Peptidbindning är en kemisk process som leder till bildandet av en bindning mellan en del som innehåller en karboxylgrupp och en del som innehåller en aminosyragrupp. Som resultat av denna reaktion bildas en amidbindning. När sådana bindningar binder aminosyrorna under peptidsyntesen blir de en del av det som kallas peptidskelettet.
Reaktiva komponenter behöver inte vara enskilda aminosyror. En bindningsreaktion kan förena en aminosyra med en annan, förena en annan aminosyra till en växande peptidkedja eller förena större peptidsubstanser som tidigare syntetiserats separat.
Åt första anblicken kan sammanfogning av peptider verka som en enkel uppgift: man behöver bara koppla samman en aminosyra med nästa.
Från ett kemiskt perspektiv är dock bildandet av en amidbindning bara en del av helheten.
En kombination måste uppstå på rätt plats och med en lämplig stereokemisk konfiguration, medan andra reaktiva funktionella grupper måste hållas under lämplig kontroll. En reaktion kan till synes gå smidigt och använda upp större delen eller till och med hela utgångsmaterialet, men ändå leda till att en oönskad blandning av det slutliga peptidet och andra strukturer uppstår.
Därför betyder inte slutet på reaktionen och produkternas korrekt bildande samma sak.
Studier som jämför olika ligeringssystem, strategier för att säkra funktionella grupper samt stereokemiska resultat visar varför det inte finns någon universellt bästa ligeringsobservation, oberoende av vilken typ av syntetiserad peptid som används.
Från ett vetenskapligt perspektiv är det inte så mycket mer användbart att fråga:
„Vilken binda-reagens är bäst?”
Det bättre frågan är:
„Vilket tillvägagångssätt gör det möjligt att erhålla den önskade peptiden med lämplig konvertering, bevarande av stereokemisk integritet och korrekt kontroll av föroreningar under förhållanden som är lämpliga för den specifika substansen?”
Denna distinktion är av avgörande betydelse för att förstå peptidbindningens kemi.
Vad innebär sammanslagningen av peptiderna?
Bindning kombinerar två komponenter genom att skapa ett nytt bindningsförhållande
I den typiska reaktion som leder till bildandet av ett peptidiskt skikt, kopplas karboxylgruppen som är bundet till en av aminosyrorna till aminosyrogenen på den andra aminosyran.
Den uppkomna föreningen är en kemiskt bindande amid.
Om sådana bindningar binder samman andra aminosyror i en peptidkedja, kallas de vanligtvis peptidsammanbindning.
Den exakta fysiska placeringen av de reagerande komponenterna beror på den använda syntesstrategin.
Under peptidsyntesen på fast fas avslöjas den aminosyradelen vanligtvis i den växande peptidhållningen som är kopplad till bindemedlet, medan den komponent som innehåller karboxylgruppen kommer från den inlagda säkrade aminosyran.
I en synteseprocess som utförs i en vätska kan båda komponenterna emellertid finnas i flytande form.
Vid sammanfogning av fragmenten binds större, säkrade peptidssegmenten, istället för att lägga till enskilda aminosyresubstanser en efter en.
Olika strategier förändrar sättet att hantera reaktionerna, separera materialen och rensa bort dem, men de eliminerar inte det grundläggande kemiska problemet: de rätta funktionella grupperna måste reagera med varandra, medan oönskade reaktioner i andra delar av molekylen bör vara tillräckligt begränsade.
Bindning, konvertering och effektivitet är olika begrepp
Flera termer som ofta används för att beskriva peptidsammansättningar kan låta likadana, trots att de avser olika ämnen.
Konverteringen anger vilken del av den givna utgångsmaterialen som har reagerat.
Men den talar inte automatiskt om vad materialet har förvandlats till.
Om 99% av den utgångsmedlet försvinner, men en del av det bildar oönskade biprodukter, innebär 99-procentig konvertering inte att 99% av det avsedda peptidet bildas.
Uppkomsten av det slutliga produkten besvarar en annan fråga: vilken mängd av den avsedda molekylstrukturen faktiskt har skapats? Svaret kräver en analytisk metod som gör det möjligt att skilja det rätta produkten från relevanta alternativa strukturer.
Den isolerade kapaciteten beskriver den mängd av den specificerade produkten som slutligen återfanns i förhållande till den definierade mängden av den ursprungliga materialen. Slutkapaciteten kan därför också påverkas av bearbetnings-, separerings- och rensningsstegen, även om själva sammanfogningen gick smidigt.
Kromatografisk renhet beskriver fördelningen av de beståndsdelar som detekteras under förhållanden som är specificerade för en given kromatografimetod. Den kan ge mycket värdefull information om provens sammansättning, men dess tolkning kan begränsas av sammanslagning, skillnader i detektorns respons eller närvaron av beståndsdelar som är svåra att detektera med den givna metoden.
Stereokemisk renhet svarar däremot på frågan om den avsedda rummässiga konfigurationen av partikeln har bevarats. Detta är en separat analytisk fråga, eftersom vissa stereokemiska varianter kan ha exakt samma molekylmassa som den slutliga produkten.
Dessa skillnader hjälper till att förstå resultaten, som vid första anblicken kan verka motstridiga.
Reaktionen kan ge en hög konvertering av utgångsmaterialet och samtidigt leda till att flera produkter bildas. Den råa preparatet kan ha en stor återvunnen massa, men kan innehålla en betydande mängd föroreningar. Intensiv rening kan däremot leda till att man får material med hög renhet på bekostnad av lägre isoleringsprestanda.
Ingen av dessa observationer är i sig själva motstridiga med de andra.
De beskriver helt enkelt olika egenskaper hos produkten eller olika faser av processen.
Därför har uttrycket „mätningen var komplett” betydligt större värde om man också vet vilken analysmetod som användes och vad som exakt mättes.
Svåra substrat avslöjar olika begränsningar i processen
Alla peptidsammanhållningsreaktioner är inte lika komplicerade kemiskt.
En starkt överbelastad reaktiv plats kan sakta ner bindningsprocessen, eftersom de reagerande grupperna har svårt att nå varandra.
Svag löslighet kan begränsa den effektiva kontakten mellan reaktionskomponenterna.
I syntesen i fast fas kan en växande peptidkedja interagera med angränsande kedjor eller ta till sig strukturer som begränsar tillgången till reaktiva platser, även om bindningsmedlen är närvarande i överflöd.
Dessa problem har olika kemiska orsaker.
Man kan därför inte utgå från att en lösning automatiskt kommer att vara effektiv i alla fall.
Studier som jämförde repetitiva ligeringstrategier för svåra peptidskedjor analyserade det faktiska innehållet i de erhållna råprodukterna i stället för att endast basera bedömningen på den teoretiska reaktiviteten eller ryktet kring de enskilda reagenserna. En av de studerade strategierna fungerade bra i de analyserade modellerna, men detta betyder inte att det finns en universell lösning som passar alla peptidskedjor.
Det viktigaste slutsatsen är att metodens effektivitet bör bedömas utifrån produkten som erhålls från ett visst substrat, och inte enbart utifrån reputationen hos det använda reagenset.
Aktivering av karboxylgruppen
Varför är aktivering vanligtvis nödvändig?
Enbart blandning av omodifierat karboxylsyra med en aminosyra under normala förhållanden leder vanligtvis inte effektivt till bildandet av en ren peptidbindning.
Istället kan syra-bas-reaktioner inträffa, och effektiv bildning av amidbindning kräver en lämplig kemisk väg.
Av den anledningen omfattar kopplingen av peptider vanligtvis aktivering av en komponent som innehåller en karboxylgrupp.
Aktivering ökar dess känslighet för reaktion med en lämplig amingrupp. Ett lämpligt reaktionsmiljö och en lämplig avlägsnande grupp underlättar bildningen av det nya amidbindningen.
En aktiverad intermediärprodukt kan endast existera under en kort period och behöver inte isoleras.
Målet är dock inte att uppnå maximal möjlig kemisk reaktivitet.
Syftet är en kontrollerad reaktivitet.
En aktiverad intermediär som reagerar mycket snabbt med vatten, med andra oönskade nukleofiler eller deltar i en konkurrerande reaktion, kan snabbt försvinna samtidigt som det leder till att en relativt liten mängd av det avsedda peptidet bildas.
En hög reaktivitet är därför endast fördelaktig när den kan riktas korrekt för att skapa det önskade bindningsresultatet.
Bindemedel och tillsatser har olika funktioner
Vid sammanfogningen av peptider kan flera typer av kemiska föreningar vara involverade som utför olika funktioner.
Karbodiimider utgör en av familjerna av reagenser som används för att aktivera karboxylgrupperna.
Andra kopplingssystem använder andra aktiveringsmekanismer, inklusive ofta förekommande ioniska reagenser som system baserade på HATU.
Extra föreningar kan fungera som tillsatser.
Begreppet „additiv” betyder dock inte att det givna ämnet är kemiskt obetydligt. Additiv kan påverka mellanprodukter, bindningseffektivitet, konkurrerande reaktionsvägar och stereokemiska resultat.
Studier av Oxyma vid syntesen av peptider med deltagande av karbodiimider analyserade både bindningseffektiviteten och begränsningen av racemisation i utvalda modeller.
Sådana data är värdefulla för de undersökta systemen och de specifika modellerna.
Det betyder dock inte att användningen av samma förening i varje möjliga peptidsammansättning ger samma resultat.
Senare studier med Oxyma-B jämförde resultaten av optisk renhet för flera olika modellpeptider.
Studie av många substrat är särskilt viktig eftersom mycket goda resultat vid lätt kemiskt bindning inte nödvändigtvis förutsätter att reaktantens beteende är koncentrerat, aggregationsbenäget eller stereokemiskt känsligt.
Vad betyder HATU i peptidsyntesen?
HATU är ett bindemedel som används för att underlätta bildandet av amidbindningar, inklusive vid syntesen av peptider.
HATU är inte ett peptid.
Det är inte heller en skyddsgrupp.
Enbart hans närvaro är inte bevis på att bindningen är avslutad eller att den erhållna peptiden är ren.
Effektiviteten beror på substratets typ, de andra reagenserna, lösningsmedelsystemet samt det bredare sammanhanget av reaktionsförhållanden.
Studierna av aggregationskänsliga sekvenser jämförde bland annat metoder baserade på HATU med systemen Oxyma/karbodiimid under förhållanden med upprepad kondensation.
Det visar på varför sökningar som „HATU peptide” ska förstås som frågor om bindningskemien och valet av metod, och inte som bevis för att en särskild reaktant utgör en universell metod för syntes av peptider.
Endast namnet på reaktanten räcker inte till för att återge eller korrekt tolka det publicerade resultatet.
Betydelsen har också reaktionsförhållanden, peptidssekvensen samt sättet att analysera framgången av processen.
Aktivering och stereokontroll kräver balans
Att behålla den aktiverade derivaten av ett aminosyra i reaktionssystemet under längre tid är inte alltid fördelaktigt.
Den önskade bindningsreaktionen inträffar vid sidan av andra möjliga kemiska processer.
Vissa konkurrerande rutter kan ändra stereotyperna.
Experimentella studier av säkrade epimeryka-produkter undersökte effekten av kombinationer av aminosyror, lösningsmedel och andra reaktionskomponenter på de stereokemiska förändringar som inträffar vid kondensation med karbodiimidar.
Det visar på en viktig princip: hela reaktionsmiljön kan vara lika viktig som den övergripande familjen av användade bindningsreaktiva ämnen.
Strategin för bindning måste därför ge tillräcklig reaktivitet för att skapa det önskade bindningsresultatet, samtidigt som möjligheten att uppstå oönskade reaktioner begränsas.
Disse reglerna kan diskuteras i utbildningssyfte utan att de konverteras till en färdig laboratorieprotokoll. Den exakta mängden reagenser, ordningen för tillsatsen och reaktionsförhållandena beror på den specifika syntesprocess som utvecklas.
Rolletilldelning för skyddsgrupper
Säkerhetsåtgärder minskar konkurrerande svarstider
En aminosyra kan innehålla fler reaktiva grupper än bara aminsyran och karboxylgruppen som behövs för att skapa en peptidisk kedja.
Dess sidofläkt kan innehålla ytterligare reaktiva kemiska grupper.
Om alla potentiellt reaktiva grupper förblev öppna under varje fas av bindningen, skulle den avsedda bildningen av peptidsammanhållning kunna konkurrera med spridning eller andra oönskade reaktioner.
En strategi som använder skyddsgrupper gör det möjligt att tillfälligt maskera utvalda reaktionsplatser.
På så sätt kan lämpliga aminosyror och karboxylgrupper reagera med varandra, medan andra platser förblir otillgängliga eller tillräckligt svaga för reaktion vid de givna förhållandena.
Skyddet ger därför kemisk selektivitet.
En effektiv strategi bygger dock inte bara på att koppla samman en kemiskt stabil grupp.
Skyddsgruppen måste också tas bort senare.
En säkerhetsmekanism som effektivt förhindrar oönskade reaktioner vid kondensation, men som inte kan avlägsnas senare utan att den målmolekyl som ska kondenseras skadas, skapar ytterligare en syntetisk problematik.
En fullständig strategi måste alltså ta hänsyn till både stabiliteten under den period då skydd krävs och möjligheten att selektivt ta bort skyddet när det inte längre behövs.
Midlertidiga och långvariga säkerheter har olika funktioner
Enskilda skyddsgrupper kan vara kvar på enheten under olika tidsperioder.
I en typisk synteseprocess vid fast fas använder man en Fmoc-bindning av den slutliga aminosyregruppen i den växande kedjan, som avlägsnas flera gånger när sekvensen förlängs.
Många grupper av sidovävslänor kvarstår emellertid kvar under många sammanlänkningscykler och avlägsnas först på ett senare stadium.
Standardmetoder baserade på Fmoc visar hur de återkommande cyklerna av selektiv borttagning av bindningar och kondensationer koordineras.
Den typ av protektion som krävs för en specifik sidorande kedja beror på resten av aminosyran, hela peptidet och den valda syntesstrategin.
Det skulle alltså inte vara korrekt att säga att varje aminosyra kräver samma skydd eller att alla synteser använder sig av samma skyddsgrupper.
Interimskyddsgrupper bör också särskiljas från kemiska grupper som avsiktligt förblir i den färdiga peptiden.
En planerad modifiering av den N-terminala eller amidgruppen på C-änden kan till exempel utgöra en del av den slutliga strukturen.
En temporär skyddsgrupp som av misstag kvarstod i den slutliga föreningen skulle däremot innebära en oönskad strukturell skillnad.
Ortogonalitet är ett krav på kemisk överensstämmelse
Ortogonal skydd innebär en strategi där utvalda skyddsgrupper kan avlägsnas, samtidigt som andra säkerhetsåtgärder i tillräcklig utsträckning förblir oförändrade.
Detta gör det möjligt att avslöja olika reaktiva platser vid avsedda stadier av syntesen.
Ortogonalitet bör inte endast förstås som en egenskap hos en enskild aktiva substans som anges på etiketten.
Den beskriver överensstämmelsen mellan hela den planerade sekvensen av kemiska operationer.
Den avsedda borttagningen av bindningen bör ske utan att orsaka oacceptabla förändringar i andra delar av det växande peptidet.
I en fast fas-syntes kan denna överensstämmelse även omfatta bärare-kopplingssystemet samt onormala eller särskilt kemiskt känsliga byggblock.
Studier av aspartimidbildning, där säkerhetsmekanismerna för sidorande kedjor och skelettet i ett modellpeptid modifierades, visade skillnader i bildningen av biprodukter.
Det visar att valet av säkerhetsåtgärd kan påverka inte bara uppkomsten av den uppenbara sidoriktningen av kedjan.
Det kan också ändra andra vägar för föroreningarnas bildning under syntesen.
Skyddsgrupper gör inte att alla sekvenser beter sig på samma sätt
Även om två sekvenser innehåller samma potentiellt problematiska aminosyra, behöver de inte vara identiska.
Omgivande faktorer kan påverka sannolikheten för att konkurrerande reaktioner ska uppstå.
Systematiska studier av modellsekvenser som innehöll aspartin visade att aminosyran efter denna rest bidrog till bildningen av aspartimidrelaterade produkter under de studerade förhållandena.
Det betyder inte att varje sekvens som innehåller en sådan motiv måste orsaka problem.
Det visar dock att sammanhanget kring sekvensen bör beaktas vid utarbetandet av metoden och riskanalysen.
En säkerhetsstrategi som visat sig fungera i ett specifikt peptid garanterar inte samma beteende hos alla andra peptider som innehåller samma rest.
Rasifiering och andra biverkningar
Racemization och epimerization gäller den rumsliga strukturen hos en molekyl
Många aminosyror har ett stereoisotopiskt centrum.
En ändring av konfigurationen hos ett sådant centrum kan leda till att en annan molekyl bildas strukturellt sett, även om dess grundämnesammansättning och molekylmassa förblir oförändrade.
Rent tekniskt innebär racemisation att den enantiomeriska berikningen försvinner i riktning mot en racemisk blandning.
I ett peptid som innehåller många stereoisomeriska centra leder omvändningen av konfigurationen av ett specifikt centrum vanligtvis till bildandet av en epimer, vilket är en typ av diastereoisomer.
I litteraturen om peptidsyntes används dock termen „racemization” ofta i vidare bemärkelse för oönskade konformationer som uppstår under bindning eller andra faser av syntesen.
Denna skillnad är viktig eftersom peptids identitet inte bara beror på vilka atomer som finns i molekylen.
Dessutom är deras rumsliga fördelning viktig.
Inte alla aminosyror har samma risk för stereokemiska effekter.
Glycin har till exempel inte den typiska kiraliska alfa-kolatomen som finns i de flesta aminosyrorna.
De övriga resterna skiljer sig åt i sin känslighet för konfigurationsändringar beroende på sin struktur och reaktionsmiljö.
En korrekt massa kan åtföljas av en felaktig stereokemi
Epimerytisk peptid kan ha exakt samma molekylmassa som det målpeptid.
Därför visar observationen av den förväntade massan med hjälp av masspektrometri automatiskt inte att varje aminosyrareservo inte behöll sin avsedda stereokemiska konfiguration.
Kromatografiska analyser möjliggjorde separering av säkrade epimerya proteiner och användningen av dessa separeringar för att analysera stereokemiska förändringar relaterade till bindningskemien.
Enligt den specifika substansen kan en korrekt stereokemisk analys kräva lämpliga kromatografimetoder, referensämnen, derivatiseringsstrategier eller andra analytiska metoder som kan skilja mellan relevanta strukturer.
Enskilda analytiska studier analyserade också de stereokemiska förändringar som inträffar vid anslutning av aminosyror till fasta bärare.
Det leder till ytterligare en viktig slutsats: föroreningen som upptäckts i den färdiga peptiden behöver inte komma från den senaste bindningsreaktionen.
Det kunde ha uppstått tidigare i processen och kvarstå när syntesen fortsatte.
Syntesen av aspartimid är ett separat problem
Syntesen av aspartimid är en specifik sidoredögningsväg som är kopplad till utsatta peptidsatser som innehåller aspartin.
Processen omfattar skapandet av en cyklisk mellanprodukt, från vilken olika närbesläktade strukturer kan bildas.
De kan omfatta modifierade sammanhang inom peptidskelettet samt stereokemiska varianter.
Aspartimidbildning bör alltså inte beskrivas som en annan benämning på icke fullständig kondensation.
En peptidkedja kan redan innehålla de rätta aminosyrorna, och en senare reaktion kan modifiera en del av dess struktur.
Experimentella studier visar att strategier för skydd, närliggande restsubstanser och återkommande förhållanden kopplade till borttagning av skyddsgrupper kan påverka denna process.
Denna distinktion är särskilt viktig vid tolkning av problem som uppstår vid syntes.
Enbart att upprepa kondensationen eller tillsätta mer konditionerande medel kommer inte automatiskt att reparera den förorening som uppstått genom en helt annan kemisk väg.
Ofullständiga reaktioner leder till andra typer av problem
Olämplig sammanfogning skapar en separat kategori av föroreningar.
Om en kedja av proteiner som är bundna till ett protein inte får in det planerade aminosyran, men reagerar korrekt under en senare cykel, kan den bildade peptiden vara utan den resterande aminosyran.
Sådan en molekyl kallas vanligtvis för en deleterande sekvens.
Andra kedjor kan sluta att förlängas och förbli kortade.
Dessa produkter skiljer sig i princip från epimererna.
Epimer kan ha en korrekt aminosyresekvens och en sammansatt struktur, men en felaktig stereokemi för ett centrum.
Peptiddelegation har däremot en annan sekvens eller längd.
Vissa syntesstrategier använder så kallad capping för att förhindra ytterligare förlängning av vissa icke-reagerade kedjor.
Men capping reparerar inte det felaktiga kedjan och omvandlar det inte till den önskade peptiden.
Det ändrar bara dess beteende under de följande stegen.
Den råa blandningen som erhålls vid syntesen kan därför innehålla produkter som uppstår genom flera olika mekanismer.
En samlad prestandavärdering gör det inte möjligt att fastslå vilka mekanismer för föroreningarnas uppkomst som var ansvariga för det slutliga resultatet.
Temperaturen och processförhållandena påverkar kompromissen mellan hastighet och kvalitet
En temperaturhöjning eller andra metoder för att påskynda syntesen kan öka hastigheten på de önskade reaktionerna.
Samtidigt kan de dock påskynda de oönskade reaktionerna.
Studier av SPPS med mikrovågsstöd analyserade racemisationen och bildningen av aspartimid i modellsystem och visade att den beroende av resttypens känslighet var relevant under de använda förhållandena.
Detta betyder inte att upphettning per definition är felaktig vid syntesen av peptider.
Det betyder inte heller att lägre temperatur alltid är bättre.
Den viktigaste principen är: Hastigheten i processen och den kemiska kvaliteten ska bedömas samtidigt.
Högre temperatur, längre exponering eller flera processer kan påverka både den önskade bildningen av bindningar och konkurrerande reaktioner.
En lämplig kompromiss bör därför utvärderas experimentellt för en specifik sekvens.
Modifikationer av den slutliga produkten kan också inträffa redan efter själva sammanfogningen har avslutats.
Studier som jämförde olika scavengery vid avlägsnande av peptider från gelen visade olika föroreningsprofiler.
Detta påminner om att den slutliga föroreningen inte automatiskt ska hänföras till sambandssammansättningsreaktionen.
Peptidsyntesen är en multipelprocess, och senare avblockering, avskiljande och ytterligare bearbetning kan ändra materialet som tidigare byggdes korrekt.
Hur bedöms sammanslagningens effektivitet?
Testen som utförs under processen svarar bara på vissa frågor.
Under syntesen i fast fas kan ett test för att upptäcka andra tillgängliga aminosyregrupper hjälpa till att bedöma om acyleringen inte genomfördes helt.
Sådana tester kan vara mycket användbara.
Deras tolkning bör dock begränsas till det kemiska frågetecknet, som den tillämpliga metoden faktiskt kan besvara.
Beroende på analysmetoden och typen av aminosyra kan test som baseras på färgförändring reagera olika på olika aminer.
Tillgängligheten av det undersökta området är också viktig.
En reaktiv aminosubstansgrupp, till vilken testmedlet fysiskt har svårt att nå, är inte densamma som en aminosubstansgrupp som genomförde reaktionen korrekt – även om den aktuella testmetoden inte kan skilja dessa situationer klart och tydligt.
Begränsningar kan därför omfatta tillgängligheten av den reaktiva platsen, känsligheten hos testet, kemiska interferenser samt typen av den identifierade funktionella gruppen.
Resultatet från ett test som utfördes under processen får inte automatiskt tolkas som bevis för att hela peptidet har rätt sekvens, stereokemi och renhet.
Processövervakning är mest värdefullt när resultaten kan kombineras med analys av det faktiska peptidhjälpmedlet.
Kromatografi delar upp, och masspektrometri hjälper till att karakterisera komponenterna.
Kromatografi och masspektrometri ger kompletterande information.
Kromatografi kan separera komponenterna i provet och visa närvaro av fler än en identifierbar komponent.
Massspektrometri kan ge information om molekylmassa och hjälpa till att karakterisera eller identifiera de olika komponenterna.
Forskningar som kombinerade båda metoderna gjorde det möjligt att analysera råprodukterna från peptidsyntesen i fasta faser och få information om deras identitet samt graden av borttagning av skyddsgrupperna.
Kombinationen av båda metoderna ger vanligtvis mer information än antagandet att varje kromatografisk punkt redan har identifierats eller att varje upptäckt massa motsvarar en ren och strukturellt komplett fraktion.
Det finns dock fortfarande vissa begränsningar.
Olika komponenter kan samverka, vilket innebär att de inte helt separeras genom kromatografi.
Enskilda ämnen kan också ge olika respons från detektorn.
Strukturella isomerer och stereoisomerer kan kräva användning av ytterligare analytiska metoder.
Av samma anledning innebär det faktum att peptidet har testats med HPLC-metoden inte automatiskt att alla relevanta föroreningar har identifierats.
Den specifika HPLC-metodens användbarhet beror på den faktiska uppnådda avdelningen samt på den analytiska frågan som den ska besvara.
Det bör förklaras hur resultatet beräknades.
Den procentuella värden som anges för peptidsammansättningen kan betyda flera helt olika saker.
Det kan avse omvandlingen av utgångsmaterialet, den relativa ytan på den kromatografiska toppytan, den uppmätta halten av det slutliga produkten, den råproduktens kapacitet eller den isolerade produktens kapacitet.
Att bara ange ett nummer utan att förklara vad det gäller kan därför skapa intrycket av stor precision.
Hållbara jämförelser bör specificera substratet, den analyserade fasen av bindningen, den analysmetod som använts, provtagningspunkten samt typerna av föroreningar som undersöks.
Om upprepad kombination har använts, bör detta också beaktas.
Slutresultatet efter två kopplingar behöver inte spegla vad som hände under den första reaktionen.
En liknande försiktighet krävs när det gäller detektionsgränserna för analytiska metoder.
Uttrycket „inte påvisad” betyder att den aktuella substansen inte har påvisats under de angivna förhållandena och med de begränsningar som tillämpades vid metoden.
Det bör inte automatiskt betraktas som ett absolut påstående att det inte finns någon förorening alls.
Data om reaktant bör omfatta mer än en enkel modell
En bindningsreagens som fungerar exceptionellt bra i en enkel modellreaktion kan bete sig annorlunda för en aminosyra med en stor stereokemisk tätning, en känslig stereokemisk centrum, ett svagt lösligt substrat eller en peptidkedja som är känslig för aggregering.
Studier som jämför Oxyma-B med flera olika modellpeptider visar varför en bedömning av bindningskemikalien på mer än ett substrat är värdefull.
Slutligen bör en användbar metod för kondensation leda till att den önskade strukturen uppnås med en acceptabel föroreningsprofil och ett återkommande resultat för den önskade syntesen.
Av den anledningen kan effektiviteten av bindning bättre förstås som en samling av olika mätningar än som en egenskap som beskrivs genom namnet på en enskild reagens eller resultatet av ett test av substratets försvinnande.
Vanliga frågor och svar
1. Varför behövs skyddsgrupper vid syntesen av peptider?
Skyddsgrupper begränsar temporärt oönskade reaktioner, vilket gör att de rätta funktionella grupperna kan skapa den önskade peptidsammanfogningen. Aminosyrer kan innehålla flera reaktiva platser och att låta alla samtidigt vara tillgängliga kan leda till konkurrerande reaktioner. En effektiv säkerhetsstrategi måste också ta hänsyn till möjligheten att senare avlägsna skyddsgrupperna och deras överensstämmelse med den återstående delen av molekylen. Modellstudier visar att valet av skyddsgrupper kan påverka inte bara reaktionsgrundläggande selektivitet utan också biprodukternas bildning. Skyddsgruppen är alltså en del av en hel syntesestrategi och inte en universell lösning på alla kemiska problem.
2. Kan en felaktig kombination fortfarande leda till förorening?
Ja. Avsedd peptidbindning kan uppstå medan andra partiklar i samma blandning genomgår partiell konvertering eller oönskade bieffekter. Detta är särskilt tydligt när det gäller epimerya produkter, eftersom bildandet av den rätta bindningen och upprätthållandet av den rätta stereokemien är separata frågor. Detektering av det önskade peptidet betyder alltså inte att det är det enda närvarande produkten. En vetenskapligt motiverad bedömning av bindningsframgång kräver en definierad slutpunkt för analysen och information om relevanta föroreningar.
3. Är peptidsammansättningen detsamma som hela peptidsyntesen?
Nej. Kombinering är en enskild process för att skapa en bindning inom ramen för en mycket bredare syntesprocess. Syntesen på den fasta fasen kan även inkludera anslutning till bärare, säkring, borttagning av skyddsgrupper, flöden flera gånger, avlägsnande, bearbetning, rening och slutlig karakterisering. Eftersom oönskade produkter kan uppstå även utanför kombinationsfasen, bör den slutliga föroreningen inte automatiskt hänföras till felaktig kombination utan data som visar på dess faktiska ursprung.
4. Varför aktiveras karboxylgruppen?
Aktivering av karboxylgruppen skapar en mer fördelaktig väg för dess reaktion med en lämplig amingrupp, vilket underlättar bildningen av amidbindningen. Ökad reaktivitet kan dock också möjliggöra konkurrerande reaktioner. Därför undersöks inte bara effektiviteten vid bildning av bindningen i samband med bedömningen av bindningssystemen, utan även stereokemiska effekter och bildning av biprodukter. Målet med aktivering är inte att maximera reaktionsaktiviteten hos en molekyl utan att uppnå lämplig selektivitet för reaktionen.
5. Vad används HATU till?
HATU är en bindningsmedicin som används för att underlätta bildandet av amidbindningar, inklusive vid bindning av peptider. Det är varken ett peptid eller en protektör. Sammanlänkande studier av svåra peptidsatser visar att metoder som använder HATU bör bedömas i sin fulla kontext av reaktionsförhållandena. Bara informationen om att HATU användes bekräftar inte en fullständig konvertering, stereokemisk stabilitet eller bättre föroreningsprofil.
6. Finns det en optimal reagens för att koppla ihop peptider?
Nej. Det finns ingen universell ranking av reagenser som är lämpliga för varje peptid och varje reaktion. Styrkeförlust, substratets löslighet, aggregering, stereokemisk känslighet och sekvensens sammanhang kan påverka resultatet. Valet av reagens bör därför baseras på mätresultaten för den specifika reaktionen och inte enbart på dess renommé eller popularitet.
7. Betecknar „bindningsmedel” och „tillägg” samma sak?
Nej. Dessa termer kan beskriva olika funktioner i sambandssystemet. En kopplingsmedlet kan direkt delta i aktiveringen, medan en tillsats kan påverka bildandet av mellanprodukter, reaktionshastigheten, den stereokemiska integriteten eller konkurrerande kemiska vägar. Därför bör hela reaktionssystemet analyseras, och inte alla dess komponenter betraktas som utbytbara substitut.
8. Kan peptidhjälpsterapi användas för att behandla hela peptidhjälpsterapi för att behandla hela peptidhjälpsterapi i stället för enskilda aminosyror?
Ja. Reagensreaktionen kan kombinera större, skyddade peptidhuvuden, och inte bara enskilda aminosyror. En ökning av reaktionsmedlens storlek eliminerar dock inte behovet av att kontrollera reaktionsplatsens selektivitet, stereokemi eller den slutliga produkts egenskaper. Vid reaktion av fragment krävs fortfarande data som bekräftar att den korrekta kombinationen verkligen har uppstått på rätt sätt.
9. Vad är skillnaden mellan rasematisering och epimerytisation?
Racetisering i strikt bemärkelse innebär förlusten av enantiomerisk koncentration mot en racemisk blandning, medan epimerisering innebär en förändring av konfigurationen av ett stereogent centrum i en molekyl som innehåller många sådana centrum. I litteraturen om peptidsyntes används termen racemisering ofta i en mer bred bemärkelse för att beskriva oönskade förändringar i konfigurationen av aminosyrorna. Därför bör den exakta termen motsvara den faktiska strukturella förändringen.
10. Kan massspectrometri upptäcka alla stereokemiska fel?
Nej. Stereoisomerer kan ha exakt samma molekylmassa. Att uppnå den förväntade massan bekräftar därför inte den korrekta konfigurationen av varje stereogent centrum. Ytterligare metoder, till exempel lämpliga kromatografiska tekniker eller derivatiseringsstrategier, kan behövas för att bedöma sådana skillnader. Massspektrometri är fortfarande ett oerhört användbart verktyg för att karakterisera molekyler, men resultaten bör tolkas med hänsyn till begränsningarna för det specifika strukturella frågestället.
11. Betyder bildandet av aspartimid bara en misslyckad bindning?
Nej. Syntesen av aspartimid är en separat biverkningsväg som är kopplad till utsatta sekvenser som innehåller aspartin. Nära belägna restriktioner och villkor för borttagning av skyddsgrupper kan påverka dess förekomst. En oönskad strukturell förändring kan därför uppstå även när den relevanta aminosyran har kopplats korrekt in. Det är viktigt att fastslå föroreningens ursprung eftersom upprepade bindningar inte nödvändigtvis löser problemet som uppstår genom en helt annan väg för reaktionen.
12. Ger upprepad binding garantier för att reaktionen ska lyckas?
Nej. En upprepad kondensation kan i vissa fall förbättra konverteringen, men den garanterar inte att alla reaktiva platser blir tillgängliga eller att andra biverkningar elimineras. Resultatet beror fortfarande på substratet och den använda metoden. Analys av produkten är därför nödvändig för att fastslå vad som verkligen gav ytterligare kondensation.
13. Förbättrar högre temperatur alltid kvaliteten på sammanslagningen?
Nej. En temperaturhöjning kan påskynda den önskade reaktionen, men den kan också påskynda oönskade kemiska processer. En snabbare omvandling bör därför inte automatiskt tolkas som en förbättring av den kemiska kvaliteten. Temperaturen måste bedömas både utifrån produktens slutliga form och utifrån profilen för de föroreningar som bildas.
14. Bekräftar avsaknaden av den fria aminogruppen uppkomsten av en korrekt peptid?
Nej. Bristen på en identifierbar fri aminosyregrupp motsvarar en mycket mer begränsad fråga om en viss funktionell grupp under de villkor som används i testet. Den bekräftar inte självständig sekvensering av peptidet, dess stereokemi eller renhet. Övervakning av fria aminosyregrupper kan vara ett användbart verktyg för processkontroll, men ersätter inte den slutliga karakteriseringen av produkten.
15. Är HPLC-renheten detsamma som ihopkopplingsprestandan?
Nej. HPLC-renhet och effektivitet beskriver olika egenskaper. HPLC-renhet är beroende av metoden för att beskriva sammansättningen av de identifierade komponenterna i provet, medan effektivitet hänför sig till mängden av den specificerade produkten som erhålls i förhållande till den definierade mängden av den ursprungliga materialen. Rengöring kan öka den kromatografiska renheten samtidigt som mängden av det återvunna slutprodukten minskar. Därför har procentandelen liten betydelse om inte exakt anges vad som representeras.
16. Kan föroreningar uppstå redan efter att sammanfogningen är avslutad?
Ja. Efter att bindningsreaktionen har avslutats omfattar peptidens syntes ytterligare kemiska steg. Borttagning av skyddsgrupper, avblockering och vidare behandling kan modifiera molekylen eller leda till uppkomsten av ytterligare föroreningar. Det betyder inte att varje slutlig förorening uppstår under senare steg, men det visar varför korrekt bindning inte är en garanti för kvaliteten på den slutliga produkten.
17. Vad gör att jämförelsen av sammansättningsmetoder är trovärdig?
En trovärdig jämförelse bör bedöma alternativa metoder för samma tydligt definierade mål och under tillräckligt jämförbara förhållanden. Den bör ange vilka substrat som används, vilken provtagningsmetod och vilka analysmetoder samt vilka typer av föroreningar som bedöms, i stället för att presentera en oklargjord procentuell värdering eller bygga på referenspreparatets renommé. Jämförelser som omfattar flera olika modellpeptider kan ge mer information än en enskild hög prestanda för ett enkelt substrat, eftersom de visar hur effektiviteten förändras i en molekylär kontext. Även då bör slutsatserna vara begränsade till faktiskt undersökta kemiska system.
Sammanfattning
Peptidbindning är den grundläggande processen i kemisk peptidsyntes eftersom den leder till bildandet av amidbindningar som binder aminosyrorna i peptidskelettet. Att beskriva bindning endast som „förenande av två aminosyror” bortser dock från en betydande del av kemin som avgör om den erhållna produkten verkligen är den avsedda peptiden.
En komponent som innehåller en karboxylgrupp kräver vanligtvis aktivering för att den effektivt ska kunna bilda en amidbindning. Bindningsmedel och tillsatser kan underlätta denna process, men deras effektivitet beror på substratet, reaktionsmiljön och sättet att analysera resultatet. Därför bör reaktanten analyseras inom ramen för ett fullständigt experimentellt sammanhang och inte klassificeras oberoende av det syntetiserade peptidet.
Skyddsgrupper ger ytterligare kontroll genom att tillfälligt förhindra oönskade funktionella grupper från att delta i reaktionen. Deras användbarhet beror inte bara på effektiv säkerhetsåtgärder, utan också på möjligheten att selektivt avlägsna dem och överensstämma med följande faser av syntesen. Skyddstrategin och de närliggande rester av aminosyror kan också påverka bildningen av vissa biverkningar.
Stereokemisk integritet utgör ytterligare en viktig faktor. Bindningsreaktionen kan leda till bildandet av en amidbindning samtidigt som epimeryt genereras. Eftersom epimeryt kan ha samma molekylvikt som den egentliga peptiden, bekräftar själva massan inte fullständig strukturell korrekthet. Ändringar i konfigurationen kan också uppstå på andra stadier, såsom den initiala kopplingen av aminosyran till den fasta fasen.
Andra föroreningar uppstår genom olika mekanismer. Ofullständig bindning kan leda till uppkomsten av deleterande eller förkortade sekvenser, medan reaktioner relaterade till aspartimid kan modifiera ett peptid som redan innehåller de rätta aminosyresubstanserna. En påskyndning av processen kan påverka både önskade reaktioner och sidoruter, och ytterligare föroreningar kan också uppstå under senare steg, såsom avskiljning.
Av dessa skäl kräver bedömningen av peptidsammansättningen mer än att fastslå om utgångsmaterialet har försvunnit.
Konvertering, framställning av det slutliga produkten, isolerad produktionskapacitet, kromatografisk renhet och stereokemisk renhet besvarar olika frågor.
Test som utförs under syntesen kan hjälpa till att upptäcka ofullständiga reaktioner, men de bekräftar inte själva peptids fullständiga struktur. Kromatografi och masspektrometri ger kompletterande information, medan frågor om stereokemi eller mycket liknande strukturer kan kräva ytterligare analytiska metoder.
Den mest välgrundade metoden för att koppla ihop peptider är därför inriktad på en specifik molekyl och baserad på data.
Den användbara metoden för kondensation är inte helt enkelt en metod som använder den mest välkända eller mest reaktiva reaktant. Det är en metod som på ett konsekvent sätt leder till att det önskade molekylära bindningsförhållandet uppnås, samtidigt som den tillämpliga stereokemiska integriteten och kontrollen av relevanta föroreningar för den specifika syntetiserade peptiden bibehålls.
Referenser
- Subirós-Funosas, R., Prohens, R., Barbas, R., El-Faham, A., & Albericio, F. (2009). Oxyma: En effektiv tillsats för peptidsyntes för att ersätta HOBt och HOAt baserade på benzotriazol med lägre risk för explosion. Kemi—A European Journal, 15(37), 9394–9403. https://doi.org/10.1002/chem.200900614
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Racemizationstudier i peptidsyntes genom separation av skyddade epimeriska peptider med hjälp av omvänd högpresterande flytande kromatografi. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Utvärdering av kombinerad användning av Oxyma och HATU för att sammanställa peptidsammansättningar. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Jad, Y. E., Khattab, S. N., de la Torre, B. G., Govender, T., Kruger, H. G., El-Faham, A., & Albericio, F. (2014). Oxyma-B, en utmärkt racemiseringshämmare för peptidsyntes. Organisk och biomolekylär kemi, 12(42), 8379–8385. https://doi.org/10.1039/c4ob01612b
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Peptidsyntes i fast fas: Från standardprocesser till syntesen av svåra sekvenser. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Aspartimideproblemet i Fmoc-baserade SPPS. Del I. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Asparimideproblemet i Fmoc-baserad SPPS. Del II. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Användning av Marfey-reagenset för att kvantifiera racemisering vid förankring av aminosyror på fasta bärrar för peptidsyntes. Analytisk biokemi, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Begränsning av racemisering och aspartimidbildning vid mikrovågsbehandlad Fmoc-fasta fas-peptidsyntes. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-benzenedimethanethiol (1,4-BDMT) som en rensare av grövre peptidhartsavskiljningar. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., & Pallai, P. (1991). Karakterisering av råprodukter från fastfas-peptidsyntes med mu-HPLC/fast atom bombardement masspektrometri. Peptide Research, 4(1), 40–46. PubMed