Syntéza peptidov v pevných fázach, najčastejšie označovaná skratkou SPPS (solid-phase peptide synthesis), je chemická metóda budovania peptidov z aminokyseliny na aminokyselinu, pričom jeden koniec vznikajúceho reťazca zostáva chemicky viazaný na nerozpustný nosič.
Namiesto izolácie vznikajúceho peptidu po každej reakcii chemici ponechávajú ho priložený k pevnou fáze, pričom vkladajú a odstraňujú ďalšie kvapalné činidlá a rozpúšťadlá. Opakovateľné cykly umožňujú odhalenie reaktívnej aminovej skupiny, pripojenie ďalšieho aminokyselového prvku a odstránenie rozpúšťadiel, ktoré už nie sú potrebné. Po dokončení plánovanej aminokyselovej sekvencie môže byť peptid oddelený od nosiča a následne podrobený ďalšej úprave a analýze.
Taká organizácia procesu je jedným z hlavných dôvodov, prečo sa SPPS stala takou dôležitou metódou v chemii peptidov. Stála fáza zjednodušuje vykonávanie mnohých opakujúcich sa chemických operácií a umožnila automatizáciu syntézy.
Pohodlie syntézy v pevnom stave však neznamená záruku chemickej dokonalosti.
Pridanie vznikajúceho peptidu k nosiču nezaručuje, že každý reťazec dostane všetky plánované aminokyseliny. Rovnako nezaručuje ani to, že materiál uvoľnený na konci procesu bude chemicky čistý alebo bude mať správnu štruktúru.
Zostavovanie reťazca, odstraňovanie a opätovné získavanie produktu, čistenie, overovanie identity a konečná štrukturálna charakteristika sú samostatnými časťami celého procesu.
Moderné metodologické publikácie ukazujú jednak užitočnosť SPPS, ale aj potrebu úprav štandardných metód v prípade zložitých sekvencií. V jednej z publikovaných metód využívajúcej strategiu Fmoc je opísaná napríklad rutinná syntéza, ale aj upravený prístup k peptidovým sekvenciám citlivým na agregáciu. [1]
Rozumieť SPPS teda vyžaduje niečo viac ako len zapamätanie si ďalších chemických krokov. Musíte tiež vedieť, aký je cieľ každého kroku, čo sa môže počas neho stať nesprávne a aké analytické otázky treba naďalej zodpovedať po jeho dokončení.
Čo je syntéza peptidov v pevnom stave?
Vytvárajúci peptid zostáva spojený a roztoky sa menia
V konvenčnej SPPS je peptid chemicky pripojený k malým nerozpustným časticiam, ktoré sa obyčajne nazývajú zrnká živice, pomocou vhodného chemického spojiva.
Zŕnky zostávajú v reakčnom systéme, zatiaľ čo ďalšie kvapalné činidlá a prečerpanejšie roztoky sa dávajú do pôsobenia a odstraňujú.
To výrazne zjednodušuje opakovanú syntézu.
V klasickej etapovej syntéze je izolácia a čistenie rastúceho peptidu po každom pripojení aminokyseliny náročnou úlohou. V SPPS zostáva vznikajúci reťazec spojený s nerozpustnou fázou. Vďaka tomu sa rozpustné prebytočné činidlá a mnohé vedľajšie produkty dajú odstrániť odprašovaním, zatiaľ čo peptid spojený s živicou zostáva na mieste.
Výraz „stálá fáza” však môže viesť k neporozumeniu.
To neznamená, že tvorba peptidových väzieb prebieha bez účasti kvapaliny alebo rozpúšťadla.
Kopolymér je zvyčajne obklopený tekutým reakčným prostredím a jeho interakcia s rozpúšťadlom môže výrazne ovplyvniť priebeh syntézy. Reakčné činidlá musia stále prechádzať v polymérnom prostredí alebo okolo neho a dostať sa do reakčných oblastí rastúceho peptidu.
Pripojenie peptidu k nosiču má zvyčajne kovalentný charakter. To znamená, že vznikajúca molekula je spojená s nosičom pomocou spojiva chemickým väzbou.
Peptid teda nie je jednoducho uväznený medzi časticami, zadržaný v filtre alebo voľne usadený na povrchu.
Takýto chemický vzorec je záměrne navrhnutý tak, aby vznikajúci reťazec zostal viazaný počas ďalších reakcií a fáz prefiltrácie a aby bol neskôr v príslušných podmienkach uvoľnený.
Konvenčná syntéza prebieha od C-konca smerom k N-koncu
Klasická lineárna stratégia SPPS zvyčajne začína aminokyselinou, ktorá v hotovom peptide bude predstavovať jej koniec C.
Zvyšok sa pripojí k nosiču.
Po odkrytí príslušnej reaktívnej aminovej skupiny sa pridáva ďalší zabezpečený aminokyselín a chemicky sa pripája k vznikajúcemu reťazcu. Opakovanie tohto procesu postupne predlžuje peptid smerom k N-koncu.
Je vhodné zdôrazniť tento smer, pretože sa líši od biologickej syntézy bielkovín v rybosómoch.
Syntetická ribozómová syntéza predlžuje polypeptid od N-konca smerom k C-koncu. Konvenčná fázová SPPS zvyčajne vytvára sekvenciu v opačnom smere.
Koncová sekvencia aminokyselín môže byť však identická. Rozdiel je v spôsobe jej zostavenia.
Je dôležité definovať pojem „konvenčné”, pretože chemie peptidov sa tiež týka špecializovaných stratégií využívajúcich alternatívne miesto prepojenia, syntézu fragmentov, reakcie ligácie a ďalšie neštandardné riešenia.
Popis smeru od C- po N- koniec sa teda týka typického etapového procesu SPPS a nie všetkých možných metód peptidovej chemie využívajúcich stálu fázu.
SPPS je len jednou z prvkov tvorby peptidov
Syntéza v pevných fázach nie je jediným spôsobom získavania peptidov.
Peptidy môžu byť tiež získavané chemickou syntézou v roztoku, biologickými expresnými systémami, enzymatickými transformáciami, ligáciou fragmentov alebo kombináciou rôznych metód.
SPPS je obzvlášť užitočná v prípade potreby kontrolovanej syntézy sekvencií a využitia zabezpečených, modifikovaných alebo inak špecializovaných aminokyselinových stavebných blokov.
Ani v rámci jedného projektu týkajúceho sa konkrétneho peptidu nie je vždy potrebné používať tú istú metódu od začiatku až do konca.
Jednotlivé fragmenty peptidu môžu byť napríklad syntetizované na živici, oddelene očistené a následne spojené inou chemickou metódou. Iné molekuly môžu vyžadovať faldovanie, oxidáciu, cyklizáciu alebo ďalšie štrukturálne transformácie už po získaní počiatočnej lineárnej sekvencie.
Výber vhodnej cesty závisí teda od cieľovej molekuly, jej štrukturálnej zložitosti a analytických a kvalitatívnych požiadaviek projektu.
Proces je vhodné považovať za sériu ďalších otázok.
Pripojenie k nosiču určuje počiatočný bod a ovplyvňuje následnú chemickú reakciu uvoľňovania produktu. Napriek tomu však treba určiť, či pripojenie prebehlo správne a či bola zachovaná stereochemická integrita.
Zloženie reťazca má za cieľ spojiť aminokyseliny v plánovanom poradí. Potom je však potrebné overiť, či všetky reťazce reagovali správne a či nevznikli sekvencie s chýbajúcimi aminokyselinami, skrátenými alebo modifikovanými produktmi.
Odstraňovanie a likvidácia ochranných skupín má za cieľ uvoľniť peptid a odstrániť konkrétne chemické ochranné prvky. Samotné účinné uvoľnenie produktu však nehovorí o tom, aké ďalšie látky sa nachádzajú v surovom materiáli.
Čistenie slúži na oddelenie požadovaného materiálu od nežiaducich zložiek, ale aj vyčistená frakcia stále potrebuje potvrdenie identity a hodnotenie kvality.
Koncová štruktúrna a analytická charakteristika má však odpovedať na otázku, či izolovaný materiál má chemické vlastnosti očakávané pre cieľový peptid a či použité analytické metódy sú vhodné pre zamýšľané použitie.
Ide o koncepčné kroky, nie o laboratórnu príručku. Konkrétne činidlá, zariadenie a podmienky reakcie závisia od cieľového peptidu a vyžadujú vhodne vypracovanú a validovanú metódu.
Pripojenie k živici a skladanie reťazca
Živica, spojovací materiál a stupňosústruženia plnia rôzne funkcie
V diskusiách o SPPS sa často vyskytujú tri termíny: živica, spojovacie činidlo a stupeň naštartovania, teda loading.
Opisujú súvisiace, ale odlišné vlastnosti.
Živica je nerozpustný materiál, ktorý slúži ako nosič.
Spojovací činidlo poskytuje chemické spojenie medzi týmto nosičom a peptidom alebo prvou aminokyselinovou reťazcou. Jeho chemická vlastnosť môže ovplyvniť nielen spôsob pripojenia peptidu, ale aj jeho následné uvoľňovanie.
Loading opisuje však počet aktívnych pripojovacích miest vzhľadom na množstvo nosiča.
Tieto pojmy nie sú synonymami.
Dve živice môžu fyzicky vyzerať veľmi podobne, avšak mať odlišné funkčné skupiny, väzby alebo stupeň kondenzácie. Tieto rozdiely môžu ovplyvniť dostupnosť reaktívnych miest pri skladaní reťazca, tuhnutie živice a chemickú podobu konečného peptidu po odpojení.
Ďalšou dôležitou súčasťou je plánovaná skupina na C-konci.
Rôzne systémy nosič-reakcia môžu byť napríklad zvolené tak, aby sa získal peptid zakončený karboksylovou alebo amidovou skupinou.
Je to dôležitý chemický rozdiel.
Zmena terminálnej skupiny znamená zmenu samotnej molekuly, a nie len spôsob jej balenia alebo opisu.
Závislosť ovplyvňuje dostupnosť pripojených reťazcov
Veľa živíc používaných v SPPS pohlcuje rozpúšťadlo a po dotyku s príslušným kvapalinovým prostredím sa napučiava.
To mení polymérne prostredie a môže zvyšovať alebo znižovať priestor, ktorým sa musia rozpustené činidlá pohybovať, aby sa dostali k peptidovým reťazcom spojeným s živicou.
Zrážanie nie je teda len fyzickou zaujímavosťou.
Môže ovplyvňovať dostupnosť reaktívnych skupín počas syntézy.
Systematické skúmanie nosičov na báze polystyrénu a PEG ukázalo, že vlastnosti ako typ väziva a stupeň zahustenia živice významne ovplyvňovali tuhnutie v testovaných ekologickejších rozpúšťadlách. Takisto sa zistilo, že tuhnutie sa môže meniť počas odstraňovania ochranných skupín a pri predĺžení peptidového reťazca. [2]
To ukazuje, že správanie živice sa nemôže vždy považovať za jej stálu vlastnosť.
V praxi závisí od interakcie živice, rozpúšťadla, spojiva, priloženého peptidu a aktuálneho štádia syntézy.
Dobré zmäkčenie alebo priaznivý priebeh reakcie pre jednu kombináciu živice, rozpúšťadla a peptidu teda neznamená, že iná kombinácia bude reagovať identicky.
Samotný proces pripojenia si tiež vyžaduje kontrolu kvality.
Prvý krok pripojenia sa môže zdať jednoduchý, pretože peptidový reťazec sa ešte len začína vytvárať.
Nesprávnosť zistená v tomto štádiu však môže zostať prítomná počas celého následného syntetického procesu.
Ak sa prvá zložka pripojí nesprávne alebo sa počas tohto procesu zmení jej stereochemická konfigurácia, správne pripojenie všetkých ďalších zložiek nemusí opraviť pôvodný problém.
V roku 1992 bol vyvinut analytický postup určený špeciálne na meranie racemizácie, ku ktorej dochádza pri pripájaní zabezpečených aminokyselín k pevným nosičom. [3]
Význam tejto práce presahuje samotnú použitú analytickú metódu.
Ukazuje to, že stereochemická kvalita môže vyžadovať kontrolu ešte pred začatím opakujúcich sa cyklov predlžovania reťazca.
Aj množstvo materiálu, ktoré pôvodne bolo pripojené k nosiču, si vyžaduje správne interpretovanie.
Nominálny stupeň polymerizácie živice, meraný experimentálne, množstvo surového materiálu získaného po odpojení a konečná účinnosť izolovaného a očisteného peptidu sú rôznymi veličinami.
Nie je potrebné ich považovať za náhradné ukazovatele úspešnosti syntézy.
Dlhšie reťazce môžu byť čoraz ťažšie k dispozícii
S postupným predĺžením peptidového reťazca samotná priradená molekula začína ovplyvňovať svoj chemický prostredie.
Susedné reťazce môžu pôsobiť na seba prostredníctvom vodivých väzieb, hydrofóbnych interakcií a iných intermolekulárnych síl. Niektoré sekvencie môžu prejavovať obzvlášť silnú tendenciu k takýmto interakciám.
To môže obmedzovať prístup k reaktívnym skupinám.
V takom prípade môže byť pripojenie ďalšieho aminokyseliny ťažšie, aj keď do systému bol vložený zdanlivo dostatočný objem spojujúceho činidla.
V štúdii týkajúcej sa zložitých sekvencií citlivých na agregáciu sa porovnali rôzne metódy spájania a analyzovali získané surové produkty. Výsledky podporujú princíp, že proces by mal byť prispôsobený konkrétnej sekvencii namiesto toho, aby sa predpokladalo existenciu jednej stratégie spájania, ktorá je vždy najlepšia. [4]
To tiež vysvetľuje, prečo samotné zvýšenie stupňa zahusťovania živice alebo množstva činidla automaticky nevyrieši všetky problémy.
Ak je základným problémom obmedzený prístup k reaktívnym miestam, stáva sa dôležitejším otázkou, či sa fakticky dostal do príslušných miest a či reakcia prebehla účinne bez vzniku neprípustného množstva vedľajších produktov.
Zabezpečenie, odstránenie ochranných skupín a spájanie
Ochranné skupiny kontrolujú miesto výskytu reakcie
Aminokyseliny obsahujú chemické skupiny, ktoré sú schopné zúčastňovať sa na rôznych reakciách.
Pri kontrolovanom podávaní peptidu chcú chemici zvyčajne zabezpečiť, aby konkrétna aminová skupina reagovala s konkrétnym blokom obsahujúcim karboksylovú skupinu, zatiaľ čo ostatné potenciálne reaktívne miesta zostanú dočasne neaktívne.
Práve týmto účelom slúžia ochranné skupiny.
Dočasne blokujú vybrane aktivačné miesta, čím umožňujú inému miestu zúčastniť sa na plánovanej reakcii.
V všeobecne používanom strategickom SPPS založenom na Fmoc zostáva koncová aminová skupina rastúceho reťazca zabezpečená medzi ďalšími etapami prikladania. Keď sa má pridať ďalší aminokyselina, dočasná ochrana sa odstráni, čím sa odhaľuje aminová skupina.
Reaktivné bočné reťaze môžu mať samostatné ochranné skupiny navrhnuté tak, aby zostali nedotknuté počas opakujúcich sa cyklov vytvárania hlavného reťazca.
Cieľom je kontrolovaná selektívnosť.
Príslušný blok obsahujúci karboksylovú skupinu by sa mal zlúčiť s príslušnou aminovou skupinou, namiesto toho, aby viedol k nekontrolovanej rozvetvenosti alebo iným konkurenčným reakciám.
Ortogonalita znamená možnosť selektívneho odstraňovania zabezpečení
Ortogonálna stratégia ochranných skupín umožňuje odstrániť jednu ochrannú skupinu za podmienok, keď ostatné potrebné zabezpečenia zostávajú dostatočne nedotknuté.
To chemikovi poskytuje možnosť kontrolovaneho odhaľovania rôznych reaktívnych miest v jednotlivých fázach syntézy.
FMOC a Boc sú dobre známe pojmy v oblasti peptidovej chémie, ale neznamenajú rôzne druhy peptidových väzieb ani rôzne konečné štruktúry peptidov.
Ide o ochranné skupiny spojené s rôznymi stratégiami syntézy a rôznymi metódami ich odstránenia.
Dočasnú chemickú cestu používanú pri tvorbe peptidu je teda potrebné odlíšiť od jeho konečnej štruktúry.
Ochranné opatrenia tiež neposkytujú úplnú ochranu pred všetkými možnými vedľajšími účinkami.
Výskum vzniku aspartimidu napríklad ukazuje, že stratégia zabezpečenia, susedné aminokyselinové zbytky a podmienky odstraňovania ochranných skupín môžu mať vplyv na vznik znečisťujúcich látok aj v dobre známych metódach SPPS. [5] [6]
Stratégia ochranných skupín teda obmedzuje určité nežiaduce reakcie, ale neodstraňuje potrebu kontroly procesu ani konečnej analytickej charakteristiky.
Spojenie vytvára ďalšie amidové väzby štruktúry peptidu.
Reakcia spájania vedie k vytvoreniu ďalšieho amidového väzby v štruktúre peptidu.
Aminokyselinový blok obsahujúci karboksylovú skupinu je zvyčajne chemicky aktivovaný, aby mohol účinne reagovať s odkrytou aminovou skupinou rastúceho peptidu spojeného s živicou.
Po ukončení spájania sa rozpustný prebytok materiálu môže odstrániť prepláchnutím.
Nový pridružený aminokyselín sa potom stáva konečnou zložkou rastúceho reťazca. Potom je možné odkryť jeho aminokyselinovú skupinu a začať ďalší cyklus väzby.
Teoreticky opakované reprodukovanie tejto sekvencie umožňuje kontrolovať poradie aminokyselín prostredníctvom kontroly poradí, v akom sa uvádzajú stavebné bloky.
V praxi však existuje veľmi dôležité upozornenie:
Plánovaná chemická reakcia musí v každom cykle fungovať správne.
Ak je jedno spojenie neúplné, časť reťazcov nemusí dostať plánovanú časť.
Ak zostanú tieto proteíny pripojené k živici a správne reagujú v ďalšom cykle, môžu vzniknúť sekvencie delecie, t. j. molekuly peptidov bez jedného alebo niekoľkých plánovaných aminokyselin.
Iné reťazce môžu zostať skrátené.
Prefiltrácia odstraňuje rozpustné činidlá a vedľajšie produkty, ale selektívne eliminuje všetky nesprávne postavené reťazce, ktoré sú stále kovalentne viazané na nosič.
Malé straty sa môžu kumulovať v mnohých cykloch.
Opakovateľný charakter SPPS vedie k významnému matematickému problému.
Malá chyba v jednom kroku sa môže zdať bezvýznamná, ale po mnohých opakovaniach jej následky môžu kumulovať.
Zvážme jednoduchý matematický príklad.
Ak by syntéza peptidu vyžadovala 50 krokov spájania a každý z nich by sám o sebe mal 99 percentnú pravdepodobnosť správneho dokončenia, teoretický percentuálny podiel molekúl, ktoré úspešne prejdú všetkými 50 krokov, by bol približne 60,5%.
Je to len ilustrácia.
Predpokladá sa, že všetky fázy konajú identicky a nezávisle. Neberie do úvahy problémy s odstránením ochranných skupín, vedľajšie účinky, straty počas odpojenia a čistenia, agregáciu ani mnoho ďalších skutočných faktorov.
Nie je teda možné tento výsledok interpretovať ako predpovede skutočnej výkonnosti výroby.
Príklad poukazuje na to, prečo ani veľmi vysoká účinnosť jednotlivých krokov nepredstavuje chemicky jednoduchý produkt surového materiálu po niekoľko desiatok opakovaní.
Z tohto dôvodu je monitorovanie syntézy a kontrola znečisťovania dôležité počas celého procesu syntézy peptidu, a nie až po pridaní posledného aminokyseliny.
Automatizácia, vykurovanie a ďalšie technologické riešenia môžu urýchliť syntézu, ale rýchlosť procesu by sa vždy mala posudzovať spolu s kvalitou produktu.
Výskum SPPS podporovaného mikrovlnnou energiou analyzoval závislosť typu reaktantov od výsledku a vznik aspartimidu, čo ukázalo, prečo musia byť podmienky reakcie naďalej prispôsobené vlastnostiam konkrétnej sekvencie. [7]
Odstránenie a opätovné získanie surového produktu
Odstránenie izolácie uvoľňuje produkt z nosiča
Po dokončení plánovanej sekvencie peptidov sa zvyčajne chemicky oddelí od nosiča.
Tento krok sa označuje ako cleavage, čiže odpojenie.
Odstraňovanie prerušuje konštantne navrhnuté chemické spojenie medzi peptidom a nosičom.
V závislosti od použitej stratégie sa odstraňovanie môže uskutočniť súčasne s odstránením časti alebo všetkých skupín ochranných reťazcov bočných končatín. V iných procesoch môže byť peptid alebo jeho fragment uvoľnený s zachovaním určitých ochranných mechanizmov, ak sú plánované ďalšie chemické reakcie.
Vhodná chemická reakcia uvoľňovania závisí od spojovacieho činidla a cieľovej molekuly.
Podmienky, ktoré účinne uvoľňujú jeden peptid, môžu chemicky poškodiť chemicky citlivú skupinu v inom.
Preto opisuje odštiepenie chemický cieľ, a nie univerzálny súbor činidiel alebo podmienok vhodných pre všetky peptidy.
Podobne správne zostavenie štruktúry peptidu nepreukazuje, že všetky ochranné skupiny boli následne účinne odstránené.
Montáž reťazca a konečné odstránenie bezpečnostných prvkov zodpovedajú rôznym chemickým otázkam a vyžadujú samostatné posúdenie.
Podmienky odstraňovania môžu ovplyvňovať profil znečistenia
Odstraňovanie nie je nutne chemicky neutrálny proces.
Odstránenie ochranných skupín a odpojenie peptidu od nosiča môže viesť k vzniku reaktívnych chemických formácií schopných meniť vlastnosti peptidu alebo iných zložiek zmesi.
Preto môžu byť v vypracovaných metodikách použité takzvané scavengery, čo sú zlúčeniny zachytávajúce konkrétne nežiaduce reaktívne produkty a ovplyvňujúce vznik vedľajších produktov.
V roku 2019 sa v štúdii analyzovalo rôzne čistiace činidlá pri odstraňovaní exenatidu z peptidovej živice a zistilo sa, že ich výber ovplyvňoval kvalitu surového produktu a sledovaný profil znečisťovania. [8]
Na tomto základe by sa nemalo vytvárať univerzálna receptúra na odstraňovanie škodlivín.
Výskum však ukazuje, že podmienky tohto kroku môžu ovplyvňovať kvalitu produktu a preto by mali byť hodnotené pre konkrétny peptid a použitý systém ochranných skupín.
Správny proces odstraňovania je teda zameraný na niekoľko aspektov.
Peptid musí byť vhodne odpojený, požadované ochranné skupiny musia byť odstránené, cieľový materiál musí byť znovu získaný a nežiaduce chemické reakcie musia byť kontrolované.
Obnovenie surového produktu nie je konečným čistením
Po odštiepení sa vykonáva proces, ktorý umožňuje oddeliť materiál obsahujúci peptid od pevných živíc a zvyšných zložiek reakčnej zmesi.
Pri tom je možné využiť rozdiely v rozpustnosti, kvapnosti alebo iných chemických vlastnostiach.
Obnovenie viditeľného usadenia alebo frakcie obsahujúcej peptid však nepreukazuje, že materiál sa skladá výhradne z zamýšľaného produktu.
Na tejto úrovni sa zvyčajne hovorí o surovom peptide.
Môže obsahovať cieľovú molekulu spolu s deleciovými sekvenciami, skrátenými reťazcami, chemicky modifikovanými peptidy, nedokonale odpojenými štruktúrami, materiálmi pochádzajúcimi z činidiel a inými znečisťujúcimi látkami.
Význam jednotlivých znečisťujúcich látok závisí od sekvencie, podmienok syntézy a účelu použitia.
V jednom z výskumov sa chromatografický rozsah kombinoval so spektrometriou hmotnosti s cieľom charakterizovať surové produkty SPPS a priradiť jednotlivé chromatografické body konkrétnym peptidom. [9]
To poukazuje na to, prečo informácie získané pomocou separatívnych a štrukturálnych metód navzájom dopĺňajú.
Kromatografia môže preukázať prítomnosť mnohých zložiek, zatiaľ čo hmotnostná spektrometria môže poskytnúť ďalšie informácie, ktoré pomôžu určiť, čo môžu byť niektoré z nich.
Čistenie a potvrdenie identity odpovedajú na rôzne otázky
Čistenie má za cieľ zvýrazniť alebo izolovať cieľovú molekulu z ostatných zložiek.
Identifikácia zodpovedá otázke, či izolovaný materiál skutočne má očakávané chemické vlastnosti.
Tieto otázky sa čiastočne zhodujú, ale nie sú totožné.
Dobře rozdelený chromatografický pik nie je automaticky úplným dôkazom štruktúry častice.
Podobne samotné dosiahnutie očakávanej hmotnosti častíc sama o sebe nie je úplným hodnotením čistoty ani štruktúrnej správnosti.
Blízko príbuzné varianty sekvencií, stereoizoméry alebo chemicky modifikované formy môžu byť ťažko rozlíšiteľné alebo oddeliť.
Metóda čistenia by sa preto mala posudzovať vo vzťahu k skutočnej zmesi vytvorenej počas danej syntézy a nemala by sa považovať za postačujúcu len preto, že fungovala pri inom peptide.
Ak konečná zlúčenina tiež vyžaduje vytvorenie disiarčných mostov, cyklizáciu alebo inú transformáciu po dokončení syntézy reťazca, objavujú sa ďalšie analytické otázky týkajúce sa správnosti väzieb, štruktúrnej jednotnosti a toho, či sa skutočne získala zamýšľaná zrelá forma zlúčeniny.
Výhody, obmedzenia a zdroje znečisťovania
Prečo je SPPS tak široko používaná?
Jednou z najdôležitejších výhod SPPS je možnosť udržiavania vznikajúceho peptidu na nosiči počas opakovaného výmeny kvapalných činidiel.
To zjednodušuje opakované chemické operácie a umožňuje automatizáciu.
Chemici môžu implementovať plánovanú sekvenciu aminokyselinových stavebných blokov a ak to umožňuje chemická štruktúra procesu, aj niektoré neštandardné aminokyseliny a ďalšie modifikácie.
Moderné automatické systémy ukazujú, ako ďaleko sa dá tento koncept rozvinúť.
V štúdii z roku 2020 o automatizovanej syntéze plazmy sa opisuje získavanie bielkovinových reťazcov obsahujúcich až 164 aminokyselinových pozostávok. Po následnom čistení a fázovaní sa získali funkčné materiály. [10]
Je to pôsobivý príklad technických možností.
To však neznamená, že každú sekvenciu s dĺžkou 164 reťazcov – ani každý dlhý peptid alebo proteín – možno získať s rovnakou ľahkosťou.
To tiež neznamená, že čistenie a štrukturálna charakteristika sa stávajú zbytočnými.
Výskum skôr ukazuje, aké výsledky možno dosiahnuť pomocou starostlivo vypracovaného systému pre správne zvolené molekuly.
Automatizácia kontroluje vykonanie procesu.
Nie je však schopný zmeniť nevhodnú chemiu na vhodnú.
Preto je potrebné analyzovať výkonnosť zariadenia, sekvenciu peptidu a samotnú molekulu súčasne.
Ako vznikajú typické znečisťujúce látky?
Pri SPPS môže existovať niekoľko rôznych ciest, ktoré vedú k vzniku znečisťujúcich látok. Ich pochopenie pomáha objasniť, prečo sú konečné analytické testy stále potrebné.
Delečný reťazec alebo skrátený produkt môže vzniknúť vtedy, keď plánované pripojenie aminokyseliny neuskutoční alebo keď sa rast reťazca zastaví. Pretože nesprávny reťazec môže naďalej zostať pripojený k živici, neskoršie odstraňovanie ho nemusí odstrániť.
Epimerizácia znamená zmenu stereochemickej konfigurácie zodpovedajúceho centra. Toto má analytický význam, pretože epimer môže mať rovnakú nominálnu molekulovú hmotnosť ako vlastný peptid a zároveň sa líšiť svojou priestorovou konfiguráciou.
Produkty súvisiace s aspartimidom môžu vzniknúť v dôsledku vedľajších reakcií závislých od sekvencie, ktoré zahŕňajú zvyšky aspartámu. V závislosti od chemického priebehu môže vzniknúť viac ako jeden typ takýchto produktov.
Neúplné odstránenie ochranných skupín nastáva vtedy, keď skupina, ktorá by mala byť odstránená, zostáva viazaná na molekulu. Peptyd môže teda mať nominálnu očakávanú dĺžku reťazca, ale stále má nesprávnu chemickú štruktúru.
Modifikácie spojené s odštiepením sa môžu vyskytnúť počas konečného uvoľňovania peptidu alebo odstránenia ochranných skupín. Rovnako však správna štruktúra reťazca nezaručuje, že peptid prejde cez proces odštiepenia bez zmien.
Neúplné reakcie súvisiace s agregáciou sa však môžu vyskytnúť vtedy, keď vznikajúce reťazce pôsobia na seba takým spôsobom, že obmedzujú prístup k reaktívnym miestam. Vložením dostatočného množstva činidla do reaktívneho nádoby sa nezaručuje, že každé reaktívne miesto je fyzicky prístupné a podlieha príslušnej reakcii.
To sú možné spôsoby vzniku znečisťovania.
To neznamená, že každá strana získaná metódou SPPS musí obsahovať všetky uvedené typy nesprávností.
Ich význam v konkrétnej syntéze sa stanovuje na základe poznatkov o procese, analytických výskumov a vhodnej kontroly kvality.
Syntetizované prírodné peptidy vyžadujú niečo viac ako len reprodukciu sekvencie
Niektoré peptidy sú štruktúrne oveľa zložitejšie, ako by vyplývalo zo samotnej lineárnej sekvencie aminokyselín.
Dobrým príkladom je epidermina.
Štrukturálna charakteristika epidermíny ukázala prítomnosť mnohých kruhov obsahujúcich síru a neštandardných zvyškov. [11]
Samotné reprodukcia lineárnej reťazcovosti aminokyselin by teda nebolo dostatočným dôkazom o tom, že sa získala autentická zrelá epidermóna.
Toto rozlíšenie je dôležité pri interpretácii publikácií alebo vyhľadávaní týkajúcich sa syntézy epidermy v pevných fázach.
Publikácia môže popisovať lineárny prekurzor, fragment, analóg alebo inú príbuznú štruktúru, a nie overenú úplnú syntézu kompletného zrelého molekulu.
Publikácia Structural Publication citovaná tu ako [11] opisuje charakteristiku samotnej epidermis; nejde o správu o jej úplnej syntéze metódou SPPS.
Výskumy o úplnej syntéze musia byť teda hodnotené vo vzťahu k skutočnej cieľovej štruktúre molekuly a nie len jej lineárnej aminokyselinovej sekvencii.
Výkonnosť, čistota a identita sa musia uvádzať samostatne
Tri pojmy, ktoré sa často mylne zamieňajú v diskusiách o syntéze peptidov, sú výkonnosť, čistota a identita.
Veľká hmotnosť získaného produktu nemusí znamenať, že väčšina tejto látky predstavuje zamýšľaný peptid. Surový materiál môže obsahovať značné množstvo znečisťujúcich látok.
Rovnako vysoká čistota chromatografická automaticky nepotvrdzuje všetky aspekty štruktúrnej identity.
Aj peptid, ktorého chemická štruktúra bola presne charakterizovaná, týmto automaticky nezískava potvrdené biologické, terapeutické alebo klinické použitie.
Sú to samostatné otázky.
Spoľahlivý opis syntézy by mal teda uvádzať, aká bola cieľová molekula, v akom štádiu sa merala účinnosť a či analyzovaný materiál bol surový alebo čistený, a aké analytické údaje sa použili na potvrdenie tvrdení týkajúcich sa štruktúry.
Vďaka tomu je možné výsledky syntézy interpretovať a porovnávať presnejšie.
Jednotlivú percentuálnu hodnotu alebo hmotnostnú hodnotu nemožno premeniť na všeobecné tvrdenie, že peptid je „vysoko kvalitný”, bez toho, aby sa poznalo, čo sa skutočne meralo.
Často kladené otázky
1. Prečo v SPPS používa fázu konštantnej hodnoty?
Stála fáza udržiava vznikajúci peptid na nosiči, zatiaľ čo rozpustné činidlá, vedľajšie produkty reakcie a prečerpané roztoky môžu byť opakovane aplikované a odstránené. To výrazne zjednodušuje opakované skladanie reťazca a umožňuje automatizáciu syntézy peptidov, ako to dokazuje moderná metóda automatizovanej streamovej syntézy. [10] Nosič však nezaručuje, že každá reakcia prebehne ideálne, ani neoddeľuje nesprávne zostavený reťazec viazaný s živicou od správneho. Jeho hlavnou výhodou je zlepšenie riadenia procesu. Chemická selektivita, úplnosť reakcie, čistota a štruktúrna identita stále vyžadujú osobitné posúdenie.
2. Eliminuje syntéza v pevnom stave potrebu čistenia?
Nie. Neplatné peptidové reťazce môžu zostať pripojené k živici počas syntézy a následne byť uvoľnené spolu s plánovaným produktom. Výskumy analyzujúce surové produkty SPPS pomocou chromatografie a hmotnostnej spektrometrie ukazujú, že preplachovanie počas syntézy a konečné čistenie plnia rôzne funkcie. [9] Preplachovanie najmä odstraňuje rozpustné zložky obklopujúce živicu, zatiaľ čo čistenie po odstraňovaní separuje požadovaný peptid od nežiaducich peptidových a nepeptidových zložiek. SPPS zjednodušuje vedľajšie operácie, ale nezaručuje konečnú čistotu.
3. Znamená „stabilná fáza” to, že sa rozpúšťadlo nepoužíva?
Nie. V konvenčnej SPPS je nerozpustný nosič zvyčajne obklopený kvapalinovými činidlami a rozpúšťadlami. Rozpúšťadlá ovplyvňujú fyzikálne vlastnosti živice, okrem iného stupeň jej púčenia a ľahkosť, s akou môžu činidlá dosiahnuť spojené reťazce. Experimentálne štúdie preukázali rozptyl živice závislý od rozpúšťadla a zmeny spojené s chemikáliou zlúčenia, stupňom spájania a predĺžením reťazca. [2] Živica a rozpúšťadlo teda spolu vytvárajú reakčný prostredie.
4. V ktorom smere rastie peptid počas SPPS?
Konvenčná etapová SPPS zvyčajne vytvára peptid od jeho C-koncovej časti smerom k N-koncovému konci. Prvý aminokyselina, ktorá má tvoriť C-koncovú časť hotovej molekuly, je pripojená k nosiču, pričom ďalšie zvyšky predlžujú odkrytý koniec aminokyselinového reťazca. Publikované metódy založené na Fmoc zobrazujú tento typický vzor. [1] Existujú však špecializované stratégie využívajúce pevnú fázu, ktoré sa môžu vyvíjať inak.
5. Znamenajú živica a spojovací materiál to isté?
Nie. Hliníková živica je nerozpustným nosičom, zatiaľ čo spojovací mechanizmus predstavuje chemické spojenie medzi nosičom a rastúcim peptidom. Funkcionalita spojovacieho mechanizmu môže bez ohľadu na samotný polymér ovplyvňovať pripojenie, zachovanie živice a následné uvoľňovanie peptidu. Výskum nosičov používaných pri syntéze peptidov ukazuje, prečo samotné označenie typu živice nemusí stačiť na opis správania celého systému.[2]
6. Zvyšuje väčší stupeň zahusťovania živice vždy výrobu?
Nie. Vyšší loading znamená väčší počet potenciálnych miest pre pripojenie na danú množinu nosiča, ale nemusí viesť k získaniu väčšieho množstva správne konštruovaného a obnoviteľného peptidu. Úroveň zviazania môže meniť lokálne molekulárne prostredie a experimentálne bol identifikovaný ako jeden z faktorov ovplyvňujúcich zmäkčenie živice. [2] Ak sú prepojené reťazce príliš zúžené alebo silne navzájom interagujúce, dostupnosť reaktívnych miest môže byť zhoršená. Loading sa preto musí analyzovať spolu s vlastnosťami živice, zachovaním sekvencie, účinnosťou reakcie a kvalitou konečného produktu.
7. Prečo sa aminokyseliny chránia počas syntézy peptidu?
Ochranné skupiny dočasne znemožňujú vybraným aktívnym skupinám účasť na reakciách, zatiaľ čo sa vytvára konkrétny väzobný reťazec. To umožňuje kontrolované, postupné skladanie reťazca. Zároveň však ochrana eliminuje všetky vedľajšie reakcie. Výskumy na modelových systémoch však ukázali, že stratégia ochranných skupín a obklopujúci sekvencia môžu mať vplyv na vznik aspartimidu. [5] Ochranné skupiny teda zabezpečujú chemickú selektivitu, ale celá stratégia zabezpečenia a odpojenia stále vyžaduje starostlivé plánovanie a hodnotenie.
8. Čo znamená ortogonálna ochrana funkčných skupín?
Ortogonalita znamená možnosť odstrániť jednu ochrannú skupinu za podmienok, ktoré ponechajú ostatné potrebné zabezpečenia dostatočne nedotknuté. To umožňuje odkryť konkrétne reaktívne miesta v plánovaných fázach syntézy. Upevnené metódy SPPS sú založené na kontrolovanom zabezpečovaní a odstraňovaní ochranných skupín namiesto simultánneho odkryvania všetkých reaktívnych skupín. [1] Skutočná zhoda použitých zabezpečení však stále závisí od cieľovej molekuly a reakčných podmienok.
9. Znamenajú Fmoc a Boc rôzne typy peptidov?
Nie. Fmoc a Boc sú ochranné skupiny a súvisia s nimi syntetické stratégie, nie rôzne typy peptidového skeletu. Rozdiely v chemickom spôsobe ich eliminácie ovplyvňujú spôsob syntézy, ale dočasnú ochrannú chemiu nemožno zamieňať s konečnou štruktúrou cieľového peptidu. Publikované metódy založené na Fmoc ukazujú jeden z bežne používaných variantov SPPS, ale to neznamená, že každý peptid musí byť získaný touto metódou. [1]
10. Môže už prvý krok pripojenia spôsobiť znečistenie?
Áno. Fáza pripojenia môže ovplyvniť stereochemickú kvalitu ešte pred začatím opakovaného predlžovania reťazca. Vyvinuli sa analytické metódy určené špeciálne na označenie racemizácie počas pripojenia zabezpečených aminokyselin k živiciam. [3] To neznamená, že každé pripojenie spôsobuje významnú racemizáciu. Skôr poukazuje na to, že samotné pripojenie je chemicky významným krokom, počas ktorého môžu vzniknúť merateľné zmeny, ktoré je potrebné zohľadniť pri celkovej hodnotiacej analýze kvality.
11. Prečo sú niektoré peptidové sekvencie označované ako zložité?
Niektoré rastúce peptidové reťazce pôsobia na seba alebo na susedné reťazce tak, že obmedzujú prístup k reaktívnym miestam. Voda, hydrofóbne interakcie a agregujúce sa vlastnosti môžu sťažovať následné spájanie. Výskum sekvencií citlivých na agregáciu ukazuje, že zmena spôsobu spájania môže ovplyvniť zloženie konečného produktu. [4] Ťažkosť syntézy teda závisí od vlastností molekuly a reakčných podmienok, a nie len od dĺžky peptidu.
12. Znamená rýchlejšia syntéza vždy lepší produkt?
Nie. Rýchlosť syntézy a kvalita produktu sú samostatnými parametrami. Ohrev, mikrovlnné podávanie a automatizácia môžu skrátiť čas procesu, ale urýchlenie reakcie môže tiež zmeniť rovnováhu medzi požadovanými a vedľajšími reakciami. Výskumy syntézy podporovanej mikrovlnou energiou ukázali závislosť od typu zbytkového reaktantu na racemizáciu a tvorbu aspartimidu, čo poukazuje na potrebu vhodnej kontroly podmienok. [7] Krátší čas syntézy je výhodný len vtedy, keď získaný materiál spĺňa aj požadované chemické a analytické kritériá.
13. Značí odstraňovanie lepidla jednoducho odstránenie zŕn lepidla?
Nie. Odstraňovanie je chemický proces vedúci k roztrhnutiu navrhnutého spojenia medzi peptidom a nosičom. Odstránenie granúl živice pomocou filtrácie je však fyzikálnou operáciou a samo o sebe nepotvrdzuje správny priebeh odstraňovania chemikálií. Uvoľňovanie peptidu môže dochádzať súčasne s odstraňovaním ochranných skupín a inými reakciami. Výskum odstraňovačov používaných počas odstraňovania ukazuje, že tento krok môže mať vplyv na znečisťovacie profil. [8]
14. Znamená vysoká účinnosť surového produktu vysokú čistotu peptidu?
Nie. Účinnosť tvrdého materiálu opisuje množstvo materiálu získaného pred odstránením všetkých nežiaducich zložiek. Tento materiál môže obsahovať cieľový peptid spolu s deleciovými sekvenciami, modifikovanými štruktúrami, ostatnými ochrannými skupinami a inými znečisťujúcimi látkami. Výskumy tvrdých zmesí SPPS pomocou chromatografie a hmotnostnej spektrometrie ukazujú, prečo požadovaná hmotnosť, čistota a molekulárna identita musia byť interpretované osobitne. [9] Dôsledne uvedená účinnosť by preto mala naznačovať fázu, v ktorej bola hmotnosť nameraná, a to, či bol materiál už očistený.
15. Je možné pomocou SPPS získavať dlhé reťazce peptidov?
Áno. Starostlivo vypracované metódy SPPS môžu umožňovať získavanie veľmi dlhých reťazcov. V štúdiách automatizovanej syntézy prebiehajúcej vo vodnom režime sa získavali reťazce obsahujúce až 164 pozostávajúcich z aminokyselín, ktoré potom podliehali čisteniu a fázovaniu pred funkčnou analýzou. [10] To poukazuje na možnosti súčasnej syntézy peptidov, ale neznamená, že každú sekvenciu s podobnou dĺžkou možno získať s rovnakou účinnosťou. Dĺžka je len jedným z faktorov; význam majú tiež sekvenčne závislá agregácie, vedľajšie reakcie, požiadavky na fázovanie a obtiažnosť čistenia.
16. Znamená vytvorenie sekvencie epidermínu jej úplné syntézu?
Nie. Zrelá epidermída obsahuje atypické štrukturálne prvky, vrátane krúžkov obsahujúcich síru, ktoré presahujú samotnú lineárnu reťazec aminokyselín. To bolo preukázané štruktúrnymi testami. [11] Získanie lineárnej sekvencie, prekurzora alebo fragmentu však automaticky neznamená syntézu úplnej zrelé molekuly. Nárok na syntézu úplnej molekuly si vyžaduje analytické údaje potvrdzujúce replikáciu zamýšľaných väzieb a ďalších dôležitých štrukturálnych prvkov.
17. Potvrdzuje očakávaná hmotnosť častíc úplnú správnosť štruktúry?
Nie. Získanie očakávanej hmotnosti častíc predstavuje cenné informácie, ale samotná hmotnosť nepotvrdzuje všetky aspekty štruktúry peptidu a nevylučuje všetky relevantné znečisťujúce látky. Dve častice môžu mať rovnakú nominálnu hmotnosť a zároveň sa líšiť špeciálnou štruktúrou alebo špecifickým štruktúrnym systémom. Výskumy zahŕňajúce rozdelenie epiméryčných peptidov ukazujú, prečo môžu špecifické štruktúrne rozdiely vyžadovať analytické metódy schopné rozlišovať štruktúry, ktoré nemožno odlíšiť len na základe merania hmotnosti. [12] Konečnú charakteristiku je teda potrebné navrhnúť s ohľadom na reálne znečisťujúce látky a alternatívne štruktúry, ktoré môžu vzniknúť počas konkrétnej syntézy.
Zhrnutie
Syntéza peptidov v pevnom stave zmenila chemickú štruktúru peptidov a umožnila udržiavanie rastúceho reťazca na nerozpustnom nosiči počas opakovaného vstupu, vykonávania reakcií a odstraňovania rozpustných činidiel. To uľahčuje postupný zostavovanie sekvencií a predstavuje praktickú základňu pre automatickú syntézu.
Pozorná jednoduchosť tejto metódy by však nemala skrývať chemickú štruktúru prebiehajúcu v každom jej kroku.
Živica, spojovací činidlo a stupeň kondenzácie ovplyvňujú významné vlastnosti syntetického prostredia. Rozpustnosť závisí od rozpúšťadla a napätie pôsobí na dostupnosť reťazcov spojených s živicou. Ochranné skupiny kontrolujú, ktoré funkčné skupiny môžu reagovať, zatiaľ čo spájacie reakcie vytvárajú štruktúru peptidu z jednej reťazce na druhú. [1] [2]
Každý z týchto krokov má tiež svoje obmedzenia.
Počiatočné pridruženie môže ovplyvniť stereochemickú kvalitu. [3] Zložité sekvencie môžu agregovať a obmedzovať dostupnosť činidiel. [4] Chemická stabilizácia a odstraňovanie ochranných skupín môže prispieť k vedľajším reakciám, ako je vznik aspartimidu. [5] [6] Zvláčňujúce a odstraňujúce chemikálie môžu prispieť k vedľajším reakciám, ako je vznik aspartimidu. [7] Podmienky odstraňovania môžu navyše ovplyvniť zloženie surového produktu. [8]
Preto správne zostavenie reťazca neznamená získanie čistého a správne identifikovaného peptidu.
Obnova surového produktu, čistenie a štrukturálna charakteristika zostávajú samostatnými etapami. Kromatografia môže poskytovať informácie o zložení zmesi a čistote, zatiaľ čo hmotnostná spektrometría a ďalšie analytické metódy poskytujú informácie o identite. Žiadny jednotlivý analytický výsledok nemusí potvrdiť všetky aspekty štruktúry peptidu. [9] [12]
Moderná automatizovaná toková syntéza ukazuje, že za vhodných podmienok môže SPPS byť použitá aj pri veľmi dlhých reťazcoch. [10] Zároveň štruktúrne zložené peptidy, ako je epidermín, ukazujú, prečo samotné replikácia lineárnej aminokyselinovej sekvencie môže byť nedostatočná, ak zrelá molekula obsahuje ďalšie kruhy, neštandardné zvyšky alebo konkrétny systém väzieb. [11]
Najlepšie chápať SPPS nie ako jedinú reakciu, ale ako sériu samostatných chemických a analytických štádií.
Spojenie určuje počiatočný bod. Opakovane sa opakujúce sa cykly zabezpečenia, odpojovania a spájania vytvárajú plánovaný reťazec. Odpojovanie uvoľňuje produkt. Čistenie oddelí cieľovú molekulu od nežiaducich zložiek. Konečná charakteristika následne umožňuje určiť, či izolovaný materiál skutočne má pridelenú štruktúru a kvalitu.
Rozdelenie týchto fáz umožňuje vyhnúť sa niekoľkým častým nepochopeniam: úspešná syntéza automaticky nepotvrdzuje čistotu, vysoká účinnosť automaticky nepotvrdzuje identitu a očakávaná molekulová hmotnosť sama o sebe nepreukazuje úplnej správnosti štruktúry.
Odkazy
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Syntéza peptidov v pevných fázach: Od štandardných postupov po syntézu zložitých sekvencií. Príručka Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Amadi-Kamalu, C., Clarke, H., McRobie, M., Mortimer, J., North, M., Ran, Y., Routledge, A., Sibbald, D., Tickias, M., Tse, K. a Willway, H. (2020). Investigácia parametrov ovplyvňujúcich nafukovanie živice v zelených rozpúšťadlách. ChemistryOpen, 9(4), 431–441. https://doi.org/10.1002/open.202000030
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Použitie Marfeyho činidla na kvantifikáciu racemizácie pri uchytení aminokyselín na pevných podkladoch pre syntézu peptidov. Analytická biochemia, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Hodnotenie kombinovaného použitia Oxymy a HATU pri agregácii peptidových sekvencií. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Problém aspartimidu v SPPS založenom na Fmoc. Časť I. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Problém aspartimidu v SPPS založenom na Fmoc. Časť II. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Limitácia racemizácie a tvorby aspartimidu pri mikrovlnnej syntéze peletových peptidov s Fmoc. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-benzendimetanethiol (1,4-BDMT) ako čistiaci prostriedok proti rozštiepeniu zelenších peptidových živíc. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., & Pallai, P. (1991). Charakterizácia surových produktov z peletovej syntézy peptidov pomocou hmotnostnej spektrometrógie s mu-HPLC/rýchlym atómovým bombardovaním. Peptidová výskumná skupina, 4(1), 40–46. PubMed
- Hartrampf, N., Saebi, A., Poskus, M., Gates, Z. P., Callahan, A. J., Cowfer, A. E., Hanna, S., Antilla, S., Schissel, C. K., Quartararo, A. J., Ye, X., Mijalis, A. J., Simon, M. D., Loas, A., Liu, S., Jessen, C., Nielsen, T. E. a Pentelute, B. L. (2020). Syntéza proteínov automatickou fúziou kvapalín. Veda, 368(6494), 980–987. https://doi.org/10.1126/science.abb2491
- Allgaier, H., Jung, G., Werner, R. G., Schneider, U. & Zähner, H. (1986). Epidermin: Sekvenovanie heterodetického tetracyklického 21-peptidového amidového antibiotika. European Journal of Biochemistry, 160(1), 9–22. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1986.tb09933.x
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Štúdie racemizácie v syntéze peptidov pomocou separácie chránených epimérických peptidov pomocou reverznej fázy vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie. Medzinárodný časopis pre peptidové a proteínové výskumy, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x