Cietfāzes peptīdu sintēze, ko visbiežāk apzīmē ar saīsinājumu SPPS (no angļu valodas: solid-phase peptide synthesis), ir ķīmiska peptīdu veidošanas metode aminoskābe pēc aminoskābes, kamēr augošās ķēdes viens gals paliek ķīmiski saistīts ar nešķīstošunesēju.
Tā vietā, lai izolētu jaunizveidoto peptīdu pēc katras reakcijas, ķīmiķi atstāj to piesaistītu cietajai fāzei, secīgi ievadot un aizvācot šķidros reaģentus un skalošanas šķīdumus. Atkārtoti cikli ļauj atsegt reaktīvo aminogrupu, pievienot nākamo aminoskābi un atbrīvoties no šķīstošajiem komponentiem, kas vairs nav nepieciešami. Kad plānotā aminoskābju secība ir izveidota, peptīdu var atdalīt no nesēja un pēc tam pakļaut turpmākai apstrādei un analīzei.
Šāda procesa organizācija ir viens no galvenajiem iemesliem, kāpēc SPPS ir kļuvusi par tik nozīmīgu metodi peptīdu ķīmijā. Cietā fāze vienkāršo vairāku atkārtotu ķīmisko operāciju veikšanu un ir padarījusi iespējamu sintēzes automatizāciju.
Tomēr ērtā cietās fāzes sintēze negarantē ķīmisku pilnību.
Augošā peptīda pievienošana nesējam negarantē, ka katra ķēde saņems visas ieplānotās aminoskābes. Tas arī nenozīmē, ka procesa beigās atbrīvotais materiāls būs ķīmiski tīrs vai tam būs pareizā struktūra.
Ķēdes montāža, produkta atšķelšana un reģenerācija, attīrīšana, identitātes apstiprināšana un galvenais strukturālais raksturojums ir veselā procesa atsevišķas daļas.
Mūsdienu metodoloģiskās publikācijas parāda gan SPPS lietderību, gan nepieciešamību modificēt standarta metodes sarežģītu secību gadījumā. Piemēram, vienā no publicētajām metodēm, kurā izmantota Fmoc stratēģija, ir aprakstīta gan rutīnas sintēze, gan modificēta pieeja pret agregāciju jutīgām peptīdu secībām. [1]
Tāpēc SPPS izpratne prasa vairāk nekā tikai ķīmisko posmu iegaumēšanu. Ir jāzin arī katra posma mērķis, kas tajā var noiet greizi un uz kādiem analītiskajiem jautājumiem joprojām ir jāatbild pēc tā pabeigšanas.
Cietfāzes peptīdu sintēze ir metode, kurā peptīdus sintezē, pievienojot aminoskābes secīgi vienu otrai pie nešķīstoša polimēra nesēja (cietās fāzes).
Topošais peptīds paliek piesaistīts, un šķīdumi mainās
Parastajā cietfāzes peptīdu sintēzē (SPPS) peptīds ir ķīmiski saistīts ar nelielām, nešķīstošām daļiņām, ko parasti sauc par sveķu graudiņiem, izmantojot piemērotu ķīmisko saiti.
Graudi paliek reakcijas sistēmā, kamēr nākamie šķidrie reaģenti un skalošanas šķīdumi tiek ievadīti un novadīti.
Tas ievērojami vienkāršo atkārtojamu sintēzi.
Klasiskajā, pakāpeniskā šķīduma sintēzē augošā peptīda izolēšana un attīrīšana pēc katras aminoskābes pievienošanas var būt apgrūtinoša. SPPS (cietfāzes peptīdu sintēzē) veidojošā ķēde paliek saistīta ar nešķīstošu fāzi. Tādējādi šķīstošos reaģentu pārākumus un daudzus blakusproduktus var noņemt, veicot skalošanu, kamēr pie sveķiem piesaistītais peptīds paliek savā vietā.
Tomēr apzīmējums „cietā fāze” var radīt pārpratumus.
Tas nenozīmē, ka peptīdsaišu veidošanās notiek bez šķidruma vai šķīdinātāja līdzdalības.
Sveķi parasti atrodas šķidrā reakcijas vidē, un to mijiedarbība ar šķīdinātāju var būtiski ietekmēt sintēzes gaitu. Reaģentiem joprojām ir jāpārvietojas polimēra vidē vai ap to un jāsasniedz augošā peptīda reaktīvie centri.
Peptīda pievienošana nesējam parasti ir kovalenta rakstura. Tas nozīmē, ka izveidojusies molekula ir savienota ar nesēju, izmantojot saistvielu un ķīmisko saiti.
Tāpēc peptīds nav vienkārši iesprostots starp daļiņām, aizturēts ar filtru vai brīvi novietots uz virsmas.
Šāds ķīmiskais savienojums tiek mērķtiecīgi izstrādāts tā, lai iegūtā ķēde paliktu saistīta nākamo reakciju un skalošanas posmu laikā un vēlāk to varētu atbrīvot piemērotos apstākļos.
Konvencionālā sintēze notiek no C-gala uz N-galu
Klasiskā lineārā SPPS stratēģija parasti sākas no aminoskābes, kas gatavajā peptīdā veidos tā C-galu.
Atlikusī daļa tiek pievienota datu nesējam.
Pēc attiecīgās reaktīvās aminogrupas atsegšanas tiek ievadīts nākamais aizsargātais aminoskābe un ķīmiski pievienots augošajai ķēdei. Šī procesa atkārtošana pakāpeniski pagarinā peptīdu N-gala virzienā.
Šo virzienu ir vērts uzsvērt, jo tas atšķiras no bioloģiskās olbaltumvielu sintēzes ar ribosomām.
Ribosomālā sintēze pagarina polipeptīdu no N-gala uz C-galu. Parastā pakāpeniskā SPPS parasti veido secību pretējā virzienā.
Tomēr galīgā aminoskābju secība var būt identiska. Atšķiras tās uzbūves veids.
Šeit izšķirošs ir termins „konvenciālā”, jo peptīdu ķīmija ietver arī specializētas stratēģijas, kurās izmanto alternatīvas piesaistes vietas, fragmentu montāžu, ligēšanas reakcijas un citus netradicionālus risinājumus.
Virziena apraksts no C- līdz N-galam tātad attiecas uz tipisku pakāpenisku SPPS procesu, nevis uz visām iespējamām cietfāzes peptīdu ķīmijas metodēm.
SSPS ir tikai viens no peptīdu sintēzes elementiem
Cietsfāzes sintēze nav vienīgais veids, kā iegūt peptīdus.
Peptīdus var iegūt arī, izmantojot ķīmisko sintēzi šķīdumā, bioloģiskās ekspresijas sistēmas, enzīmu transformācijas, fragmentu ligāciju vai dažādu metožu kombinācijas.
SPPS ir īpaši noderīga, ja ir nepieciešama kontrolēta secības salikšana un aizsargātu, modificētu vai citādi specializētu aminoskābju celtniecības bloku izmantošana.
Pat viena konkrēta peptīda projekta ietvaros ne siempre ir jāizmanto viena un tā pati metode no sākuma līdz beigām.
Atsevišķus peptīda fragmentus var piemēram sintezēt uz sveķiem, atsevišķi attīrīt un pēc tam savienot ar citu ķīmisku metodi. Citām molekulām pēc sākotnējās lineārās secības iegūšanas var būt nepieciešama locīšana, oksidēšana, ciklizācija vai papildu strukturālas pārvērtības.
Tāpēc pareizā ceļa izvēle ir atkarīga no mērķa molekulas, tās strukturālās sarežģītības, kā arī projekta analītiskajām un kvalitatīvajām prasībām.
Procesu ir vērts apskatīt kā secīgu jautājumu sēriju.
Piesaistīšana nesējam iezīmē sākumpunktu un ietekmē produkta vēlāko atbrīvošanas ķīmiju. Tomēr joprojām ir jānosaka, vai piesaistīšana notikusi pareizi un vai ir saglabāta stereoķīmiskā integritāte.
Ķēdes sintēzei ir jānovodina līdz aminoskābju pievienošanai paredzētajā secībā. Tomēr pēc tam ir jāpārbauda, vai visas ķēdes ir reaģējušas pareizi un vai nav radušanās secības ar trūkstošām aminoskābēm, saīsināti vai modificēti produkti.
Atšķelšana un aizsarggrupu noņemšana ir paredzēta peptīda atbrīvošanai un noteiktu ķīmisko aizsarglīdzekļu noņemšanai. Tomēr pati produkta veiksmīga atbrīvošana nenorāda, kādas citas vielas atrodas izejmateriālā.
Attīrīšana kalpo tam, lai atdalītu vēlamo materiālu no nevēlamajām sastāvdaļām, taču pat attīrītai frakcijai joprojām ir nepieciešams apstiprināt identitāti un novērtēt kvalitāti.
Savukārt galvenā strukturālā un analītiskā raksturojuma uzdevums ir atbildēt uz jautājumu, vai izolētajam materiālam piemīt mērķa peptīdam paredzētās ķīmiskās īpašības un vai izmantotās analītiskās metodes ir piemērotas paredzētajam lietojumam.
Šie ir konceptuāli posmi, nevis laboratorijas instrukcija. Konkrētie reaģenti, aparatūra un reakcijas apstākļi ir atkarīgi no mērķa peptīda un prasa attiecīgi izstrādātu un validētu metodi.
Pievienošana sveķiem un ķēdes montāža
Sveķi, savienotājs un aizvietošanas pakāpe pilda dažādas funkcijas
Diskusijās par SPPS bieži parādās trīs termini: sveķi, saistviela un aizvietošanās pakāpe jeb loading.
Tās apraksta saistītas, bet dažādas īpašības.
Sveķi ir nešķīstošs materiāls, kas kalpo par nesēju.
Savienotājs nodrošina ķīmisko saikni starp šo nesēju un peptīdu vai pirmo aminoskābes atlikumu. Tā ķīmiskais sastāvs var ietekmēt gan peptīda piesaistīšanas veidu, gan tā vēlāku atbrīvošanu.
Savukārt noslodze apraksta reaktīvo piesaistes vietu skaitu attiecībā pret nesēja daudzumu.
Šie jēdzieni nav sinonīmi.
Divi sveķi fiziski var izskatīties ļoti līdzīgi, bet vienlaikus tiem var būt dažādas funkcionālās grupas, saistvielas vai aizvietošanas pakāpe. Šīs atšķirības var ietekmēt reaktīvo vietu pieejamību ķēdes montāžas laikā, sveķu uzbriešanu un galīgā peptīda ķīmisko formu pēc atšķelšanas.
Vēl viens svarīgs elements ir plānotā grupa C galā.
Dažādas nesēja un saistvielas sistēmas var izvēlēties, piemēram, tā, lai iegūtu peptīdu ar karboksilgrupu vai amīdgrupu galā.
Tā ir būtiska ķīmiska atšķirība.
Terminālās grupas maiņa nozīmē pašas molekulas maiņu, nevis tikai tās iepakošanas vai aprakstīšanas veidu.
Uzbriešana ietekmē piekļuvi pievienotajām ķēdēm
Daudzi SPPS izmantotie sveķi absorbē šķīdinātāju un uzbriest pēc saskares ar piemērotu šķidro vidi.
Tas maina polimēru vidi un var palielināt vai samazināt telpu, caur kurai izšķīdinātajiem reaģentiem ir jāpārvietojas, lai sasniegtu ar sveķiem saistītās peptīdu ķēdes.
Tāpēc uzbriešana nav tikai fiziska parādība.
Tas var ietekmēt reaktīvo grupu pieejamību sintēzes laikā.
Sistemātiska uz polistirolu un PEG balstīto nesēju izpēte parādīja, ka tādas īpašības kā saistvielas veids un sveķu aizvietošanas pakāpe būtiski ietekmēja uzbrišanu pētītajos videi draudzīgākajos šķīdinātājos. Tika arī konstatēts, ka uzbrišana var mainīties aizsarggrupu noņemšanas laikā, kā arī pagarinot peptīdu ķēdi. [2]
Tas parāda, ka sveķu uzvedību ne همیشه vienmēr var uzskatīt par to pastāvīgu īpašību.
Praktiski tas ir atkarīgs no sveķu, šķīdinātāja, saistvielas, piesaistītā peptīda un pašreizējā sintēzes posma mijiedarbības.
Laba uzbriešana vai labvēlīga reakcijas gaita vienai sveķu, šķīdinātāja un peptīda kombinācijai tāpēc nenozīmē, ka cita kombinācija uzvedīsies identiski.
Arī pieslēgšanas posmam ir nepieciešama kvalitātes kontrole
Pirmais pievienošanas posms var šķist vienkāršs, jo peptīdu ķēde tikai sākst veidoties.
Tomēr šajā posmā pieļautā kļūda var saglabāties visā turpmākajā sintēzē.
Ja pirmais atlikums tiks piesaistīts nepareizi vai šī procesa laikā mainīsies tā stereochemiskā konfigurācija, pareiza visu nākamo atlikumu pievienošana var neatrisināt sākotnējo problēmu.
1992. gada pētījumā tika izstrādāta analītiskā metode, kas īpaši paredzēta racemizācijas mērīšanai, kuranotiek, pievienojot aizsargātas aminoskābes cietajiem nesējiem. [3]
Šī darba nozīme sniedzas tālāk par pašu izmantoto analītisko metodi.
Tas liecina, ka stereochemiskā kvalitāte var būt jākontrolē jau pirms atkārtotu ķēdes pagarināšanas cēlienu uzsākšanas.
Arī sākotnēji pie nesēja pievienotā materiāla daudzums prasa pareizu interpretāciju.
Sveķu nominālā aizvietošanas pakāpe, eksperimentāli izmērītā noslodze, pēc atšķelšanas atgūtā izejmateriāla daudzums un izolētā un attīrītā peptīda gala iznākums ir dažādi lielumi.
Tos nevajadzētu uzskatīt par savstarpēji aizvietojamiem sintēzes panākumu rādītājiem.
Garākas ķēdes var kļūt grūtāk pieejamas
Pagarinot peptīdu ķēdi, pati piesaistītā molekula sāk ietekmēt savu ķīmisko vidi.
Blakus esošās ķēdes var mijiedarboties cita ar citu, izmantojot ūdeņraža saites, hidrofobās mijiedarbības un citus starpmolekulāros spēkus. Dažām secībām var būt īpaši spēcīga tieksme uz šādām mijiedarbībām.
Tas var ierobežot piekļuvi reaktīvajām grupām.
Šādā situācijā nākamās aminoskābes pievienošana var kļūt apgrūtināta, pat ja sistēmā ir ieviests šķietami pietiekams savienojošā reaģenta daudzums.
Pētījumā par grūtām, uz agregāciju tendētām sekvencēm tika salīdzinātas dažādas saistīšanas metodes un analizēti iegūtie neapstrādātie produkti. Rezultāti apstiprina principu, ka process ir jāpielāgo konkrētai sekvencei, nevis jāpieņem, ka pastāv viena saistīšanas stratēģija, kas vienmēr ir vislabākā. [4]
Tas arī izskaidro, kāpēc vienkārša sveķu aizvietošanas pakāpes vai reaģenta daudzuma palielināšana automātiski neatrisina visas problēmas.
Ja galvenā problēma ir ierobežota piekļuve reaģējošajām vietām, par jautājumu par pievienotā reaģenta daudzumu svarīgāks kļūst jautājums par to, vai tas patiešām ir piekļuvis attiecīgajām vietām un vai reakcija ir norisinājusies efektīvi, neradot nepieņemamu blakusproduktu daudzumu.
Nostiprināšana, aizsarggrupu noņemšana un savienošana
Aizsarggrupas kontrolē reakcijas norises vietu
Aminoskābes satur ķīmiskas grupas, kas spēj piedalīties dažādās reakcijās.
Veicot kontrolētu peptīdu sintēzi, ķīmiķi parasti vēlas, lai noteikta aminogrupa reaģētu ar konkrētu blokveida savienojumu, kas satur karboksilgrupu, bet citas potenciāli reaģētspējīgas vietas paliek īslaicīgi neaktīvas.
Tieši tam ir paredzētas aizsardzības grupas.
Tie īslaicīgi bloķē noteiktas reaktīvās vietas, ļaujot citai vietai piedalīties plānotajā reakcijā.
Plašā lietotajā uz Fmoc balstītajā SPPS stratēģijā augošās ķēdes gala amingrupa starp secīgiem pievienošanas posmiem paliek aizsargāta. Kad jāpievieno nākamā aminoskābe, pagaidu aizsarggrupa tiek noņemta, atsedzot amingrupu.
Reaktīvām sānu ķēdēm var būt atsevišķas aizsarggrupas, kas izstrādātas tā, lai tās paliktu neskartas galvenās ķēdes veidošanas atkārtoto ciklu laikā.
Mērķis ir kontrolēta selektivitāte.
Atbilstošam blokam, kas satur karboksilgrupu, ir jāsavienojas ar atbilstošo aminogrupu, nevis jāizraisa nekontrolēta sazarošanās vai citas konkurējošas reakcijas.
Ortogonalitāte nozīmē iespēju selektīvi noņemt drošības līdzekļus
Ortogonālā aizsardzības grupu stratēģija ļauj noņemt vienu aizsardzības grupu apstākļos, kuros citi nepieciešamie drošības pasākumi paliek pietiekami neskarti.
Tas sniedz ķīmiķim iespēju kontrolēti atsegt dažādas reaktīvās vietas sintēzes atsevišķos posmos.
Fmoc un Boc ir labi pazīstami apzīmējumi peptīdu ķīmijā, taču tie nenorāda uz dažāda veida peptīdu saitēm vai dažādām peptīda gala struktūrām.
Šīs ir aizsarggrupas, kas saistītas ar dažādām sintēzes stratēģijām un dažādām to noņemšanas metodēm.
Tāpēc pagaidu ķīmisko ceļu, ko izmanto peptīda sintēzes laikā, vajadzētu atšķirt no tā galīgās struktūras.
Drošības pasākumi arī nenodrošina pilnīgu aizsardzību pret visām iespējamām blakusparādībām.
Pētījumi par aspartimīda veidošanos, piemēram, parāda, ka aizsardzības stratēģija, blakus esošie aminoskābju atlikumi un aizsarggrupu noņemšanas apstākļi var ietekmēt piemaisījumu veidošanos pat labi zināmās SPPS metodēs. [5] [6]
Aizsarggrupu stratēģija tātad ierobežo noteiktas nevēlamas reakcijas, bet neanulē nepieciešamību pēc procesa kontroles vai galīgās analītiskās raksturošanas.
Sasaistīšana veido nākamo peptīda mugurkaula amīda saiti
Savienošanas reakcija noved pie nākamās amīda saites izveidošanās peptīda karkasā.
Aminoskābes bloks, kas satur karboksilgrupu, parasti tiek ķīmiski aktivēts, lai tas varētu efektīvi reaģēt ar sveķiem piesaistītā augošā peptīda atklāto aminogrupu.
Pēc savienošanas noslēgšanas šķīstošo materiāla pārpalikumu var noņemt, noskalojot.
Jaunpievienotā aminosābe kļūst par augošās ķēdes gala atlikumu. Pēc tam tās aminogupu var atbrīvot un sākt nākamo saistīšanas ciklu.
Teorētiski šīs sekvenšu atkārtošana ļauj kontrolēt aminoskābju secību, kontrolējot celtniecības bloku ievadīšanas secību.
Praksē tomēr pastāv ļoti svarīgs iebildums:
plānotajai ķīmiskajai reakcijai patiešām ir jānoris pareizi katrā ciklā.
Ja viena sakabe nav pilnīga, daļa ķēžu var saņemt plānoto atlikumu.
Ja tās paliek saistītas ar sveķiem un nākamajā ciklā pareizi reaģē, var veidoties delecijas sekvences jeb peptīda molekulas, kurām trūkst vienas vai vairāku paredzēto aminoskābju.
Citi ķēdes var palikt saīsināti.
Skalošana aizvāc šķīstošos reaģentus un blakusproduktus, bet selektīvi neeliminē visas nepareizi uzbūvētās ķēdes, kas joprojām ir kovalenti saistītas ar nesēju.
Nelieli zaudējumi var uzkrāties daudzos ciklos
SPPS atkārtojošais raksturs rada būtisku matemātisku problēmu.
Neliela viena posma nepilnība var šķist nesvarīga, taču pēc daudziem atkārtojumiem tās sekas var uzkrāties.
Apskatīsim vienkāršu matemātisku piemēru.
Ja peptīdu sintēzei būtu nepieciešami 50 savienošanas posmi un katra posma veiksmīgas pabeigšanas neatkarīgā varbūtība būtu 99%, tad teorētiskais molekulu īpatsvars, kas sekmīgi izturētu visus 50 posmus, būtu aptuveni 60,5%.
Šī ir tikai ilustrācija.
Tā pieņem, ka visi posmi uzvedas identiski un neatkarīgi. Tā neņem vērā aizsarggrupu noņemšanas problēmas, blakusreakcijas, zudumus atšķelšanas un attīrīšanas laikā, agregāciju vai daudzus citus reālos faktorus.
Tāpēc šo rezultātu nevajadzētu interpretēt kā reālās ražošanas efektivitātes prognozi.
Piemērs parāda tikai to, kāpēc pat ļoti augsta atsevišķu posmu iznākums negarantē ķīmiski vienkāršu jēlproduktu pēc vairākiem desmitiem atkārtojumu.
Tāpēc sintēzes uzraudzība un piemaisījumu kontrole ir būtiska visa peptīda montāžas procesa laikā, nevis tikai pēc pēdējās aminoskābes pievienošanas.
Automatizācija, apkure un citi tehnoloģiskie risinājumi var paātrināt sintēzi, taču procesa ātrums vienmēr ir jāizvērtē kopā ar produkta kvalitāti.
Mikroviļņu atbalstītas SPPS pētījumā tika analizēta no atlikuma veida atkarīgā racemizācija un aspartimīda veidošanās, parādot, kāpēc reakcijas apstākļi joprojām ir jāpielāgo konkrētās sekvences īpašībām. [7]
Neapstrādātā produkta atdalīšana un reģenerācija
Atšķelšana atbrīvo produktu no nesēja
Pēc plānotās sekvences uzbūvēšanas peptīds parasti ķīmiski jāatdala no nesēja.
Šo posmu dēvē par *cleavage* jeb šķelšanu.
Atšķelšana pārtrauc apzināti izveidoto ķīmisko saiti starp peptīdu un nesēju.
Atkarībā no izmantotās stratēģijas atšķelšana var notikt vienlaikus ar dažu vai visu sānu ķēžu aizsarggrupu noņemšanu. Citos procesos peptīds vai tā fragments var tikt atbrīvots, saglabājot dažas aizsardzības, ja ir plānotas turpmākas ķīmiskas pārvērtības.
Piemērota atbrīvošanas ķīmija ir atkarīga no saistītājelementa un mērķa molekulas.
Apstākļi, kas sekmīgi atbrīvo vienu peptīdu, var ķīmiski sabojāt jutīgu grupu citā.
Tāpēc atšķelšana apraksta ķīmisko mērķi, nevis vienu universālu reaģentu vai apstākļu kopumu, kas piemērots visiem peptīdiem.
Līdzīgi, pareiza peptīda skeleta uzbūve nepierāda, ka visas aizsarggrupas pēc tam tika veiksmīgi noņemtas.
Ķēdes salikšana un gala aizsarggrupu noņemšana atbild uz dažādiem ķīmiskiem jautājumiem un prasa atsevišķu novērtējumu.
Atšķelšanas apstākļi var ietekmēt piemaisījumu profilu
Atdalīšana nav obligāti ķīmiski neitrāls posms.
Aizsarggrupu noņemšana un peptīda saites pārraušana ar nesēju var izraisīt reaktīvu ķīmisku formu veidošanos, kas spēj modificēt peptīdu vai citas maisījuma sastāvdaļas.
Tāpēc izstrādātajās metodēs var tikt izmantoti t.s. skavenderi jeb savienojumi, kas saista noteiktus nevēlamus reaktīvus produktus un ietekmē blakusproduktu veidošanos.
2019. gada pētījumā tika analizēti dažādi saistītāji (skavendžeri) eksenatīda atšķelšanas laikā no peptīda sveķiem, un tika parādīts, ka to izvēle ietekmēja neapstrādātā produkta kvalitāti un novēroto piemaisījumu profilu. [8]
Uz šī pamata nevajadzētu veidot universālu atdalīšanas recepti.
Savukārt pētījums parāda, ka šī posma apstākļi var ietekmēt produkta kvalitāti, un tāpēc tie ir jānovērtē konkrētajam peptīdam un izmantotajai aizsarggrupu sistēmai.
Tāpēc pareizam atdalīšanas procesam ir vairākas dimensijas.
Peptīdam jābūt atbilstoši atdalītam, nepieciešamajām aizsarggrupām jābūt noņemtām, mērķmateriālam jābūt atgūtam, un nevēlamām ķīmiskajām pārvērtībām jābūt kontrolētām.
Neapstrādāta produkta iegūšana nav galīgā attīrīšana
Pēc atšķelšanas tiek veikts process, kas ļauj atdalīt peptīdu saturošo materiālu no cietajiem sveķiem un reakcijas maisījuma atlikušo sastāvdaļu daļas.
To var izdarīt, izmantojot šķīdības, gaistamības vai citu ķīmisko īpašību atšķirības.
Tomēr redzama nogulsnējuma vai peptīdu saturošas frakcijas iegūšana nepierāda, ka materiāls sastāv tikai no paredzētā produkta.
Šajā posmā parasti runā par neapstrādātu peptīdu.
Tas var saturēt mērķa molekulu kopā ar delecijas sekvencēm, saīsinātām ķēdēm, ķīmiski modificētiem peptīdiem, nepilnīgi atbloķētām strukturām, reaģentu izcelsmes materiāliem un citiem piemaisījumiem.
Atsevišķu piemaisījumu nozīme ir atkarīga no secības, sintēzes apstākļiem un paredzētā lietojuma.
Vienā no pētījumiem hromatogrāfiskā atdalīšana tika savienota ar masu spektrometriju, lai raksturotu neapstrādātus SPPS produktus un atsevišķiem hromatogrāfiskajiem pikiem piesaistītu noteiktus peptīdus. [9]
Tas parāda, kāpēc separācijas un strukturālās metodes iegūtā informācija savstarpēji papildinās.
Hromatogrāfija var uzrādīt daudzu komponentu klātbūtni, savukārt masas spektrometrija var sniegt papildu informāciju, kas palīdz noskaidrot, kas daži no tiem varētu būt.
Identitātes attīrīšana un apstiprināšana atbild uz dažādiem jautājumiem
Attīrīšanas mērķis ir mērķa molekulas bagātināšana vai izolēšana no citām sastāvdaļām.
Savukārt identifikācija atbild uz jautājumu, vai izolētajam materiālam patiešām piemīt gaidāmās ķīmiskās īpašības.
Šie jautājumi daļēji pārklājas, bet tie nav viens un tas pats.
Labi atdalīts hromatogrāfiskais pīķis automātiski nav pilnīgs molekulas struktūras pierādījums.
Līdzīgi arī sagaidāmās molekulmasas iegūde pati par sevi nav pilnīgs tīrības vai strukturālās pareizības novērtējums.
Cieši radniecīgi secības varianti, stereoizomēri vai ķīmiski modificētas formas var būt grūti atšķirami vai atdalāmi.
Tāpēc attīrīšanas metode būtu jāvērtē attiecībā pret reālo maisījumu, kas radies konkrētās sintēzes laikā, nevis jāuzskata par pietiekamu tikai tāpēc, ka tā ir devusi rezultātus cita peptīda gadījumā.
Ja gala molekulai pēc ķēdes montāžas pabeigšanas ir nepieciešama arī disulfīda tiltiņu veidošanās, ciklizācija vai cita transformācija, rodas papildu analītiskie jautājumi par savienojumu pareizību, strukturālo viendabīgumu un to, vai patiešām ir iegūta paredzētā nobriedusī molekulas forma.
Priekšrocības, ierobežojumi un piesārņojuma avoti
Kāpēc SPPS tiek tik plaši izmantota?
Viiena no svarīgākajām SPPS priekšrocībām ir iespēja noturēt augošo peptīdu uz nesēja vairākkārtējas šķidro reaģentu maiņas laikā.
Tas vienkāršo atkārtotas ķīmiskās operācijas un nodrošina automatizāciju.
Ķīmiķi var ieviest ieplānotu aminoskābju celtniecības bloku secību, un, ja procesa ķīmija to atļauj, arī dažas nestandarta aminoskābes un citas modifikācijas.
Mūsdienu automātiskās sistēmas parāda, cik tālu šo koncepciju var attīstīt.
2020. gada pētījumā par automatizēto plūsmas sintēzi tika aprakstīta olbaltumvielu ķēžu iegūšana, kas satur pat 164 aminoskābju atlikumus. Pēc tampasa attīrīšanas un locīšanas tika iegūti funkcionāli materiāli. [10]
Šis ir iespaidīgs tehnisko iespēju piemērs.
Tomēr tas nenozīmē, ka jebkuru 164 atlikumu garu secību — vai jebkuru garu peptīdu vai olbaltumvielu — var iegūt ar tādu pašu vieglumu.
Tas nenozīmē arī to, ka attīrīšana un strukturālā raksturošana kļūst lieka.
Pētījums drīzāk parāda, kādus rezultātus var sasniegt, pateicoties rūpīgi izstrādātai sistēmai atbilstoši izvēlētām molekulām.
Automātika kontrolē procesa izpildi.
Tomēr tā nespēj pārvērst nepiemērotu ķīmiju par piemērotu.
Tāpēc iekārtas veiktspēja, peptīda secība un pašas molekulas uzvedība ir jāanalizē kopsakarībā.
Kā rodas tipiskie piesārņotāji?
SPPS laikā var pastāvēt vairāki dažādi ceļi, kas noved pie netīrumu rašanās. To izpratne palīdz pamatot, kāpēc galīgie analītiskie pētījumi joprojām ir nepieciešami.
Dzēšanas sekcija vai saīsināts produkts var rasties, ja neizdodas plānotā aminoskābes pievienošana vai ja tiek pārtraukta ķēdes augšana. Tā kā nepareizā ķēde var joprojām palikt piesaistīta sveķiem, vēlāka skalošana to var neizskalot.
Epimerizācija nozīmē attiecīgā centra stereochemiskās konfigurācijas maiņu. Tam ir īpaša analītiskā nozīme, jo epimēram var būt tāda pati nominālā molekulmasa kā īstajam peptīdam, bet vienlaikus tā telpiskā konfigurācija var atšķirties.
Aspartamīda saistīti produkti var rasties secībai specifisku blakusreakciju rezultātā, kurās iesaistītas asparagīnskābes atliekas. Atkarībā no ķīmiskā procesa gaitas var rasties vairāk nekā viena veida šāds produkts.
Nepilnīga aizsarggruppu noņemšana rodas tad, kad grupa, kurai vajadzēja tikt noņemtai, paliek piesaistīta molekulai. Tādējādi peptīdam var būt nomināli paredzētais ķēdes garums, bet joprojām pastāvēt nepareiza ķīmiskā struktūra.
Modifikācijas, kas saistītas ar atšķelšanu, var parādīties peptīda gala atbrīvošanas vai aizsarggrupu noņemšanas laikā. Tāpēc pareiza ķēdes uzbūve negarantē, ka peptīds izturēs atšķelšanas posmu bez izmaiņām.
Savukārt nepilnīgas reakcijas, kas saistītas ar agregāciju, var rasties tad, kad veidojošās ķēdes mijiedarbojas savā starpā tādā veidā, kas ierobežo piekļuvi reaģējošajām vietām. Pietiekama reaģenta daudzuma ievadīšana reakcijas traukā negarantē, ka katra reaģējošā vieta ir fiziski pieejama un atbilstoši reaģē.
Šie ir iespējamie piesārņojuma rašanās ceļi.
Tas nenozīmē, ka katrai partijai, kas iegūta ar SPPS metodi, ir jāsatur visi minētie anomāliju veidi.
To nozīmi konkrētā sintēzē nosaka, pamatojoties uz zināšanām par procesu, analītiskajiem pētījumiem un atbilstošu kvalitātes kontroli.
Sarežģīti dabiskie peptīdi prasa ko vairāk nekā vienkārši secības atjaunošanu
Daži peptīdi ir strukturāli daudz sarežģītāki, nekā izrietētu tikai no to lineārās aminoskābju secības.
Labs piemērs ir epidermīns.
Epidermīna strukturālā raksturojums uzrādīja daudzu sēru saturošu gredzenu un neparastu atlikumu klātbūtni. [11]
Tāpēc pat aminoskābju lineārās secības atjaunošana nebūtu pietiekams pierādījums tam, ka ir iegūta īsta, nobriedusi epidermīna.
Šī atšķirība ir svarīga, interpretējot publikācijas vai meklējumus par epidermīna sintēzi uz cietās fāzes.
Publikācija var aprakstīt liniāru prekursoru, fragmentu, analogu vai citu saistītu struktūru, nevis verificētu pilnīgu nobriedušas molekulas sintēzi.
Strukturālā publikācija, kas šeit citēta kā [11], apraksta pašas epidermīna raksturlielumus; tā nav atskaite par tā kopējo sintēzi ar SPPS metodi.
Tāpēc apgalvojumi par totalitāro sintēzi ir jāvērtē attiecībā pret mērķa molekulas faktisko struktūru, nevis tikai tās aminoskābju lineāro secību.
Veiktspēja, tīrība un identitāte ir jāatspoguļo atsevišķi
Trīs jēdzieni, kurus peptīdu sintēzes diskusijās bieži jauc, ir iznākums, tīrība un identitāte.
Liela atgūtā produkta masa nebūt nenozīmē, ka lielāko daļu šī materiāla veido paredzētais peptīds. Neapstrādāts materiāls var saturēt ievērojamu daudzumu piemaisījumu.
Tikpat augsta hromatogrāfiskā tīrība automātiski neapstiprina visus strukturālās identitātes aspektus.
Pat nepeptīds, kura ķīmiskā struktūra ir precīzi raksturota, automātiski neiegūst apstiprinātu bioloģisko, terapeitisko vai klīnisko lietojumu.
Tie ir dažādi jautājumi.
Tāpēc uzticamam sintēzes aprakstam vajadzētu norādīt, kāda bija mērķa molekula, kurā posmā tika mērīta iznākums, vai analizētais materiāls bija neapstrādāts vai attīrīts, un kādi analītiskie dati tika izmantoti, lai apstiprinātu apgalvojumus par struktūru.
Pateicoties tam, sintēzes rezultātus var interpretēt un salīdzināt ticamākā veidā.
Vienu procentuālo vērtību vai masas vērtību nevajadzētu pārvērst vispārējā apgalvojumā, ka peptīds ir „augstas kvalitātes”, nezinot, kas patiesībā ir izmērīts.
Biežāk uzdotie jautājumi
1. Kāpēc SPPS izmanto cieto fāzi?
Cietā fāze notur veidojošos peptīdu uz nesēja, kamēr šķīstošos reaģentus, reakcijas blakusproduktus un skalošanas šķīdumus var vairākkārt ievadīt un aizvākt. Tas būtiski vienkāršo atkārtotu ķēdes montāžu un nodrošina peptīdu sintēzes automatizāciju, ko ilustrē mūsdienu zāģētās plūsmas sintēzes metodes. [10] Tomēr nesējs negarantē, ka katra reakcija noritēs ideāli, kā arī neatdala nepareizi uzbūvētu, ar sveķiem saistītu ķēdi no pareizās. Tā galvenā priekšrocība ir procesa norises vienkāršošana. Ķīmiskā selektivitāte, reakcijas pilnīgums, tīrība un struktūras identitāte joprojām prasa atsevišķu novērtējumu.
2. Vai cietfāzes sintēze novērš attīrīšanas nepieciešamību?
Nē. Nepareizas peptīdu ķēdes var palikt piesaistītas pie sveķiem sintēzes laikā un pēc tam tikt atdalītas kopā ar paredzēto produktu. Pētījumi, kuros analizēti neapstrādāti SPPS produkti, izmantojot hromatogrāfiju un masu spektrometriju, parāda, ka skalošana sintēzes laikā un galīgā attīrīšana pilda dažādas funkcijas. [9] Skalošana galvenokārt izvarta šķīstošās sastāvdaļas ap sveķiem, savukārt attīrīšana pēc atšķelšanas ir paredzēta, lai atdalītu vēlamo peptīdu no nevēlamajām peptīdu un nepeptīdu sastāvdaļām. SPPS vienkāršo starpposma darbības, taču negarantē galīgo tīrību.
3. Vai „cietā fāze” nozīmē, ka šķīdinātājs netiek izmantots?
Nē. Konvencionālā SPPS nešķīdināmais nesējs parasti ir ieskauts ar šķidriem reaģentiem un šķīdinātājiem. Šķīdinātāji ietekmē sveķu fizisko vidi, tostarp to uzbriešanas pakāpi un vieglumu, ar kādu reaģenti var piekļūt piesaistītajām ķēdēm. Eksperimentālie pētījumi ir uzrādījuši no šķīdinātāja atkarīgu sveķu uzbriešanu, kā arī izmaiņas, kas saistītas ar saistvielas ķīmiju, aizvietošanas pakāpi un ķēdes pagarināšanu. [2] Tādējādi sveķi un šķīdinātājs kopā veido reakcijas vidi.
4. Kurā virzienā aug peptīds SPPS laikā?
Parastā pakāpeniskā SPPS parasti veido peptīdu no tā C-gala atlikuma N-gala virzienā. Pirmais aminoskābes atlikums, kas veidos gatavās molekulas C-galu, tiek piesaistīts pie nesēja, un nākamie atlikumi pagarina ķēdes atklāto amingalu. Publicētās metodes, kuru pamatā ir Fmoc, demonstrē šo tipisko shēmu. [1] Tomēr pastāv specializētas cietfāzes stratēģijas, kas var norisināties citādi.
5. Vai sveķi un savienotājs nozīmē to pašu?
Nē. Sveķi ir nešķīstošs nesējs, savukārt saistviela veido ķīmisku saiti starp nesēju un augošo peptīdu. Saistvielas funkcionalitāte var neatkarīgi no paša polimēra ietekmēt piesaisti, sveķu uzvedību un turpmāko peptīda atbrīvošanu. Pētījumi par nesējiem, ko izmanto peptīdu sintēzē, parāda, kāpēc ar vienkāršu sveķa veida norādīšanu var nepietikt, lai raksturotu visas sistēmas uzvedību. [2]
6. Vai lielāka sveķu aizvietošanas pakāpe vienmēr palielina ražošanu?
Nē. Augstāka noslodze nozīmē lielāku potenciālo piesaistes vietu skaitu uz noteiktunesēja daudzumu, taču tā neobligāti nodrošina lielāku pareizi uzbūvēta un atgūstama peptīda daudzumu. Aizvietošanas pakāpe var mainīt vietējo molekulāro vidi, un eksperimentāli tā ir norādīta kā viens no faktoriem, kas ietekmē sveķu uzbriešanu. [2] Ja piesaistītās ķēdes ir pārmērīgi blīvas vai savstarpēji spēcīgi mijiedarbojas, reaģētspējīgo vietu pieejamība var pasliktināties. Tāpēc noslodze ir jāanalizē kopā ar sveķu īpašībām, sekvences uzvedību, reakcijas iznākumu un galaprodukta kvalitāti.
7. Kāpēc aminoskābes tiek aizsargātas peptīdu sintēzes laikā?
Aizsarggrupas īslaicīgi neļauj izvēlētām reaktīvajām grupām piedalīties reakcijās, kamēr tiek veidota konkrēta saite. Tas nodrošina kontrolētu, pakāpenisku ķēdes montāžu. Tomēr aizsardzība nenovērš visas blakusreakcijas. Pētījumi ar modeļu sistēmām, piemēram, ir parādījuši, ka aizsarggrupu stratēģija un apkārtējā secība var ietekmēt aspartimīda veidošanos. [5] Tādējādi aizsarggrupas nodrošina ķīmisko selektivitāti, taču visa aizsardzības un atbrīvošanas stratēģija joprojām prasa rūpīgu plānošanu un novērtējumu.
8. Ko nozīmē funkcionālo grupu ortogonālā aizsardzība?
Ortogonalitāte nozīmē iespēju noņemt vienu aizsarggrupu apstākļos, kas atstāj citas nepieciešamās aizsardzības pietiekami neskartas. Tas ļauj atsegt noteiktas reaktīvās vietas plānotajos sintēzes posmos. Labi iedibinātas SPPS metodes balstās uz kontrolētu aizsardzību un atsaistīšanu, nevis visu reaktīvo grupu vienlaicīgu atsegšanu. [1] Tomēr izmantoto aizsardzību faktiskā saderība joprojām ir atkarīga no mērķa molekulas un reakcijas apstākļiem.
9. Vai Fmoc un Boc apzīmē dažādus peptīdu veidus?
Nē. Fmoc un Boc ir aizsarggrupas un ar tām saistītās sintētiskās stratēģijas, nevis dažādi peptīda skeleta veidi. To noņemšanas ķīmijas atšķirības ietekmē sintēzes veikšanas veidu, taču pagaidu aizsargķīmiju nevajadzētu jaukt ar mērķa peptīda galīgo struktūru. Publicētās uz Fmoc balstītās metodes parāda vienu no plaši izmantotajiem SPPS variantiem, taču tas nenozīmē, ka katrs peptīds ir jāiegūst ar šo metodi. [1]
10. Vai jau pirmais pievienošanas posms var izraisīt piesārņojumu?
Labi. Piesaistīšanas posms var ietekmēt stereochemisko kvalitāti vēl pirms vairākkārtējas ķēdes pagarināšanas sākuma. Ir izstrādātas analītiskās metodes, kas paredzētas tieši racemizācijas noteikšanai, aizsargātas aminoskābes piesaistīšanas laikā pie sveķiem. [3] Tas nenozīmē, ka katra piesaistīšana izraisa būtisku racemizāciju. Tas tomēr parāda, ka pati piesaistīšana ir ķīmiski nozīmīgs posms, kura laikā var rasties izmērojamas izmaiņas, kas jāņem vērā vispārējā kvalitātes novērtējumā.
11. Kāpēc dažas peptīdu sekvences tiek raksturotas kā grūtas?
Dažas augošas peptīdu ķēdes mijiedarbojas cita ar citu vai ar blakus esošajām ķēdēm tādā veidā, kas ierobežo piekļuvi reaģējošajām vietām. Ūdeņraža saites, hidrofobā mijiedarbība un agregācijai līdzīga uzvedība var apgrūtināt nākamo savienošanu. Pētījumi par secībām, kas ir jutīgas pret agregāciju, parāda, ka savienošanas veida maiņa var ietekmēt neapstrādātā produkta sastāvu. [4] Līdz ar to sintēzes grūtības ir atkarīgas no molekulas īpašībām un reakcijas apstākļiem, nevis tikai no peptīda garuma.
12. Vai ātrāka sintēze vienmēr nozīmē labāku produktu?
Nē. Sintēzes ātrums un produkta kvalitāte ir atsevišķi parametri. Karsēšana, mikroviļņu palīdzība un automatizācija var saīsināt procesa laiku, taču reakcijas paātrināšana var arī izmainīt līdzsvaru starp vēlamajām un blakusreakcijām. Pētījumi par mikroviļņu atbalstītu sintēzi ir parādījuši no atlikuma veida atkarīgu racemizāciju un aspartimīda veidošanos, kas norāda uz nepieciešamību pēc atbilstošas apstākļu kontroles. [7] Isāks sintēzes laiks ir izdevīgs tikai tad, ja iegūtais materiāls atbilst arī prasītajiem ķīmiskajiem un analītiskajiem kritērijiem.
13. Vai atdalīšana vienkārši nozīmē sveķu graudiņu noņemšanu?
Nē. Odsalšana ir ķīmisks process, kas izraisa paredzētās saites starp peptīdu un nesēju pārraušanu. Savukārt sveķu graudu noņemšana filtrēšanas ceļā ir fiziskas atdalīšanas operācija un pati par sevi neapstiprina atsalšanas ķīmijas pareizu gaitu. Peptīda atbrīvošanās var notikt vienlaikus ar aizsarggrupu noņemšanu un citām reakcijām. Pētījumi par atsalšanas laikā izmantotajiem uztvērējiem (scavengers) rāda, ka šis posms var ietekmēt piemaisījumu profilu. [8]
14. Vai produkta augsta neapstrādātā veiktspēja nozīmē augstu peptīda tīrību?
Nē. Neattīrīta iznākums raksturo atgūtā materiāla daudzumu pirms visu nevēlamo sastāvdaļu noņemšanas. Šis materiāls var saturēt mērķa peptīdu kopā ar delēcijas sekvencēm, modificētām struktūrām, atlikušajām aizsarggrupām un citiem piemaisījumiem. SPPS neattīrīto maisījumu pētījumi, izmantojot hromatogrāfiju un masu spektrometriju, parāda, kāpēc atgūtā masa, tīrība un molekulārā identitāte prasa atsevišķu interpretāciju. [9] Tāpēc precīzi uzrādītam iznākumam vajadzētu norādīt posmu, kurā tas tika izmērīts, un to, vai materiāls jau bija attīrīts.
15. Vai SPPS nodrošina garu peptīdu ķēžu iegūšanu?
Jā. Rūpīgi izstrādātas SPPS metodes var ļaut iegūt ļoti garas ķēdes. Pētījumos par automatizētu plūsmas sintēzi tika iegūtas ķēdes, kas satur pat 164 atlikumus, kuras pēc tam tika attīrītas un salocītas pirms funkcionālās novērtēšanas. [10] Tas parāda mūsdienu peptīdu sintēzes iespējas, taču nenozīmē, ka katru līdzīga garuma sekvenci var iegūt ar vienādu iznākumu. Garums ir tikai viens no faktoriem; nozīme ir arī no sekvences atkarīgai agregācijai, blakusreakcijām, locīšanas prasībām un attīrīšanas sarežģītībai.
16. Vai epidermīna secības izveide nozīmē tā pilnīgas sintēzes veikšanu?
Nē. Nogatavināta epidermīna satur netipiskus strukturālos elementus, tostarp sēru saturošus gredzenus, kas pārsniedz vienkārši lineāro aminoskābju secību. Tas ir pierādīts struktūrpētījumos. [11] Tāpēc lineāras sekvences, prekursoru vai fragmentu iegūšana automātiski nenozīmē pilnīgas, nobriedušas molekulas sintēzi. Apgalvojums par totalitāro sintēzi prasa analītiskus datus, kas apstiprina paredzēto savienojumu un citu būtisku strukturālo elementu atjaunošanos.
17. Vai paredzamā molekulmasa apstiprina pilnīgu struktūras pareizību?
Nē. Paredzētās molekulmasas sasniegšana sniedz vērtīgu informāciju, taču pati masa neapstiprina visus peptīda struktūras aspektus un neizslēdz visus būtiskos piemaisījumus. Divām molekulām var būt vienāda nominālā masa, un tajā pašā laikā tās var atšķirties ar stereochemiju vai konkrētu strukturālo izvietojumu. Pētījumi, kas ietver epimēru peptīdu atdalīšanu, parāda, kāpēc stereochemiskās atšķirības var prasīt tādas analītiskās metodes, kas spēj atšķirt struktūras, kuras nav iespējams atšķirt, pamatojoties tikai uz masas mērījumu. [12] Tāpēc galīgā raksturojuma izstrādē jāņem vērā reālistiski piemaisījumi un alternatīvas struktūras, kas var rasties konkrētās sintēzes laikā.
Kopsavilkums
Peptīdu sintēze uz cietā fāzē ir mainījusi peptīdu ķīmiju, ļaujot noturēt augošo ķēdi uz nešķīstoša nesēja vairākkārtējas šķīstošu reaģentu ievadīšanas, reakciju veikšanas un noņemšanas laikā. Tas atvieglo pakāpenisku secības veidošanu un nodrošina praktisku pamatu automātiskajai sintēzei.
Šīs metodes šķietamā vienkāršība tomēr nedrīkst aizēnot katrā posmā notiekošo ķīmiju.
Sveķi, saistviela un aizvietošanas pakāpe ietekmē būtiskas sintēzes vides īpašības. No šķīdinātāja atkarīgā uzbriešana ietekmē piekļuvi pie sveķiem piesaistītajām ķēdēm. Aizsarggrupas kontrolē, kuras funkcionālās grupas var reaģēt, savukārt sajūgšanas reakcijas veido peptīda skeletu pa atlikumam. [1] [2]
Katram no šiem posmiem ir arī savi ierobežojumi.
Sākotnējā pievienošana var ietekmēt stereochemisko kvalitāti. [3] Sarežģītas secības var agregēties un ierobežot reaģentu pieejamību. [4] Aizsarggrupu ievadīšanas un noņemšanas ķīmija var veicināt blakusreakcijas, piemēram, aspartimīda veidošanos. [5] [6] Paātrināti sintēzes apstākļi var mainīt racemizācijas pakāpi vai piemaisījumu profilu. [7] Atšķelšanas apstākļi var papildus ietekmēt jēlprodukta sastāvu. [8]
Tāpēc pareiza ķēdes uzbūvēšana nav pielīdzinātn tīra un pareizi identificēta peptīda iegūšanai.
Neapstrādātā produkta iegūšana, attīrīšana un strukturālā raksturošana paliek atsevišķi posmi. Hromatogrāfija var sniegt informāciju despre maisījuma sastāvu un tīrību, savukārt masas spektrometrija un citas analītiskās metodes sniedz informāciju par identitāti. Nevienam atsevišķam analītiskajam rezultātam nav jāapstiprina visi peptīda struktūras aspekti. [9] [12]
Mūsdienu automatizētā plūsmas sintēze parāda, ka ar atbilstoši izstrādātiem nosacījumiem SPPS var izmantot pat ļoti garām ķēdēm. [10] Vienlaikus strukturāli sarežģīti peptīdi, piemēram, epidermīns, parāda, kāpēc vienkārša lineāras aminoskābju secības atjaunošana var izrādīties nepietiekama, ja gatavā molekula satur papildu gredzenus, netipiskus atlikumus vai noteiktu savienojumu izvietojumu. [11]
Vislabāk SPPS saprast nevis kā vienu reakciju, bet gan kā secīgu atsevišķu ķīmisku un analītisku posmu kopumu.
Pievienošana iezīmē sākuma punktu. Atkārtoti aizsardzības, atbrīvošanas un saistīšanas cikli veido plānoto ķēdi. Atšķelšana atbrīvo produktu. Attīrīšana atdala mērķa molekulu no nevēlamiem komponentiem. Galīgā raksturošana pēc tam ļauj noteikt, vai izolētajam materiālam patiešām ir tam piedēvētā struktūra un kvalitāte.
Šo posmi nodalīšana ļauj izvairīties no vairākiem bieži sastopamiem pārpratumiem: veiksmīga sintēze automātiski neapstiprina tīrību, augsta iznākuma pakāpe automātiski neapstiprina identitāti, un paredzamā molekulmasa pati par sevi nepierāda pilnīgu strukturālo pareizību.
Atsauces
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Cietfāzes peptīdu sintēze: No standarta procedūrām līdz sarežģītu sekvenču sintēzei. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Amadi-Kamalu, C., Klārks, H., Makrobijs, M., Mortimers J., Norts M., Ran, J., Ratledžs, A., Sibbalds, D., Tikias, M., Tse, K., & Vilvejs, H. (2020). Sveķu uzbriešanu ietekmējošo parametru izpēte zaļajos šķīdinātājos. ChemistryOpen, 9(4), 431–441. https://doi.org/10.1002/open.202000030
- Adamson, J. G., Hoang, T., Kriviči, A. un Lahua, G. A. (1992). Marfeja reaģenta izmantošana racemizācijas kvantitatīvai noteikšanai, piestiprinot aminoskābes pie cietajiem nesējiem peptīdu sintēzei. Analytical Biochemistry, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Evaluation of combined use of Oxyma and HATU in aggregating peptide sequences. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Aspartimīda problēma uz Fmoc balstītā cietfāzes peptīdu sintēzē (SPPS). I daļa. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Aspartimīda problēma Fmoc balstītā cietfāzes peptīdu sintēzē (SPPS). II daļa. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Palasek, S. A., Kokss, Z. Dž., un Kolinss, Dž. M. (2007). Racemizācijas un aspartimīda veidošanās ierobežošana mikroviļņu pastiprinātā Fmoc cietfāzes peptīdu sintēzē. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-Benzēndimetantiols (1,4-BDMT) kā saistviela videi draudzīgākai peptīdu sveķu sašķelšanai. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., un Pallai, P. (1991). Neattīrītu produktu raksturojums no cietfāzes peptīdu sintēzes, izmantojot mu-HPLC/ātro atomu bombardēšanas masu spektrometriju. Peptīdu pētījumi, 4(1), 40–46. PubMed
- Hartrampf, N., Sēbi, A., Poskus, M., Geits, Z. P., Kalahans, A. Dž., Kaufers, A. E., Hanna, S., Antila, S., Šisels, C. K., Kvortararo, A. Dž., Je, X., Mijaliss, A. Dž., Simons, M. D., Loass, A., Liu, S., Jesens, C., Nilsens, T. E., & Penteluts, B. L. (2020). Olbaltumvielu sintēze, izmantojot automatizētu plūsmas ķīmiju. Science, 368(6494), 980–987. https://doi.org/10.1126/science.abb2491
- Allgaier, H., Jung, G., Werner, R. G., Schneider, U., & Zähner, H. (1986). Epidermin: Sequencing of a heterodetic tetracyclic 21-peptide amide antibiotic. European Journal of Biochemistry, 160(1), 9–22. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1986.tb09933.x
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Racemization studies in peptide synthesis through the separation of protected epimeric peptides by reversed-phase high performance liquid chromatography. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x