Peptiidide sidestamine on keemiline protsess, mis viib sideme moodustumiseni karboksüülrühma sisaldava komponendi ja aminorühma sisaldava komponendi vahel. Selle reaktsiooni tulemusena tekib amiidside. Kui selline side ühendab peptiidi sünteesi käigus aminohappejääke, saab sellest osa, mida nimetatakse peptiidselgrooks.
Reageerivad komponendid ei pea olema üksikud aminohapped. Sidestusreaktsioon võib ühendada ühe aminohappe teisega, liita järgmise aminohappe kasvava ahelaga või ühendada suuremaid peptiidifragmente, mis on varem eraldi sünteesitud.
Esmapilgul võib peptiidide sidestamine tunduda lihtne ülesanne: tuleb lihtsalt üks aminohape teisega ühendada.
Keemilisest vaatenurgast on amiidsideme moodustumine siiski vaid osa kogu eesmärgist.
Sidestus peab toimuma õiges kohas ja säilitades sobiva stereokeemilise konfiguratsiooni, samas kui teised reaktiivsed funktsionaalrühmad peavad olema nõuetekohaselt kontrolli all. Reaktsioon võib pealtnäha kulgeda edukalt ja tarbida ära suurema osa või isegi kogu lähteaine, kuid sellegipoolest viia sihtpeptiidi ja teiste struktuuride soovimatu segunemiseni.
Seetõttu ei tähenda reaktsiooni lõppemine ja toote õige moodustumine sama asja.
Uuringud, mis võrdlevad erinevaid sidestussüsteeme, funktsionaalsete rühmade kaitsmise strateegiaid ja stereokeemilisi tulemusi, näitavad, miks ei ole olemas ühte universaalselt parimat sidestusreaktiivi, mis sõltumata sünteesitava peptiidi tüübist sobiks kõigeks.
Teaduslikust vaatepunktist ei ole seega kasulikum küsimus:
„Milline sidestusreaktiiv on parim?”
Parem küsimus on:
„Milline lähenemisviis võimaldab saada soovitud peptiidi sobiva muundamise, stereokeemilise teravuse säilitamise ja nõuetekohase lisandite kontrolliga konkreetsele molekulile sobivates tingimustes?”
See eristus on peptiidide sidestamise keemia mõistmiseks ülioluline.
Peptiidide sidumine tähendab keemilist protsessi, mille käigus seotakse kaks või enam ainevahetussaadust (aminohapet) omavahel amiidsideme (peptiidsideme) abil, et moodustada pikemaid ahelad ehk peptiide või valke.
Sidestamine ühendab kaks komponenti uue sideme loomise teel
Tüüpilises peptiidskeleti moodustamise reaktsioonis seotakse ühe aminohappejäägi karboksüülrühm teise jäägi aminorühmaga.
Moodustuv ühend on keemiliselt amiidne sidemega.
Kui selline side ühendab aminohappejääke ahelas, nimetatakse seda tavaliselt peptiidsidemeks.
Reageerivate komponentide täpne füüsiline paigutus sõltub kasutatud sünteesistrateegiast.
Tahke faasi peptiidsünteesi ajal kuulub paljastatud aminorühm tavaliselt vaigu külge seotud kasvava peptiidahela juurde, samas kui karboksüülrühma sisaldav komponent pärineb sisseviidavast kaitstud aminohappest.
Lahuses toimuvas süntesis võivad aga mõlemad komponendid olla vedelas faasis.
Fragmentide sidumisel ühendatakse suuremad, kaitstud peptiidsegmentid, selle asemel et lisada üksikuid aminohappejääke üksteise järel.
Erinevad strateegiad muudavad reaktsioonide läbiviimise, ainete eraldamise ja puhastamise viisi, kuid ei kõrvalda keemilist põhiprobleemi: õiged funktsionaalrühma peavad omavahel reageerima, samal ajal kui soovimatud reaktsioonid molekuli teistes osades peaksid jääma piisavalt piiratuks.
Sideme moodustumine, konversioon ja saagis on erinevad mõisted
Mõned peptiidide sidestamise kirjeldamisel sageli kasutatavad terminid võivad kõlada sarnaselt, hoolimata sellest, et need viitavad erinevatele teemadele.
Konversioon määrab, milline osa antud lähteainest on reageerinud.
See ei ütle aga automaatselt, milleks see materjal muutus.
Kui 99% lähteainest kaob, kuid osa sellest moodustab soovimatuid kõrvalsaadusi, ei tähenda 99-protsendiline konversioon seda, et tekkinud on 99% soovitud peptiidi.
Sihttoote teke vastab teisele küsimusele: milline kogus kavandatud molekulaarstruktuurist tegelikult moodustus? Vastus nõuab analüütilist meetodit, mis võimaldab eristada õiget toodet olulistest alternatiivsetest struktuuridest.
Eraldatud saagis kirjeldab teatud toote kogust, mis õnnestus lõpuks tagasi saada, võrreldes määratud lähteainete kogusega. Seetõttu võivad lõplikku saagist mõjutada ka töötlemis-, eraldamis- ja puhastusetapid, isegi kui sidestus ise kulges tõhusalt.
Kromatograafiline puhtus kirjeldab teatud kromatograafilise meetodi tingimustes tuvastatavate komponentide jaotust. See võib anda väga väärtuslikku teavet proovi koostise kohta, kuid selle tõlgendamist võivad piirata kaaseluutsioon, erinevused detektori vastuses või selliste komponentide olemasolu, mida antud meetod tuvastab nõrgalt.
Stereokeemiline puhtus seevastu annab vastuse küsimusele, kas molekuli kavandatud ruumiline konfiguratsioon on säilinud. See on eraldiseisev analüütiline küsimus, kuna mõnel stereokeemilisel variandil võib olla sihttootega täpselt sama molekulmass.
Need erinevused aitavad mõista tulemusi, mis esmapilgul võivad tunduda vasturääkivad.
Reaktsioon võib näidata lähteaine suurt muundumist, viies samal ajal mitme saaduse tekkeni. Toorsaadus võib olla suure taastatud massiga, kuid sisaldada märkimisväärsel hulgal lisandeid. Intensiivne puhastamine võib aga viia kõrge puhtusastmega materjali saamiseni madalama eraldatud saagise arvelt.
Ükski neist tähelepanekutest ei ole iseenesest teistega vastuolus.
Nad kirjeldavad lihtsalt toote erinevaid omadusi või protsessi eri etappe.
Seetõttu on väitel „sidestus oli täielik” palju suurem väärtus, kui on teada ka kasutatud analüüsimeetod ja see, mida täpselt mõõdeti.
Keerulised substraadid toovad esile protsessi erinevad piirangud
Mitte iga peptiidide sidestusreaktsioon ei seondu samaväärse keemilise keerukusega.
Tugevalt steeriliselt takistatud reaktsioonitsentrum võib aeglustada sideme moodustumist, kuna reageerivatel rühmadel on raskendatud ligipääs üksteisele.
Nõrk lahustuvus võib piirata reaktsioonikomponentide tõhusat kokkupuudet.
Tahke faasi sünteesil võib kasvav peptiidahel interakteeruda naaberahelatega või võtta vastu struktuure, mis piiravad juurdepääsu reaktsioonikohtadele,isegi kui sidestusreagendid on näivalt liias.
Nendel probleemidel on erinev keemiline taust.
Seetõttu ei saa eeldada, et üks lahendus on automaatselt tõhus kõigil juhtudel.
Uuringud, mis võrdlevad raskete peptiidijärjestuste jaoks korduva sidestamise strateegiaid, analüüsisid saadud toodete tegelikku koostist, selle asemel et tugineda hinnangutes ainult üksikute reaktiivide teoreetilisele reaktiivsusele või mainele. Üks uuritud strateegiatest osutus analüüsitud mudelites soodsaks, kuid see ei tähenda universaalse, iga peptiidijärjestuse jaoks sobiva lahenduse olemasolu.
Kõige olulisem järeldus on see, et meetodi efektiivsust tuleks hinnata konkreetsest substraadist saadud saaduse, mitte ainult kasutatud reaktiivi maine põhjal.
Karksüülrühma aktiveerimine
Miks on aktiveerimine tavaliselt vajalik?
Pelgalt modifitseerimata karboksüülhappe ja amiini segamine tavatingimustes ei anna tavaliselt tõhusalt puhta peptiidsideme moodustumist.
Selle asemel võivad toimuda happe-aluse vastastikmõjud ja amiidsideme efektiivne moodustumine nõuab sobivat keemilist teed.
Seetõttu hõlmab peptiidide sidestamine tavaliselt karboksüülrühma sisaldava komponendi aktiveerimist.
Aktiveerimine suurendab selle vastuvõtlikkust reaktsiooniks vastava aminorühmaga. Sobiv reaktsioonikeskkond ja sobiv lahknev rühm hõlbustavad uue amiidsideme moodustumist.
Aktiveeritud vahesaadus saab eksisteerida vaid lühikest aega ja seda ei pea isoleerima.
Eesmärk ei ole siiski saavutada maksimaalset võimalikku keemilist reaktiivsust.
Eesmärk on kontrollitav reaktiivsus.
Aktiveeritud vaheprodukt, mis reageerib väga kiiresti vee, mõne teise soovimatu nukleofiiliga või osaleb konkureerivas reaktsioonis, võib kiiresti kaduda ja samal ajal viia suhteliselt väikese koguse soovitud peptiidi moodustumiseni.
Kõrge reaktiivsus on seega kasulik ainult siis, haaratuna on seda võimalik suunata soovitud sideme moodustumisele.
Sidestusreagensid ja lisandid täidavad erinevaid funktsioone
Peptiidide sidumises võib osaleda mitut tüüpi keemilisi komponente, mis täidavad erinevaid funktsioone.
Karbodiimiidid on üks karboksüülrühmade aktiveerimiseks kasutatavate reaktiivide perekondi.
Teised sidestussüsteemid kasutavad erinevaid aktiveerimismehhanisme, sealhulgas sageli esinevaid onium-tüüpi reaktiive, nagu HATU-põhised süsteemid.
Lisainühendid võivad toimida lisanditena.
Mõiste „lisand” ei tähenda siiski, et kõnealune ühend oleks keemiliselt ebaoluline. Lisand võib mõjutada vaheprodukte, sidestuse saagist, konkureerivaid reaktsiooniteid ja stereokeemilisi tulemusi.
Oxyma kasutamise uuringud peptiidide sünteesis karbodiimiidide abil analüüsisid nii sidestamise efektiivsust kui ka ratsemise piiramist valitud mudelites.
Sellised andmed on väärtuslikud uuritavate süsteemide ja konkreetsete mudelite jaoks.
Need ei tähenda siiski, et sama ühendi kasutamine igas võimalikus peptiidide sidestamises annab identse tulemuse.
Hilisemad Oxyma-B uuringud võrdlesid optilise puhtuse tulemusi mitmes mudelpeptiidis.
Paljude substraatide uurimine on eriti oluline, kuna väga head tulemused keemiliselt lihtsas sidestuses ei pruugi ennustada reaktiivi käitumist steriilselt takistatud, agregeerumisele aldis või stereokeemiliselt tundlikus kohas.
Mida tähendab HATU peptiidsünteesis?
HATU on sidestusreaktiiv, mida kasutatakse amiidsidemete moodustumise soodustamiseks, sealhulgas peptiidide sünteesil.
HATU ei ole peptiid.
See ei ole ka kaitsegrupp.
Tema pelk kohalolu ei ole tõend selle kohta, et sidestamine on lõppenud ega selle kohta, et saadud peptiid on puhas.
Tõhusus sõltub substraadi tüübist, ülejäänud reaktiividest, lahustisüsteemist ja reaktsioonitingimuste laiemast kontekstist.
Agregatsioonile vastuvõtlike järjestuste uuringud võrdlesid muu hulgas HATU-l ja Oxyma/karbodiimiidi süsteemidel põhinevaid lähenemisviise korduva sidestamise tingimustes.
See näitab, miks otsinguid nagu „HATU peptide” tuleks mõista küsimustena sidestuskeemia ja meetodi valiku kohta, mitte aga tõendina selle konkreetse reagendi universaalsusest peptiidide sünteesil.
Pelgast reagendi nimest ei piisa avaldatud tulemuse taasesitamiseks ega õigeks tõlgendamiseks.
Olulised on ka reaktsioonitingimused, peptiidi sekvents ja protsessi õnnestumise analüütilise määratlemise viis.
Aktiveerimine ja stereokeemiline kontroll eeldavad tasakaalu säilitamist
Aktiivse aminohappe derivaadi pikem hoidmine reaktsioonisüsteemis ei ole alati kasulik.
Soovitud sidestusreaktsioon toimub teiste võimalike keemiliste protsesside kõrval.
Mõned konkureerivad rajad võivad stereokeemiat muuta.
Kaitstud epimeersete produktidega läbi viidud eksperimentaalsed uuringud analüüsisid aminohapete kombinatsiooni, lahusti ja muude reaktsioonikomponentide mõju karbodiimiidide osalusel toimuva sidestamise ajal aset leidvatele stereokeemilistele muutustele.
See illustreerib olulist reeglit: kogu reaktsioonikeskkond võib olla sama oluline kui kasutatava sidestusreaktiivi üldine perekond.
Seetõttu peab sidestusstrategia tagama piisava reaktiivsuse soovitud sideme moodustamiseks, piirates samal ajal soovimatute reaktsioonide toimumise võimalust.
Neid põhimõtteid võib arutada hariduslikel eesmärkidel ilma neid valmis laboriprotokolliks muutmata. Reaktiivide täpsed kogused, nende lisamise järjekord ja reaktsioonitingimused sõltuvad konkreetsest väljatöötatavast sünteesiprotsessist.
Kaitsegruppide roll
Kaitsmine piirab konkureerivaid reaktsioonikohti
Aminohape võib sisaldada rohkem reaktiivseid rühmi kui pelgalt amiin- ja karboksüülrühm, mida on vaja peptiidahela moodustamiseks.
Tema ahel võib sisaldada täiendavaid reaktiivseid keemilisi rühmi.
Kui kõik potentsiaalselt reaktiivsed rühmad jääksid igal sidestusetapil katmata, võiks kavandatud peptiidsideme moodustumine konkureerida hargnemise või muude soovimatute reaktsioonidega.
Kaitsegruppe kasutav strateegia võimaldab valitud reaktiivseid kohti ajutiselt maskeerida.
Tänu sellele saavad vastavad amino- ja karboksüülrühmad omavahel reageerida, sam turist jäävad teised kohad antud tingimustes kättesaamatuks või liiga vähe reaktiivseks.
Kaitsmine tagab seega keemilise selektiivsuse.
Tõhus strateegia ei seisne siiski pelgalt keemiliselt stabiilse rühma liitmises.
Kaitsegrupp tuleb hiljem samuti eemaldada.
Kaitserühm, mis hoiab sidumise ajal tõhusalt ära soovimatud reaktsioonid, kuid mida ei saa hiljem sihtmolekuli kahjustamata eemaldada, tekitab uue sünteetilise probleemi.
Seetõttu peab täielik strateegia arvestama nii stabiilsusega perioodil, mil kaitset on vaja, kui ka võimalusega turvameede valikuliselt eemaldada, kui seda pole enam vaja.
Ajutistel ja pikaajalistel kaitsemeetmetel on erinevad funktsioonid
Üksikud kaitserühmad võivad molekulil püsida erineva aja vältel.
Tüüpilises Fmoc-tüüpi tahke faasi sünteesis eemaldatakse kasvava ahela C-terminaalse rühma asemel N-terminaalne kaitsemeede korduvalt järjestuse pikenedes.
Paljud kõrvalahelate kaitserühmad seevastu jäävad alles paljude sidestustsüklite ajaks ja eemaldatakse alles hilisemas etapis.
Fmoc-põhised standardmeetodid näitavad, kuidas koordineeritakse selektiivse deblokeerimise ja sidestamise korduvaid tsükleid.
Konkreetse külgahela jaoks vajalik kaitserühm sõltub aminohappe jäägist, kogu peptiidist ja valitud sünteesistrateegiast.
Seega ei oleks õige väita, et iga aminohape vajab ühesugust kaitset või et kõik sünteesid kasutavad samu kaitserühmi.
Ajutisi kaitserühmi tuleb eristada ka keemilistest rühmadest, mis jäetakse teadlikult valmis peptiidi sisse.
Planeeritud N-otsa modifikatsioon või amiid C-otsas võib näiteks moodustada osa sihtstruktuurist.
Ajakohane kaitserühm aga, mis kogemata lõppmolekuli jäi, tähendaks soovimatut struktuurset erinevust.
Ortogonaalsus on keemilise ühilduvuse nõue
Ortogonaalne kaitse tähendab strateegiat, mille puhul valitud kaitserühmad saab eemaldada, jättes teised kaitsed piisavalt puutumata.
See võimaldab paljastada erinevaid reaktiivseid kohti teadlikult valitud sünteesietappidel.
Ortogonaalsust ei tohiks mõista lihtsalt kui üksiku reaktiivi omadust, mis on kirjas selle etiketil.
See kirjeldab kogu kavandatud keemiliste operatsioonide jada vastavust.
Kavandatud kaitserühma eemaldamine peaks toimumu ilma kasvava peptiidi teistes osades lubamatuid muutusi põhjustamata.
Tahke faasi sünteesis võib see kokkusobivus hõlmata ka kandja-vahelüli süsteemi ning ebatavalisi või keemiliselt eriti tundlikke ehitusplokke.
Aspartimiidi tekke uuringud, milles modifitseeriti mudelpeptiidi kõrvalahelate ja skeleti kaitsegruppe, näitasid erinevusi kõrvalsaaduste tekkes.
See näitab, et turvise valik võib mõjutada enamat kui lihtsalt ilmse kõrvalahela reaktsiooni ilmnemist.
See võib sünteesi käigus muuta ka muid saasteainete tekkeradasid.
Kaitserühmad ei pane kõiki järjestusi ühtemoodi käituma
Isegi kui kaks järjestust sisaldavad sama potentsiaalselt problemaatilist aminohapet, ei pea need käituma identselt.
Naabruses olevad jäägid võivad mõjutada konkureerivate reaktsioonide toimumise tõenäosust.
Aspartaati sisaldavate mudelijärjestuste süstemaatiline uurimine näitas, et sellele jäägile järgnev aminohape mõjutas uuritud tingimustes aspartimiidiga seotud produktide moodustumist.
See ei tähenda, et iga sellist motiivi sisaldav järjestus peaks probleeme tekitama.
See näitab aga, että järjestuse konteksti tuleks meetodi väljatöötamisel ja riskihindamisel arvesse võtta.
Kaitsemisstrateegia, mis toimis ühel mudelpeptiidil, ei garanteeri ühegi teise sama jääki sisaldava peptiidi identset käitumist.
Ratsemisatsioon ja muud kõrvalreaktsioonid
Ratsemisatsioon ja epimerisatsioon on seotud molekuli ruumilise paigutusega
Paljud aminohappe jäägid sisaldavad stereogeenset tsentrit.
Sellise tsentri konfiguratsiooni muutmine võib viia struktuurselt teistsuguse molekuli tekkeni, isegi kui selle elementaarne koostis ja molekulmass jäävad muutumatuks.
Rangelt võttes tähendab ratsemisatsioon enantiomeerse rikastuse kadumist ratseemilise segu suunas.
Peptiidis, mis sisaldab mitut stereogeenset tsentrit, viib ühe konkreetse tsentri konfiguratsiooni pöördumine tavaliselt epimeeri ehk diastereoisomeeri liigi tekkeni.
Peptiidide sünteesi käsitlevas kirjanduses kasutatakse terminit „ratsemisatsioon” siiski laiemas tähenduses, viidates soovimatutele konfiguratsioonimuutustele, mis toimuvad sidestamise või muude sünteesi etappide käigus.
See eristus on oluline, sest peptiidi identilisus ei sõltu ainult sellest, millised aatomid molekulis on.
Oluline on ka nende ruumiline paigutus.
Mitte iga aminohappejääk ei seondu samasuguse stereokeemilise riskiga.
Glütsiinil puudub näiteks enamikule aminohapetele omane tüüpiline kiraalne alfa-süsinikuaatom.
Ülejäänud jäägid erinevad oma struktuurist ja reaktsioonikeskkonnast olenevalt konfiguratsioonimuutuste suhtes vastuvõtlikkuse poolest.
Õige massiga võib kaasneda vale stereokeemia
Epimeersel peptiidil võib olla täpselt sama molekulmass kui sihtpeptiidil.
Seetõttu ei tõenda oodatud massi täheldamine massispektromeetria abil automaatselt, et iga aminohappejääk säilitas kavandatud stereokeemilise konfiguratsiooni.
Kromatograafilised uuringud võimaldasid eraldada kaitstud epimeerseid peptiide ja kasutada neid eraldamisi sidestuskeemiaga seotud stereokeemiliste muutuste analüüsimiseks.
Olenevalt molekulist võib õige stereokeemiline hindamine nõuda sobivaid kromatograafilisi meetodeid, võrdlusühendeid, derivatiseerimisstrateegiaid või muid analüütilisi meetodeid, mis suudavad eristada olulisi struktuure.
Isiklikud analüütilised uuringud analüüsisid ka stereokeemilisi muutusi, mis toimuvad aminohapete sidumisel tahkete kandjatega.
See viib teise olulise järelduseni: valmis peptiidist leitud saaste ei pea pärinema viimasest sidestusreaktsioonist.
See võis tekkida varasemas etapis ja püsida sünteesi järgnevates etappides.
Aspartimiidi moodustumine on omaette probleem
Aspartimiidi moodustumine on spetsiifiline kõrvalreaktsiooni rada, mis on seotud asparaginaati sisaldavate tundlike peptiidijärjestustega.
Protsess hõlmab tsüklilise vaheprodukti moodustamist, millest võivad seejärel tekkida erinevad seotud struktuurid.
Need võivad hõlmata modifitseeritud sidemeid peptiidses selgroos ja stereokeemilisi variante.
Aspartamiidi teket ei tohki seetõttu kirjeldada lihtsalt kui mittetäieliku sidestamise teist nimetust.
Peptiidahel võib juba sisaldada õigeid aminohappejääke ja hilisem kõrvalreaktsioon võib muuta osa selle struktuurist.
Eksperimentaalsed uuringud näitavad, et seda protsessi võivad mõjutada kaitsmisstrateegia, naaberahelad ja kaitserühmade eemaldamisega seotud korduvad tingimused.
See eristus on eriti oluline sünteesil ilmnevate probleemide tõlgendamisel.
Lihtsalt sidestamise kordamine või suurema hulga sidestusreaktiivi lisamine ei paranda automaatselt saastust, mis on tekkinud täiesti teise keemilise raja tulemusena.
Mittetäielikud reaktsioonid toovad kaasa teistsuguse probleemi
Mittetäielik sidestus moodustab eraldi saasteainete kategooria.
Kui üks vaiguga seotud ahel ei saa plaanitud aminohapet, kuid reageerib hilisema tsükli jooksul õigesti, võib saadaval peptiidil see jääk puududa.
Sellist molekuli nimetatakse tavaliselt deletsioonijärjestuseks.
Teised ahelad võivad pikenemise lõpetada ja jääda lühemaks.
Need tooted erinevad põhimõtteliselt epimeeridest.
Epimeeril võib olla õige aminohappeanaloog ja empiiriline valem, kuid ühe tsentri stereokeemia on vale.
Deleetsioonipeptiidil on aga teistsugune järjestus või pikkus.
Mõned sünteesistrateegiad kasutavad nn cappingut, et takistada teatud reageerimata ahelate edasist pikenemist.
Capping ei paranda siiski defektset ahelat ega muuda seda sihtpeptiidiks.
See muudab ainult tema käitumist järgmistel etappidel.
Seega võib sünteesil saadud toores segu sisaldada mitme eri mehhanismi teel moodustunud saadusi.
Üheainsa koondnäitaja põhjal ei ole võimalik kindlaks teha, millised saaste tekkimise mehhanismid lõpptulemuse eest vastutasid.
Temperatuur ja protsessi tingimused mõjutavad kiiruse ja kvaliteedi vahelist kompromissi
Temperatuuri tõstmine või muud sünteesi kiirendamise viisid võivad suurendada soovitud reaktsioonide kiirust.
Samas võivad need aga ka kõrvaltoimeid kiirendada.
Mikrolaineidega toetatud SPPS-uuringutes analüüsiti ratsemiseerumist ja aspartimiidi teket mudelsüsteemides ning näidati, et kasutatud tingimustes sõltus tundlikkus jäägi tüübist.
See ei tähenda, et kuumutamine oleks peptiidide sünteesis iseenesest vale.
See ei tähenda ka seda, et madalam temperatuur oleks alati parem.
Kõige olulisem põhimõte on järgmine: protsessi kiirust ja keemilist kvaliteeti tuleb hinnata üheaegselt.
Kõrgem temperatuur, pikem kokkupuude või korduv töötlemine võivad mõjutada nii soovitud sidemete teket kui ka konkureerivaid reaktsioone.
Seega tuleks sobivat kompromissi hinnata eksperimentaalselt konkreetse jada puhul.
Lõpptoote muudatusi võib teha ka pärast ühendamise lõppu.
Uuringud, milles võrreldi erinevaid skavengereid peptiidi vaigust eraldamisel, näitasid erinevaid saasteainete profiile.
See tuletab meelde, et lõplikku saastumist ei tohiks automaatselt seostada konjugatsioonireaktsiooniga.
Peptiidi süntees on mitmeetapiline protsess ning sellele järgnev desproteineerimine, lõikamine ja edasine töötlemine võivad muuta materjali, mis oli varem õigesti üles ehitatud.
Kuidas hinnatakse sidumise tõhusust?
Protsessi käigus läbiviidavad testid annavad vastuseid vaid kindlatele küsimustele
Tahkes faasis toimuva sünteesi käigus võib järelejäänud vabade amiinirühmade tuvastamise test aidata hinnata, kas atsüülimisetapp võis jääda poolikuks.
Sellised testid võivad olla väga kasulikud.
Nende tõlgendamine peaks siiski piirduma keemilise küsimusega, millele kasutatud meetod tõepoolest vastust annab.
Sõltuvalt analüüsimeetodist ja aminohappe liigist võivad värvimuutusel põhinevad testid reageerida erinevatele amiinidele erinevalt.
Oluline on ka uuritava koha ligipääsetavus.
Reaktiivne aminorühm, millele testreaktiiv on füüsiliselt raske juurde pääseda, ei ole sama mis aminorühm, mis on korralikult läbinud konjugeerimisreaktsiooni — isegi kui antud test ei suuda neid olukordi üheselt eristada.
Piirangud võivad seega hõlmata reaktiivse koha kättesaadavust, testi tundlikkust, keemilisi häireid ning tuvastatava funktsionaalrühma tüüpi.
Protsessi käigus läbi viidud katse negatiivset tulemust ei tohiks automaatselt tõlgendada tõendina selle kohta, et kogu peptiidil on õige järjestus, stereokeemia ja puhtus.
Protsessi jälgimine on kõige väärtuslikum siis, kui selle tulemusi saab hiljem võrrelda tegeliku peptiiditoote analüüsiga.
Kromatograafia eraldab komponente ja massispektromeetria aitab neid iseloomustada
Kromatograafia ja massispektromeetria annavad üksteist täiendavat teavet.
Kromatograafia võib proovi komponente eraldada ja näidata rohkem kui ühe tuvastatava komponendi olemasolu.
Massispektromeetria võib anda teavet molekulmassist, aidates iseloomustada või identifitseerida üksikuid koostisosi.
Mõlemat meetodit ühendavad uuringud võimaldasid analüüsida peptiidide sünteesi toorprodukte tahkes faasis ning saada teavet nende identiteedi ja kaitserühmade eemaldamise astme kohta.
Mõlema meetodi kombineerimine annab tavaliselt rohkem teavet kui eeldus, et iga kromatograafiline piik on juba identifitseeritud või et iga tuvastatud mass vastab puhtale ja struktuurselt terviklikule fraktsioonile.
Siiski on endiselt piiranguid.
Erinevad komponendid võivad koelueeruda, st neid ei suudeta kromatograafiliselt täielikult eraldada.
Erinevad ained võivad samuti põhjustada detektoris erinevaid reaktsioone.
Struktuuriisomeerid ja stereoisomeerid võivad nõuda täiendavate analüüsimeetodite rakendamist.
Samest põhjusest ei tähenda pelgalt tõdemus, et peptiidi on analüüsitud HPLC meetodil, automaatselt seda, et kõik olulised lisandid on eraldatud.
Konkreetse HPLC meetodi sobivus sõltub tegelikult saavutatud eraldusvõimest ja analüütilisest küsimusest, millele tuleb vastata.
Tuleb selgitada, kuidas tulemus on arvutatud
Protsentuaalne väärtus, mis on antud seoses peptiidide sidumisega, võib tähendada mitut täiesti erinevat asja.
See võib viidata lähteaine konversioonile, kromatograafilise piki suhtelisele pinnale, sihttoote mõõdetud sisaldusele, toorsaagisele või eraldatud saagisele.
Pelgalt numbri esitamine ilma selgituseta, mille kohta see käib, võib seega jätta eksliku mulje suurest täpsusest.
Usaldusväärsed võrdlused peaksid määrama substraadi, analüüsitava sidestusetapi, kasutatud analüütilise meetodi, proovivõtu hetke ja uuritavate saasteainete tüübid.
Kui kasutatakse korduvat sidestamist, tuleb seda samuti arvesse võtta.
Lõpptulemus pärast kahte sidestusreaktsiooni ei pea kajastama seda, mis toimus esimese reaktsiooni käigus.
Sarnast ettevaatust nõuavad analüütiliste meetodite avastamispiirid.
Väide „ei avastatud” tähendab, et antud ainet ei avastatud teatud tingimustel ja kasutatud meetodi piirangute piires.
Seda ei tohiks automaatselt tõlgendada absoluutse väitena, et konkreetset saasteainet ei esine üldse.
Reagendi andmed peaksid hõlmama enamat kui lihtsat mudelit
Sidestusreaktiiv, mis toimib erakordselt hästi lihtsas mudelreaktsioonis, võib suure steerilise takistusega aminohappe, tundliku stereokeemilise tsentri, halvasti lahustuva substraadi või aggregatsioonialdis peptiidahela korral käituda teisiti.
Võrdlusuuringud Oxyma-B-ga mitmes mudelpeptiidis näitavad, miks on sidestuskeemia hindamine rohkem kui ühel substraadil väärtuslik.
Lõpptulemusena peaks kasulik sidumismeetod viima soovitud struktuurini, millel on aktsepteeritav lisandite profiil ja sihtsünteesi jaoks korratav tulemus.
Seetõttu on sidestustõhusust parem mõista erinevate mõõtmiste kogumina kui omadusena, mida kirjeldab ühe reagendi nimi või ühe substraadi lagunemistesti tulemus.
Korduma kippuvad küsimused
1. Miks on peptiidide sünteesi ajal vaja kaitserühmi?
Kaitserühmad piiravad ajutiselt soovimatuid reaktsioone, võimaldades õigetel funktsionaalrühmadel moodustada kavandatud peptiidsideme. Aminohapped võivad sisaldada mitut reaktiivset kohta ja kõigi nende samaaegne kättesaadavaks jätmine võib viia konkureerivate reaktsioonideni. Tõhus kaitsestrateegia peab arvestama ka kaitserühmade hilisema eemaldamise võimalusega ja nende ühilduvusega molekuli ülejäänud osaga. Mudeluuringud näitavad, et kaitserühmade valik võib mõjutada mitte ainult reaktsiooni põhiselektiivsust, vaid ka kõrvalsaaduste teket. Kaitserühm on seega sünteesistrateegia üks elemente, mitte universaalne lahendus kõigile keemilistele probleemidele.
2. Kas õige ühendamine võib siiski põhjustada saasteainete teket?
Jah. Soovitud peptiidside võib moodustuda, samal ajal kui teised samas segus olevad molekulid reageerivad mittetäielikult või osalevad soovimatutes kõrvalreaktsioonides. Seda näitavad eriti hästi epimeersete produktide uuringud, kuna õige sideme moodustumine ja õige stereokeemia säilitamine on eraldiseisvad küsimused. Sihtpeptiidi tuvastamine ei tähenda seega, et see on ainus olemasolev produkt. Sünteesi õnnestumise teaduslikult põhjendatud hindamine nõuab analüüsi määratletud lõpp-punkti ja teavet oluliste lisandite kohta.
3. Kas peptiidide sidestamine on sama mis kogu peptiidi süntees?
Ei. Sidestamine on sideme moodustamise üksik toiming palju laiema sünteesiprotsessi raames. Tahkfaassüntees võib hõlmata ka kandjaga ühendamist, kaitsmist, kaitsrühmade eemaldamist, mitmekordset pesemist, eraldamist, töötlemist, puhastamist ja lõplikku iseloomustamist. Kuna soovimatuid saadusi võib tekkida ka väljaspool sidamisetappi, ei tohiks lõplikku saastumist automaatselt valele sidumisele omistada ilma andmeteta, mis viitavad selle tegelikule päritolule.
4. Miks karboksüülrühm on aktiveeritud?
Karboksüülrühma aktiveerimine loob soodsama tee selle reaktsiooniks vastava aminorühmaga, hõlbustades seeläbi amiidsideme moodustumist. Suurenenud reaktiivsus võib aga võimaldada ka konkureerivaid reaktsioone. Seetõttu analüüsitakse sidestussüsteemide hindamisel mitte ainult sideme moodustumise tõhusust, vaid ka stereokeemilisi tagajärgi ja kõrvalsaaduste teket. Aktiveerimise eesmärk ei ole molekuli reaktiivsuse maksimaalne suurendamine, vaid reaktsiooni sobiva selektiivsuse saavutamine.
5. Milleks kasutatakse HATU-t?
HATU on sidestusreaktiiv, mida kasutatakse amiidsidemete moodustumise hõlbustamiseks, sealhulgas peptiidide sidestamisel. See ei ole peptiid ega kaitserühm. Võrdlusuuringud raskete peptiidijärjestustega näitavad, et HATU-d kasutavaid meetodeid tuleb hinnata reaktsioonitingimuste täielikus kontekstis. Pelgalt teave HATU kasutamise kohta ei kinnita täielikku konversiooni, stereokeemia säilimist ega paremat lisandite profiili.
6. Kas on olemas ühte parimat peptiidide sidestamise reaktiivi?
Ei. Ühtegi universaalset reaktiivide pingerida, mis sobiks igale peptiidile ja igale reaktsioonile, ei ole olemas. Tulemust voivad mõjutada steeriline takistus, substraadi lahustuvus, agregatsioon, stereokeemiline tundlikkus ja ahela kontekst. Seetõttu peaks reaktiivi valik tuginema konkreetse reaktsiooni jaoks mõõdetud tulemustele, mitte pelgalt selle mainele või populaarsusele.
7. Kas „sidestusreagens” ja „lisand” tähendavad sama asja?
Ei. Need mõisted võivad kirjeldada erinevaid funktsioone sidestussüsteemis. Sidestusreaktiiv võib otseselt osaleda aktiveerimises, samas kui lisand võib mõjutada vaheproduktide teket, reaktsiooni saagist, stereokeemilist terviklikkust või konkureerivaid keemilisi radasid. Seetõttu tuleb analüüsida kogu reaktsioonisüsteemi, mitte käsitleda kõiki selle komponente asendatavate ekvivalentidena.
8. Kas saab liita terveid peptiidifragmente üksikute aminohapete asemel?
Jah. Sidestusreaktsioon võib ühendada suuremaid kaitstud peptiidifragmente, mitte ainult üksikuid aminohappeid. Reageerivate komponentide suuruse suurenemine ei välista siiski vajadust kontrollida reaktsioonikoha selektiivsust, stereokeemiat ega lõpptoote omadusi. Fragmentide sidumisel on endiselt vaja tõendavaid andmeid selle kohta, et õige ühendus on tõepoolest korrektselt tekkinud.
9. Mis vahe on ratsemise ja epimeriseerumise vahel?
Ratsemiseerumine täpses tähenduses tähendab enantiomeerse rikastuse kadumist ratseemilise segu suunas, samas kui epimeriseerumine tähendab ühe stereogeense tsentre konfiguratsiooni muutumist molekulis, mis sisaldab mitut sellist tsentrit. Peptiidide sünteesi käsitlevas kirjanduses kasutatakse terminit ratsemiseerumine sageli laiemalt aminohappejääkide soovimatute konfiguratsioonimuutuste kirjeldamiseks. Seega peaks täpne määratlus vastama tegelikule struktuurimuutusele.
10. Kas massispektromeetria suudab tuvastada iga stereokeemilise vea?
Ei. Stereoisomeeridel võib olla täpselt sama molekulmass. Oodatud massi saamine ei kinnita seega iga stereogeense tsentri õiget konfiguratsiooni. Selliste erinevuste hindamiseks võib vaja minna täiendavaid meetodeid, näiteks sobivaid kromatograafia tehnikaid või derivatiseerimisstrateegiaid. Massispektromeetria on endiselt äärmiselt kasulik tööriist molekulaarseks iseloomustamiseks, kuid selle tulemusi tuleb tõlgendada vastavalt konkreetse struktuuriküsimuse piirangutele.
11. Kas aspartimiidi moodustumine tähendab lihtsalt ebaõnnestunud sidestamist?
Ei. Aspartimiidi moodustumine on eraldiseisev kõrvalreaktsiooni rada, mis on seotud asparagiinhapet sisaldavate tundlike järjestustega. Seda võivad mõjutada naaberahelad ja kaitserühmade eemaldamisega seotud tingimused. Soovimatu struktuurimuutus võib seega toimuda isegi siis, kui vastav aminohape on eelnevalt õigesti liidetud. Saaste päritolu kindlakstegemine on oluline, sest sidestamise kordamine ei pruugi lahendada täiesti teisest reaktsioonirajast tulenevat probleemi.
12. Kas sidestamise kordamine tagab reaktsiooni õnnestumise?
Ei. Sidestamise kordamine võib mõnel juhul parandada konversiooni, kuid see ei garanteeri, et kõik reaktiivsed kohad muutuvad kättesaadavaks ega seda, et muud kõrvalreaktsioonid elimineeritakse. Tulemus sõltub siiski substraadist ja kasutatud meetodist. Seetõttu on toote analüüs hädavajalik, et teha kindlaks, mida täiendav sidestamine tegelikult andis.
13. Kas kõrgem temperatuur parandab alati sidumiskvaliteeti?
Ei. Temperatuuri tõstmine võib kiirendada soovitud reaktsiooni, kuid see võib kiirendada ka soovimatuid keemilisi protsesse. Seetõttu ei tohiks kiiremat muundumist automaatselt tõlgendada keemilise kvaliteedi paranemisena. Temperatuuri tuleb hinnata nii sihttoote moodustumise kui ka tekkivate lisandite profiili seisukohast.
14. Kas vaba aminorühma kadumine kinnitab õige peptiidi teket?
Ei. Tuvastamatu vaba amiinorühm vastab palju kitsamale küsimusele, mis puudutab konkreetset funktsionaalrühma kasutatud testi tingimustes. See ei kinnita iseenesest peptiidi täielikku järjestust, stereokeemiat ega puhtust. Vabade amiinorühmade seire võib olla protsessi kontrolli kasulik element, kuid see ei asenda toote lõplikku karakteriseerimist.
15. Kas HPLC puhtus on sama mis haakeseadme jõudlus?
Ei. HPLC puhtus ja saagis kirjeldavad erinevaid omadusi. HPLC puhtus on meetodist sõltuv kirjeldus proovi tuvastatud komponentide koostise kohta, samas kui saagis viitab kindla saaduse kogusele, mis saadi määratletud lähteaine koguse suhtes. Puhastamine võib suurendada kromatograafilist puhtust ja samal ajal vähendada taastatud sihtsaaduse kogust. Seetõttu on protsendiväärtusel piiratud tähendus, kui ei ole täpselt kindlaks määratud, mida see esindab.
16. Kas reostust võib tekkida juba pärast siduri ühendamise lõpetamist?
Jah. Pärast sidestusreaktsiooni lõppemist hõlmab peptiidi süntees täiendavaid keemilisi etappe. Kaitserühmade eemaldamine, eraldamine ja edasine töötlemine võivad molekuli modifitseerida või põhjustada täiendavate lisandite teket. See ei tähenda, et iga lõplik lisand tekib hilisemates etappides, kuid see näitab, miks korrektne sidestamine ei garanteeri lõpptoote kvaliteeti.
17. Mis teeb sidumismeetodite võrdluse usaldusväärseks?
Usaldusväärne võrdlus peaks hindama alternatiivseid meetodeid sama, selgelt määratletud eesmärgi saavutamiseks ja piisavalt võrreldavates tingimustes. See peaks näitama kasutatud substraate, proovivõtuetappi, analüüsimeetodeid ja hinnatud saasteainete liike, selle ainsa põhjendamatu protsendimäära esitamise või reaktiivi mainele tuginemise asemel. Mitut erinevat mudelpeptiidi hõlmavad võrdlused võivad anda rohkem teavet kui üksainus lihtsa substraadiga saavutatud kõrge efektiivsus, kuna need näitavad, kuidas tõhusus molekulaarse kontekstiga muutub. Isegi siis peaksid järeldused piirduma tegelikult uuritud keemiliste süsteemidega.
Kokkuvõte
Peptiidide sidestamine on peptiidide keemilise sünteesi alustala, kuna see viib amiidsidemete moodustumiseni, mis ühendavad aminohappejäägid peptiidahelaks. Sidestamise kirjeldamine pelgalt „kahe aminohappe ühendamisena” jätab aga tähelepanuta suure osa sellest keemiast, mis määrab, kas saadud produkt on tegelikult soovitud peptiid.
Karksüülrühma sisaldav komponent vajab tavaliselt aktiveerimist, et amiidsideme efektiivne moodustumine saaks toimuda sobival viisil. Siduvad reaktiivid ja lisandid võivad seda protsessi hõlbustada, kuid nende efektiivsus sõltub substraadist, reaktsioonikeskkonnast ja tulemuse analüütilisest hindamisest. Seetõttu tuleb reaktiivi analüüsida täielikus eksperimentaalses kontekstis, mitte liigitada seda sünteesitavast peptiidist sõltumatult.
Kaitserühmad tagavad täiendava kontrollitaseme, takistades ajutiselt soovimatutel funktsionaalrühmadel reaktsioonis osalemist. Nende kasulikkus ei sõltu mitte ainult tõhusast kaitsmisest, vaid ka selektiivse eemaldamise võimalusest ja ühilduvusest järgmiste sünteesietappidega. Kaitsmisstrateegia ja naabruses asuvad aminohappejäägid võivad samuti mõjutada teatud kõrvalsaaduste teket.
Stereokeemiline identsus on veel üks oluline element. Sestestusreaktsioon võib viia amiidsideme moodustumiseni ja samal ajal tekitada epimeerset materjali. Kuna epimeeril võib olla õige peptiidiga sama molekulmass, ei kinnita pelgalt massi vastavus täielikku struktuurilist õigsust. Konfiguratsioonimuutusi võib tekkida ka teistes etappides, näiteks aminohappe esialgsel sidumisel tahke faasiga.
Muud lisandid tekivad teiste mehhanismide kaudu. Mittetäielik sidestamine võib viia deletsiooni- või lühendatud järjestuste tekkeni, samas kui aspartimiidiga seotud reaktsioonid võivad modifitseerida peptiidi, mis juba sisaldab õigeid aminohappejääke. Protsessi kiirendamine võib mõjutada nii soovitud reaktsioone kui ka kõrvalsaadusi ning täiendavaid lisandeid võib tekkida ka hilisemates etappides, näiteks eraldamisel.
Nendel põhjustel nõuab peptiidide sidestamise hindamine enamat kui lihtsalt kindlakstegemist, kas lähteaine on kadunud.
Konversioon, sihtsaaduse teke, eraldatud saagis, kromatograafiline puhtus ja stereokeemiline puhtus vastavad erinevatele küsimustele.
Sünteesi käigus tehtud testid võivad aidata tuvastada puudulikke reaktsioone, kuid ei kinnita iseseisvalt peptiidi täielikku struktuuri. Kromatograafia ja mass spectrometry pakuvad täiendavat teavet, samas kui stereokeemia või väga sarnaste struktuuridega seotud küsimused võivad nõuda täiendavaid analüüsimeetodeid.
Kõige põhjendatum lähenemine peptiidide sidumisele on seega suunatud konkreetsele molekulile ja põhineb andmetel.
Kasulik sidestamismeetod ei ole lihtsalt meetod, mis kasutab kõige tuntumat või reaktiivsemat reaktiivi. See on meetod, mis viib korratavalt soovitud molekulaarse ühenduse moodustumiseni, säilitades samal ajal konkreetse sünteesitava peptiidi jaoks sobiva stereokeemilise terviklikkuse ja oluliste lisandite kontrolli.
Viited
- Subirós-Funosas, R., Prohens, R., Barbas, R., El-Faham, A., & Albericio, F. (2009). Oxyma: An efficient additive for peptide synthesis to replace the benzotriazole-based HOBt and HOAt with a lower risk of explosion. Chemistry—A European Journal, 15(37), 9394–9403. https://doi.org/10.1002/chem.200900614
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Racemisatsiooni uuringud peptiidide sünteesis kaitstud epimeersete peptiidide eraldamise teel faasivastase kõrgsurve vedelikkromatograafia abil. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Evaluation of combined use of Oxyma and HATU in aggregating peptide sequences. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Jad, Y. E., Khattab, S. N., de la Torre, B. G., Govender, T., Kruger, H. G., El-Faham, A., & Albericio, F. (2014). Oxyma-B, an excellent racemization suppressor for peptide synthesis. Organic & Biomolecular Chemistry, 12(42), 8379–8385. https://doi.org/10.1039/c4ob01612b
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Tahke faasi peptiidsüntees: Standardsetest protseduuridest raskete järjestuste sünteesini. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Aspartimiidiprobleem Fmoc-põhises SPPS-is. I osa. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Aspartiimiidiprobleem Fmoc-põhises SPPS-is. II osa. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Use of Marfey’s reagent to quantitate racemization upon anchoring of amino acids to solid supports for peptide synthesis. Analytical Biochemistry, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Palasek, S. A., Cox, Z. J. ja Collins, J. M. (2007). Ratsemiseerumise ja aspartimiidi tekke piiramine mikrolaineahjus kiirendatud Fmoc-tahkfaasi peptiidisünteesis. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-Benseendimetaantiool (1,4-BDMT) püünisainena peptiidide vaigu keskkonnasõbralikumaks eraldamiseks. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., & Pallai, P. (1991). The characterization of crude products from solid-phase peptide synthesis by mu-HPLC/fast atom bombardment mass spectrometry. Peptiidide uuringud, 4(1), 40–46. PubMed