Het mengen van peptiden: reagentia, beschermende groepen en bijwerkingen

Het mengen van peptiden is een chemisch proces dat leidt tot de vorming van een binding tussen een bestanddeel dat een carboxylgroep bevat en een bestanddeel dat een aminozuurgroep bevat. Tijdens deze reactie ontstaat een amidbinding. Wanneer deze binding aminozuurresten tijdens de synthese van een peptide combineert, wordt deze onderdeel van wat wordt aangeduid als het peptide-structuurframe.

Reagerende componenten hoeven geen individuele aminozuren te zijn. De bindreactie kan een aminozuur met een ander verbinden, een volgende aminozuur aan de groeiende peptidenketen toevoegen of grotere fragmenten van peptiden die eerder afzonderlijk zijn gesynthetiseerd verbinden.

Op het eerste gezicht lijkt het samenstellen van peptiden een eenvoudig probleem: je moet alleen één aminozuur met het volgende verbinden.

Vanuit een chemisch perspectief is de vorming van een amidbinding echter slechts een deel van het geheel.

De verbinding moet ontstaan op de juiste plaats en met behoud van de juiste stereochemische configuratie, terwijl andere reactieve functionele groepen adequaat gecontroleerd moeten blijven. De reactie kan schijnbaar succesvol verlopen en de meeste of zelfs de volledige uitgangsmaterialen verbruiken, maar toch kan het leiden tot het ontstaan van een ongewenste mengeling van het eindproductpeptide en andere structuren.

Daarom betekenen het afsluiten van de reactie en het correct ontstaan van het product niet hetzelfde.

Onderzoek dat verschillende bindingenystemen vergelijkt, strategieën voor het beschermen van functionele groepen en stereochemische resultaten laten zien waarom er geen universeel beste bindingmiddel is, onafhankelijk van het type geproduceerd peptide.

Vanuit wetenschappelijk oogpunt is de vraag dus niet nuttiger:

„Welke koppelingstof is het beste?”

De betere vraag is:

„Welke aanpak maakt het mogelijk om de beoogde peptide te verkrijgen met de juiste conversie, behoud van stereochemische integriteit en een goede controle van de verontreinigingen onder omstandigheden die geschikt zijn voor de specifieke molecule?”

Deze onderscheiding is van fundamenteel belang voor het begrijpen van de chemie van de peptidebindingen.

Wat betekent het mengen van peptiden?

De synthese combineert twee componenten door het vormen van een nieuw binding.

In een typische reactie die leidt tot de vorming van een peptisch skelet, wordt de carboxylgroep die aan één aminozuurrest is gekoppeld, verbonden met de aminozuurgroep van de andere rest.

De gevormde verbinding is chemisch gezien een amidbinding.

Als deze binding de andere aminozuren in de peptydketen verbindt, wordt deze meestal als peptydbinding beschouwd.

De precieze fysieke plaatsing van de reactieve componenten hangt af van de gebruikte synthesestrategie.

Bij de synthese van peptiden op vaste fase is de ontsluitende aminogroep meestal onderdeel van de groeiende peptydketen die aan de vezel is gekoppeld, terwijl de component die een carboxygroep bevat afkomstig is van een geïntegreerd beschermd aminozuur.

In de synthese die in een oplossing plaatsvindt, kunnen beide bestanddelen echter in een vloeibare fase aanwezig zijn.

Bij het samenbrengen van fragmenten worden grotere, beschermde peptidssegmenten gebruikt in plaats van individuele aminozuurresten één voor één toe te voegen.

Verscheidene strategieën veranderen de manier waarop reacties worden uitgevoerd, de materialen worden verdeeld en gereinigd, maar elimineren niet het fundamentele chemische probleem: de juiste functionele groepen moeten met elkaar reageren, terwijl de ongewenste reacties in andere delen van de molecule voldoende beperkt moeten blijven.

Verbinding ontstaan, conversie en efficiëntie zijn verschillende begrippen.

Een aantal termen die vaak worden gebruikt bij het beschrijven van de koppeling van peptiden kunnen op elkaar lijken, hoewel ze verschillende onderwerpen betreffen.

De conversie bepaalt welke deel van het oorspronkelijke materiaal is gereageerd.

Maar het zegt niet automatisch wat er met dat materiaal is gebeurd.

Als 99% van het uitgangsmateriaal verdwijnt, maar een deel daarvan ongewenste bijproducten vormt, betekent een conversie van 99% niet dat er 99% gewenste peptiden zijn ontstaan.

De vorming van het eindproduct beantwoordt aan een ander vraagstuk: hoeveel van de beoogde moleculaire structuur is daadwerkelijk gevormd? Een antwoord daarop vereist een analytische methode waarmee het juiste product kan worden onderscheiden van relevante alternatieve structuren.

De isolerte productiviteit beschrijft de hoeveelheid van het specifieke product dat uiteindelijk is teruggewonnen in vergelijking met de gedefinieerde hoeveelheid van het oorspronkelijke materiaal. De uiteindelijke productiviteit kan dus ook worden beïnvloed door stappen zoals bewerking, verdeling en reiniging, zelfs als de samenstelling zelf efficiënt verliep.

Chromatografische zuiverheid beschrijft de verdeling van de bestanddelen die worden gedetecteerd onder de omstandigheden van een bepaalde chromatografische methode. Deze kan zeer waardevolle informatie over de samenstelling van het monster verschaffen, maar de interpretatie ervan kan worden beperkt door coelucatie, verschillen in de reactie van de detektor of het voorkomen van bestanddelen die door de betreffende methode slecht worden gedetecteerd.

De stereochemische zuiverheid beantwoordt echter de vraag of de beoogde ruimtelijke configuratie van de molecule is bewaard gebleven. Dit is een apart analytisch probleem, omdat sommige stereochemische varianten precies dezelfde moleculaire massa kunnen hebben als het eindproduct.

Deze verschillen helpen om de resultaten te begrijpen die op het eerste gezicht misschien tegenstrijdig lijken.

De reactie kan een hoge conversie van het uitgangsmateriaal opleveren, maar tegelijkertijd leiden tot het ontstaan van meerdere producten. Het ruwe preparaat kan een grote teruggewonnen massa hebben, maar bevat een aanzienlijke hoeveelheid verontreinigingen. Intensief reinigen kan echter leiden tot het verkrijgen van materiaal met een hoge zuiverheid ten koste van een lagere isolatieprestatie.

Nog geen van deze waarnemingen is per se in strijd met de andere.

Ze beschrijven gewoon verschillende eigenschappen van het product of verschillende fasen van het proces.

Daarom heeft de uitspraak „de meting was volledig” een veel grotere waarde als men ook weet welke analytische methode werd gebruikt en wat precies werd gemeten.

Veelzijdige substraten onthullen verschillende beperkingen van het proces

Niet elke reactie van het mengen van peptiden leidt tot dezelfde mate van chemische complexiteit.

Een sterk steroïde-geïnduceerd reactief gebied kan de vorming van de binding vertragen, omdat de reacterende groepen een beperkte toegang hebben tot elkaar.

Een lage oplosbaarheid kan de effectieve interactie tussen de bestanddelen van de reactie beperken.

In de constante fase-synthese kan een groeiend peptidenketen met andere ketens interageren of structuren vormen die de toegang tot reactieve plekken beperken, zelfs als bindende reactiemiddelen aanwezig zijn in een schijnvol overmaat.

Deze problemen hebben verschillende chemische onderliggende oorzaken.

Het kan dus niet worden aangenomen dat één oplossing automatisch effectief is in alle gevallen.

Studies die strategieën voor herhaalde koppeling vergelijken voor moeilijke peptidschermingen, analyseerden de werkelijke samenstelling van de verkregen ruwe producten in plaats van uitsluitend te vertrouwen op de theoretische reactiviteit of reputatie van de individuele reactiemiddelen. Een van de onderzochte strategieën presteerde goed in de onderzochte modellen, maar dit betekent niet dat er een universele oplossing bestaat die geschikt is voor elke peptidscherming.

De belangrijkste conclusie is dat de effectiviteit van de methode moet worden beoordeeld op basis van het product dat wordt verkregen uit een specifieke substrat, en niet alleen op basis van de reputatie van het gebruikte reactief.

Activatie van de carboxylgroep

Waarom is activering meestal nodig?

Alleen al het mengen van ongemodificeerd carboxyzuur met een aminozuur onder normale omstandigheden leidt meestal niet efficiënt tot het ontstaan van een zuiver peptisch binding.

In plaats daarvan kunnen zuur-base-interacties optreden, en het efficiënte vormen van amidibindingen vereist een geschikte chemische route.

Daarom omvat het mengen van peptiden meestal de activatie van een bestanddeel dat een carboxygroep bevat.

De activatie verhoogt de gevoeligheid van het peptide voor reactie met de juiste aminogroep. Een geschikte reactiefomgeving en de juiste afvalgroep vergemakkelijken de vorming van een nieuw amidbinding.

Een geactiveerd tussenproduct kan slechts voor een korte tijd bestaan en hoeft niet geïsoleerd te worden.

Het doel is echter niet om maximale chemische reactiviteit te bereiken.

Het doel is een gecontroleerde reactiviteit.

Een geactiveerd intermediair product dat zeer snel reageert met water, een ander ongewenst nucleofiel of deelneemt aan een competitieve reactie, kan snel verdwijnen, terwijl tegelijkertijd een relatief kleine hoeveelheid van het beoogde peptide wordt gevormd.

Een hoge reactiviteit is dus alleen gunstig wanneer deze op de juiste manier kan worden gericht op het ontstaan van de beoogde binding.

Verbindingsmiddelen en additieven vervullen verschillende functies

Bij de samenstelling van peptiden kunnen verschillende soorten chemische stoffen betrokken zijn die verschillende functies vervullen.

Carbodiimiden vormen een familie van reactieproducten die worden gebruikt om carboxygroepen te activeren.

Andere koppelingssystemen gebruiken andere activeringsmechanismen, waaronder vaak voorkomende ionische reactiemechanismen, zoals systemen die zijn gebaseerd op HATU.

Extra verbindingen kunnen als toevoegingen fungeren.

De term „additief” betekent echter niet dat een bepaalde verbinding chemisch onbelangrijk is. Een additief kan invloed hebben op tussenproducten, de efficiëntie van de reactie, concurrerende reactielijnen en stereochemische resultaten.

Onderzoek naar Oxyma in de synthese van peptiden met de aanwezigheid van carbodiimiden analyseerde zowel de effectiviteit van de binding als de beperking van racemisatie bij geselecteerde modellen.

Deze gegevens zijn waardevol voor de onderzochte systemen en specifieke modellen.

Dat betekent echter niet dat het gebruik van dezelfde verbinding in elke mogelijke combinatie van peptiden hetzelfde resultaat zal opleveren.

Later onderzoeken met Oxyma-B vergeleken de resultaten met betrekking tot de optische zuiverheid van verschillende modelpeptiden.

Het onderzoeken van veel substraten is bijzonder belangrijk, omdat zeer goede resultaten bij eenvoudig chemisch samenbrengen niet noodzakelijkerwijs een vooruitblik bieden op het gedrag van het reactief in een steroot belast omgeving, waar het gemakkelijk kan aggregeren of stereochemisch gevoelig is.

Wat betekent HATU in de synthese van peptiden?

HATU is een bindmiddel dat wordt gebruikt om het vormen van amidbindingen te vergemakkelijken, onder andere tijdens de synthese van peptiden.

HATU is geen peptide.

Het is ook geen beschermingsgroep.

Zijn aanwezigheid op zichzelf is geen bewijs dat de samenstelling is voltooid of dat het ontvangen peptide puur is.

De efficiëntie hangt af van het type substraat, de overige reactieonderdelen, het oplosmiddelsysteem en de bredere context van de reactievoorwaarden.

De studies naar aggregatie-gevoelige sequenties vergeleken onder andere benaderingen gebaseerd op HATU en Oxyma/carbodiimid in omstandigheden van herhaaldelijk mengen.

Dit laat zien waarom zoekopdrachten zoals „HATU peptide” moeten worden begrepen als vragen over de chemische binding en de keuze van de methode, en niet als bewijs dat één specifieke reactief een universele methode voor de synthese van peptiden is.

De naam van het reactiemiddel alleen is niet voldoende om de gepubliceerde resultaten te reproduceren of een juiste interpretatie ervan te geven.

Ook de reactievoorwaarden, de peptidssequentie en de manier waarop het succes van het proces analytisch wordt gedefinieerd, zijn van belang.

Activering en stereochemische controle vereisen een evenwichtige balans.

Het langer vasthouden van de geactiveerde afbraakproduct van een aminozuur in het reactiesysteem is niet altijd gunstig.

De gewenste koppeling vindt plaats naast andere mogelijke chemische processen.

Sommige concurrerende routes kunnen de stereotypevorming veranderen.

Experimentele studies naar beschermde epimere producten analyseerden de invloed van combinaties van aminozuren, oplosmiddel en andere reactiebestanddelen op de stereochemische veranderingen die optreden tijdens de samenstelling met de participatie van carbodiimiden.

Dit toont een belangrijk principe aan: de volledige reactieomgeving kan even belangrijk zijn als de algemene samenstelling van het gebruikte bindende reactief materiaal.

De samenwerkingsstrategie moet dus voldoende reactiviteit bieden om het gewenste bindingseffect te bereiken, terwijl tegelijkertijd de mogelijkheid wordt beperkt dat ongewenste reacties optreden.

Deze regels kunnen voor educatieve doeleinden worden besproken zonder dat ze worden omgezet in een klaarstaand laboratoriumprotocol. De juiste hoeveelheden reactiestoffen, de volgorde van toevoeging en de voorwaarden van de reactie zijn afhankelijk van het specifieke synthetiseringsproces dat wordt ontwikkeld.

De rol van de beschermende groepen

Beveiliging beperkt de beschikbare reactiemogelijkheden

Een aminozuur kan meer reactieve groepen bevatten dan alleen de amino- en carboxylgroepen die nodig zijn voor het vormen van het peptidhars.

Zijn zijketen kan extra reactieve chemische groepen bevatten.

Als alle potentieel reactieve groepen tijdens elke stap van de binding ontsloten zouden blijven, zou de beoogde vorming van een peptydverbinding kunnen concurreren met de verdeling of andere ongewenste reacties.

Een strategie waarbij beschermingsgroepen worden ingezet, maakt het voorlopig mogelijk om geselecteerde reactiegebieden te camoufleren.

Hierdoor kunnen de juiste amino- en carboxygroepen met elkaar reageren, terwijl andere plekken in deze omstandigheden ontoegankelijk of ontoereikend reactief blijven.

Bescherming biedt dus chemische selectiviteit.

Een effectieve strategie bestaat echter niet alleen uit het samenvoegen van een stabiel chemisch materiaal.

De beveiliging moet later ook worden verwijderd.

Een bescherming die ongewenste reacties tijdens het mengen effectief voorkomt, maar die later niet kan worden verwijderd zonder de doelmolecule te beschadigen, vormt een nieuw synthetisch probleem.

Een volledige strategie moet dus zowel rekening houden met de stabiliteit in de periode waarin bescherming nodig is als met de mogelijkheid om de beveiliging selectief te verwijderen wanneer deze niet langer nodig is.

Voorlopige en langdurige beschermingsmaatregelen vervullen verschillende functies

Afzonderlijke beschermingsgroepen kunnen gedurende verschillende perioden op de cel blijven.

In een typische synthese op vaste fase waarbij een Fmoc-bescherming van de uiteindelijke aminogroep van de groeiende keten wordt gebruikt, wordt deze herhaaldelijk verwijderd naarmate de sequentie langer wordt.

Veel groepen van beschermende zijkettingen blijven echter aanwezig gedurende talrijke cycli van samenvoeging en worden pas op een later tijdstip verwijderd.

Standaard methoden gebaseerd op Fmoc tonen hoe de repetitieve cycli van selectieve verwijdering van beschermingslagen en koppeling worden gecoördineerd.

De soort bescherming die nodig is voor een specifieke zijketen hangt af van de rest van de aminozuren, het volledige peptide en de gekozen synthesestrategie.

Het zou dus niet juist zijn om te beweren dat elke aminozuur hetzelfde beschermingsmechanisme nodig heeft of dat alle syntheses dezelfde beschermende groepen gebruiken.

De tijdelijke beschermende groepen moeten ook worden onderscheiden van chemische groepen die doelbewust in het geproduceerde peptide blijven.

Een geplande N-terminal of amid-groep op het C-eind kan bijvoorbeeld een onderdeel van de uiteindelijke structuur vormen.

Een tijdelijke beschermende groep die toevallig in het uiteindelijke geheel bleef, zou echter een ongewenste structurele discrepantie betekenen.

Ortogonaliteit is een vereiste voor de chemische compatibiliteit

Orthogonal beveiliging is een strategie waarbij geselecteerde beveiligingsgroepen kunnen worden verwijderd, waarbij andere beveiligingen voldoende intact blijven.

Dit maakt het mogelijk om verschillende reactiegebieden te ontdekken op speciaal geselecteerde fasen van de synthese.

Ortogonaliteit mag niet enkel worden begrepen als de eigenschap van een individueel ingrediënt die is vermeld op de etiket.

Daarin wordt de samenhang van de gehele geplande reeks chemische operaties beschreven.

De doelgerichte verwijdering van de bescherming moet plaatsvinden zonder dat onaanvaardbare veranderingen in andere delen van het groeiende peptide ontstaan.

In de vastefase-synthese kan deze overeenstemming ook betrekking hebben op het drager-connector-systeem en op atypische of bijzonder chemisch gevoelige bouwblokken.

Onderzoek naar de vorming van aspartimidie, waarbij de beschermingslagen van de zijketens en het skelet in een modelpeptide werden aangepast, toonde verschillen in de vorming van bijproducten aan.

Dit toont aan dat de keuze voor een bescherming niet alleen van invloed kan zijn op de manifestatie van een duidelijke zijketenreactie.

Het kan ook andere routes van de vorming van verontreinigingen tijdens de synthese veranderen.

Veiligheidsgroepen zorgen er niet voor dat alle sequenties hetzelfde gedragen zich.

Zelfs als de twee sequenties dezelfde potentieel problematische aminozuur bevatten, hoeven ze niet identiek te zijn.

De omliggende restanten kunnen een invloed hebben op de kans op het optreden van concurrentiegerelateerde reacties.

Strikt onderzoek van modelsequenties die asparagine bevatten toonde aan dat de aminozuursequentie na deze restgroep een invloed had op de vorming van aspartimiderelevante producten onder de onderzochte omstandigheden.

Dit betekent niet dat elke sequentie die zo'n thema bevat, problemen moet veroorzaken.

Het toont echter aan dat de context van de reeks moet worden meegenomen bij het ontwikkelen van de methode en bij het beoordelen van het risico.

Een beschermingsstrategie die bij één modelpeptide heeft gewerkt, garandeert niet hetzelfde gedrag bij elk ander peptide dat dezelfde restant bevat.

Rasvermeerdering en andere bijwerkingen

Racematisering en epimerisatie betreffen het ruimtelijke arrangement van de molecule

Veel restanten van aminozuren bevatten een stereocentrum.

Een verandering in de configuratie van een dergelijk centrum kan leiden tot de vorming van een ander structureel geheel, zelfs als de elementaire samenstelling en de moleculaire massa ongewijzigd blijven.

Nauw gezegd betekent racemisatie het verliezen van de enantiomerische verrijking in de richting van een racemische mengeling.

Bij een peptide dat veel stereogeen centra bevat, leidt het omkeren van de configuratie van één specifiek centrum meestal tot de vorming van een epimer, oftewel een soort diastereoisomer.

In de literatuur over de synthese van peptiden wordt de term „racematisatie” echter breder gebruikt in verband met ongewenste configuratieveranderingen die optreden tijdens het mengen of andere fasen van de synthese.

Deze onderscheiding is belangrijk, omdat de identiteit van een peptide niet alleen afhankelijk is van de atomen die zich in de moleculaire structuur bevinden.

De plaatsing ervan in de ruimte is ook belangrijk.

Niet elke rest van een aminozuur houdt hetzelfde stereochemisch risico in.

Glycine heeft bijvoorbeeld geen typisch chiral koolstofatoom alfa zoals dat in de meeste aminozuren voorkomt.

De overige restanten verschillen in hun gevoeligheid voor configuratieveranderingen afhankelijk van hun structuur en reactiefaciliteit.

Een juiste massa kan gepaard gaan met een onjuiste stereochemie

Een epimere peptyd kan precies dezelfde molecuulmassa hebben als de doelpeptyd.

Daarom bewijst het observeren van de verwachte massa met een massaspectrometer niet automatisch dat elke aminozuurrest de beoogde stereochemische configuratie heeft behouden.

Chromatografische analyses stelden het mogelijk om beschermde epimere peptiden te scheiden en deze afsplitsingen te gebruiken voor de analyse van stereochemische veranderingen die verband hielden met de chemie van de binding.

Afhankelijk van de molecule kan een geschikte stereochemische beoordeling gepaard gaan met de juiste chromatografische methoden, referentielijsten, derivatiseringsstrategieën of andere analytische methoden die in staat zijn om relevante structuren te onderscheiden.

Afzonderlijke analytische studies analyseerden ook de stereochemische veranderingen die optreden bij de aanbinding van aminozuren aan vaste dragerstoffen.

Dit leidt tot een ander belangrijk gevolg: de vervuiling die in het geproduceerde peptide wordt aangetroffen hoeft niet afkomstig te zijn van de laatste bindreactie.

Het zou op een eerder stadium kunnen zijn ontstaan en tijdens de volgende stappen van de synthese nog aanwezig kunnen zijn gebleven.

De vorming van aspartimid is een apart probleem.

De vorming van aspartimidum is een specifieke bijwerking van de reactie die plaatsvindt in verband met gevoelige peptidensequenties die asparagine bevatten.

Het proces omvat het creëren van een cyclisch tussenproduct dat vervolgens verschillende verwante structuren kan vormen.

Deze kunnen bestaan uit veranderde bindingen in het peptide-geheel en stereochemische varianten.

De vorming van aspartimid moet dus niet eenvoudigweg worden beschreven als een andere naam voor een onvolledige binding.

De peptijdraad kan al de juiste aminozuurresten bevatten, en een latere reactie kan een deel van zijn structuur veranderen.

Experimentele studies tonen aan dat deze processen kunnen worden beïnvloed door de beschermingsstrategieën, de naburige restanten en de herhalende omstandigheden die samenhangen met het verwijderen van beschermende groepen.

Deze onderscheiding is vooral belangrijk bij de interpretatie van problemen die voorkomen bij de synthese.

Het herhalen van het samenbrengen of het toevoegen van meer samenbindend middel herstelt automatisch de vervuiling die is ontstaan door een geheel andere chemische route.

Onvolledige reacties leiden tot andere soorten problemen

Onvolledige samenvoeging vormt een aparte categorie van verontreinigingen.

Als een keten die verbonden is met een proteïne het geplande aminozuur niet ontvangt, maar zich tijdens een latere cyclus correct zal verwerken, kan het geproduceerde peptide deze restsubstantie missen.

Dit soort molecule wordt gewoonlijk beschreven als een deleersequentie.

Andere kettingen kunnen ophouden te groeien en worden afgekort.

Deze producten verschillen in wezen van epimeren.

Een epimer kan een juiste aminozuursequentie en een samengevatte formule hebben, maar een onjuiste stereochemie van één centrum.

Een peptyd met een deleerfunctie heeft echter een andere sequentie of lengte.

Sommige synthese-strategieën gebruiken zogenaamde capping om het verdubbelen van bepaalde niet gereageerde ketens te voorkomen.

Maar capping herstelt de beschadigde keten niet en transformeert deze niet in het doelwit voor de peptiden.

Het verandert alleen zijn gedrag tijdens de volgende fasen.

De ruwe mengsel die bij de synthese wordt verkregen, kan dus producten bevatten die ontstaan door verschillende mechanismen.

De totale efficiëntiewaarde maakt het niet mogelijk om te bepalen welke mechanismen voor de vorming van de verontreinigingen verantwoordelijk waren voor het uiteindelijke resultaat.

De temperatuur en de procesomstandigheden beïnvloeden het compromis tussen snelheid en kwaliteit.

Een verhoging van de temperatuur of andere manieren om de synthese te versnellen, kunnen de snelheid van de gewenste reacties verhogen.

Aan de andere kant kunnen ze de bijwerkingen echter versnellen.

Studies met SPPS-ondersteunde microgolven analyseerden de racemisatie en de vorming van aspartimid in modelsystemen en toonden aan dat de afhankelijkheid van het type restvarieert onder de gebruikte omstandigheden.

Dit betekent niet dat verwarming per definitie onjuist is voor de synthese van peptiden.

Het betekent ook niet dat een lagere temperatuur altijd beter is.

De belangrijkste regel luidt: de snelheid van het proces en de chemische kwaliteit moeten tegelijkertijd worden beoordeeld.

Een hogere temperatuur, een langere blootstelling of meerdere verwerkingstappen kunnen zowel het gewenste bindingenproces als de concurrentiegerichte reacties beïnvloeden.

Een geschikte compromis moet dus experimenteel worden beoordeeld voor een specifieke sequentie.

Modificaties aan het eindproduct kunnen ook plaatsvinden nadat de koppeling zelf is voltooid.

Studies die verschillende scavengers vergelijken bij het verwijderen van een peptide uit een vezel, hebben verschillende verontreinigingsprofielen aangetoond.

Dit wijst erop dat de eindverontreiniging niet automatisch kan worden toegeschreven aan de koppelingreactie.

De synthese van een peptide is een veelstapsproces, en de latere ontbinding, afscheiding en verdere verwerking kunnen het materiaal veranderen dat eerder correct is opgebouwd.

Hoe wordt de efficiëntie van het samenstellen beoordeeld?

De tests die tijdens het proces worden uitgevoerd, beantwoorden alleen aan bepaalde vragen.

Bij de synthese in de vaste fase kan een test voor het detecteren van overige beschikbare aminozuren helpen beoordelen of de acyleringstap niet volledig heeft plaatsgevonden.

Deze tests kunnen zeer nuttig zijn.

Hun interpretatie moet echter beperkt blijven tot de chemische vraag die inderdaad wordt beantwoord door de gebruikte methode.

Afhankelijk van de analytische methode en het type aminozuur kunnen testen op basis van kleurverandering op verschillende manieren reageren op verschillende aminozuren.

De beschikbaarheid van de onderzochte locatie is ook van belang.

Een reactieve aminozure groep, waarvoor de teststof fysiek geen toegang heeft, is niet hetzelfde als een aminozuurgroep die een goede binding heeft opgebouwd — zelfs als de test niet in staat is om deze situaties duidelijk te onderscheiden.

De beperkingen kunnen dus betrekking hebben op de beschikbaarheid van de reactieve plaats, de gevoeligheid van de test, chemische interferenties en het type van de functionele groep die wordt gedetecteerd.

Het negatieve resultaat van een test die tijdens het proces is uitgevoerd, mag niet automatisch worden geïnterpreteerd als bewijs dat het hele peptide een juiste sequentie, stereochemie en zuiverheid heeft.

Het monitoren van het proces is het meest waardevol wanneer de resultaten later kunnen worden vergeleken met de analyse van het daadwerkelijke peptydproduct.

Chromatografie scheidt, terwijl massaspectrometrie helpt om de samenstelling van de bestanddelen te karakteriseren.

Chromatografie en massaspectrometrie leveren complementaire informatie.

Chromatografie kan de bestanddelen van een monster scheiden en de aanwezigheid van meer dan één detecteerbaar bestanddeel aangeven.

Massenspectrometrie kan informatie over de moleculaire massa opleveren en helpt bij de karakterisering of het toewijzen van individuele componenten.

Studies die beide technieken combineren, stelden het mogelijk om ruwe producten van de synthese van peptiden in vaste toestand te analyseren en informatie te verkrijgen over hun identiteit en de mate waarin de beschermende groepen zijn verwijderd.

De combinatie van beide methoden levert doorgaans meer informatie dan het vermoeden dat elk chromatografisch punt al is geïdentificeerd of dat elke gemeten massa correspondeert met een zuivere en structureel volledige fractie.

Er zijn echter wel beperkingen.

Verscheidene bestanddelen kunnen samenwerken, wat betekent dat ze niet volledig chromatografisch kunnen worden gescheiden.

Afzonderlijke stoffen kunnen ook een verschillende reactie van de detector veroorzaken.

Strukturele isomeren en stereoisomeren kunnen een gebruik van extra analytische methoden vereisen.

Vanwege dezelfde reden betekent het alleen constateren dat een peptide is getest volgens de HPLC-methode niet automatisch dat alle relevante verontreinigingen zijn verwijderd.

De bruikbaarheid van een specifieke HPLC-methode hangt af van de daadwerkelijk verkregen verdeling en van de analytische vraag die deze moet beantwoorden.

Het moet duidelijk worden uitgelegd hoe het resultaat is berekend.

De percentagewaarde die wordt gegeven met betrekking tot het koppelen van peptiden kan verschillende dingen betekenen.

Het kan verwijzen naar de conversie van het uitgangsmateriaal, de relatieve oppervlakte van het chromatografische punt, de gemeten inhoud van het eindproduct, de efficiëntie van het ruwe materiaal of de efficiëntie van het geïsoleerde materiaal.

Het geven van de getal zelf zonder uitleg over wat het betreft, kan dus een verwarrend beeld van grote precisie scheppen.

Betrouwbare vergelijkingen moeten het substraat, het geanalyseerde fasen van de samenstelling, de gebruikte analytische methode, het moment van het nemen van de monster en de soorten van de onderzochte verontreinigingen bepalen.

Als herhaalde koppeling is toegepast, moet dit ook worden meegenomen.

Het uiteindelijke resultaat na twee operaties om het gezicht te verbinden hoeft niet te weerspiegelen wat er tijdens de eerste reactie is gebeurd.

Vergelijkbare voorzichtigheid is vereist bij de detectiegrenzen van analytische methoden.

De vermelding „niet gedetecteerd” betekent dat de betreffende stof niet is gedetecteerd onder de specifieke omstandigheden en met de beperkingen van de gebruikte methode.

Het mag niet automatisch worden verondersteld dat er helemaal geen verontreiniging bestaat.

De gegevens over het reactiefactor moeten meer dan een eenvoudige model omvatten.

De koppelingstherminale, die bijzonder goed werkt bij een eenvoudige modelreactie, kan anders gedragen zich bij een aminozuur met een hoog sterisch volume, een gevoelig stereochemisch centrum, een slecht oplosbaar substraat of een peptidenketen die vatbaar is voor aggregatie.

Studies die Oxyma-B vergelijken met verschillende modelpeptiden tonen aan waarom het beoordelen van de binding chemisch op meerdere substraten waardevol is.

In het eindresultaat moet een bruikbare methode voor het samenstellen leiden tot een gewenste structuur met een acceptabel vervuilingsprofiel en een reproduceerbare resultaten voor de beoogde synthese.

Daarom moet efficiëntie bij het koppelen beter worden begrepen als een verzameling van verschillende metingen dan als een eigenschap die wordt beschreven door de naam van een individueel reactief of het resultaat van een test voor het verdwijnen van het substrat.

Veelgestelde vragen

1. Waarom zijn beschermende groepen nodig tijdens de synthese van peptiden?

Beschermgroepen beperken tijdelijk ongewenste reacties, waardoor de juiste functionele groepen het gewenste peptydbinding kunnen uitvoeren. Aminozuren kunnen verschillende reactieplaatsen bevatten en het laten beschikbaar zijn van alle plaatsen tegelijk kan tot concurrentiegerichte reacties leiden. Een effectieve beschermingsstrategie moet ook rekening houden met de mogelijkheid van later verwijderen van de beschermingen en de samenhang met de rest van de molecule. Modelonderzoeken tonen aan dat de keuze van beschermgroepen niet alleen de basisselectiviteit van de reactie kan beïnvloeden, maar ook de vorming van bijproducten. Een beschermgroep is dus een onderdeel van de gehele synthesestrategie en geen universele oplossing voor alle chemische problemen.

2. Kan een juiste samenstelling nog steeds leiden tot het ontstaan van verontreiniging?

Ja. Doelgerichte peptydbinding kan optreden terwijl andere deeltjes in dezelfde mengeling onvolledige conversie ondergaan of ongewenste bijproducten vormen. Dit wordt vooral goed zichtbaar bij de studie van epimere producten, omdat het vormen van de juiste binding en het behoud van de juiste stereochemie afzonderlijke processen zijn. Het detecteren van het doelpeptide betekent dus niet dat het het enige aanwezige product is. Een wetenschappelijk onderbouwd beoordeling van het succes van de binding vereist een gedefinieerd eindpunt voor de analyse en informatie over relevante verontreinigingen.

3. Is het mengen van peptiden hetzelfde als de volledige synthese van een peptide?

Nee. Het mengen is een enkel proces waarmee een binding wordt gevormd binnen een veel brederere syntheseproces. De synthese op vaste fase kan ook omvatten het aanbinden aan een drager, het beveiligen, verwijderen van beschermende groepen, herhaalde verwijdering, afscheiding, behandeling, reiniging en de uiteindelijke karakterisering. Omdat ongewenste producten ook buiten het mengenstadium kunnen ontstaan, mag de eindverontreiniging niet automatisch worden toegeschreven aan onjuist mengen zonder gegevens die wijzen op de werkelijke oorsprong ervan.

4. Waarom wordt de carboxylgroep geactiveerd?

De activatie van de carboxylgroep creëert een gunstiger pad voor de reactie met de juiste aminogroep, waardoor de vorming van een amidbinding gemakkelijker wordt. Verhoogde reactiviteit kan echter ook concurrentiegerichte reacties mogelijk maken. Daarom wordt bij het beoordelen van bindende systemen niet alleen de efficiëntie van de vorming van een binding geanalyseerd, maar ook de stereochemische effecten en de vorming van bijproducten. Het doel van de activatie is niet het maximaliseren van de reactiviteit van de molecule, maar het bereiken van een geschikte selectiviteit van de reactie.

5. Waarvoor dient HATU?

HATU is een bindmiddel dat wordt gebruikt om het vormen van amidbindingen te vergemakkelijken, waaronder bij het verbinden van peptiden. Het is geen peptide en geen beschermende groep. Vergelijkende studies van moeilijke peptidensequenties tonen aan dat methoden die HATU gebruiken in hun volledige context moeten worden beoordeeld. De informatie alleen dat HATU is gebruikt, bevestigt niet de volledige conversie, stereochemische stabiliteit of een betere verontreinigingsprofiel.

6. Is er één beste reagentia voor het mengen van peptiden?

Nee. Er bestaat geen universele rangschikking van reactieproducten die geschikt is voor elk peptide en elke reactie. Stroomverschuivingen, oplosbaarheid van het substraat, aggregatie, stereochemische gevoeligheid en de context van de sequentie kunnen de uitkomst beïnvloeden. De keuze van een reactieproduct moet dus gebaseerd zijn op gemeten resultaten voor een specifieke reactie, en niet alleen op zijn reputatie of populariteit.

7. Betekenen „de koppelingstoevoeging” en „de toevoeging” hetzelfde?

Nee. Deze termen kunnen verschillende functies beschrijven in het samenwerkingssysteem. Een samenwerkingsmiddel kan direct bijdragen aan de activatie, terwijl een additief kan invloed hebben op de vorming van tussenproducten, de reactieprestaties, de stereochemische integriteit of concurrerende chemische routes. Daarom moet het gehele reactiesysteem worden geanalyseerd en niet alle componenten ervan als verwisselbare equivalenten worden beschouwd.

8. Is het mogelijk om hele fragmenten van peptiden te combineren in plaats van individuele aminozuren?

Ja. De koppelingreactie kan grotere, beschermde peptidenfragmenten combineren, in plaats van alleen individuele aminozuren. Een vergroting van de grootte van de reagerende componenten elimineert echter niet de noodzaak om de selectiviteit van de reactieplaats, de stereochemie of de uiteindelijke karakteristieken van het product te controleren. Bij koppeling van fragmenten zijn nog steeds gegevens nodig om te bevestigen dat de juiste combinatie inderdaad correct is ontstaan.

9. Wat is het verschil tussen racematisatie en epimereisatie?

Racematisering in de strikte zin betekent het verliezen van de enantiomerische verrijking naar een racemische mengeling, terwijl epimerisatie betekent een verandering in de configuratie van één stereocentrum in een molecule die meerdere dergelijke centra bevat. In literatuur over de synthese van peptiden wordt de term racemisatie vaak breder gebruikt om ongewenste veranderingen in de configuratie van aminozuurresten te beschrijven. Een nauwkeurige definitie moet dus de werkelijke structurele verandering weerspiegelen.

10. Kan massaspectrometrie elk stereochemisch foutje detecteren?

Nee. Stereoisomeren kunnen precies dezelfde moleculaire massa hebben. Het verkrijgen van de verwachte massa bevestigt dus niet de juiste configuratie van elk stereocentrum. Voor het beoordelen van dergelijke verschillen kunnen aanvullende methoden nodig zijn, zoals geschikte chromatografische technieken of derivatiseringsstrategieën. Massa-spectrometrië is een uiterst nuttig instrument voor de karakterisering van moleculen, maar de resultaten moeten worden geïnterpreteerd in overeenstemming met de beperkingen van het specifieke structurele vraagstuk.

11. Betekent de vorming van aspartimid gewoon een onjuist bindingsmechanisme?

Nee. De vorming van aspartimidum is een afzonderlijk bijproductieritueel dat samenhangt met gevoelige sequenties die asparagine bevatten. De aanwezigheid ervan kan worden beïnvloed door naburige restanten en omstandigheden die samenhangen met het verwijderen van beschermende groepen. Een ongewenste structurele verandering kan dus optreden zelfs wanneer de juiste aminozuur eerder correct is gekoppeld. Het vaststellen van de oorsprong van de vervuiling is belangrijk, omdat een herhaling van de binding niet noodzakelijkerwijs het probleem op te lossen die voortvloeit uit een geheel ander bijproductieritueel.

12. Zorgen het herhalen van het samenbrengen ervoor dat de reactie succesvol zal verlopen?

Nee. Een herhaalbehandeling kan in sommige gevallen de conversie verbeteren, maar garandeert niet dat alle reactieve plekken beschikbaar zullen zijn of dat andere bijwerkingen worden voorkomen. Het resultaat blijft daarom afhankelijk van het substraat en de gebruikte methode. Een analyse van het product is daarom noodzakelijk om te bepalen wat daadwerkelijk extra conversie heeft opgeleverd.

13. Verbruikt een hogere temperatuur altijd de kwaliteit van de koppeling?

Nee. Een verhoging van de temperatuur kan de gewenste reactie versnellen, maar kan ook ongewenste chemische processen versnellen. Een snellere conversie mag dus niet automatisch worden geïnterpreteerd als een verbetering van de chemische kwaliteit. De temperatuur moet zowel vanuit het oogpunt van de vorming van het eindproduct als vanuit het oogpunt van het profiel van de aanwezige verontreinigingen worden beoordeeld.

14. Onderbouwt het verdwijnen van de vrije aminogroep de vorming van een goed functionerend peptide?

Nee. Het ontbreken van een detecteerbare vrije aminogroep is een antwoord op een veel kortere vraag over een bepaald functioneel groep in de omstandigheden van de gebruikte test. Het bevestigt niet zelfstandig de volledige peptidssequentie, zijn stereochemie of zuiverheid. De monitoring van vrije aminogroepen kan een nuttig onderdeel van het procesbeheer zijn, maar vervangt niet de eindkarakterisering van het product.

15. Is de zuiverheid van HPLC hetzelfde als de efficiëntie van het koppelen?

Nee. Reinheid HPLC en prestaties beschrijven verschillende eigenschappen. Reinheid HPLC is afhankelijk van de methode waarmee de samenstelling van de gedetecteerde bestanddelen van het monster wordt beschreven, terwijl prestaties betrekking hebben op de hoeveelheid van het bepaalde product dat wordt verkregen in verhouding tot de gedefinieerde hoeveelheid aaningsstof. Reiniging kan de chromatografische zuiverheid vergroten, terwijl tegelijkertijd de hoeveelheid van het herwonnen eindproduct wordt verminderd. Daarom is de procentuele waarde slechts beperkt van belang, tenzij duidelijk is wat er wordt bedoeld.

16. Kunnen vervuilingen ontstaan nadat de koppeling is voltooid?

Ja. Na het einde van de bindreactie omvat de synthese van het peptide nog andere chemische stappen. Het verwijderen van beschermende groepen, het ontbinden en de verdere verwerking kunnen de molecule wijzigen of leiden tot het ontstaan van extra verontreinigingen. Dit betekent niet dat elke uiteindelijke verontreiniging zich op latere stadia voordoet, maar het laat zien waarom een correcte binding geen garantie is voor de kwaliteit van het eindproduct.

17. Wat maakt het vergelijken van koppelingstechnieken betrouwbaar?

Een betrouwbaar vergelijkingsonderzoek moet alternatieve methoden voor hetzelfde, duidelijk gedefinieerde doel en onder voorwaarden die voldoende vergelijkbaar zijn, evalueren. Het moet de gebruikte substraten, de proefmonsters die worden genomen, de analytische methoden en de beoordeelde soorten verontreiniging aangeven, in plaats van een onverklaard procentuele waarde te presenteren of te vertrouwen op de reputatie van het reactief. Vergelijkingen die meerdere verschillende modelpeptiden omvatten, kunnen meer informatie opleveren dan een enkele hoge prestatie voor een eenvoudig substrat, omdat ze laten zien hoe de effectiviteit verandert in functie van de moleculaire context. Ook dan moeten de conclusies beperkt blijven tot daadwerkelijk onderzocht chemisch systeem.

Samenvatting

Het mengen van peptiden is een essentieel onderdeel van de chemische synthese van peptiden, omdat dit leidt tot de vorming van amidbindingen die de aminozuren in het peptisch skelet verbinden. Het beschrijven van het mengen alleen als „de samenvoeging van twee aminozuren” slaat echter een groot deel van de chemie over dat bepalend is voor de vraag of het verkregen product inderdaad een gewenst peptide is.

Een bestanddeel dat een carboxygroep bevat, vereist meestal een activatie om een efficiënte vorming van het amidbindingencomplex mogelijk te maken. Bindmiddelen en additieven kunnen dit proces vergemakkelijken, maar hun effectiviteit hangt af van het substraat, de reactieomgeving en de manier waarop het resultaat wordt geanalyseerd. Daarom moet het reactief bestanddeel in zijn volledige experimentele context worden geanalyseerd en niet los van het geproduceerde peptide worden geclassificeerd.

Beschermingsgroepen bieden een extra niveau van controle door tijdelijk te voorkomen dat ongewenste functionaliteit deelneemt aan de reactie. Hun bruikbaarheid hangt niet alleen af van effectieve bescherming, maar ook van de mogelijkheid om selectief te verwijderen en in overeenstemming te zijn met de volgende synthesefasen. De beschermingsstrategie en de aangrenzende restaminocyclusen kunnen ook invloed hebben op de vorming van bepaalde bijproducten.

De stereochemische integriteit is een ander belangrijk element. De koppelingreactie kan leiden tot de vorming van een amidbinding en tegelijkertijd epimere materialen vormen. Omdat de epimer dezelfde moleculaire massa kan hebben als het eigenlijke peptide, bevestigt de zelfstandige massa-compatibiliteit niet de volledige structurele correctheid. Veranderingen in de configuratie kunnen ook optreden op andere stadia, zoals de aanvankelijke aanbinding van een aminozuur aan de vaste fase.

Andere verontreinigingen ontstaan door verschillende mechanismen. Een onvolledige binding kan leiden tot de vorming van deletie- of verkorte sequenties, terwijl reacties die verband houden met aspartimid het peptide kunnen wijzigen waarin de juiste aminozuurresten al aanwezig zijn. De versnelling van het proces kan zowel de gewenste reacties als de bijkomende routes beïnvloeden, en extra verontreinigingen kunnen ook ontstaan tijdens latere fasen, zoals de afscheiding.

Om deze redenen vereist de beoordeling van de binding van peptiden meer dan alleen vaststellen of het uitgangsmateriaal is verdwenen.

Omzetting, vorming van het eindproduct, geïsoleerde rendementen, chromatografische zuiverheid en stereochemische zuiverheid beantwoorden aan verschillende vragen.

Tests die tijdens de synthese worden uitgevoerd kunnen helpen bij het detecteren van incomplete reacties, maar bevestigen niet automatisch de volledige structuur van het peptide. Chromatografie en massaspectrometrie leveren complementaire informatie, terwijl vragen over stereochemie of zeer vergelijkbare structuren mogelijk aanvullende analytische methoden vereisen.

De meest logische benadering voor het koppelen van peptiden is dus gericht op een specifieke molecule en gebaseerd op gegevens.

Een nuttige samenwerkingsmethode is niet eenvoudigweg een methode die het meest bekende of meest reactieve reactiefmiddel gebruikt. Het is een methode die op een herhaalbare manier leidt tot het vormen van de beoogde moleculaire binding, waarbij tegelijkertijd de juiste stereochemische integriteit wordt gehandhaafd en relevante verontreinigingen voor het specifieke geproduceerde peptide worden gecontroleerd.

Referenties

1. Subirós-Funosas, R., Prohens, R., Barbas, R., El-Faham, A., & Albericio, F. (2009). Oxyma: Een efficiënte additief voor peptide synthese om de benzotriazol-gebaseerde HOBt en HOAt te vervangen met een lager risico op explosie. Chemie—A European Journal, 15(37), 9394–9403. https://doi.org/10.1002/chem.200900614
2. Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T. en Kuwata, S. (1992). Racemisatieonderzoeken in peptide synthese door het scheiden van beschermde epimerische peptiden met behulp van reverse-phase high performance liquid chromatography. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x
3. Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Evaluatie van het gecombineerde gebruik van Oxyma en HATU bij het samenstellen van peptideketens. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
4. Jad, Y. E., Khattab, S. N., de la Torre, B. G., Govender, T., Kruger, H. G., El-Faham, A., & Albericio, F. (2014). Oxyma-B, een uitstekend remmer van racemisatie bij de synthese van peptiden. Organische en Biomoleculaire Chemie, 12(42), 8379–8385. https://doi.org/10.1039/c4ob01612b
5. Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Peptidensynthese op vaste fase: Van standaardprocedures tot de synthese van complexe sequenties. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
6. Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Het aspartimide-probleem bij Fmoc-gebaseerde SPPS. Deel I. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
7. Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Het aspartimide-probleem bij Fmoc-gebaseerde SPPS. Deel II. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
8. Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Gebruik van Marfey’s reagentia om de racemisatie te kwantificeren bij het verankeren van aminozuren op vaste ondersteuningen voor peptide synthese. Analytische Biochemie, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
9. Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Beperking van racemisatie en aspartimidevorming bij microgolfgestuurd Fmoc-solierepolymerisatie van peptiden. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
10. Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-benzenedimethanethiol (1,4-BDMT) als remmer van de afbraak van groenere peptideharsen. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
11. McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., & Pallai, P. (1991). De karakterisering van ruwe producten uit vaste-fase-peptidensynthese met mu-HPLC/fast atom bombardment mass spectrometry. Peptide Research, 4(1), 40–46. PubMed