Combinarea peptidelor este un proces chimic care duce la formarea unei legături între componenta care conține o grupă carboxilică și componenta care conține o grupă aminoacidică. În urma acestei reacții se formează o legătură amidică. Când această legătură leagă resturile de aminoacizi în timpul sintezei peptidelor, aceasta devine parte a ceea ce este cunoscut sub numele de scheletul peptidic.
Componentele reactoare nu trebuie să fie aminoacizi individuali. Reacția de legare poate lega un aminoacid de un alt aminoacid, poate lega un alt aminoacid la lanțul peptidic în creștere sau poate lega fragmente mai mari de peptide care au fost sintetizate anterior separat.
La prima vedere, combinarea peptidelor poate părea o sarcină simplă: este suficient să se combine un aminoacid cu următorul.
Din punct de vedere chimic, formarea unei legături amidică este însă doar o parte a întregului scop.
Reacția trebuie să aibă loc în locul potrivit și cu o configurare stereochemică adecvată, în timp ce celelalte grupuri funcționale reactive trebuie să rămână controlate corespunzător. Reacția poate parțial să aibă succes și poate consuma majoritatea sau chiar întreaga cantitate inițială de material, dar totuși să ducă la apariția unei amestecuri nedorite a peptidei țintă și a altor structuri.
De aceea, finalizarea reacției și formarea corectă a produsului nu înseamnă același lucru.
Analizele care compară diferite sisteme de ligare, strategiile de protejare a grupurilor funcționale și rezultatele stereochemică arată de ce nu există un agent de ligare universal cel mai bun, independent de tipul de peptidă sintetizat.
Din punct de vedere științific, întrebarea mai utilă nu este, prin urmare:
„Care este agentul de legare cel mai bun?”
O întrebare mai bună ar fi:
„Care este abordarea care permite obținerea peptidu-lui dorit cu o conversie adecvată, conservarea integrității stereociclică și controlul adecvat al contaminanților în condiții adecvate pentru particula respectivă?”
Această distincție este de o importanță fundamentală pentru înțelegerea chimiei legării peptidelor.
Ce înseamnă legarea peptidelor?
Combinarea leagă două componente printr-o nouă legătură
În reacția tipică care duce la formarea unui schelet peptidic, grupul carboxilic legat de o restă a aminoacizilor este combinat cu grupul amino al celeilalte resturi.
Combinatia rezultata este o legatura amidica chimicata.
Dacă această legătură leagă resturile de aminoacizi din lanțul peptidic, aceasta este adesea denumită legătură peptidică.
Distribuția fizică exactă a componentelor reactive depinde de strategia de sinteză utilizată.
În timpul sintezei peptidelor în fază stază, grupul amino desprins este de obicei din lanțul peptidic crescător legat de polimer, în timp ce componenta care conține grupul carboxilic provine de la aminoacidul proteic introdus în mod sigur.
În sinteza efectuată în soluție, ambele componente pot fi, însă, în fază lichidă.
În cazul ligării fragmentelor, segmentele peptidice mai mari și protejate sunt unite, în loc să se adauge câte o singură restă de aminoacizi una după alta.
Diverse strategii schimbă modul de gestionare a reacțiilor, de separare a materialelor și de eliminare a acestora, dar nu elimină problema chimică de bază: grupurile funcționale adecvate trebuie să reacționeze între ele, în timp ce reacțiile nedorite în alte părți ale moleculei trebuie să rămână limitate în mod corespunzător.
Formarea unei legături, conversia și performanța sunt concepte diferite
Câteva termeni folosiți adesea pentru a descrie legarea peptidelor pot părea similari, deși se referă la aspecte diferite.
Conversia indică care parte a materialului inițial a fost reactivă.
Însă nu spune automat în ce s-a transformat acest material.
Dacă 99% din materialul de inițiere dispare, dar o parte din acesta va produce produse secundare nedorite, conversia de 99% nu înseamnă că s-a produs 99% din peptidul dorit.
Crearea produsului final răspunde la o altă întrebare: ce cantitate de structură moleculară dorită a fost, de fapt, creată? Răspunsul necesită o metodă analitică care să permită deosebirea produsului corect de structurile alternative relevante.
Productivitatea izolată descrie cantitatea unui produs specific recuperată în cele din urmă în raport cu cantitatea inițială de material. Prin urmare, productivitatea finală poate fi influențată și de etapele de prelucrare, separare și purificare, chiar dacă asamblarea însăși a fost efectuată eficient.
Clasificarea cromatografică descrie distribuția componentelor detectate în condițiile unei anumite metode cromatografice. Aceasta poate furniza informații foarte valoroase despre compoziția probei, dar interpretarea ei poate fi limitată de coeficientul de eluzie, diferențele în răspunsul detectorului sau prezența componentelor slab detectate de această metodă.
Starea stereochimică pură răspunde, însă, la întrebarea dacă a fost păstrată configurația spațială intenționată a moleculei. Aceasta este o problemă analitică distinctă, deoarece anumite variante stereochimice pot avea exact aceeași masă moleculară ca produsul final.
Aceste diferențe ajută la înțelegerea rezultatelor care, la prima vedere, pot părea contradictorii.
Reacția poate prezenta o conversie ridicată a materiei prime și, în același timp, poate duce la formarea mai multor produse. Preparatul brut poate avea o masă recuperată semnificativă, dar poate conține o cantitate semnificativă de contaminanți. O curățare intensivă poate, în schimb, duce la obținerea unui material cu o puritate ridicată, în detrimentul unei performanțe izolate mai scăzute.
Niciuna dintre aceste observații nu este în sine în contradicție cu celelalte.
Le descriu pur și simplu diferite proprietăți ale produsului sau diferite etape ale procesului.
De aceea, afirmația „analiza a fost completă” are o valoare mult mai mare dacă se știe, de asemenea, ce metodă analitică a fost folosită și exact ce s-a măsurat.
Substraturile dificile dezvăluie diverse limitări ale procesului
Nu fiecare reacție de legare a peptidelor implică același grad de dificultate chimică.
Un loc reactiv foarte aglomerat poate încetini formarea legării, deoarece grupurile reactante au acces dificil la ele însele.
Dificultatea de dizolvare poate limita contactul eficient dintre componentele unei reacții.
În sinteza în fază constantă, un lanț peptidic în creștere poate interacționa cu lanțurile adiacente sau poate absorbi structuri care limitează accesul la locurile de reacție, chiar dacă reactanții de legare sunt prezente în exces aparent.
Aceste probleme au diferite substraturi chimice.
Nu se poate deci presupune că o soluție va fi automat eficientă în toate cazurile.
Analizele care comparau strategiile de ligare repetată pentru secvențe peptide dificile au analizat compoziția reală a produselor brute obținute, în loc să se bazeze pe evaluarea exclusivă a reactivității teoretice sau a reputației diferitelor reactivi. O strategie analizată a avut rezultate bune în modelele analizate, dar aceasta nu înseamnă că există o soluție universală adecvată pentru fiecare secvență peptidică.
Concluzia cea mai importantă este că eficacitatea metodei trebuie evaluată în funcție de produsul obținut din substratul respectiv, și nu doar pe baza reputației agentului utilizat.
Activarea grupului carboxilic
De ce este de obicei necesară activarea?
Întreaga amestecare a acizilor carboxilic nemodificat cu o aminoacidă în condiții obișnuite nu duce de obicei la formarea unui legament peptidic pur.
În schimb, pot apărea reacții acido-bazice, iar formarea eficientă a legării amidice necesită o cale chimică adecvată.
De aceea, legarea peptidelor implică de obicei activarea componentei care conține o grupă carboxilică.
Activarea îi sporește sensibilitatea la reacția cu grupul amino corespunzător. Mediu de reacție adecvat și grupul de scădere corespunzător facilitează formarea unui nou legament amidic.
Un produs intermediar activat poate exista doar pentru o perioadă scurtă de timp și nu trebuie să fie izolat.
Scopul nu este însă obținerea maximului posibil de reactivitate chimică.
Scopul este o reacție controlată.
Un produs intermediar activat care reacționează foarte rapid cu apă, cu un alt nucleofil nedorit sau care participă la o reacție competitivă, poate dispărea rapid, dar în același timp poate duce la formarea unei cantități relativ mici de peptidă dorită.
Reactivitatea ridicată este, prin urmare, benefică numai atunci când aceasta poate fi direcționată în mod adecvat spre formarea legării dorite.
Agentii de îmbinare și aditivi au funcții diferite
În procesul de sinteza peptidelor pot participa mai multe tipuri de substanțe chimice care îndeplinesc funcții diferite.
Carbodiimidurile sunt una dintre familiile de reactivi utilizate pentru activarea grupărilor carboxilice.
Alte sisteme de conexiune utilizează mecanisme de activare diferite, inclusiv adesea reacțiile tip „oniowe”, cum ar fi sistemele bazate pe HATU.
Legături suplimentare pot servi drept accesorii.
Determinarea „aditivului” nu înseamnă însă că acel compus chimic este irelevant. Aditivul poate influența produsele intermediare, performanța de legare, căile de reacție competitive și rezultatele stereociclic.
Investigațiile asupra Oxyma în sinteza peptidelor cu participarea carbidimidilor au analizat atât eficiența legării, cât și limitarea racemizării în modelele selectate.
Aceste date sunt valoroase pentru sistemele și modelele analizate.
Cu toate acestea, aceasta nu înseamnă că utilizarea aceleiași substanțe în orice combinație posibilă a peptidelor va produce același rezultat.
Studiile ulterioare cu instrumentul Oxyma-B au comparat rezultatele privind puritatea optică în diferite modele peptidice.
Analiza multor substraturi este deosebit de importantă, deoarece rezultate foarte bune în legarea chimică ușoară nu trebuie să indice comportamentul reactantului într-un mediu aglomerat din punct de vedere termodinamic, susceptibil la agregare sau sensibil din punct de vedere stereochemic.
Ce înseamnă HATU în sinteza peptidelor?
HATU este un agent de ligare utilizat pentru facilitarea formării legăturilor amidice, inclusiv în timpul sintezei peptidelor.
HATU nu este un peptid.
Nu este nici o grupă de protecție.
Sălbăitul său în sine nu constituie dovada că legarea s-a încheiat sau că peptidul obținut este pur.
Eficienta depinde de tipul substratului, de restul reactantilor, de sistemul de solvenți și de contextul mai larg al conditiilor de reactie.
Analizele secvențelor sensibile la agregare au comparat, printre altele, abordările bazate pe HATU și sistemele Oxyma/karbodiimid în condiții de aglomerare repetată.
Acest lucru arată de ce căutări precum „HATU peptide” trebuie interpretate ca întrebări privind chimia legării și alegerea metodei, și nu ca o dovadă că un anumit agent este metoda universală de sinteză a peptidelor.
Singura denumire a reactantului nu este suficientă pentru a reproduce și a interpreta corect rezultatul publicat.
Importanța au, de asemenea, condițiile reacției, secvența peptidică și modul de definire analitică a succesului procesului.
Activarea și controlul stereochemic necesită menținerea echilibrului
Menținerea prelungită a unei forme derivate de aminoacid activat în sistemul de reacție nu este întotdeauna benefică.
Reacția de legare dorită apare alături de alte procese chimice posibile.
Câteva rute competitive pot schimba stereotipurile.
Analizele experimentale asupra produselor epimere protejate au analizat impactul combinării aminoacizilor, al solventului și al altor ingrediente ale reacției asupra schimbărilor stereocinetice care au loc în timpul ligării cu participarea carbidimidilor.
Acest lucru evidențiază o regulă importantă: întregul mediu de reacție poate fi la fel de important ca și familia generală de reactivi utilizate pentru legarea.
Strategia de combinare trebuie să asigure o reacție suficientă pentru a obține legarea dorită, limitând în același timp posibilitatea apariției reacțiilor nedorite.
Aceste reguli pot fi discutate în scopuri educaționale fără a le transforma într-un protocol de laborator gata făcut. Cantitățile exacte ale reactanților, ordinea adăugării lor și condițiile reacției depind de procesul de sinteză specific pe care îl desfășurăm.
Rolul grupurilor de protecție
Securizarea limitează locurile de reacție competitive
Un aminoacid poate conține mai multe grupuri reactive decât doar grupurile amino și carboxilă necesare pentru formarea structurii peptoidice.
Lanțul său lateral poate conține grupuri chimice reactive suplimentare.
Dacă toate grupurile potențial reactive ar rămâne deschise pe parcursul fiecărui etapă de legare, formarea intenționată a unei legături peptidice ar putea concura cu fragmentarea sau cu alte reacții nedorite.
Strategia care utilizează grupuri de protecție permite temporar masarea locurilor selectate pentru reacții.
Astfel, grupurile amino și carboxilice pot reacționa împreună, în timp ce alte locuri rămân inaccesibile sau sunt suficient de puțin reactive în acele condiții.
Securizarea asigură astfel selectivitate chimică.
O strategie eficientă însă nu se poate ajunge doar prin aducerea unei grupări stabilă din punct de vedere chimic.
Grupul de protecție trebuie, de asemenea, eliminat mai târziu.
Oprea care previne eficient reacțiile nedorite în timpul ligării, dar care nu poate fi ulterior eliminată fără deteriorarea moleculei țintă, creează o nouă problemă sintetică.
O strategie complete trebuie să țină cont atât de stabilitatea în perioada în care este necesară protecția, cât și de posibilitatea eliminării selective a protecției atunci când aceasta nu mai este necesară.
Siguranțele temporare și pe termen lung au funcții diferite
Grupările de protecție individuale pot rămâne pe fragment pentru o perioadă variabilă de timp.
În sinteza tipică la fază constantă, utilizând protecția Fmoc pentru grupul amino final al lanțului crescător, acesta este eliminat de mai multe ori pe măsură ce secvența se prelungeste.
Multe grupuri de protecție a lanțurilor laterale rămân însă prezente pe parcursul mai multor cicluri de legare și nu sunt eliminate decât la un moment ulterior.
Metodele standard bazate pe Fmoc arată modul în care ciclurile repetate de eliminare selectivă a protecțiilor și de ligare sunt coordonate.
Tipul de protecție necesar pentru un lanț lateral specific depinde de restul aminoacizilor, de întregul peptid și de strategia de sinteză aleasă.
Nu ar fi deci corect să se afirme că fiecare aminoacid necesită o protecție identică sau că toate sintezele utilizează aceleași grupuri de protecție.
Grupurile de protecție temporare trebuie, de asemenea, distins de grupurile chimice care rămân intenționat în peptida finală.
Modificarea planificată a grupului N la capătul C, de exemplu, poate constitui un element al structurii finale.
În schimb, o grupă de protecție temporară care a rămas accidental în componenta finală ar însemna o diferență structurală nedorită.
Ortogonalitatea este o condiție pentru conformitatea chimică
Protecția ortogonală înseamnă o strategie în care grupurile de protecție selectate pot fi eliminate, lăsând alte măsuri de securitate suficient de intacte.
Acest lucru permite detectarea diferitelor locuri reactivatoare în etapele de sinteză selectate în mod intenționat.
Ortogonalitatea nu trebuie înțeleasă pur și simplu ca o proprietate a unui singur ingredient scris pe etichetă.
Aceasta descrie conformitatea între întreaga secvență planificată a operațiunilor chimice.
Eliminarea intenționată a protecției trebuie să se desfășoare fără a provoca modificări nedorite în celelalte părți ale peptidu-ului crescator.
În sinteza la fază constantă, această conformitate poate include, de asemenea, sistemul suport-conexiune și blocurile de construcție neobișnuite sau special sensibile din punct de vedere chimic.
Investigațiile privind formarea aspartimidului, în care s-au modificat protejările lanțurilor laterale și ale structurii în un model peptidic, au evidențiat diferențe în formarea produselor secundare.
Acest lucru arată că alegerea mecanismului de protecție poate influența nu doar apariția unei reacții evidente a lanțului lateral.
Acesta poate, de asemenea, modifica alte căi de formare a poluanților în timpul sintezei.
Echipa de protecție nu face ca toate secvențele să se comporte la fel
Chiar dacă două secvențe conțin același aminoacid potențial problematic, nu trebuie să se comporte identic.
Restul vecinilor poate influența probabilitatea apariției unor reacții competitive.
Analizele sistematice ale secvențelor model care conțineau asparagină au demonstrat că aminoacidul care urmează acestei resturi a influențat formarea produselor asociate cu aspartimidul în condițiile studiate.
Acest lucru nu înseamnă că fiecare secvență care conține un astfel de motiv trebuie să provoace probleme.
În schimb, arată că contextul secvenței trebuie luat în considerare atunci când se dezvoltă metoda și se evaluează riscul.
Strategia de protecție care s-a dovedit eficientă pentru un singur peptid model nu garantează un comportament identic pentru fiecare alt peptid care conține aceeași restă.
Racializarea și alte reacții secundare
Racemizarea și epimerizarea se referă la structura spațială a moleculei
Multe dintre resturile de aminoacizi conțin un centru stereogenic.
O schimbare a configurației unui astfel de centru poate duce la apariția unei molecule cu structură diferită, chiar dacă compoziția elementară și masa moleculară rămân neschimbate.
Strict vorbind, racemizarea înseamnă pierderea îmbogățirii enantiomere în direcția unei amestecuri racemic.
În un polipeptid care conține multe centre stereoizomerice, inversarea configurației unui anumit centru conduce, de obicei, la apariția unui epimer, adică a unui tip de diastereoisomer.
În literatura privind sinteza peptidelor, termenul „racemizare” este însă utilizat mai larg în sensul modificărilor nedorite ale configurației care au loc în timpul ligării sau în alte etape ale sintezei.
Această distincție este importantă, deoarece identitatea unui peptid nu depinde exclusiv de atomii care se află în moleculă.
Importanța are și distribuirea lor spațială.
Nu toate resturile de aminoacizi sunt asociate cu același risc de stereochemică.
Glicina, de exemplu, nu conține un atom de carbon alfa tipic, prezent în majoritatea aminoacizilor.
Restul celorlalte tipuri de proteine sunt sensibile la schimbările de configurare în funcție de structura și mediul de reacție în care se găsesc.
Greșelii de masă pot fi însoțite de erori de stereochimie
Un peptid epimeric poate avea exact aceeași masă moleculară ca și peptida țintă.
Prin urmare, constatarea masei așteptate prin spectrometrie de masă nu demonstrează în mod automat că fiecare restă de aminoacid a păstrat configurația stereochimică dorită.
Analizele cromatografice au permis separarea peptidelor epimere protejate și utilizarea acestor fracțiuni pentru analiza modificărilor sterechimice asociate cu chimia de legare.
În funcție de moleculă, o evaluare stereochimică adecvată poate necesita metode cromatografice adecvate, compuși de referință, strategii de derivare sau alte metode analitice capabile să distingă structurile relevante.
Analizele individuale au analizat, de asemenea, schimbările stereociclic ale aminoacizilor în timpul legării lor cu suporturile fixe.
Acest lucru duce la următorul concluzie importantă: poluarea detectată în peptidul finit nu trebuie să provină din ultima reacție de ligare.
Ar fi putut să apară la un moment anterior și să rămână prezent în etapele ulterioare de sinteză.
Formarea aspartimidului este o problemă separată
Formarea aspartimidului este un proces specific al reacției secundare asociat cu secvențe peptide sensibile care conțin asparagină.
Procesul implică crearea unui produs intermediar ciclic, din care pot apărea apoi diverse structuri similare.
Acestea pot include modificări ale structurii peptidei și variante stereochimice.
Formarea aspartimidului nu trebuie, prin urmare, descrisă pur și simplu ca o altă denumire pentru un proces de legare incompletă.
Un lanț peptidic poate deja să conțină resturi aminoacide adecvate, iar reacția secundară poate modifica o parte din structura sa.
Analizele experimentale arată că procesul poate fi influențat de strategia de protecție, resturile adiacente și condițiile repetate asociate eliminării grupurilor de protecție.
Această distincție este deosebit de importantă în interpretarea problemelor care apar în sinteză.
Oricât de des se repetă reacția de ligare sau se adaugă mai multă substanță de ligare, aceasta nu va remedia automat contaminarea care a apărut ca urmare a unui alt traseu chimic.
Reacțiile incomplete duc la alte tipuri de probleme
Înconjurarea incompletă creează o categorie separată de poluare.
Dacă un lanț de proteine nu primește aminoacidul planificat, dar reacționează corect în timpul ciclului următor, peptidul rezultat poate fi lipsit de această restă.
O astfel de moleculă se vorbește de obicei ca fiind o secvență de deleție.
Alte lanțuri pot înceta să se prelungească și să rămână scurte.
Aceste produse diferă în principiu de epimeri.
Un epimer poate avea o secvență aminoacidică corectă și un model sumar, dar o stereochimie necorespunzătoare la un singur centru.
Peptida de deleție are, însă, o secvență sau o lungime diferită.
Unele strategii de sinteza utilizeaza ceea ce se numeste capping pentru a impiedica prelungirea ulterioara a anumitor lanțuri care nu au reactionat inca.
Cappingul nu repară lanțul defect și nu îl transformă în peptidul țintă.
Îi schimbă doar comportamentul în etapele ulterioare.
Mica amestecul obținut în timpul sintezei poate astfel să conțină produse formate în urma mai multor mecanisme diferite.
Valoarea totală a performanței nu permite să se determine care mecanisme de formare a poluanților au fost responsabile de rezultatul final.
Temperatura și condițiile procesului influențează compromisul dintre rapiditate și calitate
Creșterea temperaturii sau alte metode de accelerare a sintezei pot crește viteza reacțiilor dorite.
Totodată, acestea pot accelera reacțiile adverse.
Analizele SPPS cu microfoane asistate au analizat racemizarea și formarea de aspartimid în sistemele model și au demonstrat o sensibilitate dependentă de tipul restului în condițiile utilizate.
Acest lucru nu înseamnă că încălzirea este în mod natural ineficientă în sinteza peptidelor.
Nu înseamnă, de asemenea, că o temperatură mai scăzută este întotdeauna mai bună.
Principul cel mai important este următorul: viteza procesului și calitatea chimică trebuie evaluate concomitent.
O temperatură mai ridicată, o expunere mai lungă sau o prelucrare repetată pot afecta atât formarea dorită a legăturilor, cât și reacțiile competitive.
Un compromis adecvat ar trebui deci să fie evaluat experimental pentru o anumită secvență.
Modificările produsului final pot apărea și după încheierea procesului de asamblare în sine.
Analizele comparatoare ale diferitelor scavengere în timpul separării peptidelor din rășină au evidențiat profile de contaminare diferite.
Acest lucru amintește de faptul că poluarea finală nu trebuie atribuită în mod automat reacției de combinare.
Sinteza peptidu este un proces multistadiu, iar ulteriorul de desfacere, de separare și de prelucrare poate modifica materialul care a fost construit anterior corect.
Cum se evaluează eficiența aliniamentului?
Testele efectuate în timpul procesului răspund doar la întrebări specifice
În timpul sintezei la fază constantă, un test pentru detectarea restului grupurilor aminoacide disponibile poate ajuta la evaluarea faptului dacă etapa de acilare a putut fi parțială.
Astfel de teste pot fi foarte utile.
Interpretarea lor ar trebui însă să se limiteze la întrebarea chimică la care metoda aplicată răspunde cu adevărat.
În funcție de metoda analitică și de tipul de aminoacid, testele bazate pe schimbarea culorii pot reacționa în mod diferit la diferite aminoacizi.
Importanța are, de asemenea, disponibilitatea locului în care se desfășoară testarea.
Opozițională grupul aminoacidic, la care agentul de testare are acces fizic dificil, nu este același cu grupul aminoacidic care a trecut corect reacția de ligare — chiar dacă testul respectiv nu poate distinge în mod clar aceste situații.
Restrictiile pot include astfel disponibilitatea locului de reactivare, sensibilitatea testului, interferentele chimice si tipul grupului functional detectat.
Un rezultat negativ la testul efectuat în timpul procesului nu trebuie interpretat automat ca dovadă că întregul peptid are o secvență, o stereochimie și o puritate corecte.
Monitorizarea procesului este cea mai valoroasă atunci când rezultatele acestuia pot fi apoi comparate cu analiza produsului peptidic real.
Cromatografia împarte, iar spectrometria masă ajută la caracterizarea componentelor.
Cromatografia și spectrometria de masă furnizează informații complementare.
Cromatografia poate separa componentele probei și poate evidenția prezența mai multor componente detectabile.
Spectrometria masă poate furniza informații despre masa moleculelor, contribuind la caracterizarea sau atribuirea diferitelor componente.
Analizele care combină ambele tehnici au permis analizarea produselor brute de sinteza peptidelor la fază solidă și obținerea informațiilor privind identitatea acestora și gradul de eliminare a grupurilor de protecție.
Combinarea celor două metode oferă de obicei mai multe informații decât presupunerea că fiecare pixel cromatografic a fost deja identificat sau că fiecare masă detectată corespunde unei fracțiuni pure și structural completă.
Cu toate acestea, există anumite limitări.
Componentele diferite pot coexista, adică să nu fie complet separate cromatografic.
Substanțele individuale pot, de asemenea, cauza o răspuns diferit al detectorului.
Izomerele structurale și izomerele stereo pot necesita utilizarea de metode analitice suplimentare.
Din același motiv, simpla afirmație că un peptid a fost testat prin metoda HPLC nu înseamnă automat că toate contaminanții relevanți au fost distruse.
Utilitatea metodei HPLC specifice depinde de diviziunea obținută în mod real și de întrebarea analitică la care aceasta trebuie să răspundă.
Trebuie să fie explicat cum s-a calculat rezultatul
Valoarea procentuală prezentată în ceea ce privește legarea peptidelor poate însemna câteva lucruri complet diferite.
Acest termen poate fi aplicat la conversia materialului de intrare, la suprafața relativă a vârfului cromatografic, la conținutul măsurat al produsului final, la randamentul brut sau la randamentul izolat.
Atașarea în sine a numărului fără a explica despre ce este vorba poate crea astfel impresia de o precizie mare.
Comparatiile solide ar trebui să indice substratul, etapa de combinare analizată, metoda analitică utilizată, momentul prelevării probei și tipurile de poluanti examinate.
Dacă s-a utilizat o asociere repetată, aceasta trebuie, de asemenea, luată în considerare.
Rezultatul final după cele două operații de ligare nu trebuie să reflecte ceea ce s-a întâmplat în timpul primei reacții.
Limite de detecție ale metodelor analitice necesită o asemenea precauție.
Declarația „nu a fost detectată” înseamnă că substanța respectivă nu a fost detectată în anumite condiții și în limitele metodei aplicate.
Nu ar trebui să fie convertit automat într-un argument absolut că poluarea cu date nu există deloc.
Datele privind reactantul ar trebui să includă mai mult decât un model simplu
Agentul de ligare care funcționează excelent în cazul unei reacții model simple poate să se comporte altfel în cazul unui aminoacid cu o densitate steroidală mare, un centru stereochimic sensibil, un substrat slab solubil sau un lanț peptidic susceptibil la agregare.
Analizele care compară Oxyma-B cu mai mulți peptidi-model arată de ce evaluarea chimiei de legare pe mai mult de un substrat este valoroasă.
În cele din urmă, metoda de ligare utilă trebuie să conducă la obținerea structurii dorite cu un profil de poluare acceptabil și un rezultat repetabil pentru sinteza finală.
De aceea, eficiența legării poate fi înțeleasă mai bine ca un ansamblu de măsurători diferite decât ca o proprietate descrisă prin numele unui singur reactiv sau ca rezultatul unui singur test de dispariție a substratului.
Întrebări frecvente
1. De ce sunt necesare grupările de protecție în timpul sintezei peptidelor?
Echipamentele de protecție limitează temporar reacțiile nedorite, permițând astfel grupurilor funcționale adecvate să realizeze legarea peptoidică dorită. Aminoacizii pot conține mai multe locuri de reacție și lăsarea tuturor acestora simultan disponibile poate duce la reacții competitive. O strategie eficientă de protecție trebuie, de asemenea, să ia în considerare posibilitatea eliminării ulterioare a acestor protecții și compatibilitatea lor cu restul moleculei. Modul de studiu demonstrativ arată că alegerea echipamentelor de protecție poate influența nu doar selectivitatea de bază a reacției, ci și formarea de produse secundare. Grupul de protecție este astfel unul dintre elementele întregii strategii de sinteză și nu o soluție universală pentru toate problemele chimice.
2. Poate oponența corectă să ducă în continuare la apariția de contaminanți?
Da. Legarea peptidică intenționată poate apărea în timp ce alte molecule din aceeași amestecă sunt supuse unei conversii incomplete sau unor reacții secundare nedorite. Acest lucru este demonstrat în mod special de studiile produselor epimere, deoarece formarea legării adecvate și menținerea stereochimiei adecvate sunt aspecte separate. De aceea, detectarea peptidei țintă nu înseamnă că acesta este singurul produs prezent. O evaluare științifică fundamentată a succesului legării necesită un punct final de analiză definit și informații privind contaminanții relevanți.
3. Este același lucru ca și întreținerea peptidelor și întreținerea întregului peptide?
Nu. Combinarea este o singură operațiune de formare a legăturii în cadrul unui proces mult mai amplu de sinteză. Sinteza la nivelul fazei fixe poate include, de asemenea, adăugarea la suport, protejarea, eliminarea grupărilor de protecție, spălarea repetată, desprinderea, prelucrarea, purificarea și caracterizarea finală. Deoarece produsele nedorite pot apărea și în afara etapei de combinare, poluarea finală nu trebuie atribuită automat combinării defectuoase fără date care să indice originea reală a acesteia.
4. De ce este activată grupul carboxilic?
Activarea grupării carboxilice creează o cale mai favorabilă pentru reacția sa cu un grup amino adecvat, facilitând astfel formarea legării amidice. Însă, reactivitatea crescută poate permite și reacții competitive. Prin urmare, în evaluarea sistemelor de legare, se analizează nu doar eficiența formării legării, ci și efectele stereochimice și apariția produselor secundare. Scopul activării nu este maximizarea reactivității moleculei, ci obținerea unei selectivități adecvate a reacției.
5. Ce servește HATU?
HATU este un agent de ligare utilizat pentru facilitarea formării de legături amidice, inclusiv în timpul ligării peptidelor. Nu este un peptid sau o grupă de protecție. Studiile comparative ale secvențelor peptidelor dificile arată că metodele care utilizează HATU trebuie evaluate în contextul complet al condițiilor reacției. Informația în sine că HATU a fost utilizat nu confirmă în totalitate conversia, conservarea stereochimiei sau un profil mai bun al contaminanților.
6. Există un singur agent cel mai eficient pentru legarea peptidelor?
Nu. Nu există un clasament universal al reactanților adecvați pentru fiecare peptid și fiecare reacție. Densitatea sterică, solubilitatea substratului, agregarea, sensibilitatea stereochemică și contextul secvenței pot influența rezultatul. Prin urmare, alegerea reactanților trebuie să se bazeze pe rezultatele măsurate pentru o anumită reacție, și nu doar pe reputația sau popularitatea acestora.
7. Înțelegem „agent de legare” și „aditiv” ca fiind același lucru?
Nu. Aceste termeni pot descrie diverse funcții în sistemul de reacție. Agentul de reacție poate participa direct la activare, în timp ce aditivul poate influența formarea produselor intermediare, performanța reacției, integritatea stereochimică sau căile chimice concurente. Prin urmare, trebuie analizat întregul sistem de reacție și nu trebuie să se considere toate componentele sale ca fiind echivalente.
8. Este posibil să se lege între ele fragmente întregi de peptide în loc de aminoacizi individuali?
Da. Reacția de ligare poate implica mai multe fragmente peptide protejate, și nu doar aminoacizi individuali. Însă creșterea dimensiunii componentelor reacționate nu elimină necesitatea de a controla selectivitatea locului de reacție, stereochimia sau caracteristica finală a produsului. În cazul ligării fragmenților, sunt necesare în continuare date care să confirme că legarea corectă a avut loc în mod corespunzător.
9. Care este diferența dintre racemizarea și epimerezia?
Racemizarea în sensul strict al termenului înseamnă pierderea bogăției enantiomere în direcția unei amestecuri racemic, în timp ce epimerizarea implică schimbarea configurației unui singur centru stereoizomeric într-o moleculă care conține mai multe astfel de centre. În literatura de specialitate privind sinteza peptidelor, termenul „racemizare” este folosit mai extins pentru a descrie schimbările nedorite ale configurației resturilor aminoacizilor. Astfel, definiția precisă ar trebui să corespundă unei schimbări structurale reale.
10. Poate spectrometrul de masă detecta orice eroare stereochimică?
Nu. Stereoizomerele pot avea exact aceeași masă moleculară. Astfel, obținerea masei așteptate nu confirmă configurația corectă a fiecărui centru stereoigenic. Pentru a evalua astfel de diferențe, pot fi necesare metode suplimentare, cum ar fi tehnici de cromatografie adecvate sau strategii de derivare. Spectrometria masă rămâne un instrument extrem de util pentru caracterizarea moleculară, dar rezultatele sale trebuie interpretate în conformitate cu limitările specifice ale întrebării structurale.
11. Înseamnă formarea de aspartimidă pur și simplu o legare nereușită?
Nu. Formarea aspartimidului este un proces separat de reacție secundară asociat cu secvențe sensibile care conțin asparagină. Prezența sa poate fi influențată de resturile adiacente și de condițiile de eliminare a grupărilor de protecție. Astfel, o schimbare structurală nedorită poate apărea chiar și atunci când aminoacidul relevant a fost anterior corect legat. Determinarea originii contaminării este importantă deoarece repetarea legării nu trebuie să rezolve problema rezultată din un alt proces de reacție.
12. Repetarea legării garantează succesul reacției?
Nu. Repetarea legării poate, în unele cazuri, îmbunătăți conversia, dar nu garantează că toate locurile de reacție devin accesibile sau că alte reacții secundare vor fi eliminate. Rezultatul rămâne, totuși, dependent de substrat și de metoda utilizată. Astfel, analiza produsului este necesară pentru a determina ce a dat cu adevărat la legarea suplimentară.
13. Temperaturile mai ridicate îmbunătățesc întotdeauna calitatea contactului?
Nu. Înaltarea temperaturii poate accelera reacția dorită, dar poate, de asemenea, accelera procesele chimice nedorite. Prin urmare, schimbarea mai rapidă nu trebuie interpretată automat ca o îmbunătățire a calității chimice. Temperatură trebuie evaluată atât în ceea ce privește formarea produsului final, cât și a profilului de contaminanți produși.
14. Este dispariția grupului amino-liber confirmată de formarea unui peptidă corect?
Nu. Lipsa unei grupări libere de aminoacizi detectabile răspunde la o întrebare mult mai restrictivă privind un grup funcțional specific în condițiile testului aplicat. Nu confirmă în mod independent secvența completă a peptidei, stereochimia sau puritatea acesteia. Monitorizarea grupărilor libere de aminoacizi poate fi un element util în controlul procesului, dar nu înlocuiește caracterizarea finală a produsului.
15. Este curățenia HPLC aceeași cu performanța de legare?
Nu. Curățenia HPLC și performanța descriu diferite proprietăți. Curățenia HPLC este dependentă de metoda de descriere a compoziției componentelor probei detectate, în timp ce performanța se referă la cantitatea de produs specificat obținută în raport cu cantitatea inițială de material. Purificarea poate crește curățenia cromatografică și, în același timp, poate reduce cantitatea de produs final recuperat. Prin urmare, valoarea procentuală are o importanță limitată, dacă nu se specifică exact ceea ce reprezintă aceasta.
16. Pot fi produse poluări și după încheierea procesului de combinare?
Da. După finalizarea reacției de ligare, sinteza peptiduului include etape chimice ulterioare. Eliminarea grupărilor protectoare, desprinderea și prelucrarea ulterioară pot modifica moleculele sau poate duce la apariția de contaminanți suplimentari. Acest lucru nu înseamnă că fiecare contaminant final apare în etape ulterioare, ci arată de ce o ligare corectă nu reprezintă o garanție de calitate a produsului final.
17. Ce face ca compararea metodelor de asimilare să fie credibilă?
O comparare credibilă ar trebui să evalueze metodele alternative pentru același scop clar definit și în condiții suficient de comparabile. Ar trebui să indice substraturile utilizate, etapa de prelevare a probei, metodele analitice și tipurile de contaminanți evaluate, în loc să prezinte o valoare procentuală neexplicată sau să se bazeze pe reputația agentului. Comparatiile care includ mai multe peptide-model diferite pot furniza mai multe informații decât o singură performanță ridicată obținută pentru un substrat ușor, deoarece arată cum eficacitatea se schimbă în funcție de contextul molecular. Chiar și atunci, concluziile ar trebui să se limiteze la sistemele chimice efectiv studiate.
Rezumat
Combinarea peptidelor este elementul fundamental al sintezei chimice a peptidelor, deoarece duce la formarea de legături amidice care leagă resturile de aminoacizi în structura peptidelor. Însă descrierea combinării doar ca „legarea a două aminoacizi” omite o parte semnificativă din chimia care determină dacă produsul obținut este într-adevăr peptida dorit.
Un component care conține o grupă carboxilică necesită, de obicei, o activare pentru ca formarea eficientă a legăturii amidice să se producă în mod corespunzător. Agentii de legare și aditivii pot facilita acest proces, dar eficacitatea lor depinde de substrat, mediul reacției și modul de evaluare analitică a rezultatului. De aceea, agentul trebuie analizat în contextul complet al experimentului și nu clasificat independent de peptidul sintetizat.
Echipa de protecție asigură un nivel suplimentar de control prin împiedicarea temporară a participării grupurilor funcționale nedorite la reacție. Utilitatea lor depinde nu numai de asigurarea eficientă, ci și de posibilitatea de eliminare selectivă și de conformitate cu etapele ulterioare de sinteză. Strategia de protecție și resturile aminoacide adiacente pot, de asemenea, influența apariția anumitor produse secundare.
Integralitatea stereochemică constituie un alt element important. Reacția de ligare poate duce la formarea unei legături amidică și, în același timp, poate genera un compus epimeric. Deoarece epimerul poate avea aceeași masă moleculară ca și peptidul propriu-zis, conformitatea masei nu confirmă în mod complet validitatea structurală. Modificările de configurare pot apărea și în alte etape, cum ar fi legarea inițială a aminoacizilor în fază stază.
Alte contaminante aparțin mecanismelor diferite. Combinarea incompletă poate duce la formarea de secvențe deleciene sau scurte, în timp ce reacțiile legate de aspartimidă pot modifica un peptid care conține deja resturile aminoacide adecvate. Accelerarea procesului poate afecta atât reacțiile dorite, cât și căile secundare, iar contaminanții suplimentari pot apărea și în etapele ulterioare, cum ar fi dezinhibarea.
Din aceste motive, evaluarea legării peptidelor necesită ceva mai mult decât stabilirea dacă materialul de pornire a dispărut.
Conversia, formarea produsului final, performanța izolată, puritatea cromatografică și puritatea stereochimică răspund la diverse întrebări.
Testele efectuate în timpul sintezei pot ajuta la detectarea reacțiilor incomplete, dar nu confirmă în sine structura completă a unui peptid. Cromatografia și spectrometria de masă oferă informații complementare, în timp ce întrebările privind stereochimia sau structurile foarte similare pot necesita metode analitice suplimentare.
Așadar, abordarea cea mai fundamentată pentru combinarea peptidelor este orientată spre o anumită moleculă și bazată pe date.
Metoda de ligare utilizată nu este pur și simplu o metodă care utilizează cel mai cunoscut sau cel mai reactiv agent de ligare. Este o metodă care, în mod repetabil, duce la formarea unei legături moleculare dorite, menținând în același timp integritatea stereochimică adecvată și controlul contaminanților relevanți pentru peptidul specific sintetizat.
Referințe
- Subirós-Funosas, R., Prohens, R., Barbas, R., El-Faham, A., & Albericio, F. (2009). Oxyma: Un aditiv eficient pentru sinteza peptidelor, care înlocuiește HOBt și HOAt bazate pe benzotriazol, cu un risc mai mic de explozie. Chimie—A European Journal, 15(37), 9394–9403. https://doi.org/10.1002/chem.200900614
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Studii privind racemizarea în sinteza peptidelor prin separarea peptidelor epimere protejate prin cromatografie lichidă de înaltă performanță cu fază inversată. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Evaluarea utilizării combinate a Oxyma și HATU pentru agregarea secvențelor peptide. Jurnalul de Chimie a Peptidei, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Jad, Y. E., Khattab, S. N., de la Torre, B. G., Govender, T., Kruger, H. G., El-Faham, A., & Albericio, F. (2014). Oxyma-B, un excelent supresor al racemizării pentru sinteza peptidelor. Chimie organică și biomoleculară, 12(42), 8379–8385. https://doi.org/10.1039/c4ob01612b
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Sinteza peptidelor în fază solidă: de la proceduri standard la sinteza secvențelor dificile. Protokole Naturi, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Problema aspartimidei în SPPS bazat pe Fmoc. Partea I. Jurnalul de Chimie Peptidică, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Problema aspartimidei în SPPS bazat pe Fmoc. Partea a II-a. Jurnalul de Chimie Peptidică, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Utilizarea reactivului Marfey pentru cuantificarea racemizării în urma legării aminoacizilor la suporturile solide în vederea sintezei de peptide. Biochemică analitică, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Palasek, S. A., Cox, Z. J. și Collins, J. M. (2007). Limitarea racemizării și a formării aspartimidei în sinteza peptidică în fază solidă Fmoc asistată de microunde. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-Benzenedimethaniol (1,4-BDMT) ca agent de eliminare a fragmentărilor peptidei în urma hidrolizei. RSC avansează, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., & Pallai, P. (1991). Caracterizarea produselor brute din sinteza pe fază solidă de peptide prin spectrometria de masă cu mu-HPLC/bombardament rapid cu atomi. Peptide Research, 4(1), 40–46. PubMed