt atypiske eller særligt kemisk følsomme molekylære blokke.
Forskning om dannelsen af aspartimid, hvor beskyttelsesgrupperne i de yderste og skjeletlige dele af peptidet blev modificeret, viste forskelle i dannelsen af biprodukter.
Dette viser, at valg af beskyttelsesforanstaltning kan have indflydelse ikke kun på udviklingen af den åbenlyse sidekæde-reaktion.
Det kan også ændre andre baner for forureningens opståen under syntesen.
Beskyttelsesgrupper gør ikke, at alle sekvenser opfører sig ens
Selvom de to sekvenser indeholder den samme potentielt problematiske aminosyre, behøver de ikke at opføre sig ens.
Omgivende faktorer kan påvirke sandsynligheden for opståen af konkurrerende reaktioner.
Systematiske undersøgelser af modelsekvenser, der indeholder asparaginian, viste, at aminosyren efter denne rest påvirkede dannelsen af produkter forbundet med aspartimid i de undersøgte betingelser.
Det betyder ikke, at enhver sekvens, der indeholder sådan et motiv, nødvendigvis skal give problemer.
Det viser imidlertid, at konteksten omkring sekvensen bør tages i betragtning under udviklingen af metoden og risikovurderingen.
En sikkerhedstrategi, der har vist sig at fungere i et bestemt peptid, garanterer ikke samme adfærd hos ethvert andet peptid, der indeholder den samme rest.
Rasemæssig diskrimination og andre bivirkninger
Racemization og epimerization vedrører den rumlige ordning af en molekyl
Mange reststoffer af aminosyrer indeholder et stereocentrum.
En ændring i konfigurationen af et sådant center kan føre til dannelse af en strukturelt anderledes partikel, selvom dens grundstofindhold og molekylmasse forbliver uændrede.
Nøjagtigt set betyder racemisering tabet af den enantiomeriske opbyggelse i retning af en racemisk blanding.
I et peptid, der indeholder mange stereoisomere centre, fører omvendelse af konfigurationen af et specifikt centrum normalt til dannelsen af en epimer, dvs. en form for diastereoisomer.
I litteraturen om peptidsyntese anvendes imidlertid termen „racemization” mere bredt i forbindelse med uønskede konfigurationændringer, der opstår under binding eller andre stadier af syntesen.
Denne sondring er vigtig, fordi peptids identitet ikke kun afhænger af hvilke atomer der findes i molekylet.
Deres rumlige placering har også betydning.
Ikke alle aminosyrer forbundet med den samme stereokemiske risiko.
Glycin har f.eks. ikke den typiske kiral carbon-alpha-atom, der findes i de fleste aminosyrer.
De resterende dele er forskellige i deres modtagelighed over for ændringer i konfigurationen afhængigt af deres struktur og reaktionsmiljø.
En korrekt masse kan være ledsaget af en ukorrekt stereokemi
Et epimeryntype kan have nøjagtigt samme molekylmasse som det målte peptid.
Derfor bekræfter observationen af den forventede masse ved hjælp af massespektrometri automatisk ikke, at hver enkelt aminosyrerest har bevaret den tilsigtede stereokemiske konfiguration.
Kromatografiske undersøgelser muliggjorde adskillelse af beskyttede epimere peptider og anvendelse af disse afsnit til analyse af stereokemiske ændringer forbundet med binding kjemien.
Afhængigt af molekylet kan en passende stereokemisk analyse kræve brug af egnede kromatografimetoder, referencestoffer, derivatiseringsstrategier eller andre analytiske metoder, der er i stand til at skelne mellem relevante strukturer.
Særlige analytiske undersøgelser analyserede også de stereokemiske ændringer, der opstår ved tilslutning af aminosyrer til faste bærere.
Dette fører til et andet vigtigt resultat: Forureningen, der blev opdaget i det færdige peptid, behøver ikke at stamme fra den sidste koblingsreaktion.
Det kunne være opstået på et tidligere stadium og have været til stede under de efterfølgende stadier af syntesen.
Dannelsen af aspartimid er et separat problem
Dannelsen af aspartimid er en specifik sideeffektsvej forbundet med modtagelige peptidsekvenser, der indeholder aspartin.
Processen omfatter oprettelsen af et cyklisk mellemprodukt, som derefter kan blive til forskellige beslægtede strukturer.
Disse kan omfatte ændrede bindinger i peptidets skellet og stereokemiske varianter.
Dannelsen af aspartimid bør derfor ikke beskrives som blot en anden betegnelse for ufuldstændig binding.
Peptidkæden kan allerede indeholde de rette aminosyrerestene, og en senere reaktion kan ændre en del af dens struktur.
Eksperimentelle undersøgelser viser, at denne proces kan påvirkes af sikringspolitikker, naboer og tilbagevendende forhold forbundet med fjernelse af beskyttelsesgrupper.
Denne sondring er særligt vigtig ved fortolkningen af problemer, der opstår i syntesen.
Selv at gentage bindingen eller tilføje mere bindende reagens vil ikke automatisk rette op på forureningen, der opstod som følge af en helt anden kemisk proces.
Ufuldstændige reaktioner fører til andre typer problemer
Ufuldstændig sammenkobling skaber en separat kategori af forureninger.
Hvis en kæde af aminosyrer ikke modtager den planlagte aminosyre, men reagerer korrekt under en senere cyklus, kan det dannede peptid være uden denne rest.
Sådan en molekyle betegnes normalt som en delektionssekvens.
Andre kæder kan stoppe med at blive længere og forblive korte.
Disse produkter adskiller sig i det væsentlige fra epimererne.
Epimer kan have den rigtige aminosyresekvens og det samlede mønster, men en ukorrekt stereokemi for det ene centrum.
Peptydet delecyjnt har imidlertid en anden sekvens eller længde.
Nogle syntesestrategier bruger såkaldt capping for at forhindre yderligere forlængelse af bestemte ikke-reagerede kedler.
Men capping reparerer ikke det defekte kæde og omdanner det ikke til det ønskede peptid.
Det ændrer kun dets adfærd i de efterfølgende faser.
Den rå blanding, der opnås ved syntesen, kan således indeholde produkter, der opstår som følge af flere forskellige mekanismer.
Den samlede produktivitetsevne gør det ikke muligt at fastslå, hvilke mekanismer for forureningens opståen var ansvarlige for det endelige resultat.
Temperatur og procesbetingelser påvirker kompromiset mellem hastighed og kvalitet
En temperaturstigning eller andre metoder til at fremskynde syntesen kan øge hastigheden af de ønskede reaktioner.
Samtidig kan de dog fremskynde de uønskede reaktioner.
SPPS-undersøgelser med mikrobølgetilskud analyserede racemiseringen og dannelsen af aspartimid i modelsystemer og viste en afhængighed af resttypen af følsomhed under de anvendte betingelser.
Det betyder ikke, at opvarmning i sig selv er forkert i peptidsyntesen.
Det betyder heller ikke, at lavere temperatur altid er bedre.
Den vigtigste regel lyder: Hastigheden i processen og den kemiske kvalitet bør vurderes samtidigt.
Højere temperatur, længere eksponering eller gentagen behandling kan påvirke både det ønskede dannelsesforløb af bindinger og konkurrencereaktionerne.
En passende kompromis bør derfor evalueres eksperimentelt for en bestemt sekvens.
Modifikationer af det endelige produkt kan også forekomme allerede efter selve sammenkoblingen er afsluttet.
Forskning, der sammenlignede forskellige scavengers under afsætningen af peptidet fra harpiksen, viste forskellige forurelsesprofiler.
Det minder om, at den endelige forurening ikke automatisk må tilskrives bindingen.
Syntese af et peptid er en multiphasisk proces, og senere afmontering, affatning og yderligere behandling kan ændre det materiale, der tidligere blev opbygget korrekt.
Hvordan vurderes sammenkoblingseffektiviteten?
Testene, der udføres under processen, svarer kun på bestemte spørgsmål.
Under syntesen i den faste fase kan et teststof, der påviser andre tilgængelige aminosyregrupper, hjælpe med at vurdere, om acyleringen kunne have været ufuldstændig.
Sådanne tests kan være meget nyttige.
Deres fortolkning bør dog begrænses til det kemiske spørgsmål, som den anvendte metode faktisk svarer på.
Afhængigt af den analytiske metode og typen af aminosyre kan tests, der er baseret på farveændring, reagere forskelligt på forskellige aminer.
Også tilgængeligheden af det undersøgte sted er vigtig.
En reaktiv aminosyregruppe, som testreagenset fysisk ikke har adgang til, er ikke det samme som en aminosyregruppe, der har gennemgået en korrekt binding reaktion – selvom testen ikke umiddelbart kan skelne disse situationer ad.
Begrænsninger kan således omfatte tilgængeligheden af det reaktive sted, testsensitiviteten, kemiske interferenser og typen af den funktionsgruppe, der påvises.
Resultatet af en test, der blev udført under processen, bør ikke automatisk tolkes som bevis for, at hele peptidet har den korrekte sekvens, stereokemi og renhed.
Overvågningen af processen er mest værdifuld, når resultaterne senere kan sammenlignes med en analyse af det faktiske peptidprodukt.
Kromatografi adskiller, og massespektrometri hjælper med at karakterisere bestanddelene.
Kromatografi og massespektrometri leverer supplerende informationer.
Kromatografi kan adskille bestanddelene i prøven og vise tilstedeværelsen af mere end én detekterbar bestanddel.
Massespektrometri kan give oplysninger om molekylmasse og hjælpe med at karakterisere eller tilskrive de enkelte bestanddele.
Forskning, der kombinerer begge teknikker, gjorde det muligt at analysere de rå peptidsynteseprodukter på fast fase og få oplysninger om deres identitet og graden af fjernelse af beskyttende grupper.
Kombinationen af begge metoder giver normalt flere oplysninger end antagelsen om, at hver chromatografisk pik allerede er identificeret, eller at hver påviset masse svarer til en ren og strukturelt komplet fraktion.
Der er dog stadig begrænsninger.
Forskellige bestanddele kan blive blandet sammen, hvilket betyder, at de ikke bliver fuldstændigt adskilt ved kromatografi.
Forskellige stoffer kan også give forskellige responser fra detektoren.
Strukturelle isomerer og stereoisomerer kan kræve anvendelse af yderligere analytiske metoder.
Af samme grund betyder blot at peptidet er blevet undersøgt med HPLC-metoden ikke automatisk, at alle relevante forureninger er blevet opdaget.
Den konkrete værdi af en HPLC-metode afhænger af den faktiske opnåede afgrænsning og af det analytiske spørgsmål, som den skal besvare.
Det er nødvendigt at forklare, hvordan resultatet blev beregnet.
Den procentvise værdi, der angives for peptidsammenføjning, kan betyde flere helt forskellige ting.
Det kan referere til konverteringen af det udgangsmateriale, den relative overflade af det kromatografiske peak, den målte indhold af det endelige produkt, produktionskapaciteten i ubehandlet form eller isoleret produktionskapacitet.
At angive selve tallet uden at forklare, hvad det angår, kan derfor skabe et misvisende indtryk af stor præcision.
Pålidelige sammenligninger bør angive substratet, det analyserede faser af bindingen, den anvendte analytiske metode, tidspunktet for prøveudtagningen samt typerne af de undersøgte forureninger.
Hvis der er anvendt gentaget sammenkobling, skal dette også tages i betragtning.
Det endelige resultat efter to sammenføjningsoperationer behøver ikke at afspejle det, der skete under den første reaktion.
En lignende forsigtighed kræves ved grænserne for det detekterbare niveau for analytiske metoder.
Beskeden „ikke fundet” betyder, at stoffet ikke blev fundet under de specifikke betingelser og med de begrænsninger, som den anvendte metode indebar.
Det bør ikke automatisk blive til en absolut påstand om, at det pågældende forurening ikke overhovedet forekommer.
Data om reagenset bør omfatte mere end en simpel model
En ligeringstrogen, der fungerer særdeles godt i en simpel modelreaktion, kan opføre sig anderledes i tilfælde af en aminosyre med et stort stereokemisk overbelastningspunkt, et følsomt stereokemisk centrum, et svagt opløseligt substrat eller en peptidkæde, der er modstandsdygtig over for aggregering.
Forskning, der sammenligner Oxyma-B med flere modelpeptider, viser, hvorfor vurdering af bindingens kemi på mere end ét substrat er værdifuld.
Til sidst bør en anvendelig metoden for sammenkobling føre til opnåelse af den ønskede struktur med et acceptabelt forureningsprofil og et reproducerbart resultat for den ønskede syntese.
Derfor forstås sammenkoblingseffektivitet bedre som en samling af forskellige målinger end som en egenskab beskrevet ved navnet på et enkelt reagens eller resultatet af en enkelt undersøgelse af substratnedbrydning.
Ofte stillede spørgsmål
1. Hvorfor er beskyttende grupper nødvendige under peptidsyntese?
Beskyttelsesgrupperne begrænser midlertidigt uønskede reaktioner, således at de rette funktionelle grupper kan udføre det tilsigtede peptidbinding. Aminosyrer kan indeholde flere reaktionssteder, og at lade dem alle være tilgængelige samtidigt kan føre til konkurrerende reaktioner. En effektiv beskyttelsesstrategi skal også tage højde for muligheden for senere fjernelse af beskyttelsesgrupperne og deres overensstemmelse med resten af molekylet. Modellerede undersøgelser viser, at valget af beskyttelsesgrupper kan påvirke ikke kun reaktionsens grundlæggende selektivitet, men også dannelsen af biprodukter. Beskyttelsesgruppen er således et element i en hel syntesestrategi og ikke en universel løsning på alle kemiske problemer.
2. Kan en korrekt sammenkobling fortsat føre til forurening?
Ja. Intentet peptidbinding kan opstå, mens andre molekyler i samme blanding oplever ufuldstændig konvertering eller uønskede sideprocesser. Dette illustreres særligt godt ved studier af epimere produkter, da dannelsen af den rette binding og opretholdelsen af den rette stereokemien er separate begivenheder. Det faktum, at det målte peptid er det eneste, der er til stede, betyder således ikke, at det er det eneste produkt, der er til stede. En videnskabeligt begrundet vurdering af sammenkoblingssucces kræver et defineret slutpunkt for analysen og oplysninger om relevante forureninger.
3. Er peptidsyntese det samme som hele peptidsyntese?
Nej. Sammenføjning er en enkelt operation vedrørende dannelsen af en binding inden for en langt bredere synteseproces. Syntese på den faste fase kan også omfatte tilslutning til bæreren, beskyttelse, fjernelse af beskyttende grupper, gentagne rensninger, afskilning, behandling, rensning og den endelige karakterisering. Da uønskede produkter kan opstå også uden for sammenføjningsfasen, bør den endelige forurening ikke automatisk tilskrives fejlagtig sammenføjning uden data, der tyder på dens faktiske oprindelse.
4. Hvorfor aktiveres karboksylgruppen?
Aktivering af carboxylgruppen skaber en mere fordelagtig reaktionære vej sammen med den relevante aminogruppe, hvilket letter dannelsen af amidbindingen. En øget reaktivitet kan dog også muliggøre konkurrerende reaktioner. Derfor vurderes forbindelsessystemer ikke kun ud fra bindingens effektivitet, men også fra stereokemiske virkninger og biproduktdannelsen. Målet med aktivering er ikke at maksimere reaktiviteten af molekylet, men at opnå en passende selektivitet for reaktionen.
5. Hvad bruges HATU til?
HATU er et bindemiddel anvendt til at lette dannelsen af amidbindinger, herunder ved binding af peptider. Det er hverken et peptid eller en beskyttende gruppe. Sammenlignende undersøgelser af komplekse peptidsækkener viser, at metoder, der anvender HATU, bør vurderes i fuldt perspektiv af reaktionsbetingelserne. Alene oplysningen om, at HATU blev anvendt, bekræfter ikke en fuldstændig konvertering, stereokemisk stabilitet eller en bedre forureningsprofil.
6. Er der én bedste reagens til at sammenkæde peptider?
Nej. Der findes ikke en universel ranking af reagenser, der er passende for ethvert peptid og enhver reaktion. Styrke, opløselighed af substratet, aggregering, stereokemisk følsomhed og sekvensens kontekst kan alle påvirke resultatet. Valget af reagens bør derfor baseres på de målte resultater for den specifikke reaktion og ikke kun på dens renommé eller popularitet.
7. Betegner „forbindelsestekst” og „tilføjelse” det samme?
Nej. Disse betegnelser kan beskrive forskellige funktioner i en sammenkoblingssystem. Et sammenkoblingsmiddel kan direkte deltage i aktiveringen, mens et additiv kan påvirke dannelsen af mellemprodukter, reaktionsydelsen, stereokemisk integritet eller konkurrerende kemiske ruter. Derfor skal hele reaktionssystemet analyseres, og ikke alle dets bestanddele betragtes som udskiftelige modstykker.
8. Kan man sammenkæde hele peptidsplitter i stedet for enkeltstående aminosyrer?
Ja. Bindningsreaktionen kan kombinere større beskyttede peptidsubstanser, og ikke kun enkelte aminosyrer. En øget størrelse på de reagerende bestanddele eliminerer dog ikke behovet for at styre reaktionsstedets selektivitet, stereokemi eller den endelige karakteristika af produktet. Ved binding af fragmenter er der fortsat brug for data, der bekræfter, at den korrekte binding faktisk opstod korrekt.
9. Hvad er forskellen mellem racematisering og epimeryatisering?
Racematisering i streng forstand betyder tab af den enantiomeriske opdeling i retning af en racemisk blanding, mens epimerisering betyder en ændring i konfigurationen af et stereocentrum i en molekyle, der indeholder flere af disse centre. I litteraturen om peptidsyntese bruges termen racemisation ofte mere bredt for at beskrive uønskede ændringer i konfigurationen af aminosyrerestene. Et præcist begreb bør derfor svare til en faktisk strukturel ændring.
10. Kan massespektrometrien opdage enhver stereokemisk fejl?
Nej. Stereoisomerer kan have nøjagtigt samme molekylmasse. Det faktum, at den forventede masse ikke bekræfter den korrekte konfiguration af hvert stereogent centrum, bekræfter ikke nødvendigvis den korrekte konfiguration af hvert stereogent centrum. Yderligere metoder, såsom relevante kromatografiske teknikker eller derivatiseringsstrategier, kan være nødvendige for at vurdere sådanne forskelle. Massespektrometri forbliver et yderst nyttigt værktøj til molekylær karakterisering, men resultaterne bør fortolkes i overensstemmelse med begrænsningerne ved det specifikke strukturelle spørgsmål.
11. Betegner dannelsen af aspartimidet simpelthen en uheldig binding?
Nej. Dannelsen af aspartimid er en separat sideeffektsreaktion forbundet med modtagelige sekvenser, der indeholder aspartin. Dens forekomst kan påvirkes af nabrestrukturer samt betingelser for fjernelse af beskyttende grupper. En uønsket strukturell ændring kan derfor opstå, selv når den relevante aminosyre tidligere er korrekt tilsluttet. Det er vigtigt at fastslå oprindelsen af forureningen, da gentagelse af bindingen ikke nødvendigvis løser problemet, der skyldes en helt anden reaktionsvej.
12. Sikrer gentagelse af bindingen succes i reaktionen?
Nej. En gentagelse af bindingen kan i nogle tilfælde forbedre konverteringen, men det garanterer ikke, at alle reaktive positioner bliver tilgængelige, eller at andre bivirkninger elimineres. Resultatet afhænger stadig af substratet og den anvendte metode. En analyse af produktet er derfor nødvendig for at fastslå, hvad der faktisk gav yderligere binding.
13. Forbedrer højere temperatur altid kvaliteten af sammentrækningen?
Nej. En højere temperatur kan fremskynde den ønskede reaktion, men den kan også fremskynde uønskede kemiske processer. En hurtigere konvertering bør derfor ikke automatisk tolkes som en forbedring af den kemiske kvalitet. Temperaturen skal vurderes både med hensyn til at opnå det ønskede produkt og profil af de fremkomne forureninger.
14. Bekræfter fraværet af den frie aminogruppe dannelsen af et korrekt peptid?
Nej. Fraværet af en påviselig fri aminogruppe svarer til et meget mere begrænset spørgsmål vedrørende en bestemt funktionel gruppe under betingelserne for den anvendte test. Det bekræfter ikke automatisk den komplette peptidsekvens, dens stereokemi eller renhed. Overvågning af frie aminogrupper kan være et nyttigt element i proceskontrol, men erstatter ikke den endelige karakterisering af produktet.
15. Er HPLC-renhed det samme som bindingseffektivitet?
Nej. HPLC-renhed og effektivitet beskriver forskellige egenskaber. HPLC-renhed er afhængig af metoden til at beskrive sammensætningen af de pågældende prøvebestanddele, mens effektivitet henviser til mængden af det bestemte produkt, der opnås i forhold til den definerede mængde oprindelig materiale. Rensing kan forbedre den chromatografiske renhed, samtidig med at det reducerer mængden af det opnåede endelige produkt. Derfor har den procentvise værdi kun begrænset betydning, hvis det ikke er præcist angivet, hvad der repræsenteres.
16. Kan der opstå forurening allerede efter færdiggørelsen af sammenkoblingen?
Ja. Efter færdiggørelsen af bindingen omfatter peptidets syntese flere kemiske trin. Fjernelse af beskyttende grupper, afbinding og yderligere behandling kan ændre molekylet eller føre til dannelse af yderligere forureninger. Det betyder ikke, at enhver endelig forurening opstår i senere trin, men det viser, hvorfor korrekt binding ikke er en garanti for kvaliteten af det endelige produkt.
17. Hvad gør sammenligningen af sammenkoblingsmetoder troværdig?
En troværdig sammenligning bør vurdere alternative metoder til det samme, klart definerede mål og under tilstrækkeligt sammenlignelige betingelser. Den bør angive de anvendte substrater, prøvetagningsfaser, analytiske metoder og de vurderede forureningstyper, i stedet for at give en uforklarlig procentvis værdi eller basere sig på et referenceløfte. Sammenligninger, der omfatter flere forskellige modelpeptider, kan give flere oplysninger end en enkelt høj effektivitet opnået for et enkelt let substrat, da de viser, hvordan effektiviteten ændrer sig i forhold til molekylær kontekst. Selv da bør konklusionerne begrænses til faktisk undersøgte kemiske systemer.
Sammenfatning
Peptidbinding er det grundlæggende element i den kemiske syntese af peptider, da det fører til dannelsen af amidbindinger, der forbinder aminosyrerestene i peptidskelettet. At beskrive bindingen udelukkende som „sammenføjning af to aminosyrer” udelader imidlertid en betydelig del af den kemi, der er afgørende for, om det opnåede produkt faktisk er det tilsigtede peptid.
En komponent, der indeholder en karboksylgruppe, kræver normalt aktivering for at muliggøre en effektiv dannelse af amidbindingen. Bindemidler og additiver kan lette denne proces, men deres effektivitet afhænger af substratet, reaktionsmiljøet og den analytiske vurdering af resultatet. Derfor skal reagensen analyseres i fuld eksperimentel sammenhæng og ikke klassificeres uafhængigt af det syntetiserede peptid.
Beskyttelsesgrupper giver et yderligere niveau af kontrol ved midlertidigt at forhindre uønskede funktionelle grupper i at deltage i reaktionen. Deres anvendelighed afhænger ikke kun af effektiv beskyttelse, men også af muligheden for selektiv fjernelse og overensstemmelse med de efterfølgende syntesefaser. Beskyttelsesstrategien og de tilstødende rester af aminosyrer kan også påvirke dannelsen af bestemte bivirkninger.
Stereokemisk integritet er et andet væsentligt element. Bindningsreaktionen kan føre til dannelse af en amidbinding og samtidig generere et epimerylt materiale. Da epimeren kan have samme molekylmasse som det korrekte peptid, bekræfter selve massekonformiteten ikke den fuldstændige strukturelle rigtighed. Ændringer i konfigurationen kan også opstå på andre stadier, såsom den indledende binding af aminosyren til den faste fase.
Andre forureninger opstår gennem forskellige mekanismer. Ufuldstændig binding kan føre til dannelse af delegerede eller forkortede sekvenser, mens reaktioner relateret til aspartimid kan ændre peptidet ved at indeholde allerede tilstedeværende aminosyreresters. Fremgangsmåden kan både påvirke ønskede reaktioner og vedligeholdelsesveje, og yderligere forureninger kan også opstå i senere faser som f.eks. affinitetsbinding.
Af disse årsager kræver vurderingen af peptidsammensætningen mere end blot at fastslå, om udgangsmaterialet er forsvundet.
Konvertering, fremstilling af det endelige produkt, isoleret produktionskapacitet, kromatografisk renhed og stereokemisk renhed besvarer forskellige spørgsmål.
Testene, der udføres under syntesen, kan hjælpe med at opdage ufuldstændige reaktioner, men de kan ikke i sig selv bekræfte peptids strukturen fuldstændigt. Chromatografi og massespektrometri giver supplerende informationer, mens spørgsmål om stereokemi eller meget lignende strukturer kan kræve yderligere analytiske metoder.
Den mest velbegrundede tilgang til peptidsammensætning er derfor målrettet en bestemt molekyle og baseret på data.
En anvendelig bindingmetode er ikke bare en metode, der anvender den mest kendte eller mest reaktive reagens. Det er en metode, der på en tilbagevendende måde fører til dannelsen af det ønskede molekylære bind, samtidig med at den relevante stereokemiske integritet opretholdes og relevante forureninger for det specifikke syntetiserede peptid kontrolleres.
Referencer
- Subirós-Funosas, R., Prohens, R., Barbas, R., El-Faham, A., & Albericio, F. (2009). Oxyma: Et effektivt additiv til peptidsyntese, der erstatter benzotriazolbaserede HOBt og HOAt med en lavere risiko for eksplosion. Kemien—A European Journal, 15(37), 9394–9403. https://doi.org/10.1002/chem.200900614
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Racemization-studier i peptidsyntese gennem separation af beskyttede epimeriske peptider ved højtydende flydende kromatografi med omvendt fase. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Evaluering af kombineret brug af Oxyma og HATU til at aggregere peptidsekvenser. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Jad, Y. E., Khattab, S. N., de la Torre, B. G., Govender, T., Kruger, H. G., El-Faham, A., & Albericio, F. (2014). Oxyma-B, en fremragende racemiseringssuppressor til peptidsyntese. Organisk og biomolekylær kemi, 12(42), 8379–8385. https://doi.org/10.1039/c4ob01612b
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Peptidsyntese i fast fase: Fra standardprocedurer til syntese af svære sekvenser. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Aspartimideproblemet i Fmoc-baserede SPPS. Del I. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Asparimideproblemet i Fmoc-baserede SPPS. Del II. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Anvendelse af Marfey-reagens til at kvantificere racemisering ved fastgøring af aminosyrer til faste bærere til peptidsyntese. Analytisk biokemi, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Begrænsning af racemisering og aspartimidedannelse ved mikrobølgeteknologi til syntese af fmk-holdige peptider i fast fase. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-Benzenedimethanethiol (1,4-BDMT) som et rensende middel mod kløvning af grønnere peptidharpikser. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., & Pallai, P. (1991). Karakterisering af råprodukter fra fastfase-peptidsyntese ved mu-HPLC/hurtig atombombardement-massespektrometri. Peptide Research, 4(1), 40–46. PubMed