Sinteza peptidov v stalni fazi, najpogosteje po kratici SPPS (solid-phase peptide synthesis), je kemijska metoda gradnje peptidov aminokislin po aminokislini, medtem ko ostane en konec nastajajočega verige kemično vezan na neraztopljivo nosilno snov.
Namesto da izolirajo nastajajoči peptid po vsaki reakciji, kemiki ga pustijo pritrjenega na fazo stalnega stanja, medtem ko vnašajo in odstranjujejo nove tekoče reagente in prečiščevalne raztopine. Ponavljajoči se cikli omogočajo odkrivanje reaktivne aminokislinske skupine, pritrditev naslednjega aminokislinskega ostanka in odstranitev topnih sestavin, ki niso več potrebne. Po sestavljanju načrtovane aminokislinske sekvence se lahko peptid odstrani iz nosilca in nato podvrži nadaljnji obdelavi in analizi.
Ta organizacija procesa je eden glavnih razlogov, zakaj je SPPS postal tako pomembna metoda v kemiji peptidov. Faza stalnega stanja poenostavi izvajanje številnih ponavljajočih se kemijskih operacij in omogočila avtomatizacijo sinteze.
Udobje sinteze v stalni fazi pa ne pomeni kemične garancije odličnosti.
Priključitev nastajajočega peptida na nosilec ne zagotavlja, da bo vsak verige prejela vse načrtovane aminokisline. Prav tako ne pomeni, da bo material, ki se sprosti na koncu procesa, kemično čist ali bo imel pravilno strukturo.
Stavljanje v verigo, odstranjevanje in ponovno pridobivanje izdelka, čiščenje, preverjanje identitete in končna strukturna karakteristika so ločeni deli celotnega procesa.
Sodobne metodološke publikacije kažejo na uporabnost SPPS in potrebo po modifikaciji standardnih metod v primeru težkih sekvenc. V eni od objavljenih metod, ki uporabljajo strategijo Fmoc, je opisana na primer rutinska sinteza, pa tudi spremenjeno pristop k peptidnim sekvencam, občutljivim na agregacijo. [1]
Razumevanje SPPS torej zahteva nekaj več kot le zapomnitev nadaljnjih kemijskih korakov. Treba je tudi vedeti, kakšen je cilj vsakega koraka, kaj se lahko med njim zgodi narobe in katere analitične vprašanja je še treba odgovoriti po njegovem zaključku.
Kaj je sinteza peptidov v stalni fazi?
Nastajajoči peptid ostane vezan, medtem ko se raztopine spreminjajo.
V konvencionalni SPPS je peptid kemično vezan na majhne, neraztopne delce, ki jih običajno imenujemo žvečilni zrnci, z uporabo ustreznega kemičnega veziva.
Zrna ostanejo v reakcijskem sistemu, medtem ko se nadaljnja tekoča reagenti in prečiščeni raztopini dovajajo in odstranjujejo.
To močno poenostavlja ponavljajočo se sintezo.
V klasični, etapni sintezi v raztopini je izoliranje in čiščenje rastočega peptida po vsakem dodajanju aminokisline lahko težavno. V SPPS nastajajoči lančnik ostane vezan na netopni fazi. Zaradi tega se lahko raztopljivi presežki reagentov in številni stranski produkti odstranijo z filtracijo, medtem ko peptid, vezan na vezivo, ostane na mestu.
Izraz „stalna faza” pa lahko povzroči nesporazume.
To ne pomeni, da nastajanje peptidnih vezi poteka brez prisotnosti tekočine ali raztopila.
Svinčevina je običajno obdana s tekočim reakcijskim okoljem, njeno delovanje z topilom pa lahko znatno vpliva na potek sinteze. Reakcijski medij mora še vedno teči v polimernem okolju ali okoli njega in doseči aktivne dele rastočega peptida.
Spojenje peptida z nosilcem običajno poteka na kovalentni način. To pomeni, da nastala molekula ostane povezana z nosilcem prek veznika s kemijskim vezanjem.
Peptid torej ni le zaprt med delci, zadržan s filtrom ali prosto nameščen na površini.
To kemijsko spojitev je namerno zasnovano tako, da bi nastal lančnik ostal vezan med nadaljnjimi reakcijami in fazami prečiščevanja ter da bi bil pozneje lahko sproščen pod ustreznimi pogoji.
Konvencionalna sinteza poteka od C-konca proti N-koncu
Klasična linearna strategija SPPS običajno začne z aminokislino, ki bo v pripravljenem peptidu predstavljala njegov C-konc.
Preostanek se priključi na nosilec.
Ko se razkrije ustrezna reaktivna aminokislinska skupina, se doda še en zavarovan aminokislina in se kemično poveže z nastajajočim verigom. Ponavljanje tega procesa postopoma podaljša peptid proti N-koncu.
To smer je treba poudariti, saj se razlikuje od biološke sinteze beljakovin v ribosomih.
Sinteza ribozomalna podaljuje polipeptid od N-konca proti C-koncu. Konvencionalna faza SPPS običajno gradi sekvenco v nasprotni smeri.
Končna sekvenca aminokislin pa lahko ostane enaka. Razlikuje se le način, kako je sestavljena.
Pomembno je tukaj beseda „konvencionalna”, saj kemija peptidov vključuje tudi specializirane strategije, ki uporabljajo alternativne točke vezave, sestavljanje fragmentov, reakcije ligacije in druge nestandardne rešitve.
Opis poteka od C- do N-konca se torej nanaša na tipičen postopek SPPS in ne na vse možne metode peptidne kemije, ki uporabljajo stalno fazo.
SPPS je le eden od elementov pri proizvodnji peptidov
Sinteza v stalni fazi ni edini način za pridobivanje peptidov.
Peptidi lahko pridobimo tudi s kemično sintezo v raztopini, biološkimi ekspresijskimi sistemi, encimske preobrazbe, ligacijo fragmentov ali kombinacijo različnih metod.
SPPS je še posebej koristna, kadar je potrebno nadzorovano sestavljanje sekvenc ter uporaba zaščitenih, spremenjenih ali na drug način specializiranih aminokislinskih gradnikov.
Tudi v okviru enega samega projekta, ki se nanaša na določen peptid, ni vedno treba uporabljati iste metode od začetka do konca.
Določene dele peptida lahko na primer sintetiziramo na polimeru, ločeno očistimo in nato z drugimi kemičnimi metodami združimo. Druge molekule lahko zahtevajo faldiranje, oksidacijo, cikloizacijo ali dodatne strukturne preobrazbe že po pridobitvi začetne linearne sekvence.
Izbira ustrezne poti je torej odvisna od ciljne molekule, njene strukturne kompleksnosti ter analitičnih in kakovostnih zahtev projekta.
Postopek je vredno obravnavati kot niz nadaljnjih vprašanj.
Priključitev na nosilec določa začetni točki in vpliva na poznejšo kemijo sproščanja izdelka. Vendar pa je še treba ugotoviti, ali je priključitev potekla pravilno in ali je bila ohranjena stereokemijska integriteta.
Postopek sestavljanja verige naj bi omogočil vezavo aminokislin v načrtovani vrstni redu. Potem pa je treba preveriti, ali so se vsi verigi odzvali pravilno in ali ni nastala sekvenca brez potrebnih aminokislin, produktov, ki so bili skrajšani ali spremenjeni.
Odstranjevanje in odstranjevanje zaščitnih skupin naj bi sprostilo peptid in odstranilo določena kemična zavarovanja. Vendar pa samo učinkovito odstranjevanje izdelka ne pove, katere druge snovi se nahajajo v surovi snovi.
Prečiščevanje služi za ločevanje želenega materiala od neželenih sestavin, vendar tudi čiščen zrak še vedno zahteva preverjanje identitete in oceno kakovosti.
Končna strukturna in analitična karakterizacija pa naj bi odgovorila na vprašanje, ali ima izoliran material kemijske lastnosti, ki jih pričakujemo za ciljni peptid, in ali so uporabljene analitske metode primerne za predvideno uporabo.
To so koncepcijski koraki in ne laboratorijska navodila. Konkretni reagenti, oprema in pogoji reakcije so odvisni od ciljnega peptida in zahtevajo ustrezno razvito in validirano metodo.
Priključitev na žico in sestavljanje verige
Guma, vezivo in stopnja vezave imajo različne funkcije
V razpravah o SPPS se pogosto pojavljajo tri termina: žveplo, vezivo in stopnja polnjenja, tj. loading.
Opisujejo povezane, vendar različne lastnosti.
Živa je neraztopen material, ki služi kot nosilec.
Spojnik zagotavlja kemijsko povezavo med tem nosilcem in peptidom ali prvo aminokislinsko verigo. Njegova kemija lahko vpliva tako na način, kako se peptid veže, kot tudi na njegovo poznejše sproščanje.
Nakladanje pa opisuje število reaktivnih priključnih mest glede na količino nosilca.
Ti pojmi nista sinonimi.
Dve smole lahko fizično zelo podobno izgledajo, hkrati pa imajo različne funkcionalne skupine, veznike ali stopnjo vezave. Te razlike lahko vplivajo na razpoložljivost reaktivnih mest med sestavljanjem verige, raztezanje smole in kemijsko obliko končnega peptida po odcepitvi.
Drugi pomemben element je načrtovana skupina na C-koncu.
Različne sisteme nosilca-veznika je mogoče izbrati na primer tako, da dobimo peptid, ki se konča s karboksilno ali amidno skupino.
To je pomembna kemijska razlika.
Premik v terminalni skupini pomeni spremembo samega molekularnega elementa in ne le načina njegovega pakiranja ali opisovanja.
Pretiljenje vpliva na dostop do povezanih verig
Večina topil, ki se uporabljajo v SPPS, absorbira topilo in se razplavi ob stiku z ustrezno tekočo snovjo.
To spreminja polimerno okolje in lahko poveča ali zmanjša prostor, skozi katerega morajo raztopljeni reagenti potovati, da bi dosegli verige peptidov, vezanih na vezivo.
Razkrivanje ni torej zgolj fizična zanimivost.
Lahko vpliva na razpoložljivost reaktivnih skupin med sintezo.
Sistemsko raziskovanje nosilcev na osnovi polistirena in PEG je pokazalo, da takšne lastnosti, kot so vrsta veziva in stopnja vezave smole, pomembno vplivajo na raztezanje v raztopilih, ki so bili ocenjeni kot bolj okolju prijazni. Poleg tega je bilo ugotovljeno, da se raztezanje lahko spreminja med odstranjevanjem zaščitnih skupin in z zvišanjem dolžine peptidnega verige. [2]
To kaže, da vedenje žveplove kisline ni vedno mogoče obravnavati kot njeno stalno lastnost.
V praksi je odvisno od sodelovanja žvepla, topila, veziva, priloženega peptida in trenutnega stadija sinteze.
Dobro razmerje ali ugoden potek reakcije za eno kombinacijo smole, topila in peptida torej ne pomenita, da bo druga kombinacija delovala enako.
Sam proces priključitve zahteva tudi nadzor kakovosti
Prvi korak priključitve se morda zdi preprost, saj peptidni lančnik šele začne nastajati.
Napaka, ki se je v tem koraku pojavila, pa lahko ostane prisotna tudi med celotno kasnejšo sintezo.
Če se prvi del ostatkov priključi nepravilno ali se med tem procesom spremeni njena stereokemijska konfiguracija, pravilno dodajanje vseh naslednjih ostatkov ne potrebuje popraviti prvotnega problema.
V raziskavi iz leta 1992 je bila razvita analitska metoda, namenjena posebej za merjenje racemizacije, ki se dogaja med vezavo zavarovanih aminokislin na stalne nosilce. [3]
Pomembnost te naloge presega samo uporabljeno analitično metodo.
To kaže, da lahko kakovost stereochemičnega procesa zahteva nadzor še pred začetkom ponavljajočih se ciklov podaljševanja verige.
Tudi količina materiala, ki je prvotno priložen nosilcu, zahteva ustrezno interpretacijo.
Nominacijski odstotek vezave na vezivo, merjen z eksperimentalnim načinom, količina surovega materiala, pridobljene po odstranitvi vezave, in končna zmogljivost izoliranega in očistega peptida so različne veličine.
Ne smemo jih obravnavati kot nadomestne kazalnike uspeha sinteze.
Dolgčasje verige lahko postanejo težje dostopne
Zaradi podaljšanja peptidnega verige sama povezana molekula začne vplivati na svoje kemične okolje.
Sosednji verigi se lahko medsebojno vplivata z vodikovimi vezmi, hidrofilnimi učinki in drugimi medmolekulskimi silami. Nekatere sekvence lahko kažejo še posebej močno težnjo k takšnim učinkom.
To lahko omeji dostop do aktivnih skupin.
V takem primeru lahko pridobitev dodatnega aminokislina postane težja, tudi če je v sistem vnesen zgolj zgolj zadostna količina spojnega sredstva.
V raziskavi o težkih, agregacijsko občutljivih sekvencah so primerjali različne metode povezovanja in analizirali pridobljene surove izdelke. Rezultati podpirajo načelo, da je proces treba prilagoditi specifični sekvenci, namesto da bi predpostavljali obstoj ene strategije povezovanja, ki je vedno najboljša. [4]
To tudi pojasnjuje, zakaj samo povečanje stopnje vezave živice ali količine reaktivnega sredstva sam po sebi ne reši vseh težav.
Če je osnovna težava omejen dostop do reaktivnih mest, postane pomembnejše od vprašanja o količini dodanega reaktivnega sredstva vprašanje, ali je dejansko prispeval do ustreznih mest in ali je reakcija potekala učinkovito brez nastajanja nesprejemljivega števila stranskih produktov.
Zaščita, odstranjevanje zaščitnih skupin in povezovanje
Ochronne skupine nadzirajo dogajanje reakcije
Aminokisline vsebujejo kemijske skupine, ki so sposobne sodelovati v različnih reakcijah.
Med nadzorovanim dajanjem peptida kemiki običajno želijo, da določena aminokislinska skupina reagira s določenim blokom, ki vsebuje karboksilno skupino, medtem ko ostanejo drugi potencialno reaktivni mesti začasno neaktivni.
To je pravzaprav tisto, za kar služijo zaščitni skupini.
Začasno blokirajo izbrane aktivne mesta, kar drugim mestom omogoča sodelovanje v načrtovani reakciji.
V splošno sprejeti strategiji SPPS, ki temelji na Fmoc, končna aminokislinska skupina rastočega verige ostane zavarjena med naslednjimi fazami vezave. Ko naj bi bil dodan naslednji aminokislina, se začasna zaščita odstrani, pri čemer se razkrije aminokislinska skupina.
Reaktivne stranske verige lahko imajo svoje posebne zaščitne skupine, zasnovane tako, da ostanejo nepoškodovane med ponavljajočimi se cikli gradnje glavne verige.
Cilj je nadzorovana selektivnost.
Ustrezen kovalentni blok, ki vsebuje karboksilno skupino, bi se moral povezati z ustreznim aminokislinskim skupino, namesto da bi povzročal nenadzorovano razcepljanje ali druge konkurenčne reakcije.
Ortogonalnost pomeni možnost selektivnega odstranjevanja varnostnih elementov
Ortogonalna strategija zaščitnih skupin omogoča odstranitev ene zaščitne skupine v okoliščinah, v katerih ostanejo druge potrebne zaščitne ukrepe dovolj nedotaknjene.
To kemiku omogoča nadzorovano odkrivanje različnih reaktivnih mest na posameznih stopnjah sinteze.
Fmoc in Boc sta dobro znana imena v kemiji peptidov, vendar ne označujeta različnih vrst peptidnih vezi ali različnih končnih struktur peptidov.
Gre za zaščitne skupine, povezane z različnimi strategijami sinteze in različnimi metodami njihovega odstranjevanja.
Začasno kemijsko obliko, ki se uporablja med gradnjo peptida, je torej treba ločiti od njegove končne strukture.
Zaščitni ukrepi prav tako ne zagotavljajo popolne zaščite pred vsemi možnimi neželenimi učinki.
Raziskave o nastanku aspartimida na primer kažejo, da lahko strategija zavarovanja, sosednje aminokislinske ostanke in pogoji odstranjevanja zaščitnih skupin vplivajo na nastanek onesnaženja tudi v dobro poznanih metodah SPPS. [5] [6]
Strategija zaščitnih skupin torej omejuje določene neželene reakcije, vendar ne odpravlja potrebe po nadzoru procesa ali končni analitični karakterizaciji.
Spojenje tvori še en amidni vez v strukturi peptida.
Reakcija vezave vodi do nastanka novega amidnega vezavega modula v skalu peptida.
Aminokislinski blok, ki vsebuje karboksilno skupino, je običajno kemično aktiviran, da lahko učinkovito reagira z razkrito aminno skupino rastočega peptida, vezanega na vezivo.
Po zaključku spajanja se raztopljeni presežek materiala lahko odstrani z prečiščevanjem.
Novo pridružen aminokislina postane končna sestavina rastočega verige. Nato lahko razkrijemo njeno aminokislinsko skupino in začnemo naslednji ciklus vezave.
Teoretično ponavljanje te sekvence omogoča nadzor vrstnosti aminokislin z nadzorovanjem vrstnosti vnosa gradbenih blokov.
V praksi pa obstaja zelo pomembno poudarjanje:
Načrtovana kemična reakcija mora dejansko potekati pravilno v vsakem ciklu.
Če je ena povezava nepopolna, lahko del verige ne prejme načrtovanega dela.
Če ostanejo vezane na vezivo in se pravilno odzovejo v naslednjem ciklusu, lahko nastanejo delecijske sekvence, tj. molekule peptida brez enega ali več načrtovanih aminokislin.
Drugi verižniki lahko ostanejo skrajšani.
Prefiltracija odstranjuje topne reagente in stranske proizvode, vendar ne odpravlja selektivno vseh nepravilno sestavljenih verig, ki so še vedno kovalenčno vezane na nosilec.
Majhne izgube se lahko kumulirajo v več ciklih.
Ponavljajoč se značaj SPPS vodi do pomembnega matematičnega problema.
Majhna nedoslednost v posameznem koraku se morda zdi nepomembna, vendar lahko njeni učinki po več ponovljenih poskusih kumulirajo.
Razmislimo o preprostem matematičnem primeru.
Če bi sinteza peptida zahtevala 50 faz povezovanja in bi vsaka od njih imela neodvisno 99% -odstotno verjetnost za uspešen zaključek, bi teoretični odstotek molekul, ki bi uspešno prešle vse 50 faz, znašal približno 60,5%.
To je le ilustracija.
Predpostavlja, da vsa stopnja delujejo enako in neodvisno. Ne upošteva težav z odstranjevanjem zaščitnih skupin, stranskih učinkov, izgub med odcepljenjem in čiščenjem, agregacije ali drugih dejanskih dejavnikov.
Zato tega rezultata ni mogoče razlagati kot napoved dejanske proizvodne zmogljivosti.
Primer kaže le, zakaj celo zelo visoka učinkovitost posameznih faz ne zagotavlja kemijsko preprostega surovega proizvoda po več desetih ponovljenjih.
Zato je spremljanje sinteze in nadzor onesnaženja pomembno v celotnem procesu tvorbe peptida in ne šele po dodajanju zadnjega aminokislina.
Avtomatizacija, ogrevanje in druge tehnološke rešitve lahko pospešijo sintezo, vendar se hitrost procesa vedno mora ocenjevati skupaj s kakovostjo izdelka.
Raziskava o mikrovibracijsko podprti SPPS je analizirala odvisnost vrste preostanka od razmerja in nastanek aspartimida, kar kaže, zakaj pogoji reakcije še vedno morajo biti prilagojeni lastnostim določene sekvence. [7]
Odcepitev in pridobivanje surovega proizvoda
Odcepitev osvobaja izdelek s nosilca
Po sestavljanju načrtovane sekvence peptida ga je običajno treba kemično ločiti od nosilca.
Ta stopnja se imenuje cleavage, kar pomeni razbijanje vezi.
Odcepitev prekine namenoma zasnovano kemijsko vez med peptidom in nosilcem.
Odvisno od uporabljene strategije se odstranjevanje lahko izvaja hkrati z odstranjevanjem delov ali celotnih skupin zaščitnih verig obročev. V drugih procesih se lahko peptid ali njegov del sprosti ob ohranjanju nekaterih zaščitnih mehanizmov, če so predvideni nadaljnji kemični preobrati.
Ustrezna kemija sproščanja je odvisna od veziva in ciljne molekule.
Pogoji, ki učinkovito sprostijo en peptid, lahko kemično poškodujejo kemijsko občutljivo skupino v drugem.
Zato razgradnja opisuje kemijski cilj in ne en univerzalni nabor reagentov ali pogojev, ki so primerni za vse peptide.
Enako pravilna struktura sklede peptida ne dokazuje, da so bile vse zaščitne skupine nato učinkovito odstranjene.
Postavitev verige in končno odstranjevanje zavarovalnih sredstev odgovarjata na različna kemijska vprašanja in zahtevajo posebno oceno.
Pogoji razkuževanja lahko vplivajo na profil onesnaženosti
Odcepitev ne sme biti kemično nevtralen proces.
Odstranjevanje zaščitnih skupin in razbijanje vezave peptida na nosilcu lahko povzroči nastanek reaktivnih kemičnih spojin, ki so sposobne spreminjati peptid ali druge sestavine mešanice.
Zato v razvitih metodah lahko uporabimo tako imenovane scavengere, tj. spojine, ki vežejo določene neželene reaktivne produkte in vplivajo na nastanek stranskih produktov.
V raziskavi iz leta 2019 so analizirali različne scavengere med odstranjevanjem eksenatida iz peptidne smole in pokazali, da njihov izbor vpliva na kakovost surovega izdelka ter na opazljiv profil onesnaženja. [8]
Na tej podlagi ni mogoče ustvariti univerzalnega recepta za razkuževanje.
Raziskava pa kaže, da lahko pogoji tega koraka vplivajo na kakovost izdelka in jih je zato treba ocenjevati za posamezen peptid ter za uporabljen sistem zaščitnih skupin.
Ustrezni proces odcepitev ima torej več dimenzij.
Peptid je treba ustrezno razdružiti, potrebne zaščitne skupine je treba odstraniti, ciljni material je treba obnoviti in neželene kemijske spremembe je treba nadzorovati.
Obnova surovega proizvoda ni ni na krovu čiščenja
Po odcepitvi se izvaja postopek, ki omogoča ločitev snovi, ki vsebuje peptid, od trdne živice ter ostalih delov mešanice reakcijske snovi.
Pri tem je mogoče izkoristiti razlike v topnosti, topnosti ali drugih kemijskih lastnostih.
Vendar pa ponovno viden sediment ali frakcija, ki vsebuje peptid, ne dokazuje, da se material sestoji izključno iz želenega proizvoda.
Na tej stopnji se običajno govori o surovem peptidu.
Lahko vsebuje ciljno molekulo skupaj z delecijskimi sekvencami, skrajšanimi verigami, kemijsko modificiranimi peptidi, nepokončno razčlenjenimi strukturami, snovmi, pridobljenimi iz reagentov in drugimi onesnaževali.
Pomembnost posameznih onesnaževal je odvisna od sekvence, pogojev sinteze in predvidenega uporabe.
V enem od raziskav sta se razdelitev s kromatografijo združila s masno spektrometrijo za karakterizacijo surovih izdelkov SPPS in določitev posameznih pik kromatografije za določene peptide. [9]
To kaže, zakaj informacije, pridobljene s separacijskimi in strukturnimi metodami, medsebojno dopolnjujeta.
Kromatografija lahko kaže prisotnost več sestavin, medtem ko lahko masna spektrometrija zagotovi dodatne informacije, ki pomagajo ugotoviti, kaj so lahko nekateri od njih.
Čiščenje in preverjanje identitete sta odgovor na različna vprašanja
Prečiščenje ima za cilj obogatitev ali izolacijo ciljne molekule izmed drugih sestavin.
Identifikacija pa odgovarja na vprašanje, ali ima izoliran material dejansko pričakovane kemijske lastnosti.
Te vprašanja so deloma enake, vendar niso enaka.
Dobro razdeljen pik kromatografski ni samodejno popoln dokaz o strukturi molekule.
Enako, pridobitev pričakovane masne mase sama po sebi ni popolna ocena čistosti ali strukturne pravilnosti.
Vrste sekvence, stereoizomere ali kemijsko modificirane oblike, ki so skoraj sorodne, so lahko težko razločiti ali ločiti.
Metoda čiščenja bi se morala torej ocenjevati glede na dejansko mešanico, nastalo med določeno sintezo, in ne veljati za zadostno le zato, ker je delovala pri drugem peptidu.
Če končna molekula zahteva tudi tvorbo disiarčnih mostičkov, cikloizomerizacijo ali drugo preobrazbo po končanem sestavljanju verige, se pojavijo dodatna analitična vprašanja glede pravilnosti povezav, homogenosti strukture ter glede tega, ali je dejansko dobila željeno zrelo obliko molekule.
Prednosti, omejitve in viri onesnaženja
Zakaj je SPPS tako široko razširjena?
Eden od najpomembnejših prednosti SPPS je možnost ohranjanja nastajajočega peptida na nosilcu med večkratnimi zamenjavami tekočih reagentov.
To poenostavlja ponavljajoče se kemične operacije in omogoča avtomatizacijo.
Kemiki lahko uvajajo načrtovano sekvenco aminokislinskih gradnikov, in če to omogoča kemija procesa, tudi nekatere posebne aminokisline in druge modifikacije.
Sodobni avtomatski sistemi kažejo, kako daleč je mogoče razviti to zasnovo.
V raziskavi o avtomatizirani sintezi snovi iz leta 2020 je opisano pridobivanje verig beljakovin, ki vsebujejo kar 164 aminokislinskih ostankov. Po poznejšem čiščenju in faldiranju so bili pridobljeni funkcionalni materiali. [10]
To je impresiven primer tehničnih možnosti.
To pa še ne pomeni, da bi lahko vsako sekvenco z dolžino 164 ostankov – niti vsak dolg peptid ali beljakovino – dobili z enako enostavnostjo.
To tudi ne pomeni, da čiščenje in strukturna karakteristika nista več potrebna.
Raziskava kaže bolj na rezultate, ki jih je mogoče doseči s skrbno razvitim sistemom za ustrezno izbrane molekule.
Avtomatizacija nadzoruje izvedbo procesa.
Njegov um pa ni sposoben spremeniti neustrezne kemije v ustrezno.
Zato je treba zmogljivost opreme, sekvenco peptida in lastnosti samega molekula analizirati skupaj.
Kako nastajajo običajni onesnaževalci?
Med spoznavnim preizkusom lahko pride do več različnih poti nastajanja onesnaženja. Razumevanje teh poti pomaga razložiti, zakaj so končne analitske raziskave še vedno potrebne.
Delejacijska sekvenca ali skrajšan produkt se lahko razvije, če načrtovano vezavo aminokisline ne bo uspelo ali če se rast verige ustavi. Ker je lahko nepravilen verigasti del še vedno pritrjen na vezivo, poznejše odstranjevanje ne potrebuje.
Epimerizacija pomeni spremembo stereokemijske konfiguracije ustreznega centra. To ima analitično pomembno pomen, saj lahko epimer ima enako nominalno maso molekule kot ustrezen peptid, hkrati pa se razlikuje po prostorski konfiguraciji.
Proizvodi, povezani z aspartimidom, se lahko tvorijo kot stranski produkti reakcij, ki so odvisni od sekvence asparaginovih ostankov. Glede na kemijsko pot se lahko tvori več kot eno vrsto takšnih izdelkov.
Nepopolno odstranjevanje zaščitnih skupin se zgodi, ko skupina, ki jo je treba odstraniti, ostane vezana na molekulo. Peptid lahko torej ima nominalno pričakovano dolžino verige, vendar še vedno ima nepravilno kemijsko strukturo.
Modifikacije, povezane z odcepljivanjem, se lahko pojavijo med končnim sproščanjem peptida ali odstranjevanjem zaščitnih skupin. Zato pravilna sestava verige ne zagotavlja, da bo peptid prešel skozi fazo odcepljanja brez sprememb.
Neokrnjene reakcije povezane z agregacijo pa lahko nastanejo, kadar se nastajajoči verigi medsebojno vplivajo na način, ki omejuje dostop do reaktivnih mest. Vnos zadostnega količnika reagenta v reakcijsko posodo ne zagotavlja, da je vsako reaktivno mesto fizično dostopno in da se ustvari ustrezna reakcija.
To so možne poti nastajanja onesnaženja.
To ne pomeni, da mora vsaka stranka, pridobljena s sistemom SPPS, vsebovati vse navedene vrste nepravilnosti.
Njihovo pomembnost v specifični sintezi se določi na podlagi znanja o procesu, analitičnih raziskav in ustreznega nadzora kakovosti.
Naravni peptidi zahtevajo nekaj več kot le reprodukcijo sekvence
Nekatere peptidi so strukturno precej bolj kompleksni, kot bi izhajalo iz same linearne sekvence aminokislin.
Dobri primer je epidermina.
Strukturalna karakteristika epidermine je pokazala prisotnost številnih obročev, ki vsebujejo žveplo, ter neobičajnih ostankov. [11]
Samo ponovno ustvarjanje linearne sledi aminokislin ne bi bilo torej zadosten dokaz, da smo dobili pristno zrelo epidermino.
Ta razlika je pomembna pri interpretaciji publikacij ali raziskav, ki se nanašajo na sintezo epidermine v stalni fazi.
Publikacija lahko opisuje linearni predhodnik, fragment, analog ali drugo sorodno strukturo, ne pa tudi popolno sintezo celotne zrele molekule, ki je bila preverjena.
Strukturalna publikacija, ki je tukaj navedena kot [11], opisuje značilnosti same epidermije; ni to poročilo o njeni popolni sintezi s SPPS.
Trditve o popolni sintezi je torej treba ocenjevati glede na dejansko ciljno strukturo molekule in ne le glede na njeno linearno aminokislinsko sekvenco.
Izkoristek, čistost in identiteta je treba predstaviti ločeno
Tri pojme, ki se pogosto zamenjujejo v razpravah o sintezi peptidov, so učinkovitost, čistost in identiteta.
Velika masa pridobljene snovi ne pomeni nujno, da je večina tega materiala namenjeni peptid. Surov material lahko vsebuje velike količine nečistoč.
Enako visoka čistost kromatografije sam po sebi ne potrjuje vseh vidikov strukturne identitete.
Tudi peptid, katerega kemijsko strukturo je natančno opredeljeno, s tem ne pridobi samodejno potrjenega biološkega, terapevtskega ali kliničnega uporabe.
To sta ločeni vprašanji.
Zanesljiv opis sinteze bi torej moral navajati, katera je bila ciljna molekula, na katerem je etapu je bila izmerjena učinkovitost, ali je analiziran material bil surov ali prečiščen ter katere analitske podatke so uporabili za potrditev trditev o strukturi.
Na ta način je mogoče rezultate sinteze interpretirati in primerjati na bolj zanesljiv način.
Enkratno odstotno vrednost ali masno vrednost ni mogoče pretvoriti v splošen izjavo, da je peptid „visoke kakovosti”, brez vednosti o tem, kaj je dejansko bilo merjeno.
Pogosto zastavljena vprašanja
1. Zakaj se v SPPS uporablja faza stalna?
Stalna faza ohranja nastajajoči peptid na nosilcu, medtem ko se lahko topni reagenti, stranski produkti reakcije in prečiščeni raztopini večkrat ponovno dodajajo in odstranjujejo. To znatno poenostavlja ponavljajoče se sestavljanje verige in omogoča avtomatizacijo sinteze peptidov, kot je na primer sodobna metoda avtomatizirane prehodne sinteze. [10] Nosilec pa ne zagotavlja, da bo vsak odziv potekal popolnoma idealno, niti ne loči nepravilno sestavljenega verige vezanega na vezivo od pravilnega. Glavna njegova prednost je v tem, da pospešuje potek procesa. Kemijska selektivnost, popolnost reakcije, čistost in strukturna identiteta še vedno zahtevajo posebno oceno.
2. Ali sinteza na stalni fazi odpravlja potrebo po čiščenju?
Ne. Nepravilni peptidni verigi lahko ostanejo pritrjene na vezivo med sintezo in nato sprostijo skupaj z želenim produktom. Raziskave, ki analizirajo surove izdelke SPPS s pomočjo kromatografije in masne spektrometrije, kažejo, da prečiščevanje med sintezo in končno čiščenje opravljata različne funkcije. [9] Prečiščevanje predvsem odstranjuje topne sestavine, ki obdajajo vezivo, medtem ko ima čiščenje po odstranitvi veziva za ciljni peptid ločiti želen peptid od neželenih peptidnih in nepeptidnih sestavin. SPPS poenostavlja posredne operacije, vendar ne zagotavlja končne čistoče.
3. Ali pomeni „faza stalna” to, da se topilo ne uporablja?
Ne. V običajni SPPS je neraztopen nosilec običajno obdan s tekočimi reagenti in topilnimi sredstvi. Topila vplivajo na fizikalno okolje smole, med drugim na stopnjo njene razpršitve in na to, kako lahko reagenti dosežejo povezana veriga. Eksperimentalna raziskovanja so pokazala, da je raztopina smole odvisna od raztopljivosti smole ter spremembe, povezane s kemijsko strukturo vezave, stopnjo vezave in podaljšanje verige. [2] Zato smole in topilo skupaj tvorita reakcijsko okolje.
4. V katero smer narašča peptid med SPPS?
Konvencionalna faza spletnega vezanja običajno gradi peptid od njegovega C-končnega dela proti N-koncu. Prvi aminokislina, ki naj bi tvorila C-končni del končne molekule, se veže na nosilec, slednje pa podaljšuje odkrito končno aminno verigo. Objavljene metode, ki temeljijo na Fmoc, kažejo na ta tipičen potek. [1] Vendar pa obstajajo specializirane strategije, ki uporabljajo stalno fazo, ki se lahko izvajajo drugače.
5. Ali pomenujeta li smola in vezivo enako?
Ne. Guma je neraztopen nosilec, medtem ko vezni člen predstavlja kemijsko vez med nosilcem in rastjo peptida. Funkcionalnost veznega člena lahko neodvisno od samega polimera vpliva na vezavo, ohranitev gume ter poznejše sproščanje peptida. Raziskave nosilcev, ki se uporabljajo pri sintezi peptidov, kažejo, da samostojno določitev vrste gume morda ne zadostuje za opisovanje vedenja celotnega sistema. [2]
6. Ali večji odstotek vezave živice vedno poveča proizvodnjo?
Ne. Večji loading pomeni več potencialnih mest za vezavo na določeno količino nosilca, vendar to ne mora povzročiti večjega števila pravilno zgrajenih in ponovno pridobljenih peptidov. Stopnja vezave lahko spreminja lokalno molekularno okolje in je eksperimentalno naveden kot eden od dejavnikov, ki vplivajo na razkrivanje živice. [2] Če so vezani verigi preveč zgoščene ali močno medsebojno delujejo, se razpoložljivost reaktivnih mest lahko poslabša. Loading je torej treba analizirati skupaj z lastnostmi živice, vedenjem sekvence, učinkovitostjo reakcije in kakovostjo končnega izdelka.
7. Zakaj se aminokisline varujejo med sestavljanjem peptida?
Zaščitne skupine začasno onemogočajo izbranim reaktivnim skupinam sodelovanje v reakcijah, medtem ko se razvija specifično vezavo. To omogoča nadzorovano, postopno sestavljanje verige. Vendar pa zaščita ne odpravlja vseh stranskih reakcij. Raziskave na modelnih sistemih so na primer pokazale, da lahko strategija zaščitnih skupin in obkrožajoča sekvenca vplivata na nastanek aspartimidov. [5] Zaščitne skupine torej zagotavljajo kemijsko selektivnost, vendar celotna strategija zaščite in razbijanja zahteva še vedno skrbno načrtovanje in oceno.
8. Kaj pomeni ortogonalna zaščita funkcionalnih skupin?
Ortogonalnost pomeni možnost odstranitve ene zaščitne skupine v pogojih, ki ohranijo druge potrebne zaščitne mehanizme v zadostni meri nedotaknjene. To omogoča razkrivanje določenih reaktivnih mest v načrtovanih fazah sinteze. Uveljavljene metode SPPS temeljijo na nadzorovanem zaščiti in razbiranju zaščitnih mehanizmov, namesto hkratnega razkritja vseh reaktivnih skupin. [1] Vendar pa dejanska skladnost uporabljenih zaščitnih mehanizmov še vedno odvisna je od ciljne molekule in reakcijskih pogojev.
9. Ali sta Fmoc in Boc različni tipi peptidov?
Ne. Fmoc in Boc sta zaščitna skupina ter povezani s tem sintetične strategije, ne pa različnih vrst peptidnega skeleta. Razlike v kemijskem odstranjevanju vplivajo na način sinteze, vendar začasno zaščitno kemijo ni mogoče zamenjevati s končno strukturo ciljnega peptida. Objavljene metode, ki temeljijo na Fmocu, kažejo enega od splošno uporabljenih variant SPPS, vendar to ne pomeni, da mora biti vsak peptid pridobljen s to metodo. [1]
10. Ali lahko prvi korak priključitve povzroči onesnaženje?
Da. Faza povezovanja lahko vpliva na stereokemijo še pred začetkom večkratnega podaljševanja verige. Razviti so bili analitski postopki, namenjeni za določanje racemizacije med vezavo zavarovanih aminokislin na veziva. [3] To ne pomeni, da vsako vezanje povzroča pomembno racemizacijo. Namesto tega kaže na to, da je sam vez v kemijskem smislu pomemben korak, v katerem se lahko pojavijo merljive spremembe, ki jih je treba upoštevati pri splošni oceni kakovosti.
11. Zakaj se nekaterim peptidnim sekvencam reče zahtevne?
Nekatere rastajoče peptidne verige delujejo med seboj ali z bližnjimi verigami tako, da omejujejo dostop do reaktivnih mest. Vodne vezi, hidrofilne interakcije in agregacijski vzorci lahko otežijo poznejše povezovanje. Raziskave sekvenc, občutljivih na agregacijo, kažejo, da lahko sprememba načina agregacije vpliva na sestavo surovega proizvoda. [4] Zato je težava pri sintezi odvisna od lastnosti molekule in reakcijskih pogojev, ne pa le od dolžine peptida.
12. Ali hitrejša sinteza vedno pomeni boljši izdelek?
Ne. Hitrost sinteze in kakovost izdelka sta ločeni parametri. Ogrevanje, mikrorazpršeno podvajanje in avtomatizacija lahko skrajšajo čas procesa, vendar lahko pospeševanje reakcij spremeni ravnovesje med želenimi in stranskimi reakcijami. Raziskave sinteze z mikrorazpršenjem so pokazale odvisnost od vrste ostankov pri sintezi in nastajanju aspartimida, kar kaže na potrebo po ustrezni kontrole pogojev. [7] Kratek čas sinteze je koristen le, če pridobljena snov izpolnjuje tudi zahtevane kemične in analitske kriterije.
13. Ali odstranjevanje pomeni preprosto odstranjevanje žveplovih delcev?
Ne. Odstranjevanje je kemičen proces, ki povzroča raztrganje načrtovanega vezja med peptidom in nosilcem. Odstranjevanje granulatov živice s filtracijo pa je fizikalna operacija, ki sama po sebi ne potrjuje pravilnega poteka kemičnega procesa odstranjevanja. Sprostitev peptida lahko poteka hkrati z odstranjevanjem zaščitnih skupin in drugimi reakcijami. Raziskave scavengerov, ki se uporabljajo med odstranjevanjem, kažejo, da ta korak lahko vpliva na profil onesnaženja. [8]
14. Ali visoka učinkovitost surovega izdelka pomeni visoko čistost peptida?
Ne. Performanca opisuje količino pridobljene snovi pred odstranitvijo vseh neželenih sestavin. Ta snov lahko vsebuje ciljni peptid skupaj s delecijskimi sekvencami, spremenjenimi strukturami, preostanimi zaščitnimi skupinami in drugimi onesnaževali. Raziskave surovih mešanic SPPS z uporabo kromatografije in masne spektrometrije kažejo, zakaj pridobljena masa, čistost in molekulska identiteta zahtevajo posebno interpretacijo. [9] Zanesljivo predstavljena performanca mora torej navajati fazo, v kateri je bila izmerjena, ter ali je bil material že očisten.
15. Ali SPPS omogoča pridobivanje dolgih peptidnih verig?
Da. Temeljito razviti postopki SPPS lahko omogočajo pridobivanje zelo dolgih verig. V raziskavah avtomatizirane pretokovne sinteze so pridobili verige, ki so vsebovale kar 164 ostankov, ki so nato bile očiščene in faldirane pred funkcionalno oceno. [10] To kaže na možnosti sodobne sinteze peptidov, vendar to ne pomeni, da je lahko vsaka sekvenca z podobno dolžino pridobljena z enako učinkovitostjo. Dolžina je le eden od dejavnikov; pomembni so tudi sekvenčno odvisni agregati, stranski reakciji, zahteve glede falditve in težave pri očistitvi.
16. Ali je izdelava sekvence epidermine pomenila celovito sintezo te sekvence?
Ne. Zrela epiderma vsebuje nenavadne strukturne elemente, vključno s peresnimi strukturami, ki presegajo sam linearni nizek nabor aminokislin. To je bilo dokazano v strukturnih raziskavah. [11] Zato pridobitev linearne sekvence, predhodnika ali fragmenta ne pomeni samodejno sinteze popolne zrele molekule. Za dokazovanje popolne sinteze so potrebni analitični podatki, ki potrjujejo ponovno izdelavo predvidenih vezi in drugih pomembnih strukturnih elementov.
17. Ali pričakovana masa molekule potrjuje popolno pravilnost strukture?
Ne. Doseganje pričakovane masne mase je pomembna informacija, vendar sama masa ne potrjuje vseh vidikov strukture peptida in ne izključuje vseh pomembnih onesnaževal. Dve molekuli lahko imata enako nominalno maso, hkrati pa se lahko razlikujeta po stereokemični strukturi ali določenem strukturnem razporedu. Raziskave, ki vključujejo razbijanje epimernih peptidov, kažejo, zakaj lahko stereokemijske razlike zahtevajo analitske metode, ki razlikujejo strukture, ki jih ni mogoče ločiti le na podlagi merjenja mase. [12] Končno karakteristiko je torej treba projektirati ob upoštevanju realnih onesnaževal in alternativnih struktur, ki se lahko pojavijo med določenim sintezo.
Povzetek
Sinteza peptidov v stalni fazi je spremenila kemijo peptidov, kar omogoča ohranjanje rastočega veriga na neraztopnem nosilcu med večkratnim vnašanjem, izvajanjem reakcij in odstranjevanjem raztopljivih reaktivnih sredstev. To olajša fazno gradnjo sekvenc in predstavlja praktično osnovo za avtomatsko sintezo.
Očitna preprostost te metode pa ne bi smela prezreti kemije, ki poteka na vsakem koraku.
Živa, vezivna spojina in stopnja vezave vplivajo na pomembne lastnosti okolja sinteze. Raztopinoodpornost vpliva na dostop do verig vezanih na živo snov. Zaščitne skupine nadzirajo, katera funkcionalna skupina lahko reagira, medtem ko reakcije vezave gradijo strukturo peptida od konca do konca. [1] [2]
Vsak od teh korakov ima tudi svoje omejitve.
Prvi postopek pridružitve lahko vpliva na stereokemijsko kakovost. [3] Težke sekvence lahko zmanjšajo ali omejijo dostop k reaktivnim skupinam. [4] Kemija za zaščito in odstranjevanje zaščitnih skupin lahko spodbuja stranske reakcije, kot je nastanek aspartimida. [5] [6] Pospešeni pogoji sinteze lahko spreminjajo stopnjo racemizacije ali profil onesnaženja. [7] Pogoji odstranjevanja lahko dodatno vplivajo na sestavo surovega izdelka. [8]
Zato pravilno sestavljanje verige ni enako pridobitvi čistega in pravilno identificiranega peptida.
Obnova surovega proizvoda, čiščenje in strukturna karakterizacija ostajajo ločeni koraki. Kromatografija lahko zagotavlja informacije o sestavi mešanice in čistosti, medtem ko spektrometrija mas in druge analitske metode zagotavljajo informacije o identiteti. Noben posamezni analitični rezultat ne potrebuje potrditve vseh vidikov strukture peptida. [9] [12]
Sodobna avtomatizirana pretoka sinteza kaže, da je z ustrezno razvitenimi pogoji SPPS mogoče uporabiti tudi za zelo dolge verige. [10] Hkrati strukturno kompleksna peptidi, kot je epidermalna beljakovina, kažejo, zakaj lahko sam reprodukcija linearne aminokislinske sekvence ni zadostna, če zrela molekula vsebuje dodatne obroče, nepravilne dele ali določen sklop vezavnih spojin. [11]
Najbolje je SPPS razumeti ne kot en sam odziv, ampak kot zaporedje ločenih kemijskih in analitskih faz.
Priključitev določa začetni točki. Ponavljajoči se cikli varjenja, razpiranja in spajkanja sestavljajo načrtovan lančnik. Odvajanje spajkanja sprosti proizvod. Čiščenje odstranjuje neželene sestavine iz ciljne molekule. Končna karakterizacija nato omogoča ugotovitev, ali izoliran material dejansko ima značilno strukturo in kakovost, ki so ji dodeljene.
Razdelitev teh etap omogoča izogibanje nekaterim pogostim nesporazumom: uspešno sintezo sam po sebi ne potrjuje čistoče, visoka zmogljivost sam po sebi ne potrjuje identitete, pričakovana molekulska masa pa sama po sebi ne dokazuje popolne strukturne pravilnosti.
Reference
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Sintetična peptidna sinteza na trdni fazi: Od standardnih postopkov do sinteze težkih sekvenc. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Amadi-Kamalu, C., Clarke, H., McRobie, M., Mortimer, J., North, M., Ran, Y., Routledge, A., Sibbald, D., Tickias, M., Tse, K. in Willway, H. (2020). Raziskava parametrov, ki vplivajo na otekanje smole v zelenih topilih. ChemistryOpen, 9(4), 431–441. https://doi.org/10.1002/open.202000030
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Uporaba Marfeyjevega reagenta za kvantifikacijo racemizacije ob vezavi aminokislin na trdne nosilce za sintezo peptidov. Analitična biokemija, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Evaluacija kombinirane uporabe Oxyme in HATU pri združevanju peptidnih zaporedij. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Problem aspartimida v spletni metodi za dobavo fosforne kisline (FMOC) del I. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Problem aspartimida v spletni metodi za sintezo fosfornih spojin na osnovi Fmoc. Del II. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Zmanjšanje racemizacije in tvorbe aspartimida pri sintezi peptidov v trdni fazi z uporabo mikrovalovnega sistema Fmoc. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-benzendimetanitol (1,4-BDMT) kot odstranjevalec sledi po razcepitvi zelenih peptidnih smol. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D. in Pallai, P. (1991). Opisovanje surovih produktov pri sintezi peptidov v trdni fazi z masno spektrometrijo z mu-HPLC/hitrim atomskim bombardiranjem. Peptide Research, 4(1), 40–46. PubMed
- Hartrampf, N., Saebi, A., Poskus, M., Gates, Z. P., Callahan, A. J., Cowfer, A. E., Hanna, S., Antilla, S., Schissel, C. K., Quartararo, A. J., Ye, X., Mijalis, A. J., Simon, M. D., Loas, A., Liu, S., Jessen, C., Nielsen, T. E. in Pentelute, B. L. (2020). Sinteza proteinov z avtomatizirano tokokemijo. Znanost, 368(6494), 980–987. https://doi.org/10.1126/science.abb2491
- Allgaier, H., Jung, G., Werner, R. G., Schneider, U., & Zähner, H. (1986). Epidermin: Sekvenciranje heterodiktnega tetracycličnega 21-peptidnega amida kot antibiotika. European Journal of Biochemistry, 160(1), 9–22. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1986.tb09933.x
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Študije racemizacije pri sintezi peptidov z ločevanjem zaščitenih epimernih peptidov s pomočjo visoko zmogljive tekočinsko-tehnične kromatografije (HPLC). International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x