إن تراكيب الحمض الأميني على مرحلة ثابتة، والتي تُعرف غالبًا باسم SPPS (تراكيب الحمض الأميني على مرحلة ثابتة)، هي طريقة كيميائية لبناء الحمض الأميني من الأحماض الأمينية إلى الأحماض الأمينية، بينما يبقى طرف واحد من السلسلة الناتجة مرتبطًا كيميائيًا بمادة حاملة غير قابلة للذوبان.
بدلاً من عزل الببتيد الناشئ بعد كل رد فعل، يترك علماء الكيمياء هذا الببتيد معلقاً في المرحلة الصلبة، مع إدخال وإزالة عوامل مضافة أخرى، بالإضافة إلى محلول غسل. وتتيح الدوائر المتكررة الكشف عن المجموعة الأمينية النشطة، وضمِّن الببتيد التالي، وإزالة المكونات المذابة التي لم تعد ضرورية. بعد إنشاء التسلسل المخطط له للأحماض الأمينية، يمكن فصل الببتيد عن المادة المحملة، ثم إخضاعه للمعالجة والتصنيع الإضافيين.
هذه الطريقة في تنظيم العملية هي أحد الأسباب الرئيسية التي جعلت SPPS أداة مهمة للغاية في الكيمياء الجزيئية. وتسهل مرحلة الاستقرار تنفيذ العديد من العمليات الكيميائية المتكررة، وتمكن من تحقيق الأتمتة في عملية التوليف.
ومع ذلك، فإن راحة التفاعل في المرحلة الثابتة لا تعني ضماناً كيميائياً للتفوق.
عدم ربط الحمض الديالبي الذي يتم إنشاؤه حاليًا بالناقل لا يضمن أن كل سلسلة تحتوي على جميع الأحماض الأمينية المخطط لها. كما أنه لا يعني أن المادة التي يتم إطلاقها في نهاية العملية ستكون نظيفة كيميائيًا أو ستكون لها بنية صحيحة.
تكوين السلسلة، وتفكيك المنتج وإعادته، والتنظيف، والتحقق من الهوية، والخصائص الهيكلية النهائية هي أجزاء منفصلة من العملية بأكملها.
تبين المنشورات المنهجية الحديثة كلًا من فائدة SPPS والحاجة إلى تعديل الطرق القياسية في حالة التسلسلات الصعبة. في إحدى الطرق المنشورة التي تستخدم استراتيجية Fmoc، تم وصف التوليف الروتيني، بالإضافة إلى نهج معدل لسلسلات الببتيد الحساسة للتجمع. [1]
لذلك، يتطلب فهم SPPS أكثر من مجرد تذكر المراحل الكيميائية التالية. كما يجب أن يكون من الممكن معرفة الغرض من كل مرحلة، وما الذي قد يذهب بشكل خاطئ أثناءها، والأسئلة التحليلية التي لا يزال يتعين الإجابة عليها بعد انتهائه.
ما هو تراكيب الببتيدات في المرحلة الثابتة؟
يبقى الببتيد الناشئ مجمّعاً، وتتغير محلولاته.
في SPPS التقليدي، يتم ربط الببتيد كيميائياً بقطرات صغيرة غير قابلة للذوبان، والتي تُعرف عادةً باسم حبيبات اللدائن، باستخدام رابط كيميائي مناسب.
تظل الحبوب في النظام التفاعلي، بينما يتم إدخال وتصريف المواد السائلة الأخرى والمحلولات المتبقية.
ذلك يسهل إلى حد كبير التوليف المتكرر.
في التوليف الكلاسيكي المراحلية، قد يكون عزل وإزالة الببتيد الناشئ بعد كل إضافة أمينو أكسيد أمراً مرهقاً. في SPPS، يبقى السلسلة الناتجة مرتبطة بفصل غير قابل للذوبان. وبذلك، يمكن إزالة الزيوت الزائدة القابلة للذوبان والعديد من المنتجات الثانوية عن طريق التنشيق، بينما يبقى الببتيد المرتبط بالمادة العضويّة في مكانه.
ومع ذلك، قد يؤدي مصطلح „المرحلة الثابتة” إلى سوء الفهم.
ذلك لا يعني أن عملية تكوين الروابط البروتينية تحدث دون مشاركة للماء أو المذيب.
عادةً ما تكون اللدونة محاطة بمحيط تفاعل سائل، ويمكن أن يؤثر تفاعلها مع المذيب بشكل كبير في عملية التفاعل. لا يزال من الضروري أن تتحرك المذيبات في محيط البوليمر أو حوله، وتصل إلى المواقع النشطة للبوليدو الناضج.
عادةً ما يكون ربط الببتيد بالمادة الوسيطة عنصراً كولافينياً. وهذا يعني أن الذرة الناتجة تُربط بالمادة الوسيطة عبر رابط باستخدام الترابط الكيميائي.
لذلك فإن الببتيد لا يقتصر على التواجد بين الجزيئات فحسب، بل يتم إيقافه بواسطة المرشح أو يندمج بشكل فضفاض على السطح.
يتم تصميم هذا العلاج الكيميائي بشكلٍ متعمد بحيث يبقى السلسلة الناتجة مرتبطة خلال ردود الفعل والمراحل اللاحقة للتنقية، ثم يمكن تحريرها في الظروف المناسبة لاحقًا.
تتم عملية التوليف التقليدية من الطرف C نحو الطرف N.
عادةً ما تبدأ الاستراتيجية الخطية الكلاسيكية لـ SPPS من حمض أميني، والذي سيشكل نهاية C له في الببتيد الجاهز.
والبقية يتم توصيلها إلى المحمل.
بعد إزالة المجموعه الأمينية النشطة المناسبة، يتم إدخال أمينو أكسيد آمن آخر ويتم ربطه كيميائياً بالشبكة الناتجة. تزداد مدة هذه العملية تدريجياً مع اتجاه السلسلة نحو الطرف N.
من الجدير بالذكر هذا الاتجاه لأنه يختلف عن التوليف البيولوجي للبروتينات بواسطة الريبوسومات.
تُمدّد التفاعلات الريبوسومية البوليميرازية الحمض النووي المستقيمي من الطرف N نحو الطرف C. عادةً ما تبني مرحلة SPPS التقليدية التسلسل في الاتجاه المعاكس.
ومع ذلك، قد تكون السلسلة النهائية للأحماض الأمينية متطابقة. لكن طريقة بنائها تختلف.
من المهم هنا تحديد المصطلح „تقليدي”، لأن الكيمياء الخاصة بالأحماض الأمينية تشمل أيضًا استراتيجيات متخصصة تستخدم مواقع ربط بديلة، وتركيب أجزاء، وتفاعلات الربط، وغيرها من الحلول غير القياسية.
لذلك، فإن وصف المسار من C إلى نهاية N يشير إلى عملية SPPS النموذجية، وليس إلى جميع الطرق الممكنة لعلم الكيمياء للبوليمرات التي تستخدم المرحلة الثابتة.
SPPS هو مجرد عنصر واحد من عناصر إنتاج الببتيدات.
إن التخليق في المرحلة الثابتة ليس الطريقة الوحيدة للحصول على الببتيدات.
يمكن أيضًا الحصول على الببتيدات عن طريق التوليف الكيميائي في محلول، وأنظمة التعبير البيولوجية، والتحويلات الإنزيمية، وربط الأجزاء، أو مزيج من الطرق المختلفة.
SPPS تكون مفيدة بشكل خاص عندما يكون من الضروري إعداد تسلسلات محددة بدقة واستخدام وحدات بناء أمينية مخصصة ومعدلة أو خاصة بطريقة أخرى.
حتى في إطار مشروع واحد يتعلق ببروتين معين، لا يجب دائمًا تطبيق نفس الطريقة من البداية إلى النهاية.
على سبيل المثال، يمكن أن يتم تصنيع أجزاء معينة من الببتيد على الورقة، وتطهيرها بشكل منفصل، ثم ربطها بطريقة كيميائية أخرى. قد تتطلب جزيئات أخرى تماسكاً، أو تحلل، أو دورة كيميائية، أو تغييرات هيكلية إضافية بعد الحصول على التسلسل الخطي الأولي.
لذلك، يعتمد الاختيار على الجزيء المستهدف، وتعقيده الهيكلي، ومتطلبات المشروع التحليلية والجودةية.
من الأفضل النظر إلى العملية كحلقة من أسئلة متتالية.
التوصيل إلى المحمل يحدد نقطة البدء ويؤثر على الكيمياء اللاحقة لإطلاق المنتج. ومع ذلك، لا يزال يتعين تحديد ما إذا كان التوصيل قد تم بشكل صحيح وما إذا استمر الاستقرار الكيميائي.
يتمثل هدف تكوين السلسلة في ربط الأحماض الأمينية بترتيب محدد مسبقًا. ولكن بعد ذلك يجب التحقق مما إذا كانت جميع السلسلات قد استجابت بشكل صحيح وما إذا لم يتم إنشاء تسلسلات تحتوي على أحماض أمينية مفقودة أو منتجات مختصرة أو معدلة.
إن فصل المكونات الحافظة وإزالتها من شأنهما أن يحرروا الببتيد ويزيلان بعض الضمانات الكيميائية. ومع ذلك، فإن التحرر الفعلي للمنتج لا يحدد ما هي المواد الأخرى الموجودة في المادة الخام.
التعقيم يهدف إلى فصل المادة المرغوبة عن المكونات غير المرغوب فيها، ولكن حتى الفئة المعالجة لا تزال تحتاج إلى التأكد من هويتها وتقييم جودتها.
في المقابل، فإن الخصائص الهيكلية والتحليلية النهائية تهدف إلى الإجابة على السؤال المتعلق بما إذا كان المادة المعزولة تتمتع بالخصائص الكيميائية المتوقعة للبروتين المستهدف، وما إذا كانت الطرق التحليلية المستخدمة مناسبة للاستخدام المقصود.
هذه هي مراحل مفاهيمية وليست تعليمات مختبرية. تتوقف المكونات المحددة، والأجهزة، وظروف الاستجابة على الحمض الجزيئي المستهدف، وتتطلب استخدام طريقة مصمّمة ومختبرة بشكل مناسب.
التوصيل بالبوليصة وتركيب السلسلة
الحيض، الموصل ودرجة التوصيل تؤدي وظائف مختلفة
في المناقشات المتعلقة بـ SPPS غالبًا ما تظهر ثلاثة مصطلحات: الراتنج، والوصلة، ومستوى التعبئة، أي loading.
إنها تصف الخصائص المرتبطة ولكنها مختلفة.
الدهان هو مادة غير قابلة للذوبان وتعد وسيلة نقل.
يوفر الملحق رابطاً كيميائياً بين هذا الحمض الجزيئي والبروتين أو أول رتبة أمينية. يمكن أن يؤثر تركيب الملحق على طريقة ربط البروتين وكذلك على إطلاقه لاحقاً.
في المقابل، يصف Loading عدد المواضع النشطة للاتصال بالنسبة لكمية المحمل.
هذه المفاهيم ليست مرادفات.
يمكن أن تبدو المذيبات الحيوية متشابهةً جسديًا للغاية، وفي الوقت نفسه أن تحتوي على مجموعات وظيفية مختلفة أو وصلات أو درجة من التفاعل. قد تؤثر هذه الاختلافات على توافر المواقع التفاعلية أثناء تكوين السلسلة، وتصلب المذيبات، والشكل الكيميائي النهائي للبروتين الناتج بعد الفصل.
المكون المهم الآخر هو المجموعة المزمعة في نهاية العمود C.
يمكن اختيار أنظمة حامل-وصلة مختلفة، على سبيل المثال، بطريقة تجعل من الممكن الحصول على بروتين مبرمج بنهاية كربوكسيلية أو أميدية.
هذا اختلاف كيميائي مهم.
إن تغيير مجموعة الطرف يعني تغيير الجزيء نفسه، وليس مجرد طريقة تعريفه أو وصفه.
التصلب يحد من الوصول إلى السلاسل المرفقة
الكثير من المواد العضوية المستخدمة في SPPS تمتص المذيبات وتتضخم عند تعرضها للبيئة السائلة المناسبة.
هذا يغير البيئة المائية ويمكن أن يزيد أو يقلل المساحة التي يجب أن يمر بها المذيبات المذابة للوصول إلى السلسلات البروتينية المرتبطة بالمواد العضوية.
ولذلك، فإن التصلب ليس مجرد ميزة جوهرية فيزيائية.
قد يؤثر على توافر الأطراف النشطة أثناء التفاعل.
التحقيق المنتظم في المواد القائمة على البوليستيرين والبيغ أظهر أن الخصائص مثل نوع الربط ودرجة ملحومة اللدونة من اللدائن كانت لها تأثير كبير على التصلب في المذيبات الأكثر استدامة التي تم اختبارها. كما لوحظ أن التصلب قد يتغير أثناء إزالة مجموعات الحماية وخلال مد طول السلسلة البيتايدية. [2]
ذلك يدل على أن سلوك المذيبات لا يمكن دائماً التعامل معه باعتباره خاصية ثابتة لها.
في الواقع، يعتمد ذلك على تفاعل المذيب، والمكون المجمّع، والبروتين الملحق، والمرحلة الحالية للتوليف.
ولذلك فإن التفاعل الجيد أو التحول الإيجابي للرد الفعل بالنسبة لتركيبة معينة من اللدائن والمذيبات والبروتينات لا يعني أن التفاعل الآخر سيتفاعل بنفس الطريقة.
المرحلة نفسها الخاصة بالربط تتطلب أيضًا مراقبة الجودة
قد يبدو المرحلة الأولى من الانضمام بسيطة، لأن السلسلة البيولوجية الجزيئية لا تبدأ في الظهور إلا بعد ذلك.
ومع ذلك، قد يظل الخطأ المنسق في هذه المرحلة موجودًا طوال التفاعلات التوليدية اللاحقة.
إذا تم توصيل الجزء الأول من المكونات بشكل غير صحيح أو تغير تكوينه الاستريوخي أثناء هذه العملية، فلا يلزم إضافة جميع الأجزاء المتبقية الأخرى بشكل صحيح لإصلاح المشكلة الأصلية.
في دراسة أجريت في عام 1992، تم تطوير طريقة تحليلية مخصصة خصيصًا لقياس التراكميّة التي تحدث أثناء ربط الأحماض الأمينية المحمية بمواد ثابتة. [3]
يعتبر أهمية هذه الدراسة تتجاوز فقط الطريقة التحليلية المستخدمة.
إنها تُظهر أن الجودة الاستهلاكية قد تتطلب مراقبة قبل بدء دورات التمديد المتكررة للشبكة.
كما أن كمية المواد التي تم إضافتها في البداية إلى المحتوى تتطلب تفسيراً مناسباً.
الدرجة الاسمية لنسبة الإحماء بالزئبق، والتحميل الذي تم قياسه تجريبياً، وكمية المواد الخام المستردة بعد الفصل، والإنتاج النهائي للبروتين المستقلل والمصفّى هي مقاييس مختلفة.
لا ينبغي التعامل معها على أنها مؤشرات بديلة لنجاح التفاعل الكيميائي.
قد تصبح السلاسل الأطول أكثر صعوبة في الحصول عليها
مع تمديد السلسلة البيولوجية، تبدأ الذرة الفردية نفسها في التأثير على بيئتها الكيميائية.
يمكن أن تتفاعل السلاسل المجاورة مع بعضها البعض من خلال الروابط الهيدروكربونية والتفاعلات الهيدروفوبية والقوى الأخرى بين الجزيئات. قد تظهر بعض السلاسل اتجاهًا قويًا بشكل خاص نحو هذه التفاعلات.
قد يؤدي ذلك إلى الحد من الوصول إلى مجموعات النشاط.
في مثل هذه الحالة، قد يصبح ربط الحمض الأميني التالي أكثر صعوبة، حتى لو تم إدخال كمية كافية من المكون المربك إلى النظام ظاهريًا.
في دراسة تتعلق بسلسلات معقدة عرضت مجموعة متنوعة من طرق الربط، وتم تحليل المنتجات الخام الناتجة. تؤيد النتائج مبدأ أن عملية الربط يجب أن تتكيف مع السلسلة المعينة، بدلاً من افتراض وجود استراتيجية واحدة للربط تكون دائمًا الأفضل. [4]
كما يوضح هذا أيضًا سبب أن زيادة درجة اللزوجة الذاتية للصبغة أو كمية المحفز لن تحل تلقائيًا جميع المشكلات.
إذا كان المشكلة الأساسية هي محدودية الوصول إلى المواقع النشطة، فإن السؤال حول كمية المحفز المضاف يصبح أكثر أهمية من سؤال ما إذا كان المحفز قد وصل بالفعل إلى المواقع المناسبة وما إذا كانت العملية الاستقلابية قد تمت بكفاءة دون حدوث كمية غير مقبولة من المنتجات الثانوية.
تأمين مجموعات الحماية وإزالتها والربط بها
تسيطر مجموعات الحماية على مكان حدوث الاستجابة
تتضمن الأحماض الأمينية مجموعات كيميائية قادرة على المشاركة في ردود فعل مختلفة.
عندما يقومون بعملية الإرسال المراقبة للبروتين، عادةً ما يرغب المحللون في أن يتفاعل مجموعة أمينية مع كتلة محددة تحتوي على مجموعة كربوكسيل، بينما تظل أماكن أخرى محتملة للتفاعل غير نشطة مؤقتًا.
هذا هو بالضبط ما تخدمه مجموعات الحماية.
يُوقفون مؤقتًا الأماكن النشطة المختارة، مما يتيح لمكان آخر المشاركة في الاستجابة المخطط لها.
في استراتيجية SPPS الشائعة، التي تستند إلى Fmoc، تبقى المجموعة الأمينية النهائية في السلسلة المتنامية محمية بين المراحل التالية من الإيثرات. عندما يتم إدراج الأمينو أكسيد التالي، يتم إزالة الحماية المؤقتة، مما يكشف عن المجموعة الأمينية.
يمكن أن تحتوي السلسلات الجانبية المتجددة على مجموعات وقائية منفصلة مصممة بحيث تظل سليمة أثناء دورات البناء المتكررة للسلسلة الرئيسية.
الهدف هو تحديد الانتقائية بشكل محدد.
ينبغي للكتلة المناسبة التي تحتوي على مجموعة كربوكسيل أن تتفاعل مع المجموعة الأمينية المناسبة، بدلاً من أن تؤدي إلى انقسام غير محكوم أو إلى تفاعلات منافسة أخرى.
المنسقية تعني إمكانية إزالة عوامل الحماية بشكل انتقائي
الاستراتيجية الأفقية للمجموعات الأمنية تسمح بإزالة مجموعة أمنية واحدة في ظل ظروف حيث تظل الضمانات الأخرى غير معطلة إلى حد كاف.
هذا يتيح للمرّكّب الكيميائي إمكانية الكشف عن مواقع تفاعلية مختلفة في مراحل مختلفة من التفاعل الكيميائي.
تُعد Fmoc و Boc من المصطلحات المعروفة جيدًا في علم الكيمياء للبروتينات، لكنهما لا تعنيان أنواعًا مختلفة من الروابط البروتينية أو بنى البروتين النهائية المختلفة.
هذه هي مجموعات الحماية المرتبطة باستراتيجيات مختلفة للتوليف وطرق مختلفة لإزالتها.
لذلك، يجب تمييز الطريق الكيميائي المؤقت المستخدم أثناء بناء الببتيد عن هيكله النهائي.
الأدوية المضادة للفيروسات لا توفر أيضًا حماية كاملة ضد جميع الآثار الجانبية المحتملة.
التحقيقات في تكوين الأسبارتيميد، على سبيل المثال، تُظهر أن استراتيجيات الحماية، والتركيزات الجزيئية المجاورة للأمينات، وظروف إزالة مجموعات الحماية، يمكن أن تؤثر في تكوين الملوثات حتى في الطرق المعروفة جيدا لتقنيات SPPS. [5] [6]
لذلك، تقلل استراتيجية مجموعات الحماية من ردود فعل غير مرغوب فيها معينة، لكنها لا تزيل الحاجة إلى التحكم في العملية أو الخصائص التحليلية النهائية.
التفاعل يؤدي إلى تكوين رابط أميد إضافي في هيكل الببتيد.
تؤدي استجابة الارتباط إلى إنشاء ارتباط أميد آخر في هيكل الببتيد.
يتم عادةً تحفيز البلوك الأميني الذي يحتوي على مجموعة كربوكسيلية عن طريق الكيمياء لتمكينه من التفاعل بشكل فعال مع المجموعة الأمينية المفتوحة في الببتيد الناشئ المرتبط بالمادة العضوية.
بعد الانتهاء من التفاعل، يمكن إزالة الفائض من المادة المذابة عن طريق التنشيط.
في هذه الحالة، يصبح الحمض الأميني المضاف حديثًا الجزء النهائي من السلسلة المتنامية. بعد ذلك، يمكن الكشف عن مجموعة الأمين الموجودة فيه وبدء دورة الربط التالية.
من الناحية النظرية، يتيح تكرار هذه السلسلة التحكم في ترتيب الأحماض الأمينية من خلال التحكم في ترتيب إدخال الوحدات الجزيئية.
في الواقع، هناك إشارة مهمة للغاية:
يجب أن تتم الاستجابة الكيميائية المخطط لها بشكل صحيح في كل دورة.
إذا كان أحد التوصيلات غير كامل، فقد لا يتلقى الجزء الآخر من السلسلة الباقي المخطط له.
إذا بقوا متصلاً بالزجاجة وواجهوا التفاعل بشكل صحيح في الدورة التالية، فإنه يمكن أن تحدث سلسلة تفكيكية، أي جزيئات بروتين تفتقر إلى واحد أو عدة أحماض أمينية مُحددة مسبقاً.
قد تبقى الأطواق الأخرى قصيرة.
يُزيل التنشيف المذيبات والمنتجات الثانوية، لكنه لا يزيل بشكل انتقائي جميع السلسلات غير الصحيحة، التي لا تزال مرتبطة كيميائياً بالناقل.
قد تتراكم خسائر صغيرة عبر العديد من الدورات.
يؤدي الطابع المتكرر لـ SPPS إلى مشكلة رياضية هامة.
قد تبدو قصور طفيف في مرحلة واحدة غير مهمة، لكن بعد تكرارها عدة مرات، قد تتراكم تأثيراتها.
دعونا نعتبر مثالاً رياضياً بسيطاً.
إذا كانت عملية تركيب الحمض الأميني تتطلب 50 مرحلة من التفاعل، وكان لكل مرحلة احتمالية نجاح مستقلة قدرها 99% ، فإن النسبة التقديرية للجسيمات التي تمر جميعاً بنجاح عبر هذه المراحل الـ50 تبلغ حوالي 60.5%.
هذا مجرد مثال.
إنها تفترض أن جميع المراحل تتصرف بشكل متماثل ومستقل. ولا تأخذ في الاعتبار مشاكل إزالة المجموعات الحامية، والآثار الجانبية، والخسائر أثناء التفكيك والتنظيف، والتجمع، والعديد من العوامل الفعلية الأخرى.
ولذلك لا ينبغي تفسير هذا النتيجة على أنها توقع للإنتاجية الفعلية.
هذا المثال يوضح فقط لماذا لا يضمن الإنتاج الفعال للغاية لخطوات فردية وجود منتج خام بسيط كيميائياً بعد عدة مئات من التكرارات.
ولهذا فإن رصد التفاعلات وتحديد التلوث أمر ضروري طوال عملية تكوين الببتيد، وليس بعد إضافة آخر أمينو أكسيد.
يمكن أن تعجل الأتمتة والتكييف والحلول التكنولوجية الأخرى بعملية التوليف، لكن يجب دائمًا تقييم سرعة العملية معًا مع جودة المنتج.
التحليل المتعلق بالمعالجة الحرارية المساعدة بالموجات الميكرويفة بحث العلاقة بين نوع المكونات وكمية الأسبارتيميد، مما أظهر لماذا يجب أن تظل ظروف الاستجابة متماشية مع خصائص التسلسل المحدد. [7]
تفريغ المنتج الخام وإعادته
يُحرر التقطيع المنتج من حاملة المحتوى
بعد بناء السلسلة التاميلية المخططة، عادةً ما يتم فصلها كيميائياً عن ناقلها.
يُعرف هذا المرحلة باسم "الكسر"، أي التفكك.
يقطع التقطير العلاقة الكيميائية المصممة بشكل متعمد بين الببتيد والحامل.
بناءً على الاستراتيجية المستخدمة، قد يحدث التكسير بالتزامن مع إزالة جزء أو كل مجموعات الحماية الخاصة بالشبكات الجانبية. وفي عمليات أخرى، قد يتم تحرير بروتين أو جزء منه مع الحفاظ على بعض الضمانات، إذا كان من المخطط إجراء تغييرات كيميائية أخرى.
تعتمد الكيمياء المناسبة للإفراج عن المادة على الموصل والمركبة الجزيئية المستهدفة.
يمكن أن تتسبب الظروف التي تطلق بشكل فعال أحد الحمضات في إتلاف المجموعة الكيميائية الحساسة في أخرى.
ولهذا فإن عملية التفكيك تُحدد الغرض الكيميائي، وليس مجموعة واحدة من عوامل الاستجابة أو الظروف المناسبة لجميع الببتيدات.
ومثلًا، فإن البناء السليم للجزء الخلوي للبروتين لا يثبت أن جميع المجموعات الحامية قد تم إزالتها بنجاح في وقت لاحق.
تلبية متطلبات مختلف الأسئلة الكيميائية وتحديدها يتطلب وضع السلسلة وإزالتها بشكل نهائي.
قد تؤثر ظروف التخلص من النفايات على تركيبة الملوثات
لا يجب أن يكون التخلي عن التوائم مرحلة عازلة كيميائياً.
إزالة مجموعات الحماية وإزالة الربط بين الببتيد والمركِّب قد يؤدي إلى تكوين أشكال كيميائية نشطة يمكن أن تعدّل الببتيد أو غيره من مكونات المزيج.
ولهذا، قد يتم استخدام ما يُسمى بـ "السكافنجريات" في الأساليب المحددة، أي المركبات التي تلتقط المنتجات التفاعلية غير المرغوب فيها وتؤثر على تكوين المنتجات الثانوية.
في دراسة أجريت في عام 2019، تم تحليل مختلف عوامل التصفية أثناء فصل إكسيناتيد من اللب الببتيدي، وتم التبين أن اختيارها كان له تأثير على جودة المنتج الخام والخصائص الملاحظة للملوثات. [8]
لا ينبغي بناءً على هذا إنشاء وصفة عالمية لإزالة التصلب.
ومع ذلك، يوضح البحث أن ظروف هذه المرحلة قد تؤثر على جودة المنتج، ولذلك يجب تقييمها لكل بروتين معين ونظام مجموعات الحماية المستخدمة.
لذلك فإن عملية فصل العظام تتم وفقًا لعدة أبعاد.
يجب فصل الببتيد بشكل صحيح، ويجب إزالة المجموعات الحامية المطلوبة، ويجب استعادة المادة المستهدفة، ويجب التحكم في التغيرات الكيميائية غير المرغوب فيها.
استعادة المنتج الخام ليست عملية تنقية نهائية
بعد التفكيك، يتم تنفيذ عملية تمكن من فصل المادة التي تحتوي على الببتيد عن الراتنج الثابت وأجزاء المكونات المتبقية في المزيج التفاعلي.
في هذه الحالة، يمكن الاستفادة من الاختلافات في قابلية الذوبان أو اللزوجة أو الخصائص الكيميائية الأخرى.
ومع ذلك، فإن استعادة الرواسب المرئية أو الفص الموجودة من بروتين البلازما لا يثبت أن المادة تتكون فقط من المنتج المقصود.
في هذه المرحلة، عادة ما يتم التحدث عن الببتيد الخام.
قد يحتوي على الجزيء المستهدف مع سلاسل التعديل، والشبكات المصغرة، والبروتينات المعدلة كيميائياً، والتركيبات غير المكتملة، والمواد المستمدة من المحفزات وغيرها من الملوثات.
يعتمد أهمية الملوثات الفردية على التسلسل الزمني، والظروف التي يتم فيها التكوين، والاستخدام المقصود.
في إحدى الدراسات، تم الجمع بين القسم الكروماتوغرافي والقياس الكتلي لخصائص المنتجات الخام SPPS، وإسناد النقاط الكروماتوغرافية إلى الببتيدات المحددة. [9]
هذا يوضح لماذا تتكامل المعلومات المستمدة من الطرق التجريدية والمنهجية بشكل متبادل.
قد تُظهر الكروماتوغرافيا وجود العديد من المكونات، بينما قد يوفر التصوير المادي الكتلي معلومات إضافية تساعد في تحديد ماهية بعضها.
تنظيف وتأكيد الهوية يفيان بمتطلبات أسئلة مختلفة
التعقيم يهدف إلى تحسين أو عزل الجزيء المستهدف من بين المكونات الأخرى.
في المقابل، يحدد تحديد الهوية السؤال المتعلق بما إذا كان المادة المعزولة تحتوي بالفعل على الخصائص الكيميائية المتوقعة.
تتناقض هذه الأسئلة بعضها بعضاً جزئياً، لكنها ليست هي نفسها.
إن الصورة الكروماتوجرافية الموزعة بشكل جيد لا يشكل بالضرورة دليلاً كاملاً على بنية الذرة.
ومثلًا، فإن الحصول على الكتلة الجزيئية المتوقعة في حد ذاته لا يشكل تقييماً كاملاً لنقاء التركيب أو صحته الهيكلي.
الأنواع المتشابهة جينياً من السلسلة، أو الأيزوميرات، أو الأشكال المعدلة كيميائياً، قد تكون من الصعب تمييزها أو تمييزها بشكل مستقل.
لذلك يجب تقييم طريقة التصفية بالنظر إلى المزيج الفعلي الذي يتم إنتاجه أثناء التفاعل المحدد، ولا ينبغي اعتباره كافيًا فقط لأنها نجحت في حالة بيتايد آخر.
إذا كانت الجزيئة النهائية تتطلب أيضًا إنشاء جزيئات ديسيارشكية أو كيميائية أو تحويلات أخرى بعد الانتهاء من تجميع السلسلة، تظهر أسئلة تحليلية أخرى تتعلق بسلامة الروابط، ووحدانية الهيكل، وما إذا تم حقًا الحصول على الشكل الناضج المرغوب في الجزيئة.
مزايا التلوث والقيود المصادر
لماذا تُستخدم SPPS على نطاق واسع؟
ومن أهم مزايا SPPS القدرة على الاحتفاظ بالبروتين الناشئ على حامل أثناء التبديل المتكرر للمنشطات السائلة.
هذا يسهّل العمليات الكيميائية المتكررة ويسمح بالتحويل إلى أسلوب آلوي.
يمكن للمهندسين الكيميائيين إدخال سلسلة من الأحماض الأمينية المكونة للبروتينات وفقًا للخطة المحددة، وفي حال سمحت بذلك الكيمياء الخاصة بالعملية، فإنه يمكنهم أيضًا إدخال بعض الأحماض الأمينية غير القياسية وغيرها من التعديلات.
إن الأنظمة الآلية الحديثة تُظهر مدى القدرة على تطوير هذه الفكرة.
في دراسة بشأن التوليف السيروماتي الآلي عام 2020، تم وصف الحصول على سلاسل بروتينية تحتوي على ما يصل إلى 164 بقايا أمينية. بعد التصفية والتشكيل اللاحقين، تم الحصول على مواد وظيفية. [10]
هذا مثال رائع على إمكانيات التكنولوجيا.
ولكن هذا لا يعني أنه يمكن الحصول على كل تسلسل يتكون من 164 رتبة — ولا حتى على أي بروتين أو بروتين طويل — بسهولة بالغة.
كما أن هذا لا يعني أن التنقية والخصائص الهيكلية ستصبحان غير ضرورية.
إن الدراسة تُظهر بدلاً من ذلك النتائج التي يمكن تحقيقها بفضل نظام تم تصميمه بعناية باستخدام الذرات المناسبة.
تتحكم الأتمتة في تنفيذ العملية.
ولكنّه غير قادر على تحويل الكيمياء غير المناسبة إلى الكيمياء المناسبة.
ولهذا، يجب تحليل كفاءة الجهاز وسلسلة الببتيد والحالة الخاصة بالذرة نفسها بشكل متكامل.
كيف تنشأ الملوثات النموذجية؟
قد توجد عدة طرق مختلفة تؤدي إلى تكوّن الملوثات أثناء SPPS. فهمها يساعد في توضيح سبب استمرار الحاجة إلى الاختبارات التحليلية النهائية.
قد يحدث تسلسل التحلل أو المنتج المختصر عندما لا ينجح الربط المخطط لمركب أميني، أو عندما يتم قطع سلسلة التطور. نظرًا لأن السلسلة غير الصحيحة قد تظل ممتصة في السليكا، فلا يلزم التخلص منها في مرحلة لاحقة.
الايپيريميريزا يعني تغيير التكوين الاستريوكميائي للمركز المناسب. هذا أمر ذو أهمية تحليلية خاصة، حيث يمكن أن يكون للإيبريم وزن جزيئي رسمي مماثل للبروتين المناسب، وفي الوقت نفسه أن يختلف التكوين المكاني.
يمكن أن تتشكل المنتجات المرتبطة بالأسبتيميد نتيجة لعمليات جانبية تتوقف على التسلسل الجزيئي، وتتضمن بقايا الأسبارتامين. وقد يتشكل أكثر من نوع واحد من هذه المنتجات اعتمادًا على المسار الكيميائي.
تحدث الإزالة غير الكاملة للمجموعات الحامية عندما تظل المجموعة التي ينبغي إزالتها مرتبطة بالجزيء. لذا، قد يكون الحمض الأميني له طول سلسلة متوقع تقريبًا، لكنه لا يزال يمتلك بنية كيميائية غير صحيحة.
قد تحدث التعديلات المرتبطة بإزالة الرابط قد تحدث أثناء الإفراج النهائي للبروتين أو إزالة مجموعات الحماية. لذا فإن البناء الصحيح للشبكة لا يضمن أن البروتين سيمر بمرحلة إزالة الرابط دون تغيير.
في المقابل، قد تحدث ردود غير كاملة المرتبطة بالتجانس عندما تتفاعل سلاسل التفاعل مع بعضها البعض بشكل يحد من الوصول إلى المواقع التفاعلية. عدم إدخال كمية كافية من المحفز في الأنبوب التفاعلي لا يضمن أن كل موقع تفاعلي متاح فعليًا ويستجيب بشكل مناسب.
هذه هي الطرق المحتملة لتكوّن الملوثات.
هذا لا يعني أن كل حزب يتم تلقيه عن طريق SPPS يجب أن يتضمن جميع أنواع المخالفات المذكورة أعلاه.
يتم تحديد أهميتها في التوليف المحدد على أساس المعرفة بالعملية، وبحوث التحليل، ومراقبة الجودة المناسبة.
البروتينات الطبيعية المكونة تتطلب أكثر من مجرد إعادة إنشاء التسلسل الجيني
بعض الببتيدات أكثر تعقيدًا هيكليًا من ذلك الذي يتضح من السلسلة الأمينية نفسها.
ومن الأمثلة الجيدة على ذلك هي الطبقة الخارجية للبشرة.
أظهرت الخصائص الهيكلية للجلد وجود العديد من حلقات الكربونية بالإضافة إلى بقايا غير عادية. [11]
ولذلك، لن يكون مجرد استنساخ التسلسل الخطي للأحماض الأمينية كافياً لإثبات حصولنا على إندوبيريمن متطور أصلاً.
هذا التمييز مهم عند تفسير المنشورات أو البحث المتعلقة بإنتاج الطبقة الخارجية في المرحلة الثابتة.
قد يصف المنشور السابقة الخطية، أو الجزء، أو النمط المماثل، أو أي بنية أخرى متصلة بها، وليس التوليف الكامل المعتمَد للذرة الناضجة الكاملة.
يصف المنشور الهيكلي المذكور هنا [11] الخصائص الخاصة بالجلد نفسه؛ وهو ليس تقريراً عن تكوينه الكلي باستخدام طريقة SPPS.
لذلك، يجب تقييم الادعاءات المتعلقة بالتكامل الكلي بالرجوع إلى الهيكل الوظيفي الفعلي للذرة المستهدفة، وليس فقط إلى تسلسلها الأحيائي اللين.
يجب تقديم الإنتاجية والنقاء والهوية بشكل منفصل.
ثلاث مفاهيم غالباً ما تكون متبادلة التفسير في المناقشات حول تكوين الببتيدات: الإنتاجية، النقاء، والخصوصية.
لا يعني وجود كمية كبيرة من المنتج المسترد أن معظم هذا المادة يشكل بروتينًا مقصودًا. قد يحتوي المادة الخام على كميات كبيرة من الملوثات.
كما أن النقاء الكروماتوغرافي العالي لا يؤكد تلقائيًا جميع جوانب الهوية الهيكلية.
حتى إن إنتاج بروتين معين، الذي تم تصميمه بدقة من حيث التركيب الكيميائي، لا يضمن تلقائياً استخدامه البيولوجي أو العلاجي أو السريري.
هذه مسائل منفصلة.
لذلك، يجب أن يشير وصف التوليف الدقيق إلى الذرة المستهدفة، والمرحلة التي تم فيها قياس الكفاءة، وإلى ما إذا كان المادة قيد التحليل خاماً أم معقمة، وكذلك إلى البيانات التحليلية التي استخدمت لتأكيد الادعاءات المتعلقة بالتركيب.
وبهذا، يمكن تفسير نتائج التوليف ومقارنتها بطريقة أكثر موثوقية.
لا ينبغي تحويل القيمة النقدية أو القيمة الجسدية الفردية إلى بيان عام مفاده أن الحمض الأميني „ذو جودة عالية” دون معرفة ما تم قياسه بالفعل.
الأسئلة المتداولة
1. لماذا يتم استخدام المرحلة الثابتة في SPPS؟
تحافظ المرحلة الثابتة على الببتيد الناشئ على حامل، بينما يمكن إدخال وتصريف المذيبات القابلة للذوبان والمنتجات الثانوية للعملية والحلول المتبادلة عدة مرات. وهذا يسهل بشكل كبير عملية تكرار سلسلة التفاعل ويسمح بتحقيق أتمتة تكوين الببتيدات، على سبيل المثال، الطرق الحديثة للتوليف التوربوني الآلي. [10] ومع ذلك، لا يضمن حامل أن كل تفاعل سيتم إنجازه بشكل مثالي، ولا يفرّق بين سلسلة غير سليمة مرتبطة بالمواد المضافة والمنشأة بشكل صحيح. ويتمثل مزاياه الأساسية في تحسين عملية الإدارة. والخصائص الكيميائية الانتقائية، ووحدة التفاعل، ونقاء وخصوصية التركيبات الهيكلية لا تزال بحاجة إلى تقييم منفصل.
2. هل يزيل التخليق في المرحلة الثابتة الحاجة إلى المعالجة؟
لا. قد تظل سلاسل الببتيدات غير الصحيحة مجمعة مع اللدونة أثناء التفاعل، ثم يتم إطلاقها مع المنتج المقصود. أبحاث تحليل المنتجات الخام SPPS باستخدام كحالة وتصوير الكتلة تشير إلى أن المعالجة المتبقية أثناء التفاعل والتحليل النهائي لهما وظائف مختلفة. [9] تُزيل المعالجة المتبقية بشكل رئيسي المكونات القابلة للذوبان التي تحيط باللدونة، بينما يهدف المعالجة النهائية إلى فصل الببتيد المرغوب فيه عن المكونات الببتيدية وغير الببتيدية غير المرغوب فيها. SPPS يسهل العمليات الثانوية، لكنه لا يضمن النقاء النهائي.
3. هل يعني „المرحلة الثابتة” عدم استخدام المذيب؟
لا. في SPPS التقليدي، يتم عادةً تغليف حامل غير قابل للذوبان بالمواد الكيميائية السائلة والمذيبات. تؤثر المذيبات على بيئة المادة اللدينة الفيزيائية، بما في ذلك درجة انكماشها وسهولة وصول المذيبات إلى السلسلة المرفقة بها. أظهرت الدراسات التجريبية أن انكماش المادة اللدينة يعتمد على المذيب، كما أن التغيرات المرتبطة بالصلة الكيميائية، ومستوى التصلب، وتمديد السلسلة تتأثر أيضًا بالمذيب. [2] لذا، فإن المادة اللدينة والمذيب يشكلان معًا بيئة تفاعل.
4. في أي اتجاه ينمو الببتيد أثناء SPPS؟
عادةً ما يبني مرحلة SPPS التقليدية الببتيد من بقية C-terminal نحو N-terminal. الأمينو أكسيد الأول الذي يُعد C-terminal للجزيء النهائي يتم إضافته إلى ناقل، وتُمدّد البقايا الأخرى الطرف الأميني المفتوح للرابطة. تظهر الطرق المنشورة المستندة إلى Fmoc هذا الشكل النموذجي. [1] ومع ذلك، هناك استراتيجيات متخصصة تستخدم المرحلة الثابتة والتي قد تتصرف بطريقة مختلفة.
5. هل تعني اللدائن والوصلات الشيء نفسه؟
لا. اللدونة هي ناقل غير قابل للذوبان، بينما يشكل الموصل رابطاً كيميائياً بين الناقل والبروتين الناشئ. يمكن للموصل أن يؤثر، بشكل مستقل عن المكونات الكيميائية للبروتين، في الربط، في استمرار اللدونة، وفي الإفراج اللاحق للبروتين. أبحاث الموصلات المستخدمة في تكوين البروتينات تبين لماذا قد لا يكون تحديد نوع اللدونة وحده كافياً لوصف سلوك النظام بأكمله. [2]
6. هل يزيد مستوى التخصيب الزائد للصبغة دائمًا من الإنتاجية؟
لا. يعني التحميل الأعلى عددًا أكبر من المواقع المحتملة للربط لكل كمية محددة من المحمل، ولكن هذا لا يجب أن يؤدي إلى الحصول على كمية أكبر من الببتيد الذي تم بناؤه بشكل صحيح ويمكن استعادته. قد يتغير مستوى التجميع في البيئة الجزيئية المحلية، وقد تم إثباته تجريبيًا كواحد من العوامل المؤثرة على تمدد اللدائن. [2] إذا كانت سلاسل الربط المرفقة مكدسة بشكل مفرط أو تتفاعل بقوة مع بعضها البعض، فقد تتدهور قابلية الوصول إلى المواقع النشطة. لذلك، يجب تحليل التحميل مع خصائص اللدائن، وحالة التسلسل، وكفاءة الاستجابة، ونوعية المنتج النهائي.
7. لماذا يتم حماية الأحماض الأمينية أثناء تحويل الببتيد؟
تمنع مجموعات الحماية مؤقتاً مجموعات رد الفعل المختارة من المشاركة في التفاعلات، بينما يتم إنشاء ارتباط محدد. هذا يتيح عملية تصنيع سلسلة متسلسلة بشكل متسق ومستمر. ومع ذلك، لا يزيل الحماية جميع التفاعلات الجانبية. على سبيل المثال، أظهرت الدراسات على أنظمة نموذجية أن استراتيجية مجموعات الحماية والترتيب المحيط بها يمكن أن تؤثر على تكوين الأسبرتيميد. [5] لذا فإن مجموعات الحماية توفر انتقائية كيميائية، ولكن الاستراتيجية الكاملة للحماية والإزالة لا تزال تتطلب تخطيطًا دقيقًا وتقييمًا دقيقًا.
8. ما معنى الحماية الأفقية للمجموعات الوظيفية؟
المرونة هي القدرة على إزالة مجموعة وقائية واحدة في ظل ظروف تترك المكونات الأخرى اللازمة للسلامة غير معطلة إلى حد كاف. وهذا يسمح بإظهار مواقع استجابة محددة في المراحل المخططة للتفاعل. تستند الطرق القوية لـ SPPS إلى التحكم في إزالة وتفكيك المكونات، بدلاً من إزالة جميع المكونات الاستجابة في وقت واحد. [1] ومع ذلك، لا تزال الاتساق الحقيقي للمكونات المستخدمة يعتمد على المكون المستهدف والظروف المحددة للردود.
9. هل تعني Fmoc و Boc نوعين مختلفين من الببتيدات؟
لا. فموك وبوك هما مجموعتان من المركبات الحافظة المرتبطة باستراتيجيات تركيبية معينة، وليست نوعين مختلفين من الهيكل الجزيئي للبروتين. تختلف خصائص إزالة هذه المركبات الكيميائية بشكل كبير عن طريقة إعداد التركيب الجزيئي النهائي للبروتين المستهدف. تظهر الطرق المنشورة المستندة إلى فموك أحد الخيارات الشائعة لـ SPPS، ولكن هذا لا يعني أن كل بروتين يجب أن يتم الحصول عليه باستخدام هذه الطريقة. [1]
10. هل يمكن للمرحلة الأولى من الربط أن تسبب تلوثًا؟
نعم. قد يؤثر مرحلة الربط على النوعية الكيميائية للتركيب قبل بدء عملية التمديد المتكرر. تم تطوير طرق تحليلية مخصصة تحديد التراكيز أثناء الربط بين الأحماض الأمينية المحمية والمواد المضافة. [3] هذا لا يعني أن كل عملية ربط تحدث تراكيزًا كبيرة. بل يوضح أن الربط نفسه هو مرحلة كيميائية مهمة، حيث قد تحدث تغييرات قابلة للقياس تتطلب مراعاة في التقييم العام للجودة.
11. لماذا تُعرف بعض سلاسل الأحماض الأمينية بأنها صعبة التفسير؟
بعض سلاسل الببتيد الناشئة تتفاعل مع بعضها البعض أو مع سلاسل مجاورة بطريقة تحد من الوصول إلى المواقع التفاعلية. قد تعيق الروابط الهيدروكربونية والتفاعلات الهيدروفوبية والمواقف التي تشبه التجمع في وقت لاحق الوصول إلى التفاعل اللاحق. تشير دراسات سلاسل الببتيد الحساسة للتجمع إلى أن تغيير طريقة التفاعل قد تؤثر على تركيب المنتج الخام. [4] لذا فإن صعوبة التوليف تعتمد على خواص الذرة والظروف المحددة للعملية، وليس فقط على طول الببتيد.
12. هل يعني التخليق الأسرع دائمًا منتجًا أفضل؟
لا. سرعة التفاعل وجودة المنتج هما معاياران منفصلان. يمكن أن يقلل التدفئة، ودعم التفاعل بالموجات الكهرومغناطيسية، والتحكم الآلي من وقت العملية، ولكن يمكن أيضًا أن يغير التسريع من التوازن بين التفاعلات المرغوبة والجانبية. أظهرت دراسات التفاعل المدعوم بالموجات الكهرومغناطيسية وجود علاقة تبعية بين نوع المكونات والترسبات، مما يشير إلى الحاجة إلى مراقبة ملائمة للظروف. [7] إن وقت التفاعل الأقصر مفيد فقط عندما يتوافق المنتج الناتج أيضًا مع المعايير الكيميائية والتحليلية المطلوبة.
13. هل يعني فصل الشمع إزالة حبيبات اللدائن فقط؟
لا. إذابة هي عملية كيميائية تؤدي إلى كسر الوصلة المبرمجة بين الببتيد والحامل. في حين أن إزالة حبيبات اللدائن عن طريق الترشيح هي عملية جسدية للتفكيك ولا تؤكد في حد ذاتها صحة عملية إذابة الببتيد. قد تحدث إطلاق الببتيد في وقت واحد مع إزالة مجموعات الحماية وغيرها من التفاعلات. تظهر الدراسات المتعلقة بالمستخلصات المستخدمة في إذابة الببتيد أن هذه المرحلة قد تؤثر في تركيبة الملوثات. [8]
14. هل يعني الكفاءة العالية للمنتج الخام وجودية عالية للبروتين؟
لا. تُحدد الكفاءة الصارمة كمية المادة المستردة قبل إزالة جميع المكونات غير المرغوب فيها. قد يحتوي هذا المادة على الببتيد المستهدف بالإضافة إلى التسلسلات التعديلية، والهياكل المعدلة، والجماعات الحامية المتبقية، والتلوثات الأخرى. تُظهر دراسات المزيجات الصارمة من SPPS باستخدام كحامات وتصوير الكتلي، لماذا تتطلب الكتلة المستردة والوضوح والتوحيد الذريين تفسيراً منفصلاً. [9] لذا، يجب أن تشير الكفاءة الموضحة بشكل صحيح إلى المرحلة التي تم قياسها فيها، وإلى ما إذا كان المادة قد تم تنقيةها بالفعل.
15. هل يتيح SPPS تلقي سلاسل بروتينية طويلة؟
نعم. يمكن لأساليب SPPS المجهزة بعناية تمكين الحصول على سلاسل طويلة للغاية. في دراسات التخليق الآلي، تم الحصول على سلاسل تحتوي على ما يصل إلى 164 ركيزة، ثم تم تنقيةها وتدويرها قبل إجراء التقييم الوظيفي. [10] هذا يوضح إمكانيات التخليق الجزيئي الحديث، لكن هذا لا يعني أنه يمكن الحصول على كل تسلسل بنفس الطريقة وبنفس الكفاءة. الطول هو مجرد أحد العوامل؛ هناك أيضًا عوامل أخرى مثل التجمع المتصل بالترتيب، والردود الجانبية، واحتياجات التدوير، وصعوبة التخليد.
16. هل يعني بناء سلسلة من الطبقات الخارجية إنجاز التوليف الكامل لها؟
لا. تحتوي البشرة الناضجة على عناصر هيكلية غير عادية، بما في ذلك حلقات تحتوي على الكبريت تتجاوز الخط المباشر لتسلسل الأحماض الأمينية. وقد تم ذلك في دراسات هيكلية. [11] لذلك، فإن الحصول على تسلسل خطي، أو مسبّب أو جزء منه، لا يعني تلقائيًا تكوين جزيء كامل ناضج. يتطلب الادعاء بإنتاج كامل البيانات التحليلية التي تؤكد إعادة إنشاء الروابط المقصودة والعناصر الهيكلية الأخرى الهامة.
17. هل يؤكد الوزن الجزيئي المتوقع على صحة بنية المادة بالكامل؟
لا. إن الحصول على الكتلة الجزيئية المتوقعة يوفر معلومات قيمة، ولكن الكتلة نفسها لا تؤكد جميع جوانب بنية الحمض الأميني ولا تستبعد جميع الملوثات المهمة. قد يكون لخلية دقيقة كتلة اسمية واحدة، ولكنها تختلف في التصنيف الاستوائي أو في نظام هيكلي معين. تشير الدراسات التي تشمل تحليل الببتيدات الإيبرية إلى أن الاختلافات التصويرية قد تتطلب طرق تحليلية قادرة على تمييز التركيبات التي لا يمكن تمييزها فقط من خلال قياس الكتلة. [12] لذا، يجب تصميم الخصائص النهائية مع مراعاة الملوثات الواقعية والتركيبات البديلة التي قد تنشأ أثناء التفاعل المحدد.
الملخص
تغيرت الكيمياء الخاصة بالبروتينات عند تحويلها إلى شكل ثابت، مما يتيح الاحتفاظ بشبكة متنامية على حامل غير قابل للذوبان أثناء إعادة إدخالها وتفاعلها وإزالة عوامل التفاعل القابلة للذوبان. وهذا يسهل بناء السلسلة التدريجي ويشكل الأساس العملي لعملية التوليف التلقائي.
على الرغم من بساطة هذه الطريقة الظاهرية، إلا أنه لا ينبغي أن يغفل المرء الكيمياء التي تحدث في كل مرحلة.
المركبات العضوية، والوصلات، ومستوى التفاعل تؤثر على الخصائص البيئية للتفاعل. يتأثر انكماش المذيبات بالوصول إلى سلاسل المركبات العضوية. تحكم مجموعات الحماية في المجموعات الوظيفية التي يمكن أن تتفاعل، بينما تنشئ تفاعلات التفاعل هيكل الحمض النووي للبروتين من خلال تجميعها. [1] [2]
لكل مرحلة من هذه المراحل أيضًا حدودها الخاصة.
قد يؤثر الانضمام الأولي على النوعية الكيميائية. [3] قد تتراكم التسلسلات الصعبة وتقصر من إمكانية الحصول على عوامل النشاط. [4] قد تعزز كيمياء الحماية وإزالة مجموعات الحماية ردود فعل جانبية مثل تكوين الأسبارتيميد. [5] [6] قد تتغير ظروف التفاعل المتسلسل لتغير درجة التراكما أو تركيبة الملوثات. [7] قد تؤثر ظروف فصل المواد على تركيبة المنتج الخام بشكل إضافي. [8]
ولهذا فإن البناء الصحيح للشبكة لا يعني الحصول على بروتين نقي ومعروف جيداً.
استعادة المنتج الخام والتنقية والخصائص الهيكلية تظل مراحل منفصلة. يمكن أن توفر الكروماتوغرافيا معلومات عن تركيب المزيج ونقائه، في حين توفر قياسات الكتلة وغيرها من الطرق التحليلية معلومات عن هوية المادة. لا يجب أن يؤكد أي نتيجة تحليلية واحدة جميع جوانب بنية الحمض الأميني. [9] [12]
تشير التوليفات المائية الآلية الحديثة إلى أنه يمكن تطبيق SPPS حتى على سلاسل طويلة جدًا، بشرط توفّر الظروف المناسبة. [10] وفي الوقت نفسه، تُظهر الببتيدات المعقدة هيكليًا مثل الإديرمينة أن إعادة إنتاج السلسلة الأمينية الخطية بمفرده قد لا يكون كافيًا إذا كانت الجزيء الناضج يحتوي على حلقات إضافية أو بقايا غير عادية أو نظام محدد من الروابط. [11]
من الأفضل فهم SPPS ليس كرد فعل فردي، بل كسلسلة من المراحل الكيميائية والتحليلية المنفصلة.
يحدد الربط نقطة البداية. وتُعد دورات التأمين والفك والربط المتكررة بناءً على سلسلة مُخطط لها. ويُحرر فصل المنتج عن المكونات غير المرغوب فيها. ثم تُستخدم المعالجة لتفريق المكون المستهدف عن المكونات غير المرغوب فيها. ثم تُحدد الخصائص النهائية ما إذا كان المادة المعزولة فعليًا تتمتع بالتركيب والجودة الممنوحة لها بالفعل.
تُتيح تمييز هذه المراحل تجنب العديد من سوء الفهم الشائع: لا يؤكد التفاعل الناجح تلقائيًا على النقاء، ولا تؤكد الكفاءة العالية تلقائيًا على الذاتية، كما أن الكتلة الجزيئية المتوقعة في حد ذاتها لا تُثبت تمامًا صحة التركيب.
المراجع
- كوين، إي., بييرمان، م., وبييرنتر، م. (2007). تصنيع الببتيدات في المرحلة الصلبة: من الإجراءات القياسية إلى تصنيع السلسلات المعقدة. بروتوكولات الطبيعة، 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- أمدي-كامالو، س.، كلارك، H.، ماكروبي، M.، ومورتيور، J.، نورث، M.، ران، Y.، روتليدج، A.، سيببادل، D.، تيكياس، M.، تس، K.، ويلي، H. (2020). دراسة متطلبات تؤثر على انكماش الراتنج في المذيبات الخضراء. كيمياء أوبن، 9(4), 431–441. https://doi.org/10.1002/open.202000030
- آدامسون، ج. جي.، هوانغ، تي.، كريفيتشي، أ.، ولافوي، ج. أ. (1992). استخدام مادة المارفي لإحصاء التمزق عند ربط الأحماض الأمينية بالدعم الصلب من أجل تحويلها إلى بروتينات. الكيمياء التحليلية، 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- كابورالي، أ.، ودوتي، ن.، وساندومينيكو، أ.، وروفو، م. (2017). تقييم الاستخدام المتزامن لـ Oxyma وHATU في تجميع تسلسلات الببتيد. مجلة علم الببتيدات، العدد 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- مرجلر، M., ديك، F., ساكس، B., ويلر، P., وفورهر، T. (2003). مشكلة الأسباراميد في التقنيات السطحية عالية الفعالية بالاستخدام الفموي. الجزء الأول. مجلة علم الببتيدات، العدد 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- مرجلر، M., ديك، F., ساكس، B., ستيهلين، C., وفورهر، T. (2003). مشكلة الأسباراميد في التقنيات السطحية الحرارية القائمة على Fmoc. الجزء الثاني. مجلة علم الببتيدات، العدد 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- بالاسيك، S. A., كوكس، Z. J., وكولينز، J. M. (2007). الحد من التفاعل التراكمي وتكوين الأسبارميد في عملية تحويل الفاموك إلى شكل صلب عن طريق الميكروويف. مجلة علوم الببتيدات، 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- باولاس، ج.، وسينسون، ت.، وراسموسن، ج. ه. (2019). 1,4-بيزينيديميثانتيول (1,4-BDMT) كمنظف لشققات راتنج الببتيد الأخضر. تقدم RSC، 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- ماكليوب، ك. وديفيدسون، و. وهانسن، ج. وفريمان، د. وبالي، بي. (1991). وصف المنتجات الخام الناشئة عن عملية إنتاج الببتيدات في المرحلة الصلبة باستخدام أجهزة المسح الضوئي الكتلي للذرات المتسارعة (mu-HPLC/fast atom bombardment mass spectrometry). الباحثون في مجال الببتيدات، 4(1), 40–46. مجلات PubMed
- هارترامفف، ن.، سابي، أ.، بوسيت، م.، غيتس، ز. بي.، كالفن، أ. جيه، كوفر، أ. إي، هانا، س.، أنتيلا، س.، شيسيل، ك. ك.، كوارتاراورو، أ. جيه، يي، إكس.، مياليس، أ. جيه، سيمون، م. د.، لوأس، أ. جيه، ليوس، س.، جيسن، تي. إي، وبنتلوت، بي. إل. (2020). تخليق البروتينات عن طريق الكيمياء التدفقية الآلية. العلوم، 368(6494), 980–987. https://doi.org/10.1126/science.abb2491
- ألغايير، ه.، يونغ، غ.، ورنر، آر. جي، شنايدر، يو.، زيهنر، ه. (1986). إيبيديرمين: ترميز مركب أميد رباعي السلسلة ثلاثية الهيدراتيك 21. مجلة المجلة الأوروبية للكيمياء الحيوية، العدد 160(1), 9–22. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1986.tb09933.x
- ميازاوا، ت.، أوتوماتسو، ت.، يامامادا، ت.، وكواتا، س. (1992). دراسات التراكمية في تصنيع الببتيدات من خلال فصل الببتيدات الإبيريمية المحمية باستخدام كيتوشيكرول عالي الأداء عكسي المرحلة. مجلة الأبحاث الدولية للبروتينات والبروتينات الطبية، 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x