Spajkovanie peptidov je chemický proces, ktorý vedie k vytvoreniu väzby medzi zložkou obsahujúcou karboksylovú skupinu a zložkou obsahujúcou aminovú skupinu. V dôsledku tejto reakcie vzniká amidová väzba. Keď sa pri syntéze peptidu tieto ostatky aminokyselín spájajú, stávajú sa súčasťou toho, čo sa označuje ako peptidový skelet.
Reagujúcimi zložkami nemusí byť jednotlivé aminokyseliny. Reakcia spájania môže spojiť jeden aminokyselín s druhým, pripojiť ďalší aminokyselín k rastúcemu peptidovému reťazcu alebo spojiť väčšie fragmenty peptidov, ktoré boli predtým syntetizované samostatne.
Na prvý pohľad sa zdá, že spájanie peptidov môže byť jednoduchou úlohou: stačí spojiť jeden aminokyselín s ďalším.
Z chemického hľadiska je však vytvorenie amidového väzby len súčasťou celého cieľa.
Spojenie musí vzniknúť na správnom mieste a s dodržaním vhodnej stereochemickej konfigurácie, zatiaľ čo ostatné reaktívne funkčné skupiny musia zostať primerane kontrolované. Reakcia môže zdanlivo prebehnúť úspešne a využiť väčšinu alebo dokonca celý vstupný materiál, a napriek tomu môže viesť k vzniku neželanej zmesi cieľového peptidu a ďalších štruktúr.
Preto ukončenie reakcie a správne vytvorenie produktu neznamenajú to isté.
Výskumy porovnávajúce rôzne systémy spájania, stratégie zabezpečenia funkčných skupín a stereochemické výsledky ukazujú, prečo neexistuje jediný univerzálne najlepší spájajúci činidlo nezávisle od typu syntetizovaného peptidu.
Z vedeckého hľadiska nie je už užitočnejším otázkou:
„Ktorý spojovací činidlo je najlepší?”
Lepšie otázka znie:
„Aký prístup umožňuje získanie zamýšľaného peptidu s vhodnou konverziou, zachovaním stereochemickej integrity a vhodnou kontrolou znečisťujúcich látok za podmienok vhodných pre konkrétnu molekulu?”
Toto rozlíšenie má zásadný význam pre pochopenie chémie spájania peptidov.
Čo znamená spájanie peptidov?
Spojenie spája dva prvky vytvorením nového väzby
V typickej reakcii vedúcej k vzniku peptidového skeletu sa karbokyslová skupina spojená s jednou aminokyselinou spojí s aminovou skupinou druhej aminokyseliny.
Vytvárajúci sa zlúčenie je chemicky amidovým väzbom.
Ak takéto väzby spájajú ostatné aminokyseliny v peptidovom reťazci, bežne sa označuje ich názov ako peptidové väzby.
Presné fyzické usporiadanie reagujúcich látok závisí od použitej syntetizačnej stratégie.
Pri syntéze peptidov na pevných fázach je odkrytá aminová skupina zvyčajne súčasťou rastúceho peptidového reťazca pripojeného k živici, zatiaľ čo zložka obsahujúca karboxylovú skupinu pochádza z vloženého zabezpečeného aminokyselca.
V syntéze vedené v roztoku môžu obidva zložky však byť v kvapalnej fáze.
Pri spájkovaní fragmentov sa používajú väčšie, zabezpečené peptidické segmenty namiesto toho, aby sa pridávali jednotlivé aminokyselinové zvyšky po sebe.
Rôzne stratégie menia spôsob vedenia reakcií, rozdelenia materiálov a ich čistenia, ale nevyriešia základný chemický problém: správne funkčné skupiny musia reagovať navzájom, zatiaľ čo neželané reakcie v iných častiach molekuly by mali zostať primerane obmedzené.
Vznik väzby, konverzia a účinnosť sú rôzne pojmy
Niekoľko termínov často používaných pri opise spájania peptidov môže znieť podobne, hoci sa týkajú rôznych tém.
Konverzia určuje, aká časť daného vstupného materiálu bola reakciou ovplyvnená.
Nie však automaticky hovorí, v čo sa tento materiál zmenil.
Ak by sa stratilo 99 percent vstupného materiálu, ale časť z neho by vytvorila nežiaduce vedľajšie produkty, 99-percentná konverzia by neznamenala, že vzniklo 99 percent zamýšľaného peptidu.
Vývoj cieľového produktu odpovedá na ďalšie otázku: aké množstvo zamýšľanej molekulárnej štruktúry sa skutočne vytvorilo? Odpoveď si vyžaduje analytickú metódu umožňujúcu rozlíšiť správny produkt od dôležitých alternatívnych štruktúr.
Výkon izolácie opisuje množstvo konkrétneho produktu, ktoré sa nakoniec podarilo získať vzhľadom na definovanú množstvo počiatočného materiálu. Konečnú výkonnosť tak môžu ovplyvniť aj etapy spracovania, separácie a čistenia, aj keď samotné spájkovanie prebehlo efektívne.
Kromatografická čistota opisuje rozloženie zložiek detegovaných za podmienok danej chromatografickej metódy. Môže poskytovať veľmi cenné informácie o zložení vzorky, ale jej interpretáciu môžu obmedzovať súčinnosť eluovania, rozdiely v odezvách detektora alebo prítomnosť zložiek slabšie detegovaných danou metódou.
Stereochemická čistota odpovedá otázke, či bola zachovaná zamýšľaná priestorová konfigurácia častice. Ide o samostatný analytický problém, pretože niektoré stereochemické varianty môžu mať presne rovnakú molekulovú hmotnosť ako cieľový produkt.
Tieto rozdiely pomáhajú pochopiť výsledky, ktoré môžu na prvý pohľad vyzerať protichodne.
Reakcia môže vykazovať vysokú konverziu vstupného materiálu a zároveň viesť k vzniku niekoľkých produktov. Surový prípravok môže mať vysokú hmotnosť získanú späť, ale môže obsahovať značné množstvo znečisťujúcich látok. Intenzívne čistenie však môže viesť k získaniu materiálu s vysokou čistotou za cenu nižšej účinnosti izolovaného materiálu.
Žiadna z týchto pozorovaní sama osebe nie je v rozpore s ostatnými.
Jednoducho opisujú rôzne vlastnosti produktu alebo rôzne fázy procesu.
Preto je tvrdenie „zostávajúce súčasti boli kompletné” oveľa užitočnejšie, ak je tiež známe, akú analytickú metódu sa použila a čo presne bolo merané.
Ťažké substráty odhaľujú rôzne obmedzenia procesu
Nie každá reakcia spájania peptidov je spojená s rovnakou mierou chemickej náročnosti.
Silne stlačené reaktívne miesto môže spomaliť tvorbu väzby, pretože reagujúce skupiny majú obmedzený prístup k sebe.
Nízka rozpustnosť môže obmedziť účinný kontakt medzi zložkami reakcie.
Pri syntéze v pevných fázach môže rastúci peptidový reťazec pôsobiť na susedné reťazce alebo prijímať štruktúry, ktoré obmedzujú prístup k reaktívnym miestam, aj keď spojovacie činidlá sú prítomné v zdanlivej nadbytočnosti.
Tieto problémy majú rôzne chemické podstaty.
Nemôžeme teda predpokladať, že jedno riešenie bude automaticky účinné vo všetkých prípadoch.
Výskumy porovnávajúce stratégie opakovaného spájania pre zložitú sekvenciu peptidových látok analyzovali skutočný zloženie získaných surových produktov namiesto toho, aby sa hodnotenie zakladalo výhradne na teoretickej reakčivosti alebo reputácii jednotlivých činidiel. Jedna z testovaných stratégií sa v analyzovaných modeloch ukázala ako výhodná, ale to neznamená, že existuje univerzálne riešenie vhodné pre každú sekvenciu peptidových látok.
Najdôležitejším návrhom je, že účinnosť metódy sa musí hodnotiť na základe produktu získaného z konkrétneho substrátu, a nie len na základe reputácie použitého činidla.
Aktivácia karboksylovej skupiny
Prečo je aktivácia zvyčajne potrebná?
Samotné zmiešanie nerekonvertovaného karboksylového kyseliny s aminou za bežných podmienok zvyčajne nevedie k účinnému vytvoreniu čistého peptidového väzby.
Namiesto toho môžu dochádzať k interakciám kyseliny s zásadou a účinné vytváranie amidového väzby si vyžaduje vhodnú chemickú cestu.
Preto spájanie peptidov zvyčajne zahŕňa aktiváciu zložky obsahujúcej karboksylovú skupinu.
Aktivácia zvyšuje jeho citlivosť na reakciu s príslušnou aminovou skupinou. Správne reakčné prostredie a vhodná odchádzajúca skupina uľahčujú vznik nového amidového väzby.
Aktívne prechodné produkty môžu existovať len krátko a nemusí byť potrebné ich izolovať.
Cieľom však nie je dosiahnutie maximálnej možnej chemickej aktivity.
Cieľom je kontrolovaná reaktivita.
Aktívne prechodné produkty, ktoré veľmi rýchlo reagujú s vodou, s inými nežiaducimi nukleofíly alebo sa podieľajú na konkurenčnej reakcii, môžu rýchlo zmiznúť a zároveň viesť k tvorbe relatívne malého množstva zamýšľaného peptidu.
Vysoká reaktivita je teda prospešná len vtedy, keď ju možno primerane zamerať na vznik zamýšľaného väzby.
Zmesové činidlá a prísady plnia rôzne funkcie
Pri spájaní peptidov môžu účinkovať niekoľko druhov chemických látok s rôznymi funkciami.
Karbodiimidy sú jednou z rodín činidiel používaných na aktiváciu karboksylových skupín.
Iné spojovacie systémy využívajú odlišné mechanizmy aktivácie, vrátane často používaných iontových činidiel, ako sú systémy založené na HATU.
Ďalšie zlúčeniny môžu plniť funkciu prídavných látok.
Výraz „additiv” však neznamená, že daný zlúčovací produkt je chemicky irelevantný. Additiv môže ovplyvňovať vedľajšie produkty, účinnosť spájania, konkurenčné reakčné dráhy a stereochemické výsledky.
Výskum oxymy v syntéze peptidov s karbodiimidmi analyzoval ako účinnosť spájania, tak aj obmedzenie racemizácie v vybraných modeloch.
Takéto údaje sú cenné pre skúmané systémy a konkrétne modely.
To však neznamená, že použitie toho istého zlúčeniny v každom možnom spojení peptidov prinesie rovnaký výsledok.
Ďalšie štúdie spoločnosti Oxyma-B porovnávali výsledky týkajúce sa optickej čistoty v niekoľkých modelových peptidoch.
Štúdia mnohých substrátov je obzvlášť dôležitá, pretože veľmi dobré výsledky pri ľahkom chemickom spájaní nemusí predvídať správanie činidla v priestore s vysokou agregáciou alebo špeciálne citlivom stereochemickom režime.
Čo znamená HATU v syntéze peptidov?
HATU je spojovacie činidlo používané na uľahčenie tvorby amidových väzieb, a to aj pri syntéze peptidov.
HATU nie je peptidom.
Není ani ochrannou skupinou.
Samotná jeho prítomnosť nepredstavuje dôkaz toho, že spájanie bolo ukončené ani že získaný peptid je čistý.
Účinnosť závisí od typu substrátu, ostatných činidiel, systému rozpúšťadiel a širšieho kontextu reakčných podmienok.
Výskum sekvencií citlivých na agregáciu porovnával okrem iného prístupy založené na HATU a systémy Oxyma/karbodiimid v rámci opakovaného spájania.
To poukazuje na to, prečo vyhľadávania typu „HATU peptide” treba chápať ako otázky týkajúce sa chemického spájania a výberu metódy, a nie ako dôkaz toho, že jeden konkrétny činidlo predstavuje univerzálnu metódu syntézy peptidov.
Samotná názov činidla nestačí na reprodukciu ani správne interpretovanie publikovaného výsledku.
Význam majú aj podmienky reakcie, sekvencia peptidu a spôsob analytického definovania úspechu procesu.
Aktualizácia a stereochemická kontrola si vyžadujú zachovanie rovnováhy.
Dlhodobé udržiavanie aktivovanej derivátovej formy aminokyseliny v reakčnom systéme nie je vždy výhodné.
Požadovaná reakcia spájania prebieha popri iných možných chemických procesoch.
Niektoré konkurenčné trasy môžu zmeniť stereotypy.
Experimentálne štúdie s chránenými epiméryčnymi produktmi skúmali vplyv kombinácie aminokyselín, rozpúšťadla a ďalších zložiek reakcie na stereochemické zmeny, ktoré nastávajú počas spájania s účasťou karbodiimidov.
To poukazuje na dôležitú zásadu: celá reakčná konštelácia môže byť rovnako dôležitá ako samotná celá rodina použitých spájajúcich činidiel.
Stratégia spájania musí teda poskytovať dostatočnú reaktivitu na vytvorenie požadovaného zlúčenia, pričom zároveň obmedzuje možnosť vzniku nežiaducich reakcií.
Tieto pravidlá je možné diskutovať v vzdelávacích účeloch bez toho, aby sa zmenili na hotový laboratórny postup. Presné množstvá činidiel, poradie ich pridávania a podmienky reakcie závisia od konkrétneho procesu syntézy, ktorý sa vyvíja.
Úloha ochranných skupín
Zabezpečenie obmedzuje konkurenčné miesta reakcie
Aminokyselina môže obsahovať viac reaktívnych skupín ako len aminová a karboksylová skupina potrebná na vytvorenie peptidového skeletu.
Jeho bočný reťazec môže obsahovať ďalšie reaktívne chemické skupiny.
Keby všetky potenciálne reaktívne skupiny zostali odkryté počas každého stupňa spájania, plánované vytváranie peptidového väzby by mohlo konkurovať rozgaľovaniu alebo iným nežiadúcim reakciám.
Strategia využívajúca ochranné skupiny umožňuje dočasne zamaskovať vybrané aktívne miesta.
Vďaka tomu môžu príslušné aminové a karboksylové skupiny reagovať navzájom, zatiaľ čo iné miesta zostávajú nedostupné alebo dostatočne slabým činidlom v daných podmienkach.
Zabezpečenie teda poskytuje chemickú selekciu.
Účinná stratégia však nezostáva len v spojení stabilne chemicky zloženej skupiny.
Ochrannú skupinu je tiež potrebné neskôr odstrániť.
Ochranný prvok, ktorý účinne predchádza nežiadúcim reakciám počas spájkovania, ale nesmie byť neskôr odstránený bez poškodenia cieľovej molekuly, spôsobuje ďalší syntetický problém.
Plná stratégia teda musí zohľadňovať stabilitu v období, keď je ochrana potrebná, ako aj možnosť selektívneho odstránenia ochrany, keď už nie je potrebná.
Dočasné a dlhodobé zabezpečenia plnia rôzne funkcie
Rôzne skupiny ochrany môžu zostať na mieste po určitú dobu.
V typickej syntéze v pevných fázach, ktorá využíva Fmoc zabezpečenie konečnej aminovej skupiny rastúceho reťazca, sa mnohokrát odstraňuje počas predĺženia reťazca.
Mnohé skupiny ochranných reťazcov bočných koncov zostávajú však prítomné počas mnohých cyklov spájania a až v neskoršom štádiu sú odstránené.
Standardné metódy založené na Fmoc ukazujú, ako sa koordinujú opakujúce sa cykly selektívneho odstraňovania a spájania.
Typ ochrany potrebný pre konkrétny bočný reťazec závisí od zvyšku aminokyselín, celého peptidu a zvolenej syntetizačnej stratégie.
Nebolo by teda správne tvrdiť, že každý aminokyselina vyžaduje rovnakú formu ochrany alebo že všetky syntézy využívajú tie isté ochranné skupiny.
Dočasné ochranné skupiny treba tiež odlíšiť od chemických skupín, ktoré sú záměrne prítomné v hotovom peptide.
Plánovaná modifikácia N-konca alebo amidu na C-konci môže napríklad predstavovať súčasť cieľovej štruktúry.
Na druhej strane, dočasná ochranná skupina, ktorá náhodou zostala v konečnej molekule, by znamenala neželateľný štrukturálny rozdiel.
Ortogonalita je požiadavkou chemickej zhody
Ortogonalná ochrana je stratégia, v ktorej je možné odstrániť vybrané ochranné skupiny a ponechať ostatné zabezpečenia dostatočne nedotknuté.
To umožňuje odhaľovať rôzne reaktívne miesta v úmyselne zvolených fázach syntézy.
Ortogonalitu nemožno chápať len ako vlastnosť jednotlivého činidla uvedenej na jeho etikete.
Popisuje to súlad cele plánovanej sekvencie chemických operácií.
Úmyselné odstránenie zabezpečenia by malo prebiehať bez toho, aby došlo k neprijateľným zmenám v iných častiach rastúceho peptidu.
V syntéze v pevných fázach môže táto zhoda zahŕňať aj nosič-spojovací systém a atypické alebo chemicky mimoriadne citlivé stavebné bloky.
Výskum vzniku aspartimidu, v ktorom sa modifikovali zabezpečenia bočných reťazcov a skeletu v modelovom peptide, ukázal rozdielne vzory tvorby vedľajších produktov.
To ukazuje, že výber zabezpečenia môže ovplyvňovať nielen výskyt zjavnej reakcie bočného reťazca.
Môže tiež meniť iné cesty vzniku znečisťujúcich látok počas syntézy.
Ochranné skupiny nezaručujú, že všetky sekvencie sa správajú rovnako
Aj keď dve sekvencie obsahujú ten istý potenciálne problematický aminokyselín, nemusí sa správať identicky.
Príslušné zvyšky môžu ovplyvňovať pravdepodobnosť vzniku konkurenčných reakcií.
Systematické štúdie modelových sekvencií obsahujúcich asparaginianu ukázali, že aminokyselina nasledujúca po tejto reťazci ovplyvňovala vznik produktov spojených s aspartimidom za skúmaných podmienok.
To neznamená, že každá sekvencia obsahujúca taký motív musí spôsobiť problémy.
Naopak, ukazuje, že kontext sekvencie by mal byť zohľadnený pri vypracúvaní metódy a hodnotení rizika.
Strategia zabezpečenia, ktorá sa ukázala ako účinná v jednom konkrétnom peptíde, nezaručuje rovnaké správanie každého iného peptidu obsahujúceho tú istú zložku.
Rasizácia a ďalšie vedľajšie účinky
Racemizácia a epimeryzácia sa týkajú priestorového usporiadania častíc
Veľa aminokyselín pozostávajúcich z niekoľkých reťazcov obsahuje stereogénne centrum.
Zmena konfigurácie takéhoto centra môže viesť k vzniku štruktúrne odlišnej molekuly, aj keď jej prvotný prvok a molekulová hmotnosť zostávajú nezmenené.
Príliš striktne povedané, racemizácia znamená stratu enancymeryčného obohatenia smerom k racemickej zmesi.
V peptidoch obsahujúcich veľa stereogénnych centier odklonenie konfigurácie jedného konkrétneho centra zvyčajne vedie k vzniku epiméra, teda druhu disteeroizoméra.
V literatúre týkajúcej sa syntézy peptidov sa však pojem „racemizácia” vo všeobecnosti používa aj pre nežiaduce zmeny konfigurácie, ktoré nastávajú počas spájania alebo iných fáz syntézy.
Toto rozlíšenie je dôležité, pretože identita peptidu nezávisí výlučne od toho, aké atómy sa nachádzajú v molekule.
Význam má aj ich priestorové rozmiestnenie.
Nie každá aminokyselinová pozostávka je spojená s rovnakým stereochemickým rizikom.
Glycina napríklad nemá typický chiralný uhlíkový alfa atóm, ktorý sa vyskytuje v väčšine aminokyselín.
Ostatné zložky sa líšia citlivosťou na zmeny konfigurácie v závislosti od svojej štruktúry a reakčného prostredia.
Správnej hmotnosti môže byť spojená s nesprávnou stereochemickou štruktúrou
Epiméryny môžu mať presne rovnakú molekulovú hmotnosť ako cieľový peptid.
Preto zistenie očakávanej hmotnosti pomocou hmotnostnej spektrometrii automaticky neznamená, že každá aminokyselinová zložka zachovala zamýšľanú stereochemickú konfiguráciu.
Kromatografické analýzy umožnili rozlíšenie zaistených epiméryčných peptidov a využitie týchto rozdelení na analýzu stereochemických zmien spojených s chemickou interakciou väzby.
V závislosti od molekuly môže zodpovedajúca stereochemická analýza vyžadovať vhodné chromatografické metódy, referenčné zlúčeniny, stratégie derivatizácie alebo iné analytické metódy schopné rozlišovať významné štruktúry.
Osobné analytické štúdie tiež analyzovali stereochemické zmeny, ktoré nastávajú pri pripojení aminokyselín k pevným nosičom.
To vedie k ďalšiemu dôležitému záveru: znečistenie zistené v hotovom peptide nemusí pochádzať z poslednej reakcie spájania.
Mohlo by sa vytvoriť v skoršom štádiu a zostať prítomné počas ďalších štádií syntézy.
Vytvorenie aspartimidu je samostatným problémom
Vytvorenie aspartimidu je špecifickým sprievodným metabolickým tokom spojeným s citlivými peptidovými sekvenciami obsahujúcimi aspartát.
Postup zahŕňa vytvorenie cyklického medziproduktu, z ktorého sa potom môžu vytvárať rôzne príbuzné štruktúry.
Môžu zahŕňať zmenené väzby v štruktúre peptidu a stereochemické varianty.
Výskytu aspartimidu preto nie je možné opísať jednoducho ako iná forma neúplného spájania.
Peptidový reťazec už môže obsahovať správne aminokyselinové zvyšky a následná vedľajšia reakcia môže zmeniť časť jeho štruktúry.
Experimentálne štúdie ukazujú, že tento proces môžu ovplyvňovať stratégia zabezpečenia, susedné zbytky a opakujúce sa podmienky spojené s likvidáciou ochranných skupín.
Toto rozlišovanie je obzvlášť dôležité pri interpretácii problémov vyskytujúcich sa pri syntéze.
Len opakované spájkovanie alebo pridanie väčšieho množstva spojujúceho činidla automaticky nezmierni znečistenie, ktoré vzniklo v dôsledku úplne inej chemickej dráhy.
Neúplné reakcie vedú k iným problémom
Nedokonale zladené znečisťujúce látky vytvárajú samostatnú kategóriu.
Ak jeden reťazec zviazaný živicou nedostane plánovaný aminokyselín, ale bude správne reagovať počas neskoršieho cyklu, vzniknutý peptid môže byť bez tejto zvyšnej zložky.
Takúto molekulu sa zvyčajne označuje ako sekvencia delecie.
Iné reťaze môžu prestať rásť a zostať skrátené.
Tieto produkty sa v zásade odlišujú od epimerov.
Epimer môže mať správnu aminokyselinovú sekvenciu a súhrnný vzorec, ale nesprávnu stereochemickú štruktúru jedného centra.
Peptidový delečný fragment má však inú sekvenciu alebo dĺžku.
Niektoré stratégie syntézy využívajú tzv. capping na zabránenie ďalšiemu predĺženiu určitých nereagujúcich reťazcov.
Záracie spojenie však nereparuje poškodený reťazec a nepremení ho na cieľový peptid.
Zmení len jeho správanie počas ďalších fáz.
Hrubá zmes získaná pri syntéze môže teda obsahovať produkty vznikajúce v dôsledku niekoľkých rôznych mechanizmov.
Jedna súhrnná hodnota výkonnosti neumožňuje určiť, ktoré mechanizmy vzniku znečisťovania boli zodpovedné za konečný výsledok.
Teplota a procesné podmienky ovplyvňujú kompromis medzi rýchlosťou a kvalitou
Zvýšenie teploty alebo iné spôsoby urýchlenia syntézy môžu zvýšiť rýchlosť požadovaných reakcií.
Samotné však môžu urýchliť nežiaduce reakcie.
Výskum SPPS podporovanou mikrovlnou energiou analyzoval racemizáciu a vznik aspartimidu v modelových systémoch a preukázal závislosť zloženia od typu použitej energie v daných podmienkach.
To však neznamená, že sa teplo prirodzene považuje za nevhodné pre syntézu peptidov.
To tiež neznamená, že nižšia teplota je vždy lepšia.
Najdôležitejšou zásadou je: rýchlosť procesu a chemickú kvalitu je potrebné posudzovať súčasne.
Vyššia teplota, dlhšia expozícia alebo opakované spracovanie môžu mať vplyv na požadované vytváranie väzieb, ako aj na konkurenčné reakcie.
Vhodný kompromis by sa preto mal experimentálne vyhodnotiť pre konkrétnu sekvenciu.
Modifikácie konečného produktu môžu tiež nastať už po ukončení samotného spájkovania.
Výskumy porovnávajúce rôzne čistiace látky počas odstraňovania peptidu z živice ukázali rôzne profily znečisťujúcich látok.
To naznačuje, že konečné znečistenie sa nesmie automaticky pripisovať reakcii spájania.
Syntéza peptidu je procesom s viacerými fázami a následné odpojenie, odstraňovanie a ďalšia úprava môžu zmeniť materiál, ktorý bol predtým správne zostavený.
Ako sa hodnotí účinnosť spájania?
Testy vykonávané počas procesu zodpovedajú iba na konkrétne otázky
Počas syntézy v pevných fázach môže detekčný test pre ostatné dostupné aminové skupiny pomôcť posúdiť, či acylácia mohla prebiehať čiastočne.
Takéto testy môžu byť veľmi užitočné.
Ich interpretácia by však mala obmedziť sa na chemický problém, na ktorý skutočne odpovedá použitá metóda.
V závislosti od analytickej metódy a typu aminokyseliny môžu testy založené na zmene farby reagovať rôzne na rôzne amíny.
Význam má tiež dostupnosť skúmaného miesta.
Reaktivná aminová skupina, ku ktorej testovací činidlo má fyzicky nedostupné miesto, nie je rovnaká ako aminová skupina, ktorá správne prebehla reakciu spájania – aj keď daný test nedokáže jednoznačne rozlíšiť tieto situácie.
Obmedzenia môžu teda zahŕňať dostupnosť reaktívneho miesta, citlivosť testu, chemické interferencie a typ zisteného funkčného typu.
Negatívny výsledok testu vykonaného počas procesu sa nesmie automaticky interpretovať ako dôkaz toho, že celý peptid má správnu sekvenciu, stereochemickú štruktúru a čistotu.
Monitorovanie procesu je najcennejšie vtedy, keď jeho výsledky možno neskôr porovnať s analýzou reálneho peptidového produktu.
Kromatografia rozdeľuje, zatiaľ čo hmotnostná spektrometria pomáha charakterizovať zložky.
Kromatografia a hmotnostná spektrometría poskytujú informácie navzájom dopĺňajúce sa.
Kromatografia môže rozlíšiť zložky vzorky a identifikovať prítomnosť viac ako jedného zistiteľného zloženia.
Masová spektrometría môže poskytovať informácie o hmotnosti molekuly a pomáha tak charakterizovať alebo priradiť jednotlivé zložky.
Výskumy spájajúce obe techniky umožňovali analyzovať surové produkty syntézy peptidov v pevných fázach a získavať informácie o ich identite a stupni odstránenia ochranných skupín.
Kombinácia oboch metód zvyčajne poskytuje viac informácií ako predpoklad, že každý chromatografický pixel už bol identifikovaný alebo že každá zistená hmotnosť zodpovedá čistému a štruktúrne kompletnému frakčnému množstvu.
Existujú však obmedzenia.
Rôzne zložky môžu spolupracovať, t. j. nemôžu byť chromatograficky úplne oddelené.
Jednotlivé látky môžu tiež spôsobiť rôznou reakciu detektora.
Struktúrne izoméry a stereoizoméry môžu vyžadovať použitie ďalších analytických metód.
Z toho istého dôvodu samotné tvrdenie, že peptid bol testovaný metódou HPLC, automaticky neznamená, že boli rozdelené všetky významné znečisťujúce látky.
Použiteľnosť konkrétnej metódy HPLC závisí od skutočne získaného rozdelenia a od analytického problému, na ktorý má odpovedať.
Je potrebné vysvetliť, ako bol výsledok vypočítaný.
Percentuálna hodnota uvedená v súvislosti s spojením peptidov môže znamenať niekoľko úplne odlišných vecí.
Môže sa týkať konverzie vstupného materiálu, relatívnej povrchovej hrúbky chromatografického vrhu, nameraného obsahu cieľového produktu, výkonnosti surovej alebo izolovanej účinnosti.
Predloženie samotnej čísla bez vysvetlenia, o čom ide, môže teda vytvárať mylujúci dojem veľkej presnosti.
Spoľahlivé porovnania by mali určovať substrát, analyzovaný štádium spájania, použitú analytickú metódu, čas odberu vzorky a typy kontrolovaných znečisťujúcich látok.
Ak sa použilo opakované spájanie, je potrebné to tiež zohľadniť.
Konečný výsledok po dvoch operáciách zlúčenia nemusí odrážať to, čo sa stalo počas prvej reakcie.
Súvisiace obozretnosť vyžaduje hranice detekčnej schopnosti analytických metód.
Výraz „nebol zistený” znamená, že daná látka nebola zistená za daných podmienok a pri obmedzeniach použitej metódy.
To by nemalo automaticky viesť k absolútnej domnii, že dané znečistenie vôbec neexistuje.
Údaje týkajúce sa činidla by mali zahŕňať viac ako jednoduchý model.
Spojovací činidlo, ktoré účinkuje mimoriadne dobre v jednoduchom modelovom reaktore, sa môže správať inak v prípade aminokyseliny s vysokým sterylným zatížením, citlivým stereochemickým centrom, slabým rozpúšťadlom alebo peptidovým reťazcom náchylným k agregácii.
Výskumy porovnávajúce Oxyma-B v niekoľkých modelových peptidoch ukazujú, prečo je hodnotné hodnotenie chemickej väzby na viac ako jednom substráte.
Nakoniec by užitočná metóda spájania mala viesť k získaniu zamýšľanej štruktúry s prijateľným profilom znečistenia a opakovaným výsledkom pre cieľovú syntézu.
Preto je účinnosť spájania lepšie chápať ako súbor rôznych meraní ako vlastnosť opísanú názvom jednotlivého činidla alebo výsledkom jedného testu straty substrátu.
Často kladené otázky
1. Prečo sú počas syntézy peptidov potrebné ochranné skupiny?
Ochranné skupiny dočasne obmedzujú nežiaduce reakcie, čím umožňujú správnym funkčným skupinám vytvoriť zamýšľané peptidové väzby. Aminokyseliny môžu obsahovať niekoľko reaktívnych miest a ponechanie všetkých súčasne dostupných môže viesť k konkurenčným reakciám. Účinná ochranná stratégia musí tiež zohľadňovať možnosť neskoršieho odstránenia ochranných skupín a ich zlučiteľnosť s ostatnou časťou molekuly. Modely výskumu ukazujú, že výber ochranných skupín môže ovplyvňovať nielen základnú selektivitu reakcie, ale aj vznik vedľajších produktov. Štruktúra ochranných skupín je teda jedným z prvkov celej syntetickej stratégie a nie univerzálnym riešením všetkých chemických problémov.
2. Môže správne spájkovanie stále viesť k vzniku znečisťujúcich látok?
Áno. Úmyselné peptidové väzby môžu vzniknúť, zatiaľ čo iné častice v tej istej zmesi podliehajú neúplnej konverzii alebo neželaným vedľajším reakciám. Výsledky štúdií epiméryčných produktov sú obzvlášť jasné, pretože vytvorenie správneho väzby a zachovanie správnej stereochemie sú odlišné pojmy. Zistenie cieľového peptidu teda neznamená, že ide o jediný prítomný produkt. Veda podložená hodnocení úspechu väzby si vyžaduje definovaný koncový bod analýzy a informácie o relevantných znečisteniach.
3. Je spojenie peptidov rovnaké ako celá syntéza peptidu?
Nie. Spätné pridruženie je samostatnou operáciou vytvárania väzby v rámci oveľa širšieho procesu syntézy. Syntéza v pevných fázach môže zahŕňať aj pripojenie k nosiču, zabezpečenie, odstránenie ochranných skupín, opakované preplachovanie, odstraňovanie, úprava, čistenie a konečnú charakterizáciu. Keďže vedľajšie produkty môžu vzniknúť aj mimo fázy spätného pridruženia, konečné znečistenie sa nesmie automaticky pripisovať nesprávnemu spätnému pridruženiu bez údajov, ktoré by naznačovali jeho skutočný pôvod.
4. Prečo je karboksylová skupina aktivovaná?
Aktivácia karboksylovej skupiny vytvára priaznivejšiu cestu jej reakcie s príslušnou aminovou skupinou, čím uľahčuje vznik amidovej väzby. Zvýšená reaktivita však môže tiež umožňovať konkurenčné reakcie. Preto pri hodnotení spájacích systémov sa zohľadňuje nielen účinnosť tvorby väzby, ale aj stereochemické účinky a vznik vedľajších produktov. Cieľom aktivácie nie je maximálne zvýšenie reaktivity molekuly, ale dosiahnutie primeranej selektivity reakcie.
5. Čo slúži HATU?
HATU je spájajúci činidlo používané na uľahčenie tvorby amidových väzieb, a to aj pri spájkovaní peptidov. Nie je peptidom ani ochrannou skupinou. Porovnávacie štúdie s ťažkými peptidovými sekvenciami ukazujú, že metódy využívajúce HATU musia byť hodnotené v plnom kontexte reakčných podmienok. Samotné informácie o použití HATU nepotvrdzujú úplnú konverziu, zachovanie stereochemie ani lepší profil znečisťujúcich látok.
6. Existuje jeden najlepší činidlo na spájanie peptidov?
Nie. Neexistuje univerzálny ranking činidiel vhodných pre každý peptid a každú reakciu. Štruktúrna hustota, rozpustnosť substrátu, agregácia, stereochemická citlivosť a kontext sekvencie môžu mať vplyv na výsledok. Výber činidla by sa teda mal zakladať na meraných výsledkoch pre konkrétnu reakciu a nie iba na jeho reputácii alebo popularite.
7. Znamenajú „spojovací činidlo” a „prídavok” to isté?
Nie. Tieto termíny môžu opisovať rôzne funkcie v rámci systému spájania. Spojovací činidlo môže priamo účinkovať na aktiváciu, zatiaľ čo prídavok môže ovplyvňovať vznik vedľajších produktov, výkonnosť reakcie, stereochemickú integritu alebo konkurenčné chemické dráhy. Preto je potrebné analyzovať celý reakčný systém a nepovažovať všetky jeho zložky za zameniteľné náhrady.
8. Je možné spojiť celé fragmenty peptidov namiesto jednotlivých aminokyselín?
Áno. Reakcia spájania môže spájať väčšie zabezpečené peptidové fragmenty a nie len jednotlivé aminokyseliny. Zvýšenie veľkosti reagujúcich zložiek však neodstraňuje potrebu kontrolovať selektivitu reakčného miesta, stereochemie ani konečnú charakteristiku produktu. V prípade spájania fragmentov sú stále potrebné údaje potvrdzujúce, že správne spojenie sa skutočne vytvorilo správne.
9. Aká je rozdielnosť medzi racemizáciou a epimeryzací?
Racemizácia v najprísnejšom zmysle znamená stratu enantiomeryčného bohatstva smerom k racemickej zmesi, zatiaľ čo epimerizácia znamená zmenu konfigurácie jedného stereogenného centra v molekule obsahujúcej viac takýchto centier. V literatúre týkajúcej sa syntézy peptidov sa termín racemizácia bežne používa širšie na opis nežiaducich zmien konfigurácie aminokyselinových zvyškov. Presné vymedzenie by preto malo zodpovedať skutočnej štrukturálnej zmene.
10. Môže hmotnostná spektrometría odhaliť akýkoľvek stereochemický nedostatok?
Nie. Stereoisomery môžu mať presne rovnakú molekulovú hmotnosť. Preto získanie očakávanej hmotnosti nepotvrdzuje správnu konfiguráciu každého stereogenného centra. Na posúdenie takýchto rozdielov môžu byť potrebné ďalšie metódy, napríklad vhodné chromatografické techniky alebo stratégie derivatizácie. Mass spectrometry zostáva mimoriadne užitočným nástrojom molekulárnej charakterizácie, ale jej výsledky treba interpretovať v súlade s obmedzeniami konkrétneho štrukturálneho problému.
11. Znamená vznik aspartimidu jednoducho neúspešné spájanie?
Nie. Vytvorenie aspartimidu je samostatnou vedľajšou reakciou spojenou s citlivými sekvenciami obsahujúcimi aspartámnu skupinu. Jej výskyt môže byť ovplyvnený okolitými zvyškami a podmienkami spojenými s odstraňovaním ochranných skupín. Nežiadúca štruktúrna zmena sa teda môže vyskytnúť aj vtedy, keď je príslušný aminokyselina predtým správne prepojená. Určenie pôvodu znečistenia je dôležité, pretože opakované spájanie nemusí vyriešiť problém vyplývajúci z úplne odlišnej reakčnej cesty.
12. Zaručuje opakované spájanie úspech reakcie?
Nie. Opätovné spájanie môže v niektorých prípadoch zlepšiť konverziu, ale nezaručuje, že všetky reaktívne miesta budú dostupné ani že ostatné vedľajšie reakcie budú eliminované. Výsledok je stále závislý od substrátu a použitej metódy. Preto je potrebná analýza produktu, aby sa zistilo, čo skutočne umožnilo ďalšie spájanie.
13. Zlepšuje vyššia teplota vždy kvalitu spojenia?
Nie. Zvýšenie teploty môže urýchliť požadovanú reakciu, ale môže tiež urýchliť nežiaduce chemické procesy. Rýchlejšiu konverziu sa preto nesmie automaticky interpretovať ako zlepšenie chemickej kvality. Teplota sa musí posudzovať z hľadiska vytvorenia cieľového produktu a profilu vznikajúcich znečisťujúcich látok.
14. Dokazuje strata voľnej aminokyseliny vznik správneho proteínu?
Nie. Nedetekovateľná voľná aminová skupina zodpovedá oveľa užšiemu otázke týkajúcej sa konkrétnej funkčnej skupiny za podmienok použitého testu. Samotne neodhalí kompletnú sekvenciu peptidu, jeho stereochemickú štruktúru ani čistotu. Monitorovanie voľných aminových skupín môže byť užitočným prvkom kontroly procesu, ale nahrádza konečnú charakteristiku produktu.
15. Je čistota HPLC rovná sa výkonnosťou spojenia?
Nie. Čistota HPLC a výkon opisujú rôzne vlastnosti. Čistota HPLC je závislá od metódy opisovania zloženia zistených zložiek vzorky, zatiaľ čo výkon sa týka množstva definovaného produktu získaného vzhľadom na definovanú množstvo počiatočného materiálu. Čistenie môže zvýšiť chromatografickú čistotu a zároveň znížiť množstvo získaného cieľového produktu. Preto má percentuálny podiel len obmedzenú dôležitosť, pokiaľ nie je presne uvedené, čo sa predstavuje.
16. Môžu sa znečistenia objaviť aj po ukončení spájania?
Áno. Po dokončení syntetického spájkovania sa syntéza peptidu spája s ďalšími chemickými fázami. Odstránenie ochranných skupín, odstraňovanie a ďalšie úpravy môžu modifikovať molekulu alebo viesť k vzniku ďalších znečistení. To však neznamená, že každé konečné znečistenie vzniká v neskorších fázach, ale poukazuje na to, prečo správne spájkovanie nie je zárukou kvality konečného produktu.
17. Čo spôsobuje, že porovnanie metód spájania je dôveryhodné?
Spoľahlivý porovnávací proces by mal posudzovať alternatívne metódy pre ten istý jasne definovaný cieľ a za dostatočne porovnateľných podmienok. Mal by uvádzať použité substráty, etapu odberu vzoriek, analytické metódy a hodnotené typy znečisťujúcich látok, namiesto prezentovania neobjasneného percentuálneho podielu alebo opierania sa o reputáciu činidla. Porovnania zahŕňajúce niekoľko rôznych modelových peptidov môžu poskytnúť viac informácií ako jediná vysoká účinnosť získaná pre ľahký substrát, pretože ukazujú, ako sa účinnosť mení v závislosti od molekulárneho kontextu. Dokonca aj v takom prípade by závery mali zostať obmedzené na skutočne preskúmané chemické systémy.
Zhrnutie
Spajkovanie peptidov je základným prvkom chemickej syntézy peptidov, pretože vedie k vzniku amidových väzieb, ktoré spájajú aminokyselinové reťazce v peptidovom skelete. Opisovanie spajkovania výhradne ako „spojenia dvoch aminokyselín” však prehliada značnú časť chémie rozhodujúcej o tom, či získaný produkt skutočne je zamýšľaným peptidom.
Zložka obsahujúca karboksylovú skupinu zvyčajne potrebuje aktiváciu, aby sa účinne vytvorilo amidové väzobné zlúčenie. Zviazavacie činidlá a prídavné látky môžu tento proces uľahčiť, ale ich účinnosť závisí od substrátu, reakčného prostredia a spôsobu analytickej interpretácie výsledku. Z tohto dôvodu je potrebné analyzovať činidlo v plnom experimentálnom kontexte a nie klasifikovať ho nezávisle od syntetizovaného peptidu.
Ochranné skupiny poskytujú ďalšiu úroveň kontroly tým, že dočasne znemožňujú neželaným funkčným skupinám účasť na reakcii. Ich účinnosť závisí nielen od účinnej ochrany, ale aj od možnosti selektívneho odstránenia a zhodnosti s ďalšími štádiami syntézy. Stratégia ochrany a susedné aminokyselinové zbytky môžu tiež ovplyvňovať vznik určitých vedľajších produktov.
Integrálna stereochemická stabilita je ďalším dôležitým prvkom. Reakcia spájania môže viesť k vzniku amidového väzby a zároveň vytvárať epimérny materiál. Keďže epimér môže mať rovnakú molekulovú hmotnosť ako vlastný peptid, samotná zhoda hmotnosti nepotvrdzuje úplnú správnosť štruktúry. Zmeny konfigurácie môžu tiež vzniknúť v iných fázach, ako napríklad v počiatočnom pripojení aminokyseliny k pevnou fáze.
Iné znečisťujúce látky vznikajú rôznymi mechanizmami. Neúplné spájanie môže viesť k vzniku delečných alebo skrátených sekvencií, zatiaľ čo reakcie spojené s aspartimidom môžu modifikovať peptid obsahujúci už správne aminokyselinové pozostávky. Zrýchlenie procesu môže mať vplyv na požadované reakcie aj na vedľajšie cesty a ďalšie znečisťujúce látky môžu vzniknúť aj počas neskorších fáz, ako je odštiepenie.
Z týchto dôvodov posúdenie spojenia peptidov vyžaduje viac ako len zistenie, či vstupný materiál zmizol.
Konverzia, vznik cieľového produktu, izolovaná výkonnosť, chromatografická čistota a stereochemická čistota odpovedajú na rôzne otázky.
Testy vykonávané počas syntézy môžu pomôcť pri odhaľovaní neúplných reakcií, ale samy o sebe neposkytujú potvrdenie úplnej štruktúry peptidu. Chromatografia a hmotnostná spektrometría poskytujú vzájomne sa dopĺňajúce informácie, zatiaľ čo otázky týkajúce sa stereochemie alebo veľmi podobných štruktúr môžu vyžadovať ďalšie analytické metódy.
Najvhodnejší prístup k spájaniu peptidov je teda zameraný na konkrétnu molekulu a založený na údajoch.
Použiteľná metóda spájania nie je jednoducho metódou, ktorá využíva najznámejší alebo najaktívnejší činidlo. Je to metóda, ktorá opakovaným spôsobom vedie k vytvoreniu zamýšľaného molekulárneho spojenia pri súčasnom zachovaní vhodnej stereochemickej integrity a kontrole relevantných znečisťujúcich látok pre konkrétny syntetizovaný peptid.
Odkazy
- Subirós-Funosas, R., Prohens, R., Barbas, R., El-Faham, A., & Albericio, F. (2009). Oxyma: Efektívny pomocný produkt pre syntézu peptidov, ktorý nahrádza HOBt a HOAt na báze benzotriazolu a prináša nižšie riziko výbuchu. Chémia—European Journal, 15(37), 9394–9403. https://doi.org/10.1002/chem.200900614
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Štúdie racemizácie v syntéze peptidov pomocou separácie chránených epimérických peptidov pomocou reverznej fázy vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie. Medzinárodný časopis pre peptidové a proteínové výskumy, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Hodnotenie kombinovaného použitia Oxymy a HATU pri agregácii peptidových sekvencií. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Jad, Y. E., Khattab, S. N., de la Torre, B. G., Govender, T., Kruger, H. G., El-Faham, A., & Albericio, F. (2014). Oxyma-B, vynikajúci inhibítor racemizácie pri syntéze peptidov. Organická a biomolekulárna chémia, 12(42), 8379–8385. https://doi.org/10.1039/c4ob01612b
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Syntéza peptidov v pevných fázach: Od štandardných postupov po syntézu zložitých sekvencií. Príručka Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Problém aspartimidu v SPPS založenom na Fmoc. Časť I. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Problém aspartimidu v SPPS založenom na Fmoc. Časť II. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Použitie Marfeyho činidla na kvantifikáciu racemizácie pri uchytení aminokyselín na pevných podkladoch pre syntézu peptidov. Analytická biochemia, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Limitácia racemizácie a tvorby aspartimidu pri mikrovlnnej syntéze peletových peptidov s Fmoc. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-benzendimetanethiol (1,4-BDMT) ako čistiaci prostriedok proti rozštiepeniu zelenších peptidových živíc. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., & Pallai, P. (1991). Charakterizácia surových produktov z peletovej syntézy peptidov pomocou hmotnostnej spektrometrógie s mu-HPLC/rýchlym atómovým bombardovaním. Peptidová výskumná skupina, 4(1), 40–46. PubMed