Peptidsyntes på fast fas, oftast känd som SPPS (solid-phase peptide synthesis), är en kemisk metod för att bygga upp aminosyrorna i peptiderna en efter en, medan den ena änden av den bildade kedjan är kemiskt bundet till en olöslig bärare.
Istället för att isolera den bildade peptiden efter varje reaktion lämnar kemisterna den kvar i den fasta fasen genom att tillsätta och avlägsna ytterligare flytande reagenser och avlägsnande vätskor. De upprepade cyklerna möjliggör att den reaktiva aminogruppen kan avlägsnas, en ny aminosyra kan tillsättas och de lösliga komponenterna som inte längre behövs kan avlägsnas. När den planerade aminosyresekvensen är byggd kan peptiden avlägsnas från bärare och sedan bearbetas och analyseras ytterligare.
Denna processorganisation är en av de främsta orsakerna till att SPPS har blivit en så viktig metod inom peptidkemi. Den stationära fasen förenklar utförandet av många repetitiva kemiska processer och möjliggjorde automatisering av syntesen.
Behöver man dock inte en kemisk perfektion för att kunna använda syntesprocessen i fast form.
Att koppla in det uppkomna peptidet till ett bärare garanterar inte att varje kedja får alla planerade aminosyror. Det betyder inte heller att materialet som frigörs i slutet av processen kommer att vara kemiskt rent eller ha en korrekt struktur.
Länksamling, avlägsnande och återvinning av produkten, rening, identifiering och slutlig strukturell karakterisering utgör separata delar av hela processen.
Nyare metodologiska publikationer visar både användbarheten av SPPS och behovet av att modifiera standardmetoder vid svåra sekvenser. I en av de publicerade metoderna som använder FMOC-strategin beskrivs till exempel en rutinbaserad syntes, men också ett modifierat tillvägagångssätt för peptidssekvenser som är känsliga för aggregering. [1]
Förståelsen av SPPS kräver alltså något mer än att memorera de olika kemiska stadierna. Man måste också veta vad målet med varje steg är, vad som kan gå fel under processen och vilka analytiska frågor man fortfarande måste besvara efter dess avslutning.
Vad är peptidsyntes på fast fas?
Den uppkomna peptiden förblir bundet och de förändrade lösningarna förändras.
I konventionell SPPS är peptidet kemiskt kopplat till små, olösliga partiklar, som vanligtvis kallas celler av lim, med hjälp av en lämplig kemisk bindemedel.
Fröna förblir i reaktionssystemet medan ytterligare flytande reagenser och lösningsmedel förångas och avlägsnas.
Det här underlättar betydligt den repetitiva syntesen.
I klassisk, fasvisad syntes kan isolering och rening av det växande peptidet efter varje aminosyraförsättning vara besvärlig. I SPPS förblir den uppkomna kedjan bundet till den olösliga fasen. På så sätt kan lösliga överflödiga reagenser och många biprodukter avlägsnas genom rening, medan peptidet som är bundet till växtfibern förblir kvar på plats.
Begreppet „fast fas” kan dock leda till missförstånd.
Det betyder inte att peptidsammanhållning uppstår utan delaktighet av vätska eller lösningsmedel.
Harts är vanligtvis omgivet av en flytande reaktionsmiljö och dess påverkan på lösningsmedlet kan i hög grad påverka syntesens förlopp. Reaktionsmedlen måste fortfarande röra sig i eller runt det polymermiljö som peptidsyntesen sker i.
Anslutningen av peptidet till bärare är vanligtvis kovalent. Det innebär att den bildade molekylen binds till bäraren genom en bindning med kemisk bindning.
Peptidet är alltså inte bara inlåst mellan partiklarna, det är fastnat i filtret eller ligger löst på ytan.
Det kemiska bindningsförbundet är avsiktligt utformat så att den bildade kedjan förblir bundet under de följande reaktionerna och spädningsstegen och sedan kan frigöras under lämpliga förhållanden.
Konventionell syntes sker från C-änden mot N-änden.
Den klassiska linjära strategin i SPPS börjar vanligtvis med en aminosyra som i den färdiga peptiden kommer att utgöra dess C-end.
Resten kopplas sedan till bärare.
Efter att den lämpliga reaktiva aminogruppen har avlägsnats tillsätts ytterligare en säkerställd aminosyra och den kemiskt kopplas till den uppkomna kedjan. Genom att upprepa denna process förlängs peptiden gradvis mot N-änden.
Det är värt att betona den här vägen, eftersom den skiljer sig från den biologiska proteinstruktureringsprocessen genom ribosomer.
Ribosomal syntes förlänger polypeptidet från N-änden mot C-änden. Den konventionella fasen av SPPS bygger vanligtvis sekvensen i motsatt riktning.
Den slutliga aminosyresekvensen kan dock vara identisk. Det är bara sättet på vilket den byggs som skiljer sig åt.
Det är viktigt att definiera begreppet „konventionell”, eftersom peptidkemi även omfattar specialiserade strategier som använder alternativa sammanlänkningsplatser, fragmenttillverkning, ligeringar och andra icke-standardiserade lösningar.
Beskrivningen av vägen från C- till N-änden avser alltså den typiska faslösa processen för peptidkemikalier, och inte alla möjliga metoder för peptidkemikalier med fast fas.
SPPS är bara en av komponenterna i peptidsyntesen
Syntes på fast fas är inte det enda sättet att få peptider.
Peptider kan också erhållas genom kemisk syntes i en lösning, biologiska ekspressionssystem, enzymatiska omvandlingar, ligering av fragment eller kombinationer av olika metoder.
SPPS är särskilt användbart när kontrollerad sekvensuppsättning krävs samt när säkrade, modifierade eller på annat sätt specialiserade aminosyrebyggstenar används.
Inte ens inom ramen för ett projekt som handlar om en specifik peptid måste man alltid använda samma metod från början till slut.
Enskilda peptidsatser kan till exempel syntetiseras på ett bindemedel, rensas sedan separat och kombineras därefter med annan kemisk metod. Andra molekyler kan kräva folding, oxidation, cyklisering eller ytterligare strukturella förändringar redan efter att den ursprungliga linjära sekvensen har erhållits.
Valet av rätt väg beror därför på den slutliga substansen, dess strukturella komplexitet samt projektets analytiska och kvalitativa krav.
Processen är värt att betrakta som en serie av frågor som följer varandra.
Anslutningen till bäraren markerar startpunkten och påverkar den senare kemiska utsläppningen av produkten. Det är dock fortfarande nödvändigt att fastslå om anslutningen skedde korrekt och om den stereokemiska integriteten har bevarats.
Att sammanställa kedjan ska leda till att aminosyrorna kopplas ihop i den planerade ordningen. Därefter måste man dock kontrollera om alla kedjor reagerade korrekt och om det inte uppstod sekvenser med saknade aminosyror, kortade eller modifierade produkter.
Avlägsnandet av skyddsgrupperna ska frigöra peptidet och avlägsna vissa kemiska skyddsmekanismer. Men själva effektiva avlägsnandet av produkten talar dock inte om vilka andra substanser som finns i råmaterialet.
Reningsprocessen syftar till att separera det önskade materialet från de oönskade komponenterna, men även den rensade fraktionen kräver fortfarande bekräftelse av identitet och kvalitetsbedömning.
Den slutgiltiga strukturella och analytiska karaktäriseringen ska däremot svara på frågan om det isolerade materialet har de kemiska egenskaper som förväntas för den avsedda peptiden och om de analysmetoder som används är lämpliga för den avsedda användningen.
Detta är koncepterskapssteg, inte en laboratorieanvisning. De specifika reagenserna, apparaturen och reaktionsförhållandena beror på det slutliga peptidet och kräver en väl utarbetad och validerad metod.
Anslutning till limmet och montering av kedjan
Harts, bindemedel och bindningsgraden har olika funktioner
I diskussioner om SPPS förekommer ofta tre termer: lim, bindemedel och lastningsgrad, dvs. loading.
De beskriver relaterade, men olika egenskaper.
Harz är en olöslig material som fungerar som bärare.
En bindningstilkande ger en kemisk koppling mellan detta bärare och peptidet eller den första aminosyrekedjan. Dess kemi kan påverka både hur peptidet binds och hur det senare frigörs.
Loading beskriver däremot antalet aktiva anslutningsplatser i förhållande till mängden bärare.
De här begreppen är inte synonymer.
Två proteiner kan fysiskt sett se väldigt lika ut, men samtidigt ha olika funktionella grupper, bindningar eller grad av amination. Dessa skillnader kan påverka tillgången på reaktiva platser vid kedjebindning, den kemiska formen av det slutliga peptidet efter avskiljning samt den kemiska strukturen.
En annan viktig del är den planerade gruppen på C-änden.
Olika bärare-bindningssystem kan valas ut, till exempel så att man får en peptid som är avsluten med en karboxylgrupp eller en amidgrupp.
Det är en viktig kemisk skillnad.
En ändring av den terminala gruppen innebär en förändring av själva molekylen, inte bara hur den packas eller beskrivs.
Försvagning påverkar tillgången till de anslutna kedjorna
Många lösningsmedel som används i SPPS absorberar lösningsmedlet och sväller vid kontakt med det lämpliga flytande mediet.
Detta förändrar den polymeriska miljön och kan öka eller minska den yta som de lösta reagenserna måste passera för att nå de fibrer som är kopplade till den polymera peptidskedjan.
Försvagning är alltså inte bara en fysisk intressanthet.
Det kan påverka tillgången på reaktiva grupper under syntesen.
En systematisk studie av plastmaterial baserade på polystyren och PEG visade att egenskaper som kopplingstyp och graden av kondensation av bindemedlet hade en betydande inverkan på sprickbildningen i de mer miljövänliga lösningsmedlen som undersöktes. Det konstaterades också att sprickbildningen kan variera vid borttagning av skyddsgrupper och vid förlängning av peptidskedjan. [2]
Det visar att viskositetsbeteenden inte alltid kan betraktas som dess permanenta egenskap.
I praktiken beror det på samverkan mellan gelfärgämnet, lösningsmedlet, bindemedlet, den tillförda peptiden samt den aktuella syntesfasen.
En god koncentration eller en gynnsam reaktion för en kombination av bindemedel, lösningsmedel och peptid betyder inte att en annan kombination kommer att uppvisa samma beteende.
Sammanlänkningen själv kräver också kvalitetskontroll.
Det första steget i anslutningen kan verka enkelt eftersom peptidskedjan just nu bara börjar bildas.
En felaktighet som uppstått på detta stadium kan dock kvarstå under hela den senare syntesen.
Om den första restdelen kopplas in felaktigt eller om dess stereokemiska konfiguration ändras under processen, behöver den korrekta kopplingen av alla efterföljande rester inte reparera det ursprungliga problemet.
I en studie från 1992 utvecklades en analytisk metod som var särskilt avsedd för mätning av racemisation som uppstår vid kopplingen av säkrade aminosyror till fasta bärare. [3]
Arbetets betydelse går utöver själva analysmetoden som används.
Det visar att stereokvaliteten kan kräva kontroll redan innan de upprepande kedjebreddningscyklerna påbörjas.
Också mängden material som ursprungligen fanns på enheten kräver en korrekt tolkning.
Den nominella graden av limning, den experimentellt mätta lastningen, mängden råmaterial som återvinns efter avskiljning samt den slutliga produktionen av det isolerade och rensade peptidet är olika storheter.
De bör inte betraktas som substitutiva indikatorer på syntesens framgång.
Längre kedjor kan bli svårare att få tag på
Ju längre peptidskedjan förlängs, desto mer påverkar den själva den kemiska miljön som den befinner sig i.
Närbelägna kedjor kan påverka varandra genom vätebindningar, hydrofoba interaktioner och andra intermolekylära krafter. Vissa sekvenser kan visa en särskilt stark tendens till sådana interaktioner.
Detta kan begränsa tillgången till reaktiva grupper.
I sådana fall kan det bli svårare att inkludera ytterligare ett aminosyra, även om en tillräcklig mängd av bindningsmedlet har införts i systemet.
I en studie av svåra, aggregerbara sekvenser jämfördes olika metoder för sammanfogning och de råa produkterna analyserades. Resultaten stöder principen att processen bör anpassas till den specifika sekvensen i stället för att anta att det finns en enda sammanfogningsstrategi som alltid är den bästa. [4]
Det förklarar också varför enbart en ökning av graden av limning eller mängden av aktiva substanser inte automatiskt löser alla problem.
Om det grundläggande problemet är begränsad tillgång till reaktiva platser blir frågan om mängden tillsatt reagens viktigare än frågan om om det verkligen har nått de rätta platserna och om reaktionen genomfördes effektivt utan att otillåtna mängder av biprodukter uppstod.
Säkerställning, borttagning av skyddsgrupper och sammankoppling
Skyddsgrupper kontrollerar platsen där reaktionen äger rum
Aminosyror innehåller kemiska grupper som kan delta i olika reaktioner.
Vid kontrollerad uppsättning av peptidet vill kemisterna vanligtvis att en viss aminosyra ska reagera med en specifik blockkedja som innehåller en karboxylgrupp, medan andra potentiellt reaktiva platser förblir temporärt inaktiva.
Det är just detta skyddsgrupperna är till för.
De blockerar tillfälligt de valda reaktionsplatserna och låter en annan plats delta i den planerade reaktionen.
I den allmänt använda SPPS-strategin baserad på Fmoc förblir den slutliga aminosubstansen i den växande kedjan säkrad mellan de följande sammanlänkningstexterna. När nästa aminosyra ska fästas tas den tillfälliga skyddningen bort och aminosubstansen avslöjas.
Reaktiva sidoketvor kan ha separata skyddsgrupper som är utformade så att de förblir intakta under upprepade cykler av huvudkedjans uppbyggnad.
Syftet är kontrollerad selektivitet.
En lämplig blockkedja som innehåller en karboxylgrupp bör kopplas till en lämplig amingrupp, i stället för att leda till okontrollerad delning eller andra konkurrerande reaktioner.
Ortogonalitet innebär möjlighet att selektivt ta bort säkerhetsfunktioner
Ortogonal strategi för skyddsgrupper gör det möjligt att avlägsna en skyddsgrupp under förutsättning att andra nödvändiga säkerhetsåtgärder förblir tillräckligt orörda.
Det ger kemisten möjlighet att kontrollera exponeringen av olika reaktiva platser under olika stadier av syntesen.
Fmoc och Boc är välkända termer inom peptidkemi, men de anger inte olika typer av peptidhållningar eller olika slutliga peptidstrukturer.
Detta är skyddsgrupper som är kopplade till olika syntesstrategier och olika metoder för att eliminera dem.
Den tillfälliga kemiska vägen som används vid peptidsyntesen måste därför skiljas från dess slutliga struktur.
Skyddet ger inte heller fullständig skydd mot alla möjliga biverkningar.
Studier av aspartimidets bildning visar till exempel att säkerhetsstrategier, angränsande aminosyrarestriktioner och villkor för borttagning av skyddsgrupper kan påverka föroreningarnas bildning även i välbekanta SPPS-metoder [5] [6].
Gruppskyddets strategi begränsar därför vissa oönskade reaktioner, men eliminerar inte behovet av processkontroll eller slutlig analytisk karakterisering.
Sammanfogning skapar ytterligare en amidbindning av peptidets skelett.
Reaktionskoppling leder till bildandet av ytterligare ett amidbindningsförbund i peptidets skikt.
En aminosyrorubrik som innehåller en karboxylgrupp aktiveras vanligtvis kemiskt för att kunna reagera effektivt med den uppenbara aminogruppen i den växande proteinet som är bundet till virustoxin.
Efter att sammanpressningen är avslutad kan överskottet av material som är lösligt avlägsnas genom att man spolar bort det.
Den nyligen tillförda aminosyran blir då den sista kvarvarande delen av kedjan som växer. Därefter kan dess aminosyrgrupp avslöjas och en ny bindningscykel kan påbörjas.
Teoretiskt sett gör upprepning av denna sekvens det möjligt att styra ordningen av aminosyror genom att styra ordningen för tillförseln av byggstenarna.
I praktiken finns dock en mycket viktig reservation:
Den planerade kemiska reaktionen måste verkligen gå smidigt i varje cykel.
Om ett samband är ofullständigt kan en del av kedjan inte få den planerade delen.
Om de förblir bundna till proteinet och reagerar korrekt i nästa cykel kan sekvenser av deleterade proteiner bildas, vilket innebär att peptidhärden är bristfällig och saknar en eller flera av de planerade aminosyrorna.
Andra kedjor kan vara kortare.
Spolning tar bort lösliga reagenser och biprodukter, men eliminerar inte selektivt alla felbyggda kedjor som fortfarande är kovalentbundna till bäraren.
Lika små förluster kan ackumuleras i många cykler.
SPPS:s återkommande karaktär leder till ett betydande matematiskt problem.
En liten brist i en enskild etapp kan verka obetydlig, men efter många upprepningar kan dess effekter ackumuleras.
Låt oss ta ett enkelt matematiskt exempel.
Om syntesen av peptidet skulle kräva 50 sammanlänkningstappar och var och en av dem hade en egen sannolikhet på 99% att slutföras korrekt, skulle den teoretiska andelen av molekyler som framgångsrikt skulle genomlida alla 50 stegen vara omkring 60,5%.
Detta är endast en illustration.
Den förutsätter att alla faser fungerar identiskt och oberoende. Den tar inte hänsyn till problem med borttagning av skyddsgrupper, biverkningar, förluster vid avskiljande och rensning, aggregering eller många andra faktorer som är verkliga.
Det är därför inte lämpligt att tolka detta resultat som en förutsägelse av den faktiska produktiviteten.
Exemplet visar bara varför även mycket hög effektivitet för de enskilda stegen inte garanterar en kemiskt enkel råprodukt efter några tiotals upprepningar.
Därför är övervakning av syntesen och kontroll av föroreningar viktiga under hela processen för att tillverka peptidet, och inte först efter tillsatsen av det sista aminosyran.
Automatisering, uppvärmning och andra tekniska lösningar kan påskynda syntesen, men hastigheten på processen bör alltid utvärderas tillsammans med produktens kvalitet.
Studien av SPPS-stimulerad mikrofoni analyserade den beroende av typen rest-racemization och bildningen av aspartimid, vilket visar varför reaktionsförhållandena fortfarande måste anpassas till egenskaperna hos den specifika sekvensen. [7]
Avskiljning och återvinning av råprodukten
Avlägsnande av avfall från bärare ger upphov till avfall
Efter att den planerade peptidskedjan har byggts måste den vanligtvis kemiskt separeras från bärare.
Denna fas kallas cleavage, vilket betyder avskiljande.
Avskiljning bryter ner den noga utformade kemiska bindningen mellan peptidet och bärare.
Enligt den använda strategin kan avskiljningen ske samtidigt som delar eller alla grupper av skyddande kedjor på sidoranden avlägsnas. I andra processer kan peptidet eller dess fragment frigöras samtidigt som vissa säkerhetsmekanismer bevaras, om ytterligare kemiska omvandlingar planeras.
Den korrekta frigöringskemien beror på bindemedlet och den slutliga substansen.
Förhållanden som effektivt frigör en peptid kan skada den kemiskt känsliga gruppen i en annan.
Av den anledningen beskriver avspädning det kemiska syftet, inte en universell uppsättning reagenser eller förhållanden som är lämpliga för alla peptider.
På samma sätt visar en korrekt konstruktion av peptidets skelett inte att alla skyddsgrupper sedan effektivt hade avlägsnats.
Att bygga upp kedjan och att avlägsna säkerhetsanordningarna på slutet svarar på olika kemiska frågor och kräver en särskild bedömning.
Förhållandena vid avskiljning kan påverka föroreningsprofilen
Avvattning behöver inte vara en kemiskt neutral process.
Att avlägsna skyddsgrupper och bryta peptids bindning till bärare kan leda till bildning av reaktiva kemiska föreningar som kan modifiera peptidet eller andra komponenter i blandningen.
Av den anledningen kan så kallade scavengers användas i de utvecklade metoderna, vilket är föreningar som hämtar upp vissa oönskade reaktiva produkter och påverkar bildningen av biprodukter.
En studie från 2019 analyserade olika scavengers vid avlägsnandet av exenatid från peptidsyra och visade att deras val påverkade kvaliteten på det färdiga produkten samt den observerade föroreningsprofilen. [8]
Utifrån detta bör man inte skapa en universell recept för avskiljande.
Studien visar dock att förhållandena under detta steg kan påverka produktens kvalitet och bör därför utvärderas för det specifika peptidet och det använda systemet av skyddsgrupper.
En korrekt avlägsnandeprocess har alltså flera dimensioner.
Peptidet måste avlägsnas på rätt sätt, de nödvändiga skyddsgrupperna måste avlägsnas, det slutliga materialet måste återvinnas och oönskade kemiska förändringar måste kontrolleras.
Återvinning av råmaterial är inte den slutliga reningen
Efter avskiljning genomförs en process som möjliggör att materialet som innehåller peptidet separeras från den fasta bindemedlet samt de övriga komponenterna i den reaktiva blandningen.
Man kan dessutom utnyttja skillnaderna i löslighet, flyktighet eller andra kemiska egenskaper.
Att återfå synlig slam eller fraktion som innehåller ett peptid bevisar dock inte att materialet endast består av den avsedda produkten.
På detta stadium talas det vanligtvis om ett rått peptid.
Det kan innehålla den avsedda substansen tillsammans med selektiva sekvenser, förkortade kedjor, kemiskt modifierade peptider, icke fullständigt avblockerade strukturer, material som härrör från reagenser och andra föroreningar.
Betydelsen av de olika föroreningarna beror på sekvensen, syntesförhållandena och den avsedda användningen.
I en av studierna kombinerades en kromatografisk analys med masspektrometri för att karakterisera de rå produkterna av SPPS och att koppla individuella kromatografiska punkter till de specifika peptiderna. [9]
Det visar på varför informationen som erhålls genom separativa och strukturella metoder kompletterar varandra.
Kromatografi kan visa närvaro av många komponenter, medan masspektrometri kan ge ytterligare information som hjälper till att fastslå vad vissa av dem kan vara.
Rensning och bekräftelse av identitet svarar på olika frågor
Reningsprocessen syftar till att berika eller isolera den målmolekyl från andra komponenter.
Identifiering svarar däremot på frågan om det isolerade materialet verkligen har de förväntade kemiska egenskaperna.
Dessa frågor täcker delvis samman, men de är inte samma sak.
En väl uppdelad kromatografisk pik är inte automatiskt ett fullständigt bevis på molekylstrukturen.
På samma sätt är det inte självt en fullständig bedömning av renheten eller den strukturella korrektheten att uppnå den förväntade molekylmassen.
Nära besläktade varianter av sekvenser, stereoisomerer eller kemiskt modifierade former kan vara svåra att skilja från varandra eller identifiera.
Rensningsmetoden bör därför bedömas med avseende på den verkliga blandningen som uppstått vid den givna syntesen, och inte anses vara tillräcklig bara för att den har fungerat för en annan peptid.
Om den slutliga föreningen också kräver att disiarckiska broar, cyklisering eller annan omvandling skapas efter att kedjan har sammanfogats, uppstår ytterligare analytiska frågor om huruvida kopplingarna är korrekta, strukturell homogenitet och om man verkligen har erhållit den avsedda mogna formen av föreningen.
Fördelar, begränsningar och källor till föroreningar
Varför är SPPS så utbredd?
En av de viktigaste fördelarna med SPPS är möjligheten att behålla det bildade peptidet på bärare under flera omgångar av utbyte av flytande reagenser.
Det förenklar repetitiva kemiska processer och möjliggör automatisering.
Kemister kan införa en planerad sekvens av aminosyror som byggstenar, och om processkemin tillåter även vissa specialanpassade aminosyror och andra modifieringar.
Moderna automatiska system visar hur långt man kan utveckla denna idé.
I en studie om automatiserad flödessyntes från 2020 beskrevs framtagningen av proteinkedjor som innehöll upp till 164 aminosyror. Efter senare rening och folding erhölls funktionella material.[10]
Det är ett imponerande exempel på tekniska möjligheter.
Det betyder dock inte att varje sekvens med en längd på 164 aminosyror – eller varje långt peptid eller protein – kan erhållas med samma lätthet.
Det betyder inte heller att rening och strukturell karakterisering blir överflödiga.
Studien visar snarare vilka resultat som kan uppnås med ett noggrant utformat system för välvalda molekyler.
Automatisering styr utförandet av processen.
Men det kan inte byta in olämplig kemi mot lämplig.
Av den anledningen måste maskinens kapacitet, peptidssekvensen och själva molekylets beteende analyseras tillsammans.
Hur uppstår typiska föroreningar?
Under SPPS kan flera olika vägar leda till föroreningarnas uppkomst. En förståelse för dessa hjälper till att förklara varför slutliga analytiska undersökningar fortfarande är nödvändiga.
En delektionssekvens eller en kortkodad produkt kan uppstå när det inte går att koppla samman en aminosyra enligt planerat, eller när kedjans tillväxt avbryts. Eftersom en felaktig kedja kan fortfarande vara kopplad till bindemedlet, behöver den senare rensningen inte ta bort den.
Epimerisering innebär en förändring av den stereokemiska konfigurationen vid det relevanta centrumet. Detta har särskild analytisk betydelse eftersom en epimer kan ha samma nominella molekylmassa som den korrekta peptiden samtidigt som den skiljer sig åt i sin rumsliga konfiguration.
Produkter som innehåller aspartimid kan bildas genom reaktioner som är beroende av sekvensen av sidorester av asparaginasen. Enligt den kemiska processen kan mer än en typ av sådana produkter bildas.
Ommålning av skyddsgrupper uppstår när den grupp som ska avlägsnas fortfarande är bundet till molekylen. Peptidet kan alltså ha den nominella längden på kedjan, men har fortfarande en felaktig kemisk struktur.
Modifikationer relaterade till avskiljande kan uppstå under den slutliga frigörningen av peptidet eller vid borttagning av skyddsgrupper. En korrekt kedjebildning garanterar alltså inte att peptidet kommer att gå igenom avskiljande utan förändringar.
Olyckliga reaktioner relaterade till aggregering kan däremot uppstå när de uppkomna kedjorna påverkar varandra på ett sätt som begränsar tillgången till reaktionsplatserna. Att tillsätta tillräckligt med reagens till reaktionskärlet garanterar inte att varje reaktionsplats är fysiskt tillgänglig och reagerar på rätt sätt.
Detta är möjliga vägar för föroreningens uppkomst.
Detta betyder inte att varje parti som erhålls genom SPPS måste innehålla alla angivna typer av felaktigheter.
Deras betydelse i en specifik synteseprocess fastställs baserat på kunskap om processen, analytiska undersökningar och lämplig kvalitetskontroll.
Konstruerade naturliga peptider kräver något mer än att återge sekvensen
Vissa peptider är strukturellt mycket mer komplexa än vad själva den linjära aminosyresekvensen skulle kunna tyda på.
En bra exempel är epidermin.
Den strukturella karaktäristiken hos epidermis visade på närvaro av många ringar innehållande svavel samt av atypiska rester. [11]
Enbart återgivandet av den linjära ordningen av aminosyror skulle alltså inte vara tillräckligt bevis för att man hade erhållit en autentisk mogen epiderm.
Denna distinktion är viktig vid tolkning av publikationer eller sökningar som rör syntesen av epidermis på den permanenta fasen.
Publikationen kan beskriva en linjär prekursor, en fragment, en analog eller en annan närstående struktur, men inte den fullständiga syntesen av en komplett mogen molekyl.
Den strukturella publikation som citeras här som [11] beskriver egenskaperna hos själva epidermis; det är inte en rapport om dess totala syntes med SPPS-metoden.
Påståenden om total syntes måste därför bedömas med avseende på den faktiska målsyntetiska strukturen hos molekylen, och inte enbart dess linjära aminosyresekvens.
Effektivitet, renhet och identitet ska presenteras separat.
Tre begrepp som ofta misstas i diskussioner om peptidsyntes är effektivitet, renhet och identitet.
En stor mängd återvunnet material behöver inte betyda att det mesta av materialet är det avsedda peptidet. Det råa materialet kan innehålla betydande mängder föroreningar.
En lika hög kromatografisk renhet bekräftar inte automatiskt alla aspekter av den strukturella identiteten.
Även en peptid vars kemiska struktur har karakteriserats noggrant får inte automatiskt bekräftad biologisk, terapeutisk eller klinisk användning.
Detta är skilda frågor.
En noggrann beskrivning av syntesen bör därför ange vilken den slutliga substansen var, vilken fas produktionsprocessen befann sig vid, om det analyserade materialet var råmaterial eller renat material samt vilka analytiska data som användes för att bekräfta påståendena om strukturen.
På så sätt kan resultaten av syntesen tolkas och jämföras på ett mer tillförlitligt sätt.
En enskild procentuell värdering eller massa-värdering får inte användas som en generell påstående att peptidet är „av hög kvalitet” utan kunskap om vad som faktiskt mätts.
Vanliga frågor och svar
1. Varför används en konstant fas i SPPS?
Den permanenta fasen håller den uppkomna peptiden på bärare, medan lösliga reagenser, biprodukter från reaktionen och genomströmmande lösningar kan införas och avlägsnas många gånger. Detta underlättar betydligt den repetitiva kedjeproduktionen och möjliggör automatisering av peptidsyntesen, vilket exemplifieras av samtida metoder för automatiserad flödessyntes. [10] Den permanenta fasen garanterar dock inte att varje reaktion kommer att gå perfekt, eller att en felkonstruerad kedja av bindemedel från bärare separeras från den korrekt konstruerade kedjan. Dess främsta fördel är att processen kan drivas effektivare. Den kemiska selektiviteten, reaktionskompletten, renheten och strukturella identiteten kräver fortfarande en separat bedömning.
2. Eliminerar syntes på fast fas behovet av rening?
Nej. Felaktiga peptidhållor kan kvarstå i bindemedlet under syntesen och sedan frigöras tillsammans med det avsedda produkten. Studien av att analysera råa SPPS-produkter med hjälp av kromatografi och masspektrometri visar att rensningen under syntesen och den slutliga rensningen utför olika funktioner. [9] Reningen eliminerar främst de lösliga komponenterna som omger bindemedlet, medan rensningen efter avskiljande har till syfte att separera den önskade peptiden från oönskade peptidhållor och nonpeptidiska komponenter. SPPS förenklar mellanliggande processer men garanterar inte slutlig renhet.
3. Betecknar „stillestående fas” att lösningsmedlet inte används?
Nej. I konventionell SPPS är den olösliga bärare vanligtvis omgiven av flytande reagenser och lösningsmedel. Lösningsmedlen påverkar den fysiska miljön för limmet, bland annat graden av flöden och hur lätt reagenserna kan nå de sammanlänkade kedjorna. Experimentella studier har visat att det är reagensberoende flöden av lim och förändringar i bindningskemikalier, sammanlänkning, graden av sammanlänkning och kedjelängden som påverkas [2]. Limmet och lösningsmedlet bildar alltså tillsammans en reaktionsmiljö.
4. I vilket riktning växer peptidet under SPPS?
Den konventionella fasbaserade SPPS bygger vanligtvis peptidet från dess C-terminala del i riktning mot N-änden. Den första aminosyran som ska utgöra C-änden i den färdiga molekylen binds till bärare, och de efterföljande resterna förlänger den öppna aminosyreförlängningen. Publicerade metoder som bygger på Fmoc visar denna typiska bild. [1] Det finns dock specialiserade strategier som använder en fast fas, som kan fungera på annat sätt.
5. Betraktas plast och bindemedel som samma sak?
Nej. Limmet är en icke-löslig bärare, medan bindemedlet utgör en kemisk koppling mellan bäraren och den växande peptiden. Bindemedlets funktion kan, oberoende av polymeren själv, påverka bindningen, beteendet för limmet och senare frigörandet av peptiden. Forskning kring bärare som används vid peptidsyntes visar varför enbart identifieringen av typen av lim kan vara otillräcklig för att beskriva hela systemets beteende.[2]
6. Ökar en högre grad av limning alltid produktionen?
Nej. Högre loading innebär fler möjliga anslutningsplatser för en viss mängd bärande material, men det behöver inte leda till att fler korrekt byggda och återvinningsbara peptider erhålls. Graden av binding kan förändra den lokala molekylära miljön och har experimentellt identifierats som en av faktorerna som påverkar limets sprickning.[2] Om de bundna kedjorna är överbelastade eller starkt interagerar med varandra kan tillgängligheten av reaktiva bindningsplatser försämras. Loading bör därför analyseras tillsammans med limets egenskaper, sekvensen, reaktionshastigheten och den slutliga produkten.
7. Varför skyddas aminosyrorna när peptidet tillverkas?
Skyddsgrupper förhindrar tillfälligt de utvalda reaktiva grupperna från att delta i reaktionerna medan en specifik bindning uppstår. Detta möjliggör kontrollerad, stegvis kedjebindning. Skyddet eliminerar dock inte alla biverkningar. Forskning på modellsystem har visat att skyddsgruppernas strategi och den omgivande sekvensen kan påverka bildningen av aspartimid.[5] Skyddsgrupperna ger därför kemisk selektivitet, men hela skyddnings- och avblockeringsstrategin kräver fortfarande noggrann planering och bedömning.
8. Vad innebär ortogonal skydd av funktionella grupper?
Ortogonalitet innebär möjligheten att ta bort en skyddsgrupp under förutsättningar som lämnar andra nödvändiga säkerheter i tillräcklig grad orörda. Detta gör det möjligt att exponera specifika reaktiva platser vid de planerade stadierna av syntesen. Bekräftade SPPS-metoder bygger på kontrollerad av- och påsättning istället för simultan exponering av alla reaktiva grupper. [1] Den faktiska överensstämmelsen mellan de använda skyddsmekanismerna beror dock fortfarande på den slutliga substansen och reaktionsförhållandena.
9. Betecknar Fmoc och Boc olika typer av peptider?
Nej. Fmoc och Boc är skyddsgrupper och de relaterade syntetiska strategierna, inte olika typer av peptidstrukturer. Skillnaderna i hur de avlägsnas påverkar syntesmetoden, men den tillfälliga skyddskemien får inte förväxlas med den slutliga strukturen hos det målprotein. De publicerade metoderna som bygger på Fmoc visar en av de vanligaste varianterna av SPPS, men detta betyder inte att varje peptid måste framställas med denna metod. [1]
10. Kan redan den första etappen av anslutningen orsaka förorening?
Ja. Anslutningsstadiet kan påverka den stereokemiska kvaliteten redan innan flera omvandlingar av kedjan påbörjas. Analytiska metoder har utvecklats särskilt för att identifiera racemisering vid anslutning av säkrade aminosyror till bindemedel. [3] Detta betyder inte att varje anslutning leder till betydande racemisering. Det visar dock att själva anslutningen är ett kemiskt betydelsefullt steg där mätbara förändringar kan uppstå som måste beaktas vid en övergripande bedömning av kvaliteten.
11. Varför kallas vissa peptidsatser för svåra?
Vissa växande peptidkedjor interagerar med varandra eller med närliggande kedjor på ett sätt som begränsar tillgången till reaktiva platser. Vätebindningar, hydrofoba interaktioner och aggregationsliknande beteende kan göra det svårare att senare sammanföra dem. Studien av sekvenser som är känsliga för aggregering visar att ändringen av sättet att sammanföra kan påverka den färdiga produkten. [4] Svårigheten att syntetisera därför beror på molekylens egenskaper och reaktionsförhållanden, inte enbart på peptidets längd.
12. Betalar snabbare syntes alltid till sig i form av bättre produkt?
Nej. Synteshastigheten och produktens kvalitet är separata parametrar. Uppvärmning, mikrofalsstöd och automatisering kan förkorta processtiden, men att påskynda reaktionen kan också ändra balansen mellan önskade och sidoreaktioner. Forskning kring mikrofalsstött syntes visade en beroende av restresurser och aspartimidbildning, vilket tyder på behovet av lämplig kontroll av förhållandena. [7] Kortare syntesstid är endast fördelaktig när den erhållna produkten också uppfyller de erforderliga kemiska och analytiska kriterierna.
13. Betraktas avlägsnande av limet som helt enkelt att ta bort klumpar av lim?
Nej. Avlägsnande är en kemisk process som leder till att den konstruerade bindningen mellan peptidet och bärare bryts. Att avlägsna celler genom filtrering är däremot en fysisk process som inte i sig bekräftar att avlägsnandet av kemikalier fungerar korrekt. Utsläppandet av peptidet kan samtidigt inträffa vid borttagning av skyddsgrupper och andra reaktioner. Forskning kring scavengers som används vid avlägsnande visar att detta steg kan påverka föroreningsprofilen. [8]
14. Betecknar hög produktivitet av råmaterial en hög proteinrenhet?
Nej. Kapaciteten beskriver mängden återvunnet material innan alla oönskade komponenter har borttagits. Detta material kan innehålla den slutliga peptiden tillsammans med delettiva sekvenser, modifierade strukturer, återstående skyddsgrupper och andra föroreningar. Studier av kraftiga blandningar av SPPS med hjälp av kromatografi och masspektrometri visar varför den återvunna massan, renheten och molekylär identitet kräver en separat tolkning. [9] En korrekt redovisad kapacitet bör därför ange vilket steg den mättes vid och om materialet redan hade rensats.
15. Kan SPPS användas för att få tag i långa peptidsnålser?
Ja. Skonsoliderade metoder för SPPS kan möjliggöra framställning av mycket långa kedjor. I studier av automatiserad flödessyntes erhålls kedjor som innehåller upp till 164 restprodukter, vilka sedan behandlas för rening och folding innan den funktionella utvärderingen utförs. [10] Detta visar möjligheterna med modern peptidsyntes, men det betyder inte att varje sekvens med liknande längd kan erhållas med samma effektivitet. Längden är bara en faktor; aggregering beroende av sekvensen, bieffekter, krav på folding och svårigheten att rensa ut produkten spelar också en roll.
16. Betecknar uppbyggnaden av en epidermissekvens genomförandet av dess fullständiga syntes?
Nej. Mogen epidermis innehåller ovanliga strukturella element, däribland ringar av svavel som går utöver den linjära ordningen av aminosyror. Detta har visats i strukturella studier. [11] Att erhålla en linjär sekvens, en prekursor eller en fragment av en sådan, innebär alltså inte automatiskt syntesen av en komplett mogen molekyl. En påstående om total syntes kräver analytiska data som bekräftar återgivandet av de avsedda bindningarna och andra viktiga strukturella element.
17. Stämmer den förväntade partikelmassen med strukturens fullständiga korrekthet?
Nej. Att uppnå den förväntade molekylmassen är en värdefull information, men själva massan bekräftar inte alla aspekter av peptids struktur och utesluter inte alla relevanta föroreningar. Två molekyler kan ha samma nominella massa men samtidigt ha olika stereokemi eller en specifik strukturell ordning. Studien omfattar separering av epimerya proteiner och visar att stereokemiska skillnader kan kräva analytiska metoder som kan skilja strukturer som inte kan identifieras enbart genom mätning av massa. [12] Den slutliga karakteriseringen bör därför utformas med beaktande av realistiska föroreningar och alternativa strukturer som kan uppstå under en specifik synteseprocess.
Sammanfattning
Peptidsyntes på fast fas har förändrat peptidsammansättningen, vilket möjliggör att en växande kedja kan hållas på en olöslig bärare under flera upprepade tillföranden, genomförande av reaktioner och borttagning av lösliga reagenser. Detta underlättar stegvis konstruktion av sekvenser och utgör en praktisk grund för automatisk syntes.
Den uppenbart enkla naturen hos denna metod bör dock inte missförstås som en indikation på den kemi som pågår vid varje steg.
Harts, bindemedel och graden av modifiering påverkar de väsentliga egenskaperna hos syntesmiljön. Lösningsmedelsberoende kondensation påverkar tillgången till kedjorna som är kopplade till hartset. Säkerhetsgrupper kontrollerar vilka funktionella grupper som kan reagera, medan bindningsreaktionerna bygger upp peptidskelettet från rester till rester. [1] [2]
Var och en av dessa steg har också sina begränsningar.
Initiala konditioneringar kan påverka den stereokemiska kvaliteten. [3] Svåra sekvenser kan samla och begränsa tillgången på reagenser. [4] Kemisk binda och avlägsna av beskyddande grupper kan gynna sidoredaktioner, såsom bildandet av aspartimid. [5] [6] Försatta syntesförhållanden kan förändra graden av racemisering eller föroreningsprofilen. [7] Avlägsningsförhållanden kan ytterligare påverka råproduktsammansättningen. [8]
Därför är en korrekt konstruktion av kedjan inte synonymt med att man får en ren och korrekt identifierad peptid.
Återvinning av råprodukt, rening och strukturell karakterisering förblir separata steg. Kromatografi kan ge information om blandningens sammansättning och renhet, medan massespektrometri och andra analytiska metoder ger information om identitet. Ingen enskild analytisk uppskattning behöver bekräfta alla aspekter av peptidsammansättningen. [9] [12]
Modern automatiserad flödessyntes visar att SPPS kan användas även för mycket långa kedjor under lämpligt utformade förhållanden. [10] Samtidigt visar strukturellt komplexa peptider, såsom epidermin, varför själva återgivandet av en linjär aminosyresekvens kan vara otillräckligt om den mogna molekylen innehåller ytterligare ringar, ovanliga restsubstanser eller en viss sammansättningsstruktur. [11]
Det är bäst att förstå SPPS inte som en enda reaktion, utan som en serie av separata kemiska och analytiska steg.
Anslutningen markerar utgångspunkten. Upprepade cykler av säkerhetsåtgärder, avlägsnande av avlastning och sammanfogning bygger upp den planerade kedjan. Avlägsnandet av avlastningen frigör produkten. Rengöringen separerar den slutliga produkten från oönskade komponenter. Den slutliga karakteristiken gör det sedan möjligt att fastslå om det isolerade materialet verkligen har den struktur och kvalitet som tillskrivs det.
Att separera dessa faser gör det möjligt att undvika flera vanliga missförstånd: en framgångsrik syntes bekräftar inte automatiskt renheten, hög effektivitet bekräftar inte automatiskt identiteten, och den förväntade molekylmassen i sig själv bevisar inte att strukturell korrekthet är fullständig.
Referenser
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Peptidsyntes i fast fas: Från standardprocesser till syntesen av svåra sekvenser. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Amadi-Kamalu, C., Clarke, H., McRobie, M., Mortimer, J., North, M., Ran, Y., Routledge, A., Sibbald, D., Tickias, M., Tse, K. och Willway, H. (2020). Undersökning av parametrar som påverkar hartsens svällning i gröna lösningsmedel. ChemistryOpen, 9(4), 431–441. https://doi.org/10.1002/open.202000030
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Användning av Marfey-reagenset för att kvantifiera racemisering vid förankring av aminosyror på fasta bärrar för peptidsyntes. Analytisk biokemi, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Utvärdering av kombinerad användning av Oxyma och HATU för att sammanställa peptidsammansättningar. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Aspartimideproblemet i Fmoc-baserade SPPS. Del I. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Asparimideproblemet i Fmoc-baserad SPPS. Del II. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Begränsning av racemisering och aspartimidbildning vid mikrovågsbehandlad Fmoc-fasta fas-peptidsyntes. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-benzenedimethanethiol (1,4-BDMT) som en rensare av grövre peptidhartsavskiljningar. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., & Pallai, P. (1991). Karakterisering av råprodukter från fastfas-peptidsyntes med mu-HPLC/fast atom bombardement masspektrometri. Peptide Research, 4(1), 40–46. PubMed
- Hartrampf, N., Saebi, A., Poskus, M., Gates, Z. P., Callahan, A. J., Cowfer, A. E., Hanna, S., Antilla, S., Schissel, C. K., Quartararo, A. J., Ye, X., Mijalis, A. J., Simon, M. D., Loas, A., Liu, S., Jessen, C., Nielsen, T. E. och Pentelute, B. L. (2020). Syntes av proteiner genom automatiserad flödeskemi. Science, 368(6494), 980–987. https://doi.org/10.1126/science.abb2491
- Allgaier, H., Jung, G., Werner, R. G., Schneider, U., & Zähner, H. (1986). Epidermin: Sequenzering av ett heterodikt tetracykliskt 21-peptidamidantibiotikum. European Journal of Biochemistry, 160(1), 9–22. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1986.tb09933.x
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Racemizationstudier i peptidsyntes genom separation av skyddade epimeriska peptider med hjälp av omvänd högpresterande flytande kromatografi. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x