Peptidien yhdistäminen on kemiallinen prosessi, joka johtaa karboksyyliryhmän sisältävän komponentin ja aminiryhmän sisältävän komponentin välisen sidoksen syntymiseen. Tämän reaktion seurauksena syntyy amidiyhdiste. Kun tämä side yhdistää aminohappojen loput osat peptidin synteesissä, se muodostaa osan, jota kutsutaan peptidirakenteeksi.
Reaktiiviset ainesosat eivät tarvitse olla yksittäisiä aminohappoja. Sitoutumisreaktio voi yhdistää yhden aminohapon toiseen, yhdistää uuden aminohapon kasvavaan peptidi-ketjuun tai yhdistää suurempia peptidi-fragmentteja, jotka on aiemmin syntetisoitu erikseen.
Aluksi peptiinien yhdistäminen saattaa vaikuttaa yksinkertailevalta tehtävältä: riittää yhdistämään yksi aminohappo seuraavaan.
Kemiallisesti tarkasteltuna amidiyhdisteiden muodostuminen on kuitenkin vain osa kokonaisohjelmaa.
Yhdistyminen on toteutettava oikeassa paikassa ja asianmukaisella stereokemiallisella rakenteella, kun taas muut reaktiiviset funktionaaliryhmät on pidettävä asianmukaisesti kontrolloiduina. Reaktio voi näennäisesti sujua hyvin ja käyttää lopputuotteen lähes koko määrän tai jopa koko lähtöaineistoa, mutta silti johtaa epätoivottuun sekoitukseen kohdepeptidin ja muiden rakenteiden välillä.
Siksi reaktion loppu ja tuotteen oikea syntyminen eivät tarkoita samaa asiaa.
Tutkimukset, joissa verrataan erilaisia sidontajärjestelmiä, toiminnallisten ryhmien suojausstrategioita sekä stereokemiallisia tuloksia, osoittavat, miksi ei ole olemassa yhtä yleisesti paras sidontakemikaalia, riippumatta syntehoidun peptidin tyypistä.
Tutkimuksen kannalta tarkemmin tarkoituksenmukaista kysymystä ei siis ole:
„Mikä liitoksen liima on paras?”
Hyvä kysymys kuuluu:
„Mikä lähestymistapa mahdollistaa tavoitellun peptidin saavuttamisen sopivalla konverssiolla, stereokemiallisen yhtenäisyyden säilyttämisellä ja virheettömällä epäpuhtausvalvonnalla erityisen ainteen edellyttämässä ympäristössä?”
Tämä erottelu on ratkaisevan tärkeä ymmärtää peptideiden sitoutumisen kemiologiaa.
Mitä tarkoittaa peptideiden yhdistäminen?
Kovalentti yhdistäminen yhdistää kaksi ainesta luomalla uuden sidoksen
Tyypillisessä reaktiossa, joka johtaa peptidisen rakennusaineen syntyyn, yhden aminohapon kanssa sidottu karboksyyliryhmä yhdistyy toisen aminohapon kanssa.
Syntyvä yhdiste on kemiallisesti amidiyhdiste.
Jos tämä sidonta yhdistää aminohappoja peptidihaaraketjun muihin osiin, sitä yleisesti kutsutaan peptidi-sidoksi.
Reagoivien aineiden tarkka fyysinen sijainti riippuu käytetystä synteesistrategiasta.
Peptidien synteesissä staattisessa vaiheessa paljastunut aminogruppikin kuuluu yleensä kasvavaan peptidihaaraan, joka on sidottu vesihiukseen, kun taas karboksyyliryhmän sisältävä komponentti tulee tuotetusta suojaamattomasta aminohaposta.
Synteesi, joka suoritetaan liuoksessa, voi kuitenkin sisältää molemmat aineosat nestemäisessä tilassa.
Osien yhdistämisessä yhdistyvät suuremmat, suojaavat peptidi-segmentit sen sijaan, että lisättäisiin yksittäisiä aminohappoja yksi toisensa jälkeen.
Erilaisten strategioiden avulla voidaan muuttaa reaktion suuntaa, erottaa aineet ja puhdistaa ne, mutta ne eivät poista peruskemiallista ongelmaa: oikeat funktionaaliryhmät on reagoitava toistensa kanssa, kun taas ei-toivottavat reaktiot molekyylin muissa osissa on pidettävä kohtuullisena rajoituksena.
Liitoksen syntyminen, konvertointi ja tehokkuus ovat erilaisia käsitteitä
Useat termit, joita käytetään usein kuvaillessa peptideiden sitoutumista, voivat kuulostaa samalta, vaikka ne liittyvät eri aiheisiin.
Muuntaminen määrittää, mikä osa tietystä lähtökohdasta on reagoinut.
Se ei kuitenkaan automaattisesti kerro, mihin tämä materiaali muuttui.
Jos lähtöaineesta 99 prosenttia katoaa, mutta osa siitä muodostaa ei-toivottuja sivutuotteita, 99 prosentin konvertoituminen ei tarkoita, että syntyi 99% tarkoitettua peptidia.
Lopputuotteen syntyminen vastaa toista kysymystä: kuinka paljon suunniteltua molekyylirakenteen määrää todella syntyi? Vastaus edellyttää analyyttistä menetelmää, jonka avulla voidaan erottaa oikea tuote olennaisista vaihtoehtoisista rakenteista.
Erillisellä tuotantotehoksi tarkoitetaan määrää tiettyä tuotetta, jonka lopulta onnistuttiin palauttamaan määritellystä alkuperäisestä materiaalimäärästä. Lopputuotantoon voivat siis vaikuttaa myös käsittely-, erottelu- ja puhdistustavat, vaikka itse yhdistäminen olisi sujunut tehokkaasti.
Kromatografinen puhtaus kuvaa tunnistettujen aineiden jakautumista tietyn kromatografiamenettelyn olosuhteissa. Se voi tuottaa erittäin arvokasta tietoa näytteen koostumuksesta, mutta sen tulkintaa voivat rajoittaa yhteeluo, detektorin vasteen vaihtelut tai tietyn menetelmän heikosti tunnistettavien aineiden esiintyminen.
Stereokemiallinen puhtaus vastaa kuitenkin kysymykseen siitä, onko hiukkasen suunniteltu tilajärjestys säilynyt. Tämä on erillinen analyyttinen kysymys, koska jotkut stereokemialliset vaihtoehdot voivat sisältää täsmälleen saman hiukkasmassan kuin lopputuote.
Nämä erot auttavat ymmärtämään tuloksia, jotka saattavat ensi silmäyksellä vaikuttaa ristiriitaisilta.
Reaktion voi tuottaa korkeaa lähtöaineen konversiota ja samalla syntyä useita tuotteita. Raaka-aine voi sisältää paljon uutettua massa-ainetta, mutta se voi sisältää runsaasti epäpuhtauksia. Intensiivinen puhdistus voi kuitenkin tuottaa korkean puhdistustehon materiaalia halvemmalla tehokkuudella.
Mikään näistä havainnoista itsessään ei ole ristiriidassa muiden kanssa.
Ne kuvaavat vain tuotteen eri ominaisuuksia tai prosessin eri vaiheita.
Siksi „yhteys oli täydellinen” -lausuma on paljon arvokkaampaa, jos tiedetään myös, minkä analyysimenetelmän käytettiin ja mitä tarkalleen mitattiin.
Vaikeat alustat paljastavat prosessin erilaisia rajoituksia
Ei jokainen peptidien sitoutumisen reaktio aiheuta samaa kemiallista vaivannäköä.
Steroidisesti tiheästi täytetty alue voi hidastaa sidoksen syntymistä, koska reagoivilla ryhmillä on vaikeuksia päästä toisiinsa.
Heikko liukenemiskyky voi rajoittaa reaktion osien välistä tehokasta vuorovaikutusta.
Fasta fasaattisessa synteesissä kasvava peptidihaara voi kohdata naapurihaaroja tai ottaa vastaan rajoittavia rakenteita reaktiotilojen käytön kannalta, vaikka sidontakemikaalit olisivatkin esillä epäilemättä liikaa.
Nämä ongelmat ovat erilaisista kemiallisista syistä.
Ei siis voida olettaa, että yksi ratkaisu on automaattisesti tehokas kaikissa tapauksissa.
Tutkimukset, joissa verrattiin toistuvaa sidontaa koskevia strategioita vaikeiden peptidi-sekvensseiden analysoimiseksi, tarkastelivat saatuja raaka-aineita niiden todellisessa koostumuksessa sen sijaan, että arviointi perustuisi yksinomaan teoreettiseen reaktiokykyyn tai yksittäisten reagenssien maineeseen. Yksi tutkituista strategioista osoittautui hyviksi analysoiduissa malleissa, mutta se ei kuitenkaan tarkoita, että kaikille peptidi-sekvensseille sopiva yleinen ratkaisu olisi olemassa.
Tärkein päätelmä on, että menetelmän tehokkuutta on arvioitava tietyn substraatin pohjalta saatun tuotteen perusteella eikä pelkästään käytetyn reagenssin maineesta.
Karboksyyliryhmän aktivoiminen
Miksi aktivointi on yleensä tarpeen?
Itse karboksyylihapon muuttumattoman aminohapon kanssa sekoittuminen tavanomaisissa olosuhteissa ei yleensä johda tehokkaasti puhdasta peptidi-yhdisteeseen.
Sen sijaan voi tapahtua happo-emäksinen reaktio, ja tehokas amidiyhdisteiden muodostuminen edellyttää sopivaa kemiallista reittiä.
Siksi peptiinien yhdistäminen yleensä sisältää karboksyyliryhmää sisältävän komponentin aktivoimista.
Aktivoiminen lisää sen herkkyyttä reagoida sopivan aminiryhmän kanssa. Sovin reaktioriski ja sopiva irtautumisaine helpottavat uuden amidiyhdisteen syntymistä.
Aktivoitu välituote voi olla olemassa vain lyhyen aikaa eikä sitä tarvitse eristää.
Tavoitteena ei kuitenkaan ole saavuttaa mahdollisimman suurta kemiallista reaktiokykyä.
Tavoitteena on kontrolloitu reaktiivisuus.
Aktivoitu välituote, joka reagoi erittäin nopeasti veteen, muihin epätoivottuihin nukleofileihin tai osallistuu kilpailukykyiseen reaktiossa, voi nopeasti hävitä samalla, kun aikaansaatua peptidi-molekyyliä syntyy suhteellisen pieninä määrinä.
Korkea reaktiivisuus on siis hyödyllinen vain silloin, kun sitä voidaan kohdentaa asianmukaisesti suunnitellun sidoksen syntymiseen.
Liima-aineet ja lisäaineet hoitavat erilaisia tehtäviä
Peptydien yhdistelmässä voi olla mukana useita kemiallisten aineiden tyyppejä, joilla on erilaisia tehtäviä.
Karbodiimidit ovat yksi ryhmä reagensseja, joita käytetään karboksyyliryhmien aktivoimiseen.
Muut liitännäisjärjestelmät käyttävät erilaisia aktivointimekanismeja, mukaan lukien usein käytetyt oniomaisia reaktantoja sisältävät järjestelmät, kuten HATU-pohjaiset järjestelmät.
Lisäyhdisteet voivat toimia lisäaineina.
Termi „lisäaine” ei kuitenkaan tarkoita sitä, että kyseinen yhdiste on kemiallisesti merkityksetön. Lisäaine voi vaikuttaa välituotteisiin, sidontatehokkuuteen, kilpailukykyisiin reaktio-reitteihin ja stereokemiallisiin tuloksiin.
Oxyma-molekyylien tutkimus karbodiimidien avulla peptidien synteesissä analysoi sekä yhdistymiskyvyn että racemisaation rajoittamisen tehokkuutta valituissa malleissa.
Tällaiset tiedot ovat arvokkaita tutkittaville järjestelmille ja erityisille malleille.
Se ei kuitenkaan tarkoita, että sama yhdiste käytettäessä kaikkia mahdollista peptidi-liittymämuotoa tuottaisi samanlaista tulosta.
Myöhemmät Oxyma-B-tutkimukset vertailivat optisen puhtauden tuloksia useissa malliproteiineissa.
Monen substraatin tutkiminen on erityisen tärkeää, koska erittäin hyvät tulokset kemiallisesti helposti liittymisessä eivät välttämättä ennusta reagensin toimintaa paikassa, jossa se on tiheästi aggregoitavissa tai stereokemiallisesti herkässä tilassa.
Mitä tarkoittaa HATU peptidien synteesissä?
HATU on yhdistämisaine, jota käytetään helpottamaan amidiyhdisteiden muodostumista, myös peptidien synteesissä.
HATU ei ole peptidi.
Se ei ole myöskään suojeleva ryhmä.
Sen itsensä läsnäolo ei kuitenkaan ole todiste siitä, että sidonta on päättynyt tai että saatu peptidei on puhdas.
Tehokkuus riippuu substraatin tyypistä, muista reagensseista, liuottimien järjestelmästä sekä laajemmasta kontekstista reaktiovaikutuksille.
Aggregaatiokykyisiin sekvensseihin liittyvät tutkimukset vertailivat muun muassa HATU-perusteisia lähestymistapoja sekä Oxyma-/karbodiimid-järjestelmiä toistuvalla sidontajärjestelmässä.
Tämä osoittaa, miksi hakutuloksia, kuten „HATU peptide”, on ymmärrettävä yhdistymis- ja valintamenetelmät koskevina kysymyksinä eikä todisteina siitä, että yksi tietty reagenssi on universaalinen peptiineistä syntyvän yhdisteen menetelmä.
Itse aktiivisen aineen nimi ei riitä tuomaan esiin eikä oikein tulkita julkaistua tulosta.
Reaktiovaikutusten, peptidisäikeen sekvenssin ja analyyttisen prosessin onnistumisen määrittelyn menetelmät ovat myös tärkeitä.
Stereokemiallinen aktivoiminen ja valvonta edellyttävät tasapainon säilyttämistä
Aktivoituneen aminohappojen johdannaisen pitkäkestoinen säilyttäminen reaktiolaitteistossa ei ole aina hyödyllistä.
Toivottu sidontiresponsi käy läpi muiden mahdollisten kemiallisten prosessien ohella.
Joillakin kilpailukykyisillä reiteillä voi tapahtua stereotyyppien muuttuminen.
Korkeapaineputkien suojaustuotteiden kokeelliset tutkimukset tarkastelivat aminohappojen, liuottimen ja muiden reaktiomateriaalien yhdistelmän vaikutusta karbodiimidien osallistumalla tapahtuvaan stereokemialliseen muutokseen sidontaprosessin aikana.
Tämä osoittaa tärkeän periaatteen: koko reaktiokokoonpano voi olla yhtä tärkeä kuin käytetyn sidontakemikaalin yleinen perhekin.
Strategian on siis oltava riittävän reagoiva luodakseen halutun sidoksen, samalla rajoittaen samalla haitallisten reaktioiden mahdollisuutta.
Näitä sääntöjä voidaan käsitellä koulutustarkoituksissa ilman niiden muuttamista valmiiksi laboratoriotekniikan protokolliksi. Tarkat reagenssimäärät, niiden lisäämisen järjestyksen sekä reaktion edellytykset riippuvat tietystä syntetisoitavasta prosessista.
Suojeluryhmien rooli
Suojaus rajoittaa kilpailukykyisiä reaktioalueita
Aminohappo voi sisältää enemmän reaktiivisia ryhmiä kuin pelkästään aminiryhmä ja karboksyyliryhmä, joita tarvitaan peptidisen rakenneproteiinin muodostamiseen.
Sen sivulanka voi sisältää muita reaktiivisia kemiallisia ryhmiä.
Jos kaikki potentiaalisesti reaktiiviset ryhmät pysyisivät paljaana jokaisessa sidontavaiheessa, pyrittyä peptidiyhteyden muodostamiseen olisi mahdollista kilpailla jakautumisella tai muiden ei-toivottujen reaktioiden kanssa.
Strategia, joka hyödyntää suojausryhmiä, mahdollistaa valikoitujen reaktioalueiden tilapäisen peittämisen.
Näin sopivat aminohappo- ja karboksyyliryhmät voivat reagoida keskenään, kun taas muut kohdat jäävät saataville tai ovat riittävän vähäisiä reagoivia kyseisissä olosuhteissa.
Suojaus siis takaa kemiallisen selektiivisuuden.
Onnistunut strategia ei kuitenkaan perustu pelkästään kemiallisesti vakaan ryhmän yhdistämiseen.
Suojaryhmää on myös poistettava myöhemmin.
Suojaus, joka tehokkaasti estää ei-toivottuja reaktioita liittymisen aikana, mutta sitä ei myöhemmin voida poistaa vahingoittamatta kohde-molekyyliä, aiheuttaa uuden syntetisen ongelman.
Kokonaisstrategiassa on siis otettava huomioon sekä säilyvyys turvan tarpeen aikana että mahdollisuus poistaa se valikoivasti, kun se ei enää ole tarpeen.
Tilapäiset ja pitkäaikaiset suojausmenetelmät hoitavat erilaisia tehtäviä
Yksittäiset suojaava ryhmät voivat pysyä paikallaan eri aikaa.
Tyypillisessä staattisessa synteesissä Fmoc-suojauksen avulla kasvavan aminiryhmän lopussa käytettävässä yhdisteessä poistetaan usein sitä, kun ketjua pidentetään.
Monet sivuketjujen suojausryhmät kuitenkin pysyvät paikallaan lukuisien yhdistymisjaksojen ajan ja poistetaan vasta myöhemmässä vaiheessa.
Standardit FMOC-pohjaiset menetelmät osoittavat, miten toistuvat selektiiviset suojaus- ja yhdistämisjaksoni koordinoidaan.
Tarkkaan tiettyyn sivuketjuun tarvittava suojausvaihtoehto riippuu muista aminohapoista, koko peptidistä ja valitusta synteesiä koskevasta strategisesta valinnasta.
Ei siis olisi oikein väittää, että jokainen aminohappo vaatii identtistä suojausta tai että kaikki synteesiin liittyvät reaktiot käyttävät samoja suojausryhmiä.
Tilapäisiä suojaavia ryhmiä on myös erotettava kemiallisista ryhmistä, jotka pysyvät tarkoituksellisesti valmiissa peptidissä.
Suunniteltu N-pääte tai amidi C-päätteen kohdalla voivat esimerkiksi olla osa tavoitteellista rakennetta.
Sen sijaan väliaikainen suojaava ryhmä, joka sattumalta jäi viimeiseen osaan, merkitsisi epätoivottavaa rakenteellista eroa.
Ortogonalisuus on kemiallista yhdenmukaisuutta koskeva vaatimus
Ortogonalinen suojaus tarkoittaa strategiaa, jossa valitut suojausryhmät voidaan poistaa jättäen muut suojaustoimenpiteet riittävän hyvin ennallaan.
Tämä mahdollistaa eri reaktioalueiden paljastamisen tarkoituksellisesti valittujen synteesivaiheiden aikana.
Ortogonalisuutta ei pidä ymmärtää pelkästään yksittäisen aktiivisen aineosan ominaisuutena, joka on kirjattu sen etikettiin.
Se kuvailee koko suunnitellun kemiallisen toimintasuunnitelman yhdenmukaisuuden.
Suunniteltu suojausaineen poistaminen olisi suoritettava siten, että se ei aiheuta sopimattomia muutoksia kasvavan peptidin muissa osissa.
Fasta faasin synteesissä tämä yhdenmukaisuus voi kattaa myös kantaja-liittimen rakenteen sekä epätavanomaisia tai erityisen kemiallisesti herkkiä rakennusyksiköitä.
Tutkimukset aspartimidin syntymisestä, joissa muokattiin sivuketjujen ja runkoaineen suojaimia malliproteiinissa, osoittivat eroja sivutuotteiden syntymisessä.
Tämä osoittaa, että suojausvalinnan vaikutus voi ulottua myös siihen, että tapahtuu ilmeinen sivuketjureaktio.
Se voi myös muuttaa muita epäpuhtausmuodostusreittejä synteesin aikana.
Suojaryhmät eivät tee siitä, että kaikki sekvenssit käyttäytyisivät samalla tavalla.
Vaikka kaksi sekvenssia sisältäisi saman potentiaalisesti ongelmallisen aminohapon, ne eivät välttämättä toimi identtisesti.
Na kilpailukykyisiä reaktioita liittyviä muuttujia voi olla vaikutusta naapureiden reaktioiden todennäköisyyteen.
Asparagiinia sisältävien mallisäikeiden tutkimukset osoittivat, että tämän jäänteen jälkeinen aminohappo vaikutti tutkituissa olosuhteissa asparimidiin liittyvien tuotteiden syntyyn.
Tämä ei tarkoita, että jokaisella sellaisen teeman sisältävällä sekvenssillä on oltava ongelmia.
Se osoittaa kuitenkin, että sekvenssin kontekstiä on otettava huomioon kehittäessään menetelmää ja arvioidessaan riskiä.
Yksi malliproteiiniin sovellettu suojausstrategia ei takaa samanlaista toimintaa kaikissa muissa proteiineissa, joissa on sama rakenne.
Rasismi ja muut sivuvaikutukset
Racemisaatio ja epimeraatio koskevat hiukkasten tilallista järjestelmää
Monissa aminohappojen jäänteissä on stereogeeninen keskus.
Tällaisen keskuksen konfiguraation muuttaminen voi johtaa siihen, että syntyy rakenteellisesti erilainen molekyyli, vaikka sen alkuainekäsittely ja molekyylimassa säilyisivät ennallaan.
Tarkemmin sanottuna racemisaatio tarkoittaa enantomierejäisen rikastumisen menetystä kohti racemista sekoitusta.
Monia stereogeenisiä keskuksia sisältävässä peptidissä yhden tietyn keskuksen konfiguraation muuttaminen yleensä johtaa epimerin, eli diastereoisomerin, syntyyn.
Peptidien synteesistä kertovassa kirjallisuudessa termi „rasemisoituminen” käytetään kuitenkin laajemmassa merkityksessä epätoivottujen konfiguraatiomuutosten osalta, jotka tapahtuvat sidontaprosessin tai muiden synteesivaiheiden aikana.
Tämä erottelu on tärkeää, koska peptidin identiteetti ei riipu pelkästään siitä, mitä atomit ovat molekyylissä.
Heidän sijainninsa on myös tärkeää.
Ei kaikki aminohappojen jäämät aiheuta samaa stereokemiallista riskiä.
Glysina ei esimerkiksi sisällä useimpien aminohappojen tyypillistä alfa-hiilipistokemeriaa.
Muut jäämät ovat herkkiä muuttuviin konfiguraatioihin riippuen niiden rakenteesta ja reaktioympäristöstä.
Täydelliseen massaan voi liittyä epätäydellinen stereokemia
Epimeryyttinen peptidi voi sisältää täsmälleen samaa hiukkaskokoa kuin kohdepeptidi.
Siksi massaspektrometrialla odotettu massa ei automaattisesti todista siitä, että jokainen aminohapporikasvain säilytti suunniteltu stereokemiallinen rakenne.
Kromatografiset tutkimukset mahdollistivat suojausten epimerejä sisältävien peptiinien erotuksen ja näiden erotusten hyödyntämisen analysoitaessa sidontakemian aiheuttamia stereokemiallisia muutoksia.
Kosmeettisen aineen osalta sopiva stereokemiallinen arviointi voi edellyttää tarkkoja kromatografisia menetelmiä, vertailukohteita, derivaatiostrategioita tai muita analyyttisiä menetelmiä, jotka pystyvät erottamaan tärkeitä rakenteita.
Henkilökohtaiset analyysit tarkastelivat myös stereokemiallisia muutoksia, jotka tapahtuvat aminohappojen kiinnittymisen yhteydessä kiinteisiin muotoihin.
Tämä johtaa seuraavaan tärkeään johtopäätökseen: valmiissa peptidissä havaittu epäpuhtaus ei tarvitse olla peräisin viimeisestä sidontiresaktiosta.
Se olisi voinut syntyä aiemmassa vaiheessa ja säilyä olemassa jatkokehityksen seuraavissa vaiheissa.
Aspartimidin syntyminen on erillinen ongelma
Aspartimidin syntyminen on erityinen sivutuote reaktio, joka liittyy asparagiinia sisältäviin herkkiin peptidi-sekvensseihin.
Menettelyssä luodaan kiertävä välituote, josta voi sitten syntyä erilaisia sukulaisia rakenteita.
Neihin voivat kuulua muuttuneet peptidin rakenneosien väliset yhteydet sekä stereokemialliset vaihtoehdot.
Aspartimidin syntymistä ei siis pidä kuvata pelkästään täydellisen sidoksen epäonnistumisen nimellä.
Peptidiketju voi jo sisältää oikeat aminohappoyksiköt, ja myöhempi sivuriippuvuus voi muuttaa sen osaa.
Kokeelliset tutkimukset osoittavat, että tähän prosessiin voivat vaikuttaa suojaustekniikat, naapuriaineet sekä toistuvat poistamiseen liittyvät olosuhteet.
Tämä erottelu on erityisen tärkeää syntetissä esiintyvien ongelmien tulkinnassa.
Pelkkä yhdistämisen toistaminen tai lisäämällä enemmän yhdistävää ainetta ei korjaa automaattisesti saastumista, joka syntyi täysin eri kemiallisella reitillä.
Puutteelliset reaktiot aiheuttavat muita ongelmia
Puutteellinen yhdistäminen luo erillisen saasteiden luokan.
Jos yksi sideaineeseen sidottu proteiini ei saa suunniteltua aminohappoa, mutta reagoi oikein myöhemmässä syklissä, syntynyt peptidi voi olla puutteellinen.
Tällaisen molekyylin kutsutaan yleensä delekyöksi.
Muut ketjut voivat lakata pidentyessä ja jäädä lyhennettyinä.
Nämä tuotteet poikkeavat pääasiassa epimereistä.
Epimerillä voi olla oikea aminohapposykli ja sumarialue, mutta yksi keskus ei ole oikeassa stereokemiallisessa rakenteessa.
Peptydi-deleytyonilla on kuitenkin erilainen sekvenssi tai pituus.
Jotkut synteesi-strategiat käyttävät niin kutsuttua cappingia estääkseen tiettyjen epäreagoivien ketjujen jatkuvaa pidentymistä.
Capping ei kuitenkaan korjaa virheellistä ketjua eikä muuta sitä tavoitepeptidiksi.
Se muuttaa vain sen käyttäytymistä seuraavissa vaiheissa.
Synteesin aikana syntyvä kova seos voi siis sisältää useiden eri mekanismeiden kautta syntyviä tuotteita.
Yhden kokonaisarvon tehokkuus ei salli määrittää, mitkä epäpuhtauksien syntymismekanisoidot olivat vastuussa lopullisesta tuloksesta.
Lämpötila ja prosessin olosuhteet vaikuttavat kompromissiin nopeuden ja laadun välillä
Lämpötilan nostaminen tai muut synteesiä nopeuttavat menetelmät voivat parantaa toivottujen reaktioiden nopeutta.
Samalla ne voivat kuitenkin nopeuttaa haittavaikutuksia.
SPPS-mikrofoniikan tutkimuksissa analysoitiin mikrorasioitumista ja aspartimidin syntyä mallien järjestelmissä ja todettiin, että tyypin mukaan erilaiset jäämät reagoivat eri tavoin käytettyjen olosuhteissa.
Tämä ei tarkoita sitä, että lämmitys on luonteeltaan epäkohtaa peptidien synteesissä.
Se ei myöskään tarkoita, että matalampi lämpötila on aina parempi.
Tärkein periaate on seuraava: prosessin nopeus ja kemiallinen laatu on arvioitava samanaikaisesti.
Korkeampi lämpötila, pidempi altistus tai useita käsittelyvaiheita voivat vaikuttaa sekä toivottuun sidontaan että kilpailukykyisiin reaktioihin.
Siksi sopiva kompromissi olisi arvioitava kokeellisesti tietyn sekvenssin osalta.
Lopputuotteen muokkausta voi tapahtua myös sen jälkeen, kun itse yhdistäminen on päättynyt.
Tutkimukset, joissa verrattiin eri scavengereitä peptidin erotuksessa kartongista, osoittivat erilaisia epäpuhtausprofiileja.
Tämä muistuttaa siitä, että lopullista saastumista ei pidä automaattisesti yhdistää sidontiresaktiota.
Peptidien synteesi on monivaiheinen prosessi, ja myöhempi puristaminen, irrottaminen ja jatkojalostus voivat muuttaa materiaalia, joka aiemmin rakennettiin oikein.
Miten yhdistämisen tehokkuutta arvioidaan?
Prosessin aikana suoritetut testit vastaavat vain tiettyjä kysymyksiä.
Vakio-olosuhteissa tapahtuvassa synteesissä jäljellä olevia saatavilla olevia aminiryhmiä tunnistava testi voi auttaa arvioimaan, onko asyylointivaihe voinut päättyä osittain.
Tällaiset testit voivat olla erittäin hyödyllisiä.
Heidän tulkintansa olisi kuitenkin rajoittuttava kemialliseen kysymykseen, johon sovellettu menetelmä todella vastaa.
Analyysimenetelmän ja aminohapon tyypin mukaan väristä vaihtuvia testejä voivat reagoida eri tavoin erilaisiin amineihin.
Tutkittavan kohteen saatavuus on myös tärkeää.
Reaktiivinen aminiryhmä, johon testiaine ei fyysisesti voi päästä, ei ole sama kuin aminiryhmä, joka on tehnyt oikean sidontiresaktion – vaikka testissä ei olenistu yksiselitteisesti erottamaan näitä tilanteita.
Rajoitukset voivat siis koskea reaktiivisen paikan saatavuutta, testin herkkyyttä, kemiallisia häiriöitä sekä havaitun funktionaalisen ryhmän tyyppiä.
Testin negatiivista tulosta prosessin aikana ei pidä automaattisesti tulkita todisteeksi siitä, että koko peptidi sisältää oikean sekvenssin, stereokemian ja puhtauden.
Prosessin seuranta on arvokasta vain silloin, kun sen tulokset voidaan yhdistää todellisen peptidituotteen analyysiin.
Kromatografia jakaa aineita ja massaspektrometria auttaa määrittämään niiden koostumusta.
Kromatografia ja massaspektrometria tuottavat täydentäviä tietoja.
Kromatografia voi erottaa näytteen aineksia ja osoittaa useamman kuin yhden havainnollisen aineksen läsnäolon.
Massaspektrometria voi tuottaa tietoa hiukkaskoon perusteella, mikä auttaa erikseen tunnistettavien aineiden ominaisuuksien määrittämisessä tai yhdistämisessä.
Käyttämällä molempia tekniikoita yhdistettynä tutkimuksissa pystyi analysoimaan peptidien synteesin raaka-aineita staattisessa tilassa ja saamaan tietoa niiden identiteetistä sekä suoja-ryhmien poistumisasteesta.
Molempien menetelmien yhdistelmä yleensä tuo enemmän tietoa kuin se, että jokainen chromatografinen näyte on jo tunnistettu tai että jokainen havaittu massa vastaa puhdasta ja rakenteellisesti täydellistä fraktaaria.
On kuitenkin olemassa rajoituksia.
Erilaiset komponentit voivat sekoittua, eli ne eivät eroteta kokonaan chromatografisesti.
Erilaiset aineet voivat myös aiheuttaa erilaisen havaintolaitteen reaktion.
Rakenteelliset isomerit ja stereoisomerit voivat edellyttää lisäanalyysimenetelmien käyttöä.
Samasta syystä pelkkä väite siitä, että peptidiä on tutkittu HPLC-menetelmällä, ei automaattisesti tarkoita sitä, että kaikki merkittävät epäpuhtaudet on erotettu erilleen.
Tarkemman HPLC-menetelmän hyödyllisyys riippuu todellisuudessa saavutetusta erotuksesta sekä analyyttisestä kysymyksestä, jota se on tarkoitus vastata.
On selitettävä, miten tulos on laskettu.
Peptidien yhdistämistä koskevassa prosenttilukemassa voi olla useita täysin erilaisia merkityksiä.
Se voi viitata lähtöaineen konversioon, chromatografisen pulssin suhteelliseen pinta-alaan, määrättyyn lopputuotteen pitoisuuteen, raaka-aineen tuotantotehoon tai eristetyn tuotteen tuotantotehoon.
Itsenäisen luvun antaminen ilman selitystä siitä, mistä se on kyse, voi siis luoda harhaanjohtavaa vaikutelmaa suuresta tarkkuudesta.
Luotettavien vertailujen tulisi määrittää alustan, analysoitavan yhdistymävaiheen, käytettyä analyysimenetelmää, näytteenottopäivämäärää sekä tutkittavien epäpuhtauksien tyyppejä.
Jos toistuva yhdistäminen on käytetty, se on myös otettava huomioon.
Kahden yhdistämisoperaation lopullinen tulos ei välttämättä heijasta sitä, mitä ensimmäisessä reagoinnissa tapahtui.
Analytiikkamenetelmien havaintoalueelle vaaditaan vastaavaa varovaisuutta.
Tunnus „ei havaittu” tarkoittaa, että tiettyä ainetta ei havaittu tiettyjen olosuhteiden ja käytetyn menetelmän rajoitusten puitteissa.
Se ei pitäisi automaattisesti muuttaa absoluuttiseksi väitteeksi siitä, että tiettyä epäpuhtautta ei ole lainkaan.
Reaktiivista ainetta koskevien tietojen tulisi kattaa enemmän kuin yksinkertainen malli
Liitokemikaali, joka toimii erittäin hyvin yksinkertaisessa malliradikaalisuudessa, voi toimia eri tavoin aminohapossa, jossa on suuri sterioottinen kiihdytyskeskus, heikosti liukeneva substraatti tai aggregointikelpoinen peptidiketju.
Tutkimukset, joissa Oxyma-B on verrattu useisiin malliproteiineihin, osoittavat, miksi yhden ainoan substraatin kemiallisen sidontakäsittelyn arviointi on arvokasta.
Loppujen lopuksi hyödyllinen yhdistämismenetelmä tulisi johtamaan suunniteltuun rakenteeseen hyväksyttävällä epäpuhtausprofiililla ja toistuvalla tuloksen saavuttamisella tavoitellussa synteesiä varten.
Siksi yhdistämisen tehokkuutta tulkitaan paremmin eri mittaustulosten joukoin kuin yksittäisen reagenssin nimellä kuvatun ominaisuuden tai yhden substraatin häviötutkimuksen tuloksen kautta.
Usein kysytyt kysymykset
1. Miksi peptidien synteesissä tarvitaan suojaavia ryhmiä?
Suojaryhmät rajoittavat tilapäisesti ei-toivottuja reaktioita, jotta asianmukaiset toimintoryhmät voivat muodostaa suunnitellut peptidi-yhtymät. Aminohapot voivat sisältää useita reaktioalueita, ja niiden kaikki samanaikainen käytettävyys voi johtaa kilpaileviin reaktioihin. Tehokas suojausstrategia on myös otettava huomioon suojausryhmien poistamismahdollisuuksien suhteen sekä niiden yhdenmukaisuuden muiden osien kanssa. Modellitutkimukset osoittavat, että suojausryhmien valinta voi vaikuttaa paitsi reaktion perusselektiivisuuteen myös sivutuotteiden syntyyn. Suojausryhmä on siis yksi osa koko synteesiä koskevaa strategiaa eikä yleinen ratkaisu kaikille kemiallisille ongelmille.
2. Voiko oikea liittäminen edelleen johtaa epäpuhtauksien syntymiseen?
Kyllä. Sovituspeptidi voi syntyä, kun taas toiset molekyylit samassa seoksessa altistuvat epätäydelliselle konvergoitumiselle tai ei-toivottaville sivutuotteille. Tämä on erityisen hyvin nähtävissä epimeraalisten tuotteiden tutkimuksissa, koska sopivan sidoksen syntyminen ja oikean stereokemian säilyttäminen ovat erillisiä prosesseja. Tästä syystä kohdepeptidin löytäminen ei tarkoita, että se olisi ainoa läsnä oleva tuote. Tieteellisesti perusteltu yhdistämisen onnistumisen arviointi edellyttää analyysin määrättyä päätepistettä ja merkityksellisten epäpuhtauksien tietoja.
3. Onko peptideiden yhdistäminen sama asia kuin koko peptidiyhteensovittaminen?
Ei. Kieritys on yksittäinen toimenpide sidoksen muodostamiseksi paljon laajemmassa synteesiprosessissa. Vaiheittaisessa synteesissä voi myös liittyä liitosmateriaaliin liittyminen, suojaus, suojausryhmien poistaminen, useita kierroksia, irrottaminen, käsittely, puhdistus ja lopullinen karakterisointi. Koska ei-toivottuja tuotteita voi syntyä myös kierityksen ulkopuolella, lopullista saastumista ei pidä automaattisesti yhdistää virheelliseen kieritykseen ilman tietoja, jotka osoittaisivat sen todellisen alkuperän.
4. Miksi karboksyyliryhmä aktivoituu?
Boksietyypin aktivoiminen luo edullisemman reaktiotavan sen ja sopivan aminiryhmän välille, helpottaen näin amidiyhdisteiden syntymistä. Kasvettu reaktiokyky voi kuitenkin myös mahdollistaa kilpailevia reaktioita. Siksi yhdisteiden sitoutumistekijöiden arvioinnissa tarkastellaan paitsi yhdisteiden syntymisen tehokkuutta myös stereokemiallisia vaikutuksia ja sivutuotteiden syntymistä. Yhteisen aktivoimisen tavoitteena ei ole maksimoida molekyylin reaktiokyky vaan saavuttaa sopiva reaktiotekijä.
5. Miksi HATU on olemassa?
HATU on yhdistämisaine, jota käytetään helpottamaan amidiyhdisteiden muodostumista, myös peptiinien yhdistämisessä. Se ei ole peptidi eikä suoja-aine. Vertailututkimukset vaikeista peptidi-sekvensseistä osoittavat, että HATUn käyttöä koskevia menetelmiä on arvioitava kokonaisvaltaisesti reaktiotilanteiden kannalta. Pelkkä tieto siitä, että HATU on käytetty, ei tue täyttä konvertoitumista, stereokemian säilymistä tai parempaa epäpuhtausprofiilia.
6. Onko olemassa yksi paras reagenssi peptidien yhdistämiseen?
Ei. Ei ole olemassa yleistä reagenssien luokitusta, joka olisi sopiva kaikille peptideille ja reaktioille. Stereokemiallinen tiheys, substraatin liukoisuus, aggregaatio, stereokemiallinen herkkyys ja sekvenssin konteksti voivat vaikuttaa tulokseen. Reagenssin valinta tulisi sen vuoksi perustua mitattuihin tuloksiin tietystä reaktiosta eikä pelkästään sen maineeseen tai suosiolle.
7. Ovatko „liittymäaine” ja „lisäaine” sama asia?
Ei. Nämä termit voivat kuvailla erilaisia toimintoja yhdistämisjärjestelmässä. Yhdistämisaine voi suoraan osallistua aktivoitumiseen, kun taas lisäaine voi vaikuttaa välituotteiden syntymiseen, reaktion tehokkuuteen, stereokemialliseen yhtenäisyyteen tai kilpaileviin kemiallisia reittejä. Siksi on analysoitava koko reaktiolähtöjärjestelmä eikä käsiteltävä kaikkia sen osia vaihtokelpoisin vastineina.
8. Voiko peptiinien osia yhdistää kokonaisuudeksi yksittäisten aminohappojen sijaan?
Kyllä. Kytkentiresponsiossa voi yhdistyä suurempia suojaamia peptidi-fragmentteja eikä pelkästään yksittäisiä aminohappoja. Kytkentäaineiden kokoa ei kuitenkaan vähennetä tarpeen poistamiseksi reaktion selektiivisyydestä, stereokemiallisesta rakenteesta tai lopputuotteen lopullisesta koostumuksesta. Kytkentäaineiden yhteydessä edelleen tarvitaan tietoja, jotka vahvistavat, että oikea yhdiste todella syntyi oikein.
9. Mikä on ero racemisaatiossa ja epimerytaatiossa?
Tarkemmin sanottuna racemisaatio tarkoittaa enantomierejäisen rikastumisen menetystä suuntautuen racemiseen sekoitukseen, kun taas epimeraatio tarkoittaa yhden stereogeenisen keskuksen muuttamista monia tällaisia keskuksia sisältävässä molekyylissä. Peptidien synteesiä käsittelevässä kirjallisuudessa termi ”racemisaatio” käytetään yleisemmin kuvaamaan epätoivottuja aminohappojen muuttumia. Tarkka määrittely olisi siis oltava vastaava todelliselle rakenteelliselle muutokselle.
10. Voiko massaspektrometria havaita kaiken stereokemialliset virheet?
Ei. Stereoizomereilla voi olla täsmälleen sama hiukkaskoko. Näin ollen odotettu massa ei vahvista jokaisen stereogeenisen keskusrakenteen oikeaa konfiguraatiota. Tällaisia eroja voidaan arvioida lisämenetelmillä, kuten sopivilla kromatografiamenetelmillä tai derivaatiostrategioilla. Massa-spektrometria on edelleen erittäin hyödyllinen hiukkaskokkien karakterisointiväline, mutta sen tulokset on tulkittava tietyn rakenteellisen kysymyksen rajoitusten mukaisesti.
11. Eikö aspartimidin syntyminen tarkoita pelkästään epäonnista sidontaa?
Ei. Aspartimien syntyminen on erillinen sivutuotejohtolanka, joka liittyy asparagiinia sisältäviin herkkiin sekvensseihin. Sen esiintymiseen voivat vaikuttaa naapuriaineosat sekä suoja-ryhmien poistamiseen liittyvät olosuhteet. Näin ollen epätoivoinen rakennemuutos voi syntyä jopa silloin, kun sopiva aminohappo on aiemmin yhdistetty oikein. Saasteen alkuperän määrittäminen on tärkeää, koska uudelleen yhdistyminen ei välttämättä ratkaise ongelmaa, joka johtuu täysin eri reaktiolangan kautta syntyvästä yhdistymisestä.
12. Varmistaako yhdistämisen toistaminen reaktion onnistumisen?
Ei. Toistuva sidonta voi joissakin tapauksissa parantaa konvertoitumista, mutta se ei takaa, että kaikki reaktiiviset paikat tulevat käytettäviksi tai että muut sivutuotteet poistuvat. Tulos riippuu silti substraatista ja käytetystä menetelmästä. Näin ollen tuotteen analyysi on välttämätön, jotta voidaan selvittää, mikä todella aiheutti ylimääräisen sidonnan.
13. Parantaako korkeampi lämpötila aina liitoksen laatua?
Ei. Lämpötilan nostaminen voi nopeuttaa toivottua reaktiota, mutta se voi myös nopeuttaa ei-toivottuja kemiallisia prosesseja. Siksi nopeampaa muuntumista ei pidä automaattisesti tulkita kemiallisen laadun parantumiseksi. Lämpötilaa on arvioitava sekä tavoitteellisen tuotteen että syntyvien epäpuhtauksien profiilin kannalta.
14. Varmistaako vapaan aminiryhmän puuttuminen oikean peptidin syntymisen?
Ei. Vapaan aminiryhmän puuttuminen ei vastaa laajempia kysymystä tietystä funktionaalisesta ryhmästä käytetyn testin olosuhteissa. Se ei yksinään vahvista peptidisekoituksen täyttä ketjua, sen stereokemiallista koostumusta tai puhtautta. Vapaiden aminiryhmien valvonta voi olla hyödyllinen osa prosessin valvontaa, mutta se ei korvaa lopputuotteen viimeistä analyysia.
15. Onko HPLC:n puhtaus sama kuin yhdistämisen tehokkuus?
Ei. HPLC-puhdistus ja tehokkuus kuvaavat eri ominaisuuksia. HPLC-puhdistus riippuu menetelmästä, joka kuvailee näytteen tunnistettavien ainesosien koostumusta, kun taas tehokkuus viittaa määrään määrättyä tuotetta, joka saadaan määrätyn alkuaineen määrän suhteen. Puhdistus voi parantaa GC-puhdistusta ja samalla pienentää määrää hyödynnettyä lopputuotetta. Siksi prosenttiosuus on vain rajallisen tärkeä asia, jos ei ole tarkkaan määritelty, mitä se tarkoittaa.
16. Voivatko epäpuhtaudet syntyä jo yhdistämisen päätyttyä?
Kyllä. Reaktiot yhdistämisen jälkeen käsittävät seuraavat kemialliset vaiheet. Suojapitoaineiden poistaminen, irtoaminen ja jatkokehitys voivat muuttaa molekyyliä tai johtaa lisäpäästöjen syntymiseen. Tämä ei tarkoita, että jokainen lopullinen epäpuhtaus syntyy myöhemmissä vaiheissa, vaan se osoittaa, miksi oikea yhdistäminen ei ole tae lopputuotteen laadusta.
17. Mikä tekee yhdistämismenetelmien vertailusta uskottavan?
Luotettava vertailu olisi tehtävä samalle, selkeästi määritellylle tavoitteelle ja riittävän vertailukelpoisissa olosuhteissa. Se olisi perustuttava käytettyihin alustaisiin menetelmiin, näytteenoton vaiheeseen, analyysimenetelmiin sekä arvioituihin epäpuhtausmuotoihin sen sijaan, että esitetään epäselvä prosenttiluku tai perustuisi reagenssin maineeseen. Useita erilaisia mallipeptidtejä sisältävät vertailut voivat tuottaa enemmän tietoa kuin yksi korkea tehokkuus, joka saavutetaan helpolla alustalla, koska ne osoittavat, miten tehokkuus muuttuu molekyylitilanteeseen nähden. Joskin päätelmät tulisi kuitenkin rajoittaa todella tutkituihin kemiallisten järjestelmiin.
Yhteenveto
Peptideiden sidontaa on perustavanlaatuinen osa peptideiden kemiallista synteesiä, koska se johtaa amidiyhdisteiden syntyyn, jotka yhdistävät aminohappojen jäämät peptidiseinään. Jos kuitenkaan kuvaillaan sidontaa pelkästään „kahden aminohapon yhdistymisenä”, jättää se huomiotta suuren osan kemiasta, joka ratkaisee, onko saatu tuote todellakin aiottu peptideksi.
Bikarboxietyypin sisältävä komponentti vaatii yleensä aktivointia, jotta amidiyhdisteiden tehokas muodostuminen voisi tapahtua oikein. Liittymäaineet ja lisäaineet voivat helpottaa tätä prosessia, mutta niiden tehokkuus riippuu substraatista, reaktiomaisemasta ja analyyttisen tuloksen arviointitavasta. Siksi reagenssia on analysoitava kokonaisvaltaisesti kokeellisesti eikä luokiteltava riippumatta syntetisoituneesta peptidista.
Suojaryhmät tarjoavat uuden tason valvontaa estämällä tilapäisesti ei-toivottuja toimintoalueita osallistumasta reaktiossa. Heidän käyttökelpoisuutensa riippuu paitsi tehokkaasta suojaamisesta myös kyvystä poistaa ne valikoivasti ja olla yhdenmukaisia seuraavien synteesi vaiheiden kanssa. Suojaryhmästrategia ja sen lähistöllä olevat aminohappojen jäljellä olevat osat voivat myös vaikuttaa tiettyjen sivutuotteiden syntymiseen.
Stereokemiallinen integraalisuus on toinen tärkeä elementti. Yhdistymisreaktio voi johtaa amidiyhdisteen syntyyn ja samalla tuottaa epimeryyttistä materiaalia. Koska epimäärillä voi olla sama hiukkaskoko kuin oikealla peptidillä, massa-yhteensoveltuvuus ei itsessään vahvista rakenteellista oikeellisuutta täysin. Muutokset konfiguratiossa voivat myös tapahtua muissa vaiheissa, kuten aminohapon alkukytkentä kiinteään tilaan.
Muut epäpuhtaudet syntyvät erilaisin mekanismein. Puutteellinen sidontajärjestelmä voi johtaa delekyöityjen tai lyhennettyjen ketjujen syntymiseen, kun taas aspartimidireaktiot voivat muuttaa jo olemassa olevia aminohappoja sisältävää peptidia. Prosessin nopeutuminen voi vaikuttaa sekä toivottuihin reaktioihin että sivuraketteihin, ja lisäepäpuhtaudet voivat myös syntyä myöhemmissä vaiheissa, kuten erotuksessa.
Näistä syistä peptiineiden yhdistymisen arvioimiseen tarvitaan enemmän kuin vain sen selvittämistä, onko lähtöaine katoamassa.
Muuntaminen, lopputuotteen syntyminen, eristetty tuotantotehokkuus, kromatografinen puhtaus ja stereokemiallinen puhtaus vastaavat erilaisiin kysymyksiin.
Synteesiä aikana suoritettavat testit voivat auttaa havaitsemaan puutteellisia reaktioita, mutta ne eivät yksinään vahvista peptidein kokonaisrakenteen. Kromatografia ja massaspektrometria tuottavat täydentäviä tietoja, mutta stereokemian tai hyvin samankaltaisten rakenteiden kysymykset voivat edellyttää lisäanalyysimenetelmiä.
Eniten perusteltu lähestymistapa peptidien yhdistämiseen on siis kohdistettu tiettyyn molekyyliin ja se perustuu tietoon.
Hyödyllinen yhdistämismenetelmä ei ole pelkästään menetelmä, joka käyttää tunnetuimpia tai reaktiivisimmin aktiivisia reagenssejä. Se on menetelmä, joka toistuvasti johtaa suunnitellun molekyyliyhteyden syntymiseen säilyttäen samalla stereokemiallisesti relevantin integraation ja merkittävien epäpuhtauksien hallinnan, jotka ovat tärkeitä tietyn synteettisen peptidin osalta.
Viitteet
- Subirós-Funosas, R., Prohens, R., Barbas, R., El-Faham, A., & Albericio, F. (2009). Oxyma: Tehokas lisäaine peptidi-synteesissä korvaamaan bentsotriazolipohjaiset HOBt- ja HOAt-aineet pienemmällä räjähdysriskillä. Kemia—A European Journal, 15(37), 9394–9403. https://doi.org/10.1002/chem.200900614
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Raseerausopinnot peptidiyhdisteiden synteesissä suojaamattomien epimeristen peptideiden erotuksella käänteisvaiheisen korkean suorituskyvyn nestekromatografian avulla. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Oxyma- ja HATU-lääkkeen yhdistetyn käytön arviointi peptidi-sekvenssien yhdistämisessä. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Jad, Y. E., Khattab, S. N., de la Torre, B. G., Govender, T., Kruger, H. G., El-Faham, A., & Albericio, F. (2014). Oxyma-B, erinomainen racemisoitumisen estäjä peptidien synteesissä. Luonnonmukaista ja biomolekyylikemiaa, 12(42), 8379–8385. https://doi.org/10.1039/c4ob01612b
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Kiinteä-faseen peptidi-synteesi: standardeista menetelmistä vaikeiden sekvenssien synteesiin. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Asparmiinipolymeerien ongelma Fmoc-pohjaisessa SPPS-menetelmässä. Toinen osa. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Asparimidi-ongelma Fmoc-pohjaisessa SPPS-menetelmässä. Toinen osa. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Marfeyn reagenssin käyttö määrittämään racemisoitumista aminohappojen kiinnittämisen jälkeen kiinteisiin tukipohjiin peptidisynteesin aikaan. Analyyttinen biokemia, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Racemisoitumisen ja aspartimidin muodostumisen rajoittaminen mikroaaltotehostetussa Fmoc-kiinteävaihepeptidisynteesissä. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-benzenedimetanoli (1,4-BDMT) vihreämpien peptiiriresinien erottelussa hajoittavana aineena. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D. & Pallai, P. (1991). Kovan tuotteen luokittelu kiinteä-fase-peptidisynteesistä mu-HPLC/nopea atomiammuntamassa-spektrometrin avulla. Peptide Research, 4(1), 40–46. PubMed